Загрузить полную PDF-версию статьи (1107.4 Кб)

методология
1/2011(1)
Высокоэффективная
жидкостная хроматография
маркеров окислительного
стресса
А.Яшин, Я.Яшин yashinchrom@mail.ru
НПО "Химавтоматика", НТЦ "Хроматография"
О
кислительный стресс – предшественник многих опасных заболеваний. Его
ранняя диагностика – основа новой профилактической медицины. Предлагаем краткий обзор методов диагностики окислительного стресса. В их
основе – определение маркеров методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использование в них амперометрических детекторов высокой чувствительности и селективности помогает определять многие маркеры в сложных
матрицах без концентрирования и дериватизации.
Окислительный стресс
В современном научном обществе вопросам диагностики окислительного стресса уделяют пристальное
внимание. В биологических жидкостях человека
действие неблагоприятных факторов – облучение, плохая экологическая обстановка, стрессы –
вызывает рост концентрации высокореакционных
кислородных и азотных соединений, в том числе
свободных радикалов (супероксидный радикал
кислорода, гидроксид-радикал, пероксинитрит и
прочие).
Организм человека имеет трехуровневую естественную антиоксидантную систему защиты от
свободных радикалов. В определенных количествах
свободные радикалы необходимы организму: для
участия в различных биохимических процессах,
поддержания иммунного статуса человека. Однако
избыточное содержание свободных радикалов неизбежно приводит к патологическим изменениям в
человеческом организме. Такое состояние называется окислительным стрессом.
Подавляющее большинство известных теорий
старения основано на теории развития окислительного стресса. Многочисленные научные публикации подтверждают, что окислительный стресс
ведет к развитию таких самых опасных и социально
Se34
значимых заболеваний, как сердечно-сосудистые,
онкологические, сахарный диабет, нарушения мозгового кровообращения, воспалительные, ревматоидные, нейродегенеративные (болезни Паркинсона, Альцгеймера) и некоторых других [1–6].
Поэтому чрезвычайно важно диагностировать
начало развития окислительного стресса, когда он
не привел к серьезным изменениям в организме.
Существуют экспресс-методы, в частности, амперометрический метод [7], которые диагностируют
присутствие окислительного стресса. В их основе
лежит определение антиоксидантного статуса, т.е.
измерение суммарного содержания антиоксидантов в организме человека.
Существуют более достоверные методы диагностирования окислительного стресса. Некоторые из
них основаны на обнаружении на уровне 10-12–10-9
г/см3 специальных маркеров, появление которых в
биологических жидкостях свидетельствует об идущем в организме окислительном процессе. Другие
– на поиске эндогенных антиоксидантов. К их числу
относятся глутатион (GSH), цистеин, мочевая кислота и убихинол – молекулы, соединения которых
могут существовать в восстановленной форме (в
этом случае они являются антиоксидантами) или в
окисленной форме.
www.technоsphera.ru
методология
1/2011(1)
Маркеры
окислительного стресса
Измененные нуклеозиды опре­­
деляют несколькими методами: методом газовой хроматографии–
масс-спектрометрией (ГХ–МС), методом ВЭЖХ–
МС–МС, методом ВЭЖХ с амперометрическим
NH2 иммунным методом и элекдетектором, а также
H
O
трофорезом [9]. Нуклеозид – это соединение одного
N
из оснований нуклеиновой кислоты с пентозой.
HO
O
N
В зависимости
O от типа сахара эти соединения
называют либо рибонуклеозидами, либо дезоксирибонуклеозидами. Наиболее важные нуклеоHO
зиды образуются на основе аденозина, гуанозина,
цитидина и урицила. Нормальные нуклеозиды
реутилизируются в организме, однако измененные нуклеозиды не могут встраиваться при новом
синтезе РНК и ДНК. Они переходят в мочу вместе
с небольшим количеством нормальных нуклеозидов. Поэтому количество измененных нуклеозидов в моче служит критерием изменений молекул
O
ДНК и РНК. При воздействии свободных радикалов
HO
на эти молекулы в случае
окислительного стресса в
NH
моче появляются
окисленные
формы нуклеозиHO
O
N
дов и их предшественников.
В табл.1 приведены
O
наиболее информативные измененные нуклео-
Когда содержание реакционных кислородных
соединений и свободных радикалов в биологических жидкостях и клетках избыточно, антиоксидантная система человека не может их
нейтрализовать. И тогда они начинают процесс
окисления жизненно важных молекул ДНК, белков, липидов и углеводов. В результате окисления этих молекул появляются соединения – маркеры этого окисления.
