513 выделение и исследование абиотической активности

IX МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
513
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ АБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИТА
PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПИОЦИАНИНА
И.Ю. Хохлова, М.В. Чубик
Научный руководитель : доцент, к.м.н., М.В. Чубик
Томский политехнический университет, Россия, г. Томск, проспект Ленина, 30, 634050
E-mail: ir_n@sibmail.com
ISOLATION ANS ANALISIS OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY PSEUDOMONAS AERUGINOSA
METABOLITE PYOCYANIN
I.U. Khokhlova, M.V. Chubic
Scientific Supervisor: lecturer, Dr. M.V. Chubic
Tomsk Polytechnic University, Russia, Tomsk, Lenin str., 30, 634050
E-mail: ir_n@sibmail.com
Pyocyanin is a water-soluble blue-green phenazine pigment produced in large quantities by active cultures of
Pseudomonas aeruginosa when grown in nutrient agar medium. Isolation of this substance was performed by
extraction method with chloroform. Eluate was concentrated by evaporation with rotary evaporator to give crude
phenazine. Purity of the obtained substance was verifiad by thin-layer chromatography (TLC) with toluene/acetone
3/1 as eluents. The nature of Pyocyanin antibacterial action was determined for several bacteria. In addition,
according to the study of biological property, this antibacterial substance can inhibit some of microorganisms that
are Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans.
В настоящее время возрастает возможность реализации негативных социальных, экономических и
санитарно-эпидемиологических факторов. Организация медико-биологической защиты на современном
уровне является актуальной проблемой. Систематическое применение антибактериальных препаратов в
ветеринарии, неконтролируемый прием антибиотиков среди населения,
целью,
привело
в
последние
годы
к
распространению
часто с профилактической
антибиотикорезистентных
штаммов
микроорганизмов. Резистентность к антибактериальным веществам может возникать как результат
приспособительной изменчивости бактериальных клеток или спонтанно образовавшихся мутантов в
штаммах микрооргазизмов. Терапевтическая эффективность антибиотиков, таких как пенициллин,
эритромицин, синтомицин и других, резко снизилась, поэтому остро встал вопрос поиске новых
антибиотиков, не имевших ранее широкого применения. Одним из них является пиоцианин – метаболит,
выделяемый Pseudomonas aeruginosa в процессе естественной жизнедеятельности.
Целью данной работы является получение пиоцианина, в задачи входит подтверждение его структуры
и абиотических свойств.
В химическом отношении пиоцианин изучен довольно хорошо: не только установлено его строение,
но и разработаны методы синтеза, как самого антибиотика, так и некоторых его аналогов. Но несмотря на
это в России пиоцианин не вызвал интереса к изучению его антибактериальных свойств.
Пиоцианин – темно-синий водорастворимый пигмент, обладающий бактерицидным действием,
РОССИЯ, ТОМСК, 24 – 27 АПРЕЛЯ 2012 г.
ХИМИЯ
IX МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
514
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»
продуцируемый синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa) [1]. Строгий аэроб, не прихотлива при
культивировании хорошо развиваются на органических и синтетических средах. Колонии бесцветные
или белые, выпуклые, гладкие, блестящие. Характерной особенностью этого вида является внешняя
микроструктура колоний: при малом увеличении микроскопа поверхность колоний имеет характерное
сетчатое или ячеистое строение. В бульоне бактерии образуют муть и пленку. Желатин разжижают,
молоко не свертывают, нитраты восстанавливают до нитритов, образуют кислоту на глюкозе и сахарозе.
Представители этого вида синтезируют пиоцианин и некоторые другие пигменты феназинового ряда –
пиовердин (желтый пигмент), пиорубин (красный пигмент), пиомеланин (бурый пигмент).
Пиоцианин имеет форму темно-синих игольчатых кристаллов, tпл 133 ºС. Его наличие в биомассе
определяется сине-зеленым окрашиванием агара. Хорошо растворим в хлороформе, горячей воде, этиловом
спирте, ацетоне. Окисленная форма окрашена в синий цвет, восстановленная бесцветна. Твердое вещество
устойчиво несколько недель при хранении в сухом темном месте, разлагается при длительном стоянии [2].
Методика выделения пиоцианина из культуры Pseudomonas aeruginosa подробно описана в
зарубежной литературе [4]. После 3-х дней культивирования (72 часа), пиоцианин, содержащийся в
биомассе был экстрагирован хлороформом (соотношение биомасса : хлороформ =1:2) и концентрирован
с
использованием
роторного
вакуум-испарителя.
Пиоцианин
был
дважды
экстрагирован
с
использованием 0,1M HCl. Затем рН раствора доводят до нейтрального с использованием 1 N NaOH,
после чего снова экстрагируют хлороформом. Для более полного извлечения пиоцианина экстракцию
проводят дважды. После этого раствор концентрируют вакуум-испарителем и сушат на воздухе [4].
