Эфирный фосфолипид PNAE против опухолевых клеток

Индржик Кара, др.н.
Эфирный фосфолипид PNAE против опухолевых клеток:
Профилактика и лечение метастазов
Нетоксичный эфирный фосфолипд PNAE, ингибитор протеинкиназы С с
селективным противоопухолевым эффектом и воможность профилактики и
лечения метастазов у пациентов с колоректальной карциномой.
© Jindrich Kara, 2000
Обложка © Studio Tyfo, 2000
1
Содержание
1.1. Протеинкиназа С (PKC) - свойства, изоферменты, локализация в клетке
1.2. Активация протеинкиназы С форболовыми диэфирами - промоторами
опухолевого роста
1.3. Протеинкиназа С и увеличение способности опухолевых клеток к
метастазированию. Повышенная активность PKC в опухолевых клетках человека
2.1. Эфирные фосфолипиды с противоопухолевым эффектом ингибируют
активность протеинкиназы С и вызывают селективное разрушение мембран
опухолевых клеток.
2.2. Индуцирование апоптоза в опухолевых клетках фосфолипидами
3. Профилактика метастазов экспериментальных опухолей с помощью
фосфолипидов, синтетических препаратов (CAI, Cicaprost) и ингибиторов
ангиогенеза
4. Гены, контролирующие способность опухолевых клеток к метастазированию
5.1. Натуральный нетоксичный эфирный фосфолипд PNAE (плазманил-(N-ацил)этаноламин), его химическая структура, противоопухолевая активность in vitro и
in vivo и механизмы действия
5.2. Фармакокинетика и метаболизм 14C-PNAE(s) in vivo
5.3. Новая технология производства содержащего PNAE препарата ОВОСАН
5.4. Возможность профилактики метастазов в печень у пациентов после
оперативного лечения колоректальной карциномы с помощью длительного
перорального применения препарата, содержащего PNAE. Возможность
сочетания местной гипертермии и инъекционного введения PNAE в лечении
метастазов: дальнейшие перспективы
Список литературы
2
1.1. Протеинкиназа С (PKC) - свойства, изоферменты, локализация в клетке
Протеинкиназа
С
характеризуется
была
как
открыта
Я.Нишизукой
протеолитически
и
коллегами
активируемая
киназа
в
(1).
1977
Эти
и
же
исследователи в дальнейшем характеризовали ее как кальций-активируемую и
фофолипид зависимую протеинкиназу (2). Два других значительных октрытия
показали важность протеинкиназы С в трансдукции сигнала внутри клетки,
активацию
PKC
1,2-дацилглицеролом
и
связь
PKC
с
метаболизмом
фосфатидилинозитола (3), ее функции как рецептора форболовых диэфиров,
активаторов опухолевого роста (4).
Активная протеинкиназа С локализуется в основном в клеточной мембране, а
также в цитоплазме и ядре клетки. В этих структурах PKC катализирует
фосфорилирование клеточных протеинов, что приводит к важным биологическим
изменениям, пролефирации, дифференциации клеток, а также индуцирует
злокачественный фенотип.
Диацилглицерол,
который
стимулирует
ферментативную
активность
протеинкиназы С в присутствии фосфатидилсерина и ионов Ca2+, образуется в
клетке
в
процессе
гидролиза
фосфатидилинозитол-4,5-бис-фосфата.
Как
установили М.Дж. Берридж и Р.Ф.Ирвин (5), важным продуктом этой реакции
является инозитол-1,4,5-трифосфат, который в клетках выпускает ионы Ca2+ из
эндоплазматического
ретикулума.
Другой
продукт
гидролиза
фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата - это 1,2-диацилглицерол. Посредством
1,2-диацилглицерола
система
метаболизма
фосфатидилинозитол-1,4,5-
трифосфата и Ca2+ связана с активацией PKC и
фосфорилированием
клеточных протеинов (3). Эти ферментные системы играют важную роль в
регулирование пролиферации клеток (внутриклеточная сигнальная функция), и
они активируются онкогенезом в процессе злокачественных трасформаций в
клетке (63).
В процессе изуцения протеинкиназы С, особенно с помощью клонирования ее
генов (cDNA-PKC) (7,8,9), было установлено, что протеинкиназа С формирует
группу из десяти изоферментов, названных греческими буквами PKC α, βI, βII, γ,
δ,
ε,
η,
ζ,
θ,
характеристикам,
ϕ.
Эти
различной
изоферменты
экспрессии
3
различаются
их
генов
в
по
молекулярным
разных
тканях
и
внутриклеточной локализации (6). Из этой семьи протеинкиназ С наиболее часто
в клетках экспрессируются изоферменты α, βI, βII, и γ (6, 11). И.Б.Вайнштайн и
др.
(10) показали, что
онкогенами
ras,
src
и
изменение
эмбриональных фибробластов крысы
изменило
fos
экспрессию
некоторых
изоформов
протеинкиназы С. Более подбробное описания регуляции изоферментов PKC
представлено в Г.С.Блоб, Л.М.Обайд и И.А.Ханнум (11). Усиленная экспрессия α
изоферментов PKC была обнаружена в опухолевых клетках, устойчивых к
химиотерапии, особенно в клетках MCF-7 (устойчивая к различным лекарствам
линия клеток карциномы молочной железы человека) (12).
1.2. Активация протеинкиназы С форболовыми диэфирами - промоторами
опухолевого роста
Особенно интересными активаторами протеинкиназы С являются форболовые
эфиры, натуральные продукты растения Croton tiglium, которые изучались как
промоторы
(активаторы
роста)
эпителиом
у мышей,
где
они
ускоряли
пролиферацию опухолевых клеток, трансформированных канцерогеном (15).
