Научный руководитель - Тихоокеанский государственный
advertisement
1 На правах рукописи БУРЦЕВА Екатерина Викторовна КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАЛЛЕЛИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ 14.01.04 – внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Владивосток 2012 2 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Невзорова Вера Афанасьевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Кулаков Юрий Вячеславович ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России доктор медицинских наук профессор Шакирова Ольга Викторовна ФГАОУ ВПО ДВФУ Минобрнауки России Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится «29» мая 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.007.01 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 690062, г. Владивосток, проспект Острякова, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета Автореферат разослан «27» апреля 2012 года Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Н.В. Шестакова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) занимает лидирующие позиции в структуре заболеваемости и смертности цивилизованного общества в связи с нестабильной экологической ситуацией, высокой распространенностью курения табака и старением населения [GOLD 2010]. Помимо ведущего диагностического признака ХОБЛ в виде прогрессирующего и частично необратимого ограничения воздушного потока, для заболевания характерны системные проявления в разной степени определяющие прогноз течения болезни. Наиболее заметное влияние на укорочение продолжительности жизни пациентов ХОБЛ оказывает питательная недостаточность, ранним и ведущим признаком которой является потеря тощей массы тела или ее мышечного компонента [Авдеев C.Н., 2007]. В ряду причин развития питательной недостаточности, выделяют хроническое системное воспаление, увеличение работы дыхательной мускулатуры, повышение расхода энергии покоя [Westerterp K.R., 2003] в сочетании с недостаточным потреблением питательных веществ и прогрессированием депрессии [Schols A.M., 2003]. Метаболический риск для пациентов ХОБЛ определяется, в том числе развитием инсулинорезистентности и ранним присоединением сахарного диабета 2 типа [Berry J.K., Pittas A.G., 2004]. Как в формировании питательной недостаточности, так и инсулинорезистентности особая роль отводится гормонам жировой ткани адипокинам - лептину и адипонектину. Основные действия лептина направлены на повышение печеночного глюконеогенеза и захвата глюкозы скелетными мышцами; повышение скорости липолиза и уменьшение содержания триглицеридов в белой жировой ткани [Alessi I., 2005]. Взаимодействие адипонектина с рецепторами Adipo1 и AdipoR2 приводит к повышению утилизации глюкозы тканями, усилению β окисления жирных кислот и снижению гликонеогенеза в печени. Снижение содержания адипонектина в сыворотке крови рассматривается в качестве маркера инсулиновой устойчивости [Matsuzawa Y., 2004]. Большинство исследований содержания лептина и адипонектина при питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ посвящены изучению их активности в сыворотке крови [Бархатова Д.А., 4 Невзорова В.А., 2008] и индуцированной мокроте [Невзорова В.А., Пазыч С.А.,2003]. Для более глубокого понимания участия лептина и адипонектина в процессах потери тощей массы тела при ХОБЛ необходимо изучение их экспрессии в периферических тканях, что поможет уточнить сложные патогенетические взаимоотношения между обменом адипокинов и развитием питательной недостаточности и определить оптимальные пути лечения и реабилитации пациентов. Цель исследования - установить взаимосвязь между развитием питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ и морфофункциональными изменениями клеток тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры. Задачи исследования: 1. Оценить проявление питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ в зависимости от стадии заболевания, используя методы антропометрии и биоимпедансометрии и дать им сравнительную оценку. 2. Охарактеризовать морфологию клеток кожи и поперечнополосатой мускулатуры пациентов ХОБЛ методом световой и электронной микроскопии. 3. Провести иммунуноцитохимическую диагностику экспрессии рецепторов к лептину и адипонектину 1 типа в структурных элементах кожи и поперечнополосатой мускулатуры в контрольной группе и у пациентов ХОБЛ. 4. Методом корреляционного анализа провести оценку взаимосвязи рецепторной активности клеток исследуемых тканей к лептину и адипонектину 1 типа и степенью питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ Научная новизна исследования. Установлены взаимоотношения между потерей тощей массы тела у пациентов ХОБЛ и морфофункциональными изменениями тканей дермы и поперечнополосатой мускулатуры. Определены изменения в клетках кожи и поперечнополосатой мускулатуры, в виде нарушения архитектоники, появления метаболической