На правах рукописи ПРИМЕНЕНИЕ УГЛЕРОДНО-ПОЛИМЕРНЫХ ПОДЛОЖЕК В ИЗУЧЕНИИ СИРОТКИН
advertisement
На правах рукописи СИРОТКИН Алексей Константинович ПРИМЕНЕНИЕ УГЛЕРОДНО-ПОЛИМЕРНЫХ ПОДЛОЖЕК В ИЗУЧЕНИИ АДСОРБЦИИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ И ОПРЕДЕЛЕНИИ ЭТИОЛОГИИ ВИРУСНЫХ ГАСТРОЭНТЕРИТОВ У ДЕТЕЙ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ 03.00.06 - вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2005 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гриппа РАМН Научный руководитель: кандидат медицинских наук Сухинин Валерий Петрович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Соколова Екатерина Дмитриевна доктор биологических наук, профессор Рыбальченко Оксана Владимировна Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 001.043.01 при ГУ НИИ гриппа РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН. Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.043.01 кандидат медицинских н а у к Л о б о в а Тамара Геннадиевна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вирусные гастроэнтериты (ВГЭ) у детей являются одной из важнейших проблем здравоохранения во всем мире Только от ротавирусных диареи умирает около 500 000 детей в год (Parashar U D et al, 2003) Второе место по этиологической значимости после ротавирусов занимают норовирусы, являющиеся наиболее распространенной причиной гастроэнтерита, связанного с употреблением контаминированных пищевых продуктов (Glass R I et al, 2000) Благодаря интенсивным исследованиям, список патогенных и условно-патогенных кишечных вирусов постоянно пополняется В настоящее время известно свыше десяти различных вирусов, вызывающих острый гастроэнтерит Некоторые из них, например, торовирусы человека были идентифицированы лишь недавно (JamiesonF В et al, 1998) Ранняя диагностика ВГЭ имеет высокое значение при выборе оптимальных схем лечения заболевания В частности, ВГЭ не рекомендуется лечить с применением антибиотиков (Rhoads F А 1993, Rudolph J А , 1999) В связи с появлением на рынке новых противовирусных препаратов как широкого спектра действия, так и узконаправленных, точное определение этиологии заболевания приобретает все большую значимость В настоящее время, по существу, единственным диагностическим методом, позволяющим одновременно выявить весь спектр патогенных кишечных вирусов, остается просвечивающая электронная микроскопия (ЭМ) Разнообразие этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов и их высокая изменчивость способствуют тому, что ЭМ продолжает интенсивно использоваться в крупных диагностических центрах наравне с иммуноферментным анализом (ИФА) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (Biel SS, Gelderblom HR, 1999) Одним из недостатков ЭМ, снижающим эффективность ее применения, является относительно низкая чувствительность метода Традиционно для увеличения чувствительности электронно-микроскопической диагностики применяют концентрирование исследуемых препаратов с помощью ультрацентрифугирования, а также сенсибилизацию подложек антителами к искомому вирусу (иммуноэлектронная микроскопия) Указанные способы однако, не лишены целого ряда недостатков Ультрацентирифугирование требует наличия дорогостоящего оборудования и связано со значительными временными затратами Для иммуноэлектронной микроскопии необходим, в свою очередь, набор сывороток ко всему спектру выявляемых вирусов, что не всегда возможно В работе был избран оригинальный подход к увеличению чувствительности ЭМ, основанный на повышении адсорбционной способности углеродных подложек при помощи их модификации синтетическими полимерами 1 Другим существенным фактором, влияющим на результат электронномикроскопической диагностики, является умение выделить характерные морфологические особенности кишечных вирусов В 1980-х годах в НИИ полиомиелитов и вирусных энцефалитов (г Москва) проводилось изучение этиологии вспышек острого гастроэнтерита с использованием ЭМ в качестве основного метода детекции (Дроздов С Г. 1983, Хаустов В И с соавт , 1989) Применялась ЭМ и в исследованиях, проводимых в те же годы в Ленинграде (Васильев Б Я с соавт, 1986, 1989, 1990, 1991) Исследования тех лет фокусировались в основном на этиологической роли ротавирусов Прочие вирусные агенты были выявлены в ряде случаев, но их роль в кишечной патологии у детей исследована недостаточно Из-за неполноты данных по этиологии ВГЭ. в отечественной литературе отсутствует морфологическое описание некоторых патогенных кишечных вирусов, в частности, торовирусов и норовирусов Поэтому важной задачей настоящего исследования было подробное изучение этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге и составление морфологического описания всех обнаруженных этиологических агентов Для того чтобы оценить достоверность данных по этиологии ВГЭ, полученных при помощи ЭМ, необходимо было также провести сравнительное исследование по выявлению ВГЭ различными методами В настоящей работе такое исследование проведено на примере ротавирусной инфекции, выявляемой методами ЭМ, иммуноферментного анализа (ИФА) и РНК- электрофореза в полиакриламидном геле С учетом всего вышесказанного были сформулированы следующие цепи и задачи Цель исследования Разработать метод повышения чувствительности электронномикроскопической детекции вирусных частиц и помощью данного метода изучить этиологию вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге 1 2 3 4 5 Задачи исследования: Изучить адсорбцию вирусных частиц на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами Разработать метод повышения чувствительности электронномикроскопической детекции агентов ВГЭ Изучить этиологическую структуру и сезонное распределение ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге Описать особенности морфологии патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника Провести сравнительный анализ эффективности выявления ротавирусной инфекции методами ИФА и ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек Научная новизна. Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами. Впервые выявлено избирательное сродство кишечных вирусов к различным синтетическим полимерам. Впервые показано, что частицы норовирусов, саповирусов, ротавирусов и торовирусов обладают отрицательным электростатическим зарядом при нейтральных значениях pH. В исследовании впервые было обнаружено, что адсорбционные свойства кишечного аденовируса 41 типа (Ad41) и респираторного аденовируса 5 типа (Ad5) существенно различаются. Показано, что частицы Ad5 имеют выраженный отрицательный заряд, в то время как заряд вирионов Ad4l близок к нейтральному. Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики, позволяющий увеличить эффективность выявления этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов на 20% - 50%. По эффективности разработанный метод не уступает концентрированию исследуемых препаратов при помощи ультрацентрифугирования, но значительно быстрее и проще последнего. Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полимером ПДМАЭМ. Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавируса в клетки-мишени происходит «прямым» путем с «раздеванием» вирусных частиц непосредственно на наружной мембране (Tihova Μ. et al, 2001). Расширены представления об этиологической структуре вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге. Установлена этиологическая значимость ротавирусов (46,1%), норовирусов (13,4%), торовирусов (11,5%). кишечных аденовирусов (2,3%), коронавирусов (1,2%), астровирусов (0,6%) и саповирусов (0,2%) в кишечной патологии детей, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит». Впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы. Впервые в России выявлена существенная этиологическая значимость торовирусной инфекции. Обнаружено значительное число (6% от общего количества обследованных детей) сочетанных вирусных кишечных инфекций с участием торовирусов, что свидетельствует о возможности внутрибольничного распространения торовирусной инфекции. Получены оригинальные электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника. Выявлены новые морфологические особенности строения норовирусов. С использованием ЭМ в качестве референс- метода впервые подробно охарактеризованы отечественные тест-системы ИФА для выявления ротавирусного антигена. Практическая значимость работы Предложенная экспериментальная модель позволила получить качественно новую информацию об адсорбционных свойствах различных вир) сов Данная информация может найти применение в вирусологической диагностике, а также при разработке противовирусных препаратов, блокирующих инфекцию на стадии адсорбции Разработан новый метод, позволяющий существенно повысить эффективность выявления различных кишечных вирусов Метод обладает наиботьшей эффективностью при выявлении норовирусов, что имеет особое значение, поскольку тест-системы ИФА для выявления норовирусной инфекции в России не выпускаются Уникатьлые адсорбционные свойства аденовируса 41 типа выявленные в исследовании, позволяют определять принадлежность кишечных аденовирусов к подгруппе F в отсутствие иммунных сывороток Проведенное исследование позволило врачам-педиатрам, участвующим в исследовании выявить клинические особенности вирусных гастроэнтеритов различной этиологии и сформулировать критерии симптоматической диагностики вирусных ОКИ у детей Подготовлен материал для издания атласа этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов включающий в себя оригинальные электронномикроскопические изображения и описание всех известных на сегодняшний день патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника Показано, что ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек может использоваться в качестве эффективного референс- метода для оценки чувствительности и специфичности иммуноферментных тест-систем Основные положения, выносимые на защиту Предложена новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии при помощи подложек, модифицированных различными синтетическими полимерами Разработан новый метод повышения чувствительности электронномикроскопической детекции вирусных частиц Показана эффективность метода в диагностике вирусных гастроэнтеритов у детей, в особенности при выявлении калицивирусной инфекции Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге в 20012003 гг отличалась разнообразием циркулирующих агентов Наибольшее значение в кишечной патологии детей имели (в порядке значимости) ротавирусы норовирусы торовирусы, аденовирусы, коронавирусы и астровирусы Апробация работы Результаты исследований были доложены на международных симпозиумах и конференциях "Molecular Order and Mobility in Pol>mer Systems", Санкт-Петербург, 3-7 июня 2002г, «Ликвидация и этиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4-5 сент 2003г, «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», СанктПетербург, 16-18 апр 2001, «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций», Санкт-Петербург, 16-18 апр 2002, а также на заседаниях общества эпидемиологов России Сведения о внедрении Усовершенствованный метод электронно-микроскопической диагностики применяется в расшифровке этиологии ОКИ в НИИ детских инфекций и других больницах Санкт-Петербурга Подана заявка на патент Электронные микрофотографии вирусов и другие материалы работы используются на лекциях и практических занятий по вирусологии на биолого-почвенном факультете СПбГУ, а также на сертификационных курсах для вирусологов при ГУ НИИ гриппа РАМН Публикации По материалам диссертации опубликованы 22 научные работы в том числе 