Методические рекомендации для аспирантов
advertisement
ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТфилиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра биологии и физиологии М.В. Черников, М.А. Оганова МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ «МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ РЕЦЕПЦИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ» ОПОП «ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ» (подготовка научно-педагогических кадров) НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 30.06.01 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА учебный план 140603_78-123(4)-3486 ПЯТИГОРСК 2015 2 ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТфилиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра биологии и физиологии М.В. Черников, М.А. Оганова МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ «МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ РЕЦЕПЦИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ» ОПОП «ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ» (подготовка научно-педагогических кадров) НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 30.06.01 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА учебный план 140603_78-123(4)-3486 ПЯТИГОРСК 2015 3 УДК 615.03(078) ББК 52.81 я 53.0157.8 Ч 49 Рецензент: профессор кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии, докт. биол. наук Погорелый В.Е. М.В. Черников, М.А. Оганова Ч 49 Методические рекомендации по освоению дисциплины «Молекулярные основы рецепции фамакологических агентов». Образовательная программа «Фармакология, клиническая фармакология». Направление подготовки 30.06.01 Фундаментальная медицина / М.В. Черников, М.А. Оганова. – Пятигорск: ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ, 2015. – 68 с. Методические рекомендации разработаны в соответствии с рабочей программой дисциплины «Молекулярные основы взаимодействия фармакологических агентов» учебного плана 140603_78-14-123(4)-3486 (научная специальность 14.03.06 Фармакология клиническая фармакология, направление подготовки 30.06.01 Фундаментальная медицина) для очного и заочного отделения УДК 615.03(078) ББК 52.81 я 53.0157.8 Печатается по решению ЦМК ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава РФ ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ, 2015 4 1.1 Тема: Правила работы с лабораторными животными стандарты GLP ЦЕЛЬ: изучить основные правила работы с лабораторными животными ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ: 1. Фиксация крысы 2. Наркозаци крыс 3. Способы введения исследуемых и лекарственных веществ крысам 4. Способы забора крови у крыс 5. Эвтаназия крыс 6. Фиксация морских свинок 7. Наркотизация морских свинок. 8. Способы введения исследуемых и лекарственных веществ морским свинкам 9. Способы забора крови у морских свинок 10. Эвтаназия морских свинок 11. Фиксация кроликов 12. Наркотизация кроликов 13. Способы введения исследуемых веществ кроликам 14. Способы взятия крови у кроликов 15. Эвтаназия кроликов ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ 1. ФИКСАЦИЯ КРЫСЫ Взятие крысы для переноса в другую клетку. Для переноса небольших крыс , а так же агрессивных крыс, взять за хвост ближе к основанию и вынуть из клетки содержания. Не держать животное долго на весу, т.к. это его стрессирует. Для переноса большого животного взять его в руки непосредственно в клетке, охватив рукой (бережно, но достаточно крепко) грудную клетку. При переносе придерживать хвост и задние лапы второй рукой. Фиксация в руке для выполнения манипуляций. Взять крысу за основание хвоста и вынуть из клетки содержания; поместить животное на поверхность стола или на крышку клетки. Больших не агрессивных животных вынимать из клетки содержания, охватив за грудную клетку рукой, придерживая тело снизу. Не держать крысу за хвост на весу длительное время, т. к. это стрессирует животное. Охватить рукой грудную клетку, фиксирую одну или обе передние лапы между мальцами руки. Придерживать хвост и задние лапы. 5 Фиксация в руке для выполнения манипуляций. Взять крысу за основание хвоста и вынуть из клетки содержания; поместить животное на крышку клетки содержания, на поверхность стола или дать зацепиться ей ха халат, посадив на рукав или впереди на халат. Несильно, но уверенно придерживать животное к поверхности стола, держа за шкуру на спине, и собрать шкуру в руку, тем самым, обездвиживая животное. Придерживать хвост другой рукой или зажать его между пальцами той же руки. Этот способ фиксации удобен для введения веществ зондом, т.к. максимально расправляет шею и пищевод, а также для внутрибрюшных инъекций, т.к. позволяет натянуть кожу на брюхе. Метод Камилы Накинуть сверху на крысу тканую салфетку. Зафиксировать животное, охватывая рукой грудную клетку поверх салфетки. Метод позволяет зафиксировать агрессивных и возбужденных животных. Фиксация в специальном устройстве для выполнения технических манипуляций. Способ используется для внутривенной инъекции в хвостовую латеральную вену и для взятия крови из хвостовой вены. Подготовить специальный бокс для фиксации крыс. Достать животное из клетки, поместить его на ровную поверхность перед открытым боксом, мягко направить крысу в бокс, придерживая ее за хвост. Закрыть бокс. 2. НАРКОЗАЦИ КРЫС Для длительного обездвиживания наркотизированных крыс привязывают к операционному столику или к специальному станку. Ингаляционный наркоз у крыс с осторожностью можно проводить при помощи этилового эфира. Животное помещают под небольшой колпак, в камеру или эксикатор, куда кладут ватку, смоченную эфиром, и следят за наступлением наркоза. При помещении крыс (или мышей) в эксикатор или камеру для предотвращения удушья в них следует подавать воздух или кислород. При выполнении операций на сердце, легких, аорте крысы должны находиться на искусственном дыхании и у них проводят эндотрахеальный наркоз. Техника интубации трахеи у мелких лабораторных грызунов (хморских свинок, крыс и мышей), приспособления и устройства для ведения искусственного дыхания и эндотрахеального наркоза описаны А.X. Коганом (1978). Неингаляционный наркоз вызывают подкожным или внутрибрюшинным введением этаминала (внутрибрюшинно 40—50 мг/кг), барбамила (подкожно — 50—80 хмг/кг), хлоралгидрата (200—250 мг/кг) и других наркотиков. 3. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ КРЫСАМ Оральное введение Для введения в организм белой крысы порошкообразных веществ приготавливают пилюли, смешивая исследуемые вещества с мукой, хлебом или растворяя их в молоке. Пилюли дают подопытным крысам, рассаженным в 6 отдельные клетки. Если животные отказываются поедать пилюли или молоко с примешанными препаратами, прибегают к принудительному введению при помощи зонда. Успокоенную крысу берут левой рукой за кожу в области затылка таким образом, чтобы большой палец находился у угла рта крысы. Левой ладонью слегка прижимают животное к столу и обездвиживают. Голову крысы кладут на левую сторону. Большой палец отодвигают кверху и назад, открывают при этом рот и начинают вводить резиновый зонд диаметром 2—3 мм, предварительно смоченный глицерином. Зонд должен идти над языком, по возможности ближе к щекам. Если продвижение зонда встречает препятствие, то его следует вынуть и вновь попытаться ввести. Вместо резинового зонда удобно пользоваться металлическим, изготовленным из иглы для шприца. Для этого острый конец иглы стачивают и на него напаивают головку из олова. Полученный зонд следует слегка дугообразно изогнуть. Введение металлического зонда в желудок крысы не является затруднительным. Приученных к этой манипуляции крыс левой рукой удерживают за кожу в области затылка, придав им положение головой вверх. Большим и указательным пальцами натягивая щеки, открывают крысе рот. Металлический зонд, надетый на шприц и находящийся в правой руке, начинают вводить по задней стенке глотки, затем голову животного слегка опрокидывают кверху и назад (для этого указательным пальцем левой руки натягивают кожу головы в области затылка или между ушами), а зонд продвигают по ходу пищевода. Когда головка зонда находится в области шейного изгиба, то наружный конец его следует немного опустить (рис. 1). Обычно зонд проходит свободно и его введение не сопровождается осложнениями. Необходимо тщательно следить, чтобы головка зонда не имела острых выступов. Рисунок 1. Внтурижелудочное введение веществ атравматичным зондом. 7 Внутрибрюшинное введение Фиксированную крысу опускают вниз головой. Кожу живота каудальнее пупка берут в складку и у его основания прокалывают брюшную стенку, держа иглу перпендикулярно. В дальнейшем проводят иглу по ходу складки и производят инъекцию. Взятие брюшной стенки живота в складку и введение иглы по направлению складки предохраняют от повреждения иглой внутренние органы. Внутривенное введение. Внутривенные инъекции производят в боковую вену хвоста тонкой иглой. Животное фиксируют одним из описанных способов. Для расширения вен хвост протирают ваткой, смоченной теплой водой, или опускают в теплую воду (45— 55 0C). Место укола высушивают и дезинфицируют. Хвост удерживают пальцами левой руки, а в правой держат шприц. Помощник сдавливает вену у корня хвоста. Прокол делают по возможности периферичнее, причем игла должна идти поверхностно по ходу вены. Если инъецированная жидкость не встречает сопротивления и в месте нахождения кончика иглы не отмечаются вздутия под кожей, то это указывает, что игла находится в сосуде (рис. 2). Рисунок 2. Фиксация крысы для внутривенного введения веществ Для проведения инъекций у крыс используют иглы толщиной 0,45 мм. 4. СПОСОБЫ ЗАБОРА КРОВИ У КРЫС У крыс небольшое количество крови удается взять из ушных раковин. Для этого помощник левой рукой фиксирует крысу, крепко зажимая конечности, а большим и указательным пальцами натягивает кожу шеи, сдавливая сосуды этой области и создавая застой крови и гиперемию ушных раковин. Из ушной раковины возможны повторные заборы крови через 3—5 суток. Содержание эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарная формула крови при повторных взятиях крови из ушной раковины крыс остается без изменений, в то время как при повторных взятиях крови после ампутации кончика хвоста из-за возникающей воспалительной реакции увеличивается число лейкоцитов. Для забора крови из бедренной или яремной вен крыс подвергают наркозу. 8 Для получения больших количеств крови прибегают у взрослых крыс к пункции хвостовой вены. Хвост обогревают теплой водой, дезинфицируют; вену сдавливают у корня хвоста, вводят в сосуд иглу и шприцем отсасывают кровь. Нередко ДЛЯ взятия крови обрезают кончик хвоста, после чего собирают кровь, вытекающую из раны. Из кончика хвоста удается получить значительное количество крови, вакуумно отсасывая ее. Однако, чтобы взять кровь из вен хвоста, не обязательно отрезать его кончик. Для этого достаточно острой бритвой сделать надрез кончика хвоста наискось, по спирали. Такая рана менее травматична, она быстро заживает.Кровь из бедренной вены берут под наркозом. Вену отпрепаровывают, вскрывают. Из вскрытого сосуда кровь накопляется в ране. После взятия крови рану тампонируют и зашивают. Весьма удобно брать кровь у крыс, а также у других мелких лабораторных животных из ретробульбарного венозного сплетения при помощи пастеровской микропипетки (кончик пипетки должен быть слегка заточенным и иметь в диаметре не более 1 мм). Для этого наркотизированную крысу захватывают левой рукой за кожу шеи большим и указательным пальцами, а другими пальцами надежно удерживают за кожу спины. Микропипетку берут в правую руку. Концом пипетки пробуравливающими движениями прокалывают конъюнктиву внутреннего угла глаза и проводят ее на глубину 1—2 мм за глазное яблоко, где находится венозное сплетение. При правильном введении в капилляр микропипетки из ретроорбитального сплетения самотеком поступает кровь. При необходимости взять, большое количество крови следует натянуть кожу в области шеи, чтобы сдавить яремные вены и создать венозный застой, т.е. повысить венозное давление в ретроорбитальном венозном сплетении (рис. 3). При взятии крови из венозного сплетения глазницы необходимо следить, чтобы в пипетку не попала слезная жидкость. Описанный способ прост, позволяет брать кровь при хронических наблюдениях. Редко возникают осложнения в виде повреждения глаза и его слепоты. Рисунок 3. Забор крови из ретроорбительного сплетения Пункция сердца У наркотизированного животного выстригают шерсть в области предполагаемого укола и дезинфицируют кожу. Пальпаторно определяют место 9 конечного толчка сердца. На 1 см краниальнее от установленной точки, отступив на 1—2 мм от левого края грудины, делают укол, держа иглу вертикально. Пункцией сердца у крупных крыс удается получить до 6—8 мл крови. При пункции сердца лучше пользоваться вакуумным методом отсасывания крови (Лущенко, 1961). Пункцию проводят не чаще одного раза в неделю. После взятия крови подкожно вводят 0,9 %-й раствор хлорида натрия. 5. ЭВТАНАЗИЯ КРЫС Под термином эвтаназия понимают акт гуманного умерщвления без причинения боли, страха и дистресса. Для эвтаназии лабораторных грызунов широко средства химические и физические методы. К простым приемлемым физическим методам относится декапитация. Эвтаназии подвергаются: - животные в эксперименте для посмертного исследования и/или получения биологического материала - животные после окончания эксперимента, не пригодные для дальнейших исследований - животные по клиническим показаниям, испытывающие сильную боль или страдание Реактивы и расходные материалы: Резиновые перчатки, хирургические ножницы (при наличии гильятина) Меры безопасности: Процедура является безопасной для лабораторного персонала при надлежащей технике выполнения. Риск в ходе выполнения процедуры возможен в случае недостаточной фиксация животного (возможен укус). Если процедура эвтаназии выполняется в соответствии с протоколом исследования для получения биологического материала или окончания эксперимента и не возможности дальнейшего использования животных, то она не требует специальной регистрации, по данной дате проводиться оформление ряда рабочих листов по некропсии. В случае преждевременной эвтаназии по решению руководителя эксперимента процедура оформляется соответствующим протоколом. Процедура: Проверьте наличие и соответствие ярлыков на клетках животных и убедитесь в необходимости эвтаназии именно этих животных; Зафиксируете животное в руке для манипуляции. Хирургическими ножницами резким движением отсеките голову, полностью перерезав спиной мозг. В случае необходимости сбора крови, соберите истекающую кровь в заранее подготовленную пробирку (с антикоагулянтом или без него). Используйте трупы животных согласно протоколу исследования или утилизируйте их в установленном порядке. 6. ФИКСАЦИЯ МОРСКИХ СВИНОК Морские свинки в обычной обстановке спокойные, но при воздействии различных внешних раздражителей весьма пугливые и легко возбудимые животные. 10 Обычно фиксация морских свинок не представляет затруднения. Помощник левой рукой удерживает животное за спину и под грудь так, чтобы большой и указательный пальцы охватывали шею, а другие пальцы обездвиживали передние конечности и ограничивали движения головы. Правой рукой снизу он удерживает заднюю часть тела и обездвиживает задние конечности. Фиксированной таким образом морской свинке придают нужное положение (рис. 4). Если нужно фиксировать морскую свинку на длительное время, то ее привязывают к станку или операционному столику. Рисунок 4. Фиксация морских свинок 7. НАРКОТИЗАЦИЯ МОРСКИХ СВИНОК. Для наркоза морской свинки применяют с осторожностью этиловый эфир. Животное помещают в камеру или эксикатор, куда кладут ватку, смоченную наркотиком. В целях предотвращения удушья в камеру (эксикатор) следует подавать воздух или кислород. Вызвав таким образом неглубокий наркоз, привязывают животное и через маску продолжают вводить наркотик ингаляционным путем. Хлоралгидрат лучше вводить вместе о одним из наркотических анальгетиков (с промедолом). Для наркоза могут быть использованы также и другие нелетучие наркотики; гексенал, тиопентал, уретан. 8. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ МОРСКИМ СВИНКАМ Оральное введение. Помощник фиксирует морскую свинку в руках, удерживая ее головой вверх и прижимая спину животного к своей груди. В рот животного вставляют кляп, сквозь отверстие которого продвигают резиновый зонд. Перед введением зонда его необходимо смазать глицерином или жидким вазелином. Жидкости или взвеси порошкообразных веществ морским свинкам можно вводить металлическим зондом (игла от шприца, у которой сточен острый край и напаяна головка из олова), не пользуясь услугами помощника (рис. 5). 11 Рисунок 5. Фиксация морской свинки для внутрижелудочного введения Жидкости можно вводить и без зонда, постепенно вливая их в рот пипеткой или из чайной ложечки. Измельченные твердые вещества примешивают к корму. Интраназальное введение В полость носа через тоненький катетер можно ввести 0,2—0,4 мл исследуемого раствора. Ректальное введение. Перед введением производят очистительную клизму. При помощи резинового катетера, конец которого необходимо смазать вазелиновым маслом, в полость прямой кишки вводят теплый раствор. Кожное введение. Животное фиксируют в руках таким образом, чтобы задние конечности были вытянутыми. Скарификационной иглой или скальпелем на плантарной части задней конечности наносят царапины, после чего апплицируют инфекционный материал, 12 Внутрикожное введение. Местом внутрикожного введения может служить участок кожи в области спины и живота, лишенный шерсти. Удобным местом также является плантарная поверхность задних конечностей. Подкожное введение. Перед тем как произвести инъекцию, полагается выстричь шерсть и кожу продезинфицировать спиртом или йодом. Подкожное введение производят в области спины, в один из боков или в области живота (на спине кожа очень толстая и прокол следует проводить прочной иглой). Перед проколом кожу необходимо взять в складку и у ее основания вводить иглу. Внутримышечное введение. Чаще всего инъекцию производят в мышцы бедра. Внутрибрюшинное введение. Помощник удерживает фиксированное в руках животное вниз головой и прижимает его к груди. Экспериментатор пальцами левой руки берет в складку кожу живота каудальнее пупка и у основания этой складки прокалывает брюшную стенку, проводя иглу параллельно направлению складки. Момент попадания иглы в брюшную полость ощущается как внезапное исчезновение препятствия. Внутривенное введение. Луи Гийон (1931) предложил производить внутривенные введения самцам морских свинок, а также крыс и мышей в v. dorsalis penis. Автор указывает на удобства и несомненные превосходства введений жидкостей в кровоток этим способом по сравнению с инъекциями в другие вены. А. Карлсон (1959) вторично описал способ введения морским свинкам жидкостей в сосуды полового члена. Инъекции проводятся следующим образом: привязывают животное к станку (операционному столику) животом вверх, обнажают половой член от крайней плоти, помощник пережимает пальцами вену полового члена у ее основания, после чего она становится заметной, а экспериментатор вводит тоненькую иглу в сосуд. Внутривенное введение растворов можно проводить в подкожную вену голени. Для этого находящееся под легким эфирным наркозом животное фиксируют спиной вверх, ножницами Купера срезают кожу по ходу вены выше скакательного сустава и отпрепаровывают ее от окружающей ткани. Вену сдавливают жгутом или помощник пережимает ее пальцами выше отпрепарированного участка. В вену вводят тоненькую иглу. Перед инъекцией насасыванием крови в шприц убеждаются, находится ли она в полости сосуда, после чего производят введение жидкости. Вводимый раствор при этом легко выдавливают из шприца. Если окружающие вену ткани начинают набухать, это свидетельствует о том, что игла вышла из сосуда или прошла сквозь его стенки. Под наркозом внутривенные введения можно производить в бедренную или наружную яремную вены. Иногда у отдельных животных при наличии хорошо выраженных вен уха можно в них вводить испытуемые растворы. Для этой цели пользуются очень тонкой иглой. 13 9. СПОСОБЫ ЗАБОРА КРОВИ У МОРСКИХ СВИНОК Взятие небольших количеств крови можно проводить после нанесения насечек на край уха или прокола ступни. Для предупреждения быстрого свертывания крови ушную раковину покрывают тонким слоем парафина. Получить большое количество крови у ненаркотизированных животных можно по методу Г.В. Федорова (1961). На лапке в области кисти бритвой делают разрез и просовывают ее сквозь резиновую манжетку в толстостенную пробирку (гусек), из которой вакуумным насосом откачивают воздух. Кровь собирается на дне пробирки. Таким способом легко удается получить 1—4 мл крови, не подвергая опасности жизнь подопытного животного. Вакуумным насасыванием можно получить кровь из ушной вены. Кровь у наркотизированных морских свинок, как и у других лабораторных животных, можно брать из пещеристого синуса. Для этого во внутренний угол глаза, между орбитой и глазным яблоком, проводят иглу вдоль кости в горизонтальном направлении и шприцем насасывают кровь (Г. Ребигер). Пункция сердца Манипуляцию проводят под наркозом. Перед пункцией выстригают шерсть и дезинфицируют кожу. Местом пункции служит второе межреберье слева на 1—1,5 см краниальнее от конца processus xiphordeus. От левого края грудины отступают на 2 мм и вертикальным уколом прокалывают грудную клетку. Если игла находится в желудочке сердца, то при потягивании поршня кровь поступает в полость шприца. Если в шприц поступают пузырьки воздуха или серозной жидкости, это указывает, что игла находится в легких. В таких случаях иглу нужно вытянуть несколько назад. Пункцией сердца у крупных морских свинок можно получить до 10—12 мл крови. Забор следует производить не чаще одного раза в неделю При пункции сердца морской свинки кровь можно получать вакуумным способом, описанным Т.А. Луценко (1961). В.H. Зильфян и В.А. Кумкумджян (1970) рекомендуют следующий метод взятия крови у мелких лабораторных животных. Указательным и большим пальцами левой руки, одетой в перчатку для предохранения от укусов, животное берут за мягкие ткани дорсальной части шеи так, чтобы кожа несколько натянулась, и фиксируют животное в вертикальном положении. Таким образом создается застой венозной крови в области головы. Животное при этом открывает полость рта (нужно следить, чтобы при чрезмерном натягивании кожи не вызвать удушья). Сухим марлевым тампоном, зажатым в пинцет, насухо вытирают нижние резцы, десны и слизистую нижней губы. После этого бритвой или скальпелем производят неглубокий надрез наружной поверхности десны между резцами, затем анатомическим пинцетом оттягивают нижнюю губу, что способствует образованию полости, в которой собирается вытекающая из раны кровь. После взятия крови рану обрабатывают спиртом, кровотечение быстро останавливается. Описанным способом у крыс, морских свинок одновременно можно взять до 2—3 мл крови, а у мышей и хомячков — до 1 мл. После взятия крови из десны не отмечалось нарушения здоровья у животных, раны быстро заживали. 14 Картина крови, взятой предлагаемым методом, не отличается от картины крови у того же животного, взятой из хвоста. Метод позволяет брать кровь многократно и в необходимых количествах. 10. ЭВТАНАЗИЯ МОРСКИХ СВИНОК Морских свинок умерщвляют гильотинированием, хлороформом, эфиром (вводя их ингаляционно, внутрибрюшинно и в толщу легких), а также пропусканием электрического тока от городской сети через головной и спинной мозг. 11. ФИКСАЦИЯ КРОЛИКОВ Кролики отличаются от других лабораторных животных своим спокойствием и относительно слабым сопротивлением при фиксации. Привязывают их к специальным станкам или вивисекционным столам таким же образом, как кошек и собак. Следует иметь в виду, что при сильном запрокидывании головы у кроликов легко возникает смерть от удушья. Помощник может фиксировать кролика двумя руками, удерживая его левой рукой за кожу спины в области затылка, а правой — в области крестца или за задние конечности. Удобен способ фиксации кроликов с помощью индивидуального ящика (бокса) с круглой прорезью в передней стенке или специального иммобилизационного станка. При этом голову животного выводят сквозь отверстие передней стенки наружу, а туловище размещают внутри станка (клетки, ящика; рис. 6). С помощью вставной дощечки можно сокращать внутренние размеры бокса в зависимости от величины животного. Рисунок 6. Фиксация кроликов Фиксировать кролика можно и другими способами. Опеленать его туловище и конечности полотенцем или куском прочной материи или, сидя на 15 стуле, зажать задние конечности животного между ног, а левой рукой удерживать за кожу в области спины или за голову, правая рука остается свободной для манипуляций. Для вживления электродов в головной мозг кроликов используют специальный стереотаксический аппарат, надежно фиксирующий голову животного. При выполнении экспериментальных работ на органе зрения можно воспользоваться устройством для фиксации кроликов и других животных, предложенным Э.М. Мироновой и соавт. (1976). Оно состоит из внешней и внутренней «труб» и позволяет надежно закрепить туловище и голову животного при свободном доступе к глазам. В качестве роторасширителя для кроликов, при необходимости введения им желудочного зонда, Н.И. Ложкин (1968) рекомендует использовать преобразованный винтовой лабораторный зажим прямоугольной формы (рис. 7). К нижним поверхностям подвижной и неподвижной рамок зажима приклеивают две пластинки из органического стекла толщиной 5 мм (верхняя) и 19 мм (нижняя). На верхней поверхности подвижной пластинки и нижней поверхности неподвижной сделаны овальные углубления размером 2—3 мм для резцовых зубов соответственно верхней и нижней челюстей кролика. Фиксированному кролику шпателем приоткрывают рот, вставляют роторасширитель со сближенными верхней и нижней пластинками таким образом, чтобы верхние и нижние резцы попали в овальные углубления. Поворотом гайки увеличивают расстояние между рамками до максимального раскрытия полости рта. Резиновый зонд при использовании данного роторасширителя можно вводить без посторонней помощи. Рисунок 7. Винтовой лабораторный зажим 16 12. НАРКОТИЗАЦИЯ КРОЛИКОВ Кролики весьма чувствительны к хлороформу и быстро погибают от него. Небольшими концентрациями этилового эфира можно вызвать неглубокий наркоз. Для получения глубокого наркоза эфир следует добавлять небольшими порциями, осторожно. Необходимо помнить, что при одновременной даче большой дозы эфира может наступить остановка дыхания и смерть. Лучше пользоваться смесью эфира с кислородом. Кролики хорошо переносят уретановый наркоз. Уретан вводят по 0,6—1 г на 1 кг массы внутрибрюшинно и внутримышечно (20— 40 %-й раствор). Хлоралгидрат вводят в виде 10—12 %-го раствора внутривенно в дозе 100— 150мг/кг или ректально в дозе 300—500 мг/кг. Смесь хлоралгидрата с одним из наркотических анальгетиков (промедолом, фентонилом, дроперидолом) вводят внутримышечно. Для воспроизведения наркоза используют также барбитураты кратковременного (гексенал, тиопентал) и среднего (этаминал, барбамил) действия. 13. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ КРОЛИКАМ Оральное введение Оральное введение лекарственных или исследуемых веществ в виде растворов или водных взвесей производят с помощью тонкого эластичного зонда (резинового катетера) с применением кляпа. Фиксированное животное удерживают головой вверх. Один конец резинового зонда смачивают вазелином или глицерином и вводят в полость рта через отверстие вставленного за зубы кляпа. Голову при этом слегка запрокидывают назад. Продвижение зонда по пищеводу обычно не вызывает затруднений. Через воронку или шприц, прикрепленный к другому концу зонда, жидкость вливают в желудок. Перед началом введения нужно проконтролировать, не находится ли зонд в трахее, для чего его следует пережать; если кролик начинает задыхаться, значит зонд находится не в пищеводе, а в трахее. Тонкий резиновый зонд можно вводить в желудок через нос. Для введения препаратов в желудок выгодно пользоваться ушным металлическим катетером, одетым на шприц. Положение кролика при этом должно быть таким же, как при введении зонда. Изогнутый конец ушного катетера вводят в полость рта до тех пор, пока он не упрется в область задней стенки глотки. Постепенно вводят содержащуюся в шприце жидкость, которую кролик легко заглатывает. При таком способе введения мы не наблюдали осложнений в виде попадания жидкости в трахею. Порошкообразные вещества можно давать кроликам с натертой морковью или свеклой. Интраназальное введение Голову кролика, находящегося под легким наркозом, приподнимают носом кверху. В полость носа вводят тоненький пуговчатый зонд или мочевой катетер, соединенный с шприцем. 17 Ректальное введение Предварительно освобождают ампулу прямой кишки от фекальных масс, для чего ставят очистительную клизму. При помощи мочевого катетера, введенного в прямую кишку на глубину 4—5 см, вводят исследуемый раствор, подогретый до температуры тела животного. Кожное введение На кожу спины, живота, освобожденную от волосяного покрова, наносят царапины скарификационной иглой или наждачной бумагой. На подготовленный участок кожи апплицируют исследуемый материал или препарат. Внутрикожное введение Местом внутрикожной инъекции может быть участок кожи спины или живота, освобожденный от шерсти с помощью депилятора. Тонкой иглой в толщу кожи вводят исследуемый раствор до образования вздутия, напоминающего лимонную корку. Подкожное введение Перед инъекцией выстригают шерсть в области предполагаемого укола и дезинфицируют кожу раствором йода или эфиром. Пальцами левой руки берут кожу в складку и у ее основания делают прокол. Подкожные введения кролику лучше производить в бок или в области спины. Внутримышечное введение Перед уколом выстригают шерсть и дезинфицируют кожу. Инъекцию производят в мышцы бедра. Внутрибрюшинное введение Инъекцию производят в задней трети живота, несколько отступив от срединной линии. В месте предполагаемого укола выстригают шерсть и кожу дезинфицируют раствором йода или спиртом. Пальцами левой руки берут в складку брюшную стенку и у основания ее делают прокол, направляя иглу параллельно складке. Можно прокалывать брюшную стенку вертикальным проколом, но тогда острый конец иглы следует сточить. Во время внутрибрюшинного введения голова животного должна находиться ниже туловища, чтобы внутренние органы и кишки сместились к диафрагме. Внутривенное введение Инъекцию производят в краевую ушную вену, которая проходит по тонкому краю уха на наружной его поверхности. По ходу вены выстригают или выщипывают шерсть. Ухо слегка массируют или протирают спиртом (иногда ксилолом) для создания усиленного кровообращения. Помощник пережимает вену у основания уха, экспериментатор берет ухо кролика в левую руку и правой вводит иглу шприца в полость сосуда. Прокол вены следует начинать по возможности ближе к верхушке уха, так как при частых инъекциях возможна облитерация сосуда в месте укола, но при этом сохраняется неповрежденным проксимальный участок вены. После прокола вены иглу, находящуюся в 18 сосуде, фиксируют между большим и указательным пальцами левой руки. После этого помощник прекращает сдавливать вену, а экспериментатор, держа шприц в правой руке, производит инъекцию. Взрослым кроликам допустимо вводить внутривенно до 20 мл жидкости, но при введении больших доз необходимо вести контроль за дыханием и работой сердца. Под наркозом внутривенные инъекции кроликам можно проводить в наружную яремную и бедренную вены. Для проведения инъекций кроликам использут иглы толщиной 0,5—0,65 мм. 14. СПОСОБЫ ВЗЯТИЯ КРОВИ У КРОЛИКОВ Небольшие количества крови можно получить путем надреза или прокола краевой вены уха. Проколы следует делать на мелких ветвях ушной вены, начиная с верхушки уха. Для получения 2—5—10 мл крови наружную поверхность уха покрывают тонким слоем жидкого парафина и ухо с внутренней стороны протирают ксилолом, после чего прокалывают или надрезают вену и вытекающую кровь собирают в пробирку. Под наркозом кровь у кролика можно брать после отсепарирования и вскрытия бедренной или наружной яремной вены. Максимальное количество крови получают после вскрытия общей сонной артерии, причем перерезанный сердечный конец сосуда вставляют в колбочку, в которую вытекает кровь, а на мозговой конец накладывают лигатуру. Этим путем у взрослого кролика можно получить 50—70 мл крови и сохранить ему жизнь. Для этого после кровопускания перевязывают сердечный конец артерии, из которой вытекала кровь, зашивают рану и сразу же под кожу или внутрибрюшинно вводят 100— 150 мл физиологического раствора, подогретого до 37 °С. Пункция сердца Манипуляцию лучше производить под наркозом. Место предполагаемого укола освобождают от шерсти и дезинфицируют. Указательным пальцем, смазанным настойкой йода, определяют сердечный толчок и прокалывают грудную клетку, отступив 2—3 мм от левого края грудины. Прокол обычно производят в третьем межреберье. Иглу вводят на глубину 2—2,5 см. При попадании иглы в полость желудочка в шприце появляется кровь, которая самотеком или при постепенном вытягивании поршня заполняет его полость. Пункцией сердца удается получить 25—30 мл крови. Т.А. Луценко (1961) предлагает вакуумный способ отсасывания крови при кардиопункции у кроликов и других мелких лабораторных животных. Автор указывает, что, применяя этот способ, можно получить от взрослого кролика 60—70 мл крови и сохранить ему жизнь. После взятия крови парентерально вводят теплый 0,9 %-й раствор поваренной соли в двойном объеме от взятой крови. 15. ЭВТАНАЗИЯ КРОЛИКОВ Кроликов умерщвляют нанесением удара по основанию черепа, чаще всего — держа их за задние конечности вниз головой. Однако лучше пользоваться внутривенным введением хлороформа, эфира или воздуха, а также пропусканием электрического тока из городской сети через спинной и головной мозг (один электрод в виде зажима Пеана накладывают на угол рта, а 19 другой в виде иглы вводят под кожу в области крестца). Время воздействия тока — 3—5 с. Приложение 1 Максимально допустимые количества жидкости (в мл) для некоторых видов лабораторных животных в зависимости от пути введения Оценочные средства. Вопросы для собеседования 1. Описать основные методы фиксации крыс, кроликов и морских свинок. 2. Описать способ забора крови у крыс из подъязычной вены. Для каких исследований такой способ забора крови является оптимальным. 3. Какой максимальный объем жидкости можно ввести внутрижелудочно крысам, кроликам и морским свинкам. 4. Какой максимальный объем жидкости можно ввести внутривенно крысам, кроликам и морским свинкам. 5. Описать оральный способ введения веществ крысам. Продемонстрировать навыки на интактном лабораторном животном. 6. Описать внутривенный способ введения веществ Продемонстрировать навыки на интактном лабораторном животном. крысам. 7. Описать внутрибрюшинный способ введения веществ крысам. Продемонстрировать навыки на интактном лабораторном животном. 8. Охарактеризовать основные лабораторных животных. методы эфтаназии мелких и . средних 20 1.2 ТЕМА: Правила работы с оборудованием для исследования рецепторной активности биологически активных веществ. 1.3. ТЕМА: Методология изучения рецепторной активности. ЦЕЛЬ: Изучить основные методы in vitro исследований на изолированных органах и тканях веществ агонистов и антагонистов рецепторов. Изучить СОП по работе с лабораторными животными, правила наркотизации, забоя, вскрытия, извлечения внутренних органов. ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ 1. Освоить основные навыки работы с комплектом оборудования для изучения рецепторной активности фармакологических агентов на изолированных органах. 2. Освоить навыки извлечения участка подвздошной кишки морской свинки (крысы) и регистрации ее спонтанных сокращений. 3. Освоить навыки изучения рецепторной активности агонистов рецепторов. 4. Освоить навыки изучения рецепторной активности антагонистов рецепторов. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ: 1. Изучить правила работы с комплексом оборудования для работы на изолированных органов "Ugo Basil" согласно прилагаемой инструкции. 2. Приготовить физиологический раствор Тироде. состав раствора: натрия хлорид 8,0 г, калия хлорид 0,2 г, кальция хлорид 0,2 г, магния хлорид 0,1 г, гидрокарбонат натрия 1,0, дигидрофосфат натрия 0,05, глюкоза 1,0 на 1 л дистиллированной воды. 3. Согласно СОП по работе с лабораторными животными выполнить следующие манипуляции: 3.1. Приготовить препарат изолированной подвздошной кишки морской свинки (крысы) 21 Условия 1. В опыте всегда лучше использовать животных одной породы, пола и веса, содержащихся в постоянных воспроизводимых условиях. 2. Вес тела должен составлять 200-350 г и не отклоняться более чем на 10% в пределах группы. 