альтерации с преобладанием фиброретикулярной ткани и уменьшением объема мышечной ткани. Установлены изменения в фиброцитах дермы, в виде появления признаков апоптоза и нарушения структуры митохондрий с наиболее яркими проявлениями при III стадии ХОБЛ. Выяснено, что характер дислокализации рецепторов к лептину и 5 адипонектину 1 типа у пациентов ХОБЛ определяется глубиной патологического процесса и морфологическим типом клеток, экспрессирующих рецепторы к адипокинам. Повышение стадии заболевания сопровождается исчезновением экспрессии LepR и AdipoR1 в поперечнополосатой мускулатуре, критическим уменьшением LepR и повышенной экспрессией AdipoR1 в клетках тканей кожи. Существует прямая корреляционная зависимость между потерей тощей массой тела и экспрессией рецепторов к лептину, и обратная - к адипонектину. Практическая значимость работы. Доказана диагностическая значимость оценки состояния тощей массы тела в исследовании нутритивного статуса пациентов ХОБЛ при нормальных и повышенных показателях ИМТ. Выяснена необходимость использования метода биоэлектрического импеданса для определения питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ с ИМТ > 25кг/м². Установлен вклад изменения рецепторной активности клеток тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры, к лептину и адипонектину, в патогенез питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ. Определена дислокализация рецепторов к адипокинам в виде их исчезновения рецепторов в мышечной ткани и уменьшения сигналов к лептину и повышения к адипонектину 1 типа в тканях кожи. Выясненный дисбаланс в рецепторной активности адипокинов в клетках изученных тканей позволяет рекомендовать в лечение пациентов ХОБЛ программы активной физической реабилитации, в том числе, при нормальном ИМТ. Для адекватной коррекции проявлений питательной недостаточности и улучшения прогноза заболевания возможно создание препаратов регулирующих рецепторную активность адипокинов. Положения, выносимые на защиту: 1. У пациентов с ХОБЛ, в том числе при нормальном и повышенном индексе массы тела наблюдается потеря ТМТ, которая зависит от тяжести заболевания и наиболее выражена при III стадии ХОБЛ. 2. У пациентов ХОБЛ изменяется гистоархитектоника и ультраструктура тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры за счет уменьшения мышечной массы, увеличения фиброретикулярной ткани, появления метаболической альтерации, признаков апоптоза и нарушения функции митохондрий в фиброцитах дермы. 6 3. Метаболическая альтерация тканей определяется изменением экспрессии рецепторов к адипокинам на клетках тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры, имеет тесную связь со стадией ХОБЛ и степенью питательной недостаточности. Публикации По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 4 из которых – в изданиях, рекомендованных ВАК. Внедрение результатов исследования: Материалы диссертации внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений г.Владивостока и используются в учебном процессе при подготовке интернов, ординаторов и врачей на кафедре терапии, ультразвуковой и функциональной диагностики факультета повышения квалификации ГБОУ ВПО ВГМУ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Апробация работы Основные результаты работы были представлены на VIII и IX Дальневосточных конгрессах с международным участием «Человек и лекарство» г.Владивосток, 2011-2012гг.; на заседаниях общественной организации врачей первичного звена Приморского края протокол №3 от 09.03.2011г. и протокол №3 от 01.02.2012г.; на заседании филиала ВНОК г.Владивостока «Доказательная кардиология» протокол №1 от 21.12.2011г. Объем и структура диссертации Материал диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста на русском языке и состоит из списка сокращений, введения, четырех глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, включающего в себя 154 источника (30 – отечественных авторов и 124 – зарубежных авторов). Материал иллюстрирован 21 рисунком и 9 таблицами. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Исследование проведено на базе отделения пульмонологии Городской клинической больницы №1 и аллерго - респираторного центра г. Владивостока. Морфологические исследования выполнены в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России. За период 2009-2011гг., обследовано 98 пациентов (72 мужчин - 73,4% и 26 женщин - 26,5%) с I (n = 25), II (n=41) и III (n=32) стадией ХОБЛ, стабильного течения. 