В настоящее время для определения маркеров окислительного стресса используют преимущественно хроматографические методы.
Иногда для определения некоторых маркеров
применяют иммуноферментативный способ
(система ELISA). Такой анализ часто оказывается дороже хроматографических анализов.
Обычно в системе ELISA один тестируемый образец биологической жидкости предназначен для
определения только одного определенного маркера. На хроматографических приборах при
одном взятии тестируемого образца можно
NH2
определить несколько маркеHOHO
Таблица 1. Маркеры окисления молекул ДНК
ров, в частности, все маркеры
N
производных тирозинов, весь
HO
O
N
O
профиль измененных нуклеоМаркер
Структурные формулы
зидов. Одновременно с ними
можно определять все эндогенO
HO
ные антиоксиданты: цистеин,
N
NH
глутатион (GSH), убихинол,
HО
мочевую кислоту и др.
8-гидрокси-2'N
N
NH2
O
дезоксигуанозин
O
Маркеры
окисления ДНК и РНК.
Методы определения
Многие изменения молекул ДНК
и РНК, индуцированные окислительным стрессом, ведут к
повреждениям, иногда мутагенного характера. Это приводит к
онкологическим заболеваниям
и прежде­
временному старению.
В настоящее время организован
Европейский ко­митет, в рамках
которого ве­дутся ра­боты по стандартизации на­­
рушений ДНК, в
частности, уровень 8-гидрокси2'-дезо­ксигуанозина в клеточных
ДНК нормируется на уровне 0,5–5
повреждений на 106 гуанозиновых оснований [8].
www.technоsphera.ru H
H
OН
Н
Метод
определения
ВЭЖХ
с АД
Н
O
HO
5-гидрокси-2'деоксицитидин
NH
O
ВЭЖХ
с АД и УФ
N
O
N
OO
ВЭЖХ
с АД и УФ
N
N
HO
O
N
HO
NH2
HO
5-гидрокси-2'деоксиуридин
HO
O
N
HО
HO
O
H
H
OН
Н
Н
NH
NH2
35 Br
1/2011(1)
-10,155
5
10
➃N,N-диметилгуанозин
➀3-диазоурин
➁ гуанизин
➂ ксантозин
Высота пика, нА
45,080
методология
15
20
25
30
Время t, мин
Рис.1. Хроматограмма измененных нуклеозидов,
полученная на жидкостном хроматографе "ЦветЯуза"
с амперо­метрическим детектором на колонке С18 150×4,6
мм. Здесь и далее в цифры в кружках – номера пиков.
-568,272 5
10
15
20
25
В большей степени воздействию свободных
радикалов подвержены ненасыщенные связи
жирных кислот в мембранах. Маркеры окисления липидов – альдегиды, диальдегиды, метилглиоксаль, производные гексеналя, ноненаля
и изопростана. В табл.2 перечислены маркеры
окисления липидов.
Наиболее часто используют маркер малоновый диальдегид (МДА), который наиболее
информативный. МДА образуется при перекисном окислении липидов свободными радикалами при разрыве молекул полинасыщенных
жирных кислот. Повышенная концентрация
МДА в сыворотке крови служит маркером степени эндогенной интоксикации и окислительного стресса [15–19]. МДА образует шиффовы
основания с аминогруппами белка, в результате
чего возникают нерастворимые липид-белковые комплексы (пигменты изнашивания).
Маркер
30
35 Время t, мин
Рис.2. Хроматограмма мочи больного атеросклерозом:
появление пика 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин,
t=27 мин (колонка Zorbax SB-C18 4,6×250 мм, гради­
ентный режим элюирования)
Kr36
Маркеры окисления липидов
Таблица 2. Основные маркеры окисления липидов
8-гидрокси-2’-дезоксигуанозин
Высота пика, нА
4819,975
зиды, самый важный из которых – 8-гидрокси-2'дезоксигуанозин.
Окисление молекул ДНК и РНК чаще всего приводит к онкологическим болезням и преждевременному старению. В настоящее время опубликовано много работ, посвященных определению
8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина в моче и сыворотке как больных, так и здоровых людей [10–14].
