Исследование и разработка питательной среды для получения
advertisement
В настоящей работе рассмотрены питательные среды, их классификация, способы получения бактериальных концентратов. Изучены свойства лактобактерий, а именно: морфологические, культуральные, физиолого-биохимические. Разработан состав питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий, проведены исследования этой питательной среды. На основании проведенных исследований разработана технология приготовления питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….……. 7 ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР……………………………….……… 10 1.1 Классификация питательных сред…………………………………….. 10 1.2 Физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий......... 17 1.3 Способы получения бактериальных концентратов………………….. 30 1.4 Заключение по обзору литературы………………………………......... 36 ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………….…. 38 2.1 Организация выполнения работ……………………………………….. 38 2.2 Объекты исследования, оборудование………………………………... 40 2.3 Методы исследований……………………………………….……......... 41 2.3.1 Приготовление питательных сред и культивирование молочнокислыхмикроорганизмов…………………………………………………... 41 2.3.2 Методики для изучения питательной среды……………………….. 44 2.3.2.1 Определение активной кислотности……………………………… 44 2.3.2.2 Определение титруемой кислотности ……………………………. 45 2.3.2.3 Определение аминного азота в питательной среде ……………… 45 2.3.2.4 Методы количественного учета микроорганизмов ……………… 46 2.3.2.5 Определение срока годности питательной среды………………... 47 2.3.2.6 Определение прозрачности и цветности питательной среды…… 48 2.3.3 Методики для изучения морфологических свойств штамма молочнокислых бактерий……………………………………………………... 48 2.3.3.1 Окраска бактерий по Граму………………………………………... 48 2.3.3.2 Окраска спор бактерий по Шефферу-Фултону…………………... 49 2.3.3.3 Определение подвижности бактерий……………………………... 50 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Разраб. Харитонкина Е.Е. Провер. Кригер О.В. Реценз. Н. Контр. Сухих С.А. Утверд. Просеков А.Ю. Подпись Дата Исследование и разработка питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Лит. Лист Листов 5 111 КемТИПП гр.ПБн-121 2.4 Результаты собственных исследований………...…………………….. 50 2.4.1 Изучение физиолого-биохимических, морфологических и культуральных свойств штамма лактобактерий………………………………. 51 2.4.2 Совершенствование питательной среды…………………………… 55 2.4.3 Анализ физико-химических свойств полученной питательной среды.. 58 ГЛАВА 3 ИНЖЕНЕРНЫЙ РАЗДЕЛ……………………………………….. 60 3.1 Процессуальная схема производства питательной среды…………… 60 3.2 Технологическая схема производства питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий……………………… 66 ГЛАВА 4 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ…………………………………… 69 4.1 Расчет себестоимости питательной среды………………………......... 69 4.2 Экономическое обоснование использования питательной среды. 73 ГЛАВА 5 БЕЗОПАСНОСТЬ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ. 77 5.1 Условия труда…………………………………………………………... 77 5.1.1 Соответствие санитарным требованиям микробиологической лаборатории…………………………………………………………………… 77 5.1.2 Гигиена труда и производственная санитария……………………... 78 5.2 Безопасность работы в микробиологической лаборатории……......... 80 5.2.1 Безопасность работы с аппаратурой и оборудованием………......... 81 5.2.2 Безопасность работы со стеклянной посудой………………………. 83 5.2.3 Безопасность работы с реактивом…………………………………... 85 5.2.4 Безопасность работы с микроорганизмами………………………… 87 5.2.5 Электробезопасность………………………………………………… 88 5.2.6 Пожарная безопасность……………………………………………… 89 5.3 Оказание первой медицинской помощи……………………………… 90 ВЫВОДЫ............................................................................................................. 92 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................ 93 ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………………………….. 104 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 6 ВВЕДЕНИЕ Лактобактерии (Lactobacillus spp.) принадлежат к группе неспорообразующих грамположительных палочек. Они являются представителями резидентной микрофлоры человека, в первую очередь полости рта, кишечника и влагалища. Изменение количественного и качественного состава лактобактерий является диагностическим признаком дисбактериоза. В редких случаях лактобактерий могут явиться возбудителями инфекционной патологии, чаще у новорожденных: сепсис, эндокардит, менингит, пневмония и некоторые другие. Большое значение эти микроорганизмы имеют для пищевой промышленности, поскольку занимают ключевую позицию в производстве молочнокислых продуктов (простокваша, кефир, йогурт, ацидофилин). Таким образом, перед микробиологами стоят непростые задачи выделения, идентификации, культивирования и хранения Lactobacillus spp. Микроорганизм полиморфен (палочки, коккобациллы), разнообразен по типу дыхания (факультативный анаэроб, микроаэрофил, облигатный анаэроб). Он обладает немногочисленными культуральными признаками, позволяющими отличать его от морфологически сходных бактерий (образование молочной кислоты, отсутствие каталазы и некоторые другие.). Важное место в выделении лактобактерий занимают питательные среды, обеспечивающие рост и, в определенной степени, селекцию этих микроорганизмов. В мировой микробиологической практике их насчитывают несколько десятков. Наибольшее признание получила среда de Man, Rogosa, Sharpe, которую по первым буквам фамилий авторов обычно обозначают как среда MRS (MPC в русской транскрипции). Существует ряд модификаций этой среды, улучшающих, по мнению разработчиков, их ростовые свойства и селективность. В России получила распространение среда МРС-4, которая заметно отличается от авторской по своей рецептуре, но признана достаточно эффективной. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 7 Среда МРС-2 (полужидкая) является одной из лучших при работе с чистой культурой и для хранения культур [30]. Бактерии рода Lactobacillus относятся к микроорганизмам, имеющим сложные питательные потребности. Для их активного развития требуется наличие веществ, необходимых для построения бактериальной клетки (нуклеиновых кислот, полисахаридов, аминосахаров и т.д.). Так, для роста большинства молочнокислых палочек необходимы органические формы азота, которые они сами не синтезируют [15, 54]. Многим видам лактобацилл для развития необходимы витамины. Этим объясняется значительное влияние на их рост добавок к питательной среде различных экстрактов (например, дрожжевого, кукурузного), а также других соединений. В целом, питательная среда должна удовлетворять потребностям молочнокислых палочек в источниках энергии, содержать компоненты, необходимые для конструктивного метаболизма [59]. Таким образом, получение бактериального концентрата лактобактерий является сложным процессом, на который оказывает влияние большое количество факторов, кроме того, он связан с необходимостью решения ряда научных и технических проблем, частью которых является совершенствование состава питательной среды [25]. Как выше я уже сказала имеется большой перечень питательных сред, используемых для культивирования лактобактерий, однако не всегда искусственная среда отвечает питательным потребностям лактобактерий. Так, например, классическая МРС-среда, широко используемая на практике, не всегда оптимальна в отношении органического азота, источников марганца, магния, фосфора [61]. Одна из модификаций классической среды, МРС-1 [62], также имеет недостатки, а именно: высокая стоимость из-за наличия дорогостоящего импортного вещества – цистеина солянокислого; нестандартность из-за наличия в составе среды в качестве источника азота гидролизованного молока по Богданову; сложность технологии приготовления среды из-за операции суспендирования в горячей воде пептона перед внесением в среду [22]. Питательные среды, применяющиеся для культивирования молочнокислых бактерий сложные и не всегда доступные. Несмотря на большое количеАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 8 ство публикаций, посвященных питательным средам для культивирования молочнокислых бактерий, поиск новых и оптимизация уже известных сред остается актуальным в настоящее время. Настоящая дипломная работа посвящена исследованию и разработке питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Питательная среда должна отвечать питательным потребностям лактобактерий, а также не должна быть дорогостоящей. Для достижения поставленной цели сформулированы задачи исследований: − провести анализ отечественных и зарубежных литературных данных по изучаемой проблеме, сформулировать задачи собственных исследований; − изучение физиолого-биохимических и морфологических свойств штамма молочнокислых бактерий; − совершенствование состава питательной среды для культивирования лактобактерий; − анализ физико-химических свойств полученного концентрата лактобактерий; − получение результатов и подведение итогов проведенной работы; − разработать технологическую схему производства питательной среды; − рассчитать ожидаемую экономическую эффективность технологии получения питательной среды. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 9 ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР В обзоре литературы рассмотрены: классификация питательных сред, физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий, способы получения бактериального концентрата. На основе проведенных литературных данных сформулирована цель и задачи собственных исследований. 1.1 Классификация питательных сред Питательная среда обеспечивает необходимые условия для проведения процесса культивирования. Она обеспечивает жизнедеятельность, рост, развитие, накопление биомассы. Микробиологи называют питательной средой такую среду, которая содержит различные соединения сложного или простого состава, и применяют ее для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Необходимым компонентом для питательной среды является вода, так как только в водной среде протекают процессы жизнедеятельности, помимо этого вода является растворителем для большинства химических соединений и обеспечивает растворение питательных веществ микробной клетки. Также в состав питательной среды входят различные органические и неорганические вещества, такие как углерод, азот, фосфор и другие минеральные вещества, витамины и прочие [24, 27, 16]. Роль этих элементов в составе питательной среды различна и, несомненно, важна, и каждый вид микроорганизмов очень избирателен к питательным веществам среды. В качестве источника углерода чаще используют сахара (глюкоза, лактоза, сахароза) так как они являются легкодоступными, так же используют многоатомные спирты (глицерин, манит), полисахариды (целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал) и др. Азот может содержаться в форме неорганических солей или АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 10 кислот, а также в форме органических соединений, таких как аминокислоты, мочевина и тд. Фосфор является необходимым элементом клетки, так как обеспечивает нормальное течение энергетического обмена и других процессов в клетке. В среду фосфор вносят в виде солей фосфорной кислоты. В присутствии витаминов и микроэлементов практически все микроорганизмы растут лучше, но вносить их в состав сред нужно в микродозах, иначе они будут проявлять ингибирующее действие на микробные клетки [16]. Питательные среды должны обладать оптимальными физико-химическими свойствами: рН, вязкостью, влажностью, осмотическими свойствами. Из-за большого разнообразия питательных сред нет единой классификации. Для того чтобы ориентироваться в их разнообразии было предложено несколько классификаций питательных сред. При классификации питательных сред по происхождению среды разделяют на две группы: − натуральные или естественные (среды неопределенного химического состава), которые подразделяются на среды животного (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.) и растительного (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.д.) происхождения; − полусинтетические среды; − синтетические (среды известного химического состава). При исследованиях широко применяют натуральные (естественные) среды. Они состоят из продуктов растительного или животного происхождения и имеют неопределенный химический состав. К натуральным средам относят овощные или фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца, желчь, сыворотку крови, отвары и экстракты, полученные из различных природных субстратов – мяса, различных частей растений, почвы. На натуральных средах хорошо развивается большинство микроорганизмов, так как в таких средах, как правило, имеются все компоненты, которые необходимы для их роста и развития. Но у этих сред имеется существенный минус, они имеют сложный непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии, обмена веществ микроорганизмов, так АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 11 как в значительной степени не позволяют учесть потребление компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития. Натуральные среды в основном используются для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. В качестве примера натуральных сред неопределенного состава, относят мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА), картофельные среды и мн.др. Также к числу натуральных сред относят полусинтетические среды, в состав которых, помимо компонентов с известной химической природой входят и соединения неопределенного состава. Полусинтетические среды используют для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков и др. Примерами полусинтетических сред служат мясо-пептонный бульон с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро и т.д. Полусинтетическими средами также являются среды, состоящие из компонентов с известным химическим составом, такие как нитраты, углеводы, фосфаты и другие, но и в незначительных количествах содержащие компоненты неопределенного состава, такие как кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, гидролизат козеина, которые являются факторами роста. Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в точно указанных концентрациях, т.е. состав их полностью известен. У таких сред имеются свои достоинства и недостатки. Достоинством являются стандартность сред и воспроизводимость с высокой степенью точности. Эти среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. При разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В настоящее время существует огромное количество синтетических сред, которые по своим свойствам и качествам не уступают натуральным средам неопределенного состава. Синтетические среды могут состоять из большого набора компонентов, а могут иметь простой состав. Однако только для немногих патогенных бактерий имеются синтетические среды. Их применяют, главным образом, для экспериментального изучения метаболизма микроорганизмов, реже для аналитических целей, диагностики и хранения культур [3]. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 12 При классификации питательных сред по назначению различают: − питательные среды общего назначения (универсальные); − обогащенные; − специальные питательные среды, которые подразделяются на элективные, дифференциально-диагностические и консервирующие среды. Питательные среды общего назначения используют для выращивания многих видов микроорганизмов, их используют в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), бульон Хоттингера, агар Хоттингера, сусло жидкое, сусло-агар и др. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на обще- употребительных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие среды получили название обогащенных. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения. Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические (индикаторные), консервирующие. Элективные среды применяются, главным образом, для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов. Избирательность питательной среды для определенных видов микроорганизмов достигается путем создания оптимальных для них условий (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией, или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, азид натрия, теллурит калия, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их в значительной степени задерживается. Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств и дифференцировки одного вида (рода) микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбираАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 13 ют с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида. Диффенцирующие свойства питательной среды создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микроорганизма (например, сахаров, аминокислот и др.), соответствующих индикаторов (например, рНиндикаторов – бромтимолблау, фуксин и др.; Eh-индикаторов). В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях [24]. Консервирующие (транспортные) среды используются широко в клинической практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева. Основная цель их использования – сохранить жизнеспособность возбудителя и предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры в период транспортировки образцов. При классификации питательных сред по консистенции питательные среды делят на следующие группы: − жидкие; − полужидкие; − плотные; − сыпучие; − сухие. Жидкие среды обычно применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также для поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5–2 % агара, полужидкие – 0,3–0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 14 особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80–86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10–15 %), но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разрушающие желатин, что делает его неудобным для применения. Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными [1]. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, реже – для накопления биомассы (например, анаэробов). Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев. Сыпучие среды обычно используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором. Сухие питательные среды представляют собой порошки или гранулы с влажностью, не превышающей 10 % и легко растворимые в воде. Они выпускаются по соответствующим технологиям на производствах в различных масштабах, удобны для хранения, транспортировки и приготовления готовых к употреблению сред [3, 4, 7]. При классификации питательных сред по составу среды разделяют на следующие группы: − белковые; − безбелковые; − минеральные. Классификации питательных сред по загрязнённости материала. Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контаминации сапроАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 15 фитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селективные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчений идентификации) среды [4]. Изготовление питательных сред является сложным процессом, который нуждается во внимании бактериолога. Этот процесс состоит из нескольких основных этапов. Сначала к дистиллированной воде добавляют необходимые сухие компоненты среды, тщательным образом перемешивают, растворяя при нагревании. Обязательно устанавливают рН среды, которую определяют или с помощью ионометра, или индикаторными бумажками. При этом следует обратить внимание, что после стерилизации реакция среды падает на 0,2. Среды, которые содержат агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем состоянии, жидкие среды – через бумажные фильтры. Если есть необходимость, их осветляют осаждением или с помощью белка куриного яйца или сыворотки. Среды разливают в специальные матрасы, колбы, флаконы и закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды используют разные режимы стерилизации. Среды, которые содержат углеводы, желатин стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112 °С или текучей парой при температуре 100 °С дробно. Среды без углеводов можно стерилизовать в автоклаве при 115–120 °С в течение 20 мин. Если в состав сред входят неустойчивые к температуре компоненты, такие, как нативный белок, сыворотка, мочевина, то они стерилизуются или фильтрованием через бактериальные фильтры, или их добавляют готовым в стерильную среду. Контроль стерильности сред осуществляют путем выдерживания их в термостате в течение нескольких суток при температуре 37 °С. Так как питательная среда обеспечивает необходимые условия для проведения процесса культивирования, то её качество несомненно будет влиять на результаты дальнейших исследований. Поэтому к питательным средам предъявляют ряд требований: − изготавливаемые среды должны быть питательными, необходимо чтобы они содержали все вещества необходимые для выращивания микроорАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 16 ганизмов в легко усвояемом виде. Они должны быть обогащены различными веществами, такими как углерод, азот, фосфор и другими минеральными веществами, витаминами и прочим; − должны иметь оптимальную рН среду, так как концентрация рН-ионов влияет на проницаемость оболочки, благодаря чему микроорганизмы усваивают питательные вещества. Важно чтобы среда обладала буферными свойствами, так как в процессе культивирования микроорганизмы выделяют кислые или же щелочные продукты жизнедеятельности; − должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде и внутри клетки должно быть равными; − среды должны быть стерильными, так как посторонняя микрофлора затрудняет рост нужного микроорганизма и искажает результаты исследований; − необходимо чтобы плотные среды были влажными и имели оптимальную консистенцию для микроорганизмов; − среды должны быть прозрачными, это позволяет с легкостью заметить загрязнение среды посторонней микрофлорой, а также позволяет отслеживать рост культивируемых микроорганизмов; − обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH 2 . Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом; − быть по возможности унифицированными, т. е. содержать постоянное количество отдельных ингредиентов [9]. 1.2 Физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий Молочнокислые бактерии - палочки, реже шаровидные формы, все они грамположительные. Они относятся к семейству Lactobacillaceae, которое включает три рода: Streptococcus, Leuconostoc и Lactobacillus. Бактерии рода Lactobacillus для АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 17 углеводного обмена не нуждаются в лактозе. Они сами не синтезируют витамины и аминокислоты и поэтому не встречаются ни в почве, ни в воде. Естественная среда обитания этих бактерий – растения и растительные остатки. Они встречаются также в кишечнике, на коже и на слизистых оболочках человека и животных. Молоко для Lactobacillaceae является самой оптимальной средой. Виды рода Streptococcus являются гомоферментативными, то есть они сбраживают более 90 % сахара в молочную кислоту и лишь незначительную его часть – в уксусную кислоту и спирт. В роде молочнокислых стрептококков различают несколько групп. Грумма молочных бактерий: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis. Группа Viridans: Streptococcus thermophilus. Группа энтерококков: Streptococcus faecalis var. faecalis, Streptococcus faecalis var. liquefaciens, Streptococcus faecalis var. zymogenes, Streptococcus faecium, (Streptococcus durans), Streptococcus bovis, патогенные стрептококки (Streptococcus agalactiae и др.). Streptococcus lactis является первым микроорганизмом, который выделен в чистой культуре (в 1873 г. Листером). Streptococcus lactis встречается на растениях. С пылью и растительными частицами попадает на доильное оборудование и затем в молоко. Он встречается в виде коротких цепочек из двух – шести звеньев. Определенные штаммы, которые не образуют слизи и ароматических веществ с неприятным запахом, как многие дикие штаммы, входят в состав заквасок. Оптимальная температура развития Streptococcus lactis – около 30 °С. Отдельные штаммы, однако, могут также размножаться, но медленно, при низких температурах (ниже 7 °С). При температуре 25 °С Streptococcus lactis за счет образования молочной кислоты снижает показатель рН примерно до 4,5 и молоко свертывается вследствие выпадения казеина. Streptococcus cremoris (сливочный стрептококк). В сыром молоке встречается не так часто, как Streptococcus lactis, от которого он отличается морфологически, так как образует длинные цепочки. Оптимальная температура развития Streptococcus cremoris 20–25 °С. В течение 24 ч под влиянием Streptococcus cremoris при температуре 25 °С наблюдается свертывание молока при рН, равном АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 18 5,0–5,2, однако без наличия сгустка. При температуре 10–18 °С Streptococcus cremoris склонен к образованию слизи. В северных странах этот стрептококк используется для приготовления особо устойчивого кислого молока. В закваске молочнокислых бактерий Streptococcus cremoris в сочетании с Streptococcus lactis способствует более густой консистенции продукта. Streptococcus diacetilactis образует в молоке не только молочную кислоту, но и ацетоин и диацетил, важнейшие ароматические масла, а также СО2. Streptococcus diacetilactis содержится в значительном количестве в закваске для приготовления масла. Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк). Часто встречается на доильном оборудовании, молочной посуде и в сыром молоке. Устойчив к кратковременной пастеризации, но погибает при высокотемпературной пастеризации. Термофильный стрептококк, как и Streptococcus cremoris, представляет собой длинные цепочки. Оптимальная температура его развития 40–45 °С. Он совместно с Lactobacillus bulgaricus используется для приготовления йогурта и в качестве компонента культуры для приготовления эмментальского сыра. Streptococcus thermophilus чрезвычайно чувствителен по отношению к пенициллину и некоторым антибиотикам и поэтому применяется в качестве тест-микроба для биологического определения (обнаружения) антибиотиков в молоке. Виды микроорганизмов группы энтерококков (серологическая группа D) являются составными элементами нормальной кишечной микрофлоры человека и животных. Встречающийся в молоке Streptococcus bovis желательно относить не к группе Viridans, а в соответствии с его серологической классификацией в группу D энтерококков. Streptococcus faecalis var. liquefaciens отличается от Streptococcus faecalis var. faecalis более сильной протеолитической активностью. Streptococcus faecalis var. zymogenes также осуществляет протеолиз, но в меньшем объеме. По данным М. Бергей, Streptococc durans, который является разновидностью Streptococcus faecium, в настоящее время не относят к специфическому виду. Энтерококки могут попадать в молоко с калом, пылью или непосредственно из вымени (латентная инфекция, специфические маститы). У АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 19 крупного рогатого скота и овец преимущественно распространены Streptococcus faecium и Streptococcus bovis. Энтерококки устойчивы к высокой температуре и выдерживают пастеризацию молока и его термическую обработку, применяемую при изготовлении сыров, а также нагревание сырного сгустка до 51 °С при производстве эмментальского сыра. Вследствие своей устойчивости они могут выживать также при повышенной концентрации поваренной соли. Streptococcus faecalis var. liquefaciens вследствие протеолиза вызывает появление у сыра горького вкуса. Streptococcus faecium может стать причиной повторного брожения в эмментальском сыре из-за образования пропионовокислыми бактериями стимулирующих веществ и излишка лактата в зрелых сырах. Обнаружение энтерококков в молоке часто служит в качестве индикатора его фекального загрязнения. При этом необходимо учитывать, что энтерококки, особенно Streptococcus faecium, размножаются в плохо продезинфицированном доильном оборудовании, во флягах, автоцистернах, в танках для хранения молока и молокопроводах и являются постоянным источником его загрязнения. Streptococcus faecalis улучшает качество сыра чеддар при его созревании. Рекомендуется добавлять Streptococcus faecalis при производстве эмментальского и грюйерского сыров для улучшения их аромата. Значение энтерококков как микроорганизмов, вызывающих пищевое отравление, еще недостаточно изучено, однако имеются сообщения относительно пищевых отравлений сырами, содержащими энтерококки. Streptococcus faecium u Streptococcus durans не патогенны, в то время как Streptococcus faecalis/liquefaciens и определенные штаммы Streptococcus faecium zymogenes вызывают желудочно-кишечные расстройства. Виды рода Leuconostoc находятся на растениях и морфологически подобны стрептококкам. Они сбраживают сахара и гетероферментативно, то есть наряду с незначительным количеством молочной кислоты образуют также уксусную кислоту и ароматические вещества (ацетоин и диацетил). Образуются ацетоин и диацетил из солей лимонной кислоты. Однако аромат появляется АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 20 только при рН ниже 5,0. Так как Leuconostoc сквашивает молоко в незначительной степени, то необходимо для появления аромата, сопутствующего процессу сквашивания молока, использовать культуру Streptococcus lactis. Leuconostoc (раньше их называли бетакокками) являются ароматообразующими составными частями заквасок молочнокислых бактерий для приготовления масла. Они участвуют также в образовании аромата ломтевых сыров. Важнейшие их виды: Leuconostoc cilrovorum и Leuconostoc dextranicum. Род лактобацилл в молочном хозяйстве называют грамположительные молочнокислые палочки. Они различной длины и толщины, не образуют спор и окисляют молоко значительно быстрее, чем стрептококки при рН 3,2–3,5. Лактобациллы достигают оптимального развития при низком значении рН и пониженном содержании кислорода. В соответствии с классификацией М. Бергея в молочном хозяйстве все виды Tribus Lactobacilleae делятся на три рода: термобактерии, стрептобактерии и бетабактерии. Род I. Термобактерии. Длинные палочки, не образуют цепочек, при температуре ниже 15 °С не развиваются, оптимальный рост при температуре около 40 °С, гомоферментативны. Род II. Стрептобактерии. Образуют длинные цепочки, состоящие из коротких палочек, развиваются и при температуре ниже 15 °С, оптимальный рост при температуре 30 °С, гомоферментативны. Род III. Бетабактерии. Они – гетероферментативны. Естественное место обитания лактобацилл – растения (трава, силос, фрукты). Встречаются в слюне и в кишечном тракте человека и животных. В молоко лактобациллы попадают из окружающей среды, так как стерильно выдоенное молоко не содержит лактобацилл. Лактобациллы отчасти термоустойчивы и могут выживать при кратковременной пастеризации, однако не выдерживают высокотемпературную пастеризацию. Лактобациллы играют важнейшую роль в приготовлении кисломолочных продуктов, твердых и ломтевых сыров. Они оптимально развиваются и образуют АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 21 молочную кислоту только тогда, когда стрептококки создают для них благоприятные показатели рН и пониженный окислительно-восстановительный потенциал. Затем, вследствие значительного образования лактобациллами молочной кислоты, тормозится дальнейшее развитие стрептококков. При производстве эмментальского сыра участие лактобацилл в обмене веществ пропионовокислых бактерий является решающим для образования лактата. Созревание сыров происходит благодаря проявляющейся в различной степени протеолитической активности лактобацилл. Lactobacillus bulgaricus (Thermobacterium buldaricum). Образует длинные палочки и является гомоферментативной. Совместно с Streptococcus thermophilus или с окисляющей в большей степени Lactobacillus jughurti она применяется для приготовления йогурта. Иногда Lactobacillus bulgaricus входит в состав бактерий молочнокислой закваски для приготовления молочнокислых продуктов. Ее используют также при производстве твердых сыров. Оптимальная температура ее развития составляет 40–45 °С. Lactobacillus lactis (Thermobacterium lactis) образует длинные нити. Постоянно находится в кишечнике человека и животных. Ее можно обнаружить на доильном оборудовании, и чаще, чем другие виды лактобацилл, она присутствует в необработанном (сыром) молоке. Lactobacillus lactis идентична Lactobacillus caucasicus, находящейся в кефире. Она часто принимает участие в созревании твердых сыров. Оптимальная температура ее развития примерно 40 °С. Lactobacillus helveticus (Thermobacterium helveticum) встречается в необработанном (сыром) молоке, в сычуге и в сычужном ферменте телят. Используется вместе с Streptococcus thermophilus для приготовления эмментальского и грюйерского сыров. Образует не только молочную кислоту, но и участвует благодаря наличию протеолитического эндофермента в созревании сыров. Lactobacillus acidophilus (Bifidobacterium bifidum). При преимущественно молочном питании находится в большом количестве в кишечнике детей и взрослых. Часто ее обнаруживают и в кишечнике телят. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 22 Из других встречающихся в молоке лактобацилл следует отметить: Lactobacillus casei (Streptobacterium casei) – сильно протеолитическая, Lactobacillus brevis (Betabacterium breve), Lactobacillus fermenti (Betabacterium longum). Молочнокислые бактерии очень требовательны к источникам питания. Как источник углерода и энергетического материала используют глюкозу, галактозу, фруктозу, сахарозу и др., причем многие культур, которые используют лактозу, не способны использовать мальтозу и наоборот. Типичные молочнокис- лые бактерии очень требовательны к источникам азотного питания, не растут на питательных средах с минеральным азотом, нуждаются в органических соединениях азота и в некоторых дополнительных факторах роста, в частности, тиамине. Для приготовления кисломолочных продуктов применяют закваску на основе мезофильных и термофильныхбактерий (в зависимости от температуры развития) гомо-или гетероферментативных (в зависимости от продуктов сквашивания). Характеристика молочнокислых бактерий приведена в таблицах 1.2.1 и 1.2.2. Таблица 1.2.1 - Характеристика молочнокислых стрептококков Молочно- Строение Форма, размер Темпе- Погра- Характер и цвет колонии ратура ничная сгустка стрепто- роста, кислот- кокки оС ность, оТ 30-35 120, кислые Streptococcus дипло- каплевидные lactis кокки, блестящие, короткие цепочки Примечание Источники выделения ровный, сбраживает лактозу, растения, про- плотный галактозу, мальтозу, стокваша, тво- беловатые, 1-2 маннит, выборочно рог, сметана, мм, глубинные сахарозу, сорбит, кислосливоч- имеют чечеви- салицин, не сбражи- ное масло, це подобную вает арабинозу, кси- сыры форму лозу, рафинозу, рамнозу, маннозу, глицерин, крахмал Streptococcus цепочки каплевидные ровный, сбраживает глюкозу, растения, про- плотный лактозу, выборочно стокваша, тво- беловатые, 1-2 сахарозу, мальтозу, рог, сметана, мм, глубинные маннит, рафинозу, кислосливоч- имеют чечеви- салицин, не сбражи- ное масло, це подобную вает арабинозу, кси- сыры форму лозу, декстрин, гли- блестящие, cremoris 25 110 церин, крахмал АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 23 Продолжение таблицы 1.2.1 Молочно- Строение Форма, размер Темпе- Погра- Характер и цвет колонии ратура ничная сгустка стрепто- роста, кислот- кокки оС ность, оТ 25 110 кислые Streptococcus одиноч- каплевидные citrovorus ные и блестящие, двойные Примечание Источники выделения ровный, сбраживает глюкозу, растения, про- плотный галактозу, лактозу, стокваша, тво- беловатые, 1-2 не сбраживает саха- рог, сметана, кокки, мм, глубинные розу, мальтозу, ман- кислосливоч- цепочки имеют чечеви- нит, арабинозы, ное масло, разной це подобную ксилозу, рафинозу, сыры длины форму рамнозу, маннозу, сорбит, глицерин, декстрин, крахмал Streptococcus одиноч- каплевидные ровный, сбраживает глюкозу, простокваша, diacetilactis ные и блестящие, плотный, галактозу, лактозу, сыры двойные беловатые, 1-2 может рафинозу, крахмал, кокки, мм, глубинные присут- не сбраживает гли- цепочки имеют чечеви- ствовать церин разной це подобную газ длины форму Streptococcus одиноч- каплевидные paracitrovorus ные и Streptococcus 25-35 80-100 сбраживает глюкозу, простокваша, блестящие, галактозу, лактозу, сыры двойные беловатые, 1-2 сахарозу, крахмал, кокки, мм, глубинные выборочно арабино- цепочки имеют чечеви- зу, ксилозу, рафино- разной це подобную зу, не сбраживает длины форму сорбит, салицин цепочки каплевидные 25-35 40-45 70-80 110-115, блестящие, thermophilus ровный ровный, сбраживает глюкозу, простокваша, плотный галактозу, лактозу, сыры беловатые, 1-2 сахарозу, крахмал, мм, глубинные выборочно арабино- имеют чечеви- зу, ксилозу, рафино- це подобную зу, не сбраживает форму сорбит, салицин Streptococcus дипло- каплевидные стянутый, сбраживает глюкозу, кисломолоч- liquefaciens кокки, блестящие, с отделе- галактозу, лактозу, ныепродукты короткие беловатые, 1-2 нием сахарозу, мальтозу, цепочки мм, глубинные сыворот- сорбит, салицин, имеют чечеви- ки выборочно манит, 37 110-115 це подобную арабинозы, рафино- форму зу, маннозу крахмал, не сбраживают рамнозу АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 24 Таблица 1.2.2 - Характеристика молочнокислых палочек Молочно- Строение Форма, раз- Темпе- Погра- кислые стреп- мер и цвет ратура ничная то-кокки колонии роста, кислот- оС ность, оТ 40-45 200-300 Примечание Источники выделения Lactobacterium круг- поверхност- bulgaricum лые палочки с ные волни- сбраживает глюкозу, галактозу, лактозу, сахарозу, мальто- закругленными стые коло- зу, не сбраживает манит, ара- концами, часто нии, глубин- бинозу, ксилозу, рамнозу, расположенные в ные в виде сорбит, салицин, глицерин, виде цепей, кусочков декстрин, крахмал наблюдается ваты простокваша зернистость 2-20 мкм Lactobacterium палочки разной мелкие, acidophilum длины, одиноч- гладкие, бес- зу, лактозу, сахарозу, мальто- ные или в виде цветные зу, маннозу, салицин, выбо- 37 200-250 сбраживает глюкозу, галакто- цепочек 1,5-6,0 рочно рафинозу, декстрин, не мкм сбраживает манит, арабино- кишечник зы, ксилозу, рамнозу, сорбит, глицерин Lactobacterium палочки разной мелкие, casei длины, в виде гладкие, бес- зу, лактозу, мальтозу, маннит, одиночных или цветные ксилозу, маннозу, салицин, 30 80-180 сбраживает глюкозу, галакто- сдвоенных кле- декстрин, выборочно сорбит, ток не сбраживает рафинозу, сыры рамнозу, глицерин Lactobacterium палочки разной мелкие, бе- plantarum длины, образу- ловатые, зу, лактозу, сахарозу, мальто- ющие короткие и плоские зу, маннит, арабинозы, ксило- 30 180 сбраживает глюкозу, галакто- длинные цепоч- зу, маннозу, рафинозу, сор- ки 3-8 мкм бит, салицин, декстрин, не сыры сбраживает рамнозу, глицерин, крахмал Lactobacterium мелкие клетки гладкие, бле- brevis 1,5- 5 мкм стящие 30 180 сбраживает глюкозу, галакто- молоко и зу, лактозу, мальтозу, маннит, растительные выборочно сахарозу, араби- остатки нозу, ксилозу, маннозу, рафинозу, рамнозу, салицин, глицерин, декстрин, крахмал, не сбраживают сорбит Примечание. Все палочки неподвижные, не образуют спор, грамположительные. Ржевская В.С. изучала влияние на молочнокислые бактерии фенола, желчи, хлористого натрия и этилового спирта. Исследование показало, что АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 25 изучаемые штаммы способны противостоять химически агрессивным факторам среды, результаты представлены в таблице 1.2.3. Таблица 1.2.3 – Устойчивость молочнокислых бактерий к химически агрессивным факторам среды Физиолого-биохимические свойства Штаммы молочнокислых бактерий L. casei 6 L. plantarum 20 L. lactis 4/6 Фенол 0,4 0,4 0,2 Желчь 50 50 40 Хлорид натрия 16 16 6 Этанол 34 28 30 Как следует из данных таблицы 1, бактерии рода Lactobacillus продолжали расти в присутствии 0,4 %-ной концентрации фенолов в среде культивирования. L. lactis 4/6 проявил меньшую фенолоустойчивость – максимальная концентрация фенолов, при которой наблюдался рост данного штамма, составила всего 0,2 %. У штаммов лактобацилл отмечена и более высокая желчеустойчивость, они росли при 50 %-ной концентрации желчи в среде, а стрептококк – лишь при 40 %. Исследуемые молочнокислые бактерии были достаточно спиртоустойчивыми: штамм L. lactis 4/6 выдерживал 30 %-ную концентрацию этанола в среде, L. plantarum – 20–28 %. Самую высокую степень спиртоустойчивость проявил штамм L. casei 6 – его рост продолжался при 34 %-ной концентрации этилового спирта в среде культивирования. Бактерии рода Lactobacillus оказались и достаточно солеустойчивыми: рост клеток наблюдался при 16 % натрия хлористого в среде культивирования, стрептококк развивался при более низкой концентрации поваренной соли – 6 %. Таким образом, изученные физиолого-биохимические свойства (достаточно высокая степень феноло- спирто- желчеустйчивости) является доказательством приспособленности изучаемых микроорганизмов к агрессивным химическим факторам среды. Высокая степень солеустойчивости свидетельАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 26 ствует о том, что исследуемые штаммы молочнокислых бактерий можно использовать даже на засоленных почвах. Для детальной характеристики особенностей метаболизма исследуемых штаммов молочнокислых бактерий изучалась степень их ферментативной активности, результаты представлены в таблице 1.2.4. Таблица 1.2.4 – Физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий Штаммы молочнокислых бактерий Фактор среды L. casei 6 L. plantarum 20 L. lactis 4/6 Концентрация в среде культивирования, % Амилолитическая активность Липолитическая активность Протеолитическая активность Выделение аминокислот – – + + + + + + – валин лейцин Лейцин, валин, глутаминовая кислота У микроорганизмов выделенных штаммов обнаружен разный уровень протеолитической активности, проявляющийся в гидролизе белков на олиго- и полипептиды. Исследования показали, что молочнокислые бактерии рода Lactobacillus расщепляли казеин: зона гидролиза у штамма L. plantarum 20 составила 5 мм, у L. casei 6–4 мм, у штамма L. lactis 4/6 протеолиз отсутствовал. У обоих штаммов лактобацилл амилолитическая активность не выявлена, у штамма L. lactis 4/6 зона гидролиза крахмала составила 6,0±0,2 мм. У всех исследованных штаммов молочнокислых бактерий выявлена слабая липолитическая активность. Достаточно высокий уровень метаболической активности выявлен у штамма L.lactis 4/6. Проведенный хроматографический анализ показал, что эти бактерии выделяли в среду культивирования наибольшее количество свободных аминокислот (лейцин, валин, глутаминовая кислота). АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 27 Все исследуемые штаммы сбраживали обезжиренное молоко с образованием гомогенного сгустка. Посевы в молоко позволили выявить у изучаемых бактерий разную степень кислотообразования. Титруемая кислотность у L. lactis 4/6 составила 72 °Т, у L. plantarum 20–55 °Т, у L. casei 6–90 °Т. Все исследуемые штаммы створаживали молоко с метиленовой синью и восстанавливали лакмусовое молоко. Рост штамма L. plantarum 20 наблюдался при значениях рН 4,0–9,0, штамма L.casei 6 – при рН 4,0–7,0, штамма L. lactis 4/6 – при 6,0–8,0. Штамм Lactococcus lactis 4/6 на кровяном агаре не вызывал гемолиз крови. Изучение степени антибиотикорезистентности молочнокислых бактерий представляется особенно интересным, поскольку в настоящее время в качестве почвенных органических удобрений вносят птичий помет и навоз крупного рогатого скота, которые содержат антибиотики, подавляющие развитие почвенной микрофлоры или микроорганизмов, входящие в состав биопрепаратов. Степень чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам, наиболее часто используемым в ветеринарии, определяли дискодиффузным методом, измеряя диаметры зон задержки роста (ДЗЗР). Молочнокислые бактерии L. casei 6 и L. plantarum 20 были наименее чувствительны к действию офлоксацина. По отношению к тетрациклину, спирaмицину, тилозину все исследуемые штаммы молочнокислых бактерий проявляли высокую чувствительность. Штамм L. lactis 4/6 оказался более устойчивым к антибиотикам, особенно к спирaмицину, проявляя умеренную чувствительность к офлоксацину, тетрациклину и тилозину, результаты представлены в таблице 1.2.5. Таблица 1.2.5 – Антибиотикочувствительность молочнокислых бактерий Антибиотики ДЗЗР, мм L. casei 6 L. plantarum 20 L. lactis 4/6 Офлоксацин 16,0±0,8 20,0±1,0 22,0±0,9 Тетрациклин 30,0±1,0 36,0±0,9 22,0±1,1 Спиромицин 38,0±0,8 50,0±0,9 17,0±1,0 Тилозин 40,0±0,8 41,5±1,5 20,0±1,0 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 28 Характерной особенностью молочнокислых бактерий является подавление роста условно-патогенных бактерий, плесневых, фитопатогенных и токсинообразующих грибов. В ходе проведенных экспериментов установлено, что исследованные штаммы молочнокислых бактерий проявляли высокую антагонистическую активность по отношению к санитарно-значимым кишечным микроорганизмам (Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas aerogenosa, Salmonella typhimurium), образуя зоны подавления роста тест-культур диаметром более 20 мм, результаты представлены в таблице 1.2.6. У штамма L. casei 6 выявлена слабая фунгицидная активность по отношению к таким микромицетам, как Aspergillus candidus, A. fischeri и A. аlternata. Эти бактерии не подавляли рост A. flavus и Fusarium moniliforme, но обладали высокой антагонистической активностью по отношению к A. pulvinus, F. sulphureum и Scopulariopsis brevicaulis. Штамм L. plantarum 20 не подавлял рост всех изученных фитопатогенных грибов, а также плесневых грибов A. candidus, A. flavus; слабая антагонистическая активность проявилась лишь по отношению к A. fischeri. Высокая фунгицидная активность L. plantarum 20 выявлена по отношению к A. pulvinus и S. brevicaulis. Штамм L. lactis 4/6 обладал высокой фунгицидной активностью лишь по отношению к S. brevicaulis, рост других фитопатогенным грибов он подавлял слабо. Таким образом, бактерии исследуемых штаммов обладали определенным уровнем фунгицидной и бактерицидной активности, что свидетельствует об их выраженных антагонистических свойствах по отношению к наиболее распространенным фитопатогенам. Таблица 1.2.6 – Антагонистическая активность молочнокислых бактерий Тест-культуры Группа микроорганизмов ДЗЗР, мм Виды микроор- L. casei 6 L. plantarum 20 L. lactis 4/6 Штаммы санитарно-значимых S.aureus 24,0±0,4 25,6±0,5 24,0±0,5 кишечных микроорганизмов 20,9±0,5 38,5±0,7 30,6±0,4 ганизмов P.vulgaris АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 29 Продолжение таблицы 1.2.6 Тест-культуры Группа микроорганизмов ДЗЗР, мм Виды микроор- L. casei 6 L. plantarum 20 L. lactis 4/6 28,0±0,7 30,0±0,6 32,0±0,9 30,0±0,6 28,5±0,5 30,0±0,5 S.tuphimurium 25,0±0,4 25,8±0,5 28,0±0,6 A.candidus 15,0±0,5 0 0 0 0 0 A.pulvinus 25,0±1,0 23,0±1,0 0 A.fischeri 15,0±1,0 16,0±1,0 0 F.moniliforme 0 0 17,0±1,0 F.sulphureum 20,0±2,5 0 18,0±1,0 A.alternata 15,0±2,0 0 16,0±2,0 S.brevicaulis 23,0±1,0 22,0±1,0 24,0±1,0 ганизмов E.coli Штаммы санитарно-значимых P.aerogenosa кишечных микроорганизмов Плесневые грибы Фитопатогенные грибы Токсинообразующие грибы A.flavus Как правило, проявление протекторных свойств метаболитов бактериальной природы часто коррелирует с их положительным воздействием на ростовые процессы. Важность этого критерия при выборе микроорганизмов обусловлена тем, что фитостимулирующие микроорганизмы, продуцируя и выделяя экзометаболиты (ферменты, витамины, аминокислоты, витамины и другие важные биологически активные вещества) обеспечивают более высокий процент и более высокую скорость прорастания семян растений, от чего во многом зависит направленность дальнейших процессов развития проростков. 1.3 Способы получения бактериальных концентратов Основной задачей технологии производства бактериальных препаратов на основе живых микроорганизмов заключается в обеспечении таких услоАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 30 вий получения и переработки микробной массы, при которых в готовой продукции сохранилось бы максимальное число жизнеспособных клеток и не утрачивались бы их полезные свойства. Специализированные лаборатории и биофабрики выпускают закваски следующих видов: жидкие (обозначаются буквой Ж); сухие (обозначаются буквой С); замороженные (обозначаются буквой З); на плотных питательных средах (обозначаются буквами ПС). В зависимости от количества жизнеспособных клеток и способа производства различают бактериальные закваски (БЗ) и бактериальные концентраты (БК). При изготовлении бактериальных заквасок не производят концентрирование микробных клеток, поэтому количество жизнеспособных клеток в 1 см3 или 1 г заквасок составляет не более 10 млрд. При изготовлении бактериальных концентратов проводят обязательное концентрирование микробной массы, поэтому численность жизнеспособных клеток в 1 см3 или 1 г концентрата составляет сотни миллиардов. [55] Жидкие закваски представляют собой чистые культуры, находящиеся в активном состоянии и выращенные в стерильном молоке. Срок годности их составляет 2 недели при температуре хранения 3–6 °С. При длительном транспортировании без соблюдения режима охлаждения активность культур, входящих в жидкие закваски, быстро снижается. С целью повышения сроков хранения заквасок, их активности и увеличения в заквасках количества бактериальных клеток вырабатываются сухие закваски, а также жидкий и сухой бактериальный концентрат. Жидкий бактериальный концентрат приготавливается путем культивирования молочнокислых бактерий в питательной среде, их концентрирования (центрифужным способом) и смешивания полученной биомассы с защитной средой. Сухой бактериальный концентрат вырабатывается из жидкого препарата (с защитной средой) путем его сублимационной сушки. Способ сублимационной сушки заключается в высушивании бактериального препарата в замороженном состоянии при глубоком вакууме. При этом содерАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 31 жание микробных клеток в 1 г сухого бактериального препарата повышается до сотен миллиардов клеток, а срок хранения увеличивается до 4 мес. Сухие закваски вырабатывают из жидких путем их сушки методом распыления или сублимации. При производстве сухих заквасок с помощью распылительных сушилок активность чистых культур сохраняется до 3 мес. При сублимационном способе сушки сохраняемость живых клеток достигает 90 % в течение нескольких месяцев и даже лет. Сухие бактериальные закваски и концентраты в отличие от жидких являются наиболее транспортабельными и могут сохраняться в течение длительного времени. При использовании сухого бактериального концентрата упрощается схема приготовления заквасок беспересадочным способам. Сухой бактериальный концентрат активизируется путем растворения его в стерилизованном обезжиренном молоке и выдержки в течение 1,5–5 ч при оптимальной температуре развития бактериальных клеток. После активации бактериальный препарат направляется непосредственно в производство или для получения первичной производственной закваски, приготовленной на пастеризованном молоке. Разработаны закваски прямого внесения. В качестве таких заквасок используют культуры DVS (прямое сквашивание в емкости), которые просты в употреблении и не требуют предварительной подготовки, например активизации. В зависимости от числа видов микроорганизмов, входящих в состав микрофлоры, закваски подразделяют на два типа: моновидовые, состоящие из микроорганизмов одного вида или разновидности, которые условно обозначают буквой, и поливидовые, в состав микрофлоры которых входит два или более видов микроорганизмов. [33] Цикл получения бактериального концентратов предусматривает приготовление питательной среды, ее термическую обработку, охлаждение до температуры культивирования, внесение посевного материала, наращивание бактериальной массы, отделение ее от культуральной среды и концентрирование. Важное значение имеет этап накопления биомассы микроорганизмов, эффективность которого в большей степени зависит от условий культивирования и активности посевного материала. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 32 Молочнокислые бактерии различаются по потребности в стимуляторах роста, в связи с этим предложены различные питательные среды для выращивания мезофильных, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек. В качестве источника углерода они могут использовать моно- и дисахариды, органические кислоты. На обычных питательных средах они не развиваются, а растут на средах с добавлением аминокислот, гидролизатов белков мяса, лактоальбумина, казеина, различных видов муки. Положительно влияет на рост микроорганизмов добавление кукурузы, моркови, картофеля, дрожжевого автолизата, а так же некоторые пептиды, пурины, жирные кислоты. Молоко как среду накопления клеток молочнокислых бактерий, без специальной предварительной обработки использовать невозможно из-за коагуляции белков, что очень затрудняет отделение клеток. В связи с этим были проведены многочисленные исследования по использованию для накопления биомассы жидкой среды, состоящей из стандартных компонентов, а также молочной сыворотки с добавлением необходимых факторов роста. В качестве стимуляторов роста различными авторами было рекомендовано использовать дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, микроэлементы. При культивировании анаэробных микроорганизмов необходимы компоненты для уплотнения среды. В большинстве случаев для этих целей применяют агар-агар. В качестве альтернативного решения, для снижения затрат и повышения функциональных характеристик готового продукта, представляется возможным частичная или полная замена агара на полисахариды растительного происхождения со способностью к гелеобразованию. Известны составы питательных сред, которые используют для выращивания лактобактерий, например среда Блаурокка. Для приготовления этой среды необходимо 500 г говяжьей печени, освобожденной от сухожилий, пропустить через мясорубку, затем фарш заливают двойным количеством воды и кипятят в течение 2 ч, затем фильтруют. Фильтрат доводят дистиллированной водой до 1 000 см и вносят 10 г пептона, 10 г лактозы, 100 мг хлористого цистеина, 5 г NаС1 и агара 1–2 г. рН среды 6,8–7,0. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 33 При этом существенными недостатками многих известных сред является их недостаточная эффективными, и дороговизна. Наиболее близким по совокупности существенных признаков к предлагаемому составу является известный состав питательной среды для роста лактобактерий. Известный состав представляет собой гидролизат молока, в который введены в качестве добавок пептон, хлорид натрия, агар-агар, лактоза, цистеин солянокислый, при следующем соотношении компонентов, г/л: Пептон - 2,0; Хлорид натрия - 5,00; Агар-агар - 0,75; Лактоза - 10,00; Цистеин солянокислый - 0,10; Гидролизат молока - Остальное Данный состав находит применение в практике для роста лактобактерий, однако наряду с дорогой основой - белковым препаратом - гидролизатом молока, он содержит и дорогие добавки, такие как пептон, цистеин солянокислый. Кроме того, данный состав является недостаточно эффективной питательной средой для выращивания лактобактерий, а технология его получения достаточно дорога. Рахманов Рафаил Салыхович расширил арсенала питательных сред для роста лактобактерий, при ее высокой эффективности для выращивания данных бактерий и простоте технологии получения. Он составил такую среду, которая содержрит белковый гидролизат и агар-агар, дополнительно содержит аскорбиновую кислоту, а в качестве белкового гидролизата - белковый гидролизат крови или белковый гидролизат заменителя крови, при следующим соотношении компонентов, г/л: Аскорбиновая кислота - 0,01–0,10 Агар-агар - 0,70–0,80. Белковый гидролизат крови или белковый гидролизат заменителя крови – Остальное. Предлагаемый состав готовят следующим образом: полученный белковый гидролизат крови или белковый гидролизат заменителя крови разводят дистиллированной водой в соотношении 1:2, после чего в него вводят агар-агар и аскор- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 34 биновую кислоту. Полученный состав предварительно прогревают текучим паром 30 минут, а затем стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 30 минут [29]. В процессе производства бактериальных препаратов важным этапом является культивирование микроорганизмов. Основными факторами, ограничивающим рост микроорганизмов в периодических процессах являются исчерпание питательных сред и накопление в культуральной среде токсических продуктов метаболизма. Поэтому в микробиологической практике находят режимы дробной подачи некоторых субстратов в зону роста. Однако проблема сохранения жизнеспособности и основных свойств микробов при производстве бактериальных препаратов состоит не только в подборе комплекса питательных веществ для их роста. Важную роль при этом отводится условиям культивирования бактерий. Цикл развития культуры начинается с засева среды. Засев осуществляется в таком количестве, которое обеспечивает начало роста микроорганизмов с минимальной задержкой. Для многих молочнокислых бактерий активный «омоложенный» посевной материал применяется в количестве 1–3 % от объема среды. Посевной материал, попав в свежую полноценную среду, постепенно начинает размножаться. Через определенное время в стационарной фазе масса клеток в питательной среде достигает максимального уровня. Немаловажную роль для роста бактерий играют буферные свойства среды. Для поддержания оптимальной для роста буферной емкости среды используют натриевые или калиевые соли лимонной, фосфорной или уксусной кислот. Следующим необходимым этапом при получении бактериальных препаратов является отделение биомассы от культуральной среды. Для этой цели используют сепараторы или бактофуги. При этом эффект выделения бактериальных клеток из культуральной жидкости определяется формой клеток, плотностью питательной среды, режимом бактериотделения. Существенно влияет на активность полученных препаратов и на их стойкость продолжительность выращивания клеток перед их отделением. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 35 Многие исследователи рекомендуют отделять клетки в конце логарифмической, перед началом стационарной фазы роста, что обеспечивает максимальный выход клеток и их стойкость. Затем в зависимости от выбранного способа консервирования биомассы производится розлив во флаконы и хранение, замораживание или высушивание. [38] 1.5 Заключение по обзору литературы Проведенный обзор литературных данных позволяет сделать вывод о том, что в мире на данный момент изучаются и разрабатываются разные способы приготовления питательных сред для получения бактериального концентрата лактобактерий. При создании и усовершенствовании уже выпускающихся бактериальных концентратов необходимы дальнейшие исследования по изучению свойств производственных штаммов, отработке технологических режимов производства, разработке эффективных и экономичных питательных сред. В условиях расширения спроса на бактерийные концентраты особое значение приобретают доступные, стандартные и экономичные питательные среды, используемые для глубинного культивирования продуцентов при получении бактериальных концентратов. Питательная среда, по-существу, является основой бактерийных концентратов. Качественный и количественный состав питательной среды определяет ее способность обеспечивать наиболее эффективный путь наращивания биомассы бактерий, сохранять жизнеспособность клеток в процессе хранения концентратов. Таким образом, качество бактериальных концентратов и эффективность биотехнологии их производства зависит в первую очередь от успешного выбора питательной среды. В этой связи разработка новых способов приготовления питательных сред для культивирования лактобактерий является актуальной и важной научно-технической задачей. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 36 Целью дипломной работы являлось исследование и разработка питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Для реализации поставленной цели сформулированы задачи исследований: − провести анализ отечественных и зарубежных литературных данных по изучаемой проблеме, сформулировать задачи собственных исследований; − изучить физиолого-биохимические и морфологические свойства штамма молочнокислых бактерий; − подобрать состав питательной среды для культивирования лактобактерий; − провести анализ полученного концентрата лактобактерий; − подвести итоги полученных результатов проведенной работы. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 37 ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В настоящей главе рассмотрены вопросы, касающиеся организации выполнения работы, объектов и методов исследования. Представлены результаты собственных исследований и их обсуждение. 2.1 Организация выполнения работы Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждении высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)». Работа состояла из нескольких последовательных этапов. На первом этапе работы проводили анализ отечественных и зарубежных литературных данных по теме исследования, формулировали цель и задачи собственных исследований. На втором этапе изучали физиолого-биохимические и морфологические свойства штамма молочнокислых бактерий. А также были рассмотрены культуральные свойства молочнокислых бактерий, а именно цвет, структуру колонии, консистенцию колонии, прозрачность, поверхность колонии, профиль колонии, характер контура края. На третьем этапе совершенствовали состав питательной среды для культивирования лактобактерий. На четвертом этапе исследований провели анализ физико-химических свойств полученной питательной среды. Заключительный этап исследований посвящен подведению итогов полученных результатов проведенной работы. Общая схема проведения исследований показана на рисунке 2.1.1. Весь цикл исследований состоит из нескольких взаимосвязанных этапов. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 38 Анализ отечественных и зарубежных литературных данных по изучаемой теме, формулировка цели и задач собственных исследований Изучение физиолого-биохимических и морфологических свойств штамма молочнокислых бактерий - морфологические свойства - отношение к источникам углерода, азота - культуральные свойства - накопление биомассы - продолжительность культивирования Совершенствование питательной среды для культивирования лактобактерий - рН - температура - массовая доля аминного азота - сухие вещества - титруемая кислотность - рН - титруемая кислотность Анализ физико-химических свойств полученной питательной среды - сухие вещества - массовая доля аминного азота - накопление биомассы - продолжительность культивирования Практическая реализация результатов исследования Рисунок 2.1.1. – Общая схема проведения исследований АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 39 2.2 Объекты исследования, оборудование Объектами исследования на различных этапах являлись: − лиофилизированные штаммы микроорганизмов: Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90T-C4; − вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72); − полужидкая питательная среда с лактозой (ГОСТ 10444.11-89); − жидкая питательная среда МПБ (ГОСТ 20730-2009); − питательный бульон (ГОСТ Р 54065-2010); − гидролизованное молоко (ГОСТ 10444.11-89); − обезжиренное молоко (ГОСТ 30425-97); − гидроксид натрия (ГОСТ 4328-77); − гидрофосфат натрия (ГОСТ 4172-76); − уксусная кислота (ГОСТ 19814-74); − хлороформ (ТУ 2631-066-44493179-01); − глюкоза (ГОСТ 957-88); − дрожжевой экстракт (ГОСТ 4172-76). В ходе исследований использовалось оборудование: − стерилизатор паровой (автоклав электрический), DGM Pressure Gauge (ГОСТ 9586-75), производство Китай; − весы электронные аналитические, AND HR-202, производство Япония; − прибор для титрования; − микроскоп прямой AxioScope A1 Carl Zeiss AG, производство Китай; − рН-метр рН-150МИ, производство Россия; − шкаф электрический суховоздушный, ШСвЛ-80 – «Касимов» (ТУ 9452005-07505566-98 №147), производство Россия; − инкубатор LabTech LSI-301А, производство Корея; − электрическая плита SUPRA, производство КНР. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 40 2.3 Методы исследования Для решения задач, поставленных в работе, использовали стандартные, общепринятые методы исследования (микробиологические, химические и физико-химические). 2.3.1 Приготовление питательных сред и культивирование микроорганизмов Приготовление питательной среды включает в себя дозирование и взвешивание компонентов питательной среды, которые могут находиться в твердом или жидком виде, собственно приготовление питательной среды и ее стерилизацию. При разработке новой питательной среды для культивирования лактобактерий приготовили несколько уже известных вариантов питательных сред, варианты питательных сред представлены в таблице 2.3.1.1. Колбы с питательными средами автоклавировали при температуре 121±2 оС в течение 20–30 минут и охлаждали до 40±2 оС. Перед началом культивировании лактобактерий необходимо провести их активизацию в стерильной воде. Для этого необходимо лиофилизат лактобактерий растворить в небольшом количестве стерильной воды. С целью предохранения посевов от загрязнения посторонними микроорганизмами постановку опытов проводим вблизи зажженной спиртовки, предварительно обработав рабочий стол и руки 70 %-ым спиртом. Посуда, используемая при посеве предварительно стерилизуется в сушильном шкафу. Посев проводили при помощи пипетки – набираем в пипетку полученную суспензию лактобактерий в количестве 3 % от объема питательной среды и переносим в приготовленные питательные среды. Культивирование проводим в термостате при температуре 37 оС в течение трех суток. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 41 Таблица 2.3.1.1 – Варианты питательных сред Номер Название среды питательной среды Полужидкая среда 1 с лактозой Питательный бульон 2 Компоненты Содержание компонентов, % – пептон; – 1; – натрий хлористый; – 0,5; – агар-агар; – 0,4; – лактоза; – 0,5; – дистиллированная вода. – остальное. – пептон; – 1; – натрий хлористый; – 0,5; – дистиллированная вода. – остальное. 3 Гидролизованное молоко 1 – молоко; – 50; 4 Гидролизованное молоко 2 – панкреатин; – 0,1; Гидролизованное молоко 3 – хлороформ; – 0,6; 5 – дистиллированная вода. – остальное. – молоко; – 50; – панкреатин; – 0,1; – хлороформ; – 0,6; – дрожжевой экстракт; – 0,5; – глюкоза; – 1; – дистиллированная вода. – остальное. Новая питательная среда 6 Состав полужидкой среды с лактозой состоит из следующих компонентов: пептон – 10 г, натрий хлористый – 5 г, агар-агар – 4 г, лактоза – 5 г и дистиллированная вода до 1000 мл. Среда была приготовлена из промышленного выпуска сухих сред, согласно способу приготовления, указанному на упаковке. Приготовление заключается в растворении 2,9 г порошка в 100 мл дистиллированной воды, доведении полученной смеси до кипения. Далее колба со средой закрывается ватно-марлевой пробкой и отправляется на стерилизацию в автоклав. В состав питательного бульона входят следующие компоненты: пептон – 10 г, натрий хлористый – 5 г и мясной экстракт до 1000 мл. Среда была приготовлена из промышленного выпуска сухих сред, согласно способу приготовления, указанному на упаковке. Приготовление заключается в растворении 2,5 г порошка АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 42 в 100 мл дистиллированной воды, доведении полученной смеси до кипения. Далее колба со средой закрывается ватно-марлевой пробкой и отправляется на стерилизацию. Стерилизация питательных сред проводится насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе (автоклаве). Приготовление гидролизованного молока проходило в соответствии с ГОСТ 10444.11-89. Натуральное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят или обрабатывают текучим паром в течение 20 мин и охлаждают до температуры 45±2 °С. Доводят активную кислотность до рН 7,7±0,1, добавляя водный раствор с массовой долей NaOH 40 %. К 1000 мл молока добавляют от 0,5 до 1,0 г порошка панкреатина. Затем к молоку добавляют от 5 до 6 мл хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при температуре 40±2 °С в течение 18–24 ч. В течение первых 3–5 ч молоко 2–3 раза перемешивают (пробку после перемешивания приоткрывают для удаления хлороформа). Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1, устанавливают активную кислотность рН 7,1±0,1, добавляя водный раствор с массовой долей NaOH 40 %. В случае хранения гидролизованное молоко стерилизуют в автоклаве при температуре 121±1 °С в течение 20–30 мин. Так как приготовленные образцы гидролизованного молока использовались сразу, то они не подвергались стерилизации. Эксперимент проводился с тремя образцами гидролизованного молока. Первый образец был приготовлен в соответствии с ГОСТ 10444.11-89, время инкубации составляло 24 ч. Второй образец также был приготовлен в соответствии с ГОСТ 10444.1189, но время инкубации составляло 48 ч. Третий образец тоже был приготовлен в соответствии с ГОСТ 10444.11-89, но время инкубации составляло уже 72 ч. В результате мы получили три разных среды с различными параметрами, которые отображены в таблице 2.4.2.2. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 43 2.3.2 Методики для изучения питательной среды Оценка качества питательных сред проводится с помощью совокупности показателей, которые включают в себя определение активной кислотности, определение титруемой кислотности, определение аминного азота в питательной среде, количественный учет микроорганизмов развивающихся на питательной среде. 2.3.2.1 Определение активной кислотности Метод определения активной кислотности основан на измерении концентрации водородных ионов в исследуемом растворе с помощью прибора рН-метра. Определение рН питательных сред проводим согласно ГОСТ 26781-85 потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода. Подготовка pH-метра и электродной системы производится согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Перед работой на потенциометре необходимо, пользуясь стандартными буферными растворами с заданным значением при 25 °С, провести калибровку прибора. Перед измерением электрод тщательно промываем дистиллированной водой, остатки воды с электрода удаляем фильтровальной бумагой. В жидкой питательной среде определяем рН непосредственно в растворе. В стеклянный стакан вместимостью 50 или 100 мл наливаем 40±5 мл питательной среды с температурой 20±2 оС и погружаем в него электрод прибора. При этом электрод не должен касаться стенок и дна стакана. Показания считываем через 5 с после установления значения. Оценку значения pH питательных сред необходимо проводить с учетом последующей стерилизации. Необходимо учесть то, что автоклавирование, как правило, приводит к снижению pH, поэтому перед стерилизацией pH среды повышают на 0,2 единицы от требуемой величины, а после автоклавирования реакцию среды проверяют повторно. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 44 2.3.2.2 Определение титруемой кислотности с применением индикатора фенолфталеина Метод основан на нейтрализации кислот, содержащихся в продукте, раствором гидроокиси натрия в присутствии индикатора фенолфталеина. Измерение проводили следующим образом. В стакан вместимостью 100 см3 отмеривают 20 см3 дистиллированной воды, 10 см3 анализируемого продукта и три капли фенолфталеина. Смесь тщательