ПЦР, КАК ЭКСПРЕСС МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Цапалин
advertisement
ПЦР, КАК ЭКСПРЕСС МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Цапалина Е.В., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им.П.А. Столыпина» Ульяновск, Россия PCR AS A RAPID METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF INFECTIOUS DISEASES Tsapalina E.V., Mоlоfeeva N.I., Vasiliev D.A. FSBEI HPE «Ulyanovsk SAA named after P.А. Stolypin» Ulyanovsk, Russia В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является распространением. важнейшим Обнаружение принципом и контроля идентификация за их возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, - начиная бактериологического от клинических методик тестирования и кончая вирусологического и иммунохимическими и молекулярно - биологическими методами. Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем, как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности. Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мullis, получившим за это Нобелевскую премию в 1993 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклеотидов, называемые праймерами (рис.1). ДНК-мишень Рис.1.Праймеры-основа специфичности ПЦР. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n , где п — число циклов амплификации (рис. 2). Рис.2. Экспоненциальная ампфликация Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется числом олигонуклеотидных пар между 5'-концами праймеров. Обычно нуклеотидных размер пар. фрагмента Построение составляет новых несколько ДНК нитей сотен из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза, называемая Таq-полимеразой. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1—2 мин) и построения фрагмента (1—2 мин). В результате 30—35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью термоциклером (рис.3). Рис. 3.Термоциклер специального прибора, называемого Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации. Таким образом, ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах — процессу биологической амплификации, при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 105—106 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов. принципиальное преимущество Но в то перед же время ПЦР культуральными имеет методами. Диагностические потенции ПЦР не ограничены способностью микроба расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифицировать и определять свойства тех микроорганизмов, которых не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях. Здесь уместно отметить, что идентификационные тест-системы, основанные на ПЦР, разрабатываются для микроорганизмов последовательностями с ДНК известными в к интересующих данному генах. моменту Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в основе которой лежит многократное повторение циклов удвоения (амплификация) специфического участка нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода - очень высокая чувствительность: в результате амплификации концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в десятки миллионов раз. За последние 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении молекулярной основы наследственных болезней и в их диагностике с помощью молекулярного анализа ДНК. В первую очередь это относится к болезням, которые вызваны мутацией в одном гене (моногенным). Каждый год увеличивается список наследственных болезней, которые могут быть выявлены методами анализа последовательности нуклеиновых оснований хромосомной ДНК. Появилась возможность с помощью исследования образцов ДНК поставить диагноз наследственного заболевания еще до появления клинических симптомов или в пренатальный период. Это позволяет выявить носителей мутантного гена при аутосомнорецессивных болезнях, а также распознать фенотипически сходные, но генетически различные заболевания. В настоящее время расширяется сфера применения этих методов. Помимо диагностики болезней с установленным типом наследования, они начинают использоваться для изучения и мультифакториальных заболеваний (коронарная болезнь сердца, сахарный диабет, опухоли и др.), а также для идентификации личности, установления отцовства и др. Схема 1. Схема ПЦР-анализа Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, лежащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены традиционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень). Ключом к расширению клинического применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упрощение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа. Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том числе из лимфоцитов периферической крови, лимфобластоидных клеточных линий, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования берут в количестве около 10 мл с антикоагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА. В большинстве лабораторий ДНК выделяют из взятых образцов в тот же день, но их можно и хранить при температуре —20°С. Первым этапом анализа ДНК является ее экстракция из тканей по стандартному методу. Клетки крови (или ворсин хориона) гемолизируют, обрабатывают протеиназой в течение ночи для расщепления белков, экстрагируют сопутствующие вещества фенолом и хлороформом и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Методы экстракции ДНК постоянно совершенствуются, разрабатываются различные модификации, направленные на ускорение и повышение эффективности методов, а также использование менее вредных для исследователя реактивов. Количество и чистота препарата ДНК оцениваются спектрофотометрически. Экстрагированная ДНК стабильна и может храниться неопределенно долгое время. Это имеет большое значение, так как образцы от людей с генетическими заболеваниями могут быть собраны и сохранены для будущих сопоставлений при обследовании других членов семьи, а также для проведения повторных исследований после получения ДНК- проб нового поколения. Обычно образцы ДНК дублируются