9 статей в реферируемых российских научных журналах Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста содержит 8 таблиц, 17 рисунков, 25 электронных микрофотографий Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения, включающего электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника Список литературы включает 32 отечественных и 266 зарубежных источников Ключевые слова: электронная микроскопия, адсорбция вирусных частиц, синтетические полимеры, вирусный гастроэнтерит СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Контингент обследованных пациентов В период с октября 2001 г по ноябрь 2003 г были обследованы 485 детей в возрасте от 2-х месяцев до 14-ти лет, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит» в клинику НИИ детских инфекций (НИИДИ) и в Детскую инфекционную больницу №3 г Санкт-Петербурга (ДИБ-3) Средний возраст госпитализированных детей составит 2г Зм Преобладающими симптомами при поступлении были рвота, диарея лихорадочное состояние (Т> 38,0) Патогенных бактерий у обследованных детей обнаружено не было Контрольная группа состояла из 19 клинически здоровых детей в возрасте от 4 мес до 16 лет Средний возраст детей контрольной группы составил 3,5 года Электронно-микроскопические исследования Образцы фекалий брали на 2-5 день заболевания Выявление вирусов в фекалиях проводили по метод) Doane FW (1994) Образцы фекалий разбавляли в 2-10 раз 1% раствором ацетата аммония и энергично встряхивали Суспензию фекалий в количестве 1,5 мт помещали в пластиковые пробирки и осветляли на настольной центрифуге при 8 000 об/мин в течение 15 мин Каплю надосадочной жидкости наносили на парафильм и сверху на каплю помещали медную сетку, покрытую углеродной подложной Сетку оставляли на капле в течение 30-60 сек для адсорбции вирусных частиц, затем 2 раза отмывали дистиллированной водой и контрастировали 1,5% раствором ФВК Просмотр препаратов осуществляли на просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) Полимеры Для модификации углеродных подложек использовали нейтральные полимеры - поливинилпирролидон (ПВП) молекулярной массы ЗОкД. 80кД и 120кД, потожитетьно заряженные полимеры - полиаллитамин (ПААМ) 15кД, 28кД, 80кД поливиниламин (ПВАМ) 15кД, ЗОкД, полидиметиламиноэтитметакрилат (ПДМАЭМ) 32кД, 80кД, сополимер ПДМАЭМ 32кД с поли-NNN-триметил-N-метакрилоилоксиэтил-аммоний подидом (ПДМАЭМ ПТМАЭМ), отрицательно заряженные потимеры - полиметакриловую кислоту (ПМАК), ЗОкД 60кД Структурные формулы полимеров приводятся на рис 1 Потимеры были синтезированы в Институте высокомолекулярных соединений РАН (ИВС РАН) Модификация подложек Готовили 0,2% растворы исследуемых полимеров на бидистиллированной воде Медные сетки 400mesh, покрытые \псродными подложками, помещали сверху на каплю раствора полимера Через 30 сек сетку снимали, удаляли избыток влаги фильтровальной бумагой и отмывали сетку в капле дистиллированной воды Влажные сетки немедленно использовали для приготовления электронно-микроскопических препаратов методом негативного контрастирования как описано выше Рис. 1. Структурные формулы синтетических полимеров. a. b. c. d. e. полиаллиламин (ПААМ), поливиниламин (ПВАМ), поливинилпирролидон (ПВП), полидиметиламиноэтилметакрилат (ПДМАЭМ) Сополимер ПДМАЭМ с поли-NNNтриметил-Nметакрилоилоксиэтиламмоний иодидом, m/n = 2/3 (ПДМАЭМ-сополимер) f. полиметакриловая кислота (ПМАК) Вирусы. Для изучения адсорбции использовали частично очищенные при помощи центрифугирования препараты различных вирусов (ротавирусов. аденовирусов, норовирусов, саповирусов и торовирусов), выделенных из фекалий больных детей В качестве референс-препарата использовали также культуральную жидкость, содержащую аденовирус 5 типа из коллекции НИИ гриппа РАМН Onpeделение коэффициентов адсорбции. Вируссодержащие препараты разводили физиологическим раствором (pH 6,8) до концентрации, удобной для подсчета частиц (5-20 частиц в поле зрения). Производили подсчет количества вирусных частиц на углеродных подложках и на подложках, модифицированных синтетическими полимерами Условные коэффициенты адсорбции (К) определяли по относительному увеличению количества вирусных частиц на единицу площади на модифицированных подложках по сравнению с традиционными углеродными подложками В среднем просчитывали по 50 полей зрения. Иимуноферментная диагностика Для выявления ротавирусной инфекции методом ИФА использовали иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства фирмы «Аквапаст» (Санкт-Петербург). Иммуноферментный анализ осуществляли согласно рекомендациям производителя Учет результатов проводили путем измерения оптической плотности на длине волны 492 нм (ОП 492 ) с помощью вертикального фотометра Anthos 2010 (Австрия) Электрофорез ротавирусной РНК. Для выделения РНК из фекалий использовали набор «Рибосорб» производства ЦНИИ эпидемиологии им Габричевского РНК выделяли из 200 мкл образца, соблюдая пропорции реагентов Диск-электрофорез ротавирусной РНК в полиакриламидном геле проводили по метод) Laemmly. Чувствительность ИФТС в пересчете на минимальную выявляемую концентрацию вирусных частиц определяли путем постановки реакции с серией разведений клинических образцов, количество частиц в которых было предварительно подсчитано методом ЭМ с помощью стандартной методики с использованием суспензии латекса Для постановки реакции были выбраны образцы с высокими значениями ОП492 (в пределах 1.5 - 2.5) Чувствительности ИФТС определялась как среднее значение для трех образцов Чувствительность ЭМ (Spart эм ) определяли при исследовании серии разведений тех же образцов Увеличение времени просмотра свыше 20 мин считалось нецелесообразным. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Изучение адсорбции вирусных частиц на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами. На первом этапе исследования из всего количества синтезированных полимеров (около 30-ти) были отобраны соединения, удовлетворяющие следующим критериям: 1) хорошая растворимость соединения в воде в диапазоне концентраций от 0 до 10 мг/мл; 2) способность полимера равномерно распределяться на подложке без образования комков и сгустков; 3) минимальное воздействие полимера на морфологию различных вирусов. Было найдено, что в наибольшей степени перечисленным критериям удовлетворяли линейные нейтральные и заряженные полимеры с молекулярной массой от 25 до 40 kDa. Алкилированные полимеры и полимеры с молекулярной массой выше 50 kDa были склонны к образованию мицелл и сгустков, полимеры с массой меньше 15 kDa легко отмывались от подложек и не удерживали вирусные частицы. На втором этапе работы проводилось изучение адсорбции вирусов на подложках, модифицированных синтетическими полимерами. Условные коэффициенты адсорбции (К), полученные для различных вирусов и полимеров, приведены в таблице 1. Таблица 1. Условные коэффициенты адсорбции (К) различных вирусов на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами*. Как видно из сравнения коэффициентов адсорбция, нейтральный полимер ЛВП не указывал существенного влияния-, на адсорбцию исследованных вирусов Отрицательно заряженный полимер ПМАК значительно снижал сорбционную способность подложек для всех исследованных вирусов кроме Ad41 (К=0,9). Положительно заряженные полимеры в целом повышали адсорбционную способность углеродных подложек в отношении различных вирусов. Полученный результат свидетельствует о том, что частицы всех исследованных вирусов при нейтральных значениях pH заряжены отрицательно, кроме аденовируса 41 типа (Ad41), который, вероятно, имеет заряд, близкий к нейтральному. В исследовании впервые было обнаружено, что адсорбционные свойства кишечного аденовируса 41 типа (Ad4I) и респираторного аденовируса 5 типа (Ad5) существенно различаются (см. табл. 1). В частности, из сравнения коэффициентов адсорбции на подложках с отрицательно заряженным полимером ПМАК следует, что частицы Ad5 имеют выраженный отрицательный заряд, в то время как заряд вирионов Ad4l близок к нейтральному. Логично предположить, что основной вклад в заряд частиц аденовируса дают наружные домены гексонов. В поисках объяснения обнаруженных различий в заряде частиц Ad5 и Ad41 было проведено сравнение аминокислотных последовательностей гексонов Ad5 и Ad41, имеющихся в базе данных GenBank (access numbers DAA00653 и HXAD41, соответственно). Оказалось, что суммарный условный заряд (число положительно заряженных аминокислот минус число отрицательно заряженных аминокислот) наружного участка петли LI (а.к. 131-170) гексона Ad5 составляет минус 15, в то время как заряд аналогичного участка гексона Ad41 · близок к нейтральному и составляет плюс 1. Таким образом, обнаруженные различия в заряде частиц Ad5 и Ad41 подтверждаются имеющимися данными о структуре соответствующих гексонов. Интересно отметить, что заряд петли L1 аденовируса 40 типа, также принадлежащего к подгруппе F, при другой аминокислотной последовательности составляет также плюс 1 (access number AAC13967). Было обнаружено, что все исследованные вирусы, несмотря на различия в заряде и размерах частиц, проявляли выраженное сродство к одному из положительно заряженных полимеров. Так, саповирусы, норовирусы, астровирусы и ротавирусы эффективно адсорбировались на подложках с ПААМ (К=17,3; К=Ю,2; К=4,8 и К=3,0, соответственно), аденовирус Ad5 обладал наибольшим сродством к ПДМАЭМ (К=2,2), в то время как Ad41 проявлял повышенное сродство к сополимеру ПДМАЭМ (К=3,0). Наибольшие значения коэффициентов адсорбции были получены для норовирусов и саповирусов на подложках, модифицированных ПААМ (К~10 и К-17. соответственно). Морфология частиц всех исследованных агентов кроме ротавирусов существенно не изменялась при адсорбции на подложках, 10 модифицированных различными полимерами в пределах используемых концентраций полимеров (0,05-0,2%) При исследовании адсорбции ротавирусов на подложках, модифицированных ПДМАЭМ, было обнаружено превращение трехслойных частиц в двухслойные, что, повидимому, бьло обусловлено частичной декапсидацией вирионов (Рис 2) ! I ι Рис 2 Частичная декапсидация вирионов ротавируса на подложках модифицированных ПДМАЭМ Вверху трехслойные частицы ротавируса в фекалиях ребенка с острым гастроэнтеритом Использовалась обычная углеродная подложка Вниз} тот же препарат адсорбированный на подложке, модифицированной ПДМАЭМ Видно скопление двухслойных частиц Негативное контрастирование Масштабный отрезок - ЮОнм Поскольку положительно заряженые группы ПДМАЭМ напоминают аминогруппы пикосфинголипидов в raft- микродомснах клеточных мембран *в скобках указан процент выявленных случаев вирусной инфекции от общего чиста обследованных детей RV - ротавирусы, AdV - аденовирусы, TV - торовирусы, AstV - астровирусы, NV- норовирусы, SV - саповирусы, Но - патогенных вирусов не обнаружено Для определения эффективности применения модифицированных подложек по сравнению с концентрацией препаратов при помощи ультрацентрифугирования, было проведено исследование серии образцов (N=36), полученных во время вспышки норовирусной инфекции в больнице. С помощью углеродно-полимерных подложек норовирусы были обнаружены в 27 случаях из 36-ти, в то время как исследование осадка, нанесенного на традиционные углеродные подложки, позволило выявить норовиурусы в 25 случаях. (Предварительно осветленные препараты объемом 5 мл были сконцентрированы в 50 раз осаждением при 120 000 g в течение 1,5 час). В 34 случаях (24 положительных и 8 отрицательных) результаты обоих методов совпадали. В одном случае норовирусы были выявлены с использованием ультрацентрифугирования препарата и не были выявлены при помощи модифицированных подложек. В трех случаях, напротив, норовирусы были обнаружены при помощи углеродно-полимерных подложек и не были выявлены при исследовании осадка препарата. Таким образом, чувствительность нового метода по сравнению с ультрацентрифугированием составила 27/25 = 108%. Относительно низкую эффективность ультрацентрифугирования можно объяснить тем, что вместе с вирусными частицами осаждается также большое количество клеточного детрита, маскирующего частицы норовирусов и затрудняющего просмотр препаратов. Следует отметить также, что новый метод с использованием модифицированных подложек значительно быстрее и экономичнее ультрацентрифугирования. 