3. Кишечник должен быть пуст. Для этого животных лишают пищи за 24 ч до эксперимента. Инструменты: 1. большие 14 см хирургические ножницы для вскрытия брюшной полости и маленькие 9 см для препарирования. 2. один большой и один маленький пинцеты, а также изогнутый зубной пинцет 11см 3. две чашки с физиологическим раствором Тироде. В первой чашке просвет отрезка кишки промывают и опорожняют с помощью 20 мл шприца с канюлей. 4. затем отрезок кишки переносят в другую чашку (с целью сохранения охлаждают до +2 +4оС. Препарирование: 1. Животное забивают нанесением удара в затылок и обескровливанием перерезкой сонной артерии или декапитацией. 2. Брюшную полость вскрывают от лонного сочленение до грудины при помощи ножниц. 3. Для того, чтобы найти подвздошную кишку, проще всего сначала отыскать слепую, которую легко отличить, так как она значительно толще, чем тонкие кишки. 4. Продвигаясь вдоль слепой кишки, найдите ее левый (по отношению к животному) конец, в области которого она сразу же переходит в гораздо более тонкую ободочную кишку . 22 5. На 1-2 сл правее по отношению к животному ( в направлении к началу желудочно-кишечного тракта) расположено место перехода подвздошной кишки в слепую. 6. 40-сантиметровый отрезок подвздошной кишки препарируется выше илеоцекального клапана. 7. Осторожно освободить участок кишечника от окружающих тканей. 8. Поместить отрезок в теплый раствор Тироде при температуре 37 оС. 9. Отпрепарированный участок может храниться при температуре +2 +4оС до 24 часов. 3.2. Зафиксировать участок кишки в камере устройства. 3.3. Зарегистрировать спонтанные сокращения гладкой мускулатуры с помощью программного обеспечения устройства в течение 2 минут с помощью изотонического датчика. 4. Записать схему исследования агонистов рецепторов. Схема исследования веществ, обладающих агонистическим действием на рецепторы Продолжительн Процедура Реакция Цикл ость, с экспери мета Добавить стандартный 1 30 1 агонист в концентрации ЕС 50 Экспозиция Субмаксимальное 29 сокращение Отмывание Частичное расслабление 30 5 210 с 30 25 Перерыв Возвращение к исходной линии 5 Отмывание 205 Перерыв Возвращение к исходной линии Держится на исходном уровне 1 Добавить стандартный агонист в концентрации ЕС 50 Экспозиция 29 2 Субмаксимальное сокращение 23 30 5 Отмывание 25 Перерыв 1 29 Добавить испытуемое вещество Экспозиция 5 Отмывание 25 Перерыв 5 Отмывание 205 Перерыв 270 270 Повторить цикл 1 и 2 270 270 Повторить цикл 3 270 270 Повторить цикл 1 и 2 Частичное расслабление Возвращение к исходной линии Отмывание Возвращение к исходной 210 с 5 линии Перерыв Держится на исходном 205 уровне Повторить один или два раза, при необходимости - несколько раз 30 30 210 с 3 Субмаксимальное сокращение Частичное расслабление Возвращение к исходной линии Возвращение к исходной линии Держится на исходном уровне Такая же амплитуда как и в цикле 1 и 2 Амплитуда сокращений изменяется пропорционально концентрации испытуемого вещества Такая же амплитуда как и в цикле 1 и 2 Продолжать исследование, чередуя циклы 5, 6. 5. Записать схему исследования антагонистов рецепторов. Схема исследования веществ, обладающих антагонистическим действием на рецепторы В связи с тем, что антагонисты не оказывают влияния на биологические системы непосредственно, то антагонистическая активность биологически активных веществ оценивается по степени изменения реакции системы на агонист в присутствии антагониста. 24 Продолжите Процедура льность, с 30 30 210 29 Добавить стандартный агонист в концентрации ЕС 50 Экспозиция 5 Отмывание 25 Перерыв 5 Отмывание 205 Перерыв 1 270 Повторить цикл 1 30 1 29 30 1 29 30 5 25 210 5 205 270 270 Добавить стандартные агонист в концентрации ЕС 50 Экспозиция Реакция Субмаксимальное сокращение Частичное расслабление Возвращение к исходной линии Возвращение к исходной линии Держится на исходном уровне Амплитуда сокращения и сходный уровень те же, что и в цикле 1 Цикл экспери мета 1 2 3 Держится на исходном уровне Добавить стандартные агонист в концентрации ЕС 50+ стандартный агонист в концентрации ЕС50 Экспозиция Амплитуда сокращений значительно меньше, чем в цикле 1 и 2 Отмывание Частичное расслабление Перерыв Возвращение почти к исходной линии Отмывание Возвращение к исходной линии Перерыв Держится на исходном уровне Повторить цикл 1, пока Такая же амплитуда 4 амплитуда сокращений не станет как в цикле 1 такой же, как при первой пробе 25 30 1 29 30 1 29 30 5 25 210 5 205 270 270 300 300 Добавить испытываемое вещество Экспозиция Добавить стандартный агонист в концентрации ЕС50 Экспозиция 5 Состояние препарата держится на исходном уровне Части Амплитуда сокращения меньше, чем в 1 и 2 и возможно, меньше, чем в цикле 3 Отмывание Частичное расслабление Перерыв Возвращение почти к исходной линии Отмывание Возвращение к исходной линии Перерыв Держится на исходном уровне Повторить цикл 1 до тех пор, Такие же амплитуды 6 пока амплитуда сокращений не сокращения и станет такой же , как при 1-й исходный уровень, пробе как в цикле 1 Повторить цикл 5, уменьшая или Степень угнетения увеличивая концентрацию сокращения антагониста, каждый раз чередуя изменяется циклы 5 и 6 пропорционально концентрации испытуемого вещества 26 6. Заполнить протокол эксперимента Образец протокола эксперимента Опыт № Число Время Экспериментальная модель Животное Вид_______________________ Линия_________________________ Пол _______________________ Вес ___________________________ Препарирование Орган_____________________ Вес органа _____________________ Физиологический раствор Нагрузка Тип________________________ Температура_____________________ Вещества Агониты________________ Антагонисты________________________ Испытуемое вещество_________________________________________ Объем вводимого раствора_____________________________________ Растворитель ________________________________________________ Вещество Примечания: Конец опыта: Время Доза Тонус гладкой мускулатуры кишечника Опыт(V2-V1) Примечания Подпись__________________ 7. По результатам эксперимента на основе полученных данных производится расчет значений ЕС 50 для агонистов рецепторов и значений ЕС 50 и рА2 для антагонистов рецепторов. Расчеты производятся с использованием программы Excel. 27 Приложение На рисунке 1 приведен пример вида кривой сокращений гладкой мускулатуры кишечника при введении ацетилхолина гидрохлорида в концентрации ЕС 50. Обсчет данных проводится автоматически с использование интерфейса программного обеспечения. Рисунок 1. Изменение тонуса гладкой мускулатуры кишечника при введении ацетилхолина гидрохлорида в концентрации ЕС 50. Оценочные средства Вопросы для собеседования 1. Дать определение понятиям ЕС 50, рА2. 2. Описать принцип определения агонистической и антагонистической активности биологически активных веществ. 3. Описать принцип работы оборудования для исследования рецепторной активности на изолированных тканях. 4. Назвать основные рецепторы изолированного кишечника, предсердий и матки, а также стандартные агонисты и антагонисты холинорецепторов, гистаминовых рецепторов и серотониновых рецепторов. 5. Описать механизмы реализации действия лигандов на холинорецепторы, гистаминовые и серотониновые рецепторы. 28 1.4. ТЕМА: Методология поиска новых биологически активных фармакологических веществ с рецепторной активностью. Методология исследования зависимости "структура-активность" ЦЕЛЬ: Изучить методология поиска новых биологически активных фармакологических веществ с рецепторной активностью. Методология исследования зависимости "структура-активность" в различных классах химических веществ, направленного синтеза и скрининга фармакологических веществ. ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ 1. Методология поиска новых биологически активных фармакологических веществ с рецепторной активностью среди природных и синтетических соединений, продуктов биотехнологии, генной инженерии и других современных технологий на экспериментальных моделях патологических состояний. 2. Экстраполяция фармакологических параметров с биологических моделей на человека. 3. Методология исследования зависимости "структура-активность" в различных классах химических веществ, направленного синтеза и скрининга фармакологических веществ. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ: 1. Изучить основные методологические подходы поиска новых биологически активных фармакологических веществ на основе блока информации, приведенного ниже. Блок информации Основные направления в компьютерном моделировании биологической активности веществ Стратегия поиска биологически активных молекул во многом определяется тем, известны или нет трехмерные структуры молекулыбиолиганда и рецептора-мишени. При этом более ценным является знание структуры рецептора, позволяющее проводить прямое моделирование (непрямое базируется на сравнительном анализе структурных особенностей активных и неактивных соединений). Таблица отражает возможные сочетания знаний о структуре лиганда и рецептора и основные подходы к разработке лекарственных веществ (ЛВ) в каждом из случаев. Кратко охарактеризуем названные методы. 29 Прямое моделирование – один из наиболее эффективных подходов при поиске ЛВ. Это неудивительно, поскольку в его рамках воссоздается структура лиганд-рецепторного комплекса с оценкой конформаций и взаимного сродства. Докинг-процедуры оценивают комплементарность известных структур данному активному центру. Для поиска удобно использовать имеющиеся обширные базы данных известных соединений. Разработано множество программных пакетов для практической реализации этого подхода. Основные методологические трудности докинга связаны с учетом конформаций лиганда, гибкости рецептора и построением оценочной функции.В методах de novo структура целевых молекул воссоздается путем постепенного конструирования на основе небольших фрагментов, помещаемых в активный сайт рецептора, путем минимизации энергии отталкивания групп (стерический фактор) и максимизации энергии связывания. Используемые компьютерные процедуры строят гипотетические структуры, которые должны обладать высоким сродством к рецептору. Недостатками этой методологии являются относительно невысокая надежность оценки сродства лигандов к связыванию (тенденция к предсказанию ложных активных молекул) и слишком общие правила построения молекул (значительная доля генерируемых структур не может быть синтезирована на практике. Непрямые подходы базируются преимущественно на построении зависимостей «структура – активность» (Quantitative Structure – Activity Relationship (QSAR)) и фармакофорном моделировании. При фармакофорном анализе предполагается, что основной вклад в лиганд-рецепторное взаимодействие вносят некоторые функциональные группы, поэтому их можно считать ответственными за взаимосвязь структуры и активности. Чаще всего в качестве таких структурных элементов рассматриваются потенциальные доноры и акцепторы при реализации водородных и координационных связей. Как правило, анализ включает два этапа: выявление фармакофорных групп и пространственное совмещение активных конформаций ряда молекул или их силовых полей для лучшего понимания ключевых структурных особенностей. К настоящему времени разработано значительное количество программ для практической реализации данного подхода. Очевидно, что применение фармакофорного моделирования будет расширяться с появлением новых сведений о лигандрецепторных комплексах, усовершенствованием силовых полей молекулярной механики и методов учета сольватации, интеграцией с другими подходами. QSAR применяют в моделировании биологической 30 активности уже более 40 лет. В последнее время наметилась тенденция перехода от использования простых статистических корреляций к применению физически интерпретируемых дескрипторов и методик, подобных CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis, или 3D QSAR), использующих совмещение полученных с помощью подходящего «химического зонда» трехмерных силовых полей соединений, проявляющих конкретный вид биологической активности. Представленные в обзорах данные показывают, какой широкий круг лигандов, рецепторов и их свойств вовлечен в моделирование. Область применения 3D QSAR может быть существенно расширена при условии преодоления несовершенства алгоритмов суперпозиции молекул, а также за счет использования ориентационно инвариантных дескрипторов. Для более детального ознакомления с описанными методами можно рекомендовать ряд обобщающих работ. Модернизация ключевых этапов процесса разработки лекарственных средств Вопросами конструирования ЛВ занимается медицинская химия. Несмотря на относительную молодость этой области естествознания, здесь уже сложились определенные понятийный аппарат и методология, о чем свидетельствует появление монографий. Область интересов медицинской химии составляют поиск и создание биологически активных веществ на основе выявления взаимосвязи «структура – активность» и решения обратной задачи – конструирования структур с заданным свойством. Как отмечалось ранее, основной вклад в оптимизацию процесса разработки ЛС можно внести на стадии доклинических испытаний. Традиционно в доклинической фазе создания ЛВ выделяют следующие ключевые этапы: идентификацию и валидацию мишени, поиск соединения-лидера, оптимизацию базовой структуры и доклиническую оценку фармакологических свойств [38]. Каждая из этих стадий в последнее время существенно обогатилась как некоторыми экспериментальными процедурами, так и методами компьютерного моделирования (рис. 2). 31 Выявление мишени для лекарственного вещества Для создания ЛВ прежде всего необходимы сведения о патологическом процессе в организме, а также разработка соответствующей терапевтической стратегии. Ранее традиционно рассматривались различные метаболические превращения в клетках и на основании структуры метаболитов или регуляторов выбирались группы соединений для скрининга. Современное развитие геномики и протеомики позволяет точно идентифицировать мишени, ответственные за патогенез того или иного заболевания. Секвенирование генома ведет к открытию все новых мишеней, многие из которых участвуют в развитии патологий. По некоторым оценкам, около четверти разработок фармацевтических компаний уже базируется на достижениях геномики. Существуют различные процедуры выявления мишеней. Чаще всего используются молекулярно генетические подходы для определения функции гена, а также направленного изменения его экспрессии на уровне ДНК, матричной РНК или белкового продукта. Помимо тотального секвенирования нуклеотидной последовательности, применяются такие современные технологии, как позиционное клонирование, создание библиотек маркированных EST-повторами (Expressed Sequence Tags) кДНК и баз данных генов с тканеспецифической экспрессией на основе технологии биочипов (microarrays). Здесь нами не обсуждаются особенности этих методов, поскольку им посвящены специальные публикации. Отметим лишь, что с учетом существенного увеличения числа потенциальных мишеней возникает проблема выбора тех из них, которые действительно отвечают за развитие патологического состояния. Для подтверждения истинности мишени (target validation) также используются различные процедуры. Можно отметить метод направленного «нокаутирования» генов (Targeted Gene Disruption – TGD), снижение экспрессии определенного белка с помощью блокирования мРНК «антисмы- словыми» или ее каталитического расщепления рибозимными олигонуклеотидами, блокирование функций белка низкомолекулярными регуляторами или аптамерами. Большие надежды возлагаются на развитие методов функционального клонирования, биоинформатики и хемогеномики –области, призванной связать множество химических веществ и многообразие биологических мишеней (в пределе – исследовать активность всех лигандов в отношении всех рецепторов). Поиск соединения-лидера Под соединением-лидером подразумевается вещество, проявляющее необходимую биологическую активность в отношении определенной мишени. В каждом конкретном случае к подобным соединениям предъявляются свои критерии (например, определенное значение минимальной ингибирующей концентрации в отношении какого-либо фермента). Потенциально существует множество источников таких базовых соединений, однако в последнее время большинство из них находят путем тотального скрининга комбинаторных библиотек. Аналогичные коллекции интенсивно создаются практически каждой фармацевтической компанией, и 32 многие из них коммерчески доступны. Эффективность поиска соединениялидера определяется композицией библиотеки, наличием информации о пространственном строении рецептора-мишени и способом фиксации биологического отклика при скрининге. Показано, что библиотеки на основе de novo дизайна существенно эффективнее случайных коллекций. Достижения комбинаторной химии позволяют целенаправленно создавать небольшие коллекции (focused), сочетающие «лекарственное подобие» со структурным разнообразием. При этом проблема виртуальных библиотек, являющихся источником соединений с желаемыми фармакологическими характеристиками, тесно связана с проблемой молекулярного подобия и структурного разнообразия. Естественно, что каждое базовое соединение должно пройти ряд биологических испытаний на определенный тип активности. Эта стадия может занимать от нескольких часов до многих месяцев. Хотя тотальный скрининг позволяет тестировать порядка 106 соединений с существенно возросшей надежностью, его эффективность редко превышает 0,1 %. Поэтому на данном этапе возможно существенное совершенствование этого метода в первую очередь за счет технологий оценки «лекарственного подобия» и отсева «безнадежных» структур. Среди основных новаций здесь выделяются: скрининг на основе ЯМР, фармакофорный анализ, виртуальный скрининг, тотальный докинг, методы хемо- и биоинформатики. Наряду с рентгеноструктурным анализом ЯМР широко используется для определения трехмерной структуры объектов, в том числе и биомакромолекул. Магниторезонансные методики позволяют исследовать связывание биолигандов с белками-рецепторами, в том числе на уровне слабых взаимодействий (за счет большого различия в релаксационных характеристиках) и при отсутствии начальной информации. Автоматизация и повышение чувствительности процесса дают возможность анализировать сложные смеси и получать структурные данные. Разработан ряд методик приложения ЯМР к скринингу ЛВ. Другим подходом к поиску соединенийлидеров является фармакофорный анализ. Под фармакофором понимается особое расположение функциональных групп в трехмерной структуре молекулы, необходимое для ее взаимодействия с мишенью. Отображение фармакофора позволяет сформулировать критерии, которым должны отвечать соединения-лидеры, и является основой для виртуального скрининга. Совершенствование компьютерных технологий дает возможность более эффективно вести поиск удачных соединений в обширных базах данных. Не в последнюю очередь это связано с совмещением фармакофорного анализа и методов QSAR, развитием многоточечной системы «отпечатков пальцев», нахождением молекулярного подобия, применением эволюционной методологии. Последние достижения в поиске соединений-лидеров связаны с виртуальным скринингом. Под этим понятием часто объединяют различные компьютерные технологии – от моделирования на основании гомологии до тотального докинга и фармакофорного анализа. Развитие вычислительной техники и информационных баз данных делает этот процесс одним из самых дешевых способов поиска соединений-лидеров. Системы виртуального 33 скрининга особенно эффективны в тех случаях, когда, помимо сведений о структуре лигандов и рецепторов и знания общих закономерностей действия ЛС, имеется доступ к обширной базе данных соединений, характеризующейся должным химическим разнообразием. В этой связи одной из наиболее острых проблем, стоящих перед разработчиками платформ виртуального скрининга, является проблема лекарственного подобия, тесно связанная с ограниченностью числа соединений, которые по тем или иным характеристикам могут проявлять соответствующую биологическую активность. Совершенствование алгоритмов реализации процедуры причаливания (докинга) привело к развитию тотального варианта этой методики поиска базовых соединений. Для поиска удобно использовать имеющиеся обширные базы данных для уже синтезированных соединений. Если структура рецептора считается жестко фиксированной, то существующие алгоритмы позволяют проводить поиск с высокой скоростью и весьма эффективно, что, однако, неприменимо к гибким структурам. По некоторым оценкам, при поиске соединений-лидеров докинг-процедуры показали в 103 раз большую эффективность по сравнению с традиционным скринингом. Данный подход активно развивается в связи с увеличением числа доступных через Интернет удаленных баз данных и существенным расширением банка белков (Protein Data Bank) . В случае отсутствия трехмерной структуры белка широко применяется моделирование на основании гомологии . Уже существует направление, связанное с тотальным докингом множества комбинаторных библиотек в отношении ряда рецепторов на основе алгоритмов «разделяй и властвуй», позволяющих эффективно проводить анализ как биологически активных конформаций, так и оптимальных заместителей в данном ряду. Огромный поток информации, получаемой специалистами в области геномики, тотального скрининга и комбинаторного синтеза, привел к необходимости развития исследований на стыке химии, биологии, математики, компьютерных технологий в рамках новых направлений, к которым можно отнести хемо- и биоинформатику . Применяемые методики охватывают широкий круг проблем – от создания и совершенствования баз данных до анализа молекулярного подобия и построения моделей QSAR. Обсуждаемые подходы развиваются в направлении создания новых дескрипторов структуры, методов визуализации и статистической обработки информации, программного обеспечения, повышающих эффективность виртуального скрининга. Компьютерная обработка информации ведется на уровне дескрипторов молекулярной структуры, поэтому особенно важна проблема поиска новых (в особенности трехмерных) дескрипторов, определение границ их применимости, а также их использование для анализа молекулярного подобия. Оптимизация соединения-лидера Как правило, в медицинской химии после нахождения базового соединения проводят его синтетическую модификацию с целью повышения активности и селективности действия и минимизации побочных эффектов. Сложилась определенная система функционализации соединений-лидеров, однако ее возможности существенно расширяются с привлечением 34 компьютерного моделирования для построения зависимостей «структура – активность» Отсев бесперспективных соединений снижает объем синтетической работы и ускоряет оптимизацию в целом. Рациональное использование компьютерного моделирования позволяет уйти от построения названных эмпирических зависимостей и направленно создавать коллекции новых соединений. Как уже отмечалось, наличие информации о трехмерной структуре рецептора или лигандрецепторного комплекса дает возможность проводить прямое моделирование (structure-based design), в частности de novo дизайн. Знание структуры мишени ускоряет оптимизацию за счет установления биологически активной конформации ЛВ и его пространственной ориентации при взаимодействии. Далее, как правило, повторяются итерационные циклы, включающие компьютерный анализ, дизайн лигандов, их синтез, биологические тесты (с возможной корректировкой структуры лиганд рецепторного комплекса), приводящие к новым соединениям-лидерам с удовлетворительными свойствами. Такие методики широко используются для создания различных ЛС – от противодиабетических препаратов до средств терапии ВИЧ. Методологической основой рациональной оптимизации базовых соединений при отсутствии данных о структуре рецептора выступает QSAR, в рамках которого выявляются корреляции между биологической активностью и структурными молекулярными свойствами (дескрипторами) для ряда сходных соединений с помощью статистических методов. Целями моделирования зависимости «структура – активность» являются идентификация и анализ факторов, определяющих данный биологический отклик, для лучшего понимания изучаемой системы и предсказания свойств новых соединений. Существенными моментами здесь выступает допущение возможности численного описания структуры дескрипторами и одинаковый механизм действия веществ. В настоящее время наблюдается переход от традиционной экстратермодинамической методологии к трехмерному описанию структур, что особенно актуально при существовании различий в структуре неизменной части молекул. Несмотря на то, что подходы 3D QSAR вошли в исследовательскую практику только в начале 1990-х гг., их используют весьма широко. В дополнение к традиционному CoMFA разработаны методы, не зависящие от суперпозиции структур, такие как CoMMA (Comparative Molecular Moment Analysis), EVA (EigenVAlues vector descriptors), WHIM (Weighted Holistic Invariant Molecular descriptors). Важными моментами являются статистическая оценка и содержательная интерпретация моделей QSAR (перевод результатов расчетов в структурные формулы соединений для синтеза).Обычно ищут баланс между предсказательной способностью, возможностью интерпретации и компьютерной эффективностью. C помощью 3D QSAR разрабатываются различные препараты – от ингибиторов циклооксигеназы до аминогликозидных антибиотиков и противопротозойных веществ. Конечно, компьютерное моделирование биологической активности еще не гарантирует создания ЛС, однако существенно детализирует и ускоряет этот процесс, в частности, на стадии оптимизации соединения-лидера. 35 Доклиническая оценка фармакологических свойств Проявление определенным веществом желаемой биологической активности на уровне молекулмишеней или клеток не гарантирует в дальнейшем использования его в качестве лекарства. В настоящий момент незначительная доля соединений, проявивших соответствующую активность, доходит до рынка ЛС. Отсев остальных веществ часто происходит лишь на дорогостоящей завершающей стадии клинических испытаний. Ситуацию можно кардинально улучшить, научившись моделировать фармакокинетические и токсикологические свойства соединений, обозначаемые аббревиатурой ADMET (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity). Вещества, имеющиедопустимые фармакокинетические характеристики, называют «подобными лекарствам». Отсев соединений с низкой биодоступностью, неспособных преодолевать биологические барьеры либо имеющих «ложную» активность в связи с наличием реакционноспособных групп, необходимо проводить как можно раньше. Поскольку клиническим испытаниям предшествуют тесты на клеточных культурах и животных, важно уметь переносить результаты этих исследований на человека. Понятно, что раннее предсказание фармакокинетических свойств и особенностей метаболизма имеет первостепенное значение. Существует потребность в разработке in silico методов оценки ADMETсвойств, таких как биодоступность, проникновение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), степень связывания белками плазмы. Именно предсказание «лекарственного подобия» и токсичности соединений позволит увеличить эффективность клинических испытаний и всего процесса разработки ЛС, поэтому оценке фармакокинетического профиля отводится важное место. Например, при пероральном введении ЛВ, прежде чем достигнет системного кровотока, должно быть абсорбировано в желудочнокишечном тракте (ЖКТ), необходимыми условиями этого процесса являются адекватные водорастворимость и проницаемость через биологические барьеры. При транспорте вещества в организме его количество, достигающее биологической мишени, может существенно уменьшиться за счет связывания с белками плазмы. Для соединений, действующих на центральную нервную систему, крайне важна способность преодоления ГЭБ. Компьютерное моделирование ADMET-свойств осложняется множеством обусловливающих их физиологических механизмов и малым объемом надежных экспериментальных данных. В то же время разработаны методы предсказания направления и скорости метаболизма и клиренса – характеристик, во многом определяющих эффективность ЛС. Побочные эффекты от действия лекарств пока не столь предсказуемы, как соответствующие методы прогноза активности. Основные трудности в оценке побочных эффектов связаны с отсутствием информации о полном метаболическом пути соединений. Приемлемая точность предсказаний достигнута для разнообразных характеристик: биодоступности, абсорбции веществ в ЖКТ, связывания с белками плазмы, метаболической стабильности. При этом в качестве 36 дескрипторов молекулярной структуры чаще всего используются коэффициент распределения, площадь полярной части молекул, поляризуемость, липофильность, индексы электронного состояния, топологические характеристики. Улучшение качества результатов моделирования фармакокинетических свойств новых соединений неразрывно связано с уточнением физиологических и биохимических механизмов и переходом от эмпирических корреляций «структура – свойство» к построению моделей для предсказания конкретных параметров. Потенциал данного направления демонстрирует, например, разработка препаратов для терапии болезни Альцгеймера. Постоянное совершенствование процесса разработки ЛС обусловлено его ярко выраженной междисциплинарностью и возможностью привлечения новейших достижений в смежных областях: геномике, протеомике, биохимии, молекулярной биологии, медицине, фармакологии, компьютерном моделировании. Бурное развитие медицинской химии создает предпосылки для перехода от метода проб и ошибок к действительно рациональному дизайну лекарств, когда эмпирический синтез с последующей проверкой активности уступает место направленному созданию веществ с желаемыми физико-химическими свойствами и биологическим действием. Трудно предсказать заранее, какие именно подходы войдут в исследовательский обиход, однако несомненно, что расшифровка генома и совершенствование информационных технологий существенно изменят процесс разработки ЛС. С установлением новых мишеней и уточнением путей метаболизма расширяются возможности рационального конструирования лекарств. В фармакологии наблюдается переход от создания симптоматических средств к созданию средств этиотропной терапии. Следует ожидать, что с улучшением понимания генома эта тенденция усилится. Очевидно, что роль компьютерного моделирования на разных этапах создания ЛС будет неуклонно возрастать, а совершенствование in silico и in vitro методов позволит минимизировать in vivo исследования и клинические испытания, сделав дизайн лекарств эффективнее, быстрее и дешевле. Оценочные средства: Выполнить реферативные работы на темы: 1. Принципы и методы компьютерного моделирования рецепторной активности. 2. Как отрывают рецепторы? 3. Направленный синтез и скрининг фармакологических веществ. 4. Примеры изучения зависимости "структура-активность" в ПМФИ. Оценочные средства для промежуточной аттестации аспирантов: Билет для зачета Билет 1 1. Синапс: строение, принципы функционирования 2. Трансмембранные ионные каналы: лигандзависимые, потенциалзависимые, регулируемые вторичными мессенджерами 3. Описать способ забора крови у крыс из подъязычной вены. 37 Билет 2 1. Рецепторы биологически активных веществ. Общее понятие. Локализация рецепторов: синаптические и внесинаптические. 2. Виды взаимодействия фармакологических агентов с мишенями. 3. Описать основные методы фиксации крыс, кроликов и морских свинок. Билет 3 1. Физико-химические аспекты рецепции. Ковалентная, ионная, ион-дипольная, диполь-дипольная, водородная связь. Гидрофобное взаимодействие. 2. Методология изучения рецепторной активности. Методы in vitro: радиолигандного связывания, исследования на изолированных органах и тканях, культурах клеток. 3. Какой максимальный объем жидкости можно ввести внутрижелудочно и внутривенно крысам, кроликам и морским свинкам. Билет 4 1. Принципы внутрисинаптической регуляции синаптической передачи: рецепторы пост- и пресинаптической мембраны, пресинаптические ауто- и гетерорецепторы. 2. Трансмембранные рецепторы, связанные с G–белками, классификация, механизмы их функционирования с участием вторичных мессенджеров. 3. Описать оральный способ введения веществ крысам Билет 5 1. Агонисты. Антагонисты, их различные виды: конкурентные и неконкурентные. Парциальные агонисты. 2. . Методы компьютерного моделирования рецепторов и основные подходы по изучению взаимодействий «рецептор-лиганд» in silico. 3. Охарактеризовать основные методы эфтаназии мелких и средних лабораторных животных. 1.5. Тема: Экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на холинергическую передачу и холинорецепторы ЦЕЛЬ: Изучить основные методы in vitro: исследования на изолированных органах и тканях веществ агонистов и антагонистов холинорецепторов ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ 1. Определить значение ЕС 50 для ацетилхолина. 2. Определить значение ЕС 50, и рА2 для атропина сульфата. 3. Освоить навыки изучения рецепторной активности агонистов холинорецепторов. 4. Освоить навыки изучения рецепторной активности антагонистов холинорецепторов. 38 ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ: 1. Для оценки влияния изучаемых веществ на холинорецепторы используют стандартный агонист - ацетилхолина гидрохлорид и стандартный антагонист - атропина сульфат. 2. Приготовить физиологический раствор Тироде. состав раствора: натрия хлорид 8,0 г, калия хлорид 0,2 г, кальция хлорид 0,2 г, магния хлорид 0,1 г, гидрокарбонат натрия 1,0, дигидрофосфат натрия 0,05, глюкоза 1,0 на 1 л дистиллированной воды. 3. Осуществить забор участка подвздошной кишки, как было описано в методических указаниях "Методология изучения рецепторной активности". Зарегистрировать спонтанные сокращения гладкой мускулатуры с помощью программного обеспечения устройства в течение 2 минут с помощью изотонического датчика. 4. Определить значение ЕС 50 для ацетилхолина гидрохлорида (М/л) Заполнить таблицу данных Тонус гладкой мускулатуры кишечника Концентрация ацетилхолина (М/л) Опыт(V2-V1) % изменения тонуса 1 2 3 4 5 5. Определить значение ЕС 50 для атропина сульфата (М/л). Определение вели путем оценки влияния атропина сульфата в различных концентрациях на тонус гладкой мускулатуры подвздошной кишки при введении ацетилхолина в концентрации, равной ЕС 50. 39 Заполнить таблицу данных Концентрация (М/л) % изменения тонуса относительно контроля (ЕС 50 АХ) атропина сульфата 1 2 3 4 5 6. Определить значение рА2 для атропина сульфата Данная методика позволяет также определить степень сродства антагонистов к рецепторам, то есть дать заключение о конкурентном или неконкурентном характере их действия. Одним из критериев, позволяющих дать такое заключение является рА2. рА2 - отрицательный десятичный логарифм такой концентрации антагониста, в присутствии которой агонист в удвоенной концентрации оказывает такое же действие, как и агонист в одинарной концентрации в отсутствие антагониста. В качестве контроля используется концентрация ацетилхолина равная двукратной от ЕС 50. 40 Заполнить таблицу данных Концентрация атропина сульфата (М/л) 1 2 3 4 5 % изменения тонуса относительно контроля 7. Записать схему исследования агонистов холинорецепторов Схема исследования веществ, обладающих агонистическим действием на рецепторы Продолжительность, Процедура с 30 30 210 с 30 30 210 с Реакция 29 Добавить ацетилхолин ЕС 50 Экспозиция 5 Отмывание 25 Перерыв Возвращение к исходной линии 5 Отмывание 205 Перерыв Возвращение к исходной линии Держится на исходном уровне 1 29 Добавить ацетилхолин ЕС 50 Экспозиция 5 Отмывание 25 Перерыв 5 Отмывание 1 Цикл экспериме та 1 Субмаксимальное сокращение Частичное расслабление 2 Субмаксимальное сокращение Частичное расслабление Возвращение к исходной линии Возвращение к исходной линии 41 Держится на исходном уровне Повторить один или два раза, при необходимости - несколько раз 30 205 Перерыв 1 Добавить испытуемое вещество Экспозиция 3 Субмаксимальное сокращение Отмывание Частичное 30 5 расслабление Перерыв Возвращение к 25 исходной линии Отмывание Возвращение к 210 с 5 исходной линии Перерыв Держится на 205 исходном уровне Повторить цикл 1 и Такая же амплитуда 270 270 2 как и в цикле 1 и 2 Повторить цикл 3 Амплитуда 270 270 сокращений изменяется пропорционально концентрации испытуемого вещества Повторить цикл 1 и Такая же амплитуда 270 270 2 как и в цикле 1 и 2 Продолжать исследование, чередуя циклы 5, 6. 29 8. Записать схему исследования антагонистов рецепторов. Схема исследования веществ, обладающих антагонистическим действием на рецепторы В связи с тем, что антагонисты не оказывают влияния на биологические системы непосредственно, то антагонистическая активность биологически активных веществ оценивается по степени изменения реакции системы на агонист в присутствии антагониста. 