Оказалось,
что
форболовый
диэфир,
форбол
миристат-ацетат
(PMA),
специфически связывается с протеинкиназой С и, таким образом, значительно
увеличивает ферментативную активность PKC (13, 15). Протеинкиназа С в этом
случае служит рецептором для PMA. Комплекс PKC + форбол-12,13-дибутират
(3H) был изолирован в процессе очищения протеинкиназы С из мозга крысы (13)
как прямое доказательство связывания форболового диэфира с протеинкиназой
(15). Интересно, что форболовые диэфиры могут вызывать диференциацию
клеток лейкемии человека из линии HL60, и эта диференциация может быть
блокирована
бриостатином
(макроциклическим
лактоном,
выделенным
из
морских водорослей) (15).
Эти эксперименты показывают, что протеинкиназа С играет ключевую роль в
диференциации клеток лейкемии человека HL60. Вероятно, таким же образом, то
есть путем активации PKC, следовые концентрации алкил-фосфолипидов также
могут
индуцировать
дифференциацию
клеток
HL60
в
гранулоциты,
как
экспериментально доказали И.Хонма и другие (14).
Т.П.Томас,
Х.С.Талвор
и
В.Б.Андерсон
тетрадеканоилфорбол-13-ацетат
(опухолевый
4
(16)
наблюдали,
промотор)
может
что
12-0-
вызывать
связывание протеинкиназы С с клеточными ядрами в клетках NIH-3T3. Авторы
предполагают, что связь протеинкиназы С с клеточными ядрами нормальных
клеток NIH-3T3 может привести к
фосфорилированию клеточных белков как
субстратов протеинкиназы С. Изолированные ядра клеток лейкемии HL60
содержат более ферментативно активную PKC в сравнении с изолированными
ядрами
NIH-3T3, и воздействие форболовых диэфиров на клетки HL60
не
повысило активность PKC в ядрах этих клеток лейкемии. Авторы пытаются
объяснить сложный вопрос
различных биологических ответов здоровых и
больных лейкемией клеток на воздействие форболовых диэфиров. Нет
сомнений, что протеинкиназа С и ее локализация в клетке играют значительную
роль в механизме дифференциации клеток лейкемии человека HL60.
1.3. Протеинкиназа С и увеличение способности опухолевых клеток к
метастазированию. Повышенная активность PKC в опухолевых клетках
человека.
Протеинкиназа С - критический фермент в регуляции клеточного роста.
Свидетельством этого является высокая экспрессия PKC в опухолевых клетках,
а также в метастазах опухоли. С.А.Обрайен и др. (17) изучая ферментативную
активность PKC в хирургических образцах карциномы молочной железы и
здоровой ткани молочной железы тех же пациентов, установили, что совокупная
ферментативная активность изоферментов PKC в опухолевых тканях была
многократно выше в сравнении с здоровыми тканями (17). Авторы предполагают,
что
изоферменты
отличаться
от
PKC,
экспрессируемые
изоферментов
в
PKC
в
опухолевых
здоровых
тканях,
клетках,
и
с
могут
помощью
моноклональных антител могут использоваться как маркеры в диагностике
карциномы молочной железы.
Б.Коржак,
С.Вейл
и
Р.С.Кербел
(18)
опубликовали
эксприментальные
доказательства того факта, что высвобождение ионов Ca2+
под действием
ионофора A23187 в линии клеток аденокарциномы молочной железы мышей
SP1, растущей подкожно, и активация протеинкиназы С форбол-12-миристат-13ацетатом индуцирует повышенную способность этих клеток к метастазированию.
Обе эти сигнальные системы (мобилизация внутриклеточных ионов Ca2+
и
активация PKC) увеличивают независимо друг от друга способность клеток SP1
к метастазироанию в легкие подопытных мышей (18). Авторы также установили,
5
что клетки индуцированных таким образом метастазов манифестировали
генетически фиксированную способность к метастатической активности. Это
открывает вопрос об идентификации генов, ответственных за способность
опухолевых клеток к метастазированию и факторов, являющихся причиной
экспрессии этих генов (подробнее см. в 4). Р.Гопалакришна и С.Барски (18b)
продемонстрировали в модели меланомы мыши B16, что
линии опухолевых
клеток показывают более высокую ферментативную активность протеинкиназы
С, связанной с клеточной мембраной, чем подлиния опухолевых клеток со
слабой
метастатической
активностью,
в
то
время
как
ферментативная
активность PKC в цитозоле этих клеточных линий не отличается (18b). Эти
результаты показывают, что связь PKC с клеточной мембраной опухолевых
клеток увеличивает метастатический потенциал этих клеток.
Авторы
Дж.А.Дюмон,
В.Д.Джонс
и
А.Дж.Битонти
(19)
установили,
что
экспериментальные метастазы клеток меланомы мыши B16F1 подавляются
ингибиторами протеинкиназы С, а именно синтетическим препаратом
27,032
или
(4-пропил-5-(пиридинил)-2-(3H)-оксазолон)
MDL
стауроспорином
.
Препарат MDL 27,032 также значительно уменьшал адгезию клеток B16F1 к
фибриногену и коллагену в пластиковых тарелках. Авторы пришли к выводу, что
фосфорилирование протеиновых рецепторов на поверхности опухолевых клеток,
катализируемое протеинкиназой С, играет критическую роль в способности этих
опухолевых клеток формировать метастазы. В этом случае это также вопрос
ферментативной
активности
PKC,
связанной
с
клеточными
мембранами
опухолевых клеток.
Американские авторы В.Лю, Р.Дж.Маер, И.А.Ханнум, А.Т.Портер и К.В.Хонн (20)
опубликовали экспериментальные результаты, подтверждающие факт, что 12(s)гидроксиэйкозатриеновая
ненасыщенная
жирная
кислота
(12(S)HETE)
увеличивает метастический потенциал клеток опухоли простаты крыс Duning
R3327 путем активации протеинкиназы С. Авторы предлагают использовать 12липоксигеназу
(продуктом
которой
является
12(S)HETE)
и
ферменты
протеинкиназы С в качестве целевых ферментов для поиска веществ,
блокирующих эти ферменты, что могло бы использоваться для подавления
метастазов опухоли простаты у человека.
6
Напротив, омега-3 ненасыщенные жирные кислоты (эйкосапентаеновая и
докосагексановая кислота), содержащиеся в рыбьем жире и добавляемые с едой
бестимусным лысым мышам с пересаженными клетками опухоли молочной
железы человека MDA-MB-435, подавляли рост и метастазы этих клеток в легкие
подопытных животных (20b). Ингибиторный эффект этих омега-3 жирных кислот
на метастазирование опухолевых клеток в данной модели авторы объясняют
ингибированием биосинтеза 12-гидроксиэйкосапентаеновой кислоты (20b).
В связи с этим следует отметить, что докосагексановая кислота очень
значительно увеличивала проницаемость опухолевых клеток T24A (мышиная
лейкемия) и, таким образом, может иметь прямой противоопухолевый эффект
(20c).
2.1. Фосфолипиды с противоопухолевым эффектом уменьшают
активность протеинкиназы С и вызывают селективное разрушение
мембран опухолевых клеток.
Противоопухолевое
множестве
действие
публикаций
эфирных
(21-35).
фосфолипдов
Чаще
всего
было
объектом
описано
изучения
во
был
синтетический аналог лизофосфатидилхолина (лизолецитина) 1-0-октадецил-2метокси-rac-глицеро-3-фосфохолин
(ET-18-OCH3
)
(21-28).
Этот
препарат
селективно разрушает опухолевые клетки, и его действие выражается в
разрушении мембран этих клеток, как было доказано с помощью электронной
микроскопии (24-26). Препарат ET-18-OCH3
(Эделфозин) также повышает
иммунологическую защиту организма, активирует противоопухолевую активность
макрофагов и имеет значительный эффект в борьбе с метастазами опухоли в
экспериментальной модели (21-24, 48).
Другой синтетический аналог лизолецитина, тиоэфир 1-гексадецилмеркапто-2метоксиметил-rac-глицеро-3-фосфохолин,
имеет схожие противоопухолевые
эффекты (BM 41.440, Ilmofosine) (28). Также были изготовлены другие
синтетические аналоги фосфатидилхолина с противоопухолевым эффектом (27,
32).
Клинические
испытания
этих
препаратов,
особенно
Эделфозина
и
Илмофозина, доказали их терапевтический эффект (27, 28, 50), но также и
побочные токсические эффекты для организма, которые ограничивают их
клиническое применение.
7
Открытие
нового
алкил-фосфолипида
с
селективной
противоопухолевой
активностью (29), 1-0-алкил-2-ацил-sn-глицеро-3-фосфo-(N-ацил) этаноламин
(PNAE), который является натуральным производным фосфатидилэтаноламина
и не имеет каких-либо побочных токсических эффектов на организм во время
перорального, а также парентерального назначения (29-35), открывает новые
переспективы
клинического
использования
этого
нетоксичного
эфирного
фосфолипида, особенно в профилактике и лечении метастазов опухолей
человека в различных органах, в перую очередь, в печени (33, 35). В отличие от
синтетических препаратов (ET-18-OCH3 и BM 41.440), которые представляют
сместь рацемических стереоизомеров, препарат PNAE (также PNAE(s)) имеет
естественную стереоконфигурацию и не содержит в структуре молекулы какиелибо ненатуральные группы. Поэтому PNAE и его метаболиты не токсичны для
организма, что особенно хорошо для долгосрочного перорального применения и
профилактики метастазов опухоли у человека (33, 35). Разработка и создание
полусинтетических
PNAE(s)
описана
в
противоопухолевой
активности
PNAE(s)
in
(30,
vitro
34,
и
35),
in
сведения
vivo
(30,
о
31),
фармакокинетике и метаболизме in vivo были опубликованы (подробее в части
5).
Механизм противоопухолевой активности эфирных фосфолипидов, которая
проявляется в разрушении мембран опухолевых клеток (24-26, 30, 35), не
выяснен окончательно до настоящего момента, но с уверенностью можно
сказать, что он включает ингибиторный эффект эфирных фосфолипидов на
протеинкиназу С в опухолевой клетке. Все изученные эфирные фосфолипиды
подавляют ферментную систему PKC (36-39). Алкил-диглицериды, которые могут
возникать как продукты распада алкил-фосфолипидов в организме (41), также
подавляют активность протеинкиназы С (40, 41). Л.В.Даниель и др. (40)
установили, что синтетичские 1-0-алкил-2-ацил-диглицериды, а также 1-0алкенил-2-ацил-диглицериды (с ненасыщенной алифатической цепочкой в
положении 2-0- на глицероле), тоже были эффективными ингибиторами
протеинкиназы С. Эта информация также была подтверждена голландскими
исследователями (41) путем точного анализа продуктов распада препарата ET18-OCH3.
Также ингибитором протеинкиназы С является синтетический
противоопухолевый препарат гексадецилфосфохолин (42).
8
Ингибирование ферментативной активности PKC, очевидно, самый важный пункт
в механизме противоопухолевой активности эфирных фосфолипидов. Также
препараты PNAE подавляют ферментативную активность протеинкиназы С,
частично очищенной из клеток мозга мыши (39). Конкуретное ингибирование PKC
полусинтетическим
препаратом
PNAE(s)
было
обнаружено
в
отношении
фофатидилсерина, который активирует протеинкиназу С (39). Это свойство
нетоксичного эфирного фосфолипида PNAE(s) также играет значительную роль
в использовании препарата для профилактики метастазов опухоли.
Другие вещества с противоопухолевой активностью, которые используются в
клинической терапии рака,
также подавляют протеинкиназу С, например,
Тамоксифен (43), Адриамицин (44), Калфостин С (47). Таким образом,
ингибирование PKC - один из важных механизмов противоопухолевой активности
этих веществ, а также всей группы эфирных фосфолипидов. Следует отметить,
что протеинкиназа С ингибируется также неорганическими соединениям селена,
диоксидом селена и селеновой кислотой (89).
Кроме ингибирования протеинкиназы С, эфирные фосфолипиды оказывают
ингибирующее действие на систему фосфорилиования инозитол фосфатов и на
активацию
цитоплазматических
ионов
кальция
(60,
62-64).
Г.Поуис
и
Д.С.Альбертс в обзорной статьк (63) оценивают важность подавления этих
внутриклеточных сигнальных систем с помощью фосфолипдов как стратегии
химической профилактики рака. Клеточные мембраны опухолевых клеток с
ферментными системами, связанными с этими клеточными структурами, в
последнее время были объектом пристального интереса при разработке новых
противораковых лекарств (65, 66).
Сочетание уничтожающих опухолевые
липосомами
фосфолипида
(51)
уменьшает
ET-18-OCH3.и
клетки
токсические
улучшает
эфирных фосфолипидов с
побочные
эффекты
возможности
эфирного
терапевтического
применения этого эфирного фосфолипида. Сходным образом аrа-С конъюгат
тиоэфирного фосфолипида, препарат Цитопрос (ara-CDP-1-S-октадецил-2-0пальмитоил-тиоглицерол) эффективен против экспериметальных метастазов
опухоли у крыс (52).
9
2.2. Индуцирование апоптоза в опухолевых клетках эфирными
фосфолипидами.
Эфирные фосфолипиды индуцируют апоптоз в клетках лейкемии человека, но не
в здоровых клетках костного мозга (57, 58). Апоптоз (запрограммированная
смерть клетки) - это суть естественного старения и смерти клеток в организме
(68). Апоптоз - это форма сметри клетки, характеризующаяся морфологическим и
биохимическим изменениями, такими как конденсация хроматина, фрагментация
ДНК, вызванная активацией эндонуклеаз (57, 58, 69). Стимулы, которые
увеличивают текучесть клеточных мембран опухолевых клеток (например,
гипертермия или 5% этанол) (70), или действие эфирного фосфолипида ET-18OCH3 (57, 58), могут индуцировать апоптотическую смерть опухолевой клетки.
Эфирные фосфолпиды индуцируют апоптоз только в опухолевых клетках, но не
в физиологически здоровых клетках (58). Есть некоторые регуляторные гены в
клетках,
экспрессия
которых
может
подавлять
апоптопическую
смерть
(например, митохондриальный протеин Bcl-2) (58, 71, 72). Очевидно, все
противоопухолевые эфирные фосфолипиды индуцируют апоптоз в опухолевых
клетках. М.Модолелл и др. (58) на основании своих экспериментов заключили,
что индуцирование апоптоза эфирным фосфолипидом ET-18-OCH3 включает в
себя три основные стадии:
а) связывание эфирного фосфолипида на поверхности клеточной мембраны;
b) включение эфирного фосфолипида в клетку;
c) запуск сигнального механизма для апоптоза, который может быть прерван
повышенной концентрацией протеина Bcl-2.
Фактические параметры могут
различаться в разных типах опухолевых клеток. Это объясняет разницу в
чуствительности опухолевых клеток к цитотоксическому действию эфирных
фосфолипидов.
Устойчивость опухолевых клеток к некоторым цитостатикам может быть
устранена ингибированием протеинкиназы С (45). В соответствии с этими
заключениями находится и факт, что сочетание тиоэфирного фосфолипида BM
41.440 с cis-диаминдихлор-платиной усиливает цитотоксическое действие на
опухолевые клетки (37).
10
Селективный ингибитор протеинкиназы С, препарат CGP-41251, производный
антибиотика стауспорина (109), доказал противоопухолевую активность in vivo
против клеток опухоли мозга человека (глиобластом) в модели бистимусных
мышей при пероральном и внутривенном применении (110). CGP 41251
индуцирует апоптоз в этих опухолевых клетках, и препарат
CGP 41251
считается клически используемым для терапии опухолей мозга (110). В
последнее время ингибиторы протеинкиназы С изучались в модели клеток
астроцитомы
человека
с
целью
использовать
селективные
ингибиторы
протеинкиназы в терапии злокачественных опухолей мозга (88, 111).
3. Профилактика метастазов экспериментальнх опухолей с помощью
фосфолипидов, синтетических препаратов (CAI, Cicaprost) и ингибиторов
ангиогенеза
Колоректальные карциномы и их метастазы в печень и другие органы являются
причиной высокой смертности от этого распространненого типа карциномы. Даже
после хирургического удаления первичной опухоли метастазы в печени
появляются у 90% пациентов. Цитостатическое лечение метастазов в печени
(внутривенное
введение
или
местная
инфузия
флуорорацила
и
других
цитастатиков) не очень эффективно и не увеличивает заметно время выживания
пациентов.
Хирургически
удалить
метастазы
сложно
и,
в
случае
с
микрометастазами, невозможно. Поиск пути предотвращения возникновения
метастазов опухоли в печень - насущная исследовательская проблема, важная
для спасения жизней пациентов.
После операции по поводу колоректальной карциномы большое количество
опухолевых клеток циркулирует в системе кровообращения пациента (59).
Многие из этих клеток погибают благодаря механизмам имунной защиты
организма, но некоторые, в конце концов, оседают в печени и формируют
метастазы. Каскад метастатических процессов, через которые клетки проходят
во время возникновения метастазов, детально описан И.Дж.Фидлером (73).
Для роста вторичных опухолей (метастазы) необходимо формирование новых
капилляров в опухолевой ткани (ангиогенез) . Капилляры
приносят с кровью
питательные вещества необходимые для роста опухолевых клеток. Таким
образом, важным аспектом профилактики метастазов является исследование
11
ингибиторов ангиогенеза (74-77). Ингибиторное действие ингибитора ангиогенеза
TNP-470 на рост метастазов карциномы человека в печени BALB/c (лысые мыши)
было подтверждено на экспериментальной модели клеток колоректальной
карциномы человека, пересаженных бестимусным мышам (лысые мыши BALB/c )
(77). Кроме ингибиторов ангиогенеза, для профилактики метастазов необходимо
искать
другие
нетоксичные
вещества,
подходящие
для
перорального
применения. Недавно в рамках исследования по профилактике метастазов в
США были синтезированы ингибиторы инвазивности и диссеменации опухолевых
клеток. Они уже клинически протестированы. Это, например, карбоксиамидотриазол (CAI), синтетический ингибитор ионов Ca2+, передающих сигнал в
опухолевой
клетке,
что
обратимо
подавляет
ангиогенез,
пролиферацию
опухолевых клеток и их метастатический потенциал (93,94). CAI назначается
перорально, и его клинические испытания проходят в настоящий момент (94, 95).
С помощью блокирования проникновения ионов Ca2+в опухолевую клетку через
кальциевые
каналикули
CAI
также
подавляет
синтез
матриксных
металлопротеиназ и, таким обзразом, он снижает их инвазивность (95).
Синтетический
аналог
простациклина,
препарат
Цикапрост
(компании
А.Г.Шеринг, Берлин) (96, 97) подавляет метастазы карциномы молочной железы
SMT2A и карциномы простаты в модели на крысах. Его пероральное применение
у людей было фармакологически протестировано (97) и дает возможность
клинического использования. Цикапрост метаболически более устойчив, чем
простациклин, противометастатичекое действие которого уже было исследовано
в 1981 (98, 99).
12
4. Гены, контролирующие способность опухолевых клеток к
метастазированию
Критическая важность метастазов для судьбы раковых больных буквально
вынуждает исследователей изучать патогенез метастатического процесса.
Новые знания в этой сфере могут улучшить лечение и профилактику метастазов.
В последние несколько лет
были приложены огромные усилия к изучению и
идентификации генов, контролирующих метастазы опухолевых клеток (78-85).
С.Е.Эган и др. пришли к выводу, что метастатический фенотип опухолевой
клетки индуцируется онкогенезом с помощью активности протеинкиназы (79).
Клетки рака молочной железы крыс экспрессировали повышенную способность к
метастазированию после трансфекции онкогена H-ras (80).
Недавно был обнаружен ген nm23, который был идентифицирован как ген,
подавляющий процесс метастазов (82, 83, 86). Низкая экспрессия этого гена
приводила к возникновению опухолевых клеток рака молочной железы человека
с высоким метастатическим потенциалом (86). Метастазы опухоли, несомненно,
контролируются конкретными генами (82-84,87).
В наши изучение гена nm23 уже дает шанс на селективное ингибирование клеток
рака молочной железы человека с высокой способностью к метастазированию
(87).
5.1. Натуральный, нетоксичный фосфолипд PNAE (плазманил-(N-ацил)этаноламин), его химическая структура, противоопухолевая активность in
vitro и in vivo и механизмы действия
Информация об открытии нового нетоксичного алкил-фосфолипида PNAE
(плазманил-(N-ацил)-этаноламин) с противоопухолевой активностью, выделенного из
ишемических
тканей
эмбриона
цыпленка
и
из
биопрепарата
cACPL
(неочищенный противораковый фосфолипид) уже опубликована (29, 30, 35).
Этот
алкил-фосфолипид,
выделенный
из
упомянутого
биологического
материала, был хроматографически очищен на колоннах из силикагеля, а также
предварительной хроматографией на тонком слое силикагеля. Химическая
13
структура нового фосфолипида изучалась с помощью хроматографического
анализа
распада
продукта
после
ферментативного
гидролиза
алкил-
фосфолипида PNAE фосфолипазой С из клеток Bacillus cereus, после гидролиза
фосфолипазой D, и далее с помощью двухмерной хроматографии на тонком
слое
силикагеля,
с
помощью
инфра-красного
спектра
и
масс-
спектрометрического анализа (29). Противоопухолевая активность чистого
алкил-фосфолипида PNAE была протестирована на тканевых культурах клеток
опухоли человека (линия HEp-2 a T24) с помощью количественного измерения
включения
радиоактивного
тимидин-3H
в
клеточную
ДНК
при
растущих
концентрациях PNAE в микрограммах в 1 мл препарата тканевой культуры (29).
Новый фосфолипид был идентифицирован как 1-0-алкил-2-ацил-sn-глицеро-3-фосфo-(N-ацил)-этаноламин, или плазманил-(N-ацил)-этаноламин (PNAE)
(29).
Структура основного вида молекулы PNAE - 1-0-октадецил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-(N-пальмитоил)-этаноламин (29, 30) (Рис. 1).
Рис. 1:
1-0-алкил-2-ацил-sn-глицеро-3-фосфо-(N-ацил)-этаноламин или плазманил-(Nацил)-этаноламин, (PNAE) (Кара и др., 1986).
R-октадецил; R'-CO-oleoyl; R''-CO-palmitoyl
Алкил-фосфолипид PNAE показывает селективную цитолитическую активность
на линиях опухолевых клеток человека HEp-2 и T24 (карцинома желчного пузыря
человека) в тканевых культурах в концентрации 50мкг PNAE/мл и ингибирует
пролиферацию этих опухолевых клеток даже в концентрации 2мкг PNAE/мл, но
не ингибирует биосинтез ДНК в нормальных клетках в концетрации в 50 раз
выше в тканевой культуре фибробластов человека (29, 30), (Рис. 2). Эта
замечательная селективная активность PNAE только против раковых клеток
14
означает отличный терапевтический индекс PNAE и его нетоксичность для
организма.
Рис. 2:
Селективное противоопухолевое действие алкил-фосфолипида PNAE на клетки
опухоли человека HEp-2 в культуре без цитостатического действия на
диплоидные фибробласты человека (линия LEP) в таких же условиях в
параллельном эксперименте.
Клетки HEp-2 и клетки LEP инкубировались на микропластинах с культурой в
среде, содержащей обозначенную концентрацию алкил-фосфолипида PNAE, в
течение 48 часов. После удаления среды с PNAE был измерен тимидин-6-3H в
ДНК клеток HEp-2 и клеток LEP. Пролиферация опухолевых клеток HEp-2 была
остановлена при концентрации PNAE в 12,5мкг/мл, в то время как рост
нормальных фибробластов LEP не был остановлен алкил-фосфолипидом PNAE
даже при концентрации в 10 раз выше (125 мкг/мл).