2. Изучение этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей. Разработка метода повышения чувствительности электронномикроскопической детекции вирусных частиц позволила перейти к подробному изучению этиологии ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге. За период с октября 2001 г. по ноябрь 2003 г. было обследовано 485 детей. При этом было обнаружено 11 морфологически различных патогенных и условно-патогенных вирусов (без учета бактериофагов) Электронно-микроскопические изображения обнаруженных вирусов приведены на рис. 3-6. Были получены новые данные по этологической структуре вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге (таблица 3). Оказалось, что, среди моноинфекций доминировали ротавирусы, обнаруженные у 46,1°о обследованных детей. На втором месте по распространенности были норовирусы (13,4%), далее в порядке убывания следовали торовирусы (11,5%), аденовирусы (2,3%), коронавирусы (1,2%), астровирусы (0,6%) и все прочие вирусы (в сумме 1,4%). Среди микст-инфекций доминировало сочетание: ротавирус+торовирус (6% от общего числа случаев). Одним из объяснений высокой частоты выявления сочетанных инфекций с участием торовирусов может быть повышенная распространенность торовир>сных инфекций в больницах и клиниках, что согласуется с данными зарубежных исследователей (Jamieson F.B et а!, 1998). Патогенных бактерий у обследованных детей обнаружено не было. Таблица 3. Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт- Петербурге в 2001-2003гг по данным электронной микроскопии (N = 485). В сумме у 405 из 485 обследованных детей были обнаружены один или несколько различных вирусов. Таким образом, разработанный метод позволил определить вирусную природу гастроэнтерита у 83% обследованных детей. Вирусы, обнаруженные в фекалиях детей, принято разделять на три группы по патогенетической значимости (Atmar R, Estes M., 2001): I) Общепризнанные этиологические агенты гастроэнтеритов человека. К ним относят ротавирусьт, норовирусы, саповирусы, астровирусы и аденовирусы. Все перечисленные вирусы были выявлены в настоящем исследовании. 14 2) Предполагаемые этиологические агенты гастроэнтеритов человека В настоящее время в эту группу включают коронавирусы, торовирусы и пестивирусы. В данной работе торовирусная и коронавирусная инфекция была выявлена в 11,5% и 1,2% случаев, соответственно В 3-х случаях были обнаружены вирусоподобные частицы, по морфологическим признакам соответствующие пестивирусам (рис. 6). 3) Сопутствующие вирусы К ним относят прежде всего энтеровирусы Echo и Coxsackie, принадлежащие к семейству пикорнавирусов. В настоящем исследовании пикорнавирусы были обнаружены только в одном случае Кроме того, в двух случаях были обнаружены мелкие вирусоподобные частицы, по морфологическим признакам отличающиеся от всех перечисленных вирусов (рис. 5). Сокращенно подобные вирусоподобные частицы обозначают в зависимости от морфологии как SRV (small round viruses - мелкие округлые вирусы) или SRSV (small round structured viruses мелкие вирусы, обладающие структурными особенностями поверхности) Определить таксономическую принадлежность обнаруженных вирусов по морфологическим признакам не представляется возможным В фекалиях контрольной группы здоровых детей (n=19) патогенных вирусов не было обнаружено. Нормальная вирусная флора кишечника была представлена различными бактериофагами, среди которых преобладали бактериофаги семейств Podoviridae, Miovindae и Syphoviridae. Подробное морфологическое описание вирусных частиц приводится в тексте диссертации Полученные микрофотографии патогенных вирусов в целом соответствовали изображениям, приведенным в руководствах и статьях зарубежных авторов (Doan FW & Anderson Ν, 1986, Doan F W . 1994; Duckmanton L, 1997) В исследовании впервые были отмечены не описанные ранее особенности морфологии норовирусов, а именно, ромбовидная форма «пустых» частиц (рис 3 и 4) Поскольку частицы норовирусов обычно обнаруживаются в незначительном количестве, выявленные особенности морфологии способствуют более достоверной идентификации норовирусов в клинических образцах. Было изучено сезонное распределение вирусных гастроэнтеритов ν детей в Санкт-Петербурге. Ротавирусная инфекция проявляла выраженную сезонную зависимость с пиком активности в зимне-весенние месяцы Около 70% случаев ротавирусной инфекции в 2002 и 2003 гг. приходились на три месяца - февраль, март, апрель (рис. 6) Подобная же сезонная активность ротавирусной инфекции отмечена и в других странах северного полушария Норовирусная инфекция не имела столь выраженной сезонности, однако, наблюдалась тенденция к росту заболеваемости в холодное время года. Подъем заболеваемости норовирусными гастроэнтеритами наблюдался с сентября 2002г. по апрель 2003 года и затем после летнего перерыва осенью 2003 г. Приблизительно в те же сроки отмечался подъем заболеваемости норовирусными гастроэнтеритами в Европе и США (Lopman BA, 2003; CDC. MMWR, 2002 ν 51, p. 1112-1115; CDC, MMWR, 2003, v.,52, p. 41-45). Рис 3. Морфологические особенности