Измененные нуклеозиды выделяют из мочи на
специальные картриджи или определяют непосредственно в моче с помощью соответствующей
подготовки и центрифугирования. На картридже
Affi-Cel можно выделить измененные нуклеозиды
из мочи. Эти измененные нуклеозиды определяют
с помощью УФ-детектора. Окисленные формы определяют амперометрическим детектором (рис.1).
В последние годы удалось обнаружить измененные нуклеозиды, в том числе 8-гидрокси-2'дезоксигуанозин, без выделения на картридже с
Affi-Cel. Для этого мочу больного центрифугируют
и пробу вводят в хроматограф. На рис.2. приведены
хроматограммы мочи больного атеросклерозом.
На хроматограмме присутствуют более 60 пиков.
Пик, появившийся на 27-й минуте, соответствует
нуклеозиду 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозину.
Методы определения
Малоновый диальдегид
ВЭЖХ с СПФ,
дериватизация
Акролеин
ВЭЖХ с СПФ,
дериватизация
4-гидрокси-2-ноненаль
(4-HNE)
ВЭЖХ с СПФ,
дериватизация
4-гидрокси-2-гексеналь
ВЭЖХ с СПФ,
дериватизация
Метилглиоксаль
ВЭЖХ с СПФ,
дериватизация
7-кетохолестерол
ВЭЖХ с УФ
Кротоновый альдегид
ВЭЖХ с УФ
Изопростаны
ВЭЖХ–МС ГХ–МС
www.technоsphera.ru
методология
1/2011(1)
Sr38
-62,071
2
4
6
8
10
➅3-нитротирозин
➄3-хлортирозин
➃о-тирозин
➂м-тирозин
➁-тирозин
➀3, 4-DOPA
Тирозин – α-амино-β-(n-оксифенил)пропиловая
кислота – заменимая аминокислота с ароматическим кольцом и гидроксильной группой в ней в
пара-положении, поэтому тирозин является антиоксидантом. В организме человека присутствует
только L-тирозин, который входит в состав белков
и ферментов. Тирозин – важная аминокислота,
являющаяся предшественником биологически
активных соединений: адреналина, норадреналина, дофамина и др. При воздействии свободных радикалов на свободный тирозин или тирозин, содержащийся в составе белков, происходит
его окисление. В результате появляются производные – маркеры процесса окисления белков
(3-хлортирозин, 3-нитротирозин, 3,5-дихлортирозин, дитирозин и некоторые другие). Появление
этих маркеров в биологических жидкостях возни-
493,198
Определение тирозина
и его производных
Высота пика, нА
МДА определяют в образцах
N OH O
N
HS
N
HO
OH
O
SH
S
многих биологических жидкоCH
C
C
+
+ 2Н О
2
N
2
N
стей: сыворотке, плазме, моче,
N
H
CH CH CH
H
H
конденсате выдыхаемого возOH
OH
HO
духа. Чаще всего для обнаружения МДА используют образцы
Рис.3. Реакция взаимодействия МДА с тиобарбиту­ровой кислотой
сыворотки, такое определение
кает при атеросклерозе, болезнях Паркинсона и
самое надежное, а пробоподготовка проще и
Альцгеймера и других заболеваниях. Дитирозин
дешевле. Концентрация МДА в сыворотке крови у
является специфическим маркером окислительздоровых людей (в норме) меньше 1 мкмоль/л [20].
ного стресса головного мозга. Окисленные формы
Метод ВЭЖХ с фотометрическим детектором в
тирозина легко определить с помощью амперомевидимой области (длина волны λ=532 нм) [15–19] дает
трического детектора [21].
наиболее достоверные результаты. Для определеДля разделения смеси мы выбрали обращеннония МДА используют реакцию с тиобарбитуровой
фазовый режим высокоэффективной жидкосткислотой. При реакции МДА с тиобарбитуровой
ной хроматографии. В качестве разделительной
кислотой образуется окрашенное соединение – триколонки использовали колонку Zorbax SB-C 18
метиновый комплекс (поглощение при 532–535 нм)
(рис.3). Производные после этой реакции можно
4,6×250 мм. Эта колонка заполнена зернами соробнаружить и флуориметрическим детектором, в
бента – силикагеля с привитыми к его поверхноработе [20] сравниваются результаты определения
сти цепями С18, размер зерен – 5 мкм. Далее, после
МДА, полученные разными методами. В работе [4]
выбора оптимальных рабочих условий разделеприведены результаты обследования более 200 здония, в качестве элюента (подвижной фазы) в изоровых людей (107 мужчин и 106 женщин), у которых
кратическом режиме использовали ацетонитрил
МДА определяли методом ВЭЖХ с фотометриче(4%), подкисленный ортофосфорной кислотой.
