Скачать: Методические рекомендации к контролю питательных

Утверждаю
Начальник Главного управления
карантинных инфекций МЗ СССР
В.П.СЕРГИЕВ
19 февраля 1980 года
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ К КОНТРОЛЮ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ
ВВЕДЕНИЕ
Комплексная система стандартизации медицинских биологических препаратов, в том числе и
бактериологических питательных сред, предусматривает применение унифицированных методов
оценки качества готовых препаратов промышленного изготовления, а также экспериментальных
образцов на различных этапах их конструирования и испытания.
В настоящих "Методических рекомендациях" на основе обобщения опыта по контролю
питательных сред промышленного изготовления предлагаются: условная классификация
бактериологических питательных сред; биологические показатели, используемые для оценки сред;
рекомендации для выбора той совокупности показателей, которые необходимы для оценки
конкретной питательной среды в соответствии с ее назначением; описание методик оценки по всем
показателям и необходимой подготовительной работы с тест-штаммами.
Изложенными рекомендациями необходимо руководствоваться на этапе конструирования
бактериологических питательных сред, при последующих их испытаниях (авторских, комиссионных),
а также при серийном промышленном выпуске препаратов с внесением унифицированных методов
на соответствующих этапах в программы испытания и в техническую документацию.
Данные рекомендации могут быть использованы и для оценки качества питательных сред
лабораторного изготовления.
КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
По своему целевому назначению питательные среды можно условно разделить на две основные
группы: диагностические и производственные.
I. Диагностические среды
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Эта группа сред, в свою очередь, включает следующие подгруппы:
1. Среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов (жидкие, плотные) с целью
одноразового посева или длительного культивирования.
2. Среды для выделения конкретного вида возбудителя (плотные элективные, селективные).
3. Среды дифференциальные, позволяющие различать отдельные виды (группы)
микроорганизмов (плотные элективные, содержащие индикаторы, красители и т.д.).
4. Среды для идентификации, позволяющие по отдельным признакам (отношение к углеводам,
мочевине и др.) проводить идентификацию микроорганизмов.
5. Среды накопительные - для обогащения конкретного вида микроорганизмов (жидкие,
полужидкие элективные, селективные).
II. Производственные среды
К данной группе могут быть отнесены питательные среды, используемые в производственном
процессе получения медицинских биологических препаратов (бактерийных вакцин, анатоксинов и
др.) и контроле их качества.
Поскольку для получения производственных питательных сред более целесообразным является
использование не готовых сухих сред, а сухих компонентов коммерческого изготовления (белковые
основы, стимуляторы роста и др.), в данное руководство включена именно эта группа препаратов:
1. Белковые основы (пептоны, гидролизаты и т.п.), стимуляторы роста (дрожжевые и другие
экстракты).
2. Среды для контроля качества препаратов (стерильность).
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ,
ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Оценка питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей
<*> из числа нижеперечисленных, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением:
1. Чувствительность определяется по максимальному разведению
культуры,
при котором
рост.
на
всех
засеянных
чашках
(пробирках) обнаруживается
-1
-9
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Результат
) для
указывается
по
соответствующему
разведению (10
- 10
всех групп питательных сред <*>.
-------------------------------<*> Для каждого показателя указаны N (согласно N в разделе "Классификация") тех групп
препаратов, для оценки которых данный показатель является обязательным.
2. Эффективность - по выходу микробных тел с 1 мл питательной среды (в млрд./мл) - для
группы I/5 и II/1.
3. Показатель стабильности основных свойств микроорганизма - по отношению числа
атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и др. свойствам
колоний к общему числу колоний на чашках с испытуемой средой (в %) - для всех групп, кроме II/2.
4. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных признаков патогенных
микробов от непатогенных видов и естественных ассоциантов (по структурным особенностям
колоний, их окраске, изменению цвета и др. признакам) - для групп I/3, I/4.
5. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю
микрофлору. Выражается либо кратностью того минимального разведения, при котором полностью
отсутствует рост посторонней микрофлоры, либо величиной отношения числа сформировавшихся
клеток тест-штамма к расчетному количеству посеянных при соответствующем разведении клеток для всех сред I группы, кроме I/1, I/4.
6. Скорость роста - по минимальному времени инкубации после посева культур, достаточному
для их выявления (выражается в часах), - для всех групп питательных сред.
ОЦЕНКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ
Тест-штаммы культур, порядок хранения
и подготовка для контроля
Набор тест-штаммов для оценки соответствующей питательной среды авторы определяют в
процессе экспериментальной работы и рекомендуют их для контроля после проведения этапа
испытания образцов питательной среды.