7 Контрольную группу составили 20 здоровых некурящих добровольцев. Все пациенты были проинформированы о проведении исследования и выразили свое согласие, так же было оформлено дополнительное информированное согласие на проведение тонкоигольной биопсии бедра. Протокол исследования одобрен Независимым междисциплинарным Этическим Комитетом ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России протокол № 3, дело №2 от 01 февраля 2010г. Для диагностики ХОБЛ применялись рекомендации международной программы GOLD (пересмотр 2010 г.). ФВД определялась на спироанализаторе Spirosift – 500 (Япония). Для оценки обратимости бронхообструкции проводили ингаляционную пробу с 400 мкг сальбутамола. Обследование включало: общее клиническое исследование; диагностику питательного статуса пациентов в виде анкетирования с использованием субъективной глобальной оценки по Detsky. Антропометрические измерения, с вычислением индекса массы тела (ИМТ), индекса тощей массы тела (иТМТ), относительного содержания тощей массы тела (ТМТ%), окружности плеча (ОП), окружности мышц плеча (ОМП), толщины кожно-жировой складки трицепса (КЖСТр). Проведение биоимпедансометрии, с оценкой ИМТ (кг/м²) и ТМТ (%). Для оценки морфологии клеток тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры, использован метод тонкоигольной биопсии, с помощью автоматической многоразовой тонкоигольной биопсийной системы Magnum (фирма «Burd», Германия) и применение одноразовых стерильных игл MN2010 с глубиной проникновения 22мм и диаметром 0,9мм. Забор материала осуществлялся в анатомической проекции четырехглавой мышцы бедра. Для первичной регистрации и визуализации препарата проведено морфологическое исследование биопсии тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры с использованием окраски гематоксилин и эозин. Для выяснения ультраструктуры тканей взятого биопсийного материала использовалось электронномикроскопическое исследование с помощью трансмиссионного электронного микроскоп JEM-100 S (Jeol, Япония). Микрофотосъемка проведена на фотопластинке ПФП-01Т (ОАО «Компания Славич»). С целью определения локализации и рецепторной активности к лептину и адипонектину клеток, изучаемых тканей, использован метод иммунофлюорисцентного 8 исследования, с применением первичных поликлональных кроличьих антител: 1) антител на адипонектин-рецептор 1типа, (AdipoR1, Santa Cruz, sc-99183, 1:100), 2) антител на лептин рецептор, (Leptin receptor antibody, Abcam, ab60042 и вторичных антител Goat Anti-Rabbit IgG (H&L), DyLight 488 Conjugated, (Thermo Scientific, №35552, 1:200). Исследование проведено с помощью микроскопа Zeiss Axio Scope A1 с системой освещения Colibri и цифровой камерой AxioCam MRc., с использованием фильтров с длиной волны 350 nm (для DAPI) и 488 nm (для FITC). Полученное изображение обрабатывалось в программе AxioVision LE V4.8.1.0., с использованием руководства по подсчету сигналов Dako − Cytomation. Исследование проводилось при участии и помощи д.м.н. Дюйзен И.В. и доцента, к.м.н. Коцюрбий Е.А., которым авторы выражают глубокую благодарность за помощь в выполнении методик и обработки полученных результатов. Результаты обрабатывались с помощью программы STATISTICA 6.0. При сравнении двух независимых групп использовали непараметрический критерий Манна – Уитни, анализ взаимосвязей проводили непараметрическим методом корреляционного анализа Спирмена для ненормального распределения с вычислением ошибки коэффициента корреляции. Результаты исследования и обсуждение Согласно полученным результатам установлено, что ИМТ в общей группе пациентов и при I и II стадиях ХОБЛ не отличается от показателей контрольной группы (таб. 1). Снижение массы тела по отношению к контролю обнаружено только при III стадии заболевания, но даже в этой группе его значения выше 19 кг/м². Таблица 1 Показатель ИМТ, ТМТ % и иТМТ у пациентов ХОБЛ Показатель Группа Общая ХОБЛ ХОБЛ ХОБЛ III нутритивного контроля группа I стадии II стадии стадии статуса ХОБЛ ИМТ, кг/м² ТМТ, % иТМТ, кг/м² 24,1±1,5 25,0±0,6 26,0±1,2 23,5±0,8 19,5±0,7*#& 86,0±2,0* 72,2±1,3* 74,5±1,1* 72,0±1,6* 64,6±1,4*#& 17,4±1,8 15,56±1,2 15,8±1,4 15,69±1,9 14,38±2,8 Примечание. Достоверность различий (р<0,05): *-между группой контроля, общей группой и стадиями ХОБЛ, # - достоверность различий между I и III стадией ХОБЛ, & - II и III стадией ХОБЛ. 9 По результатам опроса обследованных пациентов, 33,6% имели избыточный вес до установления диагноза ХОБЛ и отметили значительную потерю массы тела по сравнению с исходными данными в течение последних 6 месяцев. Так у 56 пациентов (57,14%) с ИМТ >19 кг/м² масса тела за последние 6 месяцев в среднем снизилась на 8,16±0,34кг. Среди пациентов с потерей веса преобладали лица с III стадией ХОБЛ (31 человек). По мнению большинства исследователей, для оценки питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ наиболее существенное значение имеет не ИМТ, и даже не его потеря за 6 месяцев, а состояние тощей массы тела [Авдеев C.Н., Чучалин А.