и хранятся раздельно в двух морозильниках. Хранение ДНК обеспечивает возможность ДНК-диагностики в семьях, в которых пожилые или страдавшие наследственными заболеваниями родственники умерли до того, как стало возможным предсказательное тестирование. В случаях, когда пораженные родственники уже умерли и ДНК лейкоцитов недоступна для анализа, оказалось возможным использовать замороженную ткань мозга, взятую на аутопсии. Для радиоизотопного анализа по Саузерну обычно требуется 5—10 мкг геномной ДНК, что составляет около 2-10–18 мол. Такое количество ДНК присутствует приблизительно в 106 ядерных клеток, которые могут быть выделены менее чем из 1 мл крови, а в случае пренатальной диагностики — из биоптата ворсин хориона или из амниоцитов. Еще меньшее, крайне незначительное количество ДНК необходимо в тех случаях, когда анализу предшествует амплификация (умножение) участка ДНК-мишени с помощью недавно разработанного метода, использующего повторные циклы полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание— оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, а точнее природой его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и в первую очередь от ингибиторов Таq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами инфекционного нуклеиновой небольшого объема агента. Другой способ, кислоты, основан на с низкой концентрацией применяемый использовании для очистки нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных ингибиторов. Зная возможности и преимущества этого метода, сформулируем те направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль: — диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов, — наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях; — ПЦР — незаменимый инструмент при идентификации и молекулярно- генетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы; — ПЦР является наиболее эффективным способом выявления и изучения возбудителей сапронозов, которые, находясь во внешней среде в "некультивируемом" состоянии, способны там сохраняться, переживая неблагоприятные внешние условия в межэпидемические периоды; — ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у мед- ленно растущих и труднокультивируемых бактерий; — технология ПЦР коренным образом изменила способы маркирования штаммов для целей эпидемиологического анализа, тем самым расширив его возможности. Теперь обратимся к конкретным примерам, которые показывают, как технология ПЦР позволяет решать перечисленные выше задачи. На настоящий момент преимущество ПЦР-анализа перед "золотым стандартом" (так красиво называют культуральный метод выявления бактерий и вирусов) состоит в следующем: 1) более высокая частота обнаружения микроба, превышающая культуральный метод на 6— 7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма; 2) время, необходимое для обнаружения микроба культуральным методом, составляет около 4-6 сут., тогда как при использовании ПЦР через 4—5 ч; 3) использование технологии ПЦР позволяет проводить определение инфекционного агента в образцах, взятых неинвазивным путем. Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этой технологии для мониторинга объектов внешней среды. Помимо решения чисто прикладных задач (усовершенствование методик обнаружения возбудителей в пробах воды, почвы и т. д.) в этой области, ПЦР является важным инструментом для получения фундаментальной информации о способах поддержания жизнеспособности микроорганизмов вне связи с организмом животного или человека. За последние 5—7 лет накоплен достаточно обширный материал, свидетельствующий о способности многих видов патогенных бактерий переходить в так называемое некультивируемое состояние. Формирование некультивируемых форм бактерий сопровождается глубокими перестройками бактериальной клетки. В метаболизма результате и изменением клетки морфологии бактерий, сохраняя жизнеспособность, перестают делиться и, будучи перенесены на плотную питательную среду, не формируют колоний. Однако переход в некультивируемое состояние не является необратимым, и под воздействием изменяющихся условий внешней среды некультивируемые клетки бактерий могут восстанавливать способность к пролиферации.46 Очевидно, что некультивируемые формы бактерий нельзя выявить традиционными микробиологическими приемами, включающими посевы из исследуемых образцов на плотные питательные среды. Микроскопия с использованием витальных красителей в данном случае может служить лишь инструментом изучения формирования некультивируемых форм в лабораторном эксперименте. Показано, что переходить в некультивируемое состояние могут возбудители многих заболеваний человека. Переход в некультивируемое состояние представляет собой способ поддержания жизнеспособности в неоптимальных для активного роста условиях. Эта способность обнаруживается в первую очередь у патогенных бактерий— сапрофитов. Диагностика заболеваний, вызванных многими из подобных инфекционных агентов, успешно обеспечивается традиционными методами. Однако единственным в настоящее время методическим подходом, способным доказать присутствие в образце некультивируемых форм возбудителя, является ПЦР. При использовании такого подхода продемонстрировано, что эндемичность ряда природных очагов объясняется способностью возбудителей сапронозов сохраняться в объектах внешней среды в некультивируемом состоянии. Это положение, по нашему мнению, чрезвычайно важно для всей системы эпизоотоологического надзора, так как дает возможность, используя технологию ПЦР, выявлять потенциально опасные штаммы возбудителей сапронозов раньше, чем они попали в человеческую популяцию и вызвали эпидемиологическое осложнение. Большое значение приобретает метод ПЦР при контроле продуктов питания. Таким образом, технология ПЦР является мощным инструментом, обеспечивающим возможность фундаментального изучения хронических инфекционных заболеваний. процессов и экологии возбудителей инфекционных