Рекомендуемые для контроля свежевыделенные штаммы с момента выделения и получения их в
виде чистых культур не должны проходить более 3 - 5-ти последовательных пересевов на
питательных средах с последующим (обязательным) лиофильным высушиванием в большом
количестве ампул и представлением в ГИСК для хранения в качестве производственных штаммов.
Используемые для контроля музейные тест-штаммы получают в лиофилизированном состоянии
из ГИСК им. Тарасевича.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Лиофилизированные музейные и свежевыделенные культуры хранят при Т 4 - 6 °C.
Восстановление культур из лиофилизированного состояния проводится с использованием
жидкой <*> и плотной питательных сред, принятых для определенной группы микроорганизмов.
-------------------------------<*> В случае отсутствия первичного роста культуры на плотной среде необходимые
исследования проводят с бульонными культурами.
Рекомендуемые для контроля штаммы должны проверяться на отсутствие диссоциации по
соответствующим тестам (см. ниже). В случае необходимости проводят изучение культуральноморфологических и биохимических свойств. Тест-штаммы должны находиться в типичной для
данного микроорганизма форме. В случае, если обнаруживается более 25% полиморфных колоний,
культура не может быть использована для контроля питательных сред.
Восстановленную культуру пересевают на соответствующую среду хранения, после чего
пробирки запаивают. Полученные таким образом исходные культуры тест-штаммов хранят при Т 4 6 °C и используют по мере необходимости.
Для получения рабочей культуры исходную культуру тест-штамма из запаянной пробирки
высевают на такое количество пробирок с соответствующей средой для последующего хранения,
которое позволит обеспечить необходимый контроль питательной среды. Рабочую культуру хранят
при Т 4 - 6 °C не более 3 - 6 месяцев в условиях, предохраняющих культуру от высыхания. Для посева
на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов, прошедшие не более 2-х пассажей на
питательных средах.
Проверка тест-штаммов на диссоциацию
а) Визуальный просмотр
колоний на чашках и в микроскопе в "косонаправленном" свете.
б) Проба кипячением 2-х млрд. взвеси микробных тел агаровой культуры в физиологическом
растворе на водяной бане в течение 1 часа (учет результатов и агглютиноскопа). Взвесь культуры
должна быть гомогенной.
в) Эмульгирование агаровой культуры на стекле в 0,85% и в 4% растворах NaCl, а также в
растворе трипофлавина 1:1000 (для культур, не содержащих поверхностных К-антигенов). Культура
не должна хлопковаться.
г) Специфическая реакция агглютинации на стекле с адсорбированными агглютинирующими
специфическими сыворотками. Реакция агглютинации должна быть не менее чем на 3+.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
И СКОРОСТИ РОСТА
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Культуры тест-штаммов, выращенные на скошенном агаре, смывают физиологическим
раствором NaCl и подводят под оптический стандарт ГИСК им. Тарасевича, соответствующий 10 ед.
мутности. В тех случаях, когда не определен коэффициент пересчета микробных клеток в единицы
мутности, расчеты ведут от 10 ед. мутности по соответствующему разведению.
Из исходной стандартной взвеси готовят 10-кратные разведения путем последовательного
переноса не менее 0,5 мл культуры в 8 пробирок с 4,5 мл физиологического раствора, тщательно
перемешивая и меняя стерильную пипетку после каждого "шага".
-5
Из
взвеси
4-х
последних разведений (10
-6
, 10
-7
, 10
-8
, 10
) по 0,1 мл
из каждого вносят в 3 хорошо подсушенные чашки (пробирки) с плотной
средой
или 3 пробирки с 10 мл жидкой (полужидкой) питательной средой <*>.
-------------------------------<*> При посеве
обогащения
в
жидкие
(полужидкие)
-4
посевы производят
взвеси
из
разведений 10
питательные
-5
, 10
-6
, 10
среды
-7
, 10
по
1
мл
в каждую пробирку с 9 мл среды.
При посевах на чашки и пробирки с плотной средой взвесь культуры распределяют по
поверхности среды, используя для каждой чашки новый шпатель, а на пробирках со скошенным
агаром взвесь культуры распределяют путем обкатывания. Метод обкатки можно использовать и для
чашек. Посевы помещают в соответствующие условия выращивания.
После инкубации производят учет результатов, чувствительность среды определяют по
наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний или визуально видимый рост
на всех засеянных чашках (пробирках) с питательной средой <*>.
