ИОННЫЕ КАНАЛЫ В МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РАН
О. С. ОСТРОУМОВА С. С. ЕФИМОВА В. В. МАЛЕВ
Л. В. ЩАГИНА
ИОННЫЕ КАНАЛЫ В МОДЕЛЬНЫХ
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ
Санкт-Петербург
2012
Остроумова Ольга Сергеевна, Ефимова Светлана Сергеевна, Малев Валерий Вениаминович, Щагина Людмила Владимировна
ИОННЫЕ КАНАЛЫ В МОДЕЛЬНЫХ
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список принятых сокращений…………………………………….
Введение ……………………………………………………………
Глава 1. Модельные липидные мембраны…………...…………...
1.1. Типы модельных липидных мембран. Методы их формирования………………………………..………………..
1.1.1. Липидные монослои………………........................
1.1.2. Плоские бислойные липидные мембраны….……..
1.1.3. Липосомы……………………….……………….…..
1.2. Физико-химические свойства модельных липидных
мембран………….…………………………..……………
1.2.1. Устойчивость бислойных липидных мембран........
1.2.2. Электрическая модель липидной мембраны……...
1.2.3. Поверхностный потенциал мембраны…………….
1.2.4. Дипольный потенциал мембраны.…………………
1.2.5. Спонтанная кривизна липидных молекул и
монослоев……………………………………………
1.2.6. Толщина бислойных липидных мембран.………...
1.2.7. Текучесть бислойных липидных мембран.
Латеральная гетерогенность свойств липидного
бислоя……………………………………………….
1.3. Регистрация ионных каналов в модельных липидных
мембранах…………………………………………………
1.3.1. Общие представления об ионном транспорте через липидные мембраны…………………………..
1.3.2. Электронная схема устройства для регистрации
токов, протекающих через ионные каналы….…….
1.3.3. Характеристики одиночных пор…………………...
1.3.3.1. Проводимость и время жизни каналов…………..
1.3.3.2. Многоуровневая проводимость ионных каналов
1.3.4. Определение воротного заряда канала…………….
1.3.5. Определение размеров и формы канала…………...
1.3.6. Изучение селективности ионных каналов………
1.3.7. Анализ шума флуктуаций проводимости мембран
1.3.8. Регистрация токов через ионные каналы, встроенные в липосомы. Ионные каналы клеточных
мембран, реконструированные в модельные липидные бислои…………………………………….
Глава 2. Порообразующие токсины и антимикробные соединения ……………………..………………………………….
5
6
8
8
8
13
20
22
22
25
29
32
35
37
38
41
41
46
49
49
51
56
58
63
64
69
72
3
2.1. Липопептиды…….…………………………………….....
2.1.1. Липопептиды Pseudomonas syringae ……………...
2.1.2. Липопептиды Bacillus subtilis ……………………...
2.2. Пептиды…………………………………………………...
2.2.1. Грамицидин….................................................................
2.2.2. Аламетицин………………………………………….
2.2.3. Мастопаран…………………………………….........
2.2.4. Мелиттин и магаинин…………………………........
2.2.5. Цекропины…………………………………………..
2.3. Белки……………………………………………………….
2.3.1. Колицины……………………………………………
2.3.2. Cry дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis……
2.3.3. Токсины Staphylococcus aureus…….………………
2.3.4. Актинопорины………….……………………….......
2.3.5. Латротоксин………….………………………….......
2.3.6. Холерный токсин…….………………………….......
2.3.7. Дифтерийный токсин.…………………………........
2.4. Полиеновые макролидные антибиотики….……..……...
2.4.1. Неароматические полиеновые антибиотики.............
2.4.2. Ароматические полиеновые антибиотики................
Библиографический список ……………………………………….
4
76
76
83
88
88
91
94
96
97
98
99
100
102
105
106
106
107
107
109
114
117
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДОФС – 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфосерин (диолеилфосфатидилсерин)
ДОФЭ – 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (диолеилфосфатидилэтаноламин)
ДФФХ – 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (дифитаноилфосфатидилхолин)
ДОФХ – 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин (диолеилфосфатидилхолин)
ПЭГ – полиэтиленгликоль
5
ВВЕДЕНИЕ
Биологические мембраны играют ключевую роль в клеточной
физиологии и имеют целый ряд важнейших функций, таких как барьерная, транспортная, рецепторная, сигнальная и др. Поскольку молекулярная организация мембран достаточно сложна, используются различные модельные системы. Целью применения подобных систем является оценка роли и функции отдельных компонент, а также визуализация организации и динамики мембранной системы.
Основные представления о структуре клеточных мембран, впервые предложенные Гортером и Гренделем в 1925 г., сохранились до
сих пор. Это пленка, состоящая из двух монослоев и содержащая амфифильные соединения липиды (фосфолипиды, сфинголипиды, гликолипиды, стерины). В водном окружении гидрофобные участки липидных молекул обращены друг к другу, образуя углеводородный кор
мембраны, а их гидрофильные участки окружены раствором электролита. Наличие гидрофобного внутреннего слоя в мембранах приводит
к очень малой проницаемости мембран для низкомолекулярных ионов, что позволило в процессе эволюции создать механизмы преобразования энергии и передачи информации с использованием потенциальной энергии трансмембранного градиента концентраций этих соединений. Липиды ответственны не только за барьерную, защитную
функцию мембран, но и за формирование мембранного матрикса, в
который встроены белковые молекулы, взаимодействующие с ним.
Наука, изучающая свойства клеточных и модельных мембран
получила название «мембранология». Одно из замечательных достижений этой науки – создание модельных бислойных липидных мембран, по свойствам мало отличающихся от биологических, что позволяет рассматривать их в качестве адекватной модели биомембран. С
помощью бислойных липидных мембран можно исследовать механические свойства мембран, электрохимические свойства границы раздела липидный матрикс – раствор электролита, поверхностный двойной электрический слой, адсорбцию заряженных частиц и другие параметры системы. Липидные бислои позволяют вводить в них соединения, формирующие транспортные системы: ионные каналы, переносчики веществ и энергии. Биомембранология сейчас достигла того
состояния, при котором для решения задач используют целую комбинацию различных методов и модельных систем. Использование модельных мембранных систем в биофизических исследованиях может
помочь понять решающую роль мембранных липидов в мембранном
транспорте, предсказать токсичность препаратов, а также оптимизи6
ровать системы доставки лекарств.
Ионные каналы – это мембранные молекулярные структуры,
образованные в большинстве случаев интегральными (трансмембранными) белками, пронизывающими клеточную мембрану поперёк в
виде нескольких петель и образующими в мембране сквозной канал
(пору). Чаще всего канальные белки состоят из нескольких субъединиц, образующих структуру со сложной пространственной конфигурацией, в которой кроме поры обычно имеются дополнительные
структурно-функциональные элементы, обеспечивающие открывание/закрывание канала, его ионную избирательность, инактивацию и
регуляцию. Ионные каналы можно рассматривать как транспортный
механизм, обеспечивающий перемещение ионов между цитоплазмой
клетки и наружной средой. Используя реконструированные в бислойные мембраны каналы, можно моделировать такие свойства каналов
клеточных мембран как проводимость, ионная проницаемость, избирательный транспорт различных веществ, катион-анионная селективность, воротный механизм, многоуровневая проводимость.
В предлагаемом пособии рассматриваются вопросы, связанные с
моделированием биомембран с помощью липидных моно- и бислоев,
а также различного рода липосом, систематизированы современные
данные о структуре и свойствах ионных каналов различной природы,
выявлена роль модельных липидных мембран в расшифровке молекулярных механизмов образования и функционирования ионпроницаемых пор, продемонстировано сущетсвенное значение физико-химических свойств мембран в каналообразующей, а, следовательно, в биологической активности токсинов и антимикробных соединений. Последнее важно для понимания связи освещаемых в пособии вопросов с задачами современной фармакохимии. Конечно, изложенный материал затрагивает лишь ограниченную часть предмета.
Кроме того, учитывая современное состояние науки, некоторые вопросы можно было бы осветить более обстоятельно. Тем не менее, задача, которую решали авторы при написании этого пособия, – в первую очередь, вызвать у читателя интерес к изучению ионных каналов
и модельных мембранных систем, ознакомить его с самыми современными результатами и интересными с их точки зрения фактами и
проблемами, дать первое упрощенное представление о физикохимических процессах, лежащих в основе формирования и функционирования ион-проводящих пор. Авторы надеятся, что читатель обратится к процитированным в пособии литературным источникам за
дополнительной информацией по интересующим его вопросам.
7
ГЛАВА 1. МОДЕЛЬНЫЕ ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ
1.1. ТИПЫ МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН.
МЕТОДЫ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ
1.1.1. Липидные монослои
Большинство липидов в мономерной форме практически нерастворимы в водной фазе. На границе вода – воздух они образуют мономолекулярную пленку, монослой (рис.1).
Рис. 1. Расположение молекул липидов (А – димиристоилфосфатидилхолин, Б – цереброзид) в монослое на водной поверхности
Последние 50 лет липидные монослои широко используются как
простейшие модели биологических мембран. Они позволяют оценивать площадь, приходящуюся на молекулу липида в монослоях клеточных мембран, их поверхностный и дипольный потенциалы; изучать сорбцию отдельных мембранных компонентов, включая белки;
устанавливать взаимодействие между ними в ориентированных мономолекулярных структурах, имитирующих поверхность раздела клеточная мембрана – вода; а также изучать структурно-динамические
свойства монослоев в зависимости от их липидного состава. Необходимость использования подобных моделей обусловлена сложностью
получения в нативных клеточных мембранах информации об активности отдельных компонент из-за их большого числа и разнообразия.
Поведение белков и липидов на границе вода–воздух определяется
соотношением гидрофильных и гидрофобных взаимодействий в системе. Этими понятиями обозначают совокупность нековалентных
взаимодействий между молекулами, обеспечивающими, с одной сто8
роны, максимальный контакт полярных участков липидов, белков и
воды, а с другой – контакт углеводородных участков друг с другом
и/или с воздухом. Монослои можно формировать как на гидрофильных (водный раствор), так и на гидрофобных (масло, ртуть) подложках. Это позволяет моделировать не только границу раздела мембрана
– вода, а и область между монослоями внутри бислойной мембраны.
Основы современных представлений о мономолекулярных
пленках были заложены в работах Покельс и Рэлея в конце XIX – начале XX веков, а свойства липидных пленок на водной поверхности
использовались моряками с давних времен, еще до нашей эры. Это
связано с тем, что тонкая (монослойная) масляная пленка может гасить волны на поверхности воды за счет уменьшения ее поверхностного натяжения. Впервые это явление описали Аристотель и Плиний.
Франклин в 1774 г. предпринял изучение этого явления после
того, как увидел затухание волн за кораблем, на котором повара выливали за борт воду после мытья жирной посуды. Франклин показал,
что одной чайной ложки масла достаточно, чтобы привести к затуханию волн на поверхности озера в несколько сот квадратных метров.
Рэлей продолжил эти исследования и, хотя в то время не существовало методов измерения толщины пленок, оценил их как мономолекулярные, толщиной 1–2 нм. Так была получена информация о размерах
молекул задолго до того, как представления о существовании молекул
стали общепринятыми.
Первые измерения зависимости поверхностного давления от
площади пленки были сделаны немецким ученым Покелс в 1891 г.
Она показала зависимость поверхностного натяжения воды от площади водной поверхности и объема нанесенного на поверхность масла.
Наибольший вклад в исследование мономолекулярных пленок соединений, нерастворимых в воде, внес Ленгмюр (1917 – 1920 гг.). Эти
пленки и метод их формирования и исследования носят его имя. Ленгмюр установил, что молекулы в липидных мономолекулярных пленках ориентированы таким образом, что их гидрофильные участки находятся в контакте с водным раствором, а гидрофобные – направлены
в сторону воздуха (рис. 2).
Для формирования на поверхности водной фазы монослойной
липидной пленки используется ванна Ленгмюра (рис. 3), кювета достаточно большой площади (до 0.5 м2), которая заполняется водой или
водно-солевым раствором. На эту поверхность наносят липид или
смесь липидов в легко испаряющемся органическом растворителе.
После испарения растворителя находящиеся на поверхности моно9
слоя нерастворимые в воде молекулы липида могут двигаться только
в плоскости поверхности монослоя и, ударяясь о подвижную пластинку (барьер), создают поверхностное давление π, силу, действующую на единицу длины этого барьера.
Рис. 2. Схематическое представление состояния липидных молекул в
монослое на границе воздух – водная поверхность
Рис. 3. Схематическое изображение ванны и весов Ленгмюра.
1 — кювета; 2 — барьер; 3 — весы; S — площадь, занятая слоем липида
Опыты с использованием весов Ленгмюра заключаются в измерении зависимости силы, измеряемой весами, от площади, занимаемой определенным количеством вещества. Удельная величина этой
силы, равна разности поверхностных натяжений по обе стороны подвижного барьера. Наличие барьера и весов позволяет регулировать
поверхностное давление и измерять площадь, приходящуюся на липидную молекулу при постоянном числе молекул липида на поверхности ванны (или при увеличении общего числа молекул липида в
ванне в случае постоянной площади). Для того чтобы при заданном
10
значении π барьер находился в равновесии, к нему надо приложить
противоположно направленную силу со стороны чистой жидкости,
равную π. Нагружая коромысло весов, создают силу, действующую на
барьер в направлении, противоположном направлению силы поверхностного давления. Когда обе силы уравновешены, барьер перестает
перемещаться. Измерив в этом положении равновесия величину нагрузки на коромысло, можно найти величину поверхностного давления. Определить π можно, измерив независимо поверхностное натяжение водного раствора и пленки. Связь π с площадью, приходящейся
на молекулу липида (А) при сжатии поверхностной пленки, выражается уравнением:
a 

