ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХАТ-СОДЕРЖАЩИХ НЕЙРОНОВ

Международный Научный Институт "Educatio" III (10), 2015
150
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХАТ-СОДЕРЖАЩИХ НЕЙРОНОВ
В ЭКТОПИЧЕСКИХ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТАХ НЕОКОРТЕКСА И СПИННОГО МОЗГА КРЫС
Петрова Елена Сергеевна
Канд. биол. наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF ChAT-NEURONS IN THE ECTOPIC NEUROTRANSPLANTS OF NEOCORTEX
AND SPINAL CORD
Petrova E.S., Senior Researcher of the FSBSI “Institute of Experimental Medicine”, St. Petersburg
АННОТАЦИЯ
Цель исследования состояла в изучении холинергических нейронов в нейротрансплантатах, развивающихся в
условиях пересадки в поврежденный нерв крысы. Фрагменты дорсолатеральной стенки переднего мозгового пузыря и
спинного мозга эмбрионов крыс 14-15 сут развития пересаживали субпериневрально в поврежденный нерв взрослых
животных. С помощью применения иммуногистохимического ферментного маркера было установлено, что через 28
сут после пересадки в трансплантатах формируются отдельные ХАТ-содержащие нейроны. В трансплантатах
неокортекса формируется значительно меньше холинергических нейронов, чем в трансплантатах спинного мозга, что
характерно и для нормального онтогенеза крысы.
ABSTRACT
The aim of this investigation was to study of formation of cholinergic neurons in the embryonic rat neocortex and spinal
cord allografts developing into damage nerve. In the present study, the fragments of the wall of the anterior cerebral vesicle and
spinal cord of Wistar rat embryo (E14-15) were transplanted into the crushed sciatic nerve of adult rats. Twenty-eight days after
surgery the neurons of grafts were identified by the following immunohistochemical markers: NeuN and ChAT. The individual
ChAT-immunoreactive cells were detected in the grafts. In contrast to the grafts of spinal cord the neocortex grafts contained
little cholinergic cells. This is typical of normal ontogeny.
Ключевые слова: иммуногистохимия; нейротрансплантация; нерв; холинацетилтрансфераза
Keywords: immunohistochemistry; neurotransplantation; nerve; choline acetyltransferase
Предыдущие исследования показали, что трансплантация эмбриональных закладок ЦНС в периферический нерв взрослых крыс является удобной моделью для
изучения гистогенеза эмбриональных закладок мозга [см.
обзор: 7]. В настоящее время для исследования гистогенетических процессов в развивающихся органах нервной системы широко применяются иммуногистохимические методы выявления, дифференцирующихся нервных и глиальных клеток с помощью специфических маркеров [1-4;
6; 13]. Иммуногистохимические маркеры позволяют идентифицировать нервные и глиальные клетки на разных стадиях дифференцировки, а также выявлять зрелые нейроны
разной медиаторной принадлежности.
В последние годы отечественными и зарубежными
исследователями активно разрабатываются экспериментальные подходы для стимуляции регенерации периферических нервных проводников с помощью применения различных стволовых клеток [5, 12, 14, 15]. Некоторым исследователям удалось выявить благоприятное влияние на
регенерацию нерва эмбриональных закладок спинного
мозга [16]. Однако судьба пересаженных клеток-предшественников и закономерности их дифференцировки изучены недостаточно. Относительно их медиаторной принадлежности имеются лишь единичные работы
[8, 9, 12,14].
Наименование
маркера
Ядерный
антиген нервных
клеток NeuN
Холина-цетилтрансфераза (ХАТ)
Цель настоящей работы - изучение холинергических нейронов в нейротрансплантатах эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга крыс, развивающихся в условиях пересадки в поврежденный нерв крысы.
Материал и методы
Работа выполнена на крысах Вистар массой 200250 г (n=15). При содержании и умерщвлении животных
руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977г.). У эмбрионов крыс 14-15 сут развития выделяли фрагменты дорсолатеральной стенки переднего мозгового пузыря, содержащие закладку неокортекса, и спинной мозг в области
шейного отдела и трансплантировали под периневрий одного из стволов седалищного нерва взрослой крысы по
описанной ранее методике [11]. Через 28 сут после операции выделяли сегменты седалищных нервов с трансплантатами и фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [2].
После обезвоживания фиксированного материала и заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 5 мкм и
проводили иммуногистохимические реакции для выявления нервных клеток. Для выявления нейронов применяли
антитела к NeuN и ХАТ, характристика которых представлена в Таблице 1.
Характеристика маркеров, использованных в работе
Разведение
Первичные
Характеристика
Первичных
антитела
маркера
антител
Моноклональные
Маркер зрелых
мышиные антитела, клон
1:400
нейронов
А60; Chamicon, США
Поликлональ-ные козьи
Фермент синтеза ацеантитела (номер по кататилхолина, содержится
1:250
логу AB144, Chemicon,
в холинергических
США)
нейронах
Таблица 1
Ссылка
на источник
[2,4,10]
[3]
Международный Научный Институт "Educatio" III (10), 2015
151
Для выявления NeuN в качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора EnVision+System
Labbeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания).
При проведении иммуногистохимической реакции на
ХАТ для выявления комплекса антиген-антитело применяли вторичные антикозьи биотинилированные антитела
(разведение 1:200, номер по каталогу Е0466, Dako, Дания)
и стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой
(«Str/HRP» из набора LSAB 2 System-HRP, Dako, Дания)
[3]. Часть срезов окрашивали толуидиновым синим. Препараты исследовали под микроскопом Leica DM750. Часть
срезов окрашивали толуидиновым синим. Препараты исследовали под микроскопом Leica DM750, фотосъемку
выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия).
Результаты и их обсуждение
Фрагменты эмбриональных закладок ЦНС крысы
выживают после пересадки в поврежденный нерв, а пересаженные клетки-предшественники дифференцируются в
нейроны и глиоциты. Нейротрансплантаты через 28 сут
после пересадки легко определяются в толще нерва
(рис.1,а). Они состоят из большого числа нервных и глиальных клеток и содержат кровеносные сосуды, врастающие в трансплантат из тканей реципиента. Подробное гистологическое описание таких трансплантатов выполнено
в наших предыдущих работах [7-9; 11].
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
В настоящем исследовании с помощью применения иммуногистохимического маркера ядерного антигена
NeuN показано, что нейротрансплантаты через 28 сут содержат большое число зрелых нейронов (рис. 1,б).
С помощью иммуногистохимической реакции на
ХАТ установлено, что часть нейронов трансплантатов как
спинного мозга, так и неокортекса являются ХАТ-иммунопозитивными (рис.1,в). В трансплантатах спинного
мозга они располагаются одиночно, не образуя характерных для передних рогов спинного мозга крысы скоплений.
Плотность расположения ХАТ-содержащих клеток в
трансплантатах неокортекса значительно меньше, чем в
трансплантатах спинного мозга. Это связано с тем, что в
неокортексе крыс субпопуляция холинергических вставочных нейронов невелика. В области моторной коры
ХАТ-содержащие отдельные нервные клетки встречаются
во всех слоях и имеют небольшие размеры, биполярную
форму и длинные отростки, направленные перпендикулярно к поверхности мозга. Вопрос о функциях, которые
выполняют холинергические нейроны в неокортексе, до
конца не ясен. Предположительно они моделируют взаимоотношения других нейронов, участвуют в регуляции
кровотока и принимают участие в процессах созревания
нейронов неокортекса в онтогенезе [13].
Рис.1. Фрагменты трансплантатов
эмбриональных закладок неокортекса(а,б) и спинного мозга(в) через 28 сут после пересадки в седалищный нерв
взрослой крысы Т – трансплантаты; Н – ткани нерва реципиента.
Окраска толуидиновым синим (а), иммуногистохимические реакции на NeuN (б) и ХАТ (в). Ув.: х100(а,б); х400 (в)
Международный Научный Институт "Educatio" III (10), 2015
152
Следует отметить, что в трансплантатах эмбриональных закладок ЦНС, развивающихся в нерве, число холинергических нейронов значитльно меньше, чем в
неокортексе и спинном мозге, развивающихся in situ. Повидимому, нарушение клеточных взаимоотношений после
трансплантации, изменение миграции клеток-предшественников в ранние сроки после операции, гибель части
предшественников, отсутствие свойственных исследованным отделам ЦНС афферентных и эфферентных связей
приводит к тому, что после пересадки к изученному сроку
число холинергических нейронов невелико.
Выводы.
1. В тканевых трансплантатах эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга крысы, развивающихся в поврежденном нерве, через 28 сут после
пересадки формируется большое число NeuN-иммунопозитивных нейронов.
2. Установлено, что отдельные нейроны трансплантатов являются холинергическими и содержат холинацетилтрансферазу. При этом сохраняется закономерность, свойственная нормальному онтогенезу:
число ХАТ-иммунопозитивных клеток в трансплантатах неокортекса значительно меньше, чем в
трансплантатах спинного мозга.
Список литературы
1. Колос Е.С. Цитохимическая характеристика клеток
спинномозгового ганглия крысы на разных сроках
эмбрионального развития. Материалы II Всероссийской научной конференции молодых ученых
«Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» // Медицинский академический журнал. –
2012. – (Приложение). – C. 158-161.
2. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Петрова Е.С., Карпенко М.Н., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Гиляров А.В. Теоретические основы и
практическое применение методов иммуногистохимии (руководство) / под ред Д.Э. Коржевского.
Санкт-Петербург, 2014. (2-е издание, исправленное
и дополненное). – 119с.
3. Коржевский, Д.Э.; Григорьев, И.П.; Кирик, О.В.;
Зеленкова, Н.М.; Сухорукова, Е.Г. Метод иммуноцитохимического выявления холинергических
нейронов в центральной нервной системе лабораторных животных // Морфология. – 2013. – Т. 144.
– №6. – С. 69-72.
4. Коржевский, Д.Э.; Петрова, Е.С.; Кирик, О.В.; Безнин, Г.В.; Сухорукова, Е.Г. Нейральные маркеры,
используемые при изучении дифференцировки
стволовых клеток // Гены и клетки. – 2010. – V.5. –
№3. – P. 57-63.
5. Масгутова Г.А., Масгутов Р.Ф., Салафутдинов
И.И., Шульман А.А., Журавлева М.Н., Галлямов
А.Р., Богов А.А., Богов А.А., Ризванов А.А. Стиму-
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы при ксенотрансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
жировой ткани человека // Гены и клетки. – 2014. –
Т.9. – №3.
6. Обухов Д. К. Современные представления о развитии, структуре и эволюции неокортекса конечного
мозга млекопитающих животных и человека // Вопросы морфологии XXI века. Выпуск 1. / Под редакцией доктора медицинских наук С. В. Костюкевича. — СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова, Издательство ДЕАН, 2008. – С.200-223.
7. Петрова Е.С. Изучение гистогенетических и нейродегенеративных процессов в нервной системе с помощью гетеротопической нейротрансплантации //
Морфология. – 2009. – Т. 136. – № 6. – С. 8-19.
8. Петрова Е.С., Отеллин В.А. NADPH-d-положительные нейроны в гетеротопических трансплантатах
эмбриональных закладок ЦНС // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. – 2000. – Т. 130. – № 12.
– С. 688-691.
9. Петрова, Е.С.; Отеллин, В.А. НАДФН-диафоразапозитивные нервные клетки в гетеротопических
трансплантатах спинного мозга // Онтогенез. –
2000. – Т. 35. – №2. – C. 118-123.
10. Сухорукова Е.Г. Ядерный белок NeuN в нейронах
черного вещества головного мозга человека // Морфология. – 2013. – Т. 143. – № 2. – С. 78-80.
11. Чумасов Е.И., Петрова Е.С. Имплантация эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга в
поврежденный периферический нерв взрослой
крысы // Бюл. экспер. биол. – 1990. – Т.108. – №8. –
С.198-201.
12. Baez, J.C.; Gajavelli, S.; Thomas, C.K.; Grumbles,
R.M.; Aparicio, B.; Byer, D.; Tsoulfas, P. Embryonic
cerebral cortex cells retain CNS phenotypes after
transplantation into peripheral nerve // Exp. Neurol. –
2004. – V. 189. – №2. – P. 422-425.
13. Consonni, S.; Leone, S.; Becchetti, A.; Amadeo, A.
Developmental and neurochemical features of
cholinergic neurons in the murine cerebral cortex //
BMC Neuroscience. – 2009. – V. 10. – P.18.
14. Grambles, R.M.; Almeida, V.W.; Thomas, C.K..
Embryonic neurons transplanted into the tibial nerve
reinnervate muscle and reduce atrophy but NCAM
expression persists // Neurol. Res. – 2008. – V. 30. –
№2. – С. 283-289.
15. Lopatina T., Kalinina N., Karagyaur M., Stambolsky
D., Rubina K., Revischin A., Pavlova G., Parfyonova
Y., Tcachuk V. Adipose-derived stem cells stimulate
regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by
these cells promotes nerve healing and axon growth de
novo // PLoS ONE. – 6: e17899.
16. Xiong G., Ozaki N., Sugiura Y. Transplanted
embryonic spinal tissue promotes severed sciatic nerve
regeneration in rats // Arch. Histol. Cytol. – 2009. – V.
72. – №2. – Р. 127-138.
ПОИСК IN SILICO ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ РРНК-КЛАСТЕРА STREPTOMYCES
GLOBISPORUS 1912-2
Полищук Людмила Васильевна
Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
SEARCH IN SILICO OF SEQUENCE OF STREPTOMYCES GLOBISPORUS 1912-2 rRNA-CLUSTER
Polishchuk Ludmila, Сandidate of science, senior scientific researcher, Institute of microbiology and virology by D.K.
Zabolotnogo of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev.