здесь - институт биологии развития
advertisement
На правах рукописи КОЖЕВНИКОВА Мария Николаевна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ МИЕЛОИДНЫХ ОРГАНОВ КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология 03.00.15 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лабораториях Гистогенеза и Молекулярно-генетических механизмов онтогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Научные руководители: доктор биологических наук, Старостин Валерий Иванович кандидат биологических наук, Микаелян Арсен Суренович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Бродский Всеволод Яковлевич кандидат биологических наук, Копанцев Евгений Павлович Ведущая организация: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова. Защита состоится «___» ________ 2009 года в «__» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26; http://idbras.comcor.ru; e-mail: idbras@bk.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Автореферат разослан «___» __________ 2008 года. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: ele0806@yandex.ru Е.Б. Абрамова Общая характеристика работы Актуальность проблемы. В настоящее время мезенхимные стромальные клетки (МСК) рассматриваются как мультипотентные тканеспецифические стволовые и родоначальные клетки взрослого организма, способные осуществлять направленную дифференцировку в определенные типы клеток соединительной ткани, такие как остеобласты, хондробласты, адипоциты и стромальные клетки, организующие кроветворное микроокружение (Dominici et al., 2006). По общему признанию, основы экспериментального изучения и клинического применения МСК были заложены отечественным исследователем А. Я. Фриденштейном в 60-х гг. XX века (Friedenstein et al., 1966). МСК обнаружены в различных органах и тканях половозрелого организма, тем не менее, основным источником этих клеток на протяжении всего постнатального онтогенеза считается костный мозг. МСК также найдены в составе кроветворной стромы эмбриональных органов гемопоэза, в частности, в печени. Присутствие МСК в составе стромы кроветворных органов в разные периоды онтогенеза тесным образом связано с исключительной ролью этих клеток и их производных в формировании и поддержании кроветворного микроокружения, так называемой “ниши” кроветворной стволовой клетки (КСК). Сравнительный анализ МСК различной органной принадлежности важен для получения глубокого и всестороннего представления о биологии этих клеток в целом. Мы полагаем, наиболее подходящим критерием для проведения подобного сравнительного исследования является функциональная близость МСК. Это определило выбор органовисточников данных клеток: печень зародышей и зрелый костный мозг. Первый является транзиторным, а второй дефинитивным органами миелоидного кроветворения. При этом популяция МСК из костного мозга рассматривается нами в качестве контроля, т.к. общеизвестно, что клетки этой популяции отвечают всем критериям МСК, а сам костный мозг, как уже было сказано, является основным источником этих клеток в постнатальном периоде онтогенеза. Мы полагаем также, что изучение МСК из разных кроветворных источников в сравнительном аспекте позволит не только охарактеризовать исследуемые клеточные популяции с необходимой полнотой и определенностью, но и предоставит возможность судить об их идентичности. Интерес к подобному сравнительному анализу возник недавно, поэтому публикации, посвященные этой проблеме, малочисленны. Показано, что МСК из печени зародышей обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с костномозговыми МСК (Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007), а также, по некоторым данным, несут на своей поверхности маркеры эмбриональных стволовых клеток, такие как Oct4 и Nanog (Guillot et al., 2007). Вместе с тем, сведения о дифференцировочных потенциях МСК в составе печени зародышей остаются неполными и противоречивыми. Так, рядом авторов подтверждена способность этих клеток дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007), тогда как другими исследователями нали3 чие таких множественных потенций ставится под сомнение (in’t Anker et al., 2003; Fromigue et al., 2008). Цель и задачи исследования. Все вышесказанное позволило наметить основную цель диссертационной работы – сравнительный молекулярногенетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остеогенных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга крыс. Для достижения поставленной цели исследования были сформулированы следующие основные задачи: 1. Охарактеризовать изучаемые клеточные популяции с позиции общепринятых критериев МСК по экспрессии специфических поверхностных антигенов CD73, CD90, CD105. 2. Изучить динамику экспрессии указанных маркеров на разных сроках культивирования. 3. Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследование остеогенных потенций МСК из двух источников. 4. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры остеогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК. 5. Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследование адипогенных потенций МСК из двух источников. 6. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры адипогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведена комплексная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей крыс в период ее высокой кроветворной активности в сравнении с МСК из зрелого костного мозга. Показано, что обе клеточные популяции обладают сходным иммунофенотипом, а именно экспрессируют специфические поверхностные антигены CD90, CD73, CD105. Выявлено, что по мере увеличения сроков культивирования МСК из обоих источников наблюдается снижение экспрессии таких маркеров как CD73 и CD105. Впервые проведен сравнительный молекулярно-генетический, иммунофенотипический и гистохимический анализ остеогенных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей в сравнении с МСК из костного мозга половозрелых крыс. В сходных экспериментальных условиях in vitro МСК печеночного происхождения обладают менее выраженными потенциями к адипогенезу. Они также не способны к завершению остеогенной дифференцировки, а именно к формированию зрелых остеобластов и минерализованного межклеточного матрикса. Кроме того, МСК из печени зародышей обладают более низким уровнем экспрессии генов, вовлеченных в реализацию как остеогенной, так и адипогенной программ дифференцировок, по сравнению с костномозговыми МСК. Сравнительный анализ изученных популяций представляет общебиологический интерес, поскольку позволяет получить более целостное представле4 ние о системе МСК. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курса лекций по биологии развития и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007 г.); II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007 г.); конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н. К. Кольцова (Москва, 2006, 2007 гг.); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием (Новосибирск, 2008 г.); на XV Школе “Актуальные проблемы биологии развития” (Звенигород, 2008 г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах – 4, тезисов докладов и материалов конференций – 6. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах, содержит 52 рисунка, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 230 цитируемых источников. Материалы и методы исследования В работе использованы неинбредные крысы Wistar в возрасте 3–4 мес., весом 150–200 г и зародыши крыс на 16-е сут эмбрионального развития. Для каждого эксперимента получали клетки от 3–4 половозрелых животных и 12–44 зародышей. Выделение и культивирование МСК. Для получения культуры МСК из костного мозга половозрелых крыс содержимое диафизов бедренных и большеберцовых костей вымывали культуральной средой α-MEM (Sigma, США). Полученные образцы костного мозга суспендировали и пропускали через фильтр, d=40 мкм (BD Biosciences, США). Подсчет клеток в суспензии осуществляли с использованием камеры Горяева. После подсчета числа клеток суспензию (5 х 106 кл/мл) помещали в культуральные флаконы (Greiner, Германия) и культивировали в стандартной ростовой среде α-MEM с добавлением 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 10% сыворотки плодов коровы (Биолот, Россия), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, США). Спустя 24 ч после посева первичной культуры неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся дважды промывали 0.01 М раствором PBS (Sigma, США) и проводили смену среды. В дальнейшем среду меняли через 3–4 сут в течение 14–15 сут. При достижении 90–95% конфлуентного монослоя, клетки пересевали по культуральным флаконам с использованием 0.25% раствора трипсина (Биолот, Россия) в 1 мМ ЭДТА (Биолот, Россия). Для получения культуры МСК из печени зародышей у беременных крыс иссекали рога матки и помещали их в охлажденную культуральную среду 199 5 (Sigma, США) с добавлением 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Под бинокулярной лупой извлекали зародыши, выделяли печень, приготовляли клеточную суспензию механическим дезагрегированием с помощью шприца с иглами уменьшающегося диаметра и фильтровали. Клеточную суспензию трижды отмывали ростовой средой α-MEM центрифугированием при ≈80g. После последнего центрифугирования клетки ресуспендировали. После подсчета в камере Горяева клеточную суспензию помещали в культуральные флаконы и культивировали по описанной выше методике для МСК из зрелого костного мозга. Индукция остеогенной дифференцировки МСК in vitro. Для индукции остеогенеза МСК 2–3-го пассажей культивировали в ростовой среде α-MEM с добавлением 10-8 M дексаметазона (Sigma, США), 50 мкг/мл фосфата аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия) и 10 мМ β-глицерофосфата (Sigma, США) (остеогенная среда) со сменой среды через 3–4 сут в течение 16–21 сут. Уровень экспрессии мРНК генов маркеров остеогенной дифференцировки оценивали каждые 2, 5, 7, 12, 16, 21 сут культивирования в контрольной (ростовая среда без добавления индукторов – контрольная культура/контроль) и остеогенной (остеогенная культура/опытная культура/опыт) средах. Индукция адипогенной дифференцировки МСК in vitro.