Г.,2007]. Исходя из задач нашего исследования, мы проанализировали соотношение ТМТ к общей массе, а также вычислили индекс ТМТ (иТМТ) (таблица 1). Показатели ТМТ в общей группе пациентов с ХОБЛ достоверно снижены по сравнению с группой контроля (соответственно 72,2±1,3 и 86,0±2,0, p<0,05). Показатели ТМТ у пациентов с различными стадиями ХОБЛ, в отличие от ИМТ, снижаются по сравнению с контролем уже при I стадии ХОБЛ (соответственно 74,5±1,1 и 86,0±2,0, p<0,05). При II и III стадии ХОБЛ значения ТМТ снижаются еще более значительно, достигая минимальных показателей в последнем случае, когда они становятся достоверно ниже по сравнению с результатами исследования у пациентов с I стадией ХОБЛ (p<0,05). Дефицит тощей массы тела установлен у 8, 33 и 28 пациентов с I, II и III стадиями ХОБЛ соответственно, что составило 32%, 78,57% и 90,3% в каждой группе. Иными словами, по мере нарастания стадии заболевания количество пациентов ХОБЛ, имеющих дефицит тощей массы тела прогрессивно увеличивается и при III стадии ХОБЛ потеря тощей массы тела, скорее, правило, чем исключение. Проведенный корреляционный анализ между показателями ТМТ и стадией ХОБЛ, определенной по показателю ОФВ1 после ингаляции β2-агониста, показал наличие обратной связи средней силы (R=0,50+/-0,9; p=0,001), подтверждая высказанное ранее суждение о прогрессирующей потери тощей массы тела у пациентов с более тяжелыми стадиями болезни. Для оценки питательной недостаточности, помимо определения ИМТ и ТМТ, необходимо провести ряд антропометрических измерений, включающих исследование окружности плеча (ОП), окружности мышц плеча (ОМП), толщины кожно-жировой складки 10 трицепса (КЖСТр) и лабораторное обследование в виде определения содержания лимфоцитов в периферической крови [Шумилкин В.А., Хорошилов И.Е., 2002]. Согласно полученным результатам ОП в общей группе пациентов ХОБЛ составляет 28,4±0,67 см и достоверно не отличается от показателей контрольной группы (26,1±2,0 см, р>0,05). Показатель окружности мышц плеча (ОМП), отражающий белковый состав организма, в общей группе обследованных составляет (23,7±4,3 см) и не отличается от контрольных значений (24,2±1,2, р>0,05). В то же время у 32 пациентов ХОБЛ или в 32,6% случаев обнаружено снижение данного показателя ниже значений контрольной группы (18,2±0,8, p<0,05). Согласно мнению Рудмена Д. (1993), определение кожно-жировой складки трицепса косвенно характеризует энергетический запас организма. В нашем исследовании величина КЖСТр в общей группе пациентов ХОБЛ составляет 14,4 ± 0,6 мм и находится в референсных значениях для показателей контроля. Однако у 25 пациентов ХОБЛ или в 25,5% случаев установлено ее снижение на 1,9±0,8 мм. Содержание лимфоцитов в периферической крови связано с состоянием висцерального пула белка [Рудмен Д.,1993]. В нашем исследовании лимфоцитопения выявлена у 18 пациентов ХОБЛ, 11 и 7 из которых имели ІІ и ІІІ стадию заболевания соответственно. Суммарный анализ параметров нутритивного статуса показал, что у 42 человек или у 42,8% пациентов ХОБЛ установлена питательная недостаточность различной степени, а именно легкая степень диагностирована у 31 пациента (31,6%) и средняя – у 11 пациентов (11,2%). Оценка проявлений питательной недостаточности при различной стадии ХОБЛ показала, что при І, II и III стадии питательная недостаточность установлена у 8, 15 и 19 пациентов соответственно, что составило 32%, 35,7% и 61,2% в каждой группе. Корреляционный анализ между показателями стадии ХОБЛ и степени питательной недостаточности установил прямую связь средней силы (R=0,50+/-0,9; p=0,001). Иными словами, по мере прогрессирования заболевания у пациентов ХОБЛ нарастают проявления питательной недостаточности. По мнению ряда исследователей, для оценки питательной недостаточности более чувствительным методом по сравнению с антропометрическими измерениями является метод биоимпедансометрии [A.M. Schols, E.F.M. Wouters, 1998]. Измерение 11 ИМТ, ТМТ у пациентов ХОБЛ методами антропометрии и биоимпедансометрии не показали достоверных различий между собой, как в общей группе пациентов, так и в группах пациентов с различными стадиями заболевания (рис.1). 100 80 85,4±0,9 72,2±1,3* 60 40 20 0 24,2±1,3 24,1±1,5 73,5±0,8* 71,7±0,7* 86,0±2,0 25,3±0,8 25,0±0,6 74,5±1,1* 25,8±1,3 26,0±1,2 71,6±1,1* 72,0±1,6* 64,6±1,4*#& 23,8±0,2 23,5±0,8 64,2±0,5*#& 20,2±0,8*#& 19,5±0,7*#& группа контроля общая группа I стадия ХОБЛ II стадия ХОБЛ ХОБЛ ИМТ ТМТ ИМТ2 ТМТ2 III стадия ХОБЛ Примечание. Достоверность различий (р<0,05): *-между группой контроля, общей группой и стадиями ХОБЛ, # - достоверность различий между I и III стадией ХОБЛ, , II и III стадией ХОБЛ Рис. 1. Показатели ИМТ, ТМТ, определенные методами антропометрии и биоимпедансометрии у пациентов ХОБЛ Основываясь на мнении о неравномерности композиционной структуры тела и возможности потери ТМТ у пациентов с избыточной массой, мы проанализировали показатели ТМТ, определенные методами антропометрии и биоимпедансометрии в зависимости от ИМТ (рис. 2). Согласно полученным результатам установлены достоверные различия в показателях ТМТ у пациентов ХОБЛ с ИМТ>25 кг/м2, когда ТМТ, определенная методом биоимпедансометрии оказалась достоверно ниже, чем при ее оценке антропометрическими измерениями. Согласно мнению ряда исследователей, при потери тощей массы тела у пациентов ХОБЛ регистрируются различные признаки поражения поперечнополосатой мускулатуры чаще всего в виде атрофии и некробиоза с развитием фиброзной ткани [Corbucci GG, 1999]. 