1 - включение тимидина-6-3H в ДНК опухолевых клеток HEp-2
2 - включение тимидина-6-3H в ДНК фибробластов LEP
Саркома мыши Mc11 и саркома Крокера S 180, растущие in vivo, в значительной
степени подавляются алкил-фосфолипидом PNAE (29-31), рост карциномы
прямой кишки человека, устойчивой к флороурацилу, у бестимусных лысых
мышей также
был значительно ингибирован подкожными дозами в 4,5 мг
PNAE/мышь в течение 21 дня (П.Поукова и другие) (100).
Как и синтетические алкил-фосфолипиды, аналоги лизофосфатидилхолина (2426), алкил-фосфолипид PNAE вызывает селективное разрушение клеточных
мембран
клеток
опухоли
человека
(30,
35).
В
сотрудничестве
с
др.
З.Пелцбауером (Институт Макромолекулярной Химии, Чешская Академия Наук,
Прага) и с помощью электронной сканирующей микроскопии деструктивное
15
действие алкил-фосфолипида PNAE на клеточные мембраны клеток опухоли
человека HEp-2 было показано после 24-48 часов инкубации этих клеток в
тканевых культурах при 50 мкг PNAE/мл (30, 35), (см. Рис. 3, 4, 5).
Селективное действие алкил-фосфолипида PNAE на мембраны опухолевых
клеток было также подтверждено др. А.Котик (Институт Физиологии, Чешская
Академия Наук, Прага), который со своими коллегами экспериментально доказал
увеличение проницаемости клеточных мембран клеток опухоли, подвергшихся
действию
алкил-фосфолипида
маркированной радиоизотопом
PNAE.
Диффузия
2-деоксил-D-глюкозы,
3
H, через мембраны обработанных клеток
значительно возросла по сравнению с контрольными опухолевыми клетками,
которые не инкубировались в присутствии PNAE. Проницаемость клеточных
мембран
физиологически здоровых клеток в таких же условиях инкубации с
PNAE не изменилась (101, 102). Важную роль в противоопухолеовом и
противометастатическом действии PNAE может играть и ингибиторное действие
PNAE
на
ферментативную
активность
протеинкиназы
С,
которое
было
экспериментально подтверждено (39). С учетом важности протеинкиназы С для
способнотси опухолевых клеток к метастазированию (11, 18, 19), длительное
воздействие in vivo алкил-фосфолипида PNAE на протеинкиназу С опухолевых
клеток
может
диссеменации
иметь
значительный
опухолевых клеток
в
профилактический
организме
и
эффект
против
против
возникновения
метастазов, особенно в печени, где PNAE аккумулируется больше всего после
многократного применения (33), (см. Таб. 1).
Рис. 3:
Сканирующая электронная микрофотография опухолевой клетки человека HEp-2
в тканевой культуре. Микроворсинки на поверхости клетки, типичные для живой
клетки.
16
Рис. 4:
Сканирующая электронная микрофотография клетки HEp-2, обработанной PNAE
(50 мкг/мл) в течение 24 часов. Можно увидеть отверстия в клеточной мембране.
Рис. 5:
Сканирующая электронная микрофотография клетки HEp-2 обработанной PNAE
(50 мкг/мл) в течение 48 часов в культуре. Клеточные мембраны значительно
повреждены, клетка мертва.
Чтобы увеличить выход PNAE, мы разработали полусинтетический метод
преготовления PNAE(s) (34).
Базовым материалом являются фосфолпиды из
желтков куриных яиц, из которых был выделен прекурсор 1-0-алкил-2-ацилфосфотидил-этаноламина и химической N-ациляцией пальмитиловой кислотой in
vitro
с использованием органических катализаторов синтезирован PNAE(s) с
хорошим
и
воспроизводимым
выходом.
Противоопуухолевая
активность
полусинтетических препаратов PNAE(s) in vivo была доказана на мышах ICR с
саркомой Крокера S-180, а также на мышах C57B1/10 с саркомой Mc11 (30, 31).
Противопухолевая
активность
PNAE(s)
и
лизо-PNAE(s)
также
подтверждена в тканевых культурах клеток опухоли человека T24 (30, 31).
17
была
Химические характеристики PNAE(s) - инфра-красный спектр,
хроматографические значения Rf в различных системах растворителей, а также
противоопухолевая активность в вышеупомянутых моделях идентичны с
характеристиками природного алкил-фосфолипида PNAE, выделенного из
биопрепарата (29). Химическая структура PNAE, которую мы уже опубликовали
(29), была полностью подтверждена этими фактами.
Таб. 1:
Распределение радиоактивности 14C-PNAE(s) и 14C-маркированных метаболитов
после многократных внутривенных инъекций 14C-PNAE(s) мышам BDF1 с
опухолью (И.Кара и др., 33).
Ткань органа
-3
Радиоактивность 10 × dpm/г ткани
1-й день
2-й день
3-й день
5-й день
кровь
290
370
490
880
почки
650
1480
2100
2790
семенники
230
430
600
990
селезенка
1180
2400
2770
6000
тимус
500
1270
1430
1720
сердце
390
840
1090
1580
легкие
1760
2630
2660
3080
жировая ткань
190
940
2740
4270
лимфоузлы
620
1610
2150
2180
костная ткань
300
590
880
1820
мышцы
130
300
410
630
кровь*
250
290
374
830
печень*
4120
4620
5020
9280
мозг*
83
131
188
557
опухоль Mc11*
430
786
1100
1745
* Каждая из пяти мышей BDF1 с саркомой Mc11 ежедневно получала
внутривенную инъекцию 0,9 мг 14C-PNAE(s) (25,6x106 dpm). Радиоактивность
органов животных определялась через 24 часа после последней инъекции.
