Образование персистеров у штамма Escherichia coli 4S Мелешенко А. А., Рюмина Е. Д.

Образование
персистеров у штамма
Escherichia coli 4S
Мелешенко А. А., Рюмина Е. Д.
Научный руководитель: к. б. н. Летаров А. В.
Персистеры:
Сохраняют жизнеспособность при обработке
антибактериальными препаратами.
Метаболически не активны.
Обеспечивают выживание культуры при обработке
антибиотиком.
Цели:
Определить факторы, способствующие появлению
персистеров в культуре E. coli 4S.
Определить факторы, влияющие на выход клеток из
состояния персистентности.
Задачи:
Экспериментально подтвердить наличие
персистеров в культуре E.coli 4S.
Установить время, за которое под воздействием
ампицилина гибнут все клетки, кроме персистеров.
Определить, зависит ли образование персистеров
от фазы роста культуры.
Мы использовали:
Ампициллин – антибиотик β-лактамного ряда. Он
препятствует образованию клеточной стенки и,
следовательно, делению клеток. Поэтому нам важно,
чтобы в момент добавления антибиотика клетки
находились в состоянии активного деления. Мы
выбрали его, потому что он обладает бактерицидным
действием, легко отмывается, не вызывает мутаций и
лизирует клетки, что облегчает выделение персистеров
из культуры. Концентрация, которую мы использовали
-100мг/л.
Культура E. сoli (штамм 4S).
Чашки Петри с питательной средой (агар-агар).
Питательный бульон, физ. раствор.
Прибор, для измерения оптической плотности.
Методы.
Серийное разведение:
Какое-то количество
изначальной культуры разводят
в физ. растворе, то же самое
делают с получившимся
раствором. И так нужное кол-во
раз.
Посев шпателем:
Эксперимент 1
Кривая гибели
Схема эксперимента:
Подготавливают ночную культуру (культуры сеют в
пробирки с бульоном и ставят в качалку на ночь
(250 об/мин, 37 градусов)).
В пробирки с бульоном добавляют ночную культуру,
ставят в качалку на 1-2ч (чтобы культура начала
расти).
Высевают соответствующее разведение культуры
на чашку (точка "0") и добавляют ампициллин.
Высевают культуры на чашки через определенные
промежутки времени.
Считают колонии.
Результаты: кривая гибели состоит из двух ярко
выраженных фаз: фазы быстрой гибели и плато, где
скорость гибели гораздо меньше. Вторая фаза наступает
через 3-4 часа после добавления антибиотика (при
условии, что культура находилась в стадии активного
деления). Предположительно, это плато образуют
персистеры.
Выводы: в культуре есть клетки, которые толерантны к
антибиотику. При этом они не могут расти в присутствии
антибиотика.
Гипотеза
Это медленно растущие клетки.
Эксперимент 2
Кривая роста.
Сравнение скорости роста исходной культуры и
культуры, полученной из предпологаемых персистеров.
Схема эксперимента:
Изначальную культуру и культуру с точки 3ч кривой
гибели посеяли в пробирку с бульоном, поставили
на ночь в качалку.
Утром развели.
Через некоторые промежутки времени измеряли
оптическую плотность.
Результаты: культуры растут одинаково.
Гипотеза:
Это резистентные клетки.
Эксперимент 3
Кривая гибели
Схема эксперимента:
Колонии с чашек из точки 0 (исходная культура) и
точки 3 ч (предположительно персистеры) посеяли в
бульон.
Когда они выросли, добавили ампицилин.
Построили кривую гибели.
Результаты: клетки культур гибнут одинаково.
Вывод: толерантные к ампициллину клетки, полученные
в результате первого эксперимента, растут и умирают
также, как и обычные клетки => это не резистентные
клетки и не медленно растущие мутанты=> это
персистеры.
Гипотеза: образование персистеров связано с фазой
роста культуры. Допустим, они образуются на
стационарной фазе (что было бы логично, т. к. на этой
фазе замедляется рост культуры).
Эксперимент 4
Схема эксперимента:
Посадили ночную культуру.
Утром развели ее в 20 и 1000 раз (по 2
повторности).
Поставили кривую гибели.
Результаты: клеток в культуре 1:20 примерно в 35 раз
больше, чем в культуре 1:1000, что не соответствует
разнице разведений (в одной культуре клеток в 50 раз
больше, чем в другой).
Эксперимент 5
Log фаза
Схема эксперимента:
Ставим культуру расти на ночь
Разводим в 100 раз и оставляем расти на 3 ч
Повторяем то же самое N раз
После N-ого раза добавляем антибиотик
Строим кривую гибели
Результаты: клеток в культуре 1:20 примерно в 40 раз
больше, чем в пересеваемой (1 раз) культуре. Что опять
больше, чем предположительное кол-во персистеров,
если бы они не образовывались бы на логорифмической
фазе.
Вывод: видимо, существуют два типа персистеров
(образующиеся на стационарной и логорифмической
фазах) с разной скоростью активации. Персистеров,
образующихся на логарифмической фазе, меньше, и
они активируются быстрее.
Планы
Изучить зависимость образования персистеров от
антибиотика.
Изучить взаимодействие персистеров и фага.
Исследовать воздействие различных факторов на
активацию персистеров (t0 и др.)