12 100 81,5±1,4 80 ТМТ 60 (%) 40 78,5±1,25* 71±1,6 80,5±1,25 Метод антропометрии 69,5±1,9 20 64,5±1,08* 0 ИМТ 20-25 ИМТ < 20 Метод биоимпедансометрии ИМТ > 25 Показатели ИМТ (кг/м²) Примечание: Достоверность различий(p<0,05): *-между ТМТ определенной методами антропометрии и биоимпедансометрии у пациентов ХОБЛ Рисунок 2. Показатели ТМТ, определенные методами антропометрии и биоимпедансометрии, в зависимости от значений ИМТ Согласно нашим результатам во всех исследованных биоптатах у здоровых людей регистрируются клетки кожи, подкожно – жировой клетчатки и поперечнополосатой мускулатуры, с обычной гистоархитектоникой и без признаков метаболической альтерации и патологических изменений (рис. 3, а, б, в). а) б) в) г) Рисунок 3. Морфологическое исследование биопсии тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры лиц контрольной группы: а, б – кожа и соединительная ткань; в - поперечнополосатая мышечная ткань; и пациентов с III стадией ХОБЛ (г). Окраска гематоксилин и эозин. Увеличение х100 В биоптатах пациентов ХОБЛ (рис. 3, г), видимых изменений в эпидермисе не обнаружено. В соединительной ткани гиподермы преобладает фиброретикулярная ткань, мышечные волокна единичные, встречаются включения жировой ткани. Наиболее выраженные изменения регистрируются у пациентов с III стадий ХОБЛ, что является косвенным морфологическим проявлением системного процесса, затрагивающего поперечнополосатую мускулатуру в условиях которого происходит ее замещение фиброретикулярной брадитрофной тканью. 13 Для уточнения ультраструктуры тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры у пациентов ХОБЛ проведено электронно — микроскопическое исследование полученных образцов (рис. 4). Как следует из представленных данных, в электронограммах преобладают фиброциты. а) б) в) г) д) Рисунок 4. Электронограммы фиброцитов контрольной группы исследования (а), пациентов с I стадией ХОБЛ (б), со II стадией ХОБЛ (в, г) и III стадией ХОБЛ (д). На электронограммах у обследованных контрольной группы (а) и пациентов с I стадией ХОБЛ (б), определяется ядро клеток, которое равномерно заполнено хроматином, в нем четко визуализируется ядрышко с гомогенным содержимым. Цитоплазма клеток заполнена микротрабекулярной сеткой из тонких белковых миофиламентов диаметром 5-7 нм, обеспечивающих движение клетки. Плазмолемма фибробласта имеет многочисленные рецепторы. На внутренней поверхности цитолемы отмечаются многочисленные окаймленные ямки, что свидетельствует об эндоцитозе. На электронограммах пациентов со II стадией ХОБЛ (в), в ядре фиброцита помимо активного хроматина (эухроматина) имеются глыбки гетерохроматина (электронно-плотные структуры, фиксированные к внутренней ядерной мембране), отсутствует ядрышко. Наблюдаются перфориванная ядерная оболочка и появление вакуолей в гетерохроматине, указывающие на начальные признаки апоптоза. Уменьшается площадь цитоплазмы (г). На электронограммах пациентов с III стадией ХОБЛ (д) преобладают фиброциты с характерным проявлением апоптоза в ядре. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров, наблюдается перфориванная ядерная оболочка. В цитоплазме видны измененные в митохондриях в виде снижения плотности, количества органелл под сарколеммой; полиморфизм с наличием крупных, удлиненных, пучкующихся форм и преобладанием мелких овальных органелл; дезорганизация архитектоники и структуры крист, свидетельствующие о нарушении 14 структуры и функции митохондрий. Большинство исследований описывающих изменение ультраструктуры клеток периферических тканей при ХОБЛ отмечают изменение состояния волокон поперечнополосатой мускулатуры в виде уменьшения доли мышечных волокон I и II типа, уменьшения количества капилляров на единицу площади поверхности мышечной ткани [Palange P., Deutz N.E., 2004]. Согласно нашим результатам процессы дезорганизации структуры захватывают не только поперечнополосатую мускулатуру, но и клетки дермы, указывая на системность происходящих процессов метаболической альтерации и структурного ремоделирования. В литературе активно обсуждаются вопросы патогенеза потери тощей массы тела у пациентов ХОБЛ. Наиболее часто упоминается вклад гипоксии и плохо контролируемого системного воспаления низкой градации. Полагают, что гипоксия играет важную роль в нарушении регенеративной способности мышечной ткани при ХОБЛ, вследствие развития лактатацидоза [P. Palange, 2004], и нарушения капилляризации периферических мышечных волокон (F. Franssen, 2003). К сожалению рекомендуемая кислородотерапия не устраняет в полной мере потерю скелетной мускулатуры и достоверно увеличивает выживаемость пациентов только с IV стадией ХОБЛ [Payen J.F., Agusto A.G., Noguera A., 2006]. Исследования показателей активности системного воспаления у пациентов ХОБЛ с питательной недостаточностью показали их отрицательное влияние на тяжесть обострения и показатели бронхообструкции [Kokturk N.,2006]. Тем не менее, контроль за процессами системного воспаления при ХОБЛ затруднен. Использование глюкокортикостероидов при ХОБЛ не увеличивает продолжительность жизни и приводит к еще более выраженной потере скелетной мускулатуры. Одновременно с потерей поперечнополосатой мускулатуры при ХОБЛ возможно усиление процессов толерантности к инсулину и увеличение риска развития сахарного диабета. В качестве одного из объединяющих механизмов прогрессирования питательной недостаточности и увеличения метаболического и сердечнососудистого риска у пациентов ХОБЛ рассматривается нарушение адипокинового обмена или гормонов жировой ткани лептина и адипонектина [Невзорова В.А., Бархатова Д.А]. Результаты иммуноцитохимического исследования локализации рецепторов к 15 лептину в тканях кожи и поперечнополосатой мускулатуре у здоровых и пациентов ХОБЛ представлены на рисунке 5. Рисунок 5 (а, б, в, г). Рецепторы к лептину в группе контроля (а), при I(б),II(в),III(г) стадии ХОБЛ (метод иммунофлюорисценции; увеличение х200). В тканях контрольной группы положительная иммуноцитохимическая реакция обнаруживается в цитоплазме и на мембране клеток. Выраженная экспрессия метки в группе контроля наблюдается во всех слоях эпидермиса и клетках дермы, подкожно – жировой клетчатке и мышечной ткани. У пациентов ХОБЛ наблюдается изменение рецепторного аппарата эпителиальных клеток, что сопровождается постепенным снижением активности реакции в роговом слое эпидермиса у пациентов с I стадией ХОБЛ (Б), и впоследствии приводит к уменьшению количества рецепторов на эпителиоцитах базальных и средних слоев, а также – исчезновением рецепторов на клеточных элементах дермы. Так же заметно, что экспрессия рецепторов к лептину уменьшается по мере возрастания тяжести заболевания от I к III стадии ХОБЛ. У пациентов ХОБЛ положительная экспрессия антител регистрируется к лептину в клетках кожи и подкожно – жировой клетчатке. В клетках мышечной ткани, вне зависимости от стадии заболевания, наблюдается исчезновение иммунопозитивной окраски. 16 Результаты исследования локализации адипонектин-рецепторов 1 типа у группы контроля (а) и пациентов ХОБЛ I(б),II(в) и III(г) стадии представлены на рисунке 6. а) Группа контроля б) ХОБЛ I стадии в) ХОБЛ II стадии г) ХОБЛ III стадии Рисунок 6. (а, б, в, г). Рецепторы к адипонектину 1 типа в группе контроля (а), при I(б),II(в),III(г) стадии ХОБЛ (метод иммунофлюорисценции; (*)положительная экспрессия метки, увеличение х200). Как следует из представленных данных, в группе контроля регистрируется яркое свечение иммунофлюоресцентной метки к адипонектину 1 типа в цитоплазме и на мембране клеток кожи, подкожно – жировой клетчатки и мышечной ткани. По сравнению с группой контроля у пациентов с I, II и III стадией ХОБЛ, экспрессия рецепторов к адипонектину 1 типа, обнаруживается преимущественно в тканях кожи и исчезает в поперечнополосатой мускулатуре. Экспрессия рецепторов клеток тканей кожи к адипонектину 1 типа возрастает с увеличением стадии заболевания, с максимальной яркостью свечения у пациентов с III стадией ХОБЛ. Исходя из задач исследования нами подсчитано количество сигналов к рецепторам лептина и адипонектина в изучаемых тканях (таб. 2). 17 Таблица 2 лептину и Количественная характеристика экспрессии рецепторов к адипонектину у пациентов ХОБЛ Адипокин Контрольн Общая I стадия II III стадия ы ая группа группа ХОБЛ стадия ХОБЛ ХОБЛ LepR (ед.) 8,1±1,8 4,9±1,6 6,7±2,1 3,2±0,4 2,1±0,9*# * AdipoR1(е д.) 11,1±1,4 13,8±1,5 12,6±0,8 15,8±0, 4* 17,1±0,6* # Примечание. Достоверность различий (р<0,05): *-между группой контроля, общей группой и стадиями ХОБЛ, # - достоверность различий между I и II стадией ХОБЛ, , I и III стадией ХОБЛ Максимальное количество экспрессии рецепторов к лептину в тканях кожи и поперечнополосатой мускулатуры установлено в группе контроля, когда оно составило 8,1±1,8 (ед.) без достоверного различия с общей группой пациентов ХОБЛ и пациентов с I стадией заболевания (4,9±1,6 ед. и 6,7±2,1, соответственно, p>0,05). При II и III стадии ХОБЛ установлено достоверное снижение количества сигналов по отношению к группе контроля с минимальными значениями в последнем случае (2,1±0,9, p<0,05 по отношению к группе контроля и пациентов с I стадией ХОБЛ). В отличие от экспрессии рецепторов к лептину, количество рецепторов к адипонектину 1 типа клеток тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры в группе контроля было наименьшим и составило 11,1±1,4 (ед.), достоверно не отличаясь от показателей у пациентов в общей группе пациентов ХОБЛ и при I стадии заболевания (p>0,05). При II и III стадии ХОБЛ количество