норовирусов. Две «пустые» частицы ромбовидной формы отмечены стрелками. Масштабный отрезок - 50нм. Что касается торовирусной инфекции, то она выявлялась в течение всего периода наблюдений без выраженной сезонной зависимости. В отдельные месяцы была отмечена повышенная активность торовирусных инфекции, например, в ноябре 2001 г. в апреле 2002г, в мае 2003г. Отсутствие сезонной зависимости в распространении торовирусной инфекции отмечено и в исследованиях канадских вирусологов (Jamieson F.B. et al, 1998). Аденовирусная инфекция не проявляла выраженной сезонной зависимости Коронавирусная инфекция выявлялась преимущественно весной и осенью Анализ полученных данных показал, что этиологическая структура и сезонное распределение ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге в целом соответствуют тенденциям в распространении вирусных кишечных инфекций, наблюдаемым в развитых странах Северного полушария с \меренным климатом (Jamieson F.B. et al, 1998; Marie-Cardine Α. et al, 2002; Pang X.L. et al, 2000; Waters V. et al, 2000). Для того чтобы оценить достоверность информации, полученной с помощью ЭМ. о доли ротавирусной инфекции в этиологической структуре ВГЭ, было проведено сравнительное исследование по выявлению ротавирусной инфекции методами ЭМ и ИФА. Рис 4 Вирусы, обнаруженные в фекалиях детей с острым гастроэнтеритом RV - частицы ротавируса AdV - частицы аденовируса AstV - скопление частиц астровируса NoV - скопление частиц норовируса Масштабный отрезок- ЮОнм Все вирусы приведены в одном масштабе Рис 5 Вирусы, обнаруженные в фекалиях детей с острым гастроэнтеритом SaV - скопление вирионов саповируса SRSV - вирионы мелкого вируса, обладающего структурными особенностями поверхности, SRV - вирионы мелкого округлово вируса PicV-частицы пикорнавируса Рис 6 Оболочечные вирусы в фекалиях детей с острым гастроэнтеритом CoV - вирион коронавируса ToV - вирион торовируса FLV - частицы флави-подобного вируса (пестивируса2) 3. Сравнительная диагностика ротавирусной инфекции методами ЭМ и ИФА Выявление ротавирусной инфекции методами ЭМ и ИФА производили на двух сериях образцов. Первая серия состояла из 73 образцов фекалий детей, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит» в сезон 2001-2002гг. Образцы исследовались при помощи ЭМ в НИИ гриппа РАМН, а также методом ИФА в НИИ детских инфекций (тест-система «ВЕКТОРБЕСТ») и в б-це им. Боткина (тест-система «АКВАПАСТ»). При сравнении результатов исследований оказалось, что ЭМдиагностика с использованием углеродно-полимерных подложек по количеству выявленных случаев ротавирусной инфекции (52 случая) вдвое превосходила иммуноферментную диагностику (26 случаев) В 38 случаях результаты диагностики различными методами не совпадали. В 32 случаях ротавирусы были обнаружены при помощи ЭМ, но ротавирусный антиген не был выявлен в ИФА. В 6-ти случаях ротавирусный антиген был выявлен в ИФА, однако в соответствующих образцах были обнаружены торовирусы и аденовирусы, но не ротавирусы. Для ответа на вопрос, чем было вызвано столь значительное расхождение результатов ЭМ и ИФА, при анализе второй серии образцов была поставлена задача: определить чувствительность и специфичность иммуноферментных тест-систем (ИФТС) в сравнении с ЭМ. Вторая серия состояла из 177 образцов, собранных в сезон 2002-2003 гг Методом ЭМ ротавирусы были обнаружены в 121 случае (68%), торовир\сы в 14-ти, норовирусы в 16-ти, аденовирусы в 4-х, астровирусы в 3-х случаях, коронавирусы в 3-х случаях. В 7-ми образцах патогенных вирусов выявлено не было. В 9 случаях были выявлены сочетанные инфекции (RV-TV в 7 случаях, RV+NV - в 1сл„ RV+Ad - в 1сл.). Всего ротавирусы методом ЭМ были выявлены в 130 случаях (73%). Образцы второй серии были исследованы в лаборатории НИИ гриппа РАМН при помощи ИФТС «АКВАПАСТ», поскольку в первом опыте данная тест-система показала лучшие результаты в сравнении с ИФТС «ВЕКТОР-БЕСТ». Интерпретация результатов ИФА в значительной степени зависит от выбора критической оптической плотности ОП к р и т («граница отсечки», cutoff). Для исключения неспецифических реакций в ИФА методически наиболее правильным является определение ΟΠкритΓ как удвоенной ОП492 в реакции с гетерологичными вирусными антигенами. На рис. 7 представлены результаты определения ОП492 для образцов второй серии, сгруппированных по различным вирусам. Из приведенных данных видно, что наблюдались неспецифические реакции с гетерологичными антигенами, причем образцы, содержащие различные вирусы, существенно различались между собой по средним значениям ОП492 Рис 7 Средние значения ОП492 в иммуноферментном анализе (ИФА) образцов фекалий, содержащих различные кишечные вирусы В ИФА использовалась тест-система «Рота-антиген» (АКВАПАСТ) Примечания RV- ротавир>с. NV - норовирус, TV - торовирус, CoV коронавирус, AdV - аденовирус, RV+V - ротавирус + какой-либо из кишечных вирусов К(-) - отрицательный контроль Вертикальными отрезками показаны средние квадратичные отклонения Наиболее высокие значения ОП492 среди гетерологичных антигенов были получены для образцов, содержащих торовирусы (среднее значение 0,78) Одним из возможных объяснений неспецифических реакций в данном случае могло быть наличие антител к торовирусам в сыворотке телят, используемой в производстве ИФТС Данное объяснение вполне правдоподобно, поскольку торовирусы телят, обладающие антигенным родством с торовирусами человека, повсеместно распространены в стадах (Duckmanton L et а!, 1998, Hoet А Е et al, 2002) Высокие значения ОП492 были получены также для образцов, содержащих аденовирусы (среднее значение - 0,67) Причина неспецифических реакций в данном случае могла быть той же самой Наименьшие значения ОП492 в реакции с гетерологичными антигенами были получены для образцов, содержащих