Самая высокая аккумуляция 14C-PNAE(s) и 14C-метаболитов после многократных
внутривенных доз была обнаружена в печени мышей. Более подробно
фармакокинетика и метаболизм описаны в работе И.Кары и др. (33).
Стурктура PNAE, предложенная нами, была также подтверждена профессором
др.
Х.К.Мангольдом и коллегами (103), которые сделали препараты PNAE с
18
использованием
растительных
синтетических
клеточных
алкил-эфиров
культур.
Путем
глицерола
такого
и
биотехнологии
стереоспецифического
полусинтеза они приготовили производные с разной длиной цепочки 1-0-алкила
(1-0-тетрадецил, 1-0-гексадецил и 1-0-(Z)-9'-октадеценил)-PNAE, которые имели
схожую противоопухолевую активность,
как и наш полусинтетический алкил-
фосфолипид PNAE (103). Эти результаты еще раз доказывают правильность
химической структуры PNAE (29, 30).
Благодаря экспериментальным исследованиям мы также получили новые
важные знания о том, что противоопухолевая активность биопрепаратов PNAE, а
также
полусинтетических
алкил-фосфолипида
PNAE(s),
значительно
увеличивается ионами кальция. Противоопухолевая эффективность PNAE,
вводимого внутрипеританально мышам 57B1/10 с саркомой Mc11, очень
значительно увеличивалась при одновременном добавлении глюконата кальция
в питьевой воде (30, 31).
Этот стимуляторный эффект ионов Ca2+ на противоопухолевую активность
алкил-фосфолипида может быть объяснен опубликованными ранее фактами
(104, 105) о том, что клетки млекопитающих с поврежденными клеточными
мембранами чувствительны к ионам Ca2+, и концетрация ионов Ca2+ в 2 мМ
токсична для
клеток (104). В цитозоле здоровых клеток концентрация ионов
кальция поддерживается на уровне между и 10-6 и 10-7 моль и контролируется
неповрежденной клеточной мембраной, которая регулирует проникновение этих
ионов в клетку и их удаление из клетки. Однако если ионы кальция проникают в
избытке через поврежденную мембрану в клеточный цитозоль, повышенная
концентрация
ионов
Ca2+
имеет
токсический
эффект,
она
активирует
катаболические ферменты эндонуклеазу, протеазу и фосфолипазу (105, 106).
Эти изменения, вызванные высокой, нефизиологической концентрацией ионов
кальция в клетке, ведут ее смерти (апоптозу) (106).
Мы можем сказать, что алкил-фосфолипиды селективно индуцируют апоптоз в
опухолевых клетках, как было показано действием алкил-фосфолипида ET-18OCH3 на клетки лейкемии человека (57, 58). Так как алкил-фосфолипид PNAE
селективно увеличивает проницаемость и приводит к разрушению клеточных
мембран только у опухолевых клеток, оставляя мембраны физиологически
19
здоровых клеток нетронутыми, в присутствии PNAE ионы кальция оказывают
токсическое действие только на опухолевые клетки. Это селективное действие
сочетания PNAE(s) + Ca2+ может быть использавоно в клиническом лечении
опухолей.
5.2. Фармакокинетика и метаболизм 14C-PNAE in vivo
Было проведено экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма
алкил-фосфолипида
14
C-PNAE(s), маркированного в группе N-ацила
пальмитиловой кислотой (33). Хроматографически чистый препарат
14
C-
14
C-PNAE(s)
был приготовлен в соответствии с нашим запатентованным процессом (34). В
сотрудничестве с исследователями из Онкологического Исследовательского
Центра в Москве мы обнаружили, что препарат, который мы синтезировали,
14
C-
PNAE(s) с высокой специфической радиоактивностью, введенный внутривенно
мышам с саркомой Mc11, накапливался в ткани опухоли и в печени, где в
течение трех дней достигал концетрации в 16 раз большей, чем концентрация
14
C-PNAE(s) в крови животных.
Выведение
14
C-PNAE(s) с мочой животных несущественно (приблизительно 2%
14
из введенной дозы), внутривенно введенный препарат
C-PNAE(s) остается в
кровообращении и тканях в течение длительного времени. Нераспавшийся
PNAE(s) был также обнаружен в мозге подопытных животных.
14
C-
14
C-PNAE(s) in vivo
не полностью стабилен, за 24 часа примерно 60% PNAE(s) распадается на более
мелкие метаболиты, которые, тем не менее, нетоксичны для организма, а один
метаболит 4C-лизо-PNAE(s), который также был хроматографически обнаружен
в органах и опухоли, действует вместе с PNAE(s) против опухолевых клеток (31).
Даже во время курсового внутривенного введения
наблюдался. Также важно, что
14
C-PNAE(s) гемолиз не
14
C-PNAE(s) только незначительно выводится
почками, и поэтому большая часть препарата (PNAE(s) и его метаболиты)
остаются в организме и используются для биосинтеза липидов и фосфолипидов.
В процессе курсового внутривенного введения
повышенная концентрация алкил-фосфолипида
14
C-PNAE(s) была обнаружена
14
C-PNAE(s) и его метаболитов в
органах (печень, легкие, селезенка, мозг, кровь) и в опухоли (см. Таб. 1). Это
значит, что возможно достигнуть такую концентрацию PNAE(s) и лизо-PNAE(s) in
vivo, особенно в печени, которая позволит уничтожить опухолевые клетки.
20
Важно, что в таких условиях не оказывается никакого влияния на работу
здоровых органов, имунную систему и гемопоэз.
Согласно публикации Д.Б.Дж.Херрманна и коллег (28) в клинических тестах
препарата BM 41.440
(1-гексадецилмеркапто-2-метоксиметил-rac-глицеро-3-
фосфохолин), который вводился перорально, была обнаружена регрессия
метастазов опухоли в печени, и в нескольких случаях
была очевидна полная
эрадикация (28).
Можно предположить сходное действие и у препарата PNAE(s), преимущество
которого, к тому же, в полной нетоксичности и отсутствии побочных эффектов
даже при длительном пероральном применении, в отличие от синтетического
препарата BM 41.440. PNAE(s) может профилактически назначаться перорально
пациентам после хирургического удаления первичной опухоли (колоректальной
аденокарциномы), чтобы предотвратить метастазы в печени.
Вероятность успеха лечебного применения
PNAE(s) в обозначенных случаях
основана на следующих фактах:
1) Алкил-фосфолипид PNAE(s) нетоксичен (в отличие от цитостатиков) даже при
курсовом интраперитональном введении и не ослабляет защитные силы
организма, имунную систему;
2)PNAE(s)
при
курсовом
внутривенном
или
внутримышечном
введении
накапливается in vivo, особенно в опухоли и опухолевых тканях;
3) Долгосроное (6-8 недель) ежедневное пероральное применение PNAE (в
биопрепарате cACPL, 3 раза в день 2г cACPL с чаем) показательно приводило к
драматическому улучшению клинического состояния пациентов с метастазами в
печени, например исчезал отек печени, увеличивался вес тела, облегчалась
боль
(обезболивающее
действие)
(И.Кара
и
коллеги,
неопубликованные
результаты);
4)PNAE(s), также как и другие алкил-фосфолипиды, ингибирует протеинкиназу С
и снижает способность опухолевых клеток к метастазированию. Поэтому мы
уверены, что нетоксичный алкил-фосфолипид PNAE(s) очень подходит для
профилактики метастазов опухоли при долгосрочном пероральном применении;
21
5.3. Новая технология производства содержащего PNAE препарата ОВОСАН
Недавно мы разработали новую технологию производства препарата ОВОСАН,
содержащего высокую концентрацию PNAE. Препарат ОВОСАН в форме
желатиновых капсул, содержащих PNAE в подсолнечном масле, в настоящее
время доступен для перорального применения.
5.4. Возможность профилактики метастазов в печень у пациентов после
оперативного лечения колоректальной карциномы с помощью длительного
перорального приема препарата, содержащего PNAE. Возможность
сочетания местной гипертермии и инъекционного введения PNAE в
лечении метастазов: перспективы
Эффекты действия алкил-фосфолипида PNAE(s) могут быть усилены действием
местной гипертермии, что было показано путем сочетания гипертермии с
синтетическими
эфирными
фосфолипидами
(например,
ET-18-OCH3
и
гипертермиия) (27, 90, 91).
Ф.Л.Моффат и коллеги (107) провели в хирургическом отделении в Торонто
изучение лечения 178 пациентов с неоперабельными опухолями печени
сочетанием
местной
значительную
гипертермии
регрессию
опухолей
с
химеотерапией.
у
78%
пациентов
Они
и
обнаружили
стабилизацию
клинического состояния у 8% пациентов. У всех подвергавшихся лечению
пациентов произошло сильное уменьшение боли и заметное улучшение
клического состояния (авторы пишут «отличное качество жизни») (107).
Выживаемость пациентов увеличилась в среднем на 26 месяцев.
Противометастачический профилактический эффекта препаратов, содержащих
PNAE, у пациентов после операции по поводу колоректальной карциномы дает
шанс на эффективную профилактику метастазов в печень и на значительное
продление и спасение жизни этих пациентов.
Наш опыт с пероральным применением биопрепарата cACPL (который содержит
только 0,2% PNAE) также указывает на возможность эффективной профилактики
метастазов в мозг и возможность эффективного вспомогательного лечения
опухолей мозга с помощью долгосрочного применения препаратов, содержащих
PNAE.
Но
оптимальным
выглядит
пероральное
22
применение
препарата,
содержащего PNAE, против метастазов опухоли в печень у пациентов с
колоректальной аденокарциномой и сразу после оперативного удаления этой
злокачественной опухоли.
Наша концепция профилактики метастазов путем долгосрочного применения
нетоксичного
алкил-фосфолипида
PNAE
приближается
к
стратегии
профилактики метастазов американским препаратом карбоксимидотриазолом
(CAI), предложенной Е.С.Коном и Л.А.Лиоттой (95). Преимущество PNAE и
нашего чешского препарата, содержащего PNAE, по сравнению с CAI в полном
отсутствии побочных токсических эффектов, которые, напротив, проявляются у
пациентов при длительном пероральном применении синтетического препарата
CAI (94). Высокая избирательность противоопухолевого действия PNAE также
является преимуществом этого натурального эфирного фосфолипида.
Профилактика метастазов может, несомненно, в большей степени улучшить
перспективы
для выживаемости пациентов, чем любое другое лечение
метастазов, уже существующих в печени. Лучше предупредить, чем лечить.
23
Индржик Кара, др.н., (1923), доктор биологических наук и доктор химических наук
работал в институтах Академии Наук Чехословакии в Праге (Институт
Органической Химии и Биохимии Академии Наук Чехословакии, Институт
Молекулярной
Генетики
Академии
Наук
Эволюционной
Биологии
Академии
Наук
Чехословакии,
Чехословакии)
Лаборатория
и
занимался
исследованиями нуклеиновых кислот, антиметаболитов, ферментных систем
биосинтеза нуклеиновых кислот, изучал с помощью радиохимических методов
биохимические изменения в клетке в процессе взаимодействия опухолевых
вирусов с клетками в тканевых культурах.
Он опубликовал более тысячи научных работах в профессиональных научных
журналах,
сотрудничал
со
Швейцарским
Институтом
Экспериментального
Изучения Рака в Лозанне и с учеными Онкологического Центра Академии
Медицинских Наук в Москве.
В последние годы (1983-1995) им был открыт нетоксичный природный эфирный
фосфолипид
PNAE
с
селективным
противоопухолевым
эффектом.
Использование PNAE для профилактики и лечения опухолей, и особенно
метастазов, у людей - в настоящее время реальная возможность, что является
заметным вкладом чешской науки в борьбу против рака.
24