Очистка белков
advertisement
GE Healthcare Очистка белков Приложения, отвечающие Вашим интересам Очистк Вы должны получать качественные результаты, чистые белки и публиковать Ваши открытия вовремя, оставаясь при этом в рамках бюджета . Хоть это и сложная задача, но очистка белков никогда не должна быть проблемой для Вас. Здесь Вы найдете проверенные решения для многих современных задач по очистке белка, а также обзор хроматографических систем, сервисов и обеспечения качества, которые мы предоставляем для поддержки Ваших исследований. С приблизительно 50-летним опытом и богатыми знаниями в области очистки белков специалисты фирмы GE Healthcare всегда готовы помочь Вам в получении наилучших результатов. Содержание Очистка белков, меченых гистидином 2-стадийная очистка высокомолекулярного белка, меченного гистидином Масштабирование очистки белка, меченного гистидином Продукция для очистки белков, меченных гистидином Очистка GST-меченых белков 1-стадийная очистка и расщепление на колонке GST-меченого белка Масштабирование очистки GST-меченого белка Продукция для очистки GST-меченых белков Высокопроизводительная очистка белков Оптимизация протокола для автоматической многостадийной очистки гистидин- и GST-меченых белков Автоматическое удаление метки на системе ÄKTAxpress Продукция для высокопроизводительной очистки белков Очистка антител Очистка мышиных IgG1 MAb из культур клеток с помощью Сефарозы Protein G Разделение мономер/димер MAb Очистка гуманизованных IgG4 из культуры клеток с помощью Protein А Сравнительная связывающая способность: protein А и protein G Продукция для очистки антител Aналитические разделения Обращеннофазовая хроматография для пептидного картирования при высоком значении рН Анализ чистоты синтетических олигонуклеотидов Анализ гликированного и негликированного гемоглобина A1c Продукция для аналитических разделений Очистка немеченых белков Быстрая 3-стадийная очистка лабильного фермента Двухстадийная очистка нативного белка при оптимизированном рН Продукция для очистки немеченых белков Рефолдинг белков из телец включения Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка меченого гистидином белка из телец включения E. coli Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка в двойном градиенте Репрезентативный процесс хроматографического рефолдинга Продукция для колоночного рефолдинга Пробоподготовка 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 16 17 17 18 19 20 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 29 30 31 Удаление мажорных белков из плазмы человека Удаление трипсиноподобных сывороточных протеаз из плазмы человека Малое масштабирование при замене буфера, до 60 мл образца Обессоливание 100–300 мл образца методом тангенциальной фильтрации Продукция для подготовки образцов 32 33 33 33 34 Хроматографические системы Сервис, техническая поддержка, качество Литература Контактная информация 35 36 39 40 Очистка белков, меченных гистидином О белках, меченных гистидином Гистидиновая метка чаще всего используется для рекомбинантных белков. Препаративная очистка рекомбинантных белков, меченных гистидином на иммобилизованных металл-аффинных сорбентах (IMAC) является самым популярным и эффективным методом выделения. IMAC использует способность гистидина связываться с хелатным ионом переходного металла, таким, как никель (Ni2+). Очистка белков, меченных гистидином может проводиться как в нативных, так и в денатурирующих условиях Проблемы в очистке белков Решения Наши решения предлагают: • Существенно более высокие выходы целевого белка благодаря почти в четыре раза большему связыванию сорбентом по сравнению с ранее доступными • Минимальный риск инактивации целевого белка благодаря прекрасной совместимости сорбента с широким диапазоном восстанавливающих реагентов, детергентов и других добавок • Уменьшение ручных операций и большая гибкость в работе благодаря удобным предупакованным колонкам. Очень важно получить максимально высокий выход активного целевого белка. Высокая связывающая способность экономит Вам время и уменьшает расход сорбента и буферов. Существование Вашего целевого белка в активной форме может потребовать добавления в раствор детергентов или иных веществ. Таким образом, метод очистки и сорбент должны быть совместимы. В общем, увеличение концентрации имидазола в связывающем и элюирующем буфере уменьшает неспецифическое связывание. Наоборот, уменьшение концентрации дает большее связывание благодаря более более сильному аффинному взаимодействию. Таким образом, необходимо найти оптимальный баланс. Некоторые белки требуют больше стадий очистки для достижения требуемой чистоты. 3 2-стадийная очистка высокомолекулярного белка, меченного гистидином Рис. 1A: Первая стадия очистки с IMAC Рис. 1B: Вторая стадия очистки гель-фильтрацией Образец: 10 ml E. coli экстракта с низким уровнем экспрессии меченной гистидином маннаназы, Man 26A, из Cellulomonas fimi (Mr ~ 100 000) Образец: 0.5 ml концентрированного образца с первой стадии (IMAC) Колонка: Superdex™ 200 10/300 GL HisTrap™ HP 1 мл Буфер: PBS, pH 7.5 Скорость: 0.5 мл/мин Система: ÄKTAexplorer 100 Колонка: Связывающий буфер: 20 мM фосфат натрия, 30 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4 Элюирующий буфер: 20 мM Фосфат натрия, 500 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4 Градиент: 25 ml линейный градиент 30–300 мM имидазола Скорость: 1 мл/мин. Гель-фильтрация mAU 80.0 A 280 nm mAU 70.0 IMAC 400 60.0 300 50.0 40.0 200 30.0 20.0 100 10.0 Eluted pool 0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 0.0 50.0 ml Выводы • Высокомолекулярный меченый гистидином белок маннаназа Man 26A был очищен и получен в энзиматически активной форме • Ni Sepharose High Performance (HP) обладаеет прекрасными связывающими свойствами • получается 60 мг очищенного белка за 1 цикл очистки • вторая стадия очистки - гель-фильтрация на Superdex 200 добавлена для достижения нужной чистоты белка 95 % О сорбенте Ni Sepharose High Performance Использование Ni Sepharose HP позволяет получать узкие пики и высокую концентрацию целевого белка. Она дает: • Выскоэффективную очистку • высокую концентрацию целевого белка • Может использоваться в шприце, с насосом или хроматографической системой 4 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 ml Mr 97 000 66 000 45 000 30 000 20 100 14 400 1 2 3 4 5 Рис. 1C: SDS-PAGE Линия 1: LMW Линия 2: E. coli экстракт Линия 3: IMAC flow-through Линия 4: IMAC ранняя фракция Линия 5: IMAC целевая фракция Линия 6: после гель-фильтрации 6 Масштабирование очистки белка, меченного гистидином Рис. 2A: Масштабирование очистки белка, меченного гистидином Образец: Меченный гистидином связывающий мальтозу белок в экстракте E. coli (образцы содержали 8, 40 и 160 мг соответственно) Колонки: HisTrap FF 1 мл, HisTrap FF 5 мл, HisPrep™ FF 16/10 20млl. Все колонки упакованы сорбентом Ni Sepharose 6 Fast Flow. Связывающий буфер: 20 мM фосфат натрия, 25 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4 Элюирующий буфер: 20 мM фосфат натрия, 500 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4 Скорость: HisTrap FF 1 мл: 1 мл/мин; HisTrap FF 5 мл: 5 мл/мин; HisPrep FF 16/10: 5 мл/мин HisTrap FF 1 мл mAU Рис. 2B: SDS-PAGE 4 000 3 500 Линия 1: LMW Mr 3 000 97 000 Линия 2: исходный материал, E. coli экстракт 66 000 Линия 3: Собранный элюат, HisTrap FF 1 мл 45 000 Линия 4: Собранный элюат, HisTrap FF 5 мл 30 000 Линия 5: Собранный элюат, HisPrep FF 16/10 (20 мл) 2 500 выход ≈80 % 2 000 6.2 мг 1 500 1 000 500 20 100 0 14 400 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 40.0 ml 1 2 3 4 5 HisTrap FF 5 мл mAU Выводы 4 000 • Масштабирование с HisTrap FF 1 мл через HisTrap FF 5 мл к HisPrep FF 16/10 (20 мл) проводится легко и эффективно 3 500 выход >80 % 3 000 33 мг 2 500 • Увеличение размеров колонки при использовании идентичной линейной скорости потока дает прекрасно согласующиеся результаты • Анализ собранных фракций с помощью SDSPAGE показал почти идентичные результаты с точки зрения чистоты и выхода 2 000 1 500 1 000 500 0 0.0 50 100 150 ml HisPrep FF 16/10, 20 ml • Стабильно высокие выход и чистота белка могут быть получены при различных масштабах очистки, используя одинаковые линейные скорости потоков. mAU 4 000 О сорбенте Ni Sepharose 6 Fast Flow 3 500 выход >90 % 3 000 Ni Sepharose 6 FF позволяет легко масштабировать процесс очистки белка и использовать большие скорости потоков. • Скрининг экспрессии в многолуночных планшетах 149 мг 2 500 2 000 • Выпускается как в профессионально упакованных удобных в работе колонках HisTrap FF и HisPrep 16/10 FF , так и в виде неупакованного сорбента 1 500 1 000 500 0 0 100 200 300 400 500 600 700 ml • Позволяет работать как в ручном режиме, например, при давлении столба жидкости, так и при больших скоростях потока в хроматографических системах 5 Для высокоэффективной очистки белков и получения узких пиков на хроматографических системах Сорбенты, упакованные колонки, наборы Количество № по каталогу Ni Sepharose High Performance 25 мл 17-5268-01 Ni Sepharose High Performance 100 мл 17-5268-02 HisTrap HP 5 × 1 мл 17-5247-01 HisTrap HP 100 × 1 мл* 17-5247-05 HisTrap HP 1 × 5 мл 17-5248-01 HisTrap HP 5 × 5 мл 17-5248-02 HisTrap HP 100 × 5 мл* 17-5248-05 HisTrap HP kit 1 17-5249-01 Ni Sepharose 6 Fast Flow Для больших потоков, масштабирования и ручной очистки Сорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу Ni Sepharose 6 Fast Flow 25 мл 17-5318-01 Ni Sepharose 6 Fast Flow 100 мл 17-5318-02 Ni Sepharose 6 Fast Flow 500 мл 17-5318-03 HisTrap FF 5 × 1 мл 17-5319-01 HisTrap FF 100 × 1 мл* 17-5319-02 HisTrap FF 100 × 5 мл* 17-5255-02 HisPrep FF 16/10 1 × 20 мл 17-5256-01 HisTrap FF Гель-фильтрационные колонки для получения высокой чистоты белка Упакованные колонки Количество № по каталогу Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01 Superdex 75 10/300 GL 1 17-5174-01 Superdex Peptide 10/300 GL 1 17-5176-01 HiLoad™ 16/60 Superdex 200 pg 1 17-1069-01 HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 1 17-1068-01 HiLoad 16/60 Superdex 30 pg 1 17-1139-01 Системы ÄKTAFPLC™ ÄKTApurifier™ Литература Постер Code no. Улучшенная очистка белка, меченного гистидином, на новом сорбенте IMAС 11-0008-47 Информационный бюллетень Code no. Ni Sepharose 6 Fast Flow 11-0008-86 Ni Sepharose High Performance 18-1174-40 Руководство по выбору продукции Code no. Колонки HiTrap™ 18-1129-81 * специальные упаковки по заказу клиента 6 HisPrep FF 16/10 Очистка GST-меченных белков О GST-меченных белках Глутатион S-трансфераза (GST) – универсальное средство для экспрессии, очистки и детекции меченных белков. GST-меченные белки очищаются аффинной хроматографией с использованием иммобилизованного глутатиона, например, Glutathione Sepharose High Performance и Glutathione Sepharose 4 Fast Flow. Задачи очистки Высокая чистота белка необходима для большинства применений. Для достижения высокой чистоты нужна высокая специфичность между лигандом и меткой. Целевой белок связывается со специфичным аффинным сорбентом, примеси вымываются из колонки, после чего целевой белок элюируют. При работе с GST-меченными белками подбирают мягкие условия элюирования для сохранения активности белка. Решения Наша стратегия очистки GST-меченных белков базируется на применении Glutathione Sepharose. Glutathione Sepharose HP предназначена для высокоэффективной и качественной очистки GST-мечнных белков. Glutathione Sepharose FF применяется для масштабирования процесса. Они дают: • Высокий выход и чистоту продукта при использовании одностадийного протокола очистки • Простоту в очистке GST-меченных белков и других глутатион-S-трансфераза- или глутатион-зависимых белков • Элюирование в мягких неденатурирующих условиях с использованием восстановленного глутатиона для сохранения антигенности и функции белка. • Удаление метки с помощью PreScission™ протеазы и очистка при 4°С для повышения стабильности. • GST-метка может увеличивать выход экспрессии и растворимость Вашего белка, как указано в некоторых научных публикациях. 7 Одностадийная очистка и расщепление на колонке GST-меченого белка Рис. 3A: Очистка SH2 домена с одновременным удалением GST-метки Образец: 100 мл осветленного E. coli экстракта, экспрессирующего SH2-домен, меченный GST (Mr 37 000) Колонка: GSTrap™ 5 мл Связывающий буфер: 20 мM фосфата, 150 mM NaCl, pH 7.3 Элюирующий буфер: 50 мM Tris-HCl, 10 мM восстановленный глутатион, pH 8.0 Расщепление протеазой: 20 U/мл тромбинпротеазы в течение 14 час., 20°С Скорость: 10 мл/мин (загрузка образца и отмывка) и 2.5 мл/мин (элюция) Система: ÄKTAexplorer 10 Ввод образца Отмывка A 280 A 280 4 0.4 3 14 часов 2 Начало инкубирования с протеазой Элюирование связывающим буфером 0.3 0.2 1 Элюирование элюирующим буфером Отмывка 0.1 0 GST-метка Чистый целевой белок 0 0 50 100 150 Объем (мл) Рис. 3B: SDS-PAGE Линия 1: LMW Линия 2: Исходный материал, экстрактE. coli Mr 0 30 000 20 100 14 400 Intensity 2 3 4 5 6 7 8 120 Объем (мл) 80 Линия 5: SH2-домен без GST-метки, элюированный связывающим буфером, начало пика Линия 6: как линия 5, средняя часть пика 70 Линия 8: отщепленная элюирующим буфером GST-метка Целевой белок с одинарным зарядом 90 Линия 4: Последняя фракция отмывки Линия 7: как линия 5, последняя часть пика 1 100 Рис. 3C: MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ SH2 домена без GST-метки Линия 3: проходящий буфер 94 000 67 000 43 000 20 60 Целевой белок с двойным зарядом 50 40 30 20 10 Выводы Одностадийная очистка домена SH2 на колонке GSTrap FF 5 мл Расщепление на колонке до элюции 0 Получается высокочистый белок, как показано анализом SDS-PAGE и MALDI-ToF Полное удаление метки Высокие скорости потока (10 мл/мин) позволяют проводить очистку в 4 раза быстрее О Glutathione Sepharose 4 Fast Flow и GSTrap FF 8 Сорбент Glutathione Sepharose 4 FF обладает прекрасными характеристиками по потоку и идеален для масштабирования Колонки GSTrap 1 мл и 5 мл columns дают возможность проводить простую одностадийную очистку GST-меченных белков, других глутатион-S-трансфераза- и глутатион-зависимых белков Мягкие условия элюции сохраняют антигенность и функциональность Могут использоваться со шприцем, насосом или системой 6 000 8 000 10 000 12 000 14 000 16 000 mass (m/ Масштабирование очистки GST-меченого белка Рис. 4A: GSTrap FF 1 мл A280 mAU Элюирующий буфер %B 100 14 мг GST-Purα 1 500 80 Отмывка 60 1 000 Рис. 4A: GSTrap FF 1 мл Образец: 5 мл экстракта E. coli, экспрессирующего GST-Purα Колонка: GSTrap FF 1 мл Связывающий буфер: PBS, pH 7.4 Элюирующий буфер: 50 мM Трис-HCl, pH 8.0 10 мM восстановленный глутатион Скорость: загрузка: 0.5 мл/мин; отмывка и элюирование: 1 мл/мин Система: ÄKTAprime™ 40 Рис. 4B: GSTrap FF 5 мл 500 20 0 0 0.0 10.0 20.0 30.0 ml Рис. 4B: GSTrap FF 5 ml A280 mAU Элюирующий буфер %B 100 73 мг GST-Purα 1 500 80 Отмывка 60 1 000 40 Образец: 25 мл экстракта E. coli, экспрессирующего GST-Purα Колонка: GSTrap FF 5 мл Связывающий буфер: PBS, pH 7.4 Элюирующий буфер: 50 мM Трис-HCl, pH 8.0 10 мM восстановленный глутатион Скорость: загрузка: 2.5 мл/мин; отмывка и элюирование: 5 мл/мин Система: ÄKTAprime Рис. 4C: GSTPrep FF 16/10 Образец: 100 мл экстракта E. coli, экспрессирующего GST-Purα Колонка: GSTPrep™ FF 16/10 Связывающий буфер: PBS, pH 7.4 Элюирующий буфер: 50 мM Трис-HCl, pH 8.0 10 мM восстановленный глутатион Скорость: загрузка: 5 мл/мин; отмывка и элюирование: 10 мл/мин Система: ÄKTAprime 500 20 0 0 0.0 50.0 100.0 150.0 ml Рис. 4C: GSTPrep FF 16/10 A280 mAU Элюирующий буфер 346 мг GST-Pur %B 100 2 000 80 Отмывка 1 500 60 1 000 40 500 20 Выводы • Стабильно высокая чистота белка при различных масштабах очистки • Чистота~95 % достигается за одну стадию очистки. Масштабирование от GSTrap FF 1 мл через GSTrap FF 5 мл к GSTPrep FF 16/10 дает воспроизводимые результаты • Две или более упакованные колонки GSTrap FF 1 мл или 5 мл легко могут быть соединены последовательно для увеличения связывающей способности • Примечание: важно проводить загрузку образца на колонку при малых скоростях потока из-за низкой скорости связывания GST-метки и лиганда (глутатиона) 0 0 0 100 200 300 400 500 600 ml Рис. 4D: SDS-PAGE Mr 45 000 Линия 1: LMW Линия 2: экстракт E. coli, экспрессирующего GST-Pur, 1 г клеточной пасты/ 5 мл 30 000 Линия 3: проходящий буфер из GSTrap FF 1 мл 20 100 Линия 4: GST-pur элюированный изGSTrap FF 1 ml 14 400 Линия 5: как линия 2 97 000 66 000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Линия 6: проходящимй буфер из GSTrap FF 5 мл Линия 7: GST-pur элюированный из GSTrap FF 5 ml Линия 8: как линия 2 О GSTPrep FF 16/10 • Упакованные 20 мл HiPrep™ колонки с Glutathione Sepharose 4 FF для масштабирования очистки рекомбинантных GST-меченных белков, других глутатион-S-трансфераза и глутатион-зависимых белков • Матрица сорбента Sepharose 4 FF в упакованной колонке HiPrep дает высокую воспроизводимость результатов • Мягкие условия элюции сохраняют антигенность и функции белка Линия 9: проходящий буфер из GSTPrep FF 16/10 Линия 10: GST-pur элюированный из GSTPrep FF 16/10 9 Для высокоэффективной очистки GST-меченых белков Сорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу Glutathione Sepharose High Performance 25 мл 17-5279-01 Glutathione Sepharose High Performance 100 мл 17-5279-02 GSTrap HP 5 × 1мл 17-5281-01 GSTrap HP 100 × 1 мл* 17-5281-05 GSTrap HP 1 × 5 мл 17-5282-01 GSTrap HP 5 × 5 мл 17-5282-02 GSTrap HP 100 × 5 мл* 17-5282-05 GSTrap HP Для масштабирования и быстрой очистки GST-меченых белков Сорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-5132-01 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 100 мл 17-5132-02 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 500 мл* 17-5132-03 GSTrap FF 2 × 1 мл 17-5130-02 GSTrap FF 5 × 1 мл 17-5130-01 GSTrap FF 1 × 5 мл 17-5131-01 GSTrap FF 5 × 5 мл 17-5131-02 GSTPrep FF 16/10 1 × 20 мл 17-5234-01 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow и GSTrap FF Автоматические хроматографические системы Система Количество № по каталогу ÄKTAprime 1 18-1139-47 ÄKTAexplorer 10 1 18-1300-00 Литература Постер Быстрая очистка GST-связанных белков из больших объемов образца 18-1139-51 Информационный бюллетень № по каталогу Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 18-1174-85 Glutathione Sepharose High Performance 18-1174-32 GST Gene Fusion System 18-1159-30 Руководство по выбору продукции № по каталогу Колонки HiTrap 18-1129-81 * специальные упаковки по заказу клиента 10 ÄKTAexplorer Высокопроизводительная очистка белков О высокопроизводительной очистке Решения За последние годы существенно расширилось использование рекомбинантных белков. Введение метки упрощает процесс очистки и может также увеличить выход целевого продукта благодаря возрастанию растворимости экспрессируемого белка. (Histidine)6 и GST, наиболее популярные метки для рекомбинантных белков, позволяют быстро очищать белки и автоматизировать протокол очистки. ÄKTAxpress™ является первой полностью интегрирован- Задачи очистки • Очищать одновременно до 48 образцов Для получения высокой чистоты белка протокол его очистки должен быть многостадийным. Однако, одновременная очистка нескольких образцов с использованием многостадийного протокола на обычной хроматографической системе является весьма утомительной и времяемкой. Кроме того, многие Downstream процессы требуют удаления метки, что дополнительно усложняет протокол. Полная автоматизация такого процесса позволяет высвободить много времени, которое можно посвятить решению более важных задач. ной автоматизированной системой для высокопроизводительной многостадийной очистки меченных белков. ÄKTAxpress – модульная система, сочетающая прибор, программное обеспечение UNICORN™ , колонки и сорбенты. В зависимости от конфигурации системы, ÄKTAxpress позволяет: • Получать до 50 мг белка с чистотой >95 % без ручных манипуляций • использовать шаблоны методов для создания и использования оптимизированных протоколов, включающих отщепление метки на колонке 11 Оптимизация протокола для автоматической многостадийной очистки гистидин- и GST-меченых белков Протоколы очистки ÄKTAxpress начинаются с аффинной хроматографии, далее следует комбинация из обессоливания ионного обмена и гель-фильтрации. См таблицу 1 с описанием доступных многоступенчатых протоколов ÄKTAxpress. На рис. 5А представлен пример автоматического трехстадийного протокола очистки. Рис. 5A: Автоматическая многостадийная очистка меченной гистидином киназы Образец: Колонки Меченная гистидином киназа (Mr 42 200, pI 5.75) экспрессированная в E. coli Аффинная (АС): HisTrap HP, 1мл Обессоливание (DS): HiPrep 26/10 Desalting Ионообменная (IEX): Буферы Mono Q 5/50 GL, 1 мл AC связывающий: 50 мM Трис-HCl, 500 мM NaCl, 5 мM имидазол 1 mM DTT, 10 % глицерин, pH 8 AC элюирующий: 50 мM Трис-HCl, 500 мM NaCl, 500 мM имидазол, 1 мM DTT, 10 % глицерин , pH 8 DS и IEX связывающий: IEX элюирующий: 50 мM Tris-HCl, 25 мM NaCl, 1 мM DTT, 10 % глицерин, pH 7.5 50 мM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 мM DTT, 10 % глицерин, pH 7.5 Проходящая фракция от загрузки образца и невыбранные пики собраны в отдельных сосудах (не показано). Промежуточные пики хранятся во внутренних капиллярных петлях и автоматически вводятся в следующую колонку. Подготовка и отмывка колонок производится во время каждой очистки как часть протокола. Рис. 5B: последняя стадия очистки на Mono Q A280 IEX 4 A2 5 A3 A4 160.0 Mr 6 A5 A6 A7 A8 7 A9 165.0 1 2 3 4 DS IEX AC: Аффинная хроматография, DS: обессоливание, IEX: Ионообменная хроматография * Загрузка образца и отмывка не показаны Выводы • Автоматическая многостадийная очистка меченной гистидином протеинкиназы • Финишная очистка на Mono Q™ показывает наличие разных фосфоформ очищенной киназы и ее очень высокую чистоту (Рис. 5B) • Шаблон методов позволяет легко создавать протоколы очистки • Эффективное автоматическое детектирование и сбор пиков на промежуточных стадиях 12 A1 1 8 A1 2 9 B1 2 B1 1 170.0 5 6 7 97 000 66 000 45 000 30 000 20 100 14 400 AC A1 0 8 B1 0 B9 B8 175.0 9 10 ml Рис. 5C: SDS-PAGE Линия 1: LMW Линия 2: Исходный образец Линия 3: Проходящий буфер Линия 4–9: См. фракции на хроматограмме Линия 10: LMW Таблица 1: Доступные в ÄKTAxpress многостадийные протоколы очистки Протоколы Эффект от дополнительных хроматографических шагов AC–DS Замена буфера AC–GF Отделение нежелательных агрегатов и примесей AC–DS–IEX Отделение от других изоформ (например, гетерогенно фософрилированных или гликозилированных белков) AC–DS–IEX–DS Отделение от других изоформ на IEX и замена буфера на DS AC-DS-IEX-GF Отделение от других изоформ на IEX и Отделение нежелательных агрегатов и примесей на GF AC: Аффинная хроматография DS: Обессоливание GF: Гель-фильтрация IEX: Ионообменная хроматография Автоматическое удаление метки на системе ÄKTAxpress Колонки: Рис. 6A: Автоматическое расщеплени и очистка с использованием AcTEV протеазы AC: HisTrap HP 5 мл [для (histidine)6-меченных белков] AC: GSTrap HP 5 мл [для GST-меченных белков] Четырехстадийный протокол: AC–DS–IEX–GF DS: HiPrep 26/10 Desalting, 53 мл Sample: 0. 5 mg, M 38 900 (cleaved product M 36 400) APC1040; (histidine) -tagged r IEX: RESOURCE™ Q, 6 мл r 6 A 280 mAU GF: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade, 120 мл Расщепленный белок Буферы: AC (histidine) связывающий: 50 мM Трис-HCl, 500 мM NaCl, 20 мM имидазол, pH 7.5 AC (histidine) расщепляющий: 50 мM Трис -HCl, 500 мM NaCl, 50 мM имидазол, pH 7.5 AC (histidine) элюирующий: 50 мM Трис -HCl, 500 мM NaCl, 500 мM имидазол, pH 7.5 AC (GST) связывающий и расщепляющий: 1 000 50 мM Трис s-HCl, 150 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5 AC (GST) элюирующий: 50 мM Трис -HCl, 10 мM восстановленный глутатион, pH 8.0 DS и IEX связывающий: 50 мM Трис -HCl, pH 8.0 IEX элюирующий: 50 мM Трис -HCl, 1 M NaCl, pH 8.0 GF: 50 мM Трис -HCl, 150 мM NaCl, pH 7.5 1 500 Регенерация 0 Рис. 6B: Автоматическое расщепление и очистка с использованием PreScission протеазы Образец: GST-pur Двухстадийный протокол: AC–GF 11 мг 500 B10 1 100 AC 1 200 1 300 DS 1 400 1 500 IEX мл GF AC: Аффинная хроматография, DS: Обессоливание, IEX: Ионообменная хроматография; GF: Гель-фильтрация A 280 mAU 2 000 Расщепленный белок Регенерация 1 500 Рис. 6C: SDS-PAGE Mr 97 000 Линия 1: LMW 66 000 Линия 2: исходный образей 45 000 1 000 Линия 3: Проходящий буфер 46 мг Линия 4: Очищенный расщепленный APC1040 30 000 (Mr 36.4 x 10 ) после AC–DS–IEX–GF 500 Линия 5: Сравнение: нерасщепленный APC1040 (M 38.9 x 103) 20 100 14 400 0 A2 A4 A6 A8 200 AC 250 300 мл 1 2 3 4 5 GF AC: Аффинная хроматография, GF: Гель-фильтрация Выводы Mr 97 000 Рис. 6D: SDS-PAGE 66 000 Линия 1: LMW Линия 2: Исходный образец 45 000 Линия 3: Проходящий буфер Линия 4: Очищенный расщепленный 30 000 GST-pur (Mr 35.2 x 10 ) после AC–GF 20 100 Линия 5: Сравнение: нерасщеплен- 14 400 ный GST-pur (M 61.6 x 103) 1 2 3 4 5 • Полностью автоматическоеудаление метки с помощью PreScission и AcTEV протеазы • Выход белков с удаленной меткой составляет десятки мг • Все обработанные белки получены высокоочищенными О системе ÄKTAxpress • Двух-четырехстадийный протокол очистки позволяет получать высоко чистый белок (>95 %) • Возможность автоматического удаления метки во всех протоколах • Высокая производительность: 16 образцов за ночь (двухстадийный протокол), 8 образцов в день (4хстадийный протокол)на четырехмодульной системе • Автоматизация позволяет избежать ручных операций • В модуле можно очищать до 4 образцов одновременно • Один компьютер может контролировать до 12 модулей 13 Высокопроизводительные системы для автоматической многостадийной очистки Система ÄKTAxpress, 4х-модульная система с компьютером ÄKTAxpress TWIN, 2х-модульная система с компьютером Количество № по каталогу 1 18-6645-05 1 11-0012-85 Продукция для аффинной хроматографии в высокопроизводительной очистке белков Упакованные колонки Количество № по каталогу HisTrap HP 5 × 1 мл 17-5247-01 HisTrap HP 100 × 1 мл* 17-5247-05 HisTrap HP 5 × 5 мл 17-5248-02 HisTrap HP 100 × 5 мл* 17-5248-05 GSTrap HP 5 × 1 ml 17-5281-01 GSTrap HP 100 × 1 мл* 17-5281-05 GSTrap HP 5 × 5 мл 17-5282-02 GSTrap HP 100 × 5 мл* 17-5282-05 Продукция для обессоливания в высокопроизводительной очистке белков Упакованные колонки Количество № по каталогу HiPrep 26/10 Desalting 1 × 53 мл 17-5087-01 HiPrep 26/10 Desalting 4 × 53 мл 17-5087-02 HiTrap Desalting 5 × 5 мл 17-1408-01 HiTrap Desalting 100 × 5 мл* 11-0003-29 Ионообменная продукция в высокопроизводительной очистке белков Упакованные колонки Количество № по каталогу Mono Q 5/50 GL 1 × 1 мл 17-5166-01 Mono S™ 5/50 GL 1 × 1 мл 17-5168-01 RESOURCE Q 1 × 1 мл 17-1177-01 RESOURCE S 1 × 1 мл 17-1178-01 RESOURCE Q 1 × 6 мл 17-1179-01 RESOURCE S 1 × 6 мл 17-1180-01 Гель-фильтрационная продукция в высокопроизводительной очистке белков Упакованные колонки Количество № по каталогу HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 1 × 120 мл 17-1068-01 HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 1 × 120 мл 17-1069-01 Литература Информационный бюллетень № по каталогу ÄKTAxpress 18-1177-69 AB Информация по применению № по каталогу Automated on-column tag cleavage and multi-step purification of histidine-and GST-tagged proteins 11-0011-26 Optimizing protocols for automated multi-step purification of histidine and GST-tagged proteins using ÄKTAxpress 11-0011-25 * специальные упаковки по заказу клиента 14 Колонки HisTrap и Mono Q в системе ÄKTAxpress Четырехмодульная система ÄKTAxpress Программа UNICORN Очистка антител Об очистке антител Решения Применение моноклональных антител (MAbs) и их фрагментов в научных исследованиях, терапии и диагностике постоянно растет. Высокая специфичность MAbs является их существенным преимуществом, особенно в терапии и иммуноблотинге. Поликлональные антитела обычно используются в качестве реагентов в иммунохимических приложениях, используя сырую сыворотку из различных источников. Сорбенты Protein G и Protein A Sepharose созданы для очистки моноклональных и поликлональных IgG из асцитной жидкости, сыворотки и супенатанта культур клеток. Они дают: • Получать высоко чистый продукт (>95 %) в одну стадию Задачи очистки • Удобные в работе уже упакованные колонки и собственно сорбенты для упаковки колонок MAbs можно получать как in vivo так и in vitro. Получение in vivo включает их очистку из асцитной жидкости, содержащей много других белков, включая хост-белки, липиды и остатки клеток. Отделение хост-белков обычно сложная задача. Из-за наличия большого количества альбумина хост-белки имеют сходство с иммуноглобулином как по заряду, так и по свойствам. Липиды в асцитной жидкости могут также забивать колонку, если они предварительно не удалены. Mabs, получаемые в культурах клеток, существенно разбавлены, так что очистка белка также должна сопровождаться концентрированием образца. • Благодаря большой емкости получать высокие выходы • Высокая селективность исключает связывание большинства других белков Несмотря на высокую чистоту продукта, получаемого после аффинной хроматографии, для его окончательной очистки от агрегатов и/или димеров обычно применяют гель-фильтрацию. Наш сорбент Superdex идеально подходит для этих целей. 15 Очистка мышиных IgG1 MAb из культур клеток с помощью Сефарозы Protein G Выводы Рис. 7A: Стадия извлечения мышиных IgG1 Образец: Супернатант культуры клеток мышиных IgG1 Колонка: HiTrap Protein G HP 1 мл Связывающий буфер: 20 mM фосфат натрия, pH 7.0 • Автоматическая двухстадийная очистка с использованием аффинной хроматографии и гель-фильтрации применима для широкого спектра задач по очистке белков. • Сорбенты Protein G и Protein A Sepharose HP созданы для очистки моноклональных и поликлональных IgG из асцитной жидкости, сыворотки и супернатанта культуры клеток • Сорбенты Protein G и protein A имеют различную специфичность связывания IgG в зависимости от природы последнего (см. таблицу на стр. 17) Элюирующий буфер (B): 0.1 M глицин-HCl, pH 2.7 Система: ÄKTAprime AU 280 nm pH UV 280 nm pH 1. 0 7 О сорбенте Protein G Sepharose HP 6 0. 8 Для удобной и быстрой рутинной очистки моноклональных IgG антител: • Связывание до 25 мг человеческого IgG/мл сорбента • Высокая емкость и быстрая кинетика связывания • Устойчив при pH 3–9 (в работе) и рН2–9 (при отмывке) • Простота операций с помощью шприца, насоса или высокопроизводительной хроматографической системы семейства ÄKTAdesign™ 5 Mышиный 4 IgG1 0. 4 ввод образца 3 2 0 7. 5 15. 0 мин Разделение мономер/димер MAb Выводы Рис. 7B: Финишная очистка гель-фильтрацией IgG1,предварительно очищенного на Protein G Колонка: Superdex 200 10/300 GL В большинстве случаев при очистке антител в образце Буфер: PBS, pH 7.2 могут присутствовать димеры и агрегаты IgG. В связи с Скорость: 0.7 ml/min Система: ÄKTAFPLC этим в цикл очистки необходимо включать финишную стадию гель-фильтрации для получения чистых гомогенных MAbs. Сорбент Superdex 200 идеально подходит для mAU A280 этих целей, как показано на фиг. 7B. 25.0 О сорбенте Superdex 200 mAU A280 Димер/ агрегаты 1.2 20.0 15.0 Сорбент Superdex 200 идеально подходит для финишной очистки и удаления агрегатов и димеров из МAb: Mономеры 1.0 0.8 10.0 0.6 0.4 5.0 0.44 0.48 0.52 0.56 cv 0.0 0.0 16 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 объемы колонки (CV) • Разделяет белки в диапазоне Mr от10 000 до 600 000 (глобулярные белки) • Легкое и предсказуемое масштабирование • Прекрасная воспроизводимость и срок службы • Поставляется в виде качественно упакованных колонок и расфасованным в емкости Очистка гуманизованных IgG4 из культуры клеток с помощью Protein A Выводы Рис. 8A: очистка с использованием HiTrap rProtein A FF 1 мл Образец: 30 мл содержащего 12 мг IgG4 Колонка: HiTrap rProtein A FF, 1 мл Связывающий буфер: 200 мM фосфат натрия, pH 7.0 Элюирующий буфер: 100 мM цитрат натрия, pH 3.0 Скорость: 1 мл/мин (156 см/час) Элюировано IgG4: 11.2 мг Выход: 93 % Чистота: >95 % в соответствии с SDS-PAGE • Высокочистые гуманизованные IgG4 получены непосредственно из культур клеток миеломы с выходом 93 % • За одну стадию достигается чистота > 95 % О сорбенте HiTrap rProtein A FF A 280 mm • Колонки, упакованные сорбентом rProtein A Sepharose 4 FF для производительной и селективной очистки и фракционирования субклассов IgG Элюирующий буфер 1.5 • Очищается около 50 мг человеческих поликлональных IgG за 1 цикл • Стабилен при pH 3–9 в работе, при рН 2–10 для отмывки • Простота операций при использовании шприца, насоса или высокоэффективной хроматографической системы, например, ÄKTAdesign 1.0 0.5 Сравнительная связывающая способность: protein A и protein G Элюированный lgG4 Проходящий буфер 0.0 0 10 20 30 40 Mr 97 000 66 000 Рис. 8B: SDS-PAGE 43 000 Линия 1: LMW маркеры 30 000 Линия 2: Исходный материал 20 100 14 400 Линия 3: Проходящий буфер 1 2 3 4 Линия 4: Элюированный IgG4 Объем (мл) Время (мин) Ниже приводятся данные по сравнительной связывающей способности поликлональных иммуноглобулинов из различных источников к protein A и protein G (по результатам измерений конкурентных ELISA тестов. Вид Субкласс Protein A Protein G Человеческий IgA IgD IgE IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM* переменная – – – ++++ ++++ – ++++ переменная ++++ ++++ ++++ ++++ – Желток птичьего яйца IgY† – – Корова – ++ ++++ Собака – ++ + Коза – – ++ Морская свинка IgG1 IgG2 ++++ ++++ ++ ++ Хомяк – + ++ Лошадь – ++ ++++ Коала – – + Лама – – + Обезьяна (резус) – ++++ ++++ Мышь IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM* + ++++ +++ ++ переменная ++++ ++++ +++ +++ – Свинья IgM* +++ +++ Кролик нет различий ++++ +++ Крыса IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 – – – + + ++++ ++ ++ Овца IgG3 +/– ++ Очищено на колонках HiTrap IgM HP † Очищено на колонках HiTrap IgY HP – слабое или отсутствие связывания * ++ среднее связывание ++++ сильное связывание 17 Для получения узких пиков и высокой концентрации продукта Упакованные колонки Количество № по каталогу HiTrap Protein A HP 5 × 1 мл 17-0402-01 HiTrap Protein A HP 2 × 1 мл 17-0402-03 HiTrap Protein A HP 1 × 5 мл 17-0403-01 HiTrap Protein A HP 5 × 5 мл 17-0403-03 HiTrap Protein G HP 5 × 1 мл 17-0404-01 HiTrap Protein G HP 2 × 1 мл 17-0404-03 HiTrap Protein G HP 1 × 5 мл 17-0405-01 HiTrap Protein G HP 5 × 5 мл 17-0405-03 MAbTrap™ Kit 1 17-1128-01 HiTrap Protein A HP Для получения высоких выходов и масштабирования Сорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу rProtein A Sepharose 4 Fast Flow 5 мл 17-1279-01 rProtein A Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-1279-02 rmp Protein A Sepharose Fast Flow 5 мл 17-5138-01 rmp Protein A Sepharose Fast Flow 25 мл 17-5138-02 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 5 мл 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-0618-02 HiTrap rProtein A FF 5 × 1 мл 17-5079-01 HiTrap rProtein A FF 2 × 1 мл 17-5079-02 HiTrap rProtein A FF 1 × 5 мл 17-5080-01 HiTrap rProtein A FF 5 × 5 мл 17-5080-02 HiLoad Superdex Для удаления агрегатов и финишной очистки Продукция Количество № по каталогу HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade 1 17-1069-01 HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade 1 17-1071-01 Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01 Superdex 200 prep grade 25 мл 17-1043-10 Superdex 200 prep grade 150 мл 17-1043-01 Автоматические хроматографические системы Система Количество № по каталогу ÄKTAFPLC 1 18-1118-67 ÄKTAprime 1 18-1139-47 Литература Информационный бюллетень № по каталогу HiTrap rProtein A FF & HiTrap Protein A HP & HiTrap Protein G HP 11-0035-58 rProtein A Sepharose FF 18-1113-94 Protein G Sepharose FF 18-1012-91 Руководство по выбору продукции № по каталогу HiTrap Columns 18-1129-81 18 HiTrap Protein G HP Аналитические разделения Об аналитических разделениях После того, как белок очищен, принципиально необходимо найти точные методы для идентификации и характеризации примесей и целевого продука. Стандартная аналитическая задача включает: • определение мономер/димер • энзиматическая активность • определение чистоты и выхода • характеризация пептидных карт после триптозного расщепления для идентификации посттрансляционных модификаций Решения • Хроматография высокого разрешения дает высокую селективность, скорость, простоту и надежность результатов • При необходимости анализировать много образцов может быть создать автоматический процесс, включающий ввод образца и анализ полученных результатов • Колонки SOURCE™ RPC идеально подходят для работы в широком диапазоне рН 19 Обращеннофазовая хроматография для пептидного картирования при высоком значении pH Рис. 9A: Пептидное картирование при pH 9.5 на колонке SOURCE 5RPC ST 4.6/150 Выводы Образец: (RVP-BSA-mT), ~750 pmol • Колонки SOURCE 5RPC ST 4.6/150 очень удобны для очистки Колонка SOURCE 5RPC ST 4.6/150 Элюэнт A: 10 mM NH4OH/HCOOH, pH 9.5 Элюэнт B: 60 % ацетонитрил в элюэнте A Градиент: 0–67 % B over 115 ml i.e. 46 column volume Cкорость: 0.5 мл/мин. Система: ÄKTApurifier 10 A (mAU) 150 пептидов в щелочной среде, в особенности, плохо растворимых в кислых растворах • Полимерная матрица сорбента SOURCE дает возможность проводить обращеннофазовую хроматографию при высоких значе%B 100 — 215 nm — 254 nm — 280 nm a) SOURCE 5RPC ST 4.6/150 pH 9.5 ниях рН, позволяя получать высокое разрешение и исключительную чувствительность в масс-спектрометрическом анализе О колонке SOURCE 5RPC ST 4.6/150 100 50 50 Колонки SOURCE 5RPC ST 4.6/150 из нержавеющей стали предназначены для аналитической обращеннофазовой хроматографии пептидов, фрагментов белков и олигонуклеотидов. Они дают: • Исключительное разрешение в широком диапазоне рН (1–12) 0 –30 0 50 100 ml 0 • Отличное функционирование при высоком рН • Длительный срок службы благодаря высокой химической и физической стабильности • Высокую воспроизводимость от колонки к колонке Анализ чистоты синтетических олигонуклеотидов Рис. 9B: Проверка чистоты синтетического олигонуклеотида Выводы Образец: 5’-биотинилированный синтетический 20-мер Колонка: Mini Q™ 4.6/50 PE Стартовый буфер: 10 mM NaOH мощным инструментом для контроля чистоты синтети- Элюирующий буфер: 10 mM NaOH, 2 M NaCl ческих олигонуклеотидов Скорость: 1.0 мл/мин. Система: ÄKTApurifier 10 • Анионообменная колонка Tricorn Mini Q™ является О колонках Tricorn MiniBeads Биотинилированный 20-мер mAU mS/cm ванные ионообменным сорбентом MiniBeads™: 40.0 50.0 • Исключительно гомогенные 3 μm непористые частицы, дающие прекрасное разрешение, скорость, воспроизво- Исходная реакционная смесь 20.0 • Высокоэффективные колонки Tricorn™, качественно упако- димость результатов и долговечность • Применяют для разделения белков, пептидов, олигонукле- 0.0 отидов, углеводов и других биомолекул в соответствии с 0 20.0 30.0 40.0 0 ml mS/cm 40.0 50.0 После очистки 0.0 0 20 • Используют как для аналитических, так и для микропрепаративных целей mAU 20.0 их зарядом (Mini Q и Mini S™) 20.0 30.0 40.0 0 ml Анализ гликированного и негликированного гемоглобина A1c Рис. 10A: Анализ гемоглобина A1c Рис 10B: Сравнение HbA1c, измереного в соответствии с национальными методами калибровки и в соответствии с методом IFCC (4). Образец: 10 мл гемолизованной ЭДТА крови Колонка: Mono S 5/50 GL Буфер A: 20 мM малонат натрия, 0.2 г/л азид натрия, pH 5.7 Буфер B: Буфер A + 0.3 M LiCl 12 Градиент: 20–50 % B за 3 мин; 50–75 % B за 1.1 мин, 75–100 % B за 0.3 мин, 100 % B в течение 2.6 мин, 20 % B за 1 мин 10 14 Скорость: 2 мл/мин 8 %B HbA0 100 HbA1c 0.04 HbA1C (%) mAU 0.05 75 6 4 2 2 0.03 3 4 5 6 7 8 HbA1C (%), IFCC-NRL 9 10 11 12 50 0.02 25 0.01 HbA3 HbF 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 Время (минуты) Выводы • Гемоглобин-A1c (HbA1c) измеряли для оценки долгосрочного контроля больных диабетом • Колонка Tricorn Mono S полностью разделяет все формы гликозилированного и негликозилированного гемоглобина (Рис. 10A) • Метод анализа на Mono S использовался в Швеции в течение двух десятилетий для калибровки приборов, измеряющих HbA1c (1, 2). Рис. 10B показывает, что метод калибровки, принятый в Швеции, имеет самое высокое разрешение для HbA1c и, таким образом, находится максимально близко к стандарту, установленному IFCC (3), по сравнению с двумя другими национальными методами калибровки. • Методика с использованием Mono S – надежный и хорошо проверенный метод измерения и калибровки приборов для HbA1c . О колонках Tricorn MonoBeads Монодисперсные пористые частицы, профессионально упакованные в высокоэффективные колонки Tricorn для микропрепаративных (от пг до мкг) и аналитических разделений пептидов, фрагментов белков и олигонуклеотидов. Они дают: • Высокое разрешение, воспроизводимость и долговечность • Высокую чистоту для анализа и финишной очистки • Быстрые и простые операции с использованием высокоэффективных хроматографических систем, таких как ÄKTAdesign 21 Для обращеннофазовой хроматографии в широком диапазоне рН Упакованные колонки Количество № по каталогу SOURCE 5RPC ST 4.6/150 1 17-5116-01 SOURCE 15RPC ST 4.6/100 1 17-5068-01 Для аналитических задач, требующих высокого разрешения и связывания Упакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу Mono Q 5/50 GL 1 17-5166-01 Mono Q 10/100 GL 1 17-5167-01 Mono Q 4.6/100 PE 1 17-5179-01 Mono S 5/50 GL 1 17-5168-01 Mono S 10/100 GL 1 17-5169-01 Mono S 4.6/100 PE 1 17-5180-01 SOURCE 5RPC Для получения очень высокого разрешения в аналитических разделениях Упакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу Mini Q 4.6/50 PE 1 17-5177-01 Mini S 4.6/50 PE 1 17-5178-01 Mini Q PC 3.2/3 1 17-0686-01 Mini S PC 3.2/3 1 17-0687-01 Tricorn MiniBeads Для аналитических задач, требующих высокого разрешения и выхода Упакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу Superdex Peptide 10/300 GL 1 17-5176-01 Superdex 75 10/300 GL 1 17-5174-01 Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01 Для аналитических задач, требующихширокого диапазона разделений Упакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу Superose™ 6 10/300 GL 1 17-5172-01 Superose 12 10/300 GL 1 17-5173-01 Автоматические хроматографические системы Система Количество № по каталогу. ÄKTApurifier 10 1 18-1400-00 Литература Информационный бюллетень № по каталогу SOURCE 5RPC ST 4.6/150 and ST 2.1/150 18-1132-36 Tricorn MonoBeads™ 18-1165-92 Tricorn MiniBeads 18-1165-93 Tricorn Superdex 18-1163-79 Tricorn Superose 18-1163-80 Информация по применению № по каталогу Hemoglobin A1c measurement with Mono S method 18-1167-92 22 ÄKTApurifier Очистка немеченых белков Очистка немеченых белков Решения Очистка немеченых белков может варьироваться от про- GE Healthcare предлагает широкую номенклатуру лабора- стых одностадийных осаждений до крупномасштабных торных сорбентов и упакованных колонок для очистки валидированных процессов для биофармацевтического немеченых белков. Она покрывает все хроматографиче- производства. Очищать белок до нужной чистоты и полу- ские методы и стадии. чать его в достаточном количестве простым, надежным, Это позволяет: быстрым и дешевым способом является основной задачей • Выбрать логичную комбинацию методов очистки, осно- любой очистки. Для разработки стратегии очистки можно ванную на основных преимуществах метода и состояния использовать систематический подход. образца в начале и в конце каждой стадии Задачи очистки Для успешной очистки белка необходимо следовать многостадийному подходу для проведения извлечения, про- • Минимизировать обработку образца между стадиями очистки, комбинируя наилучшие методы • Увеличить выход, экономя время и деньги путем использования наименьшего количества стаадий очистки межуточной и финишной очистки (CiPP). Каждая из этих стадий решает свои задачи: • Извлечение: отделяет, концентрирует и стабилизирует целевой белок • Первичная очистка: удаляет основные примеси, такие как другие белки и нуклеиновые кислоты, эндотоксины и вирусы • Финишная очистка: достигается высокая чистота продукта путем удаления оставшихся примесей или близких по строению веществ 23 Быстрая 3х-стадийная очистка лабильного фермента Рис. 11A: Извлечение: ионообменная хроматография Рис. 11B: Первичная очистка: гидрофобная хроматография Образец: 40 мл осветленного E. coli экстракта DAOCS, на льду Колонка: 50 мM Tris-HCl, 1 мM EDTA, 2 мM DTT, 0.2 M бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5; Элюирующий буфер (B): A + 1.0 M NaCl Градиент: 0 % B в 5 CV, 30 % B в 5 CV, 100 % B в 5 CV (ступенчатый градиент) Скорость: 10 мл/мин (300 см/час) Система: ÄKTAFPLC Образец 3 мл DAOCS фракции после SOURCE 15ISO, на льду Образец: 40 мл DAOCS фракции после HiPrep 16/10 Q XL, на льду Колонка: SOURCE 15ISO в колонке HR 16/10 Буфер: 1.6 M (NH4)2SO4, 10 % глицерин, 50 мM Tris-HCl, 1 мM EDTA, 2 мM DTT, 0.2 мM бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5 Скорость: 1 мл/мин (30 см/час) HiPrep 16/10 Q XL Стартовый буфер (A): Рис. 11C: Финишная очистка: гель-фильтрация Стартовый буфер (A): Колонка: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade 100 мM Tris-HCl, 1 мM EDTA, 2 мM DTT, 0.2 мM бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5 Система: ÄKTAFPLC Элюирующий буфер (B): 50 мM Tris-HCl, 10 % глицерин, 1 мM EDTA, 2 мM DTT, 0.2 мM бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5 Градиент: 0–16 % B в 4 CV, 16–24 % B в 8 CV, 24–35 % B в 4 CV, 100 % B в 4 CV Скорость: 5 мл/мин (150 см/час) Система: mAU mS/cm ÄKTAFPLC mAU mAU 3 000 2 000 1 000 0 0 100 200 Mr ml 80 400 60 300 40 200 20 100 0 0 1 000 800 600 400 200 0 0 100 200 Рис. 11D: SDS-PAGE, окрашен серебром 97 000 66 000 45 000 Линия 1: LMW Линия 2: Исходный экстракт E. coli Линия 3: DAOCS фракция после Q Sepharose XL Линия 4: DAOCS фракция после SOURCE 15ISO 20 100 Линия 5: DAOCS фракция после Superdex 75 pg 14 400 Линия 6: LMW 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 6 Выводы О колонке HiPrep 16/10 Q XL • Быстрый метод очистки с использованием современного • Упакована сорбентом Sepharose Q XL или SP XL препаративного сорбента • Выделение 10 мг активного высоко лабильного фермента с чистотой, достаточной для кристаллизации • Экономия времени: с трех дней до 6 часов • Удобная оптимизация условий разделения с использованием запрограммированных шаблонов и функций поиска О колонке RESOURCE 15ISO • Одна из серии колонок, упакованных сорбентом SOURCE для быстрого и высокоэффективного разделения • Колонки RESOURCE имеют простой эфирный (SOURCE 15ETH), изопропильный (SOURCE 15ISO) и фенильный (SOURCE 15PHE) гидрофобные лиганды на сорбенте • Высокая эффективность при низком противодавлении, даже при больших загрузках до 25 мг белка 24 ml Рис. 11E: Карта плотности высокого разрешения очищенного DAOCS 30 000 1 ml • 20 мл препаративные катионо- и анионообменные колонки позволяют загружать большое количество образца и проводить быструю элюцию • Оптимизирована для надежных, воспроизводимых разделений О колонке HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade • Колонка HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade - упакованная ХK колонка для препаративной гель-фильтрации • Крутые кривые селективности дают отличное разрешение для пептидов и белков в диапазоне Mr 3 000–70 000 • Высокая механическая прочность и гидрофильность сорбента позволяют работать при высоких скоростях потока и при минимальных неспецифических взаимодействиях Двухстадийная очистка нативного белка при оптимизированном pH† Рис. 12A: Извлечение и первичная очистка: колонка HiTrap Q для анионообменной хроматографии Рис. 12B: Профили элюции оптимизированной по рН анионообменной хоматографии Рис. 12C: Финишная очистка на Superdex 200 Образец: 10 мл осветленной E2-обработанной плазмы рыб Образец: Фракции Vtg после анионообменной хроматографии на колонке RESOURCE Q из трех E2- обработанных рыб Колонка: Superdex 200 10/300 GL Буфер: 0.05 M карбонат–бикарбонат, pH 9.6 Скорость: 0.2 мл/мин Система: ÄKTApurifier 10 Образец: 250 мкл осветленного обработанного эстрадиолом (E2) вителлогенина (Vtg), образец из плазмы рыб Колонка: RESOURCE Q, 1 мл Колонка: HiTrap Q, 1 мл Связывающий буфер: 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 Связывающий 0.1 M Tris–HCl, 1 мM PMSF, pH 7.0–8.5 Элюирующий буфер: 0.1 M Tris–HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.5 0.1 M Tris-HCl, 1 мM PMSF, 0.5 M NACl, pH 7.0–8.5 Скорость: 4 мл /мин Система ÄKTApurifier 10 буфер: Элюирующий буфер: Скорость: Система: 5 мл /мин ÄKTApurifier 10 mAU (280nm) mAU (280nm) 800 mS/cm 90 3 500 700 80 3 000 600 RT-Vtg 2 500 500 70 60 pH 7.0 2 000 50 300 pH 7.5 1 500 40 200 pH 8.0 400 100 0 0 2 4 6 8μg 8 10 12 SDS-PAGE 4μg 2μg 14 16 Время 18 (мин) 0 G-VTG 1 000 0 Time (min) 0 1 2 3 4 5 Теоретический градиентt Измеренный градиент RT-Vtg: Вителлогенин радужной форели 200 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Volume (ml) RT-Vtg: Вителлогенин радужной форели CH-Vtg: Вителлогенин голавля G-Vtg: Вителлогенин пескаря Выводы • Вителлогенин (Vtg) был очищен из трех обработанных Stacking gel Vtg 1 500 10 Western blotting 8μg 4μg 2μg RT-VTG 2 000 20 500 CH-VTG 2 500 30 1 000 pH 8.5 mAU (280nm) 3 000 эстрадиолом рыб: радужной форели, пескаря и голавля (5) ➞ • Анионообменная хроматография на колонке HiTrap Q использована при оптимизации рН для извлечения и первичной очистки; наилучшее разрешение получено при pH 8.5 • После оптимизации pH колонка RESOURCE Q использоваРис. 12D: Нативный PAGE очищенного вителлогенина радужной форели и соответствующий Вестерн блот после гель-фильтрации Электрофорез проводился в 4%-ном концентрирующем и 7.5 % разделяющем ПААГ и окрашивался серебром. Иммуноблотинг проводили с использованием BN-5 анти-лососевых Vtg антител; иммунодетектирование проводилось по усовершенствованному хемилюминесцентному методу после переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану. лась для извлечения и первичной очистки во время рутинной процедуры очистки • Сорбент Superdex 200 использовался на стадии финишной очистки для дальнейшего отделения продуктов распада от нативного Vtg и хранения продукта в требуемом буфере. • Сочетание колонок RESOURCE Q и Superdex улучшило воспроизводимость и сократило время проведения процесса. О колонках RESOURCE Q и S Колонки RESOURCE Q и S заполнены сорбентом SOURCE 15 Q или 15 S для быстрого и простого разделения методом ионного обмена. Они дают: • Высокоэффективные разделения в широком диапазоне рабочих давлений • Монодисперсные 15 мкм частицы сорбента обладают прекрасными гидродинамическими характеристиками • Минимальное неспецифическое связывание и высокий выход очищенного продукта • Сравнительно низкое противодавление на высоких скоростях потока, позволяя проводить эффективное разделение даже при использовании насосов низкого давления † Перепечатано с любезного разрешения Elsevier 25 Продукция для очистки немеченых белков Если ничего не известно о целевом белке, то наиболее GE Healthcare производит широчайшую номенклатуру эффективный подход к очистке следующий: ионный обмен лабораторных упакованных колонок и сорбентов для (извлечение), гидрофобная хроматография (первичная очистки немеченых белков. Это покрывает все основные очистка) и гель-фильтрация (финишная очистка). Для полу- хроматографические методы и стадии. Логические ком- чения общей информации см. «Protein Purification Hand- бинации хроматографических стадий показаны на рис. book» или обратитесь к представителю GE Healthcare. Что- 13A. Руководство по применимости каждого метода для бы подобрать продукцию, наиболее подходящую для Ва- стадий извлечения, первичной и финишной очистки при- ших задач, смотрите наши руководства на сайте: ведены в таблице 13B. www.chromatography.amershambiosciences.com Рис. 13A: руководство по комбинированию стадий Исходный образец или образец с высоким содержанием солей Осветление образца* GF GF обессоливание обессоливание Извлечение AC IEX Первичная очистка Финишная очистка GF GF Таблица 13B: применимость методов для стадий очистки Метод IEX HIC GF GF Извлечение IEX высокое разрешение высокая емкость высокая скорость HIC хорошее разрешение хорошая емкость высокая скорость AC высокое разрешение высокая емкость высокая скорость GF высокое разрешение при использовании Superdex RPC высокое разрешение GF обессоливание HIC IEX Может требоваться разбавление Основные черты Первичная очистка Финишная очистка Стартовые условия Финишные условия ★★★ ★★★ низкая ионная сила объем образца не ограничен высокая ионная сила или сильное изменение pH, концентрированный ★★ ★★★ ★ высокая ионная сила объем образца не ограничен низкая ионная сила концентрированный ★★★ ★★★ ★★ особые условия связывания объем образца не ограничен особые условия элюции, концентрированный ★ ★★★ объем образца ограничен (<5% CVl скорость потока ограничена буфер заменен (если требуется), разбавленный ★ ★★★ требуется органический растворитель риск потери биологической активности в органическом растворителе, концентрированный ★★★ * Альтернативно, образцы могут быть отфильтрованы методом тангенциальной фильтрации, см. раздел ”Пробоподготовка” и, если необходимо, ионную силу можно уменьшить разведением AC: аффинная хроматография; DS: обессоливание; IEX: ионообменная хроматография; GF: гель-фильтрация; HIC: гидрофобная хроматография; RPC: обращеннофазовая хроматография Автоматические хроматографические системы Система Количество № по каталогу ÄKTApurifier 10 1 18-1400-00 ÄKTAFPLC 1 18-1900-26 Литература Руководство по выбору продукции № по каталогу Ion exchange columns and media 18-1127-31 Gel filtration columns and media 18-1124-19 Affinity Chromatography columns and media 18-1121-86 Fast desalting and buffer exchange of proteins and peptides 18-1128-62 HiTrap column guide 18-1129-81 Prepacked chromatography columns with ÄKTAdesign systems 18-1173-49 26 Рефолдинг белков из телец включения О рефолдинге рекомбинантных белков Решения Для экспрессии рекомбинантных белков E. coli является Хроматографический колоночный рефолдинг позволяет: наиболее часто используемым объектом. Белки экспрес- • Автоматизировать процесс сируются в цитоплазму или секретируются. Суперэкспрес- • Надежно и просто масштабировать сия белков в некоторых случаях приводит к накоплению их • Проводить одновременно рефолдинг и очистку в нерастворимых полипептидных агрегатах, называемых • Высокую совместимость и химическую стабильность тельцами включения. к различным добавкам, восстанавливающим реаген- Задачи очистки • Удобную оптимизацию условий разделения с использо- там, денатурирующим агентам и детергентам Превратить нерастворимый белок в тельцах включения ванием запрограммированных шаблонов и функций по- в полезный растворимый биологически активный бе- иска. лок. 27 Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка меченого гистидином белка из телец включения E. coli Рис. 14A: Колоночный рефолдинг и очистка Образец Меченый гистидином солюбилизованный одноцепочечный Fv фрагмент антитела Fab 57P, 10 мл (конц. 0.67 мг/мл) из телец включения E. coli Колонка: HisTrap HP 1 мл Солюбилизирующий буфер: 20 мM Tris-HCl, 6 M Gua-HCl, 1 мM DTE, 1 мM Na2-EDTA, 0.1 мM Pefabloc™, pH 7.5 Денатурирующий связывающий буфер: 20 мM Tris-HCl, 5 мM имидазол, 0.5 M NaCl, 8 M мочевина, 1 мM DTE, 0.1 мM Pefabloc, pH 7.5 Буфер для рефолдинга: 20 мM Tris-HCl, 5 мM имидазол, 0.5 M NaCl, 0.5 M аргинин-HCl, 1 мM восстановленный глутатион (GSH), 1 мM окисленный глутатион (GSSG), pH 7.5 Рис. 14B: Сенсограмма взаимодействия между иммобилизованным пептидом и ренатурированным белком Система: Biacore™ system 2000 Серсорная поверхность: Иммобилизованный пептид C16V”37” (вирус табачной мозаики) со сродством к scFv57P Чистая поверхность: иммобилизованная с пептидом без сродства к scFv57P Выход: 14 % активного белка из собранной фракции RU 20000 Нативный связывающий 20 мM Tris-HCl, 10 мM имидазол, 0.5 M NaCl, pH 7.5 буфер: 15000 Нативный элюирующий 20 мM Tris-HCl, 500 мM имидазол, 0.5 M NaCl, pH 7.5 буфер: 10000 Система: ÄKTAexplorer 10 Скорость: 1 мл/мин mAU 5000 0 3 Элюирующий буфер % 100 5 500 80 400 300 60 1 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Sec Ячейка сравнения Ячейка образца Результат вычитания образец-сравнение Выводы • Выход в рефолдинге составил 14% от очищенного белка 40 200 4 • Параметры рефолдинга для белков, меченных гистидином, могут быть легко оптимизированы, и конечный ме- 2 100 20 тод автоматизирован как для рефолдинга, так и для очистки на колонках HisTrap HP 0 0 0 20 40 60 80 100 мл 1 Ввод пробы 2 Промывка системы сначала нативным элюирующим буфером, затем нативным связывающим буфером (клапан колонки находится в положении bypass). После этого начинается уравновешивание колонки нативным связывающим буфером. О колонках HisTrap HP Сорбент Ni Sepharose HP, упакованный в удобные колонки HisTrap для очистки меченых гистидином белков: 4 Старт рефолдинга буфером рефолдинга Переуравновешивание системы в исходное состоя ние • Высокая связывающая способность, не менее 40 мг/мл сорбента 5 Старт элюирования нативным элюирующим буфером • Совместимы с различными добавками, восстанавли- 3 Рис. 14C: Фракция после очистки фрагмерта антитела scFv 57P после рефолдинга Элюирующий буфер % 500 400 80 • Простота использования со шприцем, насосом или высо- 200 40 100 20 0 91.5 92 92.5 93 93.5 94 94.5 95 мл детергентами • Незначительная потеря Ni 60 0 вающими реагентами, денатурирующими агентами и 100 300 28 -5000 коэффективной хроматографической системой, например, ÄKTAdesign Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка в двойном градиенте Рис. 15: Использование двойного градиента при ионообменном рефолдинге. Выводы • Сочетание градиента уменьшения концентрации моче- Образец: 8 мг лизоцима, растворенного в денатурирующем буфере Колонка: HiTrap SP HP 5 мл вины и увеличения рН на колонке HiTrap SP HP дает Денатурирующий буфер: 50 мM Tris-HCl, 6 M мочевина, 3 мM GSH и 3 мM GSSG (редокс соотношение 1:1), pH 6.2 более высокие выходы лизоцима с большей биологи- Буфер для рефолдинга: 100 мM Tris-HCl, 1 M мочевина, 0.3 M NaCl, 3 мM GSH и 3 мM GSSG (редокс соотношение 1:1), pH 10.0 Двойной градиент: линейный от денатурирующих до условий рефолдинга в 15 мл объема градиента. Одновременно изменение pH от 6.2 до 10 в течение градиента рефолдинга Скорость: 0.4 мл/мин A280 (mAU) pH 700 Лизоцим после рефолдинга 6 ческой активностью (8) 9 500 0.2 200 100 ентом (данные не показаны) Колонки HiTrap, профессионально упакованные ионообменным сорбентом SP Sepharose High Performance, для 4 300 в процессах без градиента или только с одним гради- О колонках HiTrap SP HP 0.3 5 ность и количество белка после рефолдинга выше, чем NaCl (M) 0.4 10 600 • Для рефолдинга денатурированного лизоцима актив- 8 эффективной очистки белков: • Малые размеры частиц сорбента (34 мкм) позволяют 3 7 2 проводить быструю адсорбцию и десорбцию даже при 0.1 высоких загрузках образца и больших скоростях потока • Высокая емкость в широком диапазоне рН 6 1 0.0 • Удобная конфигурация для простых и быстрых разделений в одной колонке или нескольких, соединенных по- 0 10 0 20 30 Объем, мл A280 NaCl мочевина следовательно pH Репрезентативный процесс хроматографического рефолдинга† Не существует единого метода рефолдинга, который удовлетворял бы всем требованиям по рефолдингу различных белков. Химические условия также меняются в зависимости от белка. Нахождение оптимальных условий рефолдинга следует проводить экспериментально. Процессы хроматографического рефолдинга (см. таблицу внизу) показывают свое преимущество для различных белков, денатурированных нативных белков или полипептидов, экспрессированных в виде телец включения (8). Метод рефолдинга Хроматографический метод Метод элюции Белок Выход ( %) Ссылка Замена растворителя гель-фильтрацией нормальная GF Нормальная GF RETS-1 изоформа PDGF Градиентная GF Нет градиента Градиент мочевины Градиент мочевины и рН ScFv 75 75 14.5 17.3 25 [6] [7] [8] Замена растворителя во время обратимой адсорбции IEX Трехбуферная система Двойной градиент Некоторые тельца включения Лизоцим человека SOD IMAC HIC RPC Трехбуферная система Нормальная HIC Нормальная RPC Гистидин-TNF α-Интерферон человека Интерлейкин-2 человека ND 50 40 90 ND ND [9–11] [12] [13] [14] [15] [16] GroEL, GroES Смесь денатурированного белка и сорбента Нормальная хроматографическая элюция Нормальная хроматографическая элюция Лизоцим 85 [17, 18] Лизоцим Лизоцим 90 90 [19, 20] [21] Использование иммобилизованного катализатора фолдинга Липосомы PEG ND: не определено; IEX: ионообменная хроматография; GF: гель-фильтрация; IMAC: иммобилизованная металл-аффинная хроматография HIC: гидрофобная хроматография; RPC: обращеннофазовая хроматография; PEG: полиэтиленгликоль † Перепечатано с любезного разрешения Elsevier 29 Примеры продукции для колоночного рефолдинга Упакованные колонки Количество № по каталогу HisTrap HP 5 × 1 мл 17-5247-01 HisTrap HP 100 × 1 мл* 17-5247-05 HisTrap HP 1 × 5 мл 17-5248-01 HisTrap HP 5 × 5 мл 17-5248-02 HisTrap HP 100 × 5 мл* 17-5248-05 HiTrap SP HP 5 × 1 мл 17-1151-01 HiTrap SP HP 5 × 5 мл 17-1152-01 HiTrap Q HP 5 × 1 мл 17-1153-01 HiTrap Q HP 5 × 5 мл 17-1154-01 HiTrap Phenyl HP 5 × 1 мл 17-1351-01 HiTrap Phenyl HP 5 × 5 мл 17-5195-01 RESOURCE ETH 1 × 1 мл 17-1184-01 RESOURCE ISO 1 × 1 мл 17-1185-01 RESOURCE PHE 1 × 1 мл 17-1186-01 RESOURCE RPC 1 мл 17-1182-01 HisTrap HP kit 1 17-5249-01 HiTrap SP HP HisTrap HP kit Гель-фильтрационная продукция для колоночного рефолдинга Упакованные колонки Количество № по каталогу Superdex 75 10/300 GL 1 17-1047-01 Superdex 200 HR 10/300 GL 1 17-1088-01 HiLoad 16/60 Superdex 30 prep grade 1 17-1139-01 HiLoad 26/60 Superdex 30 prep grade 1 17-1140-01 HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade 1 17-1068-01 HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade 1 17-1170-01 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade 1 17-1069-01 HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade 1 17-1171-01 Автоматические хроматографические системы Система Количество № по каталогу ÄKTAexplorer 10 1 18-1300-00 * специальная упаковка по заказу 30 ÄKTAexplorer Пробоподготовка О пробоподготовке Пробоподготовка присутствует в огромном количестве приложений. Для протеомного анализа плазмы человека многие исследователи изучают минорные белки. Одной из их первоначальных задач является нахождение полезных биомаркеров для различных заболеваний и условий. Масс-спектрометрический анализ (MS) является очнь важным инструментом в анализе белков. Некоторые молекулы разрушают белки в супернатантах культур клеток, бактериальных лизатах или плазме. Задачи Мажорные белки, такие как альбумин и иммуноглобулины , создают сложности при детектировании минорных белков. Протеазы, находящиеся в плазме, могут разрушить образец, если их не удалить.. MS анализ нельзя проводить, если в растворе присутствуют некоторые буферные соли. Решения • Удаление мажорных белков можно проводить на колонках HiTrap Blue HP • Колонки HiTrap Benzamidine FF (high sub) можно применять для удаления трипсиноподобных сывороточных протеаз из плазмы человека • Обессоливание на сорбенте Sephadex™ очень полезно для удаления буферных солей перед очисткой и MS анализом • Очистка на мембране методом тангенциальной фильтрации является идеальным сособом замены буфера при работе с большими объемами растворов 31 Удаление мажорных белков из плазмы человека Рис. 16A: Обессоливание на колонке HiTrap Выводы Образец: 1 мл ISTH/SSC плазмы человека, Secondary Coagulation Standard (SCS) Колонка: HiTrap Desalting 5 мл Буфер: 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, pH 7.4 фемтомолей/л и менее до миллимолярной, делая, таким об- Скорость: 5 мл/мин Система: ÄKTAFPLC разом, анализ минорных белков крайне сложной задачей mAU 3000 mS/cm 14.0 2500 12.0 Замена