Для индукции адипогенеза МСК 2–3 пассажей культивировали в ростовой среде с добавлением 10-6 М дексаметазона, 0.5 mM индометацина (Sigma, США) и 100 нг/мл инсулина (Sigma, США) (адипогенная среда) со сменой среды через 3–4 сут в течение 10–16 сут. Уровень экспрессии мРНК генов маркеров адипогенной дифференцировки оценивали каждые 3, 5, 7, 10 сут (МСК из костного мозга) и 2, 7, 12, 16 сут (МСК из печени зародышей) культивирования в контрольной (ростовая среда без добавления индукторов – контрольная культура/контроль) и адипогенной (адипогенная культура/опытная культура/опыт) средах. Гистохимические исследования. Для визуализации минеральных отложений во внеклеточном матриксе клетки окрашивали ализариновым красным S (Sigma, США) (Пирс, 1962). Активность щелочной фосфатазы оценивали с использованием набора “Alkaline Phosphatase Kit” (Sigma, США) по протоколу фирмы-производителя. Для визуализации жировых включений клетки окрашивали жировым красным О (Sigma, США) или смесью судана III и IV (Пирс, 1962). Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Гистохимические реакции анализировали с помощью микроскопа Olympus AH-3 (Япония). Иммуноцитохимические исследования. Иммунофенотипическую характеристику МСК проводили с применением антител к CD90 (Abcam, Великобритания), CD73 (BD Pharmingen. США), CD45 (BioLegend, США), CD34 (Santa Cruz, США) и CD144 (Abcam, Великобритания). В качестве положительных контролей для фенотипических маркеров кроветворных клеток CD45 и CD34 использовали отпечатки селезенки половозрелых крыс, для маркера эндотелиальных клеток CD144 – криостатные срезы селезенки этих же животных. Остеогенные потенции МСК изучали с помощью антител к белкам внеклеточного матрикса коллагену I типа (Sigma, США), остеокальцину (QED Bioscience, США), костному сиалопротеину (Chemicon, США) и фактору транскрипции Os6 terix (Abcam, Великобритания). Адипогенные потенции МСК изучали с помощью антител к ядерному рецептору PPARδ (Cayman Chemical, США) и маркеру зрелых адипоцитов ALBP (Abcam, Великобритания). Иммуноцитохимическую реакцию анализировали под микроскопом Leica DM RXA2 (Германия). Анализ изображения проводился с помощью компьютерной программы Image J. Молекулярно-генетические исследования. Выделение тотальной РНК из МСК осуществляли с помощью реактива TRI® Reagent (Sigma, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК проводили на тотальной РНК (5 мкг) с использованием обратной транскриптазы М-МLV и олиго(дТ)15 (Силекс, Россия). Предварительно тотальную РНК обрабатывали ДНКазой “Turbo” (Ambion, США) для исключения контаминации геномной ДНК. При конструировании праймеров использовалась программа DNAStar (США) и данные о структуре исследуемых генов, полученные из международной базы данных NCBI (США). Для исключения получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК праймеры конструировали на основе нуклеотидной последовательности из разных экзонов. Для количественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК была предварительно нормирована по GAPDH. ПЦР проводили на матрице кДНК с использованием ColoredTaq полимеразы (Силекс, Россия) и специфических праймеров (Литех, Россия) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler (Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофоретически в 1 %-ном агарозном геле (Amresco, США) с добавлением бромистого этидия (Sigma, США). Оценку интенсивности свечения ПЦР продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе (BIO-RAD, США) с помощью программы для анализа электрофоретического изображения QuantityOne (BIO-RAD, США). Статистическая обработка результатов исследования. Подсчет среднеквадратической (стандартной) ошибки среднего числа “костных узелков” на мм2 площади культурального флакона основан на экспресс-методе статистической обработки с использованием таблиц Стрелкова (Стрелков, 1999). Результаты исследования и их обсуждение Сравнительная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга. Для подтверждения принадлежности изучаемых клеточных популяций к системе МСК нами проведен сравнительный анализ экспрессии позитивных и негативных маркеров МСК на разных сроках их культивирования в соответствии с рекомендациями Международного общества клеточной терапии (Dominici et al., 2006). 7 В качестве негативных маркеров CD45 были выбраны следующие: общий лейCD11b 473 н.п. коцитарный антиген CD45, маркер ранCD19 них кроветворных предшественников 415 н.п. CD34, антиген В-лимфоцитов CD19, 348 н.п. CD144 маркер моноцитов/макрофагов и грану378 н.п. GAPDH лоцитов CD11b и маркер эндотелиаль(б) 1п 2п 3п ных клеток CD144. ИммунофлюоресCD45 403 н.п. центный анализ первичных культур из CD11b 473 н.п. костного мозга (КМ) и печени зароды415 н.п. CD19 шей (ПЗ) выявил примесь CD45- и CD144 348 н.п. CD34-иммунопозитивных клеток. С по378 н.п. GAPDH мощью ПЦР-анализа во всех исследованных культурах МСК на 1–2 пассаже Рис. 1. Данные ПЦР-анализа по эксдетектирована мРНК генов CD45, CD11b прессии генов негативных маркеров МСК CD45, CD11b, CD19 и CD144 в и CD144, что указывает на присутствие в клеточных популяциях из КМ (а) и ПЗ составе изучаемых популяций макрофа(б) на 1-ом (1п), 2-ом (2п) и 3-ем (3п) гов, лимфоцитов и эндотелиальных клепассажах. Справа обозначен молекуток на ранних этапах их культивировалярный вес фрагментов ПЦР-реакции в ния. В обеих культурах на 1-ом и посленуклеотидных парах (н.