норовирусы (среднее значение - 0,24) По результатам ИФА целесообразно было определить О П К р и т как* ОПКрит = ОП(Норо) х 2 = 0,48, где ОП(Норо) - среднее значение ОП492 для образцов, содержащих норовиру сы При таком определении ОП к р и т число поюжительных ответов ИФА во второй серии образцов было равно 109, а чувствительность и специфичность ИФТС в сравнении с ЭМ оказались равны 81% и 91%, соответственно. Для более полной характеристики сравниваемых методов была определена чувствительность ЭМ и ИФТС в пересчете на минимальную выявляемую концентрацию вирусных частиц в исследуемых препаратах (см. раздел «материалы и методы»). Среднее значение чувствительности ЭМ оказалось равно: Среднее значение чувствительности ИФТС было равно· Таким образом, чувствительность ЭМ в пересчете на концентрацию вирусных частиц оказалась приблизительно равна чувствительности ИФТС. При исследовании второй серии образцов (N=177) в 21 случае (17% от числа выявленных случаев) ротавирусный антиген не был выявлен в ИФА, несмотря на то, что в соответствующих образцах вирусные частицы были обнаружены при помощи ЭМ. В большинстве подобных случаев концентрация вирусных частиц в препаратах была достаточно высока (около 109 - 1011 ч/мл), и, следовательно, ложноотрицательные результаты ИФА нельзя было объяснить низкой чувствительностью ИФТС Следует подчеркнуть, что чувствительность ЭМ в отличие от ИФА не зависит от антигенных свойств возб>дителя. Использованные в исследовании тест-системы были предназначены для выявления ротавирусов группы А. поэтому ложноотрицательные результаты ИФА в принципе могли быть обусловлены циркуляцией ротавирусов других антигенных групп, например, В и С. Для исключения данной версии было проведено определение форетипов ротавирусов методом электрофореза РНК в полиакриламидном геле. Было проанализировано 37 образцов фекалий, в которых методом ЭМ было показано наличие частиц ротавирусов. Из них в 12 образцах ротавирусная инфекция не была выявлена при помощи ИФТС. Все образцы показали типичный для ротавирусов группы А паттерн миграции сегментов РНК (так называемый 4,2.3,2, паттерн) Было выявлено два форетипа, оба τ н «длинного» типа, различающиеся по характеру миграции триплета 7,8,9 сегментов РНК. Корреляции форетипирования с результатами ИФА обнаружено не было. Можно предположить, что относительно низкая в сравнении с ЭМ выявляемость ротавирусной инфекции методом ИФА была обусловлена высокой антигенной изменчивостью ротавирусов группы А. Для подтверждения данного предположения в дальнейших исследованиях планируется определить G[P]- типы ротавирусов. Т.о., диагностика ротавирусной инфекции при помощи ЭМ с использованием полимерно-) глеродных подложек показала преимущество данного метода по сравнению с ИФА, выражающееся в значительно большем количестве (20-50%) выявленных случаев 23 выводы 1 Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами, исследовать адсорбцию вирусных частиц методами электронной микроскопии Впервые показано, что частицы ротавирусов, норовирусов, саповирусов и торовирусов обладают отрицательным электростатическим зарядом при нейтральных значениях pH Выявтено избирательное сродство кишечных вирусов к различным полимерам 2 Впервые обнаружены различия в заряде и адсорбционных свойствах кишечного аденовируса 41 типа и респираторного аденовируса 5 типа Выявленные различия могут быть использованы для установления принадлежности кишечных аденовирусов к подгруппе F в отсутствие имм>нных сывороток 3 Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полидиметиламиноэтилметакрилатом (ПДМАЭМ) Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавир>са в клетку происходит «прямым» путем с декапсидацией непосредственно на мембране клетки 4 Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц На к типическом материале показана высокая эффективность метода, позволившего выявить на 25-50% больше случаев вирусного гастроэнтерита у детей по сравнению с традиционно применяемыми методиками 5 Показано, что этиопогическая структура и сезонное распределение ВГЭ у детей в С -Петербурге в общих чертах соответствуют таковым в странах Северной Европы В частности, впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы Впервые в России выявлена существенная этиологическая значимость торовирусной инфекции Обнаружено значительное число (6% от общего количества обследованных детей) сочетанных вирусных кишечных инфекций с участием торовирусов, что свидетельствует о возможности внутрибольничного распространения торовирусной инфекции 6 Составлено морфологическое описание наиболее значимых агентов ВГЭ Выявлены новые морфологические особенности норовирусов, способствующие более достоверной идентификации вирусных частиц в клиническич образцах 7 Показано преимущество ЭМ с использованием полимерно-углеродных подложек в сравнении с ИФА, выражающееся в том, что методом ЭМ бьпо выявлено на 20 - 50% больше случаев ротавирусной инфекции Список публикаций по теме диссертации. 1 Васильев Б Я , Семенов Η В , Пудовкина И Φ, Сироткин А К , Су хинин В Π Разделение ротавирусов человека и животных в прерывистом градиенте сахарозы с помощью высокоскоростного центрифугирования // Вопр вирусологии, - 1991 - Τ 36, №6 - С 516-5! 