ским детектором на длине волны 532 нм. Во взятых
Скорость подачи (прокачки) элюента 1 мл/мин
пробах наблюдали колебание значения конценобеспечила за 15 мин полное разделение смеси:
трации МДА в пределах 0,36–1,24 мкмоль/л. Анализ
3,4-DOPA, тирозина, м-тирозина, o-тирозина,
показал, что значение концентрации МДА практи3-хлортирозина и 3-нитротирозина. Конечно,
чески не зависит от пола и возраста обследуемых.
если увеличить скорость элюента или поднять
Повышение концентрации МДА в плазме наблюдатемпературу колонки, можно значительно сокрается у курильщиков, а также у людей, потребляютить время разделения смеси. На рис.4 привещих спиртные напитки.
12 Время t, мин
Рис.4. Хроматограмма разделения стандартной смеси
производных тирозина (3,4-DOPA 10 мг/дм3, тирозин
4,64 мг/дм3, мета-тирозин 5 мг/ дм3, орто-тирозин
10 мг/дм3, хлортирозин 10 мг/дм3, 3-нитротирозин
10 мг/дм3) в изократическом режиме (колонка Zorbax
SB-C18 4,6×250 мм)
www.technоsphera.ru
18
24
30
глутатион
4
Ток
36
42
Время t, мин
Рис.5. Хроматограмма определения производных
тирозина в слюне больной, обнаружены: мочевая
кислота, тирозин, хлортирозин, 3-нитротирозин (ко­­
лонка Zorbax SB-C18 4,6×250 мм, градиентный режим
элюирования)
дена хроматограмма разделения стандартных
соединений в изократическом режиме, а на
рис.5 – хроматограмма определения производных тирозина в слюне, в ней заметны пики,
соответствующие мочевой кислоте, тирозину,
хлортирозину и 3-нитротирозину.
В тех случаях, когда в биологических жидкостях присутствуют более высокомолекулярные
соединения, желательно использовать режим
градиентного элюирования. При работе в таком
режиме элюирующая способность подвижной
фазы (элюента) возрастает за счет роста концентрации ацетонитрила в общей смеси элюента. Мы определили пределы амперометрического детектирования, используя стандартные
образцы производных тирозина (табл.3).
Оценка окислительного
стресса по определению
эндогенных антиоксидантов
В биологических жидкостях человека постоянно
присутствуют эндогенные антиоксиданты: глутатион (GSH), цистеин, мочевая кислота и убихинол. Молекулы этих соединений существуют
в восстановленной форме (антиоксиданты) или
окисленной. При встрече со свободными радикалами или активной формой кислорода или
азота эти эндогенные антиоксиданты окисляются, но через определенное время восстанавливаются специальными ферментами. За счет
этого механизма в биологических жидкостях
здорового человека устанавливается опредеZr40
мочевая к -та
50
18
16
17
15
10➈
11
12 хлортирозин
13
12
150
100
19
-107,753 5
цистеин
Высота пика, нА
14
➆
тирозин
1/2011(1)
➇
➄
➁➀➂
➃
➅ мочевая кислота
Высота пика, нА
214,159
методология
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Время t, мин
Рис.6. Хроматограмма разделения стандартной
смеси цистеина, мочевой кислоты и глутатиона
восстановленного (GSH) в изократическом режиме
(колонка Zorbax SB-C18 4,6×250 мм)
ленный баланс между оксидантами и антиоксидантами.
Хроматографический метод помогает определить отношение восстановленных и окисленных
форм: глутатиона, мочевой кислоты, цистеина
к цистину, убихинола к убихинону [22–29]. Экзогенный антиоксидант – аскорбиновая кислота –
также существует в двух формах (табл.4). Отношение нитрита к нитрату в слюне также связано
с окислительно-восстановительным равновесием. Эти эндогенные антиоксиданты определяли хроматографическими методами [22–29].
На рис.6 приведена хроматограмма эндогенных
антиоксидантов. По результатам исследований
определены пределы амперометрического детектирования: цистеина – 4·10-10 г/см3, мочевой кислоты – 10 –10 г/см 3.