п.). дующих пассажах не обнаружена мРНК гена CD19. Начиная с 3-го пассажа, обе популяции МСК лишены примесей кроветворных и эндотелиальных клеток, что подтверждается не только данными иммуноцитохимии, но и ПЦР-анализа (рис. 1). Вероятно, в процессе пассирования происходит их элиминация, а созданные условия культивирования способствуют предпочтительному росту МСК. (а) 1п 2п 3п 403 н.п. В качестве позитивных маркеров МСК были выбраны следующие поверхностные антигены: мембранный гликопротеин CD90, экто-5’-нуклеотидаза CD73 и рецептор трансформирующего фактора роста β CD105. В начальные сроки культивирования (1–3 пассажи) практически все клетки популяции МСК из КМ положительно окрашивались на маркеры CD90 и CD73 (рис. 2, а, в). Маркер CD90 также выявлен почти во всех клетках популяции из ПЗ (рис. 2, б). Вместе с тем, поверхностный антиген CD73 был обнаружен лишь приблизительно в 60% клеток печеночного происхождения (рис, 2, г). Возможно, это связано с неодинаковым органным происхождением клеток, что, в свою очередь, может вносить свой вклад в фенотипическую характеристику МСК. Анализ динамики экспрессии фенотипических маркеров МСК на протяжении длительного срока культивирования выявил, что на 8–11-ом пассажах практически все клетки культуры МСК из КМ и ПЗ экспрессировали маркер CD90, что хорошо согласуется с данными ПЦР-анализа (рис. 3, а, б). Нами впервые показано, что экспрессия поверхностного антигена CD73 в культурах печеночных МСК 8–11-го пассажей сохранялась лишь в отдельных клетках, составляющих минорную субпопуляцию среди CD74-иммунонегативных клеток (рис. 3, в). 8 Рис. 2. Экспрессия поверхностных антигенов CD90 (а, б) и CD73 (в, г) в культурах МСК из зрелого КМ (а, в) и ПЗ (б, г) 3-го пассажа. а΄, б΄, в΄, г΄ - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. Рис. 3. Экспрессия поверхностных антигенов CD90 и CD73 в культурах МСК из КМ (а) и ПЗ (б, в) 11-го (а, б) и 9-го (в) пассажей. а΄, б΄, в΄ - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. Полученный результат находится в полном соответствии с данными ПЦРанализа (рис. 4). Снижение содержания мРНК гена CD73 также наблюдалось при долгосрочном культивировании МСК из зрелого КМ. С использованием специфических праймеров нами выявлено снижение уровня экспрессии еще одного гена – CD105, в обеих клеточных популяциях МСК (рис. 4). Итак, можно с определенностью утверждать, что анализируемые клеточные популяции характеризуются сходным фенотипом, а именно экспрессируют поверхностные антигены CD90, CD73 и CD105, что определенно доказывает их принадлежность к системе МСК и, начиная с 3-го пассажа, практически лишены примесей других типов клеток. 9 (а) 1п 2п 3п 8п 11п CD90 496 н.п. CD73 401 н.п. CD105 553 н.п. GAPDH 378 н.п. (б) 1п 2п 3п 9п 11п CD90 496 н.п. CD73 401 н.п. CD105 553 н.п. GAPDH 378 н.п. Рис. 4. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов позитивных маркеров МСК CD90, CD73 и CD105 в клеточных популяциях из КМ (а) и ПЗ (б) на 1-ом (1п), 2ом (2п), 3-ем (3п), 8-ом (8п), 9-ом (9п) и 11-ом (11п) пассажах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.). Молекулярно-генетический и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте. Оценка активности щелочной фосфатазы в колониях-клонах (КОЕ-ф) в первичных культурах МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга. В рамках выполненного исследования нами была проанализирована активность щелочной фосфатазы в колониях-клонах (КОЕ-ф) первичных культур МСК из двух источников. Этот фермент широко применяется в качестве маркера самых ранних предшественников остеогенных клеток. В большинстве колоний КОЕ-ф из КМ выявлялась высокая активность щелочной фосфатазы, тогда как в колониях печеночного происхождения количество клеток с положительной реакцией на фермент было существенно ниже. Полученный результат отражает крайне низкую степень коммитирования печеночных МСК в остеогенном направлении на стадии КОЕ-ф. Напротив, уже в составе первичной культуры костномозговых МСК присутствует достаточное число клеток, потенциально способных, по нашему мнению, к остеогенезу. Остеогенез в пассируемой культуре МСК из костного мозга. В культуре МСК из КМ 2–3-го пассажа остеогенез имел очаговый характер. Первые презумптивные очаги остеогенеза – участки скопления клеток с отложениями внеклеточного матрикса, появлялись уже на 10–12 сут эксперимента, что подтверждалось иммуноцитохимически с использованием антител к коллагену I типа и костному сиалопротеину (рис. 5). Слабое окрашивание ализариновым красным S культуры костномозговых МСК на 10-е сут инкубации в остеогенной среде свидетельствовало о начале минерализации внеклеточного матрикса в предполагаемых очагах остеогенеза (рис. 6, б). Максимальная активность щелочной фосфатазы также наблюдалась в пределах презумптивных очагов остеогенеза (рис. 6, г). 