7 2 Васильев Б Я , Семенов Η В , Новикова Η А , Епифанова Η Β , Сироткин А К, Сухинин В Π Электрофоретическая гетерогенность популяции ротавирусов, выделенных в Ленинграде в осенне-зимний сезон 19861987гг//Вопросы вирусологии,- 1990 -Т35,№2 -С 156-157 3 Васильев Б Я , Семенов И В , Сухинин В П , Сироткин А К, Горбачев Ε Η , Артюхов А И, Вербов В Η . Носков Φ С Сравнение методов лабораторной диагностики ротавирусных гастроэнтеритов в условиях практической лаборатории// Вопр вирусологии -1989 - Τ 34, №2 - С 247249 4 Васильев Б Я , Семенов Η В , Москвин А А , Сухинин В Π , Сироткин А К , Горбачев Ε Η , Артюхов А И , Вербов В Η , Носков Φ С Этиологическая роль ротавирусов в кишечной патологии взрослых и детей // Вопросы вирусологии, - 1989 - Τ 34, № 1 - С 106-109 5 Васильев Б Я, Сухинин В Π, Сироткин А К Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики ротавирусны\ инфекций // Сб трудов НИИ УАМН, Киев, - 1989 - С 35-36 6 Васильев Б Я, Сироткин А К, Сухинин В Π Применение ПЭМ в диагностике небактериальных гастроэнтеритов// Сб "Острые кишечные инфекции",Л -1986 -С 16-18 7 Галко Η В , Макарова Г Η , Вашукова С С , Сафонова Η В , Су хинин В Π Сироткин А К Обнаружение ротавируса в фекалиях четей больных диареей // Вопросы вирусологии, - 1984, - Τ 29, №5,- С 596-599 8 Романовская-Романько Ε Α , Сироткин А К. Сравнительная диагностика ротавирусной инфекции с помощью ИФА и электронной микроскопии// Материалы X международной научной конференции студентов аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 15-18 апреля 2003 стр 47 9 Романовская-Романько Ε А. Сироткин А К, Б)лавинов ИВ Высокая гетерогенность циркулирующих штаммов ротавирусов в Петербурге в сезон 2001-2002 гг // Материалы десятой молодежной конференции СПбГУ СПб,-2003 -С 138-140 10 Румель Η Б , Мурадян А Я , Осидак Л В , Сироткин А К , Голованова А К ЮрловаТ И Результаты серо-эпидемиологического изучения коронавирусной инфекции у детей и взрослых Санкт-Петербурга / ЖМЭИ (в печати) 11 Сергеева Η В , Тихомирова О В , Сироткин А К Аксенов О А Клиническое течение вирусных гастроэнтеритов у детей // Материалы научной конференции и VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням "Проблема инфекции в клинической медицине" СПб, 5-6 дек 2002, с 306-307 ]2.Сироткин А.К., Голованова А.К., Румель Н.Б., Ныркова О.И., Сергеева Н.В Выделение коронавируса, фенотипически подобного коронавирусу SARS. от ребенка 5-ти лет с респираторно-кишечной симптоматикой. // Материалы международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4 -5 сент. 2003., стр. 118-1!9. 13.Сироткин А.К.,' Романовская-Романько Е.А., Третьякова Н.В. Циркуляция ротавирусов группы А в Санкт-Петербурге в 2001-2003 гг.// Материалы международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», СПб, 4 -5 сент. 2003., стр. 118. И.Сироткин А.К.. Сергеева Н.В.. Тихомирова О.В., Воробьев М.М. Роль торовир\сов в этиологи ОКИ у детей. // Материалы второго конгресса педиатров-инфекционистов России, Москва. 8-10 декабря 2003г., С. 205. 15.Сироткин А.К., Сергеева Н.В., Тихомирова О.В.,. Воробьев М.М., Романовская- Романько Е.А. Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге в 2001-2003 гг. II Материалы международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4 -5 сент. 2003., стр. 117-118. 1б.Сироткин А.К., Сергеева Н.С., Тихомирова О.В., Воробьев М.М., Мурадян А.Я. Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Петербурге по данным электронно-микроскопических исследований// В сб. «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей». Мат.-лы первого конгресса педиатров-инфекционистов России. М., 4-6 декабря 2002г., с. 186. 17.Сироткин А.К., Сухинин В.П., Григорьева В.И., Часнык В.Г. Морфологические критерии электронно-микроскопической диагностики коронавирусных и торовирусных гастроэнтеритов у детей и взрослых// В сб. "Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций", материлы Всероссийской научн. конф., СПб, - 2001, - с. 37. !8.Сироткин А.К., Сухинин В.П.. Назарова О.В., Гаврилова И.И., Панарин Е.Ф. Синтетические полимеры в изучении адсорбции вирусных частиц// Доклады Академии Наук, - 2003, - т. 388, №6, - с. 1-4. 19.Сироткин А.К, Сухинин В.П., Сергеева Н.В., Назарова О.В., Панарин Е.Ф, Мурадян А.Я. Эффективная электронно-микроскопическая диагностика калицивирусов разных геногрупп на основе общих электростатических свойств вирусных частиц// В сб.: "Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций". Материалы Всеросс. научн.-практ. конф., СПб, - 2002, - с. 103. 20.Тихомирова О.В., Сергеева Н.В., Сироткин А.К., Кветная A.C. Эффективность использования пробиотиков у детей с вирусными диареями // Материалы Первого Конгресса педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей», Москва, 4-6'дек. 2002.-с. 194. 21 Тихомирова О В , Сергеева Η В , Сироткин А К , Аксенов О А , Кветная А С Вирусные диареи у детей особенности клинического течения и тактика терапии // Детские инфекции, - 2003, - №3, с 7-10 22 Sirotkin А К, Nazarova О V , Gavriova I I, Panann E F Synthetic Polymers in Visualisation and Investigation of Virus Adsorption// Abstracts of 4-th Internationa! Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems". St -Peterdburg, June 3-7, - 2002, - ρ 137 Благодарности Исследования были частично поддержаны грантом И0549 федеральной целевой программы «ИНТЕГРАЦИЯ» Автор выражает глубокую признательность руководству программы за поддержку исследований по данному проекту Проведенное исследование было бы невозможно без заинтересованного участия многих людей Не имея возможности поблагодарить всех участников, автор приносит искреннюю благодарность научному руководителю к м н Сухинину В Π , зав отделением клиники НИИ детских инфекций, дм н Тихомировой О В , к б н Сергеевой Η В , д м н Аксенову О А зав отделением детской инфекционной больницы №3 г С-Петербурга Воробьеву Μ Μ , к х н Назаровой OB ст н сотр ИВС РАН, осуществлявшей синтез полимеров, Панарину Ε Φ , члену-корреспонденту РАН, директору ИВС РАН за неизменный интерес к совместным исследованиям и консультации по вопросам химии полимеров, д м н, проф Сомининой А А за критический анализ рукописи профессору Университета г Торонто доктору Мартину Петрику (Dr Martin Petric) за любезные консультации по морфологической идентификации торовирусов