экспрессии рецепторов к адипонектину нарастает и достоверно превышает показателя контроля, а в последнем случае и данные группы пациентов с I стадией ХОБЛ. Следует отметить, что указанная динамика экспрессии рецепторов к адипокинам у пациентов ХОБЛ затрагивает только клетки тканей кожи, поскольку в отличие от здоровых, сигналы в поперечнополосатой мускулатуре полностью отсутствуют. Получена обратная корреляционная связь между количеством экспрессии рецепторов к лептину в клетках тканей кожи и стадией ХОБЛ (R=-0,48±0,1, p=0,043), а также прямая связь между 18 количеством экспрессии рецепторов к адипонектину 1 типа и стадией ХОБЛ (R=0,56±0,2, p=0,021). Помимо изучения экспрессии рецепторов к лептину и адипонектину 1 типа в клетках тканей кожи в зависимости от стадии пациентов ХОБЛ, мы проанализировали их состояние в зависимости от степени питательной недостаточности (рис. 7). По результатам исследования количество экспрессии рецепторов к лептину снижается, а к адипонектину повышается (соответственно 1,9±0,6, p=0,032 и 17,8±0,8, p=0,009) у пациентов, с признаками белковоэнергетической недостаточности II степени и показателями ТМТ 64,3±1,2%. В общей группе пациентов ХОБЛ и при белковоэнергетической недостаточности I степени, достоверных различий по сравнению с группой контроля не получено. 20 15 13,8±1,5 14,9±1,3 17,8±0,8*# 11,1±1,4 Кол-во меток 10 LepR и AdipoR1 в 5 8,1±1,8 4,9±1,6 4,5±1,1 1,9±0,6* единицах 0 Группа ХОБЛ БЭН I ст. БЭН II ст. контроля LepR Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05; # - разница между группой ХОБЛ без питательной недостаточности и с наличием питательной недостаточности II степени достоверна, р<0,05. Рисунок 7. Количество экспрессии рецепторов к адипокинам клеток тканей бедра, в зависимости от наличия и отсутствия питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ. Исходя из суждения, о наибольшем значении потери тощей массы тела при развитии БЭН у пациентов ХОБЛ, нами проведен корреляционный анализ между показателями ТМТ и количеством экспрессии рецепторов к лептину и адипонектину 1 типа, который установил наличие положительной связи между ТМТ и количеством экспрессии рецепторов к лептину (R= 0,44±0,1, p=0,0051) и обратной связи, между ТМТ и количеством экспрессии рецепторов к адипонектину 1 типа (R=-0,51±0,1, p=0,0034). 19 Полученные результаты можно объяснить снижением синтеза лептина в условиях хронического системного воспаления и недостатка белково-энергетических ресурсов у пациентов ХОБЛ. В отличие от лептина адипонектин в условиях питательной недостаточности активно участвует в процессах глюконеогенеза и катаболизма жиров. Разнонаправленные метаболические эффекты рецепторов к адипокинам обусловливают прямо противоположные связи экспрессии их рецепторов в тканях кожи с показателями ТМТ при ХОБЛ. Таким образом, у пациентов с ХОБЛ, несмотря на диапазон показателей индекса массы тела, близкий к нормальным значениям, регистрируются признаки питательной недостаточности и потери ТМТ, которые связаны с тяжестью заболевания и наиболее выражены при III стадии ХОБЛ. Наиболее точным методом для диагностики потери ТМТ, является метод биоимпедансометрии, с помощью которого можно установить начальные проявления питательной недостаточности у пациентов с избыточной массой тела. При питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ изменяется гистоархитектоника тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры, в виде уменьшения мышечной массы, увеличения фиброретикулярной ткани и появления признаков метаболической альтерации. Помимо потери скелетной мускулатуры установлены изменения ультраструктуры фиброцитов дермы, в виде присутствия признаков апоптоза и нарушения структуры митохондрий. Метаболическая альтерация клеток тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры характеризуется дисбалансом экспрессии рецепторов к адипокинов, которые полностью исчезают в мышечной ткани и разнонаправлено меняют свою активность в клетках дермы и подкожно-жировой клетчатки. Экспрессия рецепторов к лептину снижается, а к адипонектину 1 типа возрастает, свидетельствуя о вкладе выявленного рецепторного дисбаланса в развитие дисфункции скелетной мускулатуры и поражении тканей дермы у пациентов ХОБЛ с признаками питательной недостаточности. ВЫВОДЫ 1. У пациентов ХОБЛ со значениями ИМТ>19кг/м2 установлена потеря тощей массы тела как методом антропометрии, так и биоимпедансометрии. Метод биоимпедансометрии, в отличие от антропометрии, обеспечивает более точную и раннюю диагностику 20 снижения ТМТ у пациентов ХОБЛ с ИМТ >25 кг/м2 . Степень потери тощей массы тела достигает минимальных значений при III стадии ХОБЛ (64,6±1,4%, р = 0,002) и имеет прямую корреляцию со стадией заболевания (R=0,50±0,9; p=0,001), 2. У пациентов ХОБЛ, в отличие от здоровых лиц, в биоптатах тканей кожи и поперечнополосатой мускулатуры нарушается гистоархитектоника с преобладанием фиброретикулярной ткани и уменьшением объема мышечного компонента, а также появлением признаков метаболической альтерации и изменения жирового обмена. 