(1)
   2  A  b   kT ,
A 

где а – постоянная Ван-дер-Ваальса, b – эффективная площадь
сечения молекулы.
Схематическое изображение изотермы «π – А» приведено на
рис.4.
Рис. 4. Общий вид изотермы сжатия монослоя на водной поверхности
и состояния липидных молекул на границе липид – водный раствор.
А – двумерный газ, Б – растянутая жидкость, В – растянутая жидкость
и сжатая жидкость, Г – твердая фаза, Д – коллапс, разрушение пленки
При малой концентрации молекул на поверхности субфазы они находятся в состоянии "двумерный газ" (рис. 4 А). При уменьшении приходящейся на молекулу липида площади (путем смещения барьера
или увеличения концентрации липида без изменения занимаемой монослоем площади) увеличение поверхностного давления в монослое
приводит к образованию упорядоченных монослойных липидных
пленок (рис. 4 Б, В). По мере сжатия жирнокислотные цепи принима11
ют все более вытянутую форму, переходя, в конце концов, в полностью транс конфигурацию. Пленка становится «твердой», т.е. почти
несжимаемой (область рис. 4 Г). При попытке еще больше сжать
пленку, монослой разрушается, превращаясь в многослойную структуру (область коллапса, т.е. разрушения пленки – область рис. 4 Д).
Изотерма «поверхностное давление – площадь», (рис. 4) позволяет
определить среднюю площадь сечения молекулы липида в плоскости,
параллельной межфазной границе (поперечное сечение молекулы липида). Это осуществляется экстраполяцией части кривой, соответствующей конденсированному монослою, к нулевому поверхностному
давлению. В таблице 1 представлены величины равновесного давления в конденсированном монослое и площади, приходящейся на молекулу для некоторых липидов при различных температурах.
Таблица 1
Значения равновесного давления в конденсированном монослое
(πd) и площади, приходящейся на молекулу (А) для некоторых
липидов при различных температурах
Липид
πd, дин/см Температура, оС А(π = πd), Å2
3.7
25.0
102.0
трилауроилглицерин
10.1
35.0
92.0
14.9
45.0
88.0
13.5
25.0
67.0
1,319.8
35.0
63.0
дилауроилглицерин
24.9
44.5
60.0
Увеличение числа углеводородных цепей в молекуле липида сопровождается увеличением площади, приходящейся на молекулу в конденсированном монослое.
Другими вариантами используемой монослойной техники является
создание в водном растворе монослоев между водой и ртутью (рис.
5). Для этого липидный монослой переносится на ртутный электрод.
В этом случае полярные головы липидов находятся в водном растворе, а гидрофобные хвосты около поверхности ртути. Такая модель,
например, была использована для подтверждения механизмов формирования ионных каналов из двух димеров в противоположных монослоях, в частности для грамицидиновых и амфотерициновых пор.
12
Рис. 5. Формирование липидного монослоя из диолеилфосфатидилхолина (ДОФХ) в водном растворе на поверхности ртутного (Hg) электрода
1.1.2. Плоские бислойные липидные мембраны
Первые искусственные плоские бислойные липидные мембраны
были созданы в 1936 г.. Исследование этих модельных систем не было продолжено, возможно, из-за их малой стабильности. И только
почти через 30 лет Мюллер и Рудин смогли получить стабильные
плоские липидные бислои, с помощью которых можно было воспроизвести и изучить многие свойства биологических мембран. Появление этого метода явилось существенным вкладом в развитие науки о
клеточных и модельных мембранах, мембранологии, а также в развитие электрохимии и химии поверхностных явлений.
Существует достаточно большое число различных вариантов
метода формирования бислойных липидных мембран. Остановимся
на некоторых из них.
На рис. 6 А представлена схема камеры Мюллера-Рудина. Экспериментальная камера состоит из двух отсеков. Растворы соединены
через отверстие во внутреннем отсеке, на которое кистью или пипеткой наносят раствор фосфолипидов в легко испаряющейся жидкости.
Толстая пленка раствора фосфолипида самопроизвольно утончается в
результате испарения растворителя, действия гравитационных и капиллярных сил. Формирование мембраны можно наблюдать в отраженном свете с помощью микроскопа. По мере утончения цвет пленки меняется от яркого радужного до черного, когда толщина мембраны становится меньше длины волны видимого света. В итоге мембрана достигает толщины, соответствующей двум молекулам липида,
расположенным «хвост к хвосту» (около 10 нм) (рис. 7 А). Время, необходимое для почернения пленки, зависит от температуры, вида ли13
пидов и растворителя и варьирует от 20 до 100 мин. Липидные бислои, полученные таким способом, могут жить несколько часов. Электроды, измеряющие электрические характеристики мембран, находятся в растворах внутреннего и внешнего отсеков камеры. Одним из
недостатков подобной модели мембран (ее отличия от нативных биологических мембран) является наличие линз растворителя между монослоями пленки и большого тора из липидного раствора на границе
мембраны и полимерного материала, ее поддерживающего.
Рис. 6. Схематическое изображение приспособлений для получения и исследования электрохимических свойств бислойных фосфолипидных мембран.
А – приспособление, использованное в первых работах Мюллера
и соавторов. Внутри стеклянного сосуда находится полиэтиленовый
стаканчик с отверстием, края которого тщательно отшлифованы.
Фосфолипидная мембрана формируется на этом отверстие из наносимого на него кистью или тонкой пипеткой раствора липидов;
Б – приспособление для формирования сферических мембран
(диаметр шара может достигать 1 см)
Рис. 7. Методы формирования бислойных липидных мембран. А
– плоских бислойных липидных мембран, Б – липидные бислои на
14
твердой подложке, В – несколько липидных бислоев на перфорированной подложке для параллельных измерений
Частично этих недостатков лишены бислои с малым тором,
сформированные из капли липида, которая поддерживается стеклянной микропипеткой с небольшими внутренним (0.5 мм) и внешним
(5 мм) радиусами (рис. 6 Б). С помощью плунжера шприца толстую
сферическую мембрану, диаметром более 1см, выдувают из микрокапли раствора липида на кончике микропипетки. В течение 30–40 минут липидная пленка чернеет и «живет» 100 и более часов. Внешний
раствор постоянно перемешивается магнитной мешалкой. Образованная липидная мембрана разделяет водные растворы в пипетке и в кювете, где размещены электроды, присоединенные к измерительной
системе (см.1.3.2). Такую мембрану можно считать плоской, поскольку отношение радиуса мембраны к ее толщине составляет около 106.
Большое время жизни этих мембран позволяет проводить на одной
мембране серию измерений по определению трансмембранных токов
и потоков в зависимости от параметров системы: площади мембраны,
ее электрической емкости, состава мембраноомывающего раствора,
величины трансмембранной разности потенциалов и др. Большая
площадь мембраны допускает использование изотопных и флуоресцентных методов определения трансмембранных потоков ионов и/или
нейтральных молекул, что дает возможность различить такие механизмы транспорта, как облегченная диффузия ионов с помощью переносчиков и транспорт в водных порах каналов.
В ряде случаев при использовании микроскопических методов
удобно работать с плоскими горизонтальными липидными бислоями
(рис. 8).
Рис. 8. Схема установки по формированию бимолекулярной липидной мембраны на отверстии в горизонтальной пластинке
15
В этом случае каплю раствора липида вводят в отверстие горизонтальной пластинки, разделяющей соответствующие водные растворы. Липидный раствор образует в отверстии двояковыпуклую или
двояковогнутую линзу (в зависимости от объема раствора). Эта линза
устойчива во времени. Поэтому через отверстие отсасывают часть
липидного раствора до получения в отраженном свете цветной радужной пленки. Эта пленка самопроизвольно утончается в результате
испарения растворителя и перераспределения липидного раствора,
перетекающего в периферийную фазу (тор). Через некоторое время
(20-70 мин.) липидная пленка превращается в «черную» бислойную
мембрану. Самопроизвольное утончение пленки – процесс гидродинамический. Главными движущими силами процесса являются межфазное натяжение (σ), приводящее к скачку гидростатического давления (Δp) на поверхности раздела фаз в торе (капиллярное давление), и
сила Ван-дер-Ваальсового притяжения водных фаз по обе стороны
A
, где А и h– площадь и толщина пленки, соответстпленки ( F 
6h 3
венно), сжимающая пленку в поперечном направлении, когда h достигает величины порядка 100 нм.
Связь Δp с σ и главными радиусами кривизны R1 и R2 (в состоянии равновесия) дается уравнением Лапласа:
1
1 
p     ,
(2)
R
R
 1
2 
где Δp – разность давлений между фазой, находящейся под вогнутой стороной поверхности раздела, и фазой над этой поверхностью.
Все вышеприведенные методы формирования бислойных липидных мембран не лишены в той или иной мере линз растворителя в
гидрофобной области бислоя и окаймляющего мембрану тора, что отличает эти мембраны от клеточных. Эти недостатки затрудняют изучение механических параметров бислоев, т.к. приводят к неконтролируемым значениям натяжения мембран, их площади, емкости, сопротивления. Предложенный в 1972 г. Монталом и Мюллером метод
формирования бислойных липидных мембран путем сведения предварительно сформированных на водной поверхности конденсированных липидных монослоев (см. 1.1.1) приблизил модель к реальной
системе (рис. 9).
16
Рис. 9. Процесс формирования бислойной липидной мембраны из
двух монослоев на отверстии в тефлоновой перегородке
В камере, разделенной на два отсека тонкой (порядка 10 мкм) тефлоновой перегородкой с отверстием около 50–100 мкм, на водной поверхности каждого отсека формируют конденсированные липидные
монослои. Стенки отверстия предварительно обрабатывают скваленом или гексадеканом. Такая обработка удерживает липидный бислой
в отверстии пленки. Бислой образуется в результате аутогезии или адгезии двух сведенных конденсированных монослоев. (Аутогезия – частный случай адгезии, реализуется при молекулярном контакте двух
одинаковых по составу и строению объектов.) Исходные уровни растворов с монослоями могут быть как выше, так и ниже отверстия в
перегородке. В случае, когда оба уровня монослоев находятся выше
отверстия, то для образования бислоя достаточно в одном из отсеков
опустить и поднять уровень раствора. С помощью пипетки медленно,
чтобы не испортить монослой, уменьшают объем водного раствора,
достигая уровня ниже отверстия в перегородке между отсеками, а затем увеличивают объем водного раствора в этом отсеке до уровня
выше отверстия. В результате получается бислой, состоящий из одинаковых по составу монослоев. Если исходно уровни водных растворов в отсеках ниже отверстия в перегородке, то для образования на
отверстии бислоя можно либо одновременно поднять уровни водных
растворов с образованными на их поверхности конденсированными
монослоями выше отверстия в разделяющей отсеки пленке, либо поднять уровень водного раствора сначала в одном, а затем в другом отсеке. Последние варианты – это способы создания мембран из различных по липидному составу монослоев, поскольку каждый монослой мембраны формируется независимо от другого. Для подачи
трансмембранного потенциала и измерения протекающего через мем17
брану тока в оба отсека камеры введены хлорсеребряные электроды.
Полученные таким образом бислои могут моделировать клеточные
мембраны, поскольку, как правило, клеточные мембраны различны по
липидному составу внутреннего и внешнего монослоев, в частности
внутренний монослой мембран содержит больше отрицательно заряженных липидов, а внешний – больше нейтральных липидов.
Интересным способом изготовления липидных бислоев без специальной камеры является их формирование на пипетке для «patchclamp». В этом случае бислой образуется при последовательных перемещениях пипетки через монослой на поверхности воздух-вода
(рис. 10). Благодаря большей устойчивости и времени жизни таких
бислоев этот метод с успехом используется для измерений одиночных
каналов, образованных различными порообразующими белками, в частности, он позволяет детектировать взаимодействие отдельных молекул с реконструированным в бислой каналом.
Рис. 10. Схема постадийного (А, Б, В) формирования бислоя из фосфолипидных монослоев на кончике пипетки для «patch-clamp». Пипетка и фосфолипиды представлены не в масштабе
Еще одним примером мембранной модельной системы являются
плоские липидные бислои на твердой подложке (supported lipid bilayers) (рис. 7 Б). Этот метод имеет свои преимущества и недостатки,
связанные с изучением подобных бислоев. К недостаткам метода следует отнести возможное искажение свойств бислоя при взаимодействии с субстратом подложки и недоступность монослоя, прилегающего
к подложке. Основным преимуществом является высокая стабильность липидных бислоев на твердой подложке. Они остаются практически неизменными даже в условиях высокой скорости потока или
вибрации. Благодаря бóльшей стабильности, эксперименты в технике
бислоев на твердой подложке могут длиться недели и даже месяцы, в
то время как эксперименты с липидными бислоями, омываемыми растворами с обеих сторон, обычно ограничены несколькими часами.
Одним из ярких примеров преимуществ использования липидных
18
бислоев на твердой подложке является возможность применения механических методов зондирования, которые требуют прямого физического взаимодействия с образцом. Так, атомно-силовая микроскопия была использована для визуализации фазового разделения липидов, формирования трансмембранных нанопор, сорбции отдельных
молекул белка и агрегации на мембране. Стоит отметить, что точность подобных измерений составляет десятые доли нм без дополнительного маркирования объектов красителями.
Существуют и другие методы приготовления плоских модельных липидных мембран, например, одновременное формирование нескольких липидных бислоев на перфорированной подложке для параллельных измерений (см. рис. 7 В). Описание этих методов можно
найти в специальных статьях и монографиях.
Метод электрофизиологических измерений с помощью плоских
липидных бислоев характеризуется высокой воспроизводимостью,
чувствительностью и точностью параметров мембран и характеристик каналов. Эти модельные системы позволяют проводить прямые
измерения физико-химических параметров мембран: протекающих
через них ионных токов и потоков заряженных и нейтральных частиц,
электрической емкости, жесткости, ионной селективности, потенциала пробоя и др. С помощью бислоев можно измерять как характеристики немодифицированных, так и модифицированных каналоформерами, переносчиками или другими экзогенными соединениями мембран, изучать свойства встроенных в бислои транспортных систем
клеточных мембран. Использование бислойных липидных мембран
оказалось эффективным в плане моделирования различных мембранных функций, поскольку это дает возможность 1) варьировать липидный состав мембран и, таким образом, работать с мембранами, приближающимся по составу к мембранам клеток; 2) измерять электрическую проводимость мембран и встроенных каналов, их вольтамперные характеристики, ионную селективность, время пребывания
каналов в открытом состоянии и величину воротного заряда каналов;
3) регистрировать кинетические характеристики мембранных процессов; 4) проводить измерения нескольких параметров на одной мембране, благодаря возможности быстрой смены состава электролита в
мембраноомывающих растворах; 5) изменять поверхностный, трансмембранный и дипольный потенциалы мембран, а также ряд других
параметров.
19
1.1.3. Липосомы
Липосомы – липидные сферические пузырьки (везикулы) с
внутренним водным объемом. В 1963 г. Бенгхем впервые продемонстрировал, что диспергированные в воде фосфолипиды гидратируются и образуют структуры в виде концентрических тонких слоев, ламелей. Каждая ламель – липидный бислой. Бенгхем назвал эти ансамбли
липосомами, но поначалу их также называли бенгхасомами. Липосомы могут быть многослойными, содержащими много ламелей внутри
одной липосомы (иногда более 100) и однобислойными (одноламелярными), водный объем которых окружает один липидный бислой. В
отношении размеров одноламелярные липосомы можно разделить на
три вида – это малые (диаметром от 20 до 50 нм), крупные (диаметром от 50 до 100 нм) и гигантские (диаметром от 5000 до 100000 нм).
Размер гигантских липосом близок к размеру клетки. К настоящему
времени известно около 100 методов формирования липосом. Остановимся на некоторых из них. Как правило, малые и крупные липосомы готовят из растворов липидов в органических растворителях
(например, из смеси хлороформа и метанола). Затем растворители
выпаривают в вакууме до образования тонких липидных пленок. Высушенные пленки гидратируют в соответствующем буфере. Сначала
пленке дают время набухнуть, а затем суспензию подвергают встряхиванию. Получившуюся таким способом суспензию мультислойных
липосом обрабатывают ультразвуком. При этом выбираются мощность ультразвукового излучения и частота ультразвуковых колебаний, при которых структура липида не нарушается, а образуются однослойные малые липосомы. Пропускание суспензии малых липосом
через полимерные фильтры определенных размеров, позволяет получить большие одноламелярные гомогенные по размеру липосомы. Гигантские одноламелярные везикулы образуют путем мягкого гидратирования тонких липидных пленок водным раствором. В последнее
время появились аппараты, с помощью которых можно создавать гигантские липосомы. В этом случае липидную пленку сушат на платиновых электродах в потоке азота. Гидратирование проводится соответствующим буфером в переменном электрическом поле с помощью
генератора волн с амплитудой 1 В и частотой 10 Гц между электродами в течение 1÷3-х часов.
Липосомы в качестве мембранной модели используют при исследовании пассивной проницаемости мембран, как для ионов, так и
для небольших нейтральных молекул. При этом выходящие из липосом потоки веществ через реконструированные каналы фиксируют с
20
помощью ион-селективных электродов, изотопных, спектрометрических и др. методов.
Большие размеры гигантских липосом позволяют использовать
технику «patch-clamp» для регистрации ионных каналов (см. 1.3.2).
Возможность формирования асимметричных по липидному составу
липосом способствует развитию такого рода исследований. Как отмечено ранее, внешние и внутренние монослои клеточных мембран, как
правило, имеют различный липидный состав и параметры каналов в
ряде случаев зависят от стороны приложения стимула. Липосомы с
асимметричным липидным составом монослоев являются незаменимой моделью для исследования таких каналов.
Рассмотрим один из способов формирования монобислойных
липосом с асимметричным составом монослоев (рис. 11).
I этап. Формирование в минеральном масле водных капель, покрытых фосфолипидным монослоем. Для этого высушивают определенное количество фосфолипидов, необходимое для образования
внутреннего монослоя липосом. Затем при температуре выше температуры фазового перехода фосфолипиды растворяют в минеральном
масле с использованием ультразвукового излучателя. Завершением
этого этапа является введение в полученный липидный раствор буфера, содержащего сахарозу, и эмульгирование системы (с помощью
пипетки). В результате получают эмульсию покрытых фосфолипидным монослоем водных капель в масле. Размер капель варьирует от
20 до 100 мкм.
Рис. 11. Схематическое представление экспериментальной процедуры, использующейся для формирования везикул с асимметричным
составом монослоев
21
II этап. Для образования липосомы необходимо создание вокруг водной капли второго монослоя. Этот монослой создают из другого фосфолипида на межфазной границе его раствора в масле и водного раствора, аналогичного раствору водных капель, в котором сахароза заменена на эквимолярное количество глюкозы. В масляную фазу этой системы вводят ранее приготовленную эмульсию водных капель в масле. Благодаря различной плотности раствора с сахарозой и
с глюкозой, водные капли с сахарозой самопроизвольно пересекают
монослой, в результате чего образуется липосома с иным составом
внешнего монослоя, по сравнению с составом внутреннего монослоя.
Получающиеся этим методом асимметричные по липидному составу
липосомы имеют диаметр от 20 до 100 мкм, что позволяет использовать метод «patch-clamp» для измерений параметров бислоя и встроенных в него каналов клеточных мембран.
1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОДЕЛЬНЫХ
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН
1.2.1. Устойчивость бислойных липидных мембран
В ходе предшествующего изложения методов формирования искусственных липидных мембран отмечалось, что такие образования –
метастабильны, т.е. существуют лишь в течение некоторого времени,
продолжительность которого зависит от таких факторов, как сам способ формирования, температура проведения опытов, состав мембран
и разделяемых ими растворов и т.д. С другой стороны, в отсутствие
повреждающих воздействий мембраны живых клеток существуют
практически неограниченное время. Для пояснения причин столь разной устойчивости сопоставляемых объектов напомним, что при образовании бислойной липидной мембраны из капли мембранообразующего раствора происходит ее самопроизвольное утоньшение за счет
перетекания раствора в окружающий мембрану тор (см. 1.1.2 рис.
7 А). Это означает, что пока разделяющая растворы капля мембранообразующей фазы является достаточно толстой, ее существование
оказывается не выгодным энергетически по сравнению с тем же объемом фазы в смачивающем подложку торе. Когда же пленка становится черной, т.е. весьма тонкой, ситуация меняется; в таком состоянии мембрана (пленка) существует достаточно долго. Это говорит о
принципиальных отличиях толстых и тонких пленок (мембран).
С физико-химической точки зрения пленка f, разделяющая две
22
фазы α и β (в общем случае – различных, см. Рис. 12), называется
«толстой», если ее межфазные натяжения σαf и σβf на границах с этими фазами не отличаются от натяжений σαf0 и σβf0, имеющих место
при контакте фазы f только с фазой α и фазой β, соответственно:
σαf = σαf0, σβf = σβf0. Пусть, например, толстая пленка f (толщины h и
поверхности А) разделяет одинаковые фазы (α = β и, потому,
σαf0 = σβf0) и контактирует с резервуаром той же фазы (см. Рис. 12).
Поверхностная энергия такой пленки Аσαf0, очевидно, будет больше,
чем поверхностная энергия сферической капли той же фазы f с объемом, равным объему пленки Vf = Аh, так как при заданном объеме
сферическая поверхность является минимальной. Поэтому такая
пленка, обладая избыточной поверхностной энергией, окажется неустойчивой в связи с необходимостью реализации минимума энергии
системы в целом и станет утоньшаться самопроизвольно, как это и
наблюдается в действительности.
Рис. 12. «Толстая» пленка (f), разделяющая две фазы α и β
В случае «тонких» пленок межфазные натяжения σαf и σβf , вопервых, отличаются от σαf0 и σβf0, соответственно, и, во-вторых, вместо суммарного межфазного натяжения пленки (σαf + σβf) следует говорить о ее суммарном механическом натяжении γ = σαf + σβf +Δσ, где
Δσ – некое избыточное натяжение, возникающее в «тонких» пленках.
Причиной возникновения таких отличий (по сравнению с «толстыми»
пленками) являются различного рода взаимодействия поверхностных
слоев пленки друг с другом. В качестве примера таких взаимодействий часто рассматривается случай двух одноименно заряженных пластин, которые погружены в раствор электролита. В силу кулоновских
взаимодействий вблизи пластин возникают области объемного заряда
(диффузные слои), которые по своему знаку должны быть противоположены знаку заряда пластин. Толщина таких диффузных слоев достаточно мала при не слишком малых концентрациях электролита. Поэтому при расстояниях h между пластинами, существенно превы23
шающих такие толщины, заряды пластин полностью экранируются, и
рассматриваемая система оказывается аналогом толстых пленок. Однако, при расстояниях h, сопоставимых с толщиной диффузных слоев,
экранирование заряда пластин станет не полным, в системе возникнет
отталкивающая сила. Отрицательная величина этой силы, отнесенная
к поверхности пленки, называется расклинивающим давлением П. В
рассмотренном примере расклинивающее давление обусловлено кулоновскими взаимодействиями, однако не только электростатические
силы ответственны за его возникновение. Межмолекулярные (вандерваальсовы) взаимодействия также дают заметный вклад в расклинивающее давление. Кроме этого в расклинивающем давлении принято
выделять составляющие, которые определяются взаимодействиями
адсорбционных слоев пленки друг с другом. В термодинамической
теории тонких пленок показывается, что введенное выше избыточное
натяжение Δσ связано с расклинивающим давлением П соотношением:
  hП
(3)
Поэтому натяжение пленки γ равно:
  f  f  hП
(4)
В отличие от «толстых» пленок «тонкие» могут оказаться устойчивыми, если их натяжение γ заметно меньше суммы межфазных
натяжений (σαf0 + σβf0). Меньшее натяжение тонкой пленки γ по отношению к сумме (σαf0 + σβf0) (в условиях опыта 2σαf0, т.к. мембрана
обычно разделяет одинаковые растворы) подтверждается ранее упоминавшимся фактом существования «линз» мембранообразующей
фазы на сформированной из нее пленке (рис. 13).
Рис. 13. Мембрана с «линзой» растворителя
Действительно, их наличие на мембране должно отвечать условию механического равновесия сил, приложенных к периметру линзы. А именно, натяжение пленки γ должно уравновешиваться проек24
циями натяжения σαf0, действующими с обеих сторон линзы:
  20f  cos  ,
(5)
где θ – краевой угол линзы.
Поскольку при ненулевом значении краевого угла cosθ меньше единицы, то равенство (5) отвечает требуемому условию существования
тонкой пленки γ < 2σαf0 и одновременно возможности присутствия на
ней линз.
В заключение этого параграфа следует подчеркнуть, что тонкие
пленки следует рассматривать как объекты, которые стабилизируются
действующими в них специфическими силами и могут сохранять
свою устойчивость при, априорно, не слишком больших изменениях
внешних параметров системы (температуры, составов разделяемых
ими растворов, разности потенциалов и т.д.).
1.2.2. Электрическая модель липидной мембраны
Как отмечалось ранее, искусственные липидные мембраны являются более удобными объектами физико-химических исследований, нежели мембраны живых клеток. Однако проведение таких исследований предполагает адекватную трактовку полученных данных,
включающую, как правило, моделирование протекающих процессов.
Первостепенное значение при этом имеет выбор электрической модели мембранной системы. Так, для областей раздела мембраны с контактирующими с нею растворами электролитов можно использовать
давно разработанные представления о строении границ раздела фаз
(несмешивающихся жидкостей или твердого тела и жидкости) с пространственным разделением заряда (двойным электрическим слоем),
возникающим в том случае, если одна из контактирующих фаз несет
поверхностный заряд. Последнее может быть результатом преимущественной адсорбции ионов электролита или диссоциации компонентов (например, фосфолипидов).
На первых этапах развития представлений о транспорте ионов
через искусственные липидные мембраны использовалась стандартная модель, разработанная для границы раздела металлический электрод/раствор электролита (рис. 14). Согласно этой модели поверхностный заряд металлического электрода (например, жидкого ртутного)
экранируется противоположным (уже объемным) зарядом так называемого двойного электрического слоя, возникающим в примыкающей к электроду области электролита за счет кулоновских взаимодействий ионов с зарядом этого электрода. Поскольку ионы электролита
обладают конечными размерами, они не могут подойти к электроду
25
на расстояния, меньшие радиуса сольватированного иона (в отсутствие их специфической адсорбции на поверхности электрода). Плоскость центров заряда ионов, максимально приближенных к поверхности электрода и не взаимодействующих с ней специфически, называют «внешней плоскостью Гельмгольца», а саму зону между этой
плоскостью и поверхностью электрода – «плотным слоем Гельмгольца».
Рис. 14. Плотный слой Гельмгольца
Ионный заряд, сосредоточенный во внешней плоскости Гельмгольца, не может, очевидно, превышать (по абсолютной величине) заряд поверхности электрода. На самом деле он оказывается меньшим,
так как преимущественное присутствие в этой плоскости ионов того
или иного знака заряда (в зависимости от знака заряда поверхности
электрода) создает градиент концентрации по ним, т.е. отток их в более удаленные слои раствора, что и приводит к неполной экранировке
заряда электрода ионами, находящимися в указанной плоскости. Поэтому электрическое поле оказывается ненулевым и за пределами
плотного слоя. Это приводит к возникновению «диффузного слоя»,
как, в отличие от плотного слоя, называют часть двойного электрического слоя, в которой результирующая плотность объемного заряда
ионов отлична от нуля.
На Рис. 15 схематически изображено распределение потенциала
φ(х) с расстоянием х от поверхности электрода (потенциал отсчитывается от его значения в толще раствора, т.е. при x → ∞).
26
Рис. 15. Распределение потенциала вдоль нормали к поверхности электрода φ(х). Поверхность электрода соответсвует нулевому
значению координаты (x = 0)
В соответствии с рисунком потенциал электрода φ(0) тождественно равен сумме скачков потенциала в плотном слое [φ(0) - φ(d0)] и
в диффузном слое φ(d0):
(0)  (0)  (d 0 )  (d 0 )
(6)
Дифференцируя это тождество по заряду электрода ω (при постоянстве состава системы, температуры и давления), получаем
(0) (0)  (d 0 ) (d 0 )


(7)



Согласно термодинамическому определению частная производ
есть не что иное, как электрическая емкость, с, рассматриная
(0)
ваемой системы: металлический электрод/раствор электролита. Поэтому (7) можно переписать в виде:
1 1 1
  ,
(8)
c cc cd


где c c 
и cd 
являются емкостями
(0)  (d 0 )
(d 0 )
плотного и диффузного слоев, соответственно. Поскольку суммирование этих емкостей по обратным значениям отвечает их последовательному соединению, то эквивалентной электрической схемой границы раздела электрод/раствор электролита, очевидно, и является такое соединение. Поэтому если переносить данную модель строения
27
границы раздела фаз на случай липидной мембраны (имеющих две
границы раздела), то ее эквивалентной схемой будет уже последовательное соединение пяти емкостей; по две с каждой стороны мембраны плюс одна, ее собственная. Однако с развитием исследований
транспорта через липидные мембраны такая модель существенно упростилась и стала, вообще говоря, сходной с моделью двойного электрического слоя Гуи и Чапмена. В этой модели ионы считаются точечными, поэтому отсутствует плотный слой двойного электрического слоя и, соответственно, в правой части (8) не присутствует слагаемое 1/сс. Использование модели Гуи-Чапмена в случае липидных
мембран приводит к эквивалентной схеме, состоящей только из трех
последовательно соединенных емкостей (см. Рис. 16), параллельно
которым подсоединены сопротивления, отражающие возможность
переноса ионов через мембрану.
Рис. 16. Эквивалентная схема мебраны, разделяющей растовры
электролита согласно модели двойного электрического слоя ГуиЧапмена. Cd – емкость диффузного слоя; Cm – емкость мембраны; Rs–
сопротивление диффузного слоя; Rm – сопротивление мембраны
Правомочность подобного пренебрежения плотными слоями в
частном случае липидных мембран оправдывается возможностью ионов проникать через мембраны. В классических электродных процессах через границу раздела переносится только электронный заряд и,
потому, компенсирующие заряд электрода ионы не могут подойти к
нему ближе, чем на расстояние d0 – толщины плотного слоя. В случае
же транспорта ионов через мембрану расстояние их наибольшего
приближения к ней нельзя фиксировать, так как они через нее проходят. Сделать это нельзя еще и по той причине, что поверхность мембраны, контактирующая с раствором, не является идеально плоской
(на молекулярном уровне); на ней присутствуют как фрагменты ли28
пидов, так и водные включения.
Итак, можно полагать, что результирующая емкость мембранной системы в случае одинаковых составов разделяемых мембраной
растворов дается соотношением:
1 2 1
 
(9)
c cd cm
Определения емкости тонкой (бислойной) липидной мембраны с
приводят к значениям порядка 0.5÷1.0 мкФ/см2. Те же значения емкости, характерные для мембран живых клеток, говорят о сходстве тех и
других мембран в электрическом отношении. Не менее важным является то, что такие относительно небольшие значения емкости означают малость собственно мембранной емкости, сm, по сравнению с емкостями диффузных слоев, сd. Действительно, измерения емкости
ртутного электрода в растворах электролитов показали, что емкость
диффузных слоев уже при концентрациях электролита порядка 10-2 М
составляет десятки микрофарад и растет с увеличением его концентрации. Поэтому вплоть до концентраций электролита порядка 10-4 М
с вкладом емкостей диффузных слоев в емкость мембранной системы
можно не считаться, т.е. полагать с  с m практически для всех физиологически интересных условий. Это означает, что при наложении на
мембранную систему внешней разности потенциалов V она практически полностью реализуется на самой мембране, не меняя распределений потенциала в диффузных слоях растворов, разделяемых мембраной. Несколько опережая изложение соответствующего материала,
отметим, что это обстоятельство упрощает трактовку результатов
различных электрохимических измерений, используемых для изучения ионного транспорта через искусственные и биологические мембраны.
1.2.3. Поверхностный потенциал мембраны
Межфазный скачок потенциала на границах мембраны, граничный потенциал, складывается из двух компонентов: поверхностного и
дипольного потенциалов. Фиксированные на поверхности мембраны
заряды, в частности, диссоциирующие группы полярных головок
мембранных липидов, ионизирующиеся группы аминокислотных остатков в составе мембранных белков и притягивающиеся к ним противоионы электролита создают двойной электрический слой (рис. 17).
29
Рис. 17. Распределение ионов в двойном электрическом слое
Теория строения двойного электрического слоя была развита в
работах Гуи и Чепмена, а впоследствии дополнена Штерном. Согласно теории Гуи и Чепмена распределение ионов в пределах двойного
ионного слоя подчиняется закону распределения Больцмана:
zF
C  C exp(
),
(10)
x
0
RT
где Сх, – концентрация иона на расстоянии х от поверхности мембраны; С0 – концентрация в объеме водной фазы, φ – потенциал в плоскости х, отсчитанный от уровня потенциала в объеме раствора.
Вопрос о характере распределения электрического потенциала в
двойном слое решается с использованием одного из основных уравнений электростатики – уравнения Пуассона. Для рассматриваемого
одномерного случая это уравнение имеет вид:
( x)
d 2

,
(11)
2
 0
dx
где ε – абсолютная диэлектрическая постоянная, принимающая значения ε1 в водной фазе и ε2 в липидной фазе, ρ(х) – объемная плотность заряда в точке х.
В свою очередь, объёмная плотность заряда описывается уравнением:
( x)  F  zi C x i ,
(12)
i
где индекс суммирования i соответствует сорту иона в растворе.
В случае бинарного электролита и малых потенциалов совместное решение уравнений (10) и (11) с учетом (12) имеет вид:
   0 exp(x) ,
(13)
где φ0 и φ — значения электрического потенциала на границе раздела
и в плоскости х, измеряемые относительно потенциала в объеме фазы,
соответственно, х — абсолютное значение координаты х.
30
Уравнение (13) показывает, что электрический потенциал изменяется экспоненциально с изменением расстояния от границы раздела. Двойной электрический слой распространяется вглубь обеих фаз,
по обе стороны от поверхности раздела. Крутизна изменения потенциала в зависимости от расстояния определяется величиной χ (14),
которая зависит от концентрации ионов в данной фазе и диэлектрической проницаемости.
2C

zF
(14)
 0 RT
Величина χ принимает значение χ1 и χ2 для водной и липидной
фаз, соответственно. Основное изменение потенциала вблизи грани1
цы раздела происходит на расстоянии, равном 1/χ. Величина  

характеризует толщину каждой обкладки диффузного двойного слоя
и называется длиной экранирования или дебаевской длиной. Области
с длиной λ1 и λ2 справа и слева от поверхности раздела несут избыток
ионов разного знака. Из определения длины экранирования следует
несколько важных выводов: 1) длина экранирования в разбавленных
растворах превышает дебаевскую длину в концентрированных; 2) в
присутствии в растворе двухвалентных ионов длина экранирования
уменьшается по сравнению с их отсутствием. Очень часто в коллоидной химии для характеристики двойного электрического слоя используют электрокинетический или дзета-потенциал. Этот потенциал соответствует плоскости скольжения и является частью потенциала
диффузного слоя. Плоскость скольжения образуется в результате того, что при движении дисперсных частиц наиболее удаленная часть
диффузного слоя не участвует в движении, а остается неподвижной.
Поэтому появляется нескомпенсированность поверхностного заряда
частицы и становятся возможными электрокинетические явления.
Объединение уравнений Больцмана и Пуассона для случая
больших потенциалов с учетом электронейтральности двойного электрического слоя позволяет записать выражение для поверхностного
заряда мембраны (ω) в виде:
zF
  8 0 RTC sh(
)
(15)
2 RT
Дальнейшее развитие теория строения двойного электрического
слоя получила в работах Штерна, который отметил, что ионы, образующие диффузную часть двойного электрического слоя, распределяются в ней не только под действием сил электростатического взаи31
модействия и теплового движения, но и под влиянием адсорбционного взаимодействия с твердой поверхностью.
Степень ионизации мембранообразующих липидов и белков отражается на величине заряда и потенциала на поверхности мембраны.
Значение электрического потенциала зависит от поверхностной плотности заряда, рН среды, концентрации и валентности ионов в растворе. Важным эффектом, связанным с наличием поверхностного потенциала, который определяет локальные концентрации ионов, является
влияние заряда мембраны на проводимость ионных каналов. Например, отрицательный поверхностный заряд мембраны приводит к
уменьшению концентрации анионов и увеличению концентрации катионов в примембранном слое. Это проявляется, в увеличении и
уменьшении проводимости катион и анион-селективных каналов, соответственно. В качестве примеров можно привести каналы, образованные грамицидином А и сирингомицином Е. Более подробно об
этом будет сказано в разделе 2. От поверхностного потенциала мембраны может зависеть каналообразующая активность заряженных соединений. Отрицательный заряд мембраны обеспечивает первичное
взаимодействие липидного бислоя с положительно заряженными пептидами и белками, например, в случае магаинина, колицина и сирингомицина Е. Именно подобное взаимодействие во многом обеспечивает высокую специфичность действия антимикробных пептидов.
1.2.4. Дипольный потенциал мембраны
Дипольный потенциал мембраны, d, – это скачок потенциала на
границе раздела мембрана−раствор, обусловленный специфической
ориентацией диполей мембранных липидов и примембранной воды, в
результате чего электрический потенциал внутренней части бислоя
оказывается положительным относительно окружающей мембрану
водной фазы (рис. 18).
Рис. 18. Возникновение скачка дипольного потенциала на границе
раздела раствор – бислой. Углеводородный кор бислоя показан серым
32
цветом. Средняя панель соответствует мембране в отсутствие дипольных модификаторов. Левая панель – в присутствии дипольного
модификатора, увеличивающего дипольный потенциал мембраны
(красные диполи). Правая панель –в присутствии дипольного модификатора, уменьшающего скачок потенциала (синие диполи)
Дипольный потенциал мембран связан с дипольным моментом и
поверхностной плотностью диполей, а также с диэлектрической проницаемостью мембраны уравнением плоского конденсатора:
n
d   ,
(16)
0
где   – средняя проекция дипольного момента липидных молекул (с
учетом ассоциированной воды) на нормаль к плоскости мембраны; n
– поверхностная плотность диполей, ε – диэлектрическая проницаемость мембраны.
Роль дипольного потенциала мембран до сих пор не достаточно
изучена, несмотря на то, что во многих случаях его значение превышает величины трансмембранного и поверхностного потенциалов.
Дипольный потенциал мембраны зависит от ее липидного состава. В
случае фосфолипидных бислоев его величина обусловлена тем, какой
эфир образуют жирнокислотные остатки с глицерином – простой или
сложный. При этом жирнокислотный состав и вид азотистого основания практически не играют роли. Кроме того, включение в мембрану
специфических веществ, называемых дипольными модификаторами,
также приводит к изменению скачка потенциала на границе раздела
раствор-мембрана. Например, некоторые флавоноиды, полифенолы
растительного происхождения, и гормоны щитовидной железы при
встраивании в мембрану уменьшают d (рис. 19 А). Существует две
гипотезы, объясняющие этот эффект: 1) молекулы этих соединений
обладают большим дипольным моментом и их ориентация в мембране противоположна ориентации диполей липидов; 2) их адсорбция на
мембране влияет на ориентацию и плостность диполей примембранной воды. Существуют агенты, способные увеличивать скачок потенциала на границе раздела фаз. К ним относятся некоторые красители,
и стерины, в частности, холестерин (рис. 19 Б, В). Следует подчеркнуть, что дипольный потенциал влияет на взаимодействие ряда лекарственных веществ с клеточными мембранами. Некоторые лекарственные вещества сами способны изменять дипольный потенциал мембраны, например, анестетик лидокаин увеличивает d.
33
А
Б
В
флоретин
RH 421
холестерин
Рис. 19. Химическая структура наиболее распространенных дипольных модификаторов. Флавоноид флоретин (А) уменьшает d, а
стириловый краситель RH 421 (Б) и холестерин (В) увеличивают дипольный потенциал мембраны
Абсолютную величину суммарного скачка потенциала на границе мембраны, граничный потенциал, измерить невозможно, но его
можно оценить. Например, сравнивая проводимость мембраны в присутствии гидрофобных ионов с одинаковой структурой, но разным
знаком заряда. На практике в большинстве случаев важно знать не
столько абсолютную величину потенциала, сколько его изменение
вследствие адсорбции на поверхности мембран ионов или малых
электронейтральных молекул, а также крупных макромолекул и белков, многие из которых несут суммарный электрический заряд и обладают собственным дипольным моментом. Наиболее удобным объектом для экспериментального изучения являются плоские бислойные
липидные мембраны и, в частности, регистрация изменений граничного потенциала по изменению их проводимости, индуцированной
ионофорами, а также с помощью метода компенсации внутримембранного поля.
Исходя из определения дипольного потенциала, очевидно, что
его уменьшение должно приводить к снижению энергетического
барьера для проникновения через мембрану положительно заряженных ионов, а, следовательно, к увеличению проводимости катионных
каналов. Это наблюдается для грамицидиновых и аламетициновых
каналов. При варьировании дипольного потенциала также может изменяться коэффициент распределения каналообразующих агентов,
имеющих заряженные группы или обладающих значительным дипольным моментом. В результате может изменяться как число функционирующих каналов в мембране, так и характер их многоуровневой
проводимости. Примеры и механизмы будут подробно обсуждаться в
Разделе 2.
34
1.2.5. Спонтанная кривизна липидных молекул и монослоев
Спонтанная кривизна липидной молекулы определяется отношением площади поперечного сечения «головы» к площади поперечного сечения «хвоста(ов)». Если это отношение > 1, то говорят о положительной спонтанной кривизне молекулы. Примером может служить лизолипид. Диолеоилфосфатидилхолин имеет «нулевую» спонтанную кривизну, так как указанное соотношение для его молекулы
близко к 1. Молекула диолеоилфосфатидилэтаноламина имеет отрицательную спонтанную кривизну, так как площадь поперечного сечения головы меньше площади поперечного сечения хвостов. Спонтанная кривизна липидных молекул, образующих монослой, определяет
его геометрию. На рис. 20 показаны монослои из липидов с различной
спонтанной кривизной.
Рис. 20. Схематическое представление спонтанной кривизны монослоя в зависимости от спонтанной кривизны липидов
Спонтанная кривизна влияет на слияние мембран, регулирует
активность и связывание различных белков с мембраной. Кроме механочувствительных ионных каналов, чувствительность которых к
деформации бислоя очевидна, спонтанная кривизна модулирует активность белок-липидных пор, образуемых антимикробными пептидами и токсинами, и некоторых других ионных каналов, например,
формируемых антибиотиками грамицидином и аламетицином (см.
Главу 2).
Поскольку образование белок- или пептид-липидных пор предполагает положительную спонтанную кривизну, входящих в нее липидных молекул (рис. 21), то липидные молекулы с большой гидрофильной головой и с маленькой площадью сечения гидрофобного
35
хвоста(ов) (имеющие положительную спонтанную кривизну) должны
облегчать образование подобных пор, в то время как липиды, имеющие отрицательную спонтанную кривизну, – должны приводить к
противоположному эффекту.
Рис. 21. Образование белок-липидной поры требует положительной
кривизны входящих в нее липидных молекул
Чтобы понять причины зависимости свойств каналов от спонтанной кривизны образующих мембрану липидных молекул, рассмотрим профили латерального давления в бислоях, сформированных
из липидов с нулевой и отрицательной спонтанной кривизной (рис.
22).
Рис. 22. Латеральное давление в липидных бислоях, сформированных
из липидов с нулевой (А) и отрицательной (Б) спонтанной кривизной
На рис. 22 видно, что липиды с отрицательной спонтанной кривизной
увеличивают давление в гидрофобной области бислоя. В этом случае,
каналообразующая активность зависит от конформаций белка в непроводящем и проводящем состоянии. Так, например, если в непроводящем состоянии белок имеет форму цилиндра, а при переходе в
проводящее состояние пора становится «корсетной» (рис. 23), то в
мембранах из липидов с отрицательной спонтанной кривизной вероятность пребывания канала в открытом состоянии будет выше, чем в
бислоях из липидов с нулевой спонтанной кривизной.
36
Рис. 23. Схематическое представление перехода канала в мембране из
закрытого состояния в открытое.
Можно рассмотреть и еще один вариант – канал в открытом состоянии имеет меньшую длину, чем толщина бислоя. Очевидно, что
подобное состояние будет стабилизировано липидами с положительной спонтанной кривизной, как и в случае белок-липидных пор (рис.
24)
Рис. 24. Схематическое представление канала в мембране в закрытом
и в открытом состоянии
Примеры влияния спонтанной кривизны липидных молекул,
формирующих мембраны, на свойства ионных каналов будут подробно рассмотрены в Главе 2.
1.2.6. Толщина бислойных липидных мембран
В случае плоской бислойной липидной мембраны ее толщина
зависит от способа формирования. При формировании плоской мембраны из двух монослоёв по методу Монтала и Мюллера (см. 1.1.2) ее
толщина определяется липидным составом. Известно, что толщина
бислоя увеличивается на 3–3.5 Å при увеличении длины углеводо37
родного хвоста на каждые две –CH2– группы. Присутствие двойной
связи с цис-ориентацией приводит к уменьшению толщины бислоя на
2.5 Å по сравнению с мембраной из насыщенных липидов. В случае
создания бислойных липидных мембран по методу Мюллера-Рудина,
мембрана формируется из раствора липида в растворителе (см. 1.1.2).
При этом ее толщина определяется тем, какой растворитель используется для приготовления раствора липида, поскольку часть растворителя остается в бислое.
Зависимость свойств ионных каналов от толщины мембраны
обусловлена соотношением между длиной гидрофобной части трансмембранного участка порообразующего белка и толщиной бислоя.
Ионный канал стабилен, если длина его гидрофобной части соответствует толщине бислоя. Если же длина гидрофобной части канала
больше или меньше толщины гидрофобной части мембраны, канал
нестабилен и белок теряет активность (рис. 25).
Рис. 25. Схема представления соотношения толщины гидрофобной
части бислоя и гидрофобной части канала
Гидрофобный участок поры в открытом и закрытом состоянии соответствует разной толщине мембраны. В этом случае преимущество
могут получить другие подсостояния проводимости канала, обладающие иными структурными характеристиками, в частности характеризующимися бóльшими или меньшими по величине гидрофобными трансмембранными участками. В качестве примера можно говорить о подсостояниях проводимости колицинового канала (см. 2.3.1).
1.2.7. Текучесть бислойных липидных мембран. Латеральная
гетерогенность свойств липидного бислоя
Липидные бислойные мембраны при физиологических условиях
– жидкие, время колебаний липидной молекулы вблизи одного положения равновесия составляет порядка 10-7-10-8 с. Вместе с тем, молекулы в мембране размещены не беспорядочно, в их расположении наблюдается дальний порядок. Подвижность липидных молекул в основном связана с латеральной диффузией в пределах одного моно38
слоя, в то время как перескок липидных молекул между монослоями
(флип-флоп) совершается достаточно редко. Физическое состояние,
при котором есть дальний порядок во взаимной ориентации и расположении молекул, но агрегатное состояние жидкое, называется жидкокристаллическим состоянием. Различают три основных типа жидких кристаллов: смектические, нематические и холестерические.
Наименьшую упорядоченность имеют нематические жидкие кристаллы. Молекулы их параллельны, но сдвинуты вдоль своих осей одна
относительно другой на произвольные расстояния. В смектических
жидких кристаллах молекулы параллельны друг другу и расположены
слоями. Структура холестерических жидких кристаллов похожа на
структуру нематических, но отличается от них дополнительным закручиванием молекул в направлении, перпендикулярном их длинным
осям. Очевидно, что бислойные липидные мембраны являются примером смектических жидких кристаллов.
Жидкокристаллические структуры очень чувствительны к изменению внешних условий. Например, в фосфофолипидной мембране
при понижении температуры происходит переход из жидкокристаллического в гель-состояние, которое условно иногда называют твердокристаллическим. Очевидно, что проницаемость мембраны в гельсостоянии значительно меньше, чем в жидкокристаллическом. Для
нормального функционирования мембрана должна быть в жидкокристаллическом состоянии. Поэтому в живых системах при продолжительном понижении температуры окружающей среды наблюдается
адаптационное изменение химического состава мембран, обеспечивающее понижение температуры фазового перехода. Это достигается
при увеличении числа ненасыщенных связей в жирно-кислотных липидных хвостах. Другим фактором, помимо температуры, определяющим текучесть мембраны, является холестерин, либо эквивалентный ему стерин (например, мембраны клеток грибков, некоторых
простейших и насекомых вместо холестерина содержат эргостерин).
Одним из признаков фазовой диаграммы «фосфатидилхолинхолестерин» является наличие в широком температурном диапазоне
более упорядоченной фазы при концентрациях холестерина более
25 М %. Интересно отметить, что эргостерин обладает большим упорядочивающим эффектом по сравнению с холестерином.
При обработке мембран неионными детергентами, в частности,
тритоном X-100, выделяется устойчивая фракция. Так, можно обнаружить, что липидные бислои неоднородны по своей структуре: они
содержат «островки» (липидные микродомены или рафты), обога39
щенные холестерином и сфинголипидами и характеризующиеся более
плотной упаковкой липидных молекул по сравнению с окружающий
эти островки жидкокристаллической фазой (рис. 26). Как и отдельные
липидные молекулы, подобные «островки» обладают латеральной
диффузией.
Рис. 26. Липидный микродомен (рафт) в мембране
Липидные рафты представляют собой динамичные структуры.
Они очень небольшие (от нескольких десятков до сотен нанометров в
диаметре), но при действии определенных стимулов могут значительно увеличиваться – до нескольких микрометров. Одним из способов
визуализации фазового распределения в мембранах является конфокальная микроскопия гигантских липосом, сформированных из смеси
различных стеринов, фосфолипидов и сфинголипидов. Для этого используют флуоресцентные липидные метки, для которых заранее известно распределение между упорядоченной и неупорядоченной мембранными фазами.
В последнее время наблюдается значительный интерес к исследованию липидных микродоменов плазматических мембран. Повидимому, липидные рафты вовлекаются в процессы компартментализации белков и разделения биологических функций. Многие из молекул, задействованных в клеточной сигнализации, локализованы в
липидных микродоменах. Возможно, что микродомены ассоциируются с цитоскелетом. Ассоциация ионных каналов с липидными рафтами может быть решающим фактором, определяющим их активность.
40
1.3. РЕГИСТРАЦИЯ ИОННЫХ КАНАЛОВ В МОДЕЛЬНЫХ
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ
1.3.1. Общие представления об ионном транспорте через липидные мембраны
В основе описания транспорта ионов через липидные мембраны
лежат общие представления о таком процессе как совокупности последовательно и параллельно протекающих стадий переноса вещества. Ограничиваясь случаем транспорта через те или другие ионные
каналы, помимо стадии переноса ионов из толщи раствора к мембране и конечной – отвода ионов от мембраны в толщу принимающего
раствора, можно выделить еще три стадии. Ими, очевидно, являются
стадии входа ионов в канал и выхода из него, а также стадия прохождения ионом самого канала. Наличием стадий диффузии в примыкающих к мембране слоях раствора в случае транспорта ионов через
каналы мембран можно пренебречь в силу сферического характера их
протекания к (от) устью(я) канала.
При этом акт входа иона в канал может оказаться стадией адсорции ионов в устье канала и, соответственно, при выходе из канала
стадией десорбции с него. Протекание этих стадий может приводить к
блокированию транспорта тех же или иных ионов при близости их
размеров с радиусом канала. Запись кинетических уравнений, характеризующих скорость протекания таких стадий, как и скорость прохождения ионами самого канала, оказывается зависящей от формы
канала, локализации в нем указанных адсорбционно-десорбционных
стадий, наличия в канале так называемого «воротного механизма»
и/или «селективного фильтра», обеспечивающего избирательность
ионного транспорта через канал (рис. 27).
Рис. 27. Схема строения потенциал-зависимого ионного (натриевого)
канала
41
При количественном описании ионного транспорта используются следующие представления. Фактором, определяющим ионный
транспорт в канале (в общем случае – мембране), является реализующийся в нем профиль потенциальной энергии проникающих ионов.
Различают, по меньшей мере, три компоненты потенциальной энергии Wi ионов i, проникающих через канал, а именно: борновскую
энергию поляризации ионом среды канала
( z i e) 2  1
1
(17)
Wв 


,
2ri   c  w 
где ziе и ri заряд иона и его радиус (е – модуль заряда электрона); εс и
εw – значения диэлектрических постоянных внутри канала и в растворе; некулоновскую энергию Wnc, связанную с изменениями химических взаимодействий иона (например, в результате частичной десольватации) при его переходе из раствора в канал, и кулоновскую составляющую:
Wc  z i e(x) ,
(18)
где φ(x) – локальное значение потенциала.
Более корректные оценки первых двух составляющих энергии
иона показывают, что они, как и третья – кулоновская, зависят от локализации иона в канале (координаты x); ион, находясь в канале
(мембране), «чувствует» присутствие более полярной фазы (раствора)
благодаря так называемому эффекту «мнимых отображений», который обусловлен дальнодействующим характером электрических сил.
Кроме того, на границе раздела фаз возникают изменения их диэлектрических постоянных и этот эффект зависит, в частности, от размеров канала.
Как уже отмечалось ранее, дипольная составляющая скачка потенциала снижает энергию аниона в канале, а для катиона увеличивает таковую. Как следствие, диффузионный барьер для транспорта
аниона (т.е. значение потенциальной энергии, отвечающее середине
мембраны) оказывается меньшим, чем реализующийся для катиона и,
следовательно, такой канал должен обладать анионной специфичностью. Не нуждается, по-видимому, в пояснениях то, что ситуация может измениться на противоположную (канал станет катионоспецифичным) при наличии отрицательного поверхностного заряда мембраны (или самого канала) либо при различии химических взаимодействий этих ионов с раствором и каналом.
Фундаментальное значение при описании транспорта играет по42
нятие электрохимического (химического, для нейтральных частиц)
потенциала ионов:
~    z e ,

(19)
i
i
i
где μi – химический потенциал тех же ионов, а φ – электрический потенциал в месте нахождения иона. В общем случае химический потенциал i-ого сорта частиц дается соотношением:
 i   i0  kT  ln ai   i0  kT  ln Ci  kT  ln  i ,
(20)
где ai – активность данного сорта ионов, Ci – их концентрация, μi0 –
стандартный химический потенциал (т.е. значение μi при ai =1), γi –
коэффициент активности, равный единице в случае приближения
«идеального раствора», которое часто используется. Требование минимума свободной энергии системы в равновесном состоянии, очевидно, эквивалентно постоянству значений μ̃i (различающихся по
своей величине для разных i) во всех точках рассматриваемой системы. Более того, требование постоянства μ̃i остается справедливым и в
случае равновесия в гетерогенных системах; электрохимический потенциал i-ых ионов, находящихся в разделяемых мембраной растворах, обязан совпадать с таковым для тех же ионов в канале. Для случая процессов, протекающих при не слишком больших удалениях от
равновесия, Гиббсом было предложено использовать пропорциональность потока i-ых частиц, Ji , действующей на них силе, роль которой
в отсутствие сопряжения с потоками других частиц играет градиент
электрохимического потенциала:
DC
~,
J i   i i  grad 
(21)
i
kT
где Di – коэффициент диффузии.
Уравнение (21) и более общие (с учетом эффектов сопряжения)
лежат в основе описания явлений переноса (диффузии, теплопередачи, электроосмоса и т.д.). Обычно они используются для случая однородных фаз, т.е. сред, для которых можно пренебречь зависимостью
стандартных потенциалов μi0 от положения частиц в них, что, очевидно, корректно вдали от границ раздела фаз. В этих случаях подстановка в (21) выражения для μ̃i (с учетом (20)) приводит к хорошо известному электродиффузионному уравнению:
J i   Di  gradCi  ( zi Di Ci e / kT )  grad
(22)
либо к 1-ому закону Фика для нейтральных молекул
J i   Di  gradC i
(23)
В случае транспорта частиц через мембраны и, тем более, через
ионные каналы с зависимостью μi0 от положения частиц необходимо
43
считаться, т.к. выше было показано, что энергия проникающих ионов
в самом канале Wi(x) зависит, по меньшей мере, от расстояния x.
Cумма составляющих энергии иона в канале Wi ( x)  Wв  Wnc  Wc отвечает концентрационно независимой части электрохимического потенциала рассматриваемого типа ионов:
~  W  W  W  kT  ln C

(24)
i
в
nc
c
i
Последнее, в частности, означает, что в рассматриваемом приближении сумма борновской и некулоновской составляющих есть
ничто иное как стандартный химический потенциал ионов внутри канала, зависящий от их локализации
Wв  Wnc   i0 ( x) ,
(25)
в то время как кулоновская составляющая Wc  zi e(x) отличает
электрохимический потенциал ионов от их химического потенциала
μi(x). Поэтому для случая транспорта ионов в каналах (или мембранах) с переменным профилем потенциальной энергии Wi обобщением
(22) является уравнение
 z DC e
J i   Di  gradCi   i i i   grad  Di Ci grad Wв  Wnc 
(26)
kT


Последнее слагаемое правой части (26) отвечает составляющей
ионного потока, которая возникает в поле сил, обусловленных энергетической (или химической) неоднородностью рассматриваемой системы (в данном случае – ионов в канале либо в мембране в целом).
Отмеченные особенности трактовки ионного транспорта в тонких мембранах не полностью исчерпывают круг проблем его описания. В случае транспорта через каналы в искусственных и биологических мембранах не меньшее значение для понимания этого процесса
имеют вопросы пространственной и химической организации самих
каналов, энергетики их образования и функционирования и т.п. Решение таких вопросов во многом определяется структурой канала и, в
первую очередь, его радиусом. Так для каналов, радиус которых
практически совпадает с радиусом проникающих через них ионов, говорят об «однорядной» диффузии. Учет такого характера диффузии в
(26) можно осуществить, полагая Di, равным произведению:
Di  Di0 1   i ( z ) ,
(27)
0
где θi (z) – степень заполнения канала ионами, Di – их истинный коэффициент диффузии.
Подобное переопределение отражает ту особенность однорядной
диффузии, что протекание ее элементарного акта возможно только
при наличии перед движущимся ионом свободного места, не занятого
44
такой же частицей. Часто оказывается, что в канале имеется ограниченное и достаточно малое число таких «узких» мест, прохождение
которых ионами лимитирует процесс их переноса в целом. В таких
случаях используются уравнения дискретного описания или так называемой «эйринговской» кинетики. Так, при наличии в канале лишь
одного места для степени заполнения его проникающими частицами
θi (1) записывается уравнение:
d i (1)
 J1  J 2 ,
dt
(28)
где t – время, J1 – скорость входа (адсорбции) частиц, J2 – скорость
выхода (десорбции) частиц в направлении их движения. В случае
двух мест ур-ние (28) дополняется аналогичным для степени заполнения второго места θi (2):
d i ( 2)
 J2  J3 ,
dt
(29)
и так далее с увеличением числа n узких мест в канале. В стационарном режиме (
d i ( k )
 0,
dt
где k = 1, 2,…, n) из этих уравнений следует
постоянство потоков Jk = Jk+1 так, что при задании явных связей таких
потоков с концентрациями проникающих ионов, степенями заполнения мест и скачком потенциала в канале может быть получено итоговое выражение для проницаемости (проводимости) канала по данному сорту ионов. Добавим к этому, что такое дискретное описание используется для числа мест n ≤ 3, поскольку с дальнейшим увеличением n его результаты уже практически совпадают с вытекающими из
изложенного выше непрерывного подхода.
Другим аспектом описания транспорта через каналы искусственных и биологических мембран является, как это уже отмечалось
выше, учет особенностей формирования и функционирования каналов, в частности, их перехода из непроводящего состояния в проводящее и обратно. Хотя решение связанных с этим вопросов часто оказывается общим для некоторых однотипных каналов, разнообразие
групп таких сходных каналов делает целесообразным их рассмотрение при изложении соответствующих результатов для конкретных
систем (см. Главу 2).
Наконец, последним и существенным для описания транспорта
является частично затрагивавшийся вопрос о распределении потенциала по длине канала. В случае однородных (по их длине) каналов,
как правило, используется приближение постоянного поля. Иными
словами, потенциал предполагается линейно зависящим от расстояния x внутри канала. Для каналов, обладающих набором узких мест,
45
это приближение заменяется набором ступенчатых скачков потенциала на таких местах, в сумме равным общему падению потенциала по
длине канала.
Суммируя сказанное выше, можно говорить о наличии достаточно проработанных представлений об ионном транспорте через каналы тонких мембран, что позволяет перейти к изложению конкретных методик обнаружения таких каналов и изучения их свойств.
1.3.2. Электронная схема устройства для регистрации токов, протекающих через ионные каналы
Задача измерения ионных токов, протекающих через одиночные
каналы – это задача измерения очень малых токов. Типичное значение тока, протекающего через мембранные поры, составляет порядка
1 пА. История решения этой задачи включала три этапа:
1) Один внутриклеточный электрод. Измерение разности потенциалов.
Первоначально электрические явления на клеточных мембранах
измеряли с помощью острых стеклянных микроэлектродов. Техника с
одним внутриклеточным электродом позволяет измерять разность потенциалов или ток, но не даёт возможности фиксировать их на определенном уровне, так что во время исследования одновременно меняются оба параметра. Кроме того, классические острые микроэлектроды дают возможность измерения исключительно на целой клетке,
которая имеет, как правило, различные типы транспортный систем.
Все это затрудняет интерпретацию данных, полученных таким методом.
2) Двухэлектродная фиксация потенциала.
Тот факт, что фиксация трансмембранного потенциала позволит
измерять мембранную проводимость по изменениям тока при постоянном напряжении, был впервые осознан еще в 30-х гг. XX века, и тогда же английские исследователи Алан Ходжкин и Эндрю Хаксли начали эксперименты с двухэлектродной фиксацией потенциала. Суть
метода состоит в следующем. В клетку вводятся два электрода, ещё
один – электрод сравнения – остается вне клетки. Первый внутриклеточный электрод служит для измерения трансмембранной разности
потенциалов (то есть разности потенциалов между ним и электродом
сравнения), второй может подавать ток. Специальное устройство –
генератор сигнала – задает командный потенциал, которому должен
быть равен трансмембранный потенциал. Измеренный трансмембранный потенциал подается на вход устройства сравнения, которое вы46
читает измеренный потенциал из командного и, в зависимости от величины разности, подает ток на токовый электрод так, чтобы скомпенсировать эту разницу. Монитор тока, в свою очередь, постоянно
измеряет величину тока, которая для этого необходима. В 1930-х и
40-х годах, когда работали Ходжкин и Хаксли, не существовало микроэлектродов, поэтому в качестве внутриклеточных электродов использовались тонкие проволоки. Это определило выбор объекта –
единственной животной клеткой, в которую можно было ввести две
изолированные друг от друга проволоки, был гигантский аксон кальмара. На этом объекте методом двухэлектродной фиксации потенциала исследователи выполнили эксперименты, в которых была установлена ионная природа потенциала действия и впервые постулировано
существование ионных каналов. Ходжкин и Хаксли были удостоены
Нобелевской премии в 1963 г., которую поделили с Дж. Экклзом, получившим ее за исследования в области синаптической передачи.
Двухэлектродная фиксация потенциала применяется и в настоящее
время, с использованием острых стеклянных микроэлектродов, однако даже с ними эта методика имеет существенные ограничения: вопервых, два электрода могут быть введены только в весьма крупную
клетку (например, ооцит лягушки), во-вторых, она позволяет измерять проводимость всей клеточной мембраны, со всеми, как правило,
разнородными каналами в ней.
3) Метод локальной фиксации потенциала («patch-clamp»).
Эта электрофизиологическая методика для изучения свойств
ионных каналов состоит в том, что фрагмент клеточной мембраны
изолируется с помощью специальной пипетки. Метод локальной фиксации потенциала дает возможность экспериментатору контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны, а также помещать ее в среду с определенным химическим составом. В этих хорошо контролируемых условиях измеряют ионные токи, проходящие
через мембрану, что, в конечном итоге, позволяет делать выводы о
том, как ионные каналы реагируют на электрическое и химическое
воздействие. Метод настолько чувствителен, что позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул,
взаимодействующих с мембраной. Немецкие исследователи Эрвин
Неэр и Берт Сакман, разработавшие эту методику, получили в 1991
году Нобелевскую премию.
Упрощенная блок-схема установки для регистрации активности
одиночных ионных каналов представлена на рис. 28.
47
Рис. 28. Блок-схема установки для регистрации активности ионных каналов
Базой для установки служит микроскоп. Основным элементом
усилителя для «patch-clamp», определяющим его качество, является
высокочувствительный малошумный входной каскад. Упрощенная
схема входного каскада усилителя для регистрации одиночных ионных каналов показана на рис. 29. Микросхема DA1 включена в режиме преобразователя ток-напряжение, микросхема DA2 вычитает из
сигнала с выхода DA1 управляющее напряжение. Усилитель ВЧ компенсирует низкое пропускание входным каскадом высокочастотных
компонент сигнала.
Рис. 29. Принципиальная схема входного каскада усилителя для
«patch-clamp»
Сопротивление в цепи обратной связи определяет максимальный ток, который можно зарегистрировать усилителем (типичные
значения RООС – 100 МОм, 10 ГОм, 50 ГОм). Поскольку тепловой
(Джонстоновский) шум таких высокоомных сопротивлений вносит
значительный вклад в общий шум усилителя, в некоторых усилителях
сопротивление обратной связи охлаждается. Существуют и схемы
принципиально менее шумных входных каскадов – с использованием
конденсаторов.
Измерение токов, протекающих через модельные бислойные
48
липидные мембраны, также осуществляется в режиме фиксации потенциала. Для подачи трансмембранного напряжения и отведения
сигнала с мембраны, вместо пипеточного и внешнего электрода, используют хлорсеребряные электроды (Ag/AgCl), погруженные в водные растворы отделений экспериментальной кюветы (рис. 9 из 1.1.2).
Электрическая схема установки аналогична схеме установки для
«patch-clamp».
1.3.3. Характеристики одиночных пор
1.3.3.1. Проводимость и время жизни каналов
Ионные каналы клеточных мембран и каналы, образуемые экзогеными соединениями, имеют пачечный характер активности, т. е.
одиночные импульсы тока объединяются в серии (пачки) импульсов
(рис. 30). В пределах пачек канал осциллирует между открытым и закрытым (иногда его называют блокированным) состоянием. Пачечную активность характеризуют длительность пачек, межпачечных интервалов и вероятности нахождения канала в открытом и блокированном состоянии в пределах пачки. Считается, что пачечная активность отражает многостадийность процессов сборки-разборки каналов. Пачечная активность определяет в целом кинетическое поведение каналов и их потенциалозависимость. В последнем случае формирование каналом одиночных импульсов тока связывают с первичным «воротным» механизмом.
А
I, пА
Б
I, пА
0,8
1,5
0,6
1,0
0,4
0,5
0,2
0,0
0,0
240
250
260
330
340
t, с
840
843
882
885
t, с
Рис. 30. Пачечная активность сирингомициновых (A) и амфотерициновых (Б) каналов. A – мембраны сформированы из эквимолярной
смеси диолеилфосфатидилсерина (ДОФС) и диолеилфосфатидилэтаноламина (ДОФЭ), омываются 0.1 М NaCl, pH 6.0. Трансмембранный
потенциал (V) равен 150 мВ; Б – мембраны сформированы из смеси
дифитаноилфосфатидилхолина (ДФФХ) и холестерина в соотношении 67 : 33 М %, омываются 2 М КCl, pH 7.0, V = 100 мВ
49
Одиночные скачки тока характеризуются двумя величинами:
амплитудой (в пА) и временем жизни (временем пребывания канала в
открытом состоянии, в мс). Для того чтобы описать ионный канал,
необходимо определить его среднюю проводимость и среднее время
жизни. Усреднение величин требует статистической обработки полученных данных. Для построения гистограмм флуктуаций тока значения трансмембранных токов определяют по изменениям амплитуды
тока при открывании (или закрывании) одиночных каналов. Для этого
строят группированный статистический ряд (совокупность промежутков разбиения и соответствующих им частот). Число промежутков
подбирается эмпирически, во многих случаях, для определенности,
можно руководствоваться формулой Старджесса k  1  3.3 lg N . Общее
число событий (N), использующихся для анализа при фиксированном
значении трансмембранного потенциала, должно соответствовать
критериям достоверности распределения; в общем случае, это достигается увеличением объема выборки. По оси ординат откладывают
относительные частоты. Пик аппроксимируют плотностью нормального распределения с параметрами генерального распределения, соответствующими средней амплитуде и среднеквадратическому отклонению от центрального значения тока. В качестве критерия проверки гипотезы о законе распределения чаще всего используют наиболее обоснованный критерий χ2 (обычно достаточно уровня значимости 0.05). Проводимость каналов (g) определяют как отношение
среднего тока к поданной на мембрану разности потенциалов. По
проводимости можно грубо оценить размер поры. Апроксиммация
гистограмм при всех измеренных потенциалах позволяет построить
вольт-амперную характеристику канала (или зависимость проводимости от напряжения на мембране). По форме вольт-амперной характеристики можно судить о распределении заряда вдоль оси поры.
При определении среднего времени пребывания каналов в открытом состоянии (времени жизни каналов), следует использовать
случаи функционирования в мембране единственного канала или учитывать вероятность случайного совместного открывания (закрывания)
нескольких каналов. Среднее время жизни канала, τ, определяют как
показатель экспоненциальной функции, аппроксимирующей полученное распределение. Пачечная активность ионных каналов подразумевает двухэкспоненциальность распределения времени жизни непроводящего состояния: быстрая экспонента соответствует распределению времени между одиночными импульсами, медленная – между
50
пачками.
1.3.3.2. Многоуровневая проводимость ионных каналов
Во многих случаях, задача усреднения параметров одиночных
пор осложняется тем, что каналы демонстрируют многоуровневую
проводимость, т.е. наблюдаются скачки тока различной величины.
Для примера на рис. 31 показаны записи флуктуаций трансмембранного тока, соответствующие функционированию в мембране одиночных ионных каналов, образованных противогрибковым циклическим
липодепсипептидом сирингомицином Е и антимикробным пептидом
цекропином.
Для описания работы каналов с многоуровневой проводимостью
необходимо установить среднюю проводимость и время жизни всех
подсостояний проводимости. Для этого при построении гистограмм
флуктуаций трансмембранного тока по оси ординат откладывают
приведенные частоты значений трансмембранного тока и полученное
распределение аппроксимируют суммой нормальных. В случае приведенных частот площадь под пиком дает вероятность флуктуации
тока с центральным значением. Это дает возможность рассчитать
средний нормированный ток (и соответствующую ему проводимость)
как сумму произведений центральных значений токов (проводимостей) на площадь под пиками по числу пиков на гистограмме. Подобный подход незаменим в том случае, когда одним параметром, характеризующим проводимость, нужно описать функционирование каналов при изменении условий.
А
Б
0 пА
5 пА
20 с
20 пА
0 пА
10 с
Рис. 31. Многоуровневая проводимость сирингомициновых (А)
и цекропиновых (Б) каналов. Мембраны сформированы из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ. А – Омывающий мембрану раствор
0.1 M NaCl (pH 6.0), V = -100 мВ; Б – омывающий мембрану раствор
0.1 M KCl (pH 7.4), V = 25 мВ
51
Многоуровневая проводимость широко распространенное явление, свойственное большому числу ионных каналов клеточных мембран и каналам, образуемым некоторыми токсинами. В литературе
обсуждается несколько моделей многоуровневой проводимости ионных каналов: флуктуации эффективного диаметра поры, кластеризация в специфических мембранных областях за счет пептид-пептидных
и пептид-липидных взаимодействий, кооперативное функционирование каналов в кластере за счет общего воротного механизма. Рассмотрим их более подробно далее:
а) Флуктуации эффективного диаметра поры
 в результате изменения числа каналообразующих молекул
Классическим примером служат потенциал-зависимые катионные каналы, образованные антибиотиками грибкового происхождения – аламетицином и родственными ему соединениями, зервамицином и трихотоксином (рис. 32).
Рис. 32. Модель образования гексамеров и октамеров трихотоксина. Вид сверху
В ряду трихотоксин, аламетицин, зервамицин наиболее вероятная (средняя) степень олигомеризации мономеров в канале увеличивается: 6, 8-10, 13, соответственно. В некоторых случаях, при переходе канала в состояние с другой проводимостью изменяется не число
олигомеров, образующих трансмембранную пору, а число трансмембранных спиралей каналообразующего белка. Так, токсин E.coli колицин Е1 индуцирует в липидных бислоях ионные каналы с двумя
подуровнями проводимости 60 и 600 пСм. Считается, что 600 пСм
канал образуется из 60 пСм канала путём увеличения числа трансмембранных спиралей, участвующих в формировании поры (рис. 33).
52
Рис. 33. Модель образования колициновых каналов с проводимостью 60 и 600 пСм. Липиды, участвующие в образовании стенок
поры, нарисованы зелёным; две гидрофобные трансмембранные αспирали (VIII-IX) нарисованы серым
в результате изменения конформации каналообразующего
белка/ов
Хорошим примером могут служить механо-чувствительные
ионные каналы Escherichia coli (EcoMscL) с девятью подсостояниями
проводимости, являющимися результатом конформационных переходов из закрытого в полностью открытое состояние (рис. 34).
Рис. 34. Конформационный переход EcoMscL-канала из полностью закрытого (1) в полностью открытое состояние (12). Вид сверху
Считается, что причиной наличия подсостояний проводимости у
потенциал-зависимых калиевых каналов, а также потенциалзависимых Ca2+-активируемых калиевых каналов является последовательный переход четырех идентичных субъединиц из инактивированного в активированное состояние (рис. 35).
53
Рис. 35. Стадии перехода канала из инактивированного и полностью активированное состояние. (А) – полностью закрытое состояние
канала, в котором все субъединицы инактивированы, (Б, В, Г) – несколько коротко живущих состояний, в которых не все субъединицы
активированы, (Д) – полностью открытое состояния К+-канала
б) Кластеризация ионных каналов в специфических мембранных областях
Межклеточная передача сигнала предполагает концентрацию
необходимых белков в синапсе. Например, открывание Ca2+-каналов в
пресинаптической терминали обеспечивает экзоцитоз медиатора в
синаптическую щель. Функционирование хемочувствительных каналов постсинаптической мембраны приводит к возникновению постсинаптического мембранного потенциала, что является сигналом для
генерации потенциала действия. В большинстве случаев конкретные
механизмы, обеспечивающие необходимую организацию синаптических белков, неизвестны. Предполагается, что основную роль в этом
процессе играют пептид-пептидные взаимодействия. Например, в
нервномышечных синапсах позвоночных белок рапсин вызывает кластеризацию ацетилхолиновых рецепторов. В тормозных синапсах
центральной нервной системы позвоночных глициновые рецепторы
агрегируют при взаимодействии с гефирином.
Передача нервного импульса по миелиновым волокнам осуществляется сальтоторно, т.е. потенциал действия генерируется в перехватах Ранвье, а затем с декрементом распространяется от одного перехвата к другому. Такая передача обеспечивается кластеризацией
потенциал-зависимых Na+-каналов в перехватах Ранвье.
Существует также много примеров кластеризации ионных каналов в различных мембранных доменах, в том числе липидных рафтах,
54
что важно для внутриклеточной сигнализации. Так, многоуровневую
проводимость калиевых каналов кардиомиоцитов можно связывать с
их клатриновой ассоциацией.
в) Кооперативное функционирование каналов в кластере
Гипотеза кластерной организации ионных каналов как основы
многоуровневой проводимости впервые была предложена Гелетюком
и Казаченко в 1982 г. Вскоре появились и другие работы, авторы которых объясняли многоуровневый характер проводимости в рамках
кооперативного взаимодействия воротных механизмов отдельных
элементарных каналов (рис. 36).
Рис. 36. Модель кооперативной кинетики двух соседних элементарных каналов. Вероятность открывания/закрывания элементарного
канала зависит от состояния соседнего элементарного канала (С – закрытое, О – открытое). Пара каналов стабильна, если оба канала находятся в одинаковом состоянии (либо открытом, либо закрытом).
Открывание одного из соседних каналов является сигналом для открывания второго: СС↔ОС→ОО. Аналогичным образом, закрывание
одного из каналов, приводит к закрыванию соседнего: ОО↔ОС→СС
Гипотеза кластерной организации ионных каналов наиболее
полно изложена в работах Гелетюка и Казаченко. Авторы исследовали: 2 типа потенциал-зависимых K+-каналов (медленный и быстрый) в
нейронах моллюска, потенциал-зависимый K+-канал в глиальных
клетках моллюска, хемочувствительный Ca2+-активируемый K+-канал
в нейронах крысы и хемочувствительный Cl–-канал, активируемый
Ca2+ и K+, в нейронах моллюска. Показано, что в распределении подсостояний проводимости всех указанных каналов можно выделить 16
равноотстоящих друг от друга пиков, соответствующих 16 уровням
проводимости. Интервал между соседними пиками, соответствующий
элементарной проводимости, авторы назвали квантом. Его среднее
значение для разных типов каналов различалось. Было установлено,
55
что использование более высоких, по сравнению с физиологическими, концентраций токопереносящих ионов, когда степень разрешения
подсостояний значительно возрастает, число подсостояний проводимости каналов увеличивалась в 4 раза (до 60–70). Эта цифра, повидимому, близка к действительному числу подсостояний проводимости каналов. Потенциал-зависимость проводимости и ионная селективность каналов идентичны во всех подсостояниях. Переходы
каналов между подсостояниями обладают высокой степенью кооперативности (синхронности). На записях токов с большим временным
разрешением переходы между подсостояниями наблюдаются как
мгновенные скачки проводимости. Кроме того, Гелетюк и Казаченко
обнаружили интересное явление; индуцированный обратимый распад
кластеров на мономеры при удалении из среды ионов Ca2+ и добавлении восстановителей S-S-групп. На основание этих результатов был
сделан вывод о том, что каналы–субъединицы объединяются в кластер посредствам, по меньшей мере, двух типов связей – солевых и
дисульфидных мостиков. Распад кластеров может происходить и под
действием физических факторов. Так, синхронное открывание элементарных каналов нарушается и при действии микроволнового излучения.
Множество примеров кластерной организации каналов можно
обнаружить и в случае пор, образуемых токсинами. В частности, совпадение селективности и размеров каналов с различной кратной проводимостью свидетельствует в пользу кластерной организации латротоксиновых, бетиколиновых и сирингомициновых каналов. Cry δэндотоксины также образуют кластеры, состоящие из разного числа
идентичных каналов, каждый из которых имеет радиус порядка 1.01.3 нм.
1.3.4. Определение воротного заряда канала
На рис. 37 показана запись кинетики трансмембранного тока,
индуцированного противогрибковым циклическим липодепсипептидом сирингомицином Е, в ответ на приложение трансмембранного
напряжение и смене его полярности. Видно, что подача положительного напряжения вызывает открывание, а отрицательно – закрывание
каналов. Это один из примеров проявления потенциалчувствительности ионных каналов.
56
I, пА
V = - 50 мВ
V = 50 мВ
2
0
0
5
10
15
t, мин
-2
-4
Рис. 37. Кинетика изменения тока, индуцированного сирингомицином Е, при трансмембранной разности потенциалов V = ± 50 мВ.
Мембрана сформирована из эквимолярной смеси ДОФЭ и ДОФС и
омываются раствором 0.1 М NaCl, pH 6.0
Потенциал-зависимость открывания/закрывания определяется
так называемым эффективным воротным зарядом канала (Q). Q характеризует перемещение заряженных компоненов воротного механизма при открывании ионного канала. Известно, что в стационарных
условиях число открытых ионных каналов (Nch(V)) связано с работой
образования каналов (Wch) согласно равенству:
N Pr
,
(30)
N ch (V ) 
Wch
1  exp( )
kT
где NPr – количество предшественников каналов, т.е. общее число открытых и закрытых каналов в мембране. Работа образования каналов Wch, включает несколько компонентов:
Wch  U ch  eQV  V 2 ,
(31)
где Uch – химическая составляющая, определяющая работу образования стенок канала, затрачиваемую при переходе молекул каналоформера и (или) липида с поверхности бислоя в канал. Эффективный
воротный заряд Q входит в состав потенциал-зависимой составляющей работы образования канала eQV. Электрострикционная составляющая V2, обусловлена давлением, создаваемым электрическим
полем в объеме канала. В случае, если насыщения проводимости
мембран при увеличении величины трансмембранного потенциала не
наблюдается, можно предположить, что в экспериментальных условиях работа образования каналов существенно превышает kT (Wch >>
kT) и, следовательно:
57
eQV  V 2
)
(32)
N ch (V )  N Pr exp(U ch )  exp(
kT
Таким образом, эффективный воротный заряд (Q) и электрострикционный коэффициент  могут быть получены из зависимости
между числом открытых каналов и величиной трансмембранной разности потенциалов (Nch(V)). Ситуация упрощается, когда число элементарных каналов экспоненциально зависит от трансмембранного
потенциала, а следовательно, работа образования канала линейно зависит от V, т.е. электрострикционная составляющая не вносит существенного вклада в работу образования канала:
eQV
)
(33)
N ch (V )  N Pr exp(U ch )  exp(
kT
Существует два метода определения воротного заряда канала,
основанных на приведенных уравнениях:
1) из наклона прямой зависимости натурального логарифма
числа открытых каналов от безразмерного потенциала Q 
d (ln N ch )
;
d (eV / kT )
2) из наклона прямой зависимости натурального логарифма
производной по времени числа открытых каналов от безразмерного
потенциала Q 
d (ln dN ch / dt )
.
d (eV / kT )
1.3.5. Определение размеров и формы канала
Для установления внутренней геометрии и определения размеров устьев водной поры канала используют введение полиэтиленгликолей (ПЭГ) различной молекулярной массы в омывающие мембрану
растворы с одной стороны мембраны. ПЭГ различной молекулярной
массы поочередно добавляют в раствор с одной стороны мембраны
(15-20 вес. %). Чтобы уравновесить осмотическое давление с разных
сторон бислоя, с противоположной стороны вводят в той же концентрации непроникающий в канал ПЭГ с большой молекулярной массой. Уменьшение проводимости поры при введении неэлектролитов
обусловлено уменьшением удельной электропроводности раствора в
канале, которая зависит от весовой концентрации (мономерной плотности) ПЭГ в канале. Отношение весовой концентрации полимера в
канале к весовой концентрации ПЭГ в околомембранном растворе –
коэффициент распределения полимера между порой и раствором.
Макромолекулу ПЭГ с точки зрения ее гидродинамического поведения можно аппроксимировать сплошной непротекаемой сферой, ра58
диус которой зависит от числа мономеров в цепи, т.е. от молекулярной массы полимера. Очевидно, что коэффициент распределения ПЭГ
между раствором и каналом зависит от соотношения радиусов полимерной частицы и водной поры. Если гидродинамический радиус полимера много больше радиуса поры, то вероятность попадания такого
ПЭГ в канал пренебрежимо мала, т.е. весовая концентрация ПЭГ в
канале равна 0, а, следовательно, и коэффициент распределения равен
0. В этом случае проводимость канала в присутствии и в отсутствие
неэлектролита в околомембранных растворах одинакова. Полимерная
частица, радиус которой много меньше радиуса поры, легко проникает в канал, и, следовательно, весовая концентрации ПЭГ в канале равна весовой концентрации ПЭГ в околомембранном растворе, т.е. коэффициент распределения равен 1. В этом случае отношение проводимости канала в отсутствие ПЭГ в околомембранных растворах к
проводимости канала в присутствии легко проникающего ПЭГ равно
отношению удельных электропроводностей соответствующих растворов. Учитывая вышесказанное, можно ожидать, что изменения
проводимости одиночного канала при последовательном введении
неэлектролитов различной молекулярной массой с разных сторон
мембраны будут отражать размер устьев канала.
Известно, что ПЭГ увеличивают активность ионов в растворе,
поэтому проводимость канала в присутствии ПЭГ данного молекулярного веса нормируют на усредненную проводимость в присутствии непроникающих ПЭГ.
Сопротивление проводника любого вида R связано с его удельным сопротивлением ρ уравнением:
R
l
,
S
(34)
где l — длина проводника, м; S — площадь его поперечного сечения, м2.
Электрическая проводимость G — величина, обратная сопротивлению проводника R:
G
1 1S
S

 ,
R  l
l
(35)
измеряется в сименсах (См = 1/Ом).
Величина χ, обратная удельному сопротивлению:
59
1
 ,

(36)
называется удельной электрической проводимостью и представляет собой проводимость единичного объема раствора, помещенного
между плоскими параллельными инертными электродами единичной
площади, находящимися на расстоянии друг от друга, равном единице. Удельная электрическая проводимость измеряется в См × м–1
(кондуктометры, используемые для измерения электрической проводимости, обычно проградуированы в мСм × см–1 или в мкСм × см–1).
Это все рассчитано для цилиндрической поры.
В случае конической поры проводимость канала можно записать как:
1
L

dx
 ,
(37)
g ( w)   
2
 0 ( w, x)R ( x) 
где χ(w,x) – удельная электропроводность раствора с ПЭГ, которая зависит от его молекулярной массы (w) и от координаты вдоль
оси канала (x); R( x ) - локальный радиус канала: при отсчете x от
lx
большего устья поры R( x)  Rцис  ( R транс  Rцис )
, при отсчете x от
l
x
меньшего устья поры R( x)  Rцис  ( R транс  Rцис ) . Чтобы вычислить
l
этот интеграл необходимо определить функцию χ(w,x).
Известно, что электропроводность раствора практически линейно уменьшается при увеличении весовой концентрации ПЭГ от 0 до
25 вес. %. Поэтому χ(w,x) можно определить как:
( w, x)   0  p ( w, x)( 0  ) ,
(38)
где χ0 – удельная электропроводность раствора в отсутствие
ПЭГ (85 мСм/см), χ – удельная электропроводность раствора с ПЭГ,
p(w,x) – коэффициент распределения ПЭГ между порой и раствором,
т.е. отношение мономерной плотности в канале к мономерной плотности в растворе. Для полимеров, которые не могут попасть в канал,
коэффициент распределения равен 0 и χ(w,x) = χ0. В случае ПЭГ, для
которых доступен весь объем поры, коэффициент распределения равен 1 и соответственно χ(w,x) = χ.
Таким образом, сложность вычисления интеграла в уравнении
(36) состоит в определении функции p(w,x). Красильников с соавто60
рами предположили, что для конического канала при введении полимеров со стороны большего устья поры:
0; 0  x  Ф( w) L
p ( w, x)  
(39)
1
;
Ф
(
w
)
L

x

L

где Ф(w) – заполнение канала полимером, которое характеризует отношение части канала, доступной для ПЭГ данного молекулярного веса, к общей длине канала.
Рис. 38. Сравнение профилей коэффициента распределения по
оси конусообразного канала, которое определяется формулой (39) – А
и формулой (44) – Б
Рис. 38 А показывает профиль коэффициента распределения
ПЭГ в канале, построенный на основании уравнения (39). Такой эмпирический подход был с успехом применен для изучения формы ряда ионных каналов, таких как колициновый, α-токсиновый и холерный токсин. Более реалистичная картина описания распределения
ПЭГ в канале предполагает не ступенчатую, как показано на рис.
38 А, а гладкую функцию p(w,x). Согласно де Жену изменение свободной энергии полимера при его попадании в цилиндрический канал
пропорционально числу мономеров в полимерной цепи, а, следовательно, ее молекулярному весу:
F ( w)w
(40)
К сожалению, на основании теории де Жена нельзя определить
численное значение коэффициента пропорциональности.
Формула Больцмана дает соотношение между уменьшением энтропии при попадании полимерной цепи в канал и коэффициентом
распределения, который характеризует отношение возможных кон61
формаций цепи в поре к их числу в растворе:
S ( w)  k ln p( w) .
Поскольку
F ( w)
S ( w) 
,
T
то
F ( w)
p ( w)  exp(
).
kT
(41)
(42)
(43)
Согласно (40) уменьшению коэффициента распределения в e раз
по сравнению с равновесным распределением (p = 1.0) соответствует
увеличение свободной энергии на 1 kT. На основании результатов исследования других каналов, таких как VDAC или OmpF порин свободная энергия, связанная с уменьшением числа возможных конформаций полимерной цепи в канале по сравнению с раствором, равна
1 kT, когда отношение гидродинамического радиуса ПЭГ к радиусу
канала (γ) близко к 1.68. Учитывая (40) и то, что для полимерной цепи
в хорошем растворителе (вода для ПЭГ) с учетом исключенного объема (невозможности самопересечений полимерной цепи) r ( w)w3 / 5 , а
коэффициент распределения полимера между каналом и раствором
при введении ПЭГ со стороны более широкого устья поры можно
представить как:
  r ( w) 5 / 3 
  ,
p ( w, x)  exp  
(44)

