ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЛИКОЛИПИДНЫХ БИОСУРФАКТАНТОВ PHOTOCOLORIMETRIC ASSAY OF BACTERIAL GLYCOLIPIDS BIOSURFACTANTS

ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
ГЛИКОЛИПИДНЫХ БИОСУРФАКТАНТОВ
Кучумов П.В., Петриков К.В.
Тульский государственный университет
PHOTOCOLORIMETRIC ASSAY OF BACTERIAL GLYCOLIPIDS BIOSURFACTANTS
Kutchumov P.V., Petrikov K.V.
Tula State University
Биосурфактанты (био-ПАВ) – это поверхностно-активные вещества биологического
происхождения. В настоящее время, интенсивно изучается образование подобных экзоклеточных соединений микроорганизмами. Биологическая роль биосурфактантов – это
стимулирование роста углеводородокисляющих микроорганизмов на гидрофобных (обычно,
углеводородных)
субстратах
путем
снижения
межфазного
натяжения
в
системе,
солюбилизаци субстрата и, следовательно, повышения биодоступности его для дальнейшего
окисления
микробной
клеткой.
В
виде
очищенных
препаратов
био-ПАВ
могут
использоваться при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.
Основное преимущество перед синтетическими ПАВ в том, что они экологичны, так как их
внесение в почву не сопровождается токсическими эффектами и они легко разрушаются в
окружающей среде.
Оценка образования биосурфактантов эффективными штаммами-нефтедеструкторами
является актуальной задачей, решение которой позволит найти условия для оптимального
образования биоПАВ.
Определение концентрации гликолипидных биосурфактантов основано на цветной
реакции углеводной части молекулы с кислородсодержащим ароматическим соединением:
фенолом, α-нафтолом, орхинолом, антроном и т.д. в присутстви серной кислоты и при
нагревании. Фенол является наиболее удобным реагентом: он легкодоступен и достаточно
устойчив по сравнению с остальными. При использовании фенола образуется соединение,
имеющее желто-оранжевую окраску. Максимальное поглощение, наблюдаемое в области
480-490 нм, пропорционально концентрации углевода первоначальном в образце.
В данной работе использовались штаммы Pseudomonas sp. 142NF(pNF142),
Pseudomonas putida BS3701 (pBS1021,pBS1022), Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5,
Rhodococcus sp. S26 из коллекции лаборатории биологии плазмид УРАН ИБФМ, г. Пущино.
Данные микроорганизмы являются высокоэффективными нефтедеструкторами и входят в
состав препаратов для очистки загрязнённых территорий. Таким образом, изучение
образования биосурфактантов данными бактериями позволит увеличить эффективность этих
препаратов. Из рлитературных данных известно, что для микроорганизмов родов
Pseudomonas и Rhodococcus характерно образование биосурфактантов гликолипидной
природы, соответственно, содержащих углеводную часть. Это позволяет использовать
фенол-сернокислый метод для количественной оценки продуцируемых био-ПАВ.
Культивирование штаммов микроорганизмов проводили на минимльной минеральной
среде. В качестве единсвенного источника углерода и энергии использовали следующие
субстраты: гексадекан, дизельное топливо, сырую нефть, нафталин, глюкозу.
В результате было показано, что микроорганизмы рода Rhodococcus являются более
эффективными продуцентами, чем рода Pseudomonas.
Гексадекан является удоволетворительным в качестве субстрата: все три штамма
родококков продуцировали примерно одинаковое количество ПАВ, в среднем 0,20±0,05 г/л.
При деструкции нефти штаммы Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. S26 продуцировали
меньше гликолипидов, но, в тоже время, штамм Rhodococcus sp. X5 при росте на нефти
образовывал максимальное количество биосурфактанта (0,43±0,03 г/л) среди всех
исследованных вариантов. Это может говорить о различиях в механизмах окисления такого
субстрата у этих бактерий. Использование дизельного топлива дало наименьшую продукцию
био-ПАВ для всех трёх штаммов.
Псевдомонады синтезировали незначительное количество гликолипидов. Количество
сурфактанта, образованного при росте на глюкозе не превышало 0,02 г/л. Дизельное топливо
гексадекан и нафталин не подходят в качестве субстратов для псевдомонад для продукции
био-ПАВ. Эти субстраты являются гидрофобными, а глюкоза относится к гидрофильным.
Можно предположить, что гидрофильные субстраты стимулируют синтез биосурфактантов у
псевдомонад, в отличие от гидрофобных.
В ряде работ сообщалось, что наличие фактора стресса, например, повышенной
осмолярности среды, может способствовать увеличению выхода биосурфактанта. Для этого
три штамма родококов выращивались с гексадеканом при 3% или 5% содержании хлорида
натрия в среде. Однако, наблюдалось только снижение количества образуемого био-ПАВ жа
счёт общего подавления роста микробной культуры. Таким образом, для анных штамов
явление ответа на солевой стресс в виде увеличения интенсивности синтеза гликолипидов не
характерно.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» (2009-2013 г.) госконтракт №02.740.11.0296, госконтракт №П976