Найденные значения пределов детектирования соединений позволят в дальнейшем нахоТаблица 3. Пределы амперометрического
детектирования тирозина и его производных
соединения
Предел детектирования,
г/см3
3,4-DOPA
1,1•10-9
Тирозин
4,9•10-10
м-тирозин
6,1•10-10
о-тирозин
1,1•10-9
3-хлортирозин
1,9•10-9
3-нитротирозин
9,3•10-9
www.technоsphera.ru
1/2011(1)
Таблица 4. Перечень восстановленных и окисленных форм маркеров для оценки окислительного стресса
Мочевая кислота:
восстановленная
форма к окисленной
OH
C
OH
www.technоsphera.ru O
Аскорбиновая кислота/деоксиаскорбиновая кислота
O
Цистеин/цистин
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Убихинол/
убихинон
O
O
OO
OH
Глутатион:
восстановленный
глутатион к окисленному (GSH/
GSSH)
Метод
Структурные формулы
определения
SH
SH
OO OO
O
SH
SH
NNSH O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
N
HH
N N
H
H
N
HO
N
H
OO
HH
HO
N
HH
HO NH
N
OH
H
HO
22
N
O
OO SH
HO NH
OH
H
NH
H
O
O
O
NH22NH
HO
O
2
ON
H
N
HO
OH
NH2 H
O
OO
NH
NH
2
O NN
NH22
O
NH
HO
O
2NH
O2O
HH
HO
N
HH
N
HO
ВЭЖХ с АД
OH
H
HO
H N
O
HO NN
H
OH
H
N
HH
и УФ
N
OO
H s sNO OO
O
NH
O2
H
H
O
O
s
O
O
O
O
O s ss
O
s N
O OH
HO
OO
H
O
O
O
O
s
s
O
N
N
s
O
O
O ON
O
O
O
O
N H
HH
N
N sN
H
HO
O
O
OO
O
HH
HO
H H N
HO
N
HH
NH
OH
H
HO
N
NH
O
2
HO
OH
H NO
OO s H
NH22 O
O
NH
H
2NH2
O
N
O O
H
HO
N
OH
H
NH2
OO
HH
O
H
OH
O
OH
H
OH
H
O
O
O
H
OCH
H
CH
OO
CH
CH
O
CH
CH
CH
CH
2O
2
2
2
O
CH22
O
CH22
CH22O
CH22O
CH
CH
CH
CH
2 CH2O
2 CH2
2 CH2O
2 CH2
HH ВЭЖХ с АД и УФ
СH
СH СH
22 H
H
СH СH
OH
OH
СH
СH2
H
CH
CH
СH
СССH
CH
O
CH
O
СH
2O
2O
СH
СH
2
10
2
2
2
2
10
2
CH2O
O
CH2O
O
С
СH
CH
CH
С
СH
10
O
CH
O
CH
CH
CH
2
O
CH
O
2 CH
2
HH
HH
СH
С
СH
10 10
2СH
2 2 OO
23
2 2 OO
2 2
СH
СH
3
OH
H
OH
H
СH33
СH33
O
СH
O
СH
OHУбихинол
OH
3 СH3
H
Убихинол
СH3 СHСH
3
Убихинол
2
Убихинол
Убихинол
CH2O
CH2O
СH2 С
10
OH
СH3 NH
O
H
СH3
NH
2 HH
SH
SH
NH22 H
H
Убихинол NH
SH
2NH2 H
SH
O
O
SH
HH
O
O
OO OH
ВЭЖХ с АД, УФ и
OOH
H
OH
H
S
S
H
S
S
OH
O
OH
O
OH
ФЛУ
O
CH
S
S
O
OH
CH
OHNH2 H
S SS S
OH OH
2 O
OO
SH
CH22O
O
CH
2 CH2O
OO
HH
O
O
O
O
HH NH
OH
H
H O
2
OHO
H NH
NH22
H
OH
NH
H
S S
2NHOH
2
CH2O
O
HH
HH
HH
NN
H NN
H H NH
HH
NN
NO
N
H
H
H
N
2
N HN
N H
N H
N NN
N
N
ОN
HH
ОN
HH
О
О
ВЭЖХ с АД
ОH
H NH
ОH
H
NN
О
О
ОH NH
NN
ОH
NN
и УФ
NH
N
NH NH H HH
N N
N H
N H
N
N N NN
N H
H NN
H
ОH
ОH
NH
N
N
N
HH
OO CH
HH
OO CH
H
CH
CH
22
22
H
O
H
O
CH
CH
HO HCH
HO HCH
O
O
22 CH2
22 CH2
HC
HC
OH
OH
HCOH
HCOH
OO
OO
CC
O
OH
OH
HC OH
HC OH
HC
HC
OH
OH
HC
HC O
O
O
C
O
O
O
C
O
HC
HC
O
O
C
C
HC
HC
ВЭЖХ с АД
CC
CO
HO HC
H
O
CH2
CH
HC
HC
C
C
HC 2HC C C
C C
HC
и УФ
CC CC
CC CC
COH C
C
COH C
C
HC C
HC C
CC
COO C O
OH
OO
OHC O
OH OH
OH
O
OH
OHC
OH
O
HCOH OH
C OH
O OC O
OH
OH
OH
OH
OH
Отношения восстановленных форм к
окисленным
OH
OH
OH
OH
OH
методология
C
OH
C
O
C
O
41 Nb
методология
дить их в биологических жидкостях и определять
их соотношения. Далее, по величине отношения глутатиона восстановленного к окисленному,
убихинола восстановленного к окисленному
убихинону, цистеина – к цистину, нитрита – к
нитрату, можно будет оценить уровень окислительного стресса. А значит, это позволит оценить
общее состояние здоровья человека.