-------------------------------<*> При определении показателя чувствительности в жидких средах обогащения в случае
отсутствия визуально обнаруживаемого роста после соответствующей инкубации посевов из каждой
пробирки производят высев на чашки с питательным агаром, разделенным на 4 - 8 секторов, на
каждый из которых засевают по одной петле культуры из каждой пробирки с жидкой средой.
Учет результатов скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной
взвеси производят для плотных сред через 12 - 24 - 48 часов инкубации, для жидких (обогащения) через 3 - 6 и далее часов. Показатель скорости роста определяют по минимальному времени
инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый видимый
невооруженным глазом рост культуры (помутнение, наличие пленки, осадка, роста по уклону и др.)
во всех засеянных пробирках с жидкими (полужидкими) питательными средами или формирование
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках (пробирках) с плотной средой.
Определение стабильности биологических свойств культур
Определение этого показателя проводят на чашках, где выросло не менее 25 и не более 100 - 150
колоний. Изучают свойства культур, выращенных на питательных средах, по культуральноморфологическим, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим признакам. При этом
оцениваются:
а) характер роста культур (равномерное помутнение среды, формирование пленки на
поверхности среды, придонно-пристеночный рост, рост в виде осадка и др. в жидких средах.
Равномерное, зональное помутнение среды, рост по уколу, сталактитовый рост, в виде елочки в др. в полужидких средах; форма, структура, характер роста колоний, диаметр (измеряется с помощью
микрометра или циркуля-измерителя, средний диаметр вычисляется из 5-ти измерений на каждой
чашке. Диаметр колоний в популяции не должен отличаться более чем в 2 раза) - на плотных средах);
б) морфология микробов - форма (кокки, палочки, отсутствие полиморфизма в размерах, окраске
и др.):
- расположение (одиночное, парное, гроздевидное, цепочки и др.);
- строение (наличие капсулы, жгутиков, спор, включений и др.);
- подвижность;
в) серологические признаки изучают в реакции агглютинации на стекле с видовыми
(рецепторными) агглютинирующими сыворотками, с антительными диагностикумами или с
люминесцирующими сыворотками, с антительными диагностикумами или с люминесцирующими
адсорбированными сыворотками. Проверяют физико-химическое состояние клеток - стабильность
взвеси микробов (отсутствие спонтанной агглютинации) в растворе трипофлавина, в 0,85% и 4%
растворах NaCl;
г)
H S и
биохимические
свойства
(ферментация
углеводов, образование
2
индола и др.), пигментообразование;
д) фаголизабельность;
е) биологические свойства (гемолиз и др.).
Названные свойства определяют по общепринятым методикам. По п. п. "в", "г", "д" изучают не
менее чем 3 колонии с каждой чашки.
Определение дифференцирующих свойств
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Дифференцирующие свойства среды определяют по следующим тестам:
а) выраженности дифференцирующего признака - структура колоний, изменение цвета колоний
или цвета среды под колониями, ореол вокруг них, диаметр последнего, появление диффузного
изменения цвета среды;
б) четкости дифференциации колоний группы патогенных микроорганизмов от микробов
непатогенных видов, входящих в тот же систематический таксон, и от естественных ассоциантов при
посеве смесей.
Для оценки дифференцирующих свойств среды готовят смесь из штамма каждого возбудителя и
одного из штаммов непатогенных микробов. Испытывают два варианта смесей патогенного и
непатогенного микробов в отношении 1:1 и 1:10. Высев из каждой смеси производят по 0,1 мл на 3
чашки с опытной средой. Первая смесь необходима для учета четкости дифференциации, вторая - для
оценки возможности выделения единичных патогенных возбудителей из смеси с другими
микроорганизмами.
Дифференцирующие свойства сред, используемых для идентификации чистых культур,
определяют качественно набором штаммов с положительными и отрицательными признаками по
соответствующим тестам.
Определение показателя ингибиции
Ингибирующие свойства среды определяются как по отношению к патогенной флоре, так и по
отношению к микробам-ассоциантам.
При определении показателя ингибиции в отношении микробов-ассоциантов посевная доза
этих микробов должна превышать посевную дозу патогенной флоры в 10 раз для слабо элективных и
в 100 раз (и более) для селективных сред. Смесь готовится путем соединения 1 мл взвеси,
содержащей в посевной дозе 100 микробных клеток возбудителя, и 1 мл взвеси одного из микробовассоциантов, содержащего 1000 и 10000 м.к. Из указанных смесей производят высев по 0,1 мл на 3
чашки (каждый штамм смешивается с патогенным возбудителем отдельно).
Ингибирующее действие жидких селективных (элективных) питательных сред обогащения
определяют по отношению к патогенной и к соответствующей непатогенной микрофлоре с
использованием монокультур и их смеси. С этой целью по 1 мл взвеси, содержащей 10, 100 и 1000
м.к. чистой культуры патогенного, 1000, 10000 м.к. (и более) чистой культуры непатогенного
микробов, вносят в три параллельные пробирки (с 10 мл среды) каждого разведения. Одновременно
в 3 пробирки с 10 мл испытуемой среды вносят это же количество микробных клеток патогенного
возбудителя в смеси с 1000, 10000 и 100000 м.к. непатогенного микроба. Через 3 - 6 и более часов
инкубации производят высев из каждой пробирки с посевами чистых культур и из смесей по 0,1 мл
на чашки с соответствующей средой для последующей идентификации и через оптимальный срок
инкубации учитывают результат (аналогично тому, как для плотных сред).
Определение показателя эффективности
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
а) Оценку качества белковых основ по показателю эффективности на моделях жидкой
питательной среды производят путем определения концентрации микробной взвеси в среде через
соответствующий срок инкубации по изменению показателя оптической плотности (на
спектрофотометре или ФЭКе).
б) На модели плотной питательной среды эффективность определяют по следующей методике:
18 - 20-часовую культуру смывают с плотной среды физиологическим раствором хлористого натрия и
взвесь доводят до 10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича. Полученную взвесь
разводят физиологическим раствором в 2 раза, что соответствует приблизительно 500 млн.
микробных тел в 1 мл (5 ед. стандарта). 0,1 мл этого разведения засевают на 2 пробирки со
скошенным испытуемым агаром (скашивают таким образом, чтобы в нижней части пробирки не
было столбика). Через 20 часов роста при 37 °C культуры смывают с поверхности агара 2,5 мл
физиологического раствора. Добавление физиологического раствора, которое пошло на это
разведение, плюс 0,5 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и составят выход микробных
тел (в млрд.) с 1 мл среды.
Пример:
2,5 мл физиологического раствора смывают культуры с 5 мл питательного агара. Следовательно,
на 1 мл питательного агара приходится 0,5 мл взвеси культуры. Для разведения 0,5 мл взвеси
культуры до содержания 1 млрд. микробных тел (10 ед. стандарта) пошло 3,2 мл физиологического
раствора. Следовательно, в пробирке будет содержаться 3,2 мл физиологического раствора плюс 0,5
взвеси культуры, т.е. всего 3,7 мл. Выход микробных тел с 1 мл среды составит соответственно 3,7
млрд. м.к.
в) В жидких (полужидких) средах обогащения определение накопительного эффекта проводят по
следующей методике:
Разведение соответствующих тест-штаммов проводят по методике,
описанной
-4
5
-
-6
для определения чувствительности. Из разведений культур в 10
10 ,
, 10
,
-7
10
до
жидкой
1
(полужидкой)
разведения
мл
взвеси
испытуемой
производят высев
питательным
агаром для
посевной
из
по
0,1
определения
дозе, необходимого
возбудителя в
для
каждого вносят в 3 - 5 пробирок с 10 мл
средой.
Параллельно
из
каждого
мл взвеси культуры на 3 - 5 чашек с
числа
жизнеспособных микробных клеток в
последующего
вычисления
прироста
средах обогащения.
После соответствующей инкубации посевов в среде обогащения (3 - 6 и более часов),
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
независимо от видимых ее изменений, из каждой пробирки производят высев на чашки с
питательным агаром (по 0,1 мл на чашку). В случае обильного роста культуры в жидкой среде ее
перед посевом на чашки необходимо развести. Степень разведения учитывают при обсчете
результатов.
Через 18 - 20 и более часов инкубации производят подсчет сформировавшихся колоний на
чашках, засеянных из исходных взвесей культур и из жидких сред обогащения.
Прирост числа микроорганизмов при размножении в среде обогащения в процессе инкубации
посевов в течение соответствующего времени (t) определяют по формуле (в %):
n
- n
t
o
J = ------- x 100,
n
t
где:
n - число колоний на чашках, засеянных из жидких сред после
инкубации;
t
n
- число колоний при высевах исходных взвесей культур.
o
В процессе отработки методов контроля следует шире использовать методы статистической
обработки данных при определении количественных величин для показателей (определение средних
величин, средних квадратичных отклонений, вычисление коэффициента вариации, определение
доверительных интервалов и статистической значимости разницы средних величин на контрольной
и опытных средах).
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.