R
(
x
)




где r(w) – гидродинамический радиус полимерной частицы, а γ –
эмпирический коэффициент. Поскольку уравнение (44) описывает
равновесное распределение, то в случае односторонней (асимметричной) добавки ПЭГ, которая соответствует неравновесным условиям,
выражение (44) нужно применять с осторожностью. Тем не менее,
можно полагать, что при конической форме канала со значительной
разницей в размерах устьев, неравновесные эффекты малы, если полимерные частицы проникают в канал со стороны большего радиуса.
Уравнение (44) предсказывает постепенное уменьшение p(w,x) для
полимера определенного молекулярного веса с увеличением радиуса
канала, что проиллюстрировано на рис. 38 Б.
В случае введения ПЭГ со стороны меньшего устья преобладают неравновесные процессы. Около устья канала коэффициент распределения может быть рассчитан по формуле (44), а для остальной
части канала правомерно использовать аппроксимацию Фика-Якобса.
62
Этот подход описывает диффузионные процессы в порах переменного радиуса, в том числе для случая увеличения радиуса:
L
  r ( w) 

p ( w, x)  exp  
R

  cis 
5/ 3
2
  R ( x)dx
,
 Lx
2
  R ( x)dx
(45)
0
где х – расстояние вдоль оси канала, отсчитываемое от меньшего устья поры. Таким способом можно определить размеры устьев
конической поры.
1.3.6. Изучение селективности ионных каналов
Катион-анионную селективность каналов можно характеризовать числом переноса катионов/анионов или отношением их проницаемостей. Вторая величина используется также для того, чтобы построить ряд селективности канала, который бы описывал не только
катион-анионную, но и относительную селективность между катионами или анионами. Один из прямых методов определения ионной
селективности – сравнение изотопных потоков соответствующих ионов, прошедших через канал, с трансмембранным током.
Число переноса t – это отношение количества электричества,
перенесённого ионами данного рода через какое-либо поперечное сечение раствора электролита, к общему количеству электричества,
прошедшего через такое же сечение этого раствора. Оно равно отношению скорости движения (или подвижности) данного иона к сумме
скоростей движения (подвижностей) катиона и аниона. Причем
t   t   1 . Число переноса является характеристикой, зависящей от
подвижностей всех ионов в растворе электролита, от их концентрации
и температуры раствора.
Для того чтобы определить катион-анионную селективность канала необходимо измерить потенциал реверсии V* (трансмембранный
потенциал, соответствующий нулевому току V *   I 0 ) в условиях наличия градиента концентрации электролита.
Существует два подхода для вычисления указанных характеристик по измеренному потенциалу реверсии:
1) на основе уравнения Гендерсона
Согласно уравнению Гендерсона:
C
 RT  
(46)
V *  С  
(2t  1) ln 1 ,
C2
 F 
63
где φС – потенциал между электродами в отсутствие мембраны
(диффузионный потенциал) (если используются хлор-серебряные
электроды с агарозными мостиками φС близок к нулю), t+ – число переноса катионов, C1 и C2 – концентрации электролита с разных сторон
мембраны, причем C1 > C2. Следует отметить, что в общем случае
уравнение следует записывать через активности ионов, и только в
случае разбавленных растворов отношение активностей можно заменить отношением концентраций.
2) на основе уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца
Согласно уравнению Гольдмана-Ходжкина-Катца в случае градиента простого бинарного электролита на мембране:
 RT  PC1  P_ C2
(47)
V *  С  
 ln
 F  PC2  P_ C1
Из этого уравнения можно найти отношение проницаемостей
P
P
. Число переноса также можно определить через проницаемости,
учитывая, что проницаемость прямо пропорциональна подвижности
ионов в мембране (u). Для числа переноса катионов можно написать:
u
P
P P
(48)
t 

   .
u   u  P  P 1  P P_
Исследование селективности ионных каналов от концентрации
соли в окружающем мембрану растворе в ряде случаев позволяет
оценить радиус канала и число связанных зарядов на его стенках. Определение селективности каналов также может способствовать решению вопроса о характере многоуровневой проводимости. Так, в случае одинаковой селективности нескольких подуровней проводимости
можно с высокой вероятностью говорить о кластерной организации
каналов.
1.3.7. Анализ шума флуктуаций проводимости
Препараты биологических мембран обычно содержат большое
число разнообразных и одновременно действующих белковолипидных структур, способных транспортировать ионы. Примерами
таких структур служат хемо- и потенциал-чувствительные каналы,
селективные по отношению к различным катионам и анионам, ионные насосы, системы сопряжённого транспорта и так далее. Вклад от
одиночной структуры в общий трансмембранный ток в таких случаях
неразрешим, однако именно индивидуальные характеристики, такие
как скорость переноса ионов через одиночную структуру, наличие
64
различающихся по проводимости или кинетическим свойствам состояний, времена жизни в этих состояниях, как раз и представляют
наибольший интерес. Корреляционный, или спектральный, анализ
флуктуаций мембранного тока может быть использован для получения информации о транспортных характеристиках определенных белково-липидных мембранных структур, если в общем стохастическом
сигнале удается идентифицировать флуктуации, связанные с переключениями изучаемых структур между уровнями с различающейся
проводимостью. Эти уровни могут возникать как в результате различных конформационных переходов внутри самой структуры, так и
в результате обратимого связывания с блокаторами. Анализ флуктуаций проведен для большого разнообразия биологических мембран и
прояснил многие детали, касающиеся числа, проводимости и молекулярных свойств ионных каналов. Ценная информация получена о явлениях, лежащих в основе воротных процессов, блокирования и модификации каналов.
Наиболее важной характеристикой стационарного случайного
процесса в большинстве случаев можно считать его спектральную
плотность, характеризующую не только мощность процесса, но и его
частотный состав. В частности, для нормально распределенных случайных процессов описание при помощи спектральной плотности является полным. Другой, довольно часто использующейся характеристикой является автокорреляционная функция, определяемая как
среднее произведение значения флуктуирующей величины x(t) в момент времени t на ее значение по прошествии времени τ, т.е.
x(t)x(t + τ). Спектральная плотность и автокорреляционная функция
связаны преобразованием:

S x ( f )  4  x(t ) x(t  ) сos(2f)d
(49)
0
Определенная таким образом спектральная плотность имеет довольно простой физический смысл – она описывает мощность гармонических составляющих случайного сигнала x(t), приходящихся на
малый частотный интервал f, f + Δf. В связи с этим для нее справедлива нормировка:

 S ( f )df  ( x(t )) ,
2
x
(50)
0
которая означает, что сумма мощностей всех составляющих
равна мощности сигнала, т.е. его среднеквадратичному значению.
Использование классификации, давно принятой в физике твердого тела, вполне уместно и в отношении ионных систем. Она позво65
ляет идентифицировать несколько основных фундаментальных источников шума, которые вносят свой вклад в общий шум, измеряемый в эксперименте. В приложении к ионному транспорту через биологические мембраны такая классификация была впервые введена
Стивенсом:
1. Шум Джонсона (равновесные флуктуации напряжения
или тока).
Ионные системы, например, такие как водные растворы NaCl,
CuSO4, K2CrO4 и Ca(NO3)2, а также растворы серной кислоты в спирте, были среди объектов, использованных Джонсоном в его основополагающих экспериментах, которые позволили ему заключить, что
существует равновесный электрический шум универсальной природы, являющийся проявлением теплового движения заряженных частиц в проводниках.
Первые измерения равновесных электрических шумов мембран
были осуществлены на бислоях, модифицированных переносчиком
катионов валиномицином. Эти измерения показали, что липидные
бислои являются равновесными объектами по этому критерию.
2. Дробовый шум (шум транспорта заряда).
Одним из источников неравновесного шума, описанным ещё в
1918 году (т.е. на десять лет раньше, чем шум Джонсона), является
дробовый шум, связанный с дискретной природой переноса заряда.
Спектральная плотность этого шума остаётся белой (т.е. частотно независимой) вплоть до частот порядка обратного времени переноса заряда. К сожалению, разделение измеряемого шума на равновесный и
дробовый не всегда является простым.
3. Шум проводимости (модуляции тока флуктуациями проводимости системы во времени).
Во многих случаях флуктуации электрического тока через систему являются проявлением равновесных флуктуаций её проводимости. Как уже было отмечено, в биологических ионных системах шум
проводимости связан, прежде всего, с флуктуациями проводимости
ионных каналов при их спонтанных переходах между состояниями с
различающейся проводимостью или переходах, индуцированных различными блокаторами. Анализ этого шума является важным методом
в исследованиях кинетических свойств ионных каналов и их отклика
на различные фармацевтические препараты. Во многих случаях спек66
тральная плотность шума проводимости описывается зависимостью
лоренцевского типа, что существенно упрощает количественное описание измеряемого шума.
Пример, изображённый на рис. 39, демонстрирует записи флуктуаций тока, протекающего через альфа-токсиновый канал при разных значениях кислотности раствора соли (1 M NaCl) в H2O и D2O.
Рис. 39. Записи флуктуаций тока, протекающего через одиночный альфа-токсиновый канал при трансмембранной разности потенциалов 100 мВ и изменяющейся кислотности среды (pH или pD)
Увеличение pH (pD) раствора монотонно понижает проводимость канала, но немонотонно изменяет ширину шумовой дорожки. В
H2O шум ионного тока через канал при pH 5.9 больше, чем при pH 4.6
или pH 7.55. Качественное объяснение этого явления состоит в том,
что при относительно высокой концентрации протона (в данном случае, pH 4.6) некий аминокислотный остаток практически всегда находится в протонированном состоянии и, поэтому не вносит существенного вклада во флуктуации проводимости. При относительно же низкой концентрации протона (pH 7.55) остаток проводит основное время в депротонированном состоянии и редко переходит в протонированное. Наибольший уровень флуктуаций достигается при кислотности раствора, соответствующей половинной заселённости аминокислотного остатка протоном, то есть при pH = pKa, где pKa есть константа протонного равновесия, учитывающая конкретное положение
остатка в молекуле канала. Пример количественного анализа этих
экспериментальных данных приведён на рис. 40, который показывает
зависимость низкочастотной спектральной плотности флуктуаций тока от кислотности раствора.
67
Рис. 40. Спектральная плотность флуктуаций тока (10-27 А2/Гц)
как функция кислотности раствора
Анализ полученных зависимостей позволяет определить константу протонного равновесия для H2O pKa = 5.5 и среднее время
жизни протона на аминокислотном остатке, которое составляет
40 мкс; в случае D2O имеем pKa = 6.0 и среднее время жизни протона
– около 150 мкс. Изменение ионного тока в результате перезарядки
одного остатка можно оценить как 3 пА.
4. 1/f – шум (фликкер – шум).
Фликкер – шумом называется шум, спектральная плотность которого приблизительно обратно пропорциональна частоте в достаточно большом интервале частот. Первое подробное исследование, продемонстрировавшее существование этого шума в модельных мембранах, было выполнено на димеризованных аналогах грамицидина А.
Было показано, что если природный грамицидин А генерирует шум
проводимости с лоренцевским спектром, отражающим динамику ассоциации-диссоциации, то его димеризованный аналог даёт 1/f-шум в
диапазоне нескольких декад частоты. При этом интенсивность 1/fшума зависит от липидного состава мембраны. Источник этого шума,
возможно, связан с неразрешёнными переключениями канала в непроводящее состояние. В случае одиночного мальтопоринового канала, 1/f-шум связан со спонтанными ступенчатыми изменениями ионного тока одиночного канала во времени, тогда как флуктуации внутри этих состояний обладают квазилоренцевскими спектрами с плоскими низкочастотными участками.
В заключение следует отметить, что исследования шумов и
флуктуаций в ионных каналах имеют как теоретическое, так и – в связи с развитием нанотехнологий – прикладное значение.
68
1.3.8. Регистрация токов, протекающих через ионные каналы, встроенные в липосомы. Ионные каналы клеточных мембран,
реконструированные в модельные липидные бислои
Для выяснения молекулярных механизмов контроля и регуляции ионного транспорта белковыми структурами клеточных мембран
и исследования принципов функционирования ионных каналов очень
перспективным оказалось выделение каналообразующих комплексов
из клеточных мембран, изучение их химического состава и последующего встраивания в модельные бислойные липидные мембраны.
Встраивание ионных каналов в модельные бислои незаменимо при
изучении каналов внутриклеточных мембранных систем, таких как
эндоплазматический и саркоплазматический ретикулум.
Примером реконструкции каналов в бислойные липидные мембраны, выделенных из клеточных мембран, для определения химического состава и структуры каналообразующих белков и их функционирования являются работы Луневского и Берестовского с соавторами в конце 70-х годов. Авторы определили химический состав белка
кальциевого канала хоровой водоросли Nitellopsis obtuse. Для этого на
каждом этапе выделения, очистки и фракционирования компонент
гомогената посредствам реконструкции в бислои проводили определения наличия каналообразующего субстрата во фракциях. В результате был получен каналообразующий белок, характеристики которого
соответствуют Са2+-каналам водорослей, измеренным ранее методом
двухэлектродной фиксации потенциала (см. ранее). С помощью бислойных липидных мембран авторы смогли определить свойства одиночных каналов и принципы их функционирования. Таким образом,
было показано, что каналы являются агрегатами элементарных каналов, которые открываются и закрываются как одно целое. Термодинамически выгодная сборка в 0.1 М KCl соответствует каналу с проводимостью 200 пСм и, вероятно, он состоит из 80 элементарных каналов. Двухвалентные ионы способствуют агрегации каналов, а их
удаление сопровождается постепенным распадом комплексов.
Рис. 41 демонстрирует встраивание в мембрану каналов различной амплитуды при одностороннем введении высокомолекулярной
фракции гомогената клеток харовой водоросли, очищенного с помощью гель-хроматографии.
69
Рис. 41. Запись флуктуаций тока после введения в околомембранные растворы высокомолекулярной фракции, полученной при
гель-хроматографии на сефадексе G-200 гомогената клеток харовой
водоросли. Мембраны сформированы из общих липидов мозга быка.
Растворы 100 мМ КСl и 10 мМ КСl с разных сторон мембраны. Поданный на мембрану потенциал равен 0
Более предпочтительным методом встраивания ионных каналов
в бислойные липидные мембраны, в сравнении с использованием
очищенного канального белка, является инкорпорирование в бислой
нативных мембранных везикул. Например, в 1986 г. М. Нельсон ввел
в окружающий мембрану раствор мембранный препарат мозга крысы,
синаптосомы, содержащие потенциал зависимые кальциевые каналы.
Исследования взаимодействия двухвалентных катионов (Ba, Ca, Sr,
Mn) c одиночным Са2+-каналом позволили выявить по крайней мере
одно место связывания катионов, регулирующее ионную проницаемость канала.
Одним из наиболее распространенных в последние десятилетия
способов измерения токов, протекающих через одиночные каналы,
является метод «patch-clamp» (см. 1.3.2). В то же время малость размеров нативных везикул, внутриклеточных систем, содержащих ионные каналы, не позволяет исследовать физико-химические параметры
и механизмы их функционирования с помощью техники «patchclamp». Диаметр кончика пипетки, использующейся в технике «patchclamp», около 1000 нм, что больше диаметра большинства нативных
мембранных везикул (200-400 нм). Поэтому для исследования методом «patch-clamp» используются гигантские липосомы (диаметр от
5000 до 100000 нм) с встроенными в них, тем или иным способом,
клеточными канальными белками.
Фолгеринг с соавторами в 2004 г. использовал гигантские одноламелярные липосомы для встраивания в них выделенных из бактерий Lactococcus lactis или E. coli механо-чувствительных каналов
70
большой проводимости (Msel) и изучения влияния изомеризации липидов на параметры этих каналов. Авторы показали, что конформационное состояние мембранных белков, приводящее к открыванию/закрыванию каналов, может контролироваться быстрой и обратимой перестройкой липидного бислоя в результате цис или транс
изомеризации 20 % введенного в мембрану липида натрий ди-(5{[4(4-бутилфенил)азо]фенокси}пентил)фосфата при его освещении источником излучения с длиной волны 365 или 400 нм (рис. 42).
Рис. 42. Структура липида натрия ди-(5{[4-(4бутилфенил)азо]фенокси}пентил)фосфата в транс-изомеризации (А) и
цис-конформации (Б). Переход между конформациями реализуется
при освещении длиной волны 365 нм (из транс- в цис-) или при более
400 нм (из цис- в транс-)
Встраивание каналообразующих белков в гигантские липосомы
позволяет не только измерять электрофизиологические параметры
ионных каналов, но и использовать другие методы изучения каналообразования белков, например, конфокальную микроскопию. Так, при
исследовании электрических характеристик встроенных в гигантские
липосомы калиевых каналов KcsA из бактерий Streptomyces lividns,
наблюдали кластеризацию каналов, т.е. одновременное фукционирование (открывание/закрывание) от двух до пяти элементарных каналов. Параллельное определение местоположения на поверхности липосомы флуоресцентной метки и меченного белка показало гетерогенность распределения на мембране белка при гомогенном распределении метки в его отсутствие. Кроме того, интенсивность метки канального белка различна в разных участках мембраны. Авторы предположили, что кластерная организация каналов является результатом
агрегации KcsA, и наблюдаемый канал-кластер состоит из различного
числа каналообразующих белковых тетрамеров.
71
ГЛАВА 2. ПОРООБРАЗУЮЩИЕ ТОКСИНЫ И
АНТИМИКРОБНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
В этом разделе будет рассмотрено, каким образом физикохимические свойства модельных и клеточных мембран влияют на каналообразующую активность различных белков и пептидов. Большинство пептидов взаимодействуют с мембраной клеток-мишеней, но
при этом механизм их взаимодействия различен. Антимикробные
пептиды в большинстве случаев имеют положительный заряд, а поверхность липидного бислоя бактериальной мембраны – отрицательный. Поэтому ключевую роль в антибактериальном действии играют
электростатические взаимодействия положительно заряженных пептидов и отрицательно заряженной оболочки бактерий. Но только
электростатическими взаимодействиями активность пептидов не объяснить, поскольку иногда пептиды уничтожают один вид бактерий, а
другой, с таким же поверхностным зарядом, не замечают. Не последнюю роль играет и тот факт, что молекулы большинства известных
антимикробных пептидов при попадании в окружение липидов клеточной мембраны превращаются из неупорядоченных линейных в
правосторонние спиральные. Видимо, спиральная структура необходима для того, чтобы пронизать мембрану микробной клетки. Но еще
более важное свойство пептидов – амфифильность. Это означает, что
заряженные и незаряженные группы аминокислот расположены по
разные стороны молекулы, то есть заряд распределен не равномерно,
а сконцентрирован на одном участке пептида.
В настоящий момент принято две модели образования трансмембранной поры при встраивании амфифильного пептида в мембрану (рис. 43). Согласно первой, так называемой модели “бочонка”
трансмембранная пора образуется α-спиралями каналообразующей
молекулы, которые располагаются по ее периметру, при этом гидрофобные участки спиралей обращены внутрь мембраны, а гидрофильные – в раствор внутри поры. Удачным примером формирования каналов по модели “бочонка” являются каналы, образованные аламетицином (см. 2.2.2). Процесс образования подобных пор состоит из нескольких этапов: 1) формирование α-спиралей молекулами пептида
или их частями; 2) образование олигомера из α-спиралей; 3) встраивание олигомера в мембрану и образование трансмембранной поры;
4) включение дополнительных α-спиралей в состав поры и увеличение ее размера. Важным этапом процесса порообразования является
72
олигомеризация пептидов, поскольку встраивание одиночной αспирали является энергетически невыгодным, так как в этом случае
должен происходить контакт гидрофобной области мембраны и полярной области α-спирали.
Рис. 43. Модели трансмембранных пор, формируемых пептидами. Рисунок из работы
Согласно второй модели молекулы пептида образуют “ковер” на
мембране. Впервые модель “ковра” была предложена для дермасептина, и в дальнейшем была использована при описании механизма
действия других пептидов, например цекропинов. Перед образованием “ковра” положительно заряженный пептид электростатически
взаимодействует с отрицательно заряженными молекулами липида.
Затем молекулы пептида переориентируются таким образом, что их
полярные участки обращены в раствор. После происходит ассоциация
пептидных молекул. При достижении определенной пороговой концентрации пептида, связанного с мембраной, начинается встраивание
ассоциатов в бислой. В зависимости от пептида, подобное встраивание возможно при полном заполнении поверхности мембраны, или
при локальной ассоциации пептидных молекул. После образования
пор молекулы пептида переходят на внутренний монослой и разрушают мембрану за счет изменения кривизны, также возможна дальнейшая диффузия пептида в цитоплазму и поражение клеточных органелл. В отличие от модели “бочонка”, в данном случае молекулы
пептида не всегда взаимодействуют с гидрофобной областью мембраны. Общий механизм действия антимикробных пептидов (модель
Шаи-Мацузаки-Хуанга) представлен на рис. 44.
73
Рис. 44. Механизм действия антимикробного пептида (модель ШаиМацузаки-Хуанга).
При сорбции молекул пептида на мембране возможны их конформационные изменения: а – образование “ковра” из пептидов на внешнем
монослое; b – встраивание пептидов во внешний монослой и увеличение его площади. Изменение размера внешнего монослоя по отношению к внутреннему приводит к возникновению напряжения между
ними (отмечено зазубренными голубыми стрелками); с – фазовый переход и образование пор; d – переход пептидов на внутренний монослой; е – диффузия пептидов в цитоплазму и поражение органелл; f –
разрушение мембраны и гибель клетки. Отрицательно заряженные и
незаряженные молекулы липида обозначены черным и желтым цветом, соответственно
Одним из механизмов действия пептидов является образование
трансмембранных пор, в состав которых входят не только молекулы
пептида, но и молекулы мембранообразующих липидов. Такая структура получила название “тороидальной поры” (см. рис. 43). Формирование подобных пор показано для многих пептидов, не обязательно
действующих согласно модели “ковра”. В случае образования торои74
дальных пор следует ожидать существенно большего эффекта спонтанной кривизны мембранообразующих липидов на каналообразующую активность пептида по сравнению с соединениями, формирующими каналы по другому принципу (см. раздел 1). В качестве примеров петид-липидных пор можно привести сирингомициновые и мелитттиновые каналы.
В этой главе будут рассмотрены механизы влияния физикохимических свойств мембран на активность липопетидов сирингомицина Е и сурфактина, пептидов грамицидина, аламетицина, мастопарана, пардаксина, мелиттина, магаинина и цекропинов, а также белков
колицина, δ-эндотоксина, α-токсина, актинопоринов и латротоксина.
Структурные формулы некоторых из перечисленных каналообразующих соединений представлены на рис. 45.
А
Б
В
Г
Д
Е
Ж
З
И
К
Л
М
Н
О
П
Рис. 45. Химическая структура порообразующих соединений пептидной природы: липопептиды сириногомицин Е (А) и сурфактин (Б);
пептиды аламетицин (В), грамицидин (Г), мастопаран (Д), меллитин
75
(Е), магаинин (Ж) и цекропин (З); белки колицин (И), δ-эндотоксин
(К), α-токсин (Л), актинопорин (М), латротоксин (Н), холерный токсин (О) и дифтерийный токсин (П)
2.1. ЛИПОПЕПТИДЫ
2.1.1. Липопептиды Pseudomonas syringae
Грамотрицательные бактерии Pseudomonas syringae pv. syringae
синтезируют две группы токсинов, принадлежащих к классу циклических липодепсипептидов. Молекулы этих токсинов содержат углеводородный “хвост” и пептидную “голову”. Первую группу составляют
токсины с молекулярной массой 2200–2500 Да, содержащие более 22
аминокислотных остатков, 8 из которых замкнуты в макролактонный
цикл – сирингопептины. Ко второй группе относятся соединения с
молекулярной массой от 1100 до 1300 Да, циклическая голова которых содержит 9 аминокислотных остатков – липодепсинанопептиды:
сирингомицины, сирингостатины, сиринготоксины и псевдомицины
(рис. 46).
Рис. 46. Структура сирингомицинов, сирингостатинов, сиринготоксинов и псевдомицинов.
Обозначения аминокислот: Ser – серин; Arg – аргинин, Phe –
фенилаланин; Gly – глицин; Asp – аспарагиновая кислота; Lys – лизин; Dhb – 2,3-дегидроаминомасляная кислота;Asp(3-OH) – 3гидроксиаспарагиновая кислота; Thr(4-Chl) – 4-хлортреонин; Dab –
2,4-диаминомасляная кислота; Hse – гомосерин; Orn – орнитин; аThr –
аллотреонин
Молекулы этих фитотоксинов различаются аминокислотным
составом пептидной цепи (на участке между вторым и шестым остатками), и длиной гидрофобного хвоста 3-гидроксижирной кислоты, который является остатком декановой, додекановой, тетра- или гексаде76
кановой кислоты.
Сирингомицины являются типичными представителями класса
циклических липодепсинанопетидов (рис. 46). Существуют три формы сирингомицинов, которые различаются между собой только длиной жирнокислотного хвоста, состоящего из остатка декановой, додекановой или тетрадекановой кислоты для сирингомицина А1, сирингомицина Е (СМЕ) или сирингомицина G, соответственно. Амидная
связь соединяет жирнокислотный остаток с N-концом серина, который, в свою очередь, связан С-концом с 4-хлортреонином, таким образом, замыкая аминокислоты в кольцо. В состав сирингомицинов
входят аминокислоты, нетрадиционные для веществ белковой природы, синтезируемых на рибосомах: 2,3-дегидроаминомасляная кислота,
3-гидроксиаспарагиновая кислота, 4-хлортреонин, D-изомеры 2,4диаминомасляной кислоты и серина. Молекулы сирингомицинов содержат три положительно заряженных (два остатка диаминобутановых кислот (Dab) и один остаток аргинина (Arg); рК этих остатков
около 10) и один отрицательно заряженный аминокислотный остаток
(остаток 3-гидрокси-аспарагиновой кислоты (Asp(3-OH)), рК 2,8).
При значениях рН, близких к нейтральным, сирингомицины имеют
суммарный положительный заряд, равный по модулю двум зарядам
электрона. Наиболее изученным представителем этого класса липопептидов является сирингомицин Е (СМЕ).
Существует две формы сирингостатинов (рис. 46), сирингостатин А и сирингостатин B, различающиеся длиной углеводородного
хвоста. Также как и сирингомицины, головы молекул сирингостатинов содержат по три положительно заряженных аминокислотных остатка и по одному заряженному отрицательно.
Строение пептидной цепи и аминокислотный состав фитотоксинов весьма необычны для соединений белковой природы. Эти особенности вызваны тем, что синтез указанных соединений осуществляется специализированными мультиферментативными комплексами
и не связан с рибосомальным аппаратом клетки.
Бактерии Pseudomonas syringae pv. syringae являются эпифитами. Они вызывают гибель грибковых клеток, защищая, таким образом, растения от паразитов грибкового происхождения. Однако, Pseudomonas syringae pv. syringae способны вызывать некроз растительных тканей. Воротами инфекции служат ранения и повреждения,
инициированные другими заболеваниями. Протигрибковую активность связывают в основном с действием липодепсинанопептидов, а
некротические заболевания растений – с действием сирингопептинов.
77
Благодаря противогрибковой активности сирингомицины и родственные им соединения могут быть использованы при обработке собранного урожая экономически важных плодовых культур как альтернатива химическим фунгицида. Следует отметить, что сирингомицин Е ингибирует и клинически важных возбудителей грибковых заболеваний человека. Кроме того, обнаружена активность сирингомицина Е и родственных ему соединений по отношению к патогенным
для человека микобактериям Mycobacterium smegmatis. То обстоятельство, что фитотоксины значительно менее активны в отношении
клеток млекопитающих, позволяет рассматривать их в качестве перспективных фармакологических препаратов.
Установлено, что мишенью действия фитотоксинов является
клеточная мембрана. Показано, что основной причиной гибели клеток
является нарушение водно-электролитного баланса вследствие образования ионных каналов в плазматической мембране. Циклические
липодепсипептиды способны индуцировать стабильные ионопроводящие поры в модельных липидных мембранах. При одностороннем
(относительно мембраны) введении липодепсипептидов и последующем приложении трансмембранной разности потенциалов регистрируются дискретные флуктуации тока, характеризующие одиночные
события открывания и закрывания ионных каналов многоуровневой
проводимости (рис. 31).
Из этого рисунка видно наличие у каналов как минимум двух
стабильных кратных уровней проводимости – «больших» и «малых»
каналов. Определенный методом двустороннего введения ПЭГ размер
и установленная при градиенте концентрации проникающих ионов на
мембране селективность больших и малых СМЕ-каналов одинаковы,
что свидетельствует об их кластерной организации.
Как уже было отмечено в Главе 1 физико-химические свойства
мембран во многом определяют каналообразующую активность различных веществ. Эта зависимость может быть с успехом продемонстрирована на сирингомицине Е.
На рис. 47 представлены вольтамперные характеристики одиночных малых каналов в заряженных и незаряженных мембранах.
Можно заметить, что кривые нелинейны и асимметричны относительно знака напряжения. Это обусловлено пространственным распределением зарядов липида и каналоформера, что приводит к различию профилей потенциальной энергии вблизи устьев канала.
Еще одним примером зависимости свойств СМЕ-каналов от поверхностного потенциала мембраны может служить потенциал78
зависимость открывания-закрывания каналов в заряженных и незаряженных мембранах.
I, пА
1
4
1
0.1 пА
2
5с
2
2
-200
-100
100
200
V, мВ
-2
Рис. 47. Вольтамперные характеристики одиночных малых
СМЕ-каналов. ■– мембрана сформирована из эквимолярной смеси
ДОФС и ДОФЭ (отрицательно заряженная); ○– мембрана сформирована из ДФФХ (незаряженная). Околомембранный раствор:
0.1 М NaCl, рН 6.0. На вставке представлены записи флуктуаций
трансмембранного тока, соответствующие открыванию-закрыванию
малых каналов при трансмембранном напряжении 50 мВ
Приведенные на рис. 48 записи флуктуаций СМЕ индуцированного
трансмембранного тока показывают, что в отрицательно заряженных
мембранах, сформированных из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ,
приложение положительного напряжения вызывает рост, а отрицательного – уменьшение числа открытых каналов во времени (рис. 48
А), то время как в случае незаряженных мембран (ДФФХ) имеет место обратная зависимость открывания/закрывания каналов от полярности трансмембранного напряжения (рис. 48 Б).
A
I, пА
5
Б
I, пА
175 мВ
125 мВ
15
0
10
-5
5
ДОФС:ДОФЭ
0.1 М NaCl, pH 6
-10
0
-5
-15
-175 мВ
-20
0
10
20
30
40
t, с
ДФФХ
0.1 М NaCl, pH 6
-125 мВ
-10
0
50
100
t, с
Рис. 48. Записи флуктуаций трансмембранного тока, индуцированно79
го СМЕ. Солевой состав водного раствора: 0.1 M NaCl pH 6.0. Мембраны сформированы из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ (А) или
ДФФХ (Б)
Как упоминалось в Главе 1, потенциал-зависимость открывания/закрывания определяется так называемым эффективным воротным зарядом канала (Q). В случае СМЕ-каналов в отрицательно заряженных мембранах Q = 1. В незаряженных мембранах Q = -1. Зависимость полярности Q от заряда мембранообразующих липидов, указывает на непосредственное участие «голов» мембранообразующих молекул в структуре воротного механизма каналов. На основании зависимости
вольт-амперных
характеристик
и
потенциалчувствительности открывания/закрывания элементарных каналов
(рис. 37) от липидного состава мембраны и концентрации соли в омывающих бислой растворах была предложена модель СМЕ-канала как
асимметричной пептид-липидной поры, в цис-устье (со стороны введения токсина) которой находятся молекулы каналоформера, а трансустье образовано молекулами мембранных липидов (рис. 49). Методом одностороннего введения ПЭГ было показано, что малый СМЕканал представляет собой коническую пору с меньшим устьем со стороны введения каналоформера. Радиусы устьев канала составляют
0.25–0.35 нм и 0.5–0.9 нм.
Рис. 49. Схематическая модель СМЕ-канала
На рис. 50 представлены зависимости среднего числа синхронно
функционирующих малых СМЕ-каналов в кластере (m), их проводимости (g) и времени жизни (τ) от дипольного потенциала мембраны.
Уменьшение степени кооперативности открывания каналов при увеличении дипольного потенциала свидетельствует об участии дипольдипольных взаимодействий в процессе образования кластеров. Рост
проводимости СМЕ-каналов при увеличении дипольного потенциала
мембраны можно объяснить исходя из определения дипольного потенциала мембраны. Увеличение скачка потенциала, т.е. «плюса»
80
внутри углеводородного кора относительно примембранной воды,
должно сопровождаться уменьшением энергетического барьера для
входа аниона, и, следовательно, приводить к росту проводимости
анионных каналов, к которым относятся СМЕ-каналы. Влияние дипольного потенциала на время пребывания СМЕ-каналов в открытом
состоянии можно рассматривать как результат влияния дипольного
потенциала на изменение ориентации воротных частиц, ответственных за потенциал-зависимое открывание каналов.
А
Б
В
Рис. 50. Зависимость среднего числа синхронно функционирующих
малых СМЕ каналов (А), их проводимости (Б) и среднего времени
жизни (В) от изменения дипольного потенциала мембраны
Оказалось, что дипольный потенциал липидных бислоев влияет
и на каналообразующую активность фитотоксина. На рис. 51 А видно,
что уменьшение дипольного потенциала мембраны на 100 мВ при
введении в околомембранные растворы дипольного модификатора
флоретина приводит к многократному росту числа открытых СМЕканалов, в то время как добавка RH 421, увеличивающего дипольный
потенциал мембраны, сопровождается уменьшением равновесного
СМЕ-индуцированного трансмембранного тока (рис. 51 Б) Детальные
исследования этого явления показали, что рост тока обусловлен ростом воротного заряда СМЕ-каналов и коэффициента распределения
положительно заряженного СМЕ между мембраной и водной фазой.
Как уже было отмечено в Главе 1, образование пептидлипидных пор предполагает положительную спонтанную кривизну,
входящих в нее липидных молекул. Это означает, что липиды, имеющие отрицательную спонтанную кривизну, т.е. малую гидрофильную
голову в сравнении с большой площадью сечения гидрофобного хвостов, должны затруднять образование подобных пор.
81
А 4000
I, пА
0.2 pA
5s
2000
0 pA
0
1
Б
0
1
2
2
10
5
15
6
20
7
t, мин
-1000
-2000
Рис. 51. Влияние дипольных модификаторов на равновесный трансмембранный ток, индуцированный сирингомицином Е. Мембраны
сформированы из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ. А – момент
добавки флоретина до концентрации 10 мкМ указан стрелкой,
0.1 М NaCl (pH 6.0), V = 75 мВ. На вставке показаны флуктуации одиночных СМЕ каналов до введения флоретина. Б – момент введения
RH 421 до концентрации 10 мкМ указан стрелкой, 1 М NaCl (pH 6.0),
V = 50 мВ
О зависимости каналообразующей активности СМЕ от спонтанной кривизны мембранных липидов свидетельствует различие концентраций липопептида, необходимых для наблюдения одиночных
каналов при фиксированном трансмембранном напряжении в мембранах, сформированных из фосфолипидов с нейтральной (например,
диолеилфосфохолин, ДОФХ) и с отрицательной (например, диолеилфосфоэтаноламин, ДОФЭ) спонтанной кривизной. Для того чтобы зарегистрировать активность одиночных СМЕ-каналов в ДОФЭмембранах, концентрация липопептида в околомембранном растворе
должна быть в 20 раз больше, чем в случае ДОФХ-бислоев.
Цитотоксичность СМЕ для Saccharomyces cerevisiae зависит от
штамма дрожжей. Мутантные клетки W∆SYR2α, нокаутированные по
гену фермента, участвующего в биосинтезе сфинголипидов синтезируют сфинголипиды со сфингозиновым основанием, не гидроксили82
рованным в С4-положении. При этом оказалось, что указанные мутанты малочувствительны к СМЕ по сравнению с диким штаммом
W303C.
Было также установлено, что цитотоксичность СМЕ зависит от
наличия в мембранах этих клеток рафтов. Мембраны клеток дикого
типа, W303C, чувствительных к СМЕ и включающих гидроксилированные в С4-положении сфинголипиды, содержат рафты. В мембранах мутантных клеток W∆SYR2α, малочувствительных к СМЕ с не
гидроксилированными в С4-положении сфинголипидами, рафты не
обнаружены. Можно предположить, что бóльшая токсическая активность СМЕ для клеток дикого типа по сравнению с мутантными обусловлена бóльшей каналообразующей активностью липодепсипетида
в мембранах W303C, определенной бóльшим сродством СМЕ к упорядоченным мембранным доменам (рафтам) по сравнению с неупорядоченными областями. В соответствии с этим предположением были