Чистота полученного пиоцианина подтверждена методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (элюент
толуол : ацетон = 1:3). Для подтверждения полученной структуры был проведен анализ газовой
хроматографии масс-спектрометрии (ГХМС).
Для
первичного
исследования
абиотических
свойств
пиоцианина
был
проведен
опыт
с
использованием метода перпендикулярных штрихов [3]. На питательный агар в чашке Петри высевают
штрихом продуцент антибиотического вещества. Посев штрихом делают по диаметру чашки Петри.
Перпендикулярно в его штриху подсевают штрихами тест-организмы
(для этого использовались
культуры Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans).
Для посева
использовались суспензии микроорганизмов концентрацией 500 млн/мл в стерильной дистиллированной
воде. Чашки Петри выдерживали в термостате в течении 5 суток, ежедневно учитывая результаты.
Пиоцианин, выделяемый Pseudomonas aeruginosa, диффундирует в питательную среду образует зону
задержки роста тест-организмов. Нечувствительные в антибиотическому веществу микроорганизмы
растут вблизи штриха продуцента. Если антибиотик оказывает действие на тест-организм, то рост
последнего будет наблюдаться вдали от штриха продуцента. Чем больше это расстояние, тем более
чувствителен исследуемый микроорганизм к антибиотическому веществу, образуемому изучаемым
продуцентом. окрашиваемая зона, образуемая выделившемся пиоцианином составляет 10–16 мм от
штриха продуцента, интенсивность падает к периферии. Происходит видимое глазу подавление роста в
пределах всего распространения пиоцианина в питательной среде. Наиболее заметные результаты
пиоцианин показывает в отношении St. aureus – задержка роста по штриху в направлении к области
распространения пиоцианина порядка 9–13 мм. Затем следует E.coli и Candida albicans – их зона
задержки роста составляет соответственно 6 и 5 мм. На последнем месте стоит Bacillus cereus – ее зона
РОССИЯ, ТОМСК, 24 – 27 АПРЕЛЯ 2012 г.
ХИМИЯ
IX МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»
515
задержки роста составляет всего 3 мм. Различия в зоне окрашивания и зоне задержки роста может быть
вызвано недостаточно концентрацией антибиотика, содержащейся в толще агара.
Из лабораторных исследований видно, что пиоцианин наиболее эффективен в отношении
грамположительных бактерий (St. aureus). Этот результат не может быть конечным, так как продуцент
вещества и тест-организмы выращивали на одной среде, хотя известно, что одна и та же среда не всегда
пригодна для продуцента антибиотика и тест-организмов. Для подтверждения абиотических свойств
требуются дополнительные исследования.
Из литературных источников известен механизмом действия антибиотиков феназинового ряда.
Обладая способностью легко проникать внутрь бактериальных клеток и вступать там в окислительновосстановительные реакции, принимая электроны от глутатиона и NADH и превращаясь в относительно
стабильные анионы, данные вещества вызывают генерацию активных форм кислорода (О 2.-, OH-- и H2O2),
имеющих высокую реакционную способность, результатом чего является индукция окислительного
стресса и последующая гибель микроорганизмов [5].
В результате микробиологического исследования можно сделать вывод, что Pseudomonas aeruginosa
является продуцентом легкодоступного антибиотика, практически не использовавшегося ранее.
Пиоцианин не требует особых условий культивирования продуцента, прост в выделении, достаточно
устойчив, а потому может стать достаточно эффективным антибиотиком, производство которого
возможно в России.
Пиоцианин представляет собой широкий спектр возможностей для изучения его свойств. Полученные
результаты являются основой для дальнейших, более детальных исследований, которые предполагают
изучение зависимости выхода пиоцианина от времени культивирования и состава питательной среды, а
так же изучение биоцидной активности остальных метаболитов Pseudomonas aeruginosa, их сравнение
между собой и с уже известными антибиотиками, определение области и способа применения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. – М.: Медицина, 1983. – 507 с.
2.
Досон Р. Справочник биохимика. – М.: Мир, 1990. – 345 с.
3.
Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова – М.: Академия, 2005. – 602 с.
4.
Rabaey K. Boon N. Hofte M. Yverstraete W. Microbial phenazine production enhances electron transfer
in biofuel cells // Environ. Sci. Technol. – 2005. – V. 39. – P. 3401–3408.
5.
Е.Г. Веремеенко, Н.П. Максимова, Механизмы устойчивости бактерий Pseudomonas aeruginosa –
продуцентов феназиновых антибиоткиков к собственным феназинам // Труды Белорусского
Государственного Университета. – 2009. – Т. 4. – № 1. – С. 161-167.
РОССИЯ, ТОМСК, 24 – 27 АПРЕЛЯ 2012 г.
ХИМИЯ