42 Продолжительность, Процедура с Добавить 30 1 ацетилхолин ЕС 50 Экспозиция 29 30 210 5 Отмывание 25 Перерыв 5 Отмывание 205 Перерыв 270 Повторить цикл 1 30 1 29 30 1 29 30 5 25 210 5 205 Добавить Атропин ЕС 50 Экспозиция Реакция Субмаксимальное сокращение Частичное расслабление Возвращение к исходной линии Возвращение к исходной линии Держится на исходном уровне Амплитуда сокращения и сходный уровень те же, что и в цикле 1 Цикл эксперимета 1 2 3 Держится на исходном уровне Добавить стандартные агонист в концентрации ЕС 50+ стандартный агонист в концентрации ЕС50 Экспозиция Амплитуда сокращений значительно меньше, чем в цикле 1и2 Отмывание Частичное расслабление Перерыв Возвращение почти к исходной линии Отмывание Возвращение к исходной линии Перерыв Держится на исходном уровне 43 270 270 30 1 Повторить цикл 1, пока амплитуда сокращений не станет такой же, как при первой пробе Добавить испытываемое вещество Экспозиция Такая же амплитуда 4 как в цикле 1 5 Состояние препарата держится на исходном уровне Добавить стандартный Части 30 1 агонист в концентрации ЕС50 Экспозиция Амплитуда 29 сокращения меньше, чем в 1 и 2 и возможно, меньше, чем в цикле 3 Отмывание Частичное 30 5 расслабление Перерыв Возвращение почти 25 к исходной линии Отмывание Возвращение к 210 5 исходной линии Держится на 205 Перерыв исходном уровне Такие же 6 270 270 Повторить цикл 1 до тех пор, пока амплитуды амплитуда сокращения и сокращений не станет исходный уровень, такой же , как при 1-й как в цикле 1 пробе Степень угнетения 300 300 Повторить цикл 5, уменьшая или сокращения увеличивая изменяется концентрацию пропорционально антагониста, каждый концентрации раз чередуя циклы 5 и испытуемого 6 вещества 9. Заполнить протокол эксперимента 29 44 Образец протокола эксперимента Опыт № Число Время Экспериментальн ая модель Животное Вид_______________________ Линия_________________________ Пол _______________________ Вес ___________________________ Препарирование Орган_____________________ Вес органа _____________________ Физиологический Тип________________________ раствор Температура_____________________ Нагрузка Вещества Агониты________________ Антагонисты________________________ Испытуемое вещество_________________________________________ Объем вводимого раствора_____________________________________ Растворитель ________________________________________________ 45 Вещество Доза Тонус гладкой Примечания мускулатуры (V2-V1) Примечания: Конец опыта: Время Подпись__________________ Оценочные средства Ситуационная задача По указанным в таблице фактическим данным рассчитать значение ЕС 50 для ацетилхолина. Построить график зависимости эффекта от концентрации с использованием программы Еxcel. Вывести уравнение тренада. Таблица 1. Определение значения EC50 для ацетилхолина (М/л). Тонус гладкой мускулатуры кишечника Концентрация ацетилхолина 10-8 10-7 (М/л) Опыт(V2-V1) % изменения тонуса 0,041 0,014 0,008 0,008 0,004 0,006 0,099 0,096 0,016 0,023 0,032 0,023 46 0,171 0,182 0,087 0,098 0,040 0,049 10-6 0,225 0,241 0,119 0,132 0,067 0,062 0,269 0,352 0,125 0,137 0,076 0,068 10-5 10-4 1.5. Тема: Экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на гистаминовые рецепторы ЦЕЛЬ: Сформировать у аспирантов представления об основных методах in vitro: исследования на изолированных органах и тканях веществ агонистов и антагонистов гистаминовых рецепторов Практические навыки, формируемые под руководством преподавателя 1. Определение значения ЕС 50 для гистамина 2. Определение значения ЕС 50, и рА2 для ранитидина. 4. Сформировать практические навыки по изучению рецепторной активности антагонистов гистаминовых рецепторов. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ: 1. Для оценки влияния изучаемых веществ на гистаминовые рецепторы используют стандартный агонист - гистамин и стандартный антагонист ранитидин. 47 2. Приготовить физиологический раствор Кребса-Хенселейта. Состав буферного раствора Кребса-Хенселейта: Na+ 143 ммоль/л, K+ 5,9 ммоль/л, Ca2+ 1,5 ммоль/л, Mg2+ 1,2 ммоль/л, Cl- 125,1 ммоль/л, НСО3 -25 ммоль/л, SО42- 1,2 ммоль/л, Н2РО4- 1,2 ммоль/л, глюкоза 11 ммоль/л. Насыщение буферного раствора карбогеном (5% СО2 и 95% О2) производилось с целью его оксигенации и доведения рН до уровня рН 7,4. Напряжение кислорода при этом составляло 100-120 мм рт. ст. Температура перфузата и сердца составляла 37,0±0,1°С. 3. Осуществить забор предсердий путем иссечения сердца у морской свинки (предсердия данного вида животных чувствительны к воздействию на гистаминовые рецепторы), аккуратно отделить ушки предсердий, не задев участи проводящей системы. Выделенные изолированные предсердия, зафиксировать в ванночке при постоянной перфузии аэрируемым питательным раствором Кребса-Хенселейта. Время Промежуток инкубации между сопровождающийся исследуемых двумя веществ последующими отмыванием изолированного составляет введениями предсердия 2 минуты. веществ, каждые 4 минуты, составлял 40 минут. Спонтанные сокращения регистрировали с помощью изотонического датчика. 4. Определить значение ЕС 50 для гистамина (М/л) Заполнить таблицу данных Частота сокращений предсердий Концентрация гистамина (М/л) % изменения частоты 1 2 3 4 5 48 5. Определить значение ЕС 50 для ранитидина (М/л). Определение вели путем оценки влияния ранитидина в различных концентрациях на тонус частоту сокращений предсердий при введении гистамина в концентрации, равной ЕС 50. Заполнить таблицу данных Концентрация (М/л) % изменения частоты сокращений предсердий (ЕС 50 АХ) гистамина 1 2 3 4 5 6. Определить значение рА2 для ранитидина Данная методика позволяет также определить степень сродства антагонистов к рецепторам, то есть дать заключение о конкурентном или неконкурентном характере их действия. Одним из критериев, позволяющих дать такое заключение является рА2. Заполнить таблицу данных Концентрация ранитидина (М/л) 1 2 3 4 5 % изменения частоты сокращений предсердий 49 7. Записать схему исследования антагонистов гистаминовых рецепторов. 8. Заполнить протокол эксперимента Образец протокола эксперимента Опыт № Число Время Экспериментальн ая модель Животное Вид_______________________ Линия_________________________ Пол _______________________ Вес ___________________________ Препарирование Орган_____________________ Вес органа _____________________ Физиологический Тип________________________ раствор Температура_____________________ Нагрузка Вещества Агониты________________ Антагонисты________________________ Испытуемое вещество_________________________________________ Объем вводимого раствора_____________________________________ Растворитель ________________________________________________ 50 Вещество Доза Частота Примечания сокращений предсердий Примечания: Конец опыта: Время Подпись__________________ Оценочные средства для промежуточной аттестации Билет 1 1. Молекулярное строение холинорецепторов различных внутриклеточные пути передачи сигнала. 2. Дать определение понятию ЕС 50 для агониста и антагониста. типов, Билет 2 1. Физиологические эффекты стимуляции холинорецепторов различных типов. 2. Описать схему изучения веществ - антагонистов холинорецепторов. Билет 3 1. Парасимпатический отдел вегетативной нервной системы: регуляция физиологических функций, эффекты стимуляции. 2. Обосновать выбор тест-систем для изучения влияния на холинорецепторы. Описать процедуру подготовки изолированного участка подвздошной кишки крысы к экспериментальному исследованию. Билет 4 1. . Рецепторы гистамина, их типы, локализация и распределение в организме. 2. Обосновать выбор тест-систем для изучения влияния на гистаминовые рецепторы. Описать процедуру подготовки изолированного предсердия морской свинки к экспериментальному исследованию. Билет 5 1. Молекулярное строение гистаминовых рецепторов различных типов, внутриклеточные пути передачи сигнала. 2. Описать схему изучения веществ - антагонистов гистаминовых рецепторов. 51 1.6. ТЕМА: Экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на серотонинергическую передачу и серотониновые рецепторы ЦЕЛЬ: Изучить основные методы in vitro: исследования на изолированных органах и тканях веществ агонистов и антагонистов серотониновых рецепторов ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ 1. Определить значение ЕС 50 для серотонина. 2. Определить значение ЕС 50, и рА2 для кетансерина. 3. Освоить навыки изучения рецепторной активности агонистов серотониновых рецепторов. 4. Освоить навыки изучения рецепторной активности антагонистов серотониновых рецепторов. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ: 1. Для оценки влияния изучаемых веществ на холинорецепторы используют стандартный агонист - серотонина гидрохлорид и стандартный антагонист кетансерина. 2. Приготовить физиологический раствор Тироде с пониженным содержанием кальция. состав раствора: натрия хлорид 8,0 г, калия хлорид 0,2 г, кальция хлорид 0,08 г, магния хлорид 0,1 г, гидрокарбонат натрия 1,0, дигидрофосфат натрия 0,05, глюкоза 1,0 на 1 л дистиллированной воды. 3. Согласно СОП по работе с лабораторными животными выполнить следующие манипуляции: Условия: 1. Для опытов используются девственные самки морских свинок массой 240300 г или крыс 200-250 г. В одной серии опыта необходимо использовать животных, находящихся в одинаковой фазе полового цикла 1.1. половой цикл: а) проэструс - фаза пролиферации 52 б) эструс - овуляция в) метаэструс - фаза секреции г) диэтрус - регресс желтого тела 2. Вскрыть брюшную полость срединным разрезом от лонного сочленения до грудины и, отодвинув кишечник в сторону, найти матку. 3. Перевязать оба рога матки непосредственно под яичниками при помощи лигатуры. 4. Отпрепарировать каждый рог от соединительной ткани и перерезать его на 2 сл ниже лигатуры. 5 Зафиксировать участок рога матки в камере устройства. 6 Зарегистрировать спонтанные сокращения гладкой мускулатуры матки с помощью изотонического датчика. 4. Определить значение ЕС 50 для серотонина (М/л) Заполнить таблицу данных Тонус гладкой мускулатуры кишечника Концентрация ацетилхолина (М/л) Опыт(V2-V1) % изменения тонуса 1 2 3 4 5 5. Определить значение ЕС 50 для кетансерина (М/л). Определение вели путем оценки влияния кетансерина в различных концентрациях на тонус гладкой мускулатуры рога матки при введении серотонина в концентрации, равной ЕС 50. 53 Заполнить таблицу данных Концентрация % изменения тонуса относительно контроля (М/л) (серотонин ЕС 50) кетансерина 1 2 3 4 5 6. Определить значение рА2 для кетансерина Данная методика позволяет также определить степень сродства антагонистов к рецепторам, то есть дать заключение о конкурентном или неконкурентном характере их действия. Одним из критериев, позволяющих дать такое заключение является рА2. рА2 - отрицательный десятичный логарифм такой концентрации антагониста, в присутствии которой агонист в удвоенной концентрации оказывает такое же действие, как и агонист в одинарной концентрации в отсутствие антагониста. В качестве контроля используется концентрация серотонина равная двукратной от ЕС 50. Заполнить таблицу данных Концентрация кетансерина (М/л) 1 2 3 4 5 % изменения тонуса относительно контроля 54 7. Записать схему исследования агонистов серотониновых рецепторов. Схема исследования веществ, обладающих агонистическим действием на серотониновые рецепторы Продолжительность, Процедура Реакция Цикл с экспериме та Добавить серотонин 1 30 1 ЕС 50 Экспозиция Субмаксимальное 29 сокращение Отмывание Частичное 30 5 расслабление 210 с 25 Перерыв Возвращение к исходной линии 5 Отмывание 205 Перерыв Возвращение к исходной линии Держится на исходном уровне Добавить серотонин 2 ЕС 50 Экспозиция Субмаксимальное 29 сокращение Отмывание Частичное 30 5 расслабление Перерыв Возвращение к 25 исходной линии Отмывание Возвращение к 210 с 5 исходной линии Перерыв Держится на исходном 205 уровне Повторить один или два раза, при необходимости - несколько раз 30 1 30 1 30 210 с 29 Добавить испытуемое вещество Экспозиция 5 Отмывание 25 Перерыв 5 Отмывание 3 Субмаксимальное сокращение Частичное расслабление Возвращение к исходной линии Возвращение к исходной линии 55 205 Перерыв 270 270 270 270 Повторить цикл 1 и 2 Повторить цикл 3 Повторить цикл 1 и 2 Продолжать исследование, чередуя циклы 5, 6. 270 270 Держится на исходном уровне Такая же амплитуда как и в цикле 1 и 2 Амплитуда сокращений изменяется пропорционально концентрации испытуемого вещества Такая же амплитуда как и в цикле 1 и 2 8. Записать схему исследования антагонистов рецепторов. Схема исследования веществ, обладающих антагонистическим действием на серотониновые рецепторы В связи с тем, что антагонисты не оказывают влияния на биологические системы непосредственно, то антагонистическая активность биологически активных веществ оценивается по степени изменения реакции системы на агонист (серотонин) в присутствии антагониста (кетансерин) . Продолжительность, Процедура Реакция Цикл с эксперимета Добавить 1 30 1 серотонин ЕС 50 Экспозиция Субмаксимальное 29 сокращение Отмывание Частичное 30 5 расслабление Перерыв Возвращение к 25 исходной линии Отмывание Возвращение к 210 5 исходной линии Перерыв Держится на исходном 205 уровне Амплитуда 2 270 Повторить цикл 1 сокращения и сходный уровень те же, что и в цикле 1 56 30 1 29 30 1 29 30 5 25 210 5 205 270 270 30 1 29 30 1 29 30 5 25 Добавить 3 Кетансерин ЕС 50 Экспозиция Держится на исходном уровне Добавить серотонин ЕС 50 Экспозиция Амплитуда сокращений значительно меньше, чем в цикле 1 и 2 Отмывание Частичное расслабление Перерыв Возвращение почти к исходной линии Отмывание Возвращение к исходной линии Перерыв Держится на исходном уровне Повторить цикл Такая же амплитуда 4 1, пока амплитуда как в цикле 1 сокращений не станет такой же, как при первой пробе 5 Добавить испытываемое вещество Экспозиция Состояние препарата держится на исходном уровне Добавить Части серотонин ЕС50 Экспозиция Амплитуда сокращения меньше, чем в 1 и 2 и возможно, меньше, чем в цикле 3 Отмывание Частичное расслабление Перерыв Возвращение почти к исходной линии 57 Возвращение к исходной линии Перерыв Держится на исходном 205 уровне Повторить цикл 1 Такие же амплитуды 6 270 270 до тех пор, пока сокращения и амплитуда исходный уровень, как сокращений не в цикле 1 станет такой же , как при 1-й пробе Повторить цикл Степень угнетения 300 300 5, уменьшая или сокращения увеличивая изменяется концентрацию пропорционально антагониста, концентрации каждый раз испытуемого вещества чередуя циклы 5 и6 9. Заполнить протокол эксперимента Образец протокола эксперимента 210 5 Отмывание Опыт № Число Время Экспериментальная модель Животное Вид_______________________ Линия_________________________ Пол _______________________ Вес ___________________________ Препарирование Орган_____________________ Вес органа _____________________ Физиологический раствор Тип________________________ Температура_____________________ Нагрузка Вещества Агониты________________ Антагонисты________________________ Испытуемое вещество_________________________________________ Объем вводимого раствора_____________________________________ Растворитель ________________________________________________ 58 Вещество Доза Примечания: Конец опыта: Время Тонус гладкой мускулатуры (V2-V1) Примечания Подпись__________________ 1.6. Тема: Экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на пуриновые и аденозиновые рецепторы ЦЕЛЬ: Изучить основы молекулярной фармакологии аденозиновых и пуриновых рецепторов ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ 1. Освоить правила и принципы работы на лазерном анализаторе микрочастиц "Ласка-Т" 2. Освоить методики изучения влияния веществ на рецепторы тромбоцитов с помощью лазерного анализатора микрочастиц "Ласка-Т", осуществлять регистрацию процессов активации и агрегации тромбоцитов. 3. Освоить навыки забора крови для приготовления плазмы, обогащенной тромбоцитами. 4. Рассчитать ЕС50 для АДФ в данных условиях эксперимента. 5. Освоить основные экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на и пуриновые (Р2X, P2Y) рецепторы с помощью лазерного анализатора микрочастиц "Ласка-Т". 59 ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ 1. Изучить принцип и порядок работы на лазерном анализаторе микрочастиц "Ласка-Т" согласно инструкции Подготовка к работе 1. Включить электропитание анализатора кнопкой на сетевой панели. 2. Включить лазер. 3. Анализатор готов к работе через 30 минут после включения. Калибровка анализатора 1. При выключенном лазере одновременно нажать кнопки 1 и 3. 2. Далее нажмите 2, наблюдайте смену символов. 3. Включить лазер и ожидать 1-2 минуты. 4. Нажать кнопку 2. 5. Повторно нажать кнопку 2. 6. Далее выйти из режима калибровки двукратным нажатием кнопок 3 и 4. 7. После калибровки на дисплее 1 или 3 устанавливается угол 0 (град), а на дисплее 2 или 4 показания должны быть близкими к 100%. Допускается отклонение в 2%. Запись эксперимента 1. Приготовить суспензию анализируемого образца. 2. Взять чистую кювету с магнитным волчком и налить в нее солевую среду. 3. Поместить кювету в кюветное отделение и включить мешалку. 4. Включить запись эксперимента - опция ИЗМЕРЕНИЯ-СТАРТ. 5. После этого появится окно эксперимента. 6. После записи исходного фона в кювету микропипеткой добавляется суспензия приготовленного образца. 7. Остановка эксперимента осуществляется принудительно через опцию ИЗМЕРЕНИЕ-СТОП. 2. Приготовить плазму крови, обогащенную тромбоцитами. 60 2.1. Приготовление обогащенной тромбоцитами плазмы. Реактивы: Раствор цитрата натрия 3,8% - взвесить 1,9 г сухого цитрата натрия и растворить в 50 мл изотонического р-ра NaCl Забор крови: У кролика, помещенного в бокс, выбривается участок кожи над краевой веной уха. Стерильной новой одноразовой в/м иглой осуществляется прокол вены. Кровь самотеком собирается в пластиковую пробирку с раствором цитрата натрия (0,5 мл) до объема 5 мл (соотношение раствора цитрата натрия и крови 1:9). Центрифугирование Полученная кровь центрифугируется в течение 10 мин при скорости вращения 1000 об/мин (крайнее правое положение переключателя). При установке пробирки с кровью в центрифугу необходимо поместить вторую пробирку с таким же объемом жидкости в диаметрально противоположную позицию для уравновешивания. После отключения центрифуги пробирка с кровью аккуратно переносится в штатив (исключить встряхивание и взбалтывание). Надосадочная жидкость аккуратно, без эритроцитов, находящихся в осадке, переносится в другую пластиковую пробирку при помощи автоматической пипетки (по 200 – 500 мкл). 2.2. Приготовление буферного раствора (зависит от типа рецепторов) 2.4 Осуществить записи кривых активации и агрегации для расчета ЕС 50 АДФ Пример кривой активации на фоне введения АДФ в концентрации, равной ЕС50. Запись - угол 10-12о. 61 Кривая агрегации тромбоцитов записывается в углу 0-2о. 2.5 На основе полученных результатов осуществить расчет значений ЕС 50 активации и агрегации для АДФ Заполнить таблицу данных и построить график в программе Excel. Таблица – Экспериментальные данные. Процент активации (агрегации) Доза 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 62 2.6. Для изучения влияния исследуемых веществ на пуриновые рецепторы следует определить изменение процента активации и агрегации тромбоцитов на фоне введения изучаемых веществ. Для оценки направленности действия используют стандартные агонисты и антагонисты для каждого вида изучаемых рецепторов. Приложение 1 Таблица 1 – Фармакологическая характеристика подтипов аденозиновых и пуриновых рецепторов, локализованных в тромбоцитах Подтип Физиологический рецептора эффект Р2Х1 Агонисты Антагонисты Активация Αβ-meATФ, ТНФ-АТФ, тромбоцитов 2 Ме SАТФ, ИФ3И, АТФ NFO 23, NF 449 P2Y1 Агрегация 2-МеSАДФ, МRS2179 тромбоцитов АДФ βS, МRS2279 АДФ, МRS2500 АТФ, МRS2365 Оценочные средства Ситуационные задачи Задача 1 Мужчина, 36 лет, обратился к врачу с жалобами на сильные приступообразные боли в области пупка, иногда эпигастральной области, иррадиирующие в поясницу и низ живота, сопровождающиеся урчанием кишечника, диареей. При этом у него повышалось АД. Между приступами оставались тупые боли в области пупка, болезненность при пальпации. Другой очаговой симптоматики со стороны нервной системы не выявлено. В анамнезе у больного травма живота. С повреждением какого отдела АНС связаны описанные симптомы в виде урчания кишечника, диареи, повышения АД? Почему? Какие структуры автономной нервной системы вовлечены в патологический процесс? Укажите заинтересованные нейромедиаторы, рецепторы и эффекторные клетки? 63 На чем должен базироваться принцип лечения? На какие структуры АНС может быть направлено воздействие, в том числе и лекарственных препаратов для облегчения страданий пациента? Задача 2 При проведении дезинсекции больной отравился хлорофосом (ингибирует ацетилхолинэстеразу). Опишите вегетативные проявления, которые будут наблюдаться у этого больного. Почему в данном случае больному показано введение атропина? Задача 3 Как, по Вашему мнению, можно физиологически обосновать применение атропина в числе премедикаментозных средств - лекарственных веществ, которые назначают больному при подготовке к стоматологической операции? Задача 4 Почему для исследования влияния веществ на гистаминовые рецепторы используют предсердия морских свинок? Задача 5 Почему клопидогрель не оказывает влияние на активацию тромбоцитов in vitro? Задача 6 Почему при регистрации сокращений мускулатуры матки при исследовании влияния веществ на серотониновые рецепторы производят при температуре 30-32оС. Оценочные средства для промежуточной аттестации Билет 1 1. Рецепторы серотонина, их типы, локализация и распределение в организме. 2. Экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на пуриновые рецепторы. 3. Назовите селективных антагониты Р2Х и Р2У рецепторов. Билет 2 1. Эндогенные лиганды пуриновых рецепторов. 2. Физиологические эффекты стимуляции центральных и периферических серотониновых рецепторов различных типов. 3. Экспериментальные модели и методы изучения действия веществ на серотонинергическую передачу и серотониновые рецепторы. Билет 3 1. Фармакологические агенты, влияющие на пуриновые рецепторы, агонисты, антагонисты, их фармакологические свойства, применение, терапевтический потенциал. 2. Фармакологические агенты, действующие в области серотонинергических синапсов. 3. Назовите неселективных антагониты Р2Х и Р2У рецепторов. 64 Билет 4 1. Патофизиологическая роль различных типов пуриновых рецепторов в развитии патологических состояний и заболеваний у человека. 2. Опишите процедуру подготовки пробы для исследования влияния веществ на пуриновые рецепторы тромбоцитов. 3. Опишите принцип работы лазерного анализатора микрочастиц ЛаскаТ. Основная литература 1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: пособие для врачей 16-е, перераб., испр. и доп. М.: Новая волна; Издатель Умеренков, 2012.1216 с. Дополнительная литература 2. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России.: справочник ред. кол.: Ю.Ф. Исаков [и др.]. - 18-е изд. М.: А, 2012.- 1664 с. 3. Петров В.И. Клиническая фармакология и фармакотерапия в реальной врачебной практике: мастер-класс: учеб. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.880 с 4. Основы фармакотерапии и клинической фармакологии. под ред. М.Д. Гаевого, В.И. Петрова. - 3-е изд., испр. и доп. Ростов н/Д: МарТ, 2010.800 с 5. Бурбелло А.Т. Современные лекарственные средства: клиникофармакологический справочник практического врача /А. В. Шабров ; 4-е изд., перераб. и доп. СПб.: Нева, 2007.- 800 с 6. Зиганшин А.У. Р2 -рецепторы: перспективная мишень для будующих лекарств/ Зиганшин А.У., Зиганшина Л.Е. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2009. – 136 с. 7. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под редакцией Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева. М.: Профиль–2С, 2010, - 358 с 65 8. Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с. 9. Головко Ю.С., Иванкевич О.А., Головко А.С. Современные методы поиска новых лекарственных средств /Весник БГУ, сер. 2, 2012 - с. 715 66 67 Учебное пособие Кафедра биологии и физиологии М.В. Черников, М.А. Оганова МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ «МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ РЕЦЕПЦИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ» ОПОП «ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ» (подготовка научно-педагогических кадров) НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 30.06.01 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА учебный план 140603_78-123(4)-3486 Технический редактор: Браташова Т.М. Подписано в печать ___________________________ Формат 60841/16, бумага писчая белая. Усл. печ. л. Уч.-изд.л. Тираж ________ экз. Заказ ________ Пятигорский филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России 357532, Пятигорск, проспект Калинина, 11 68