проведены соответствующие исследования каналообразующей активности СМЕ в модельных мембранах, в состав которых вводились
сфинголипиды из мембран дикого и мутантного штаммов дрожжевых
клеток. Для формирования мембран, содержащих 20 М % сфинголипидов мембран W303C или W∆SYR2α, использовали эквимолярную
смесь ДОФС/ДОФЭ/эргостерин. Указанный липидный состав близок
к составу плазматической мембраны дрожжей. Установлено, что при
фиксированных значениях концентрации СМЕ и трансмембранного
потенциала стационарный трансмембранный ток, протекающий через
модифицированные СМЕ липидные бислои, зависит от их сфинголипидного состава. Так при одинаковых концентрациях каналоформера
в случае мембран, содержащих сфиголипиды из клеток дикого типа
Saccharomyces cerevisiae W303C, независимо от величины трансмембранной разности потенциалов значение тока в 40 раз выше по сравнению с бислоями, содержащими сфинголипиды мутантных клеток
W∆SYR2α. Различие каналообразующей активности СМЕ в сфинголипидсодержащих бислоях при совпадении вольтамперных характеристик и величин Q каналов, может быть результатом различия коэффициентов распределения липопептида между липидной и водной фазами в этих системах.
2.1.2. Липопептиды Bacillus subtilis
Циклический гептапептид сурфактин продуцируется различными штаммами Bacillus subtilis. В состав молекулы сурфактина входит
остаток 3-гидрокси-13-метилтетрадекановой кислоты и гидрофильное
83
лактоновое кольцо, состоящее из 7 аминокислот (рис. 52). Молекулярная масса сурфактина составляет 1036 Да.
Рис. 52. Химическая формула молекулы сурфактина. Обозначение аминокислот: Glu – глутаминовая кислота, Leu – лейцин, Val –
валин, Asp – аспарагиновая кислота
Благодаря присутствию в структуре молекулы отрицательно заряженных аминокислотных остатков (аспартата и глутамата), сурфактин в области нейтральных pH имеет заряд -2е. В растворе молекула
принимает седлообразную конформацию. Сурфактин обладает детергентными свойствами, т.е. способностью образовывать пептидлипидные мицеллы. Липопептид снижает поверхностное натяжение
воды (от 72 до 27 мН/м) и показывает низкую критическую концентрацию мицеллообразования (в диапазоне 9–50 мкм, в зависимости от
окружающих условий). Сурфактин вызывает лизис эритроцитов, демонстрирует противоопухолевое, антивирусное, антибактериальное и
противогрибковое действие, а также проявляет антимикоплазменную
активность в отношении Mycoplasma hyorhinis и Mycoplasma orale.
Эти свойства сурфактина позволяют считать его перспективным для
использования в качестве биосурфактанта, а также в фармакологической практике. Как и большинство природных антимикробных пептидов, сурфактин, вероятно, действует путем увеличения ионной проницаемости плазматических мембран клеток-мишеней.
Известно, что добавление сурфактина в околомембранный раствор приводит к увеличению трансмембранного тока за счёт формирования ионных каналов различной проводимости. Как правило, число уровней проводимости велико и практически неконтролируемо в
условиях эксперимента. По этой причине молекулярные механизмы
формирования и функционирования сурфактиновых каналов до сих
пор не ясны.
В работах по изучению сурфактин-индуцированной утечки
флуорофора из липосом и ионной проницаемости липидных бислоев
в присутствии сурфактина было установлено, что минимальная
структура, необходимая для образования поры в бислое, – это димер.
По всей вероятности, многоуровневая проводимость каналов обу84
словлена различной степенью олигомеризации сурфактиновых молекул в мембране, но окончательного подтверждения данной гипотезы
пока не получено. Трансмембранный ток, протекающий через одиночный сурфактиновый канал, прямо пропорционален трансмембранному потенциалу V, вольт-амперная кривая линейна и симметрична
относительно знака V. Селективность сурфактиновых каналов зависит
от их проводимости. На рис. 53 представлены вольт-амперные характеристики различных подуровней проводимости сурфактиновых каналов при градиенте концентрации электролита на мембране
(1 M KCl (pH 6.5) / 0.1 M KCl (pH 6.5)). На рис. 53 видно, что потенциал реверсии, отвечающий нулевому току, равен 45 мВ для поры с
проводимостью 40 пСм и 0 мВ для поры с проводимостью 450 пСм.
А
I, пА
Б
I, пА
0,2
20
Vrev = 45 мВ
0,0
40
50
V, мВ
0
-0,2
-0,4
-50
0
50
V, мВ
Vrev= 0 мВ
-20
Рис. 53. Вольт-ампрерные кривые для двух разных подуровней
проводимости (А и Б) одиночных сурфактиновых каналов. Линии
представляют аппроксимацию экспериментальных точек прямыми с
наклоном в 40 (А) и 450 (Б) пСм. Отсекаемый отрезок по оси потенциалов, соответствующий нулевому току, определяет потенциал реверсии: 45 (А) и 0 мВ (Б). Состав омывающих бислои растворов: в
цис-отсеке экспериментальной камеры 1.0 M KCl, pH 6.5, в трансотсеке – 0.1 M KCl, pH 6.5. Липидные бислои сформированы из
ДФФХ. Концентрация сурфактина в растворе, омывающем бислой с
обеих сторон: 0.2 мкМ (А) и 0.4 мкМ (Б)
На основании уравнения Гендерсона (см. Главу 1) можно рассчитать числа переноса катионов калия для указанных величин потенциала реверсии: t+ = 0.85 и t+ = t– = 0.50, соответственно. Очевидно, что увеличение проводимости поры коррелирует с потерей селективности. Эти данные указывают на различие эффективных диаметров каналов разной проводимости. По всей вероятности, наличие двух
отрицательно заряженных аминокислотных остатков в молекулах
сурфактина, образующих каналы, обеспечивает выраженную катион85
ную селективность только для относительно узких пор.
Установлено, что поверхностный потенциал липидных бислоев
влияет на каналообразующую активность сурфактина. Наличие отрицательного поверхностного заряда мембраны приводит к росту пороговой концентрации сурфактина, при которой регистрируется активность одиночных сурфактиновых каналов в мембране. По всей вероятности, в силу электростатического отталкивания, отрицательно заряженные молекулы сурфактина хуже сорбируются на бислое, имеющем существенный отрицательный поверхностный заряд, по сравнению с нейтральной мембраной.
Варьирование дипольного потенциала мембраны приводит к
значительной модификации свойств как одиночных сурфактиновых
каналов, так и мультиканальной проводимости бислоя. Близость кинетических характеристик разных подсостояний проводимости (их
времени жизни) дает возможность характеризовать многоуровневую
проводимость сурфактиновых каналов при изменении параметров
системы с помощью среднего нормированного тока (см. Глава 1). При
варьировании дипольного потенциала мембраны с помощью дипольных модификаторов (флоретина и RH 421) средний нормированный
ток, протекающий через одиночные сурфактиновые каналы изменяется (рис. 54).
Можно думать, что при увеличении дипольного потенциала
увеличивается число сурфактиновых молекул в проводящих олигомерах. Очевидно, что наличие отрицательного заряда у молекул сурфактина должно приводить к увеличению его коэффициента распределения и росту равновесного сурфактин-индуцированного трансмембранного тока при увеличении дипольного потенциала мембран, что и
наблюдается в эксперименте (рис. 55). Эти данные свидетельствуют о
превалирующей роли заряд-дипольных взаимодействий в формировании и функционировании пор, образуемых липопептидами в модельных мембранах.
А
контроль
1
200 пА
2с
n/(N*h), пА-1
0,005
0,004
3
0,003
4
0,002
2
5
0,001
300 пА
5с
86
0
200
400
I, пА600
800
1000
1
флоретин
100 пА
5с
n/(N*h), пА-1
Б
0,015
0,010
2
3
0,005
4
100 пА
0
100
200
I, пА
В
контроль
5 пА
n/(N*h), пА-1
2с
3с
300
400
1
0,4
0,2
2
2 пА
0
2с
RH 421
30 пА
20 с
I, пА
20
0,06
n/(N*h), пА-1
Г
10
2
1
0,04
0,02
0
30
60
I, пА
90
Рис. 54. Левая панель – Запись флуктуаций тока, протекающего
через сурфактиновые каналы в отсутствии дипольных модификаторов
(контроль) (А, В), в присутствии 20 мкМ флоретина (Б) и 10 мкМ
RH 421 (Г). Мембраны сформированы их ДФФХ и омываются
1 M КCl (pH 6.5), V = 25 мВ. Правая панель – Гистограммы флуктуаций сурфактин-индуцированного трансмембранного тока. Концентрация сурфактина в мембраноомывающем растворе в случае А и Б –
0.4 мкМ, а в В и Г – 0.2 мкМ
87
А
I, пА
50 pA
3 sec
8000
4000
0
0
Б
20
40
t, мин
8000
1 pA
2 sec
4000
0
0
3
60
62
Рис. 55. Эффект дипольных модификаторов мембран на равновесный сурфактин-индуцированный трансмембранный ток. Мембраны сформированы из ДФФХ и омываются 1 М KCl, pH 6.5. Моменты
введения флоретина до концентрации 20 мкМ (V = 50 мВ) (А) или
RH 421 до концентрации 5 мкМ (V = 25 мВ) (Б) в мембраноомывающие растворы указаны стрелками
2.2. ПЕПТИДЫ
2.2.1. Грамицидин
Грамицидин – гетерогенная смесь пептидных антибиотиков,
продуцируемых бактерией Bacillus brevis. Соотношение компонентов,
линейных пептидов грамицидина A, B, C, D и циклического декапептида С(S), зависит от штамма микроорганизма. Грамицидин играет
важную роль в процессе спорообразования у Bacillus brevis, определяя формирование нормальных спор. Показано, что штаммы, дефектные по синтезу грамицидина формируют споры с повышенной термочуствительностью. Грамицидин А специфически ингибирует экспрессию отдельных (вегетативных) генов, определяя, таким образом, переход микроорганизма в покоящуюся стадию. Механизм такой регуляции до конца не ясен, но известно, что грамицидин А препятствует
образованию комплекса РНК- полимеразы с ДНК, необходимого для
инициации транскрипции.
В бислойных липидных мембранах грамицидин формирует катион-селективные поры. Согласно литературным данным дипольный
88
потенциал мембраны изменяет параметры ионных каналов, образованных грамицидином в липидных бислоях. Уменьшение дипольного
потенциала мембран приводит к росту проводимости и времени жизни грамицидиновых каналов (рис. 56). Из определения дипольного
потенциала понятно, что при уменьшении φd должен наблюдаться
рост проводимости катион-селективных пор. Эффект дипольного потенциала мембраны на время жизни грамицидинового канала может
быть результатом регулируемого дипольным потенциалом мембран
перемещения индольных диполей триптофановых остатков грамицидина в области скачка потенциала на границе раздела бислой-раствор.
Рис. 56. Запись флуктуаций тока, протекающего через грамицидиновые каналы в отсутствие дипольных модификаторов и в присутствии
20 мкМ флоретина или 1 мкМ RH 421. Бислои сформированы из
ДФФХ и омываются 1 М КCl, pH 7.0
Добавление дипольного модификатора генистеина до конечной
концентрации 10 мкМ в мембраноомывающих растворах сопровождается увеличением времени жизни каналов в 1.5 раза и каналообразующей активности грамицидина в 9 раз. Проводимость канала при
этом не изменяется (рис. 57).Это дает основание думать, что наблюдаемые эффекты генистеина на время жизни грамицидиновых каналов и каналообразующую активность пептида не являются результатом изменения дипольного потенциала, а обусловлены изменением
спонтанной кривизны липидных монослоев.
Рис. 57. Запись флуктуаций грамицидин-индуцированного трансмембранного тока в отсутствие (контроль) и в присутствии генистеина
89
(10 мкМ): (А) эффект на время жизни канала, (Б) влияние на каналообразующую активность каналов. Омывающий ДФФХ мембрану раствор 1 М NaCl pH 7.0, V = 200 мВ
Свойства грамицидинового канала зависят от соотношения между толщиной мембраны и длиной канала. При увеличении толщины
мембраны основная популяция грамицидиновых каналов переходит
из состояния двух одиночных спиралей, ассоциированных «голова к
голове», в состояние двойной спирали (рис. 58).
Рис. 58. Структура грамицидина: (А) – одноцепочечный мономер и (Б) – двуцепочечный димер
Как было отмечено в главе 1, ионный канал стабилен, если длина гидрофобной части трансмембранного участка соответствует толщине бислоя. Если же длина гидрофобной части канала больше или
меньше толщины гидрофобной части мембраны, ионный канал обычной геометрии нестабилен или вообще теряет активность. В этом случае преимущество могут получить другие подсостояния проводимости, обладающие иными структурными характеристиками. В случае,
когда длина гидрофобной части канала больше толщины гидрофобной части бислоя стабилизировать подобный канал помогают липиды
с отрицательной спонтанной кривизной.
Также изучено влияние толщины бислоя на миниграмицидины –
искусственно синтезированные производные грамицидина, содержащие на 4 аминокислоты меньше, чем природный грамицидин А. Увеличение несоответствия между толщиной липидного бислоя и длиной
трансмембранных спиралей приводит к тому, что, в отличие от грамицидина А, эти соединения могут эффективно образовывать каналы
только в более тонких мембранах. Такие производные не образуют
каналы в относительно толстых мембранах (С18). Каналы образуются
при уменьшении толщины мембраны (до С16). При дальнейшем уменьшении толщины мембраны (до С14), время жизни канала, отражающее его стабильность, увеличивается.
90
2.2.2. Аламетицин
Аламетицин – пептид, состоящий из 20 аминокислот, является
природным продуктом жизнедеятельности гриба Trichoderma viride,
впервые был выделен в 1967 г. Аламетицин относится к семейству
пептидов, называемых пептаиболами из-за большого количества остатков α-аминоизомасляной кислоты. В бислойных липидных мембранах аламетицин образует потенциал-зависимые ионные каналы. В
составе молекулы выделяют α-спиральные участки, которыми богат
С-конец молекулы, ответственный за встраивание аламетицина в
мембрану. Проводимость канала зависит от концентрации аламетицина и липидного состава мембраны. Каналы, обладают преимущественно катионной селективностью.
Аламетициновый канал устроен по принципу «бочонка». Согласно этой модели пора, образованная аламетицином, может увеличиваться в диаметре за счет встраивания в нее новых молекул пептида. Таким образом канал собирается из молекул аламетицина, как бочонок из «дощечек» (бочарных клепок). Каждому состоянию канала
соответствует определенное количество мономеров в кольце. Однако
механизм встраивания аламетицина в мембрану остается неясным. По
одной из версий мономеры аламетицина сначала пронизывают мембрану насквозь, а затем за счет латеральной диффузии собираются в
канал. По другой версии мономеры собираются на поверхности мембраны в агрегаты - предпоры, которые в результате конформационных изменений образуют ионный канал. Показано изменение свойств
аламетициновых каналов в зависимости от величины дипольного потенциала мембраны. Уменьшение дипольного потенциала ДФФХ
мембраны за счет введения флоридзина, гликозида известного дипольного модификатора флоретина, увеличивает проводимость одиночных аламетициновых каналов (рис. 59) и каналообразующую активность пептида. Встраивание в мембрану со стороны введения пептида 6-кетохолестанола, стерина, увеличивающего дипольный потенциал мембраны, приводит к обратным эффектам. Эти данные позволили предложить механизм, позволяющий связать каналообразующую активность аламетицина с величиной дипольного потенциала
мембраны (рис. 60). Адсорбция флоридзина на мембране приводит к
уменьшению скачка потенциала на границе раздела бислой-раствор,
что облегчает встраивание аламетициновых диполей в мембрану, поскольку положительный полюс аламетицинового диполя (N-конец
пептида) располагается в гидрофобной области бислоя. В результате
увеличивается коэффициент распределения аламетицина между ли91
пидной и водной фазами, что в свою очередь вызывает рост каналообразующей активности аламетицина.
Рис. 59. Запись флуктуаций тока, протекающего через аламетициновый ионпроводящий олигомер в отсутствие дипольных модификаторов (А) и в присутствии со стороны введения пептида 500 мкМ флоридзина в мембраноомывающем растворе (Б) или 50 М % 6кетохолестанола в мембранообразующем растворе (В). С – закрытое
состояние канала, О1 – первое проводящее состояние канала. Мембраны сформированы из ДФФХ и омываются 1 М NaCl pH 5.1,
V = –110 мВ
Рис. 60. Схема, иллюстрирующая механизм увеличения каналообразующей активности аламетицина при уменьшении дипольного момента цис-монослоя. Потенциал-зависимость увеличения аламетициновой активности в присутствии 500 мкМ флоризина. В этом представлении штрихованные и пунктирные линии иллюстрируют изменение дипольного потенциала мембраны в пределах поверхностного
слоя (IF) и гидрокарбоновой области мембраны в отсутствие (контроль) и в присутствии флориздина
Несколько позже было предложено альтернативное объяснение
эффекта дипольного модификатора RH 421: уменьшение числа аламетициновых каналов в присутствии RH 421 (рис. 61) связано не с уве92
личением дипольного потенциала мембраны при введении дипольмодифицирующего агента, а обусловлено изменением спонтанной
кривизны мембраны.
Рис. 61. Запись флуктуаций аламетицин-индуцированного трансмембранного тока в ДФФХ-мембране. Добавка дипольного модификатора
RH 421 со стороны введения пептида указана стрелкой. Омывающий
мембрану раствор 0.5 М NaCl pH 6.5, V = -100 мВ
Для того чтобы понять, как спонтанная кривизна липидных молекул может влиять на каналообразующую активность аламетицина,
нужно рассмотреть конформационные изменения, происходящие в
ходе формирования аламетициновой поры. Отрицательная спонтанная кривизна липидных молекул, формирующих бислой, способствует появлению более высоких уровней проводимости для аламетициновых каналов по сравнению с бислоями из липидов, с нулевой спонтанной кривизной (рис. 62).
Рис. 62. Записи флуктуаций аламетицин-индуцированного трансмембранного тока в мембранах, сформированных из липидов с нулевой
(левая панель) и отрицательной (правая панель) спонтанной кривизной
93
/
Большая вероятность появления высоких уровней проводимости в
бислое, сформированном из липидов с отрицательной спонтанной
кривизной, обусловлена конформационными изменениями: из цилиндрических мономеров аламетицина образуется «корсетная» пора (рис.
23). При добавке RH 421 из-за электростатического отталкивания
сульфонатных групп SO3– модификатора липидный монослой приобретает положительную спонтанную кривизну (рис. 63), что затрудняет образование аламетициновых пор.
Рис. 63. Схема, иллюстирующая изменение спонтанной кривизны липидного монослоя при введении RH 421
2.2.3. Мастопаран
Пептидный токсин мастопаран из яда насекомых, относящихся к
отряду Hymenoptera, вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение из них гистамина. Поэтому этот пептид интересен с точки
зрения моделирования аллергических реакций и использования в качестве противовоспалительного агента негормональной природы. Известно, что мастопаран активен в отношении грамположительных
бактерий. В настоящее время в литературе обсуждаются возможности
использования этого пептида для конструирования пептидных векторов. Способность мастопарана взаимодействовать с клеточной мембраной может обеспечить целевую доставку молекул-регуляторов
различных клеточных функций, в том числе клеточного цикла и апоптоза, что важно ввиду противоопухолевого действия последних. Мастопаран может быть также использован в качестве негормонального
регулятора сигнальных систем.
Мастопаран – пептид, состоящий и 14 аминокислотных остатков. Согласно литературным данным он образует в бислойных липидных мембранах ионные каналы двух типов. I тип каналов демон94
стрируют несколько уровней проводимости в диапазоне 15–700 пСм.
II тип каналов характеризуется переходом каналов малой проводимости в каналы проводимости до 650 пСм. Оба типа мастопарановых
каналов потенциал-зависимы: их открывание/закрывание определяется знаком трансмембранного потенциала. Вероятность формированиия поры зависит от ионной силы омывающих бислои растоворов: каналы наблюдаются при концентрации электролита более 0.3 М. Повышение концентрации KCl до 3.0 M стабилизирует открытый канал.
При этом мастопарановые каналы слабо катион-селективны, с отноp
шением проницаемостей ионов K   2 .
pCl 
На рис. 64 представлены записи флуктуаций одиночных мастопарановых каналов II типа.
A
2 пА
2с
Б
0 пА
3 пА
2с
Рис. 64. Флуктуации мастопарановых каналов в бислойых липидных мембранах.
А – Мембрана сформирована из ДФФХ, омывающий мембрану
раствор 0.5 М KCl, pH 7.0, V = -100 мВ. Концентрация мастопарана в
цис-отсеке экспериментальной камеры 4 мкМ.
Б – Мембрана сформирована из эквимолярной смеси
ДОФС:ДОФЭ, омывающий мембрану раствор 1.0 М KCl, pH 7.0,
V = 50 мВ. Концентрация мастопарана в цис-отсеке экспериментальной камеры 7 мкМ
Сравнение пороговых концентраций мастопарана, необходимых
для наблюдения одиночных каналов при фиксированной трансмембранной разности потенциалов в незаряженных мембранах, сформированных из дифитаноилфосфохолина, и в отрицательно заряженных
бислоях, образованных из эквимолярной смеси диолеилфосфосерина
и диолеилфосфоэтаноламина, омываемых 0.5 M растворами KCl показало, что пороговая концентрация мастопарана зависит от поверх95
ностного потенциала бислоя: наличие отрицательного поверхностного заряда мембраны приводит к уменьшению пороговой концентрации мастопарана. По всей вероятности, в силу электростатического
притяжения, положительно заряженные молекулы мастопарана лучше
сорбируются на бислое, имеющем отрицательный поверхностный заряд, чем на незаряженной мембране.
2.2.4. Мелиттин и магаинин
Мелиттин – основной цитолитический линейный пептид с молекулярной массой 2.8 кДа (26 аминокислотных остатка), выделенный
из яда медоносной пчелы и обладающий свойствами поверхностноактивного вещества. Поверхностно-активные свойства мелиттина
особенно ярко проявляются на границе раздела воздух-вода, где его
активность превышает в 50-100 раз эффект известных детергентов.
При высоких концентрациях мелиттин вызывает лизис мембран, а
при сублитических – образует ионные каналы в липидном бислое
клетки. Мелиттин вызывает гемолиз эритроцитов, высвобождает гистамин из тучных клеток. Пептид также увеличивает текучесть фосфолипидного матрикса мембран, что приводит к изменению активности
многих мембраносвязанных ферментов. Физико-химические свойства
мелитина обусловливают его выраженную антибактериальную активность в отношении многих видов микроорганизмов, включая микоплазмы.
Магаинины – антимикробные амфипатические пептиды, способные вызвать лизис бактериальных и грибковых клеток путем образования трансмембранных пор в мембранах клеток-мишеней. В конце
1980-х годов Майкл Заслофф, работающий в системе Национальных
институтов здоровья в Бетезде (США), открыл, что кожный покров
обыкновенной лягушки в ответ на микробное поражение или повреждение запускает сильнейшую систему биохимической защиты – выделяет большое количество антимикробных пептидов, состоящих из
23 аминокислот, которые Заслофф назвал "магаинины". В водном
растворе при нейтральном рН магаинин практически не имеет вторичной структуры, в то время как при связывании с мембраной он
приобретает α-спиральную структуру (спиральность – 60-90 %).
Односторонняя добавка дипольного модификатора RH 421 (со
стороны введения пептидов) сопровождается увеличением мембранной активности мелиттина и магаинина (рис. 65).
96
Рис. 65. Запись флуктуаций тока, протекающего через (А)– мелиттиновые, (Б) – магаининовые каналы в ДФФХ-мембранах, при трансмембранном потенциале –200 мВ и –180 мВ, соответственно. Момент
введения RH 421 указан стрелкой. Омывающие мембраны растворы:
0.5 М NaCl pH 6.5
Антимикробные пептиды мелиттин и магаинин в бислойных
липидных мембранах формируют пептид-липидные тороидальные
поры. Как уже отмечалось, формирование тороидальной поры требует
положительной спонтанной кривизны мембранных липидов. Поэтому
формирование магаининовых или мелиттиновых каналов в мембранах
из ДФФХ затруднено. Введение RH 421 нивелирует отрицательную
спонтанную кривизну ДФФХ-монослоя, в результате чего увеличивается каналообразующая способность магаинина и мелиттина.
В литературе нет однозначных указаний о влиянии толщины
бислоя на образование тороидальных пор. В частности, некоторые авторы склонны считать, что активность мелиттина не зависит от толщины мембраны. Однако в этих работах была исследована достаточно
узкая область толщин бислоя. Сравнение данных, полученных на
мембранах, состоящих из ДОФХ и диэрукоилфосфатидилхолина, говорит о том, что пороговая концентрация пептида значительно выше
в более толстой мембране. При этом в тонких мембранах, сформированных из димиристоилфосфатидилхолина, мелиттин принимает
трансмембранную ориентацию при всех исследованных концентрациях пептида. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что вероятность образования подобных каналов все же зависит от толщины мембраны.
2.2.5. Цекропины
В 1980 г. группа исследователей под руководством Ханса Бомана из Стокгольмского университета (Швеция) обнаружила новый
класс антимикробных пептидов. Гусенице шелкопряда Hyalophora
cecropia была введена инъекция раствора, зараженного бактериями.
97
Анализ химических веществ, синтезируемых инфицированной гусеницей в ответ на укол, позволил идентифицировать пептидные молекулы, состоящие из 25-50 аминокислотных остатков. Их назвали цекропинами в честь шелкопряда. Антимикробная активность цекропинов оказалась очень высокой. Вскоре подобные вещества нашли в
секрете бабочек и мух. Открытие Бомана вызвало широкий интерес,
обусловленный сходством структуры этих пептидов и мелиттина и
высокой избирательностью их действия. Цекропины активны только в
отношении Escherichia coli и не действуют на другие микроорганизмы и клетки высших организмов. Это делает цекропины потенциальными кандидатами для применения в качестве лекарственных
средств.
Биологическая активность цекропинов обусловлена их способностью формировать ионные каналы в клеточных и модельных мембранах. Известно, что в бислойных липидных мембранах цекропины
образуют ионные каналы с различными уровнями проводимости (см.
рис. 31). Их проводимость в растворах 0.1 M NaCl может достигать
2.5 нСм, что предполагает диаметр канала около 4 нм. Каналы обладают преимущественно анионной селективностью. Цекропиновые каналы открываются и закрываются в зависимости от знака приложенного к мембране потенциала, т.е. характеризуются наличием воротного заряда.
В настоящее время найдено несколько видов цекропинов (А, В,
D и AD). Сравнение их активности позволило определить некоторые
особенности образования ионных каналов. Цекропин AD является
наиболее эффективным агентом, способным образовывать потенциалзависимые ионные каналы в бислое, а также оказался самым мощным
антимикробным пептидом в тестах на живых микроорганизмах. Присутствие положительного заряда на поверхности бислоя или наличие
холестерина в мембране значительно уменьшает проводимость мембраны, вызванную цекропином AD.
2.3. БЕЛКИ
Большая по сравнению с пептидами молекулярная масса белков
обуславливает меньшую выраженность влияния поверхностного и
дипольного потенциала на их каналообразующую активность, поскольку заряженные и полярные аминокислотные остатки белка,
формирующие стенки поры, экранируют мембранный потенциал для
проходящих ионов. Поэтому эффекты граничного потенциала на каналообразующую активность белков в этом разделе необсуждаются.
/
98
2.3.1. Колицины
Колицины – вещества белковой природы с молекулярной массой от 70 до 100 кДа продуцируются бактериями Escherichia coli и
обладают антибактериальной активностью по отношению к E.coli и
родственным ей видам. Известно более 25 типов колицинов, различающихся по своим физико-химическим и антигенным свойствам и
по способности адсорбироваться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. Они обозначаются латинскими буквами
А, В, С, D, El, Е2, К и др. Механизм бактерицидного действия колицинов неодинаков. Показано, что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов (ЕЗ) нарушает функцию рибосом, другой (Е2) является ферментом – эндодезоксирибонуклеазой. Токсическое действие колицина Е1 обусловлено сорбцией
белковых молекул на поверхности цитоплазматической мембраны,
последующим формированием в ней ионных пор и нарушением водно-электролитного баланса. Колицины внедряются в клетку путём
использования рецепторов внешней мембраны, основной функцией
которых является транспорт метаболитов. Для того чтобы синтезируемый бактерией белок не разрушал саму бактерию, той же плазмидой кодируется иммунный белок (Lex A), высокоспецифичное взаимодействие с которым ингибирует токсическое действие колицина.
Молекула колицина Е1 состоит из трёх функциональных доменов (T,
R и С), один из которых является каналообразующим (С). Для изучения канальной активности колицина Е1 во многих случаях используют лишь С-домен колицина, а не весь белок, так как канальные свойства С-домена соответствуют таковым для целого белка.
Колицин Е1 в ДФФХ мембранах, омываемых растворами
1 М КCl (pH 4.0), формирует белково-липидные тороидальные поры с
двумя подуровнями проводимости 60 и 600 пСм (рис. 66). Состояние
с высокой проводимостью никогда не появляется до открывания хотя
бы одного малого канала. Это подразумевает, что состояние с высокой проводимостью формируется из уже существующего 60 пСм канала. Оба состояния проявляют одинаковую потенциал-зависимость:
открываются при подаче положительного потенциала со стороны введения белка и закрываются, когда знак потенциала изменяется на
противоположный (рис. 67). Индуцированный колицином Е1 интегральный трансмембранный ток проявляет анионную селективность
при кислых значениях рН раствора. Отношение проницаемости для
анионов хлора к проницаемости для катионов калия равно 7 – для со99
стояний с высокой проводимостью и 4 – с низкой проводимостью.
Рис. 66. Многоуровневая проводимость колицин Е1 каналов. Омывающий ДФФХ-мембрану раствор 1 М КCl pH 4.0, V = 80 мВ
Рис. 67. Влияние знака трансмембранного потенциала на активность
каналов. Омывающий ДФФХ мембрану раствор 1 M KCl, pH 4.0.
V = ± 60 мВ. Стрелкой указан момент переключения знака трансмембранного потенциала
Измерение эффективного диаметра водной поры колицинового канала показало, что диаметр канала с проводимостью 60 пСм и 600 пСм
/
равен 12 Å и 16 Å, соответственно. Большая анионная селективность
высокопроводящего состояния по сравнению с каналом низкой про/
водимости говорит о том, что в первом случае пора образована бо
льшим числом α-спиралей, содержащих положительно заряженные
аминокислотные остатки (см. рис. 33).
Установлено влияние толщины мембраны на каналообразующую активность колицина: с увеличением толщины мембраны возрастает вероятность открывания более высокопроводящего подуровня
проводимости колицинового канала. Это, по всей вероятности, обу/
словлено большей величиной гидрофобного сегмента поры с проводимостью 600 пСм.
2.3.2. Cry дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis
Cry δ-эндотоксины продуцируются грамположительными бактериями
Bacillus thuringiensis и используются в качестве альтернативы хими100
ческим инсектицидам. Cry 1 токсины синтезируются в виде неактивных предшественников с молекулярной массой 125-140 кДа. Протоксины практически не растворимы в воде (растворяются лишь в среднем кишечнике чувствительных видов насекомых при рН около 9.5) и