Внедрение метода ВЭЖХ для определения
маркеров окислительного стресса в стандартные
биохимические лаборатории больниц и диагностических центров позволит диагностировать
окислительный стресс в самом начале его наступления. Вовремя назначенная антиоксидантная
терапия предупредит развитие болезни. Такой
профилактический скрининг значительно сократит затраты на медицину.
Литература
1. Dalle-Donne I., Rossi R., Colombo R. et al.
Biomarkers of oxidative damage in human dise­
ase. – Clin Chem., 2006, v. 32, p. 601–623.
2. Papaharalambus C.A., Griendling K.K. Basic
mechanisms of oxidative stress and reactive
oxygen species in cardiovascular injury. – Trends
Cardiovasc. Med., 2007, v.17, p.48–54.
3. Ogino K., Wang D.-H. Biomarkers of oxidative /
Nitrosative stress: an approach to disease
prevention. Review. – Acta Med. Okayama, 2007,
v.61, p.181–189.
4. Roberts R.A., Laskin D.L. et al. Nitrative and
oxidative stress in toxicology and disease. –
Toxicological sciences, 2009, v.112 (1), p.4–16.
5. Piazza J.R. et al. Frontiers in the use of biomarkers
of health in Research on stress and Aging. –
J. Gerontology: Psychological Sciences, 2010, v.65 B,
p.513–525.
6. Hawkley L.C. et al. Stress and the aging immune
system Brain. – Behavior and Immunity, 2004,
v.18, p.114–119.
7. Яшин Я.И., Рыжнев В.Ю., Яшин А.Я., Черноусова
Н.И. Природные антиоксиданты. Содержание в
пищевых продуктах и их влияние на здоровье и
старение человека. – М.: ТрансЛит., 2009.
8.European Standards Committee on Oxidative
DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA
oxidation in human cells by chromatographic and
enzymic methods. – Free Radical Biol. Med. 2003,
v.34, p.1089–1099.
9. Wood S.G., Gedik C.M., Vaughan N.J., Collins
A.R. Measurement of 8-oxo- deoxyguanosine in
lymphocytes, cultured cells and tissue samples by
Mo42
1/2011(1)
HPLC with electrochemical detection. In Barnett
Y.A. and Barnett C.R. (eds). Aging Methods and
Protocols. – NJ.: Humana Press Inc. Totowa, 2000,
p.171–178.
10.Valavanidis A., Vlachogianni T. and Fiotakis C.
8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG): A Critical
Biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. –
Journal of Environmental Science and Health Part,
2009, v.27, p.120–139.
11. Bartsch H., Nair J. New DNA – based biomarkers
for oxidative stress and cancer chemoprevention
studies. Eur. J. Cancer 2000, v.36, p.1229–1234.
12. Wood S.G., Gedik C.M., Vaughan N.J., Collins
A.R. Measurement of 8-oxo- deoxyguanosine in
lymphocytes, cultured cells and tissue samples by
HPLC with electrochemical detection. In Barnett Y.A.
and Barnett C.R. (eds). Aging Methods and Protocols.
Humana Press Inc. Totowa 2000, NJ, p. 171-178.
13. Helbock H.J., Beckman K.B., Shigenoga M.K. et al.
DNA oxidation matters: the HPLC electrochemical
detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and
8-oxo-guanosine. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1998, v.95, p.288–293.
14. Matayatsuk C., Wilairat P. Quantitative
determination of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as
a biomarker of oxidative stress in thalassemic
patients using HPLC with an electrochemical
detector. – J. Anal. Chem., 2008, v.63, p.52–56.
15.Carbonneau M.A., Peuchaut E., Sess D. et al.
Free and bound malondialdehyde measured as
thiobarbituric acid adduct by HPLC in serum and
plasma. – Clin. Chem., 1991, v.37, p.1422–1429.
16. Nielsen F., Mikkelsen B.B., Nielsen J.B. et al. Plasma
malondialdehyde as biomarker of oxidative stress:
reference interval and effects of life-style factors. –
Clinical Chemistry, 1997, v.43(7), p.1209–1214.
17. Young I.S., Trimble E.R. Measurement of
malondialdehyde in plasma by high performance
liquid chromatography with f luorimetric
detection. – Ann. Clin. Biochem., 1991, v.28,
p.504–508.
18.Richard M.J., Guiraud P., Meo J., Favier A. HPLC
separation of malondialdehyde – thiobarbituric
acid adduct in biological materials (plasma and
human cells) using a commercially available
reagent. – J. Chromatogr., 1992, v.577, p.9–18.
19.Gerritsen W.B., van Boven W.-J.P., Boss D.S. et al.
Malondialdehyde in plasma, a biomarker of global
oxidative stress during mini-CABG compared to
on- end off-pump CABG surgery: a pilot study. –
Interactive Cardio Vascular and Thoractic Surgery,
2006, v.5, p.27–31.
www.technоsphera.ru
методология
20.Bird R.P., Draper H.H. Comparative studies
on different methods of malonaldehyde
determination. – Methods Enzymol., 1984, v.105,
p.299–305.
21. Hensley K., Williamson K.S., Maidt M.L. et al.
Determination of Biological oxidative stress using
HPLC with electrochemical detection. – J. High
Resol. Chromatogr., 1999, v.22, p.429–437.
22.Afzal M., Afzal A., Jones A., Armstrong D. A
Rapid Method for the Quantification of GSH and
GSSQ in Biological Samples. In: “Oxidative stress.
Biomarkers and antioxidant protocols”. – N.J. :
Humana Press, Totowa, 2002, р.117–122.
23.Yamamoto Y., Yamashita S. Ubiquinol/
Ubiquinone Ratio as marker of oxidative stress.
In: “Oxidative stress. Biomarkers and antioxidant
protocols”. – N.J.: Humana Press, Totowa, 2002,р.
241–246.
24.Forman H.J., Zhang H., Rinna A. Glutathione:
overview of its protective roles, measurement and
biosynthesis. – Mol. Aspects Med. 2009, v.30, p.1–12.
25.Johnson J.M., Strobel F.H., Reed M. et al. A rapid
LC-FTMS method for analysis of cysteine, cystine
www.technоsphera.ru 1/2011(1)
and cysteine/cystine steady-steady-stateredox
potential in human plasma. – Clin. Chim. Acta,
2007, v.366, p.43–48.
26.Jones D.P., Carlson J.L., Samiec P.S. et al.
Glutathione measurement in human plasma.
Evaluation of sample collection, storage and
derivatization conditions for analysis of dansyl
derivatives by HPLC. – Clinica Chimica Acta, 1998,
v.275, p.175–184.
27. Ashfag S., Abramson J.L., Jones D.P. et al. The
Relationship between plasma levels of oxidized
and reduced thiols and early atherosclerosis in
healthy adults. – J. Amer. College Cardiol., 2006,
v.47, p.1005–1011.
28.Iyer S.S., Jones D.P., Brigham K.L., Rojas M.
Oxidation of plasma cysteine/cystine redox state
in Endotoxin-Induced lung injury. – Am. J, Respir.
Cell Mol. Biol., 2009, v.40, p.90–98.
29.Miller L.T., Watson W.H., Kirlin W.G. et al.
Oxidation of the glutathione/glutathione disulfide
redox state is induced by cysteine deficiency in
human colon carcinoma HT29 cells. – J. Nutr.,
2002, v.132, p.2303–2306.
43 Tc