буфера 2000 10.0 8.0 1500 6.0 1000 4.0 500 0 2.0 0.0 2.0 4.0 6.0 0.0 мл 8.0 • Концентрация белков в плазме варьируется от нескольких • Предварительная хроматографическая очистка плазмы улучшает детектирование и идентификацию минорных белков в 2-D электрофорезе и/или жидкостной хроматографии с последующим MS анализом • Быстрый, простой и полуавтоматический хроматографический метод для фракционирования белков плазмы • Показана идентификация ряда белков, демонстрирующая простоту и надежность метода О колонках HiTrap Blue HP • Колонки HiTrap Blue HP упакованы сорбентом Blue Рис. 16B: HiTrap Blue HP (2 колонки по 5 мл последовательно) Образец 3 мл ISTH/SSC плазмы человека, SCS, обессоленный Колонка: HiTrap Blue HP (2 x 5 mмл последовательно) Связывающий буфер: 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, pH 7.4 Элюирующий буфер: 20 мM Tris-HCl, 1.0 M NaCl, pH 7.4 Скорость: Система: 3 мл/мин ÄKTAFPLC mAU 300 Sepharose HP, имеющим лиганд Cibacron™ Blue F3G-A • Этот лиганд ковалентно связан с высоко сшитой агарозной матрицей и стабилен в широком диапазоне рН • Для очистки альбумина, ферментов, факторов свертываемости крови, интерферонов и аналогичных белков mS/cm 160 250 140 Удаление альбумина 200 120 complement component 1 inhibitor 100 150 80 60 100 40 50 transferrin gelsolin (2 spots) profilaggrin 20 0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 мл 0 kininogen (4 spots) hemopexin (8 spots) antithrombin III (4 spots) IgG HiTrap Protein G HP Удаление иммуноглобулина Данные не показаны fibrinogen beta (3 spots) fibrinogen beta (5 spots) Рис. 16C: RESOURCE Q Образец: 3 мл ISTH/SSC плазмы человека, SCS, альбумин и иммуноглобулин удалены (рис. 13A и 13B) Колонка: RESOURCE Q 5 мл Стартовый буфер: 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, pH 7.4 Элюирующий буфер: 20 мM Tris-HCl, 1.0 M NaCl, pH 7.4 Скорость: 3 мл/мин Градиент: ступенчатый Система: ÄKTAFPLC macroglobulin alpha-2 (5 spots) mAU 160 mS/cm Anion 140 exchange fractionation 120 serum albumin (8 spots) macroglobulin alpha-2 (3 spots) angiotensinogen (7 spots) alpha 1 antitrypsin (5 spots) 80 no id (3 spots) 100 60 IgA (3 spots) haptoglobin (3 spots) apolipo protein A-IV apolipo protein A-I (4 spots) 80 40 60 40 20 20 0 0 32 helicase -like protein NHL isoform b alpha-1B glycoprotein (4 spots) 20 40 60 80 0 100 мл haptoglobin (4 spots) Ig kappa (3 spots) Удаление трипсиноподобных сывороточных протеаз из плазмы человека Активность 10-3 IU/мг A280 A405 1.00 3.0 A280 2.5 0.80 Рис. 17: Удаление трипсиноподобных сывороточных протеаз 2.0 Образец: 1 мл плазмы человека, отфильтрованной через 0.45 мкм фильтр Колонка: HiTrap бензамидин FF (high sub), 1 мл Связывающий буфер: 20 мM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 7.4 Элюирующий буфер: 50 мM глицин, pH 3.0 Градиент: 0–100 % элюирующий буфер в один шаг Скорость: Система: 1.0 мл/мин ÄKTAexplorer 10 0.60 1.5 0.40 1.0 0.20 0 0.5 0.0 5.0 10.0 мл 15.0 Выводы О колонках HiTrap бензамидин FF (high sub) • Протеазы, находящиеся в плазме человека, могут разру- • Для удаления и/или очистки сывороточных протеаз в одну стадию шать образец, если их не удалить • Высокая связывающая способность • Почти все трипсиноподобные сывороточные протеазы были удалены из плазмы человека и связаны на колонке • Эффективное удаление тромбина и фактора Xa после удаления метки из рекомбинантных белков Малое масштабирование при замене буфера, до 60 мл образца Рис. 18: Пять обессоливающих колонок HiTrap Desalting, соединенных последовательно Образец: 2 мг/мл BSA в 50 мM фосфате натрия, 0.5 M NaCl, pH 7.0 Колонка: HiTrap обессоливающая, 1 × 5 мл, 3 × 5 мл, 5 × 5 мл Объем образца: 28 % объема колонки (1.4, 4.3 и 7.1 мл соответственно) Буфер: Скорость: Система: ÄKTAFPLC 5 мл/мин Рис. 18A: Одна колонка HiTrap Desalting 5 мл AU 280nm A 0.40 Рис. 18B: Две колонки HiTrap Desalting по 5 мл AU Электропроводность, mS/см BSA 280nm BSA B NaCl 50 0.30 50 мM фосфат натрия, 0.15 M NaCl, pH 7.0 Рис. 18C: Три колонки HiTrap Desalting по 5 мл Электропроводность, mS/см AU 280nm NaCl 0.40 50 40 0.20 30 20 0.00 0 2.0 4.0 6.0 ml 50 0.30 40 40 0.10 NaCl C 0.40 0.30 0.20 Электропроводность, mS/см BSA 0.20 30 30 0.10 0.10 20 0.00 0 5.0 10.0 15.0 20.0 20 0.00 ml 0 10.0 20.0 30.0 ml Выводы О колонках HiTrap Desalting и HiPrep Desalting Рис. 18А–С показывает результаты использования колонок Колонки HiTrap Desalting и HiPrep Desalting упакованы сор- HiTrap Desalting для обессоливания образцов объемом 1.4, бентом Sephadex G-25 для быстрого простого обессолива- 4.3 и 7.1 мл. Последовательное соединение колонок HiTrap ния и замены буфера. Использование четырех последова- Desalting позволяет быстро и просто масштабировать про- тельно соединенных колонок HiPrep 26/10 Desalting позво- цесс без увеличения противодавления. ляет обессолить 60 мл образца за короткое время. Обессоливание 100-300 мл образца методом тангенциальной фильтрации Рис. 19: Обессоливание 100 мл методом тангенциальной фильтрации Образец: 100 мл раствора белка (1 мг/мл) в 2 M NaCl Буфер для диафильтрации: вода Модуль фильтрации: MidGee™ UFP-3-C-MM06A (площадь фильтрации 26 cм2) Скорость: 30 мл/мин Система: mAU 800 600 • Обессоливание 100 мл раствора белка методом тангенциальной фильтрации уменьшило концентрацию солей с 125 mS/cм до 2 mS/cм, концентрация белка увеличена в 10 раз • Тангенциальная фильтрация – простая технология очистки для замены буфера и обессоливания Start Diafiltration UV Conductivity Pressure 8.0 400 4.0 200 2.0 mS/cm 800 600 600 6.0 Concentration Diafiltration 400 400 ÄKTAprime Выводы bar 0 0.0 0 20 200 40 60 80 0 100 120 140 min Обессоливание на ультрафильтрационных картриджах Тангенциальную фильтрацию проводили на картриджах MidGee UFP-3-C-MM06A, подключенных к системе ÄKTAprime. • Идеально для обработки 100–300 мл образца • Многократно используемые фильтры дают во спроизводимые результаты 33 Удаление мажорных белков Упакованные колонки Количество № по каталогу HiTrap Blue HP 1 × 5 мл 17-0413-01 HiTrap Blue HP 5 × 1 мл 17-0412-01 RESOURCE Q 1 × 6 мл 17-1179-01 RESOURCE Q 1 × 1 мл 17-1177-01 HiTrap Protein G HP 2 × 1 мл 17-0404-03 HiTrap Protein G HP 5 × 1мл 17-0404-01 HiTrap Protein G HP 1 × 5 мл 17-0405-01 HiTrap Protein G HP 5 × 5 мл 17-0405-03 Колонки HiTrap Blue HP Удаление трипсиноподобных протеаз Упакованные колонки и сорбенты Количество № по каталогу HiTrap Benzamidine FF (high sub) 2 × 1 мл 17-5143-02 HiTrap Benzamidine FF (high sub) 5 × 1 мл 17-5143-01 HiTrap Benzamidine FF (high sub) 1 × 5 мл 17-5144-01 Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-5123-10 Колонки HiTrap Benzamidine FF (high sub) Обессоливание и масштабирование замены буфера Упакованные колонки Количество № по каталогу HiTrap Desalting 5 × 5 мл 17-1408-01 HiPrep 26/10 Desalting 1 (53 мл) 17-5087-01 HiPrep 26/10 Desalting 4 (53 мл) 17-5087-02 Обессоливание с помощью тангенциальной фильтрации Половолоконные фильтры Предел отсечения № по каталогу MidGee UFP-3-C-MM06A 3 kD 56-4100-05 MidGee UFP-10-C-MM06A 10 kD 56-4100-13 MidGee UFP-30-C-MM06A 30 kD 56-4100-21 MidGee UFP-50-C-MM06A 50 kD 56-4100-29 MidGee UFP-100-C-MM06A 100 kD 56-4100-37 Автоматические хроматографические системы Системы Количество № по каталогу ÄKTAFPLC 1 18-1118-67 ÄKTAprime 1 18-1139-47 Литература Руководство по выбору продукции Affinity chromatography columns and media 18-1121-86 Gel filtration column and media 18-1124-19 HiTrap columns 18-1129-81 Hollow fiber cartridges and systems 18-1165-29 34 Картридж MidGee Хроматографические системы ÄKTAprime plus: простая хроматографическая очистка ÄKTAexplorer: для быстрой разработки метода и масштабирования ÄKTApurifier: высокоэффективная очистка и характеризация ÄKTAFPLC: высокоэффективная очистка белков и других биомолекул ÄKTApilot: быстрая разработка процесса и пилотное производство Задачи ÄKTAprime plus ÄKTAxpress: для высокопроизводительной очистки меченых белков и антител ÄKTAFPLC ÄKTApurifier ÄKTAexplorer ÄKTApilot Простая одностадийная очистка • • • • • Воспроизводимые результаты для рутинной очистки • • • • • Оптимизация одностадийной очистки для повыщения чистоты • • • • • • • • • Автоматическая разработка и оптимизация метода • • • Автоматическое приготовление буферов • • Автоматический выбор рН • • Контроль системы и обработка данных в соответствии с требованиями GLP Автоматический подбор сорбентов или колонок • • Автоматическая многостадийная очистка • • Разработка метода и масштабирование • • Санитарный дизайн по cGMP • Масштабирование, разработка процесса и переход в производство • Полностью автоматизированные, высокопроизводительные, unattended operations ÄKTAxpress • • • Система контроля UNICORN: одна программа обеспечивает контроль в реальном времени за всеми нашими хроматографическими системами. Она дает простые в использовании редактируемые шаблоны методов для всех основных применений и технологий. UNICORN enables direct method transfer while providing powerful data reporting and evaluation. 35 Очистка быстрее, проще и надежнее. За более, чем 50 лет. Подразделение по выделению белков фирмы GE Healthcare насчитывает более 230 разработчиков, значительную часть которых составляют химики, биохимики и инженеры. Совместно со специалистами по продаже продукции они тесно сотрудничают с нашими пользователями и другими ключевыми специалистами в области естественных наук, биотехнологии и биофармацевтической промышленности. За 50 лет признанного лидерства в разработке и совершенствовании технологий очистки белков нашей задачей остается делать Ваши операции быстрее, проще, надежнее и производительнее. Вот два последних примера: • Система ÄKTAxpress, котрая автоматизирует многостадийную очистку до 48 образцов и позволяет получать за ночь до 50 мг меченого белка с чистотой более 95%. • Сорбенты Ni Sepharose High Performance и Fast Flow, доступные как в виде собственно сорбентов, так и упакованные в колонки HisTrap и HisPrep. Последняя комбинация позволяет проводить простую одностадийную очистку меченых гистидином белков при увеличении связывающей емкости сорбента до 4 раз. Высокая воспроизводимость и контроль качества Мы имеем самую большую в мире производственную базу для изготовления хроматографических сорбентов с годовой мощностью 450 000 литров и/или килограммов. Наши сорбенты и колонки производятся в соответствии с валидированными методами и их качество строго контролируется. Это гарантирует воспроизводимость характеристик наших сорбентов и колонок от партии к партии, что помогает достигать воспроизводимых результатов в очистке. Обеспечение качества Вся наша продукция производится и поставляется в соответствии с требованиями ISO 9001 и сопровождается технической документацией. Критичные материалы, применяемые при создании оборудования (например, колонн, систем и т.