3. В фиброцитах клеток дермы у пациентов ХОБЛ регистрируются нарушение структуры и функции митохондрий и признаки апоптоза, проявление которых нарастает с увеличением стадии болезни. 4. Рецепторы к лептину и адипонектину 1 типа у здоровых людей идентифицированы в клетках кожи, подкожно-жировой клетчатки и мышечной ткани. Развитие ХОБЛ сопровождается возникновением дисбаланса в локализации рецепторов к адипокинам в виде их исчезновения в клетках поперечнополосатой мускулатуры, а также в уменьшении экспрессии к лептину (2,1±0,9 ед., p=0,023) и повышении к адипонектину 1типа (17,1±0,6 ед., p=0,013) в тканях кожи. 5. Установлена обратная корреляционная связь между экспрессией рецепторов к лептину и стадией ХОБЛ (R=-0,48±0,1, p=0,043) и прямая - между экспрессией к адипонектину и стадией ХОБЛ (R=0,56±0,2, p=0,021). Существует связь между степенью потери ТМТ и активностью экспрессии рецепторов к лептину и адипонетину. Так минимальная экспрессия рецепторов к лептину (1,9±0,4, p=0,032) и максимальная к адипонектину 1типа (17,8±0,8, p=0,009) наблюдаются при II степени питательной недостаточности, когда потеря ТМТ составляет (64,3±1,2%). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для ранней диагностики питательной недостаточности у всех пациентов ХОБЛ с нормальными показателями ИМТ необходимо исследование содержания тощей массы тела методом антропометрии и биоимпедансометрии. При этом, когда ИМТ > 25 кг/м², рекомендовано проводить обследование с помощью биоэлектрического импеданса. 21 2. Метод тонкоигольной биопсии тканей бедра с определением иммуноцитохимической диагностики рецепторов к лептину и адипонектину может быть использован в качестве оценки состояния ТМТ и рекомендован для включения в программы диагностики питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ. Для коррекции питательной недостаточности у пациентов с ХОБЛ патогенетически обоснована разработка препаратов, восстанавливающих чувствительность к рецепторам адипокинов. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Бурцева, Е. В. Исследование нутритивного статуса пациентов ХОБЛ с помощью методов антропометрии и биоимпедансометрии [Электронный ресурс] / Е. В. Бурцева // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 2. – С. 1-9. – URL: www.scienceeducation.ru/102-5912 (дата обращения: 12.04.2012). 2. Бурцева, Е. В. Метод чрезкожной тонкоигольной биопсии в оценке состояния нутритивного статуса пациентов ХОБЛ / Е. В. Бурцева, В. А. Невзорова, И. В. Дюйзен // Вестн. последипломного мед. образования. – 2012. – № 1. – С. 38-42. 3. Бурцева, Е. В. Функциональная активность адипокиновых рецепторов клеток тканей бедра при ХОБЛ / Е. В. Бурцева, В. А. Невзорова // Справочник врача общ. практики. – 2012. – № 5. – С. 2429. 4. Локализация рецепторов к лептину и адипонектину в коже и мышечной ткани при питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ / Е. В. Бурцева, В. А. Невзорова, И. В. Дюйзен, Е. А. Коцюрбий // Бюл. Сиб. отд. РАМН. – 2012. – № 2. – С. 54-58. 5. Бурцева, Е. В. Активность адипокинов в оценке питательной недостаточности у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких / Е. В. Бурцева // Человек и лекарство: сб. мат. VIII Дальневосточн. регионального конгр. с междунар. участием (15-16 сентября 2011 года) / [науч. ред. В. Б. Шуматов]. – Владивосток : Медицина ДВ, 2011. – С. 122-123. 6. Бурцева, Е. В. Биоимпедансометрия в ранней диагностике питательной недостаточности у пациентов ХОБЛ / Е. В. Бурцева // 22 Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XIII Тихоокеан. науч.-практич. конф. студ. и молодых ученых с междунар. участием (19-20 апреля 2012 года) / ВГМУ; [ред. В. А. Невзорова и др.]. – Владивосток : Медицина ДВ, 2012. – С. 268. 7. Бурцева, Е. В. Оценка питательной недостаточности у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких / Е. В. Бурцева // Человек и лекарство: сб. мат. VIII Дальневосточн. регионального конгр. с междунар. участием. (15-16 сентября 2011 года) / [науч. ред. В. Б. Шуматов]. – Владивосток : Медицина ДВ, 2011. – C. 9-10. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ БЭН – белково – энергетическая недостаточность ЖМТ – жировая масса тела ИКЧ – индекс курящего человека ИМТ – индекс массы тела иТМТ – индекс тощей массы тела КЖСТр – кожно-жировая складка трицепса ОМП – окружность мышц плеча ОП – окружность плеча ОФВ1 – объем форсированного выдоха за 1 секунду ТМТ – тощая масса тела ФВД – функция внешнего дыхания ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь легких AdipoR1 – рецепторы к адипонектину 1 типа LepR – рецепторы к лептину Работа выполнена при поддержке государственного контракта № 14.740.11.0186 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.