10 Рис. 5. Экспрессия коллагена I типа (Col I) (а) и костного сиалопротеина (BSP) (б) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 11- (а) и 12-е (б) сут инкубации клеток в остеогенной среде. а΄, б΄ - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. Рис. 6. Скопления соединений кальция и положительно окрашенных на щелочную фосфатазу (ЩФ) клеток (указаны стрелками) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 10-е сут инкубации в контрольной (а, в) и остеогенной (б, г) средах. а, б – окраска ализариновым красным S (Alizarin Red S). Ядра докрашены гематоксилином. На 16–21 сут культивирования в остеогенной среде уже полностью сформированы так называемые “костные узелки” – массивные скопления внеклеточного минерализованного матрикса и полигональных клеток, похожих на остеобласты. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к коллагену I типа и костному сиалопротеину выявило присутствие этих белков преимущественно в пределах “костных узелков”, где их количество было значительно выше, по сравнению с начальными сроками культивирования клеток в остеогенной среде (рис. 7). Рис. 7. Экспрессия коллагена I типа (Col I) и костного сиалопротеина (BSP) в “костных узелках” в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 16-е сут инкубации клеток в остеогенной среде. а", б", в" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а', б'). Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркера зрелых остеобластов остеокальцина выявил присутствие этого белка также преимущественно в пределах “костных узелков” (рис. 8). C помощью фазово-контрастной микроскопии показано, что клетки, экспрессирующие остеокальцин, обладали кубической или полигональной формой, а их ядра были смещены к периферии, т.е. по морфологии напоминали функционально зрелые остеобласты (рис. 8, а). Ни в 11 одной из контрольных культур экспрессия остеокальцина, костного сиалопротеина и коллагена I типа не обнаружена. Рис. 8. Экспрессия остеокальцина (ОС) в пределах “костных узелков” в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 16-е сут инкубации клеток в остеогенной среде. а – фазово-контрастная микроскопия; а" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. Минерализованный костный матрикс, хорошо заметный при фазовоконтрастной микроскопии (рис. 9, б), положительно окрашивался ализариновым красным S (рис. 9, г, е). Среднее число таких “костных узелков” составило 0.72 ± 0.17 на мм2 площади культурального флакона. Рис. 9. Участки минерализованной костной ткани (отмечены стрелками) в культуре МСК из КМ 2-го пассажа. 16 сут инкубации клеток в контрольной (а, в, д) и остеогенной (б, г, е) средах. а, б - фазово-контрастная микроскопия; в, г, д, е- окраска ализариновым красным S (Alizarin Red S); д, е – ядра докрашены гематоксилином. Кроме того, нами впервые выявлен ряд особенностей временного и топографического паттерна распределения фактора транскрипции Osterix в культуре МСК из КМ на разных сроках культивирования в остеогенной среде. Показано, что экспрессия этого фактора значительно усиливалась в местах предполагаемых очагов остеогенеза, когда сами очаги еще не были обособлены морфологически, и достигала максимального значения в окончательно сформированных “костных узелках” (рис. 10). 12 Рис. 10. Экспрессия фактора транскрипции Osterix (Оsx) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 2-е (а), 10-е (б) и 16-е (в) сут культивирования в остеогенной среде. а", б", в" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а', б', в'). Остеогенез в пассируемой культуре МСК из печени зародышей. В сравнимых экспериментальных условиях в культуре МСК из ПЗ наблюдались некоторые морфогенетические преобразования, отчасти напоминающие таковые в остеогенной культуре МСК из КМ. Уже к 10-ым сут инкубации в остеогенной среде клетки формировали скопления, сходные с “костными узелками” (рис. 11). Рис. 11. Фазово-контрастная микроскопия МСК из ПЗ на 10-е (а, б) и 16-е (в, г) сут культивирования в контрольной (а, в) и остеогенной (б, г) средах. Стрелками указаны участки скопления клеток, напоминающие “костные узелки”. Рис. 12. Экспрессия коллагена I типа (Col I) (а) и костного сиалопротеина (BSP) (б) в МСК из ПЗ 3-го пассажа. 14-е сут инкубации клеток в остеогенной среде. а΄, б΄ - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. 13 В пределах таких клеточных скоплений наблюдались массивные отложения межклеточного вещества, при этом сами клетки сохраняли фибробластоподобную морфологию. Иммунофлуоресцентный анализ выявил в клеточных скоплениях отложения коллагеновых волокон I типа и костный сиалопротеин (рис. 12). Под действием остеогенных индукторов в культуре МСК из ПЗ также происходило незначительное усиление экспрессии щелочной фосфатазы. Тем не менее, число клеток, положительно окрашенных на щелочную фосфатазу, а также интенсивность самой реакции, были заметно ниже, чем в МСК из КМ. Как известно, основным морфологическим признаком поздних этапов остеогенной дифференцировки in vitro является минерализация внеклеточного матрикса. Однако во всех исследованных культурах печеночных МСК гистохимически отложения кальция выявлены не были, за исключением крайне малочисленных положительно окрашенных ализариновым красным S участков (рис. 13). Среднее число таких участков было ничтожно мало и составило всего Рис. 13. Клеточные скопления в культуре 2х10-4 ± 0.28 на мм2 площади куль- МСК из ПЗ, напоминающие “костные узелки”. 