д.) проверяются на биологическую безопасность в соответствии с действующими стандартами. Мы обеспечиваем полное отслеживание всех источников используемых материалов. Кроме того, мы инвестируем средства в технологии контроля характеристик сорбентов, которые доказывают, что наши сорбенты соответствуют заявленным спецификациям и, таким обзаром, гарантируют пользователю полную уверенность в качестве продукции. 36 37 Готовы помочь в Ваших исследованиях your research Наши специалисты по очистке белков готовы предоставить Вам в помощь мощные ресурсы. Фактически, каждую минуту каждого рабочего дня они помогают пользователям нашей продукции в решении задач по очистке. Наши профессиональные специалисты по продажам также всегда готовы Вам помочь. Вы можете обратиться к специалистам технической поддержки в режиме онлайн, или по телефону. Наши профессионалы по логистике, а также системы складского менеджмента и процедуры гарантируют своевременные поставки. Наша профессиональная сервисная служба предложит стандартный или персональный договор на обслуживание оборудования и процесса. Научные форумы Мы создаем профессионалам условия для обмена опытом и знаниями. В режиме он-лайн мы предлагаем образовательные центры и клубы пользователей. Мы проводим или же активно участвуем в тысячах живых форумов каждый год. Курсы и тренинги Повышение уровня знаний и эффективности работы Ваших сотрудников предоставляет Вам длительное конкурентное преимущество. Мы предлагаем как общие, так и специализированные тренинги для удовлетворения Ваших конкретных нужд. В среднем более 450 инженеров и ученых ежегодно обучаются на наших курсах Fast Trak™. Tехническая литература Многие университеты во всем мире используют наши методические руководства в качестве учебных материалов. Мы предоставляем Вам техническую литературу, включая каталоги продукции, научные постеры, информацию по применению и другое. Эта информация регулярно обновляется в соответствии с новейшими данными и доступна по адресу в Интернете: www.chromatography.amershambiosciences.com 38 Литература 1. Jeppsson, J-O. et al. Measurement of hemoglobin A1c by a new liquid chromatographic assay: methodology, clinical utility and relation to glucose tolerance evaluated. Clin. Chem.; 32, 1867–72 (1986) 2. Eckerbom, S.et al. Improved method for analysis of glycated hemoglobin by ion exchange chromatography. Ann. Clin. Biochem. 31, 355–360 (1994). 13. Li, M. and Su, Z. Refolding of superoxide dismutase by ionexchange chromatography, Biotechnol. Lett. 24 919–923 (2002) 14. Xu, J., Zhou, Q., Ma, Z., Yu, J., Hua, M. and Ding, R. Study on construction of His6-human TNFb fusion expression plasmid and single-step purification of its product, Pharm. Biotechnol. 7, 1–5, (2000) 3. Jeppsson, J-O. et al. Approved IFCC Reference Method for Measurement of HbA1c in Human Blood. Clin. Chem. Lab. Med. 40, 78–89 (2002) 15. Guo, L. Simultaneous purification and renaturation of recombinant human interferon alpha expressed by E. coli by highperformance hydrophobic interaction chromatography, Chin. J. Chromatogr. 19, 301–303 (2001) 4. Hoelzel, W. et al. IFCC Reference system for Measurement of Hemoglobin A1c in Human Blood and the National Standardization Schemes in the United States, Japan and Sweden: A Method- Comparison Study. Clin.Chem. 50, 166–174 (2004) 16. Ling, M., Xu, X., Shi, F., Zhu, Y., and Long, N. Refolding of recombinant human interleukin-2 by reverse phase high performance liquid chromatography, Chin. J. Biotechnol. 13, 180–183 (1997) 5. Brion, Francois. et al. Two-step purification method of vitellogenin from three teleost fish species: rainbow trout, gudgeon and chub. Jour. Chrom. B Biomed. Sc.i appl., 737 (1–2), 3–12 (2000) 17. Dong, X.-Y., Yang, H., Gan, Y.-R., Bai, S. and Sun, Y. Reactivation of denatured lysozyme with immobilized molecular chaperones GroE, Chin. J. Biotechnol. 16, 169–173 (2000) 6. Amons, R. and Schrier, P.I. Removal of sodium dodecyl sulfate from proteins and peptides by gel filtration, Anal. Biochem. 116, 439–443 (1981) 18. Altamirano, M.M., Garcia, C. Possani, L.D., and Fersht, A. Oxidative refolding chromatography: folding of the scorpion toxin Cn5, Nature Biotechnol. 17,187–191 (1999) 7. Hamaker, K.H., Liu, J., Seely, R.J., Ladisch, C.M., and Ladisch, M.R. Chromatography for rapid buffer exchange and refolding of secretory leukocyte protease inhibitor, Biotechnol. Prog. 12, 184–189, (1996) 19. Yoshimoto, M. and Kuboi, R. Oxidative refolding of denatured/ reduced lysozyme utilizing the chaperone-like function of liposomes and immobilized liposome chromatography, Biotechnol. Progr. 15, 480–487, (1999) 8. Gu, Z., Weidenhaupt, M., Ivanova, N., Pavlov, M., Xu, B., Su, Z., Janson, J.-C. Chromatographic methods for the isolation and refolding of proteins from E. coli inclusion bodies, Protein Expr. Purif. 25, 174–179, (2002) 9. Mozhaev, V.V., Martinek, K., Berezin, I.V. Effect of immobilization on protein (trypsin) folding, Mol. Biol. (Moscow) 13, 73–80 (1979) 10. Creighton, T.E., Folding of proteins adsorbed reversibly to ion exchange resins, D.L. Oxender (Ed.), UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, 39, 249–257 (1986) 11. T.E. Creighton, A process for production of a protein, 1986, World Patent, WO 86/05809. 12. M. Li, Z. Su, Refolding human lysozyme produced as an inclusion body by urea concentration and pH gradient ion exchange chromatography, Chromatographia, 56 33–38, (2002) 20. Yoshimoto, M., Shimanouchi, T., Umakoshi, H., and Kuboi, R. Immobilized liposome chromatography for refolding and purification of protein, J. Chromatogr. B 743, 93–99 (2000) 21. Geng, X.D. and Chang, X.Q. High performance hydrophobic interaction chromatography as a tool for protein refolding, J. Chromatogr. A 599, 185–194, (1992) Благодарности Хотим выразить благодарность многим исследовательским институтам, лабораториям и профессорам, а также другим нашим партнерам, которые посвятили нам свое время, поделились знаниями и информацией, позволившими нам создать эту брошюру. Хотим также поблагодарить издательство Elsevier за любезное согласие на перепечатку статей, опубликованных в журналах Journal of Chromatography B и Protein Expression and Purification. Дополнительная литература Руководства Code No. Affinity chromatography 18-1022-29 Recombinant protein purification 18-1142-75 GST gene fusion system 18-1157-58 Antibody purification 18-1037-46 Affinity chromatography 18-1022-29 Ion exchange chromatography and chromatofocusing 18-1114-21 Protein purification 18-1132-29 Hydrophobic interaction chromatography and reversed phase chromatography 11-0012-69 Gel filtration 18-1022-18 39 www.chromatography.amershambiosciences.com www.gehealthcare.com GE Healthcare Amersham Biosciences AB Björkgatan 30 SE-751 84 Uppsala Sweden ЗАО ДжиИ Хэлскеа 117198 Москва, Ленинский просп., 113/1 тел. (495) 956-51-77 факс (495) 956-51-76 E-mail: Lsrus@ge.com ÄKTAdesign, ÄKTAexplorer, ÄKTAFPLC, ÄKTAprime, ÄKTApurifier, ÄKTAxpress, Fast Trak, FPLC, GSTPrep, GSTrap, HiLoad, HiPrep, HisPrep, HiTrap, HisTrap, MAbTrap, MidGee, MiniBeads, Mini Q, Mini S, MonoBeads, Mono Q, Mono S, PreScission, RESOURCE, Sephadex, Sepharose, SOURCE, Superdex, Superose, Tricorn, and UNICORN are trademarks of GE Healthcare Limited, a General Electric company. Biacore is a registered trademark of Biacore AB. Cibacron is a registered trademark of Ciba Speciality Chemicals Corporation. Pefabloc is a registered trademark of Pentafam AG. All goods and services are sold subject to the terms and conditions of sale of the company within GE Healthcare that supplies them. General Electric Company reserves the right, subject to any regulatory and contractual approval, if required, to make changes in specifications and features shown herein, or discontinue the product described at any time without notice or obligation. Contact your local GE Healthcare representative for the most current information. Licensing information All materials for research use only. Not for diagnostic or therapeutic purposes. A license for commercial use of GST gene fusion vectors must be obtained from Chemicon International Incorporated, 28820 Single Oak Drive, Temecula, California 92590, USA. Purification and preparation of fusion proteins and affinity peptides comprising at least two adjacent histidine residues may require a license under US pat 5,284,933 and US pat 5,310,663, including corresponding foreign patents (assigne: Hoffman La Roche, Inc). © 2005 General Electric Company – All rights reserved. Amersham Biosciences AB, a General Electric company going to market as GE Healthcare. GE Healthcare Amersham Biosciences AB Björkgatan 30, 751 84 Uppsala, Sweden GE Healthcare Amersham Biosciences Europe GmbH Munzinger Strasse 9, D-79111 Freiburg, Germany GE Healthcare Amersham Biosciences UK Ltd Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, UK GE Healthcare Amersham Biosciences Corp 800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, USA GE Healthcare Amersham Biosciences KK Sanken Bldg. 3-25-1, Hyakunincho, Shinjuku-ku, Tokyo 169-0073, Japan Asia Pacific Tel: +852 2811 8693 Fax: +852 2811 5251 • Australasia Tel: + 61 2 9899 0999 Fax: +61 2 9899 7511 • Austria Tel: 01/57606-1619 Fax: 01/57606-1627 • Belgium Tel: 0800 73 888 Fax: 03 272 1637 • Canada Tel: 800 463 5800 Fax: 800 567 1008 • Central, East, & South East Europe Tel: +43 1 982 3826 Fax: +43 1 985 8327 • Denmark Tel: 45 16 2400 Fax: 45 16 2424 • Finland & Baltics Tel: +358-(0)9-512 39 40 Fax: +358 (0)9 512 39 439 • France Tel: 01 69 35 67 00 Fax: 01 69 41 96 77 • Germany Tel: 0761/4903-490 Fax: 0761/4903-405 • Italy Tel: 02 27322 1 Fax: 02 27302 212 • Japan Tel: +81 3 5331 9336 Fax: +81 3 5331 9370 • Latin America Tel: +55 11 3933 7300 Fax: +55 11 3933 7304 • Middle East & Africa Tel: +30 210 9600 687 Fax: +30 210 9600 693 • Netherlands Tel: 0165 580 410 Fax: 0165 580 401 • Norway Tel: 815 65 555 Fax: 815 65 666 • Portugal Tel: 21 417 7035 Fax: 21 417 3184 • Russia & other C.I.S. & N.I.S Tel: +7 (095) 232 0250, 956 1137 Fax: +7 (095) 230 6377 • South East Asia Tel: 60 3 8024 2080 Fax: 60 3 8024 2090 • Spain Tel: 93 594 49 50 Fax: 93 594 49 55 • Sweden Tel: 018 612 1900 Fax: 018 612 1910 • Switzerland Tel: 0848 8028 12 Fax: 0848 8028 13 • UK Tel: 0800 616928 Fax: 0800 616927 • USA Tel: 800 526 3593 Fax: 877 295 8102 GE imagination at work 11-0027-81 AB