являются безопасными для всех позвоночных (включая человека). В
кишечнике насекомого протоксины расщепляются протеазами, превращаясь в активные белки (δ-эндотоксины) с молекулярной массой
55-75 кДа, которые формируют ионные каналы в апикальной мембране кишечных эпителиоцитов и вызывают выравнивание концентраций
ионов снаружи и внутри клеток, что приводит к нарушению работы
пищеварительной системы личинки, постепенно вызывая голодную
смерть. Активированный трипсином Cry 1C δ-эндотоксин образует в
липидных мембранах потенциал-независимые ионные каналы (рис.
68). В бислоях, сформированных из эквимолярной смеси пальмитоилфосфатидилэтаноламина и пальмитоилфосфатидилхолина и омываемых 0.3 М KCl (pH 8.0), эти каналы имеют 7-12 уровней проводимости от 21 пСм до 246 пСм с линейными вольт-амперными характеристиками (рис. 69) и демонстрируют близкую слабо катионную селективность. Измерение размеров пор разной проводимости показало
близость радиусов этих пор (1.0–1.3 нм). Полученные результаты позволили говорить о кластерной организации Cry 1C δ-эндотоксиновых
каналов.
Рис. 68. Запись флуктуаций тока, протекающего через Cry 1C δэндотоксиновые каналы: (А) – короткоживущие каналы, (Б) – каналы,
обладающие пачечной активностью, (В) – долгоживущие каналы.
c – закрытое состояние канала. Мембраны сформированы из пальмитоилфосфатидилэтаноламина:пальмитоилфосфатидилхолина (M:M) в
растворе 0.3 М KCl при pH 8.0. Значение трансмембранного потенциала (V) указано на рисунке
101
Рис. 69. Вольт-амперные характеристики подуровней проводимости
(от 21 пСм до 246 пСм) Cry 1C δ-эндотоксиновых каналов. Мембрана
сформирована из пальмитоилфосфатидилэтаноламина и пальмитоилфосфатидилхолина (М:М) и омывается раствор 0.3 М KCl (pH 8.0)
2.3.3. Токсины Staphylococcus aureus
Стафилококки представляют собой грамположительные аэробные или анаэробные кокки, принадлежащие к семейству микрококков. Для медицины интерес представляют такие виды стафилококков,
как золотистый стафилококк (S. aureus), эпидермальный стафилококк
(S. epidermidis) и сапрофитный стафилококк (S. saprophyticus), поскольку эти виды наиболее часто вызывают заболевания у человека, в
частности кожные, респираторные, костные, суставные, раневые инфекции, поражение мягких тканей. Наибольшее значение в патологии
человека имеет золотистый стафилококк. Свое название он получил,
благодаря тому, что вырабатываемые им при росте на твердых питательных средах каротиноиды окрашивают колонии в золотистый
цвет. Показателями стафилококковой инфекции могут быть гнойные
заболевания кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис,
синдром токсического шока, ангина, пневмония, менингит, остеомиелит, а также расстройство центральной нервной системы. Стафилококки продуцируют несколько видов токсинов: α-, β-, γ- гемолизины и
лейкоцидин.
α-гемолизин золотистого стафилококка является основным токсином бактерий, выделенных из клинических образцов. Он взаимодействует с клеточной мембраной и вызывает локальный протеолиз.
К его действию чувствительны моноциты, лимфоциты, эритроциты,
тромбоциты, лейкоциты, эндотелиоциты и другие клетки. При подкожном введении лабораторным животным α-токсин вызывает кожные некротические реакции, после внутривенного введения — гибель
102
животных.
α-гемолизин – это белок с молекулярной массой около 33 кДа. В
водном растворе альфа-гемолизин находится в мономерной форме.
Попадая на поверхность мембраны, 6-7 мономеров образуют асимметричный комплекс, который представляет собой грибовидную
структуру, состоящую из «шляпки» (на внешней стороне мембраны
клетки-мишени) и «ножки» (трансмембранная пора, образованная полипептидными β-слоями) (рис. 70).
Рис. 70. Стадии формирования α-гемолизинового канала. α1-мономер
токсина в водном растворе, α*1-мономер токсина на поверхности
мембраны, α*7-комплекс из 7 мономеров токсина на поверхности бислоя, α7-токсиновый канал в бислойной липидной мембране
В результате формируется потенциал-зависимый ионный канал с несколькими подуровнями проводимости. В бислойных липидных мембранах α-гемолизиновый канал при значениях трансмембранного потенциала более |100| мВ закрывается, – из высокопроводящего состояния переходит в низкопроводящие с проводимостью приблизительно в 10 раз меньшей, чем в полностью открытом состоянии (рис.
71). В открытом состоянии α-гемолизиновый канал проницаем преимущественно для анионов, а в закрытом – для катионов.
Введение в мембраноомывающие растворы дипольного модификатора флоретина, увеличивающего потенциал-чувствительность
α-гемолизинового канала, увеличивает потенциал-чувствительность
канала: переводит пору в состояние с меньшей проводимостью при
более низких абсолютных значениях трансмембранной разности потенциалов. Тестирование других дипольных модификаторов и структурных аналогов флоретина позволило сделать заключение, что эффект флоретина не связан с уменьшением дипольного потенциала
мембраны, а является результатом непосредственного взаимодействия
флавоноида с сенсором напряжения α-гемолизиновой поры, располо103
женном в основании «ножки».
А
± 125
± 25
± 50
± 75
± 150 мВ
± 100
0 пА
20 пА
6с
0 пА
25 пА
5 мин
Б
В
n/N
0,3
-150 мВ
50 мВ
0,2
n/N
0,15
0,10
0,1
0,05
0
400
800
G, пСм
G, пСм
0
400
800
Рис. 71. А – Запись флуктуаций трансмембранного тока, протекающего через одиночный канал, образованный α-гемолизином в ДФФХмембранах, омываемых раствором 1 М KCl, pH 7.5. Стрелками указаны моменты изменения трансмембранного потенциала; Б и В – Гистограммы трансмембранного тока, протекающего через одиночный αгемолизиновый канал для высокопроводящего и низкопроводящих
состояний. Трансмембранный потенциал (V) указан на гистограммах
β-токсин – это Mg2+ – зависимая сфингомиелаза С, которая расщепляет сфингомиелин во внешнем монослое мембраны эритроцитов.
Это изменение не приводит к разрушению клеток, но делает их уязвимыми для многих других литических агентов.
γ-токсин и лейкоцидин золотистого стафилококка — бикомпонентные гемолизины с умеренной активностью в отношении эритроцитов и лейкоцитов человека, соответственно. γ-токсин состоит из
компонентов Hlg1 и Hlg2, которые совместно вызывают лизис эритроцитов, а лейкоцидин – из LukS и LukF, разрушающих лейкоциты и
моноциты/макрофаги. Известно, что γ-токсин также как α-гемолизин
формирует ионные каналы. Трансмембранная часть поры имеет диаметр 2.5 нм, а кольцевая структура надмембранной части – 7 нм и 3
нм (внешний и внутренний диаметр, соответственно). Молекулярный
механизм каналообразующей активности лейкоцидина не установлен.
104
2.3.4. Актинопорины
Актинии, относящиеся к типу Coelenterata, являются источником биологически активных соединений полипептидной природы, таких как нейро- и цитотоксины, протеолитические ферменты, ингибиторы протеиназ. Нейротоксины, будучи модуляторами и блокаторами
Na+ и К+ каналов, используются в качестве инструментов в нейрофизиологических и фармакологических исследованиях. Выделены и
охарактеризованы цитолитические токсины из более чем 30 видов актиний. На основании первичной структуры и физико-химических
свойств токсины разделены на 4 группы. К I группе относятся цитолизины RTX-A, RTX-S и RTX-G с молекулярной массой около 58 кДа, выделенные из Radianthus macrodactylus и Tealia felina. II группу цитолизинов составляют высокоосновные полипептиды (рI 9 и
выше) с молекулярной массой 20 кДа, так называемые актинопорины,
выделенные из Actiniidae и Stichodactylidae. B III группу входят цитолитические фосфолипазы А2 (30-40 кДа) из Aiptasia pallida и подобные им по физико-химическим свойствам цитолизины без ферментативной активности из Urticina piscivora. Единственным представителем IV группы холестерин-ингибируемых цитолизинов является метридиолизин (м.м. около 80 кДа), выделенный из актинии Metridium
senile. Наиболее изучены цитолизины II группы: эквинатоксины, стихолизины и магнификализины, выделенные из Actinia equina,
Stichodactyla helianthus и Heteractis magnifica, соответственно. К настоящему времени установлены аминокислотные последовательности
восьми зрелых актинопоринов. Для эквинатоксина II (Eqt II) установлена кристаллическая структура. Показано, что актинопорины оказывают мембранотропное действие на сфингомиелин-содержащие мембраны эукариот. Белки формируют в них катион-селективные ионные
поры тороидальной структуры с проводимостью от 100 до 400 пСм,
включающие 3-4 мономера токсина.
Предложена модель для описания процесса порообразования
цитолизином: белок взаимодействует своим богатым триптофанами
участком с липидным бислоем, причем это взаимодействие обратимо
и не приводит к лизису клетки. Затем N–концевой фрагмент молекулы цитолизина проникает в липидный бислой, конформация мономера изменяется, образуется достаточно прочный комплекс цитолизина
с липидным матриксом, в котором формируются поры, приводящие к
нарушению проницаемости мембраны.
105
2.3.5. Латротоксин
Альфа - латротоксин – белок с молекулярной массой 130 кДа
является основным компонентом яда паука каракурта Latrodectus
tredicumguttatus. Мишенью латротоксина являются синапсы центральной нервной системы, где токсин связывается с белковым рецептором. Комплекс нейротоксин-рецептор образует Ca2+-канал. Входящий кальциевый ток запускает процесс высвобождения нейромедиатора. Под действием нейротоксина достигается 1000–1500-кратное
увеличение скорости высвобождения нейромедиатора, что через 3050 минут приводит к истощению его запасов в нервном окончании и
развитию полного блока нервно-мышечной передачи.
В бислойных липидных мембранах латротоксин образует Ca2+ –
селективные потенциал-зависимые ионные каналы. Открывание/закрывание латротоксиновых-каналов зависит от полярности
приложенного к мембране потенциала. Проводимость таких каналов
находится в диапазоне от 112 пСм до 1110 пCм в случае фосфатидилхолиновых (нейтральных по заряду) мембран и от 75 пСм до 170 пСм
для липидных бислоев из фосфатидилсерина (отрицательнозаряженных), омываемых 0.1 M KCl (pH 7.5). Селективность αлатротоксиновых каналов зависит от состава мембраны и одинакова
для каналов разной проводимости. Измерения размеров поры латротоксиновых-каналов с помощью незаряженных водорастворимых полимеров показали совпадение радиуса поры (0.9 нм) для каналов с
разной проводимостью. На этом основании была предложена модель
кластерной организации латротоксиновых каналов.
2.3.6. Холерный токсин
Холерный токсин – вырабатываемый Vibrio cholerae олигомерный белок с молекулярной массой около 65 кДа, состоящий из шести
субъединиц. После попадания в организм человека бактерии секретируют токсин. Результатом действия токсина является интенсивное
обезвоживание. В основе биологической активности холерного токсина лежит его способность образовывать анион-селективные каналы
в клеточных и модельных липидных мембранах. Образование таких
каналов приводит к нарушению водно-солевого баланса клетокмишеней. Субъединицы холерного токсина относятся к А и В типу.
Молекулярная масса каждой В субъединицы составляет 12 кДа. Пять
В субъединиц токсина образуют кольцо, а А структура присоединена
дисульфидными связями к В кольцу. Холерный токсин связывается с
белком-рецептором в мембране клеток-мишеней. В-кольцо образует
106
трансмембранную пору, по которой транспортируется А-домен. Дисульфидные связи разрушаются и А домен высвобождается в цитозоль. Субъединица А обладает каталитической активностью.
2.3.7. Дифтерийный токсин
Дифтерийный токсин – белок с молекулярной массой 62 кДа,
секретируемый Corynebacterium diphtheriae, состоит из двух фрагментов А и В. Фрагмент В обеспечивает связывание бактерий с поверхностью клеточной мембраны и облегчает перемещение ферментативно активного А-фрагмента в цитозоль. При этом B-фрагмент встраивается в мембрану и образует ионселективные канал, по которому
транспортируется А-фрагмент. Фрагмент А нарушает синтез белков,
что в конечном счете приводит к гибели клеток.
В бислойных липидных мембранах В-фрагмент дифтерийного
токсина формирует потенциал-зависимые анион-селективные каналы.
Средняя проводимость этих каналов в азолектиновой мембране около
6 пСм в 0.2 М NaCl и около 20 пСм в 1.0 М NaCl (рис. 72). Показано,
что формирование канала дифтерийным токсином зависит от знака
приложенного трансмембранного потенциала: при положительных
относительно стороны введения токсина потенциалах флуктуации тока не наблюдаются в течение длительного времени, а при подаче отрицательных потенциалов каналы быстро открываются.
Рис. 72.Флуктуации тока, протекающего через одиночные дифтерийные каналы. Показаны моменты открывания и закрывания одиночного канала. Мембраны сформированы из эквимолярной смеси
фосфатидилэтаноламина и азолектина и омываются 1.0 М NaCl,
pH 4.85. Трансмембранный потенциал указан на рисунке
2.4. ПОЛИЕНОВЫЕ МАКРОЛИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ
В 60-70-х годах прошлого столетия был обнаружен новый класс
мембраноактивных порообразующих соединений – полиеновые макролидные антибиотики (ПА). Это большой класс веществ, продуци107
руемых микроорганизмами Streptomyces (Actinomyces). Современный
перечень ПА содержит более 200 наименований. Молекулярная масса
ПА равна примерно 1000 Да. Стоит особо подчеркнуть, что ПА – это
непептидные антибиотики. Синтез макролидов осуществляется с помощью фермента поликетидсинтетазы путем поэтапной конденсации
карбоновых кислот. Макролидные антибиотики представляют собой
большую группу природных соединений, которые обладают высокой
биологической активностью. ПА являются одним из самых эффективных препаратов для лечения грибковых инфекций, глубоких системных микозов и широко используются в клинической медицине
уже много десятилетий. Интерес к ПА еще более возрос в связи с обнаружением их противоопухолевой и противовирусной активности.
Выявлена способность ПА снижать уровень холестерина в крови и
благоприятно влиять на процесс жировой дистрофии печени. Приходится, однако, отметить, что токсичность указанных антибиотиков
резко ограничивает их применение и требует создания новых лекарственных форм.
В химической структуре всех ПА имеется макролидное кольцо.
Макролидное кольцо содержит жесткую гидрофобную цепь, в состав
которой входят сопряженные двойные связи (от 3 до 8), и гидрофильную цепь, включающую гидроксильные и карбонильные группы. Сопряженные двойные связи определяют хромофорные свойства этих
веществ. Отсюда их общее название – «полиены». ПА классифицируются как n-ены, где n равно числу конъюгированных двойных связей. В зависимости от числа двойных связей в хромофоре ПА разделяются на несколько групп – триены (известно 5 соединений), тетраены (20), пентаены (30), гексаены (9), гептаены (30), октаены (3). Хромофорная система с определенным числом двойных связей, входящая
в структуру молекул полиенов, определяет конформационную жесткость всего макролактонного кольца. Благодаря жесткости полиеновой цепи, молекулы антибиотиков имеют вытянутую палочкообразную форму. Длина лактонного кольца молекул ПА составляет примерно 2.8 нм. На одном конце молекул большинства ПА содержатся
две заряженные группы: карбоксильная и аминосахар (микозамин или
перозамин). Некоторые ПА, например, филипин, не содержат аминосахар.
ПА разделяются на две подгруппы. К первой подгруппе относятся антибиотики, не содержащие ароматическую группировку (амфотерицин В, нистатин, кандидин, микогептин) (рис. 73).
108
А
Б
амфотерицин В
нистатин
Рис. 73. Химическая структура неароматических ПА амфотерицина В (А) и нистатина (Б)
Ко второй подгруппе относятся антибиотики, содержащие ароматическую группировку (леворин, кандицидин, гамицин, аскозин, перимицин) (рис. 74).
леворин А2
Рис. 74. Химическая структура ароматического ПА леворина
2.4.1. Неароматические полиеновые антибиотики
В биологическом аспекте наиболее подробно изучен амфотерицин В. В состав лактонного кольца амфотерицина В входят 38 углеродных атомов (рис. 73 А). Гидрофильная и гептаеновая цепи в макролактонном кольце, представлены, соответственно, углеродными
атомами С1-С15 и С20-С33, которые располагаются параллельно друг к
другу. Гептаеновая цепочка С20 -С33 является жесткой системой, состоящей из семи двойных связей. В гидрофильной цепи молекулы
амфотерицина В содержатся карбонильные и гидроксильные группы.
Гидроксильные группы в гидрофильной части молекулы расположены в одной плоскости. В положениях 6 и 19 находятся карбоксильная
группа и остаток микозамина, соответственно. Еще одна гидроксильная группа локализована в конце гидрофобной части молекулы в положении 35. Нистатин (рис. 73 Б) иногда называт гидрированным
гептаеном, так как одна насыщенная связь разделяет хромофор на
диеновый и тетраеновый участки, но в остальном молекула нистатина
аналогична по структуре молекуле амфотерицина В.
На протяжении нескольких десятилетий амфотерицин В является одним из наиболее часто применяемых препаратов, используемых
для борьбы с системными микозами. Несмотря на большое число по109
бочных эффектов, таких как нефротоксичность, анемия, сердечная
аритмия, он остается препаратом выбора для лечения больных со
сниженным иммунитетом, например, онкологических больных при
интенсивной химиотерапии, пациентов после пересадки органов и
больных СПИДом. Фармацевтические технологии разработки инновационных препаратов направлены на снижение концентрации свободного амфотерицина В в сыворотке пациентов без ущерба для его
терапевтической эффективности. Считается, что чувствительные
клетки гибнут благодаря способности амфотерицина В связываться с
их плазматическими мембранами, формировать в ней трансмембранные поры и нарушать водно-электролитный баланс клетки-мишени.
Несмотря на 50-летнее исследование молекулярных механизмов формирования и функционирования амфотерицинового каналов в модельных липидных мембранах, точная молекулярная архитектура канала все еще находится на стадии обсуждения: предложены различные модели. Наиболее популярной является стерин-зависимая модель, в рамках которой образование полиенового канала при его двусторонней относительно мембраны добавке происходит при ассоциации двух «полупор», образованных комплексами полиеновых и стериновых молекул и располагающихся в противоположных монослоях.
Схематическая модель образования поры показана на рис. 75.
Рис. 75. Гипотетическая модель образования амфотерицинового канала
Полупора, имеющая цилиндрическую форму, образуется одинаковым числом (7-10) молекул антибиотика и стерина, ориентированных поперек мембраны. Полость поры выстлана гидрофильными цепочками лактонового кольца. Сквозная трансмембранная пора формируется из двух полупор за счет водородных связей между гидроксильными группами молекул амфотерцина, сосредоточенных в сты110
кующихся полупорах.
Стерин-зависимая модель позволяет предположить, что терапевтическая эффективность амфотерицина В связана с его селективностью по отношению к стеринам клеточных мембран. Дело в том,
что плазматические мембраны клеток млекопитающих содержат холестерин, а грибковые клетки – эргостерин. Тем не менее, неизвестно,
что является причиной подобной селективности: различие в физикохимических свойствах мембран, содержащих холестерин или эргостерин (их текучесть, дипольный потенциал, форма и размер упорядоченных мембранных микродоменов), или же большая стабильность
комплекса амфотерицин-эргостерин по сравнению с комплексом амфотерицин-холестерин. Приведем некоторые факты, свидетельствующие в пользу первой гипотезы.
1) Известно, что стерины ответственны за текучесть мембраны.
При этом конденсирующий эффект эргостерина в мембранах из насыщенных фософолипидов более выражен, чем в присутствии холестерина (рис. 76).
Рис. 76. Эффект эргостерина (А) и холестерина (Б) на агрегатное
состояние мембраны. Молекулы стеринов представлены в виде цветных прямоугольников
Кроме того, сам амфотерицин В также влияет на плотность упаковки
липидных молекул в мембране. Он увеличивает ориентационный порядок ацильных цепей фосфолипидов в холестерин-содержащих мембранах. В эргостерин-содержащих бислоях наблюдается противоположный эффект: амфотерицин В приводит к разжижению в области
углеводородного кора мембраны.
2) От концентрации стерина в мембране зависит ее агрегатное
состояние и латеральная гетерогенность. Так, главной особенностью
фазовой диаграммы «фосфатидилхолин:холестерин» является наличие упорядоченной фазы (рафтов) при концентрациях холестерина
111
более 25 M %. Недавно было показано, что полиеновые молекулы
преимущественно локализуются на границе рафтов с неупорядоченными мембранными областями. Помимо текучести, стерины влияют и
на дипольный потенциал мембраны или ее отдельных областей. Известно, что холестерин увеличивает дипольный потенциал липидных
бислоев. Детальных исследований эффекта эргостерина на дипольный
потенциал мембран пока не проведено.
3) Методами молекулярной динамики показано, что в мембране
отрицательно заряженная карбоксильная группа амфотерицина В немного смещена в сторону водной фазы по сравнению с протонированной аминогруппой (рис. 77).
Рис. 77. Ориентация молекулы амфотерицина В в мембране.
Верхняя часть рисунка соответствует водной фазе, нижняя – углеводородному кору бислоя
Подобная ориентация молекул полиена должна способствовать некоторому падению дипольного потенциала мембраны. Все это может
служить предпосылкой к определяющей роли физико-химических
свойств мембраны в каналообразующей активности полиеновых макролидных антибиотиков.
Некоторые исследователи поддерживают гипотезу о доминировании энергетических характеристик полиен-стериновых комплексов
в порообразовании. В случае палочковидных молекул сила вандерваальсовых взаимодействий зависит от взаимной ориентации молекул и
достигает максимума в случае их копланарности. Последнее позволяет утверждать, что наличие двух дополнительных двойных связей в
молекуле эргостерина (по сравнению с холестерином) будет способствовать возникновению дополнительных точек π-π электронного
взаимодействия между стериновой и полиеновой молекулами, необходимых для стабилизации «правильной» ориентации комплекса (рис.
112
78 А). Отсутствие этих двойных связей в молекуле холестерина может
приводить как к увеличению энергии комплексообразования (рис. 78
Б), так и к энтропийным потерям, связанным с уменьшением конформационной гибкости насыщенной боковой цепи стерина.
Рис. 78. Межмолекулярные связи, образующиеся в комплексах
амфотерицин-эргостерин (А) и амфотерицин-холестерин (Б).
Изучение проводимости одиночных амфотерициновых каналов
в зависимости от липидного состава мембраны не выявило какихлибо серьезных отличий для мембран, сформированных с участием
незаряженных и заряженных фосфолипидов. Вольт-амперные характеристики каналов, образованных амфотерицином В, нистатином и
микогептином симметричны относительно знака трансмембранной
разности потенциалов и нелинейны. Для примера на рис. 79 представлена вольт-амперная характеристика одиночных амфотерициновых
каналов.
I, пА
2
150 мВ
1 пА
1
2с
0 пА
0
-200
-100
100
-1
200
V, мВ
0 пА
1 пА
-2
2с
-150 мВ
Рис. 79. Вольт-амперная характеристика одиночных амфотерициновых каналов. Мембраны сформированы из смеси
113
ДФФХ:холестерин в молярном соотношении 67:33 М % и омываются
2 М КCl (pH 7.0). На вставках представлены флуктуации тока, протекающего через амфотерициновые каналы при указанных значениях
трансмембранного потенциала
Хотя природа селективности амфотерициновых каналов до сих
пор не выяснена, известно, что проницаемость каналов для анионов
выше проницаемости для катионов. В этой связи тот факт, что при
уменьшении дипольного потенциала мембраны уменьшается проводимость одиночных амфотерициновых каналов, не вызывает удивления. Однако установлены и специфические эффекты дипольных модификаторов на каналообразующую активность амфотерицина, обусловленные их связыванием с полиен-стериновыми комплексами за
счет включения в вандерваальсово взаимодействие. Эти данные также
свидетельствуют о двойственной природе механизмов регуляции
мембранной активности полиенов: за счет изменения структурнодинамических свойств бислоя и энергии комплексообразования полиен-стерин.
2.4.2. Ароматические полиеновые антибиотики
Как уже было отмечено, амфотерициновые каналы избирательно
проницаемы для одновалентных анионов. Однако при исследовании
ароматических антибиотиков было обнаружено, что каналы, образованные леворином, трихомицином и кандицидином, избирательно
проницаемы не для анионов, а для катионов щелочных металлов. Эти
антибиотики отличаются от амфотерицина В наличием в молекулах
дополнительной ароматической группировки – ρ-аминоацетофенона,
в которой содержится положительно заряженный азот. Также как неароматические полиены, макролиды с ароматической группировкой
практически не эффективны в отсутствие стеринов. Однако, в отличие неароматических антибиотиков ароматические эффективны и при
одностороннем относительно мембраны введении. Малая проницаемость мембраны для полиеновых антибиотиков позволяет утверждать, что каналы, образованные ароматическими полиенами, асимметричны, в отличие от симметричных пор, сформированных неароматическими макролидами. Наиболее изученным представителем
этого класса является леворин А2. Асимметричность структуры канала подтверждается потенциал-зависимостью открывания-закрывания
левориновых каналов. Еще одной отличительной чертой ароматиче114
ских полиеновых антибиотиков от неароматических является необратимая инактивация интегральной мембранной проводимости. Вид
стерина влияет на форму инактивационной кривой.
Шумовой анализ показывает, что спектры шума в случае леворина А2 и амфотерицина В сильно различаются: первый характеризуется высоким уровнем фликкер-шума (см. 1.3.6), источником которого является диффузное движение ионных каналов в липидном матриксе, которое приводит к случайным переключениям канала, во втором случае в спектре доминирует лоренцевская компонента, а флуктуации проводимости связаны преимущественно с процессами сборки
и разборки каналов, сопровождающих переход из открытого в закрытое состояния. Столь различное «шумовое» поведение леворина А2 и
амфотерицина В позволяет сделать вывод о том, что механизм функционирования леворинового канала отличается от механизма функционирования амфотерицинового канала. Причиной подобных различий должна быть дополнительная ароматическая группировка, расположенная на гидрофобном конце молекулы леворина А2 и снабженная
функциональными группами, способными образовывать водородные
связи. Интенсивность сигналов фликкер-шума сильно зависит от вида
липида, используемого для формирования липидного бислоя, модифицированного леворином, что еще раз подчеркивает важную роль
влияния липидного окружения на процесс функционирования ионных
каналов.
Запись флуктуаций тока, протекающего через одиночные левориновые каналы, показана на рис. 80.
Рис. 80. Запись флуктуаций тока, протекающего через мембрану, при односторонней модификации леворином А2 при трансмембранном потенциале 100 мВ (знак плюс со стороны введения антибиотика). Концентрация антибиотика равна 5 10-8 М. Мембраноомывающий раствор: 2 М KCI, рН 6.5, t = 220С. Мембраны сформированы
из смеси фосфолипида с холестерином в весовом соотношении 20:1.
Стрелкой обозначен уровень проводимости немодифицированной
мембраны
115
Результаты исследования селективности модифицированных леворином мембран, а также зависимостей проводимости бислоя от концентрации ПА позволили предложить гипотезу формирования в мембране леворинового канала (рис. 81).
Рис. 81. Гипотетическая молекулярная модель сформированного
леворинового канала в бислойной мембране
Как следует из рис. 81, левориновый канал представляет собой олигомерную структуру, которая состоит из нескольких, чередующихся
между собой молекул антибиотика и молекул стерина. При этом гидрофильные цепи молекул антибиотиков выстилают внутреннюю полость поры.
Следует отметить, что дальнейшие исследования каналообразующей активности ПА и поиск потенциальных синергистов их противогрибкового действия могут способствовать расширению сферы использования ПА в терапевтических целях.
116
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Биофизика / Антонов В.Ф. [и др.]. – Изд-во «Владус», 2000. 288
с.
Алексеенко В.А. Взаимодействие кальциевых каналов плазматической мембраны клеток А431 и рецептора инозитолтрисфосфата эндоплазматического ретикулума: дис. на соискание ученой степени
кандидата биол. наук / В.А. Алексеенко. – СПб, 2003. – 75 с.
Безруков С.М. Физика ионных каналов: дис. на соискание ученой степени доктора физ.-мат. наук / С.М. Безруков. – Гатчина:
ПИЯФ, 2007. – 297 с.
Гелетюк В.И. Кластерная организация ионных каналов / В.И.
Гелетюк, В.Н. Казаченко. – М., 1990. – 223 с.
Дамаскин Б.Б. Электрохимия / Б. Б. Дамаскин, О. А. Петрий, Г.
А. Цирлина. – 2_е изд., испр. и перераб. – М.: Химия, КолосС, 2006. –
672 с.
Делахей П. Двойной слой и кинетика электродных процессов /
П. Делахай. – Из-во «Мир», М., 1967. – 351 с.
Ивков В.Г. Липидный бислой биологических мембран / В.Г. Ивков, Г.Н. Берестовский. – М., 1982. – 224 с.
Касумов Х.М. Структура и мембранная функция полиеновых
макролидных антибиотиков / Х.М. Касумов. – М.: «Наука»; Баку:
«Элм», 2009. – 512 с.
Крутецкая З.И. Биофизика мембран / З.И. Крутецкая, Лонской
А.В. –СПб.: Изд-во С.-Петербург. ун-та, 1994. – 287 с.
Ковальчук С.И. Формирование неселективных пептид-липидных
пор как модель процесса белковой трансдукции с помощью поликатионных аналогов грамицидина А: дис. на соискание ученой степени
кандидата хим. наук / С.И. Ковальчук. – М., 2010. – 189 с.
Лев А.А. Моделирование ионной избирательности клеточных
мембран / А.А. Лев. – Изд-во «Наука», Л., 1976. – 210 с.
Маркин В.С. Индуцированный ионный транспорт / В.С. Маркин,
Ю.А. Чизмаджев. Изд-во «Наука», М., 1974. – 251 с.
Мембраны: ионные каналы / Под ред. Чизмаджева Ю.А. М.,
1981. 239 с.
117
Русанов А.И. Фазовые равновесия и поверхностные явления /
А.И. Русанов. – Из-во «Химия», Л., 1967. – 388 с.
Рубин А.Б. Биофизика Кн. 2. Биофзика клеточных процессов. М.,
1987. 303 с.
Регистрация одиночных каналов / Под ред. Б. Сакмана и Э. Неера. М., 1987. 448 с.
Самойлов В.О. Медицинская биофизика / В.О. Самойлов. – Издво «Спецлит», 2007. – 560 с.
Трухан Э.М. Введение в биофизику / Э.М. Трухан. – М.: МФТИ,
2008. – 242 с.
Andersen O.S. Gramicidin channels / O.S. Andersen, R.E. Koeppe,
B. Roux. – IEEE Trans Nanobioscience, 2005. 10 p.
Hille B. Ionic channels of Excitable Membranes / Sinauer associates
inc., Sunderland, Massachusetts, 1992. 607 p.
Pore-forming Peptides and Protein Toxins / Edited by G. Menestrina,
M. Dalla Serra and P. Lazarovici. London and New York, 2003. 315 p.
Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes / Edited by A.
Leitmannova Liu. Amsterdam: Elsevier, 2008. 276 p.
118