16-е (а, б) и 21-е сут (в, г) культивироватурального флакона. ния клеток в контрольной (а, б) и остеогенВ клеточных скоплениях, напоми- ной (в, г) средах. Окраска ализариновым нающих “костные узелки”, остео- красным S (Alizarin Red S). Ядра докрашены кальцин также не обнаружен. гематоксилином. Иммуноцитохимическое окрашивание с использованием антител к Osterix выявило этот фактор лишь в единичных клетках опытной культуры МСК печеночного происхождения. Отсутствие кальцификации внеклеточного матрикса и экспрессии фактора транскрипции Osterix, а также сохранение клетками фибробластоподобной морфологии в пределах клеточных скоплений указывают на неспособность печеночных МСК в заданных условиях культивирования завершить терминальную фазу остеогенной дифференцировки. Полученные данные иммуноцитохимии и гистохимии подтверждены с помощью ПЦР-анализа. Максимальный уровень экспрессии генов остеокальцина OC и щелочной фосфатазы ALP в культуре МСК из КМ приходился на более поздние сроки культивирования клеток в остеогенной среде (9–16 сут эксперимента), что сопряжено с периодом накоплением соединений кальция во внеклеточном матриксе культуры. Напротив, в культуре печеночных МСК содержание мРНК этих генов оставалось крайне низким на протяжении всего эксперимента по индукции остеогенной дифференцировки, что еще раз указывает на неспособность этих клеток осуществлять минерализацию внеклеточного матрикса в созданных условиях in vitro (рис. 14). 14 (а) 2сут 5сут 9сут (б) 12сут 16сут 2сут 5сут 9сут 12сут 16сут ALP con 477 н.п. ALP ex OC con 273 н.п. OC ex GAPDH con 378 н.п. GAPDH ex Рис. 14. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов ОС и ALP в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ex) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.). Интересные результаты получены при изучении профиля экспрессии гена RUNX2 (рис. 15). В МСК из КМ на протяжении всего периода культивирования в остеогенной среде, за исключением начальных сроков (2–5 сут), отмечался высокий уровень экспрессии гена RUNX2. Вместе с тем, в популяции МСК печеночного происхождения содержание мРНК этого гена оказалось значительно ниже и не претерпевало существенных изменений на протяжении всего эксперимента. В обеих популяциях МСК также отмечен высокий уровень экспрессии генов коллагена I типа COL1A1 и остеопонтина OP (рис. 15). (а) 2сут 5сут 9сут (б) 12сут 16сут 2сут 5сут 9сут 12сут 16сут OP con 362 н.п. OP ex COL1A1 con 324 н.п. COL1A1 ex RUNX2 con 289 н.п. RUNX2 ex GAPDH con 378 н.п. GAPDH ex Рис. 15. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов RUNX2, COL1A1, OP в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ex) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.). Cледует обратить внимание, что остеопонтин, в отличие от маркера функционально зрелых остеобластов остекальцина, в основном экспрессируется незрелыми остеогенными клетками. Поэтому повышенное содержание мРНК гена OP в опытной культуре печеночных МСК не является достаточным признаком реализации программы остеогенной дифференцировки. Кроме того, остеопонтин считается одним из ключевых ингибиторов процесса минерализации внеклеточного матрикса. Возможно, высокий уровень содержания мРНК этого гена на протяжении всего срока культивирования МСК печеночного происхождения является одной из причин подавления процессов образования и роста кристаллов гидроксиапатита in vitro. 15 Молекулярно-генетический и морфологический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте. Появление первых жировых клеток в культуре МСК из ПЗ приходилось на более поздние сроки инкубации клеток в индукционной среде, а сама дифференцировка протекала менее интенсивно, чем в культуре МСК из КМ (рис. 16, 17). Рис. 16. Адипоциты с множественными липидными включениями в культуре МСК из КМ 2го пассажа. 10-е сут культивирования в контрольной (а, б, в) и адипогенной (г, д, е) средах. а, б, г, д – окраска суданом III и IV, ядра докрашены гематоксилином; в, е – фазовоконтрастная микроскопия. Рис. 17. Адипоциты с множественными липидными включениями в культуре МСК из ПЗ 2го (е) и 3-го (а–д) пассажей. 16-е сут культивирования в контрольной (а, г) и адипогенной (б, в, д, е) средах. а, б, в – окраска жировым красным О (Oil Red O); г, д, е – окраска суданом III и IV; ядра докрашены гематоксилином. 16 Интересно отметить, что в культуре печеночных МСК группы зрелых адипоцитов морфологически были обособлены от остальных клеток, сохраняющих фибробластоподобную морфологию и не содержащих липидные включения. Последние также обнаруживались и среди адипоцитов внутри группы (рис. 17, е). В контрольных культурах МСК из обоих органов дифференцированные адипоциты не выявлены (рис. 16, а–в, рис. 17, а, г), хотя единичные клетки с морфологией фибробластов содержали в цитоплазме мелкие суданофильные включения. При культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой среде 14–21 сут возможно появление спонтанной дифференцировки клеток в адипогенном направлении (рис. 18, а, б). Кроме того, формирование зрелых адипоцитов наблюдалось также в стандартной остеогенной среде (рис. 18, в, г). В последнем случае, жировые клетки выявлялись в непосредственной близости от очагов остеогенеза (рис. 18, г). Рис. 18. Мультилокулярные адипоциты при культивировании МСК из КМ 4-го (а, б) и 2-го (в, г) пассажей в стандартной ростовой среде (а, б) и в остеогенной среде (в, г) на 18-е (в) и 21-е (г) сут эксперимента. Стрелками указан очаг остеогенеза (красная стрелка) и зрелые адипоциты (желтые стрелки). а, б – фазовоконтрастная микроскопия; в – окраска суданом III и IV с докрашиванием ядер гематоксилином; г – окраска гематоксилин-эозином. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к фактору транскрипции PPARδ и маркеру зрелых адипоцитов ALBP на поздних сроках культивирования МСК из КМ (16-е сут эксперимента) выявило значительное усиление экспрессии перечисленных маркеров в опыте по сравнению с контролем (рис. 19). Следует отметить, что как в контроле, так и на ранних сроках культивирования костномозговых МСК в индукционной среде экспрессия ALBP преимущественно регистрировалась в ядрах (рис. 18, в). В ходе дальнейшей инкубации клеток в адипогенной среде цитоплазматическая локализация этого белка становилась более заметной (рис. 19, г). Ядерная локализация ALBP объясняется его ролью как транспортера жирных кислот в ядро клетки, где последние могут выступать в качестве специфических лигандов для ядерного рецептора PPARγ. Полученные результаты находятся в хорошем соответствии с имеющимися данными литературы, где также продемонстрирована преимущественная ядерная локализация белка 17 ALBP на ранних этапах дифференцировки преадипоцитов (Helledie et al., 2000, 2002). Рис. 19. Экспрессия фактора транскрипции PPARδ (а, б) и маркера зрелых адипоцитов ALBP (в, г) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 10-е сут культивирования клеток в контрольной (а, в) и опытной (б, г) средах. а΄, б΄, в΄, г΄ – совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. По данным иммунофлуоресцентного анализа содержание фактора транскрипции PPARδ лишь в отдельных МСК печеночного происхождения было сопоставимым с таковым в костномозговых МСК (указаны стрелками на рис. 20, б). Рис. 20. Экспрессия фактора транскрипции PPARδ (а, б) и маркера зрелых адипоцитов ALBP (в, г) в культуре МСК из ПЗ 3-го пассажа на 16-е сут культивирования клеток в контрольной (а, в) и опытной (б, г) средах. а΄, б΄, в΄, г΄ – совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI. На 16-е сут инкубации МСК из ПЗ в адипогенной среде содержание ALBP в клетках было значительно ниже по сравнению с МСК из КМ, т.к. белок, в основном, располагался в ядрах, за исключением некоторых клеток, в которых ALBP обнаруживался также и в цитоплазме (указаны стрелками на рис. 20, г). 18 Следующий этап работы посвящен изучению адипогенных потенций МСК на молекулярно-генетическом уровне. В МСК костномозгового происхождения максимальный уровень экспрессии генов PPARδ, PPARγ и ALBP приходился на 7–10 сут инкубации клеток в адипогенной среде, что совпадает по времени с возрастанием численности терминально дифференцированных адипоцитов в культуре (рис. 21, а). Отмечено также, что на 10-е сут культивирования МСК из КМ в контрольной среде содержание мРНК гена PPARγ было практически сопоставимым с таковым в опыте. Как известно, ядерный рецептор PPARγ обладает антимитотической активностью, которая обуславливает выход адипогенных клеток из клеточного цикла, что является обязательным условием их дальнейшей дифференцировки (Gregoire et al., 1998). По-видимому, достижение клетками контрольной культуры 100% конфлуентности к поздним срокам культивирования, а также присутствие в добавляемой к среде сыворотке различных цитокинов, являются достаточным условием для выхода ранних предшественников адипоцитов из клеточного цикла и дальнейшей реализации программы адипогенеза этими клетками. Данный процесс, возможно, сопровождается повышением уровня экспрессии гена PPARγ в клетках контрольной культуры. Косвенным доказательством присутствия в контроле преадипоцитов разной степени зрелости является спонтанная адипогенная дифференцировка, иногда наблюдаемая при культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой среде, т.е. без индукторов. На 7–10 сут культивирования костномозговых МСК в адипогенной среде также детектирована мРНК гена LEP, кодирующего гормон лептин (рис. 21, а). (а) 2 сут 5 сут (б) 7 сут 10 сут 2 сут PPARγ con 7 сут 12 сут 16 сут 455 н.п. PPARγ ex PPARδ con 405 н.п. PPARδ ex ALBP con 337 н.п. ALBP ex LEP con 271 н.п. LEP ex GAPDH con 378 н.п. GAPDH ex Рис. 21. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов PPARγ PPARδ, ALBP и LEP в культурах МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ex) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.). Напротив, более низкий уровень экспрессии гена ALBP, незначительное содержание мРНК гена PPARδ, а также практически полное отсутствие мРНК гена LEP в опытных культурах печеночных МСК полностью подтверждают результаты гистохимии и иммуноцитохимии, согласно которым адипогенные потенции этих клеток в заданных условиях культивирования выражены слабее (рис. 21, б). Вместе с тем отмечено, что на 16-е сут инкубации МСК из ПЗ в 19 адипогенной среде уровень экспрессии гена PPARγ увеличивался и становился сравнимым с таковым в МСК из КМ. Полученный результат свидетельствует о влиянии индукторов адипогенеза на дифференцировочный статус МСК печеночного происхождения. В совокупности, полученные экспериментальные данные позволяют заключить: исследованные клеточные популяции из двух кроветворных органов, печени зародышей и зрелого костного мозга, отвечают критериям МСК, однако их остеогенные и адипогенные потенции в сравнимых экспериментальных условиях культивирования неодинаковы, что, вероятно, объясняется разными программами развития этих клеток в онтогенезе. Выводы 1. МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга обладают сходным иммунофенотипом, т.е. экспрессируют специфические поверхностные антигены CD90, CD73, CD105. 2. В обеих клеточных популяциях МСК, начиная с 8-го пассажа, наблюдается снижение экспрессии CD73 и CD105, что, возможно, является признаком клеточного старения. 3. МСК из печени зародышей, в отличие от МСК из зрелого костного мозга, под влиянием индукторов остеогенеза не способны к реализации терминальных этапов остеогенной дифференцировки, несмотря на некоторые морфологические преобразования. 4. Временной и топографический характер распределения ключевого регулятора остеогенной дифференцировки Osterix в культуре МСК из зрелого костного мозга свидетельствует о строгой привязанности экспрессии этого фактора транскрипции к презумптивным и сформированным очагам остеогенеза in vitro. 5. Под влиянием остеогенных индукторов в МСК из зрелого костного мозга заметно повышалось содержание мРНК генов ОС, ALP и RUNX2, тогда как в МСК из печени зародышей уровень экспрессии перечисленных генов оставался сравнительно низким. 6. Адипогенная дифференцировка МСК из печени зародышей выражена слабее по сравнению с таковой МСК из костного мозга, что проявляется в невысокой численности зрелых адипоцитов, более позднем их формировании, а также в менее интенсивной экспрессии фактора транскрипции PPARδ и маркера зрелых адипоцитов ALBP. 7. Под влиянием адипогенных индукторов в МСК из печени зародышей отмечали пониженное содержание мРНК гена ALBP, крайне низкий уровень экспрессии гена PPARδ, а также отсутствие мРНК гена LEP, в сравнении с выраженной экспрессией указанных генов в МСК из зрелого костного мозга. 20 СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Паюшина О. В., Старостин В. И. 2008. Сравнительная характеристика мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних этапах культивирования. Известия РАН. Серия биол. №2: 156–162. Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Молекулярногенетические основы регуляции остеогенной дифференцировки мезенхимных стромальных клеток. Известия РАН. Серия биол. №.3: 261–271. Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Сравнительная иммунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных стромальных клеток из дефинитивных и транзиторных кроветворных органов. Доклады Академии Наук. 422 (№2): 265–267. Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Молекулярногенетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остеогенных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс. Цитология. 51 (в печати). Тезисы конференций: Кожевникова М.Н., Паюшина О.В., Микаелян А.С. Морфогенетические преобразования мезенхимных стромальных клеток (МСК) крыс в ранние и поздние сроки культивирования // Симпозиум с международным участием “Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза”. Москва, 9–11 октября 2007. Сборник тезисов, стр. 83–84. Кожевникова М.Н., Старостин В.И., Микаелян А.С. Анализ адипогенной и остеогенной дифференцировок мезенхимных родоначальных клеток костного мозга и эмбриональной печени крысы in vitro // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2007, 38(4): 315. Кожевникова М.Н., Паюшина О.В., Микаелян А.С. Сравнительная характеристика мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних пассажах // Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Цитология, 2007, 49(9): 756–757. Кожевникова М.Н., Микаелян А.С., Старостин В.И. Сравнительная иммунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных стромальных клеток из дефинитивных и эмбриональных кроветворных органов // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2008, 39(4): 314– 315. 21 Кожевникова М.Н., Микаелян А.С. Молекулярно-генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля и остеогенных потенций мезенхимных стромальных клеток из печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11–15 мая 2008. Сборник тезисов, стр. 217. Кожевникова М.Н., Микаелян А.С., Старостин В.И. Сравнительный молекулярно-генетический и гистохимический анализ адипогенных потенций мезенхимных стромальных клеток из зародышевой печени и зрелого костного мозга крыс // XV Школа “Актуальные проблемы биологии развития”. Звенигород, 19– 24 октября 2008. Сборник тезисов, стр. 41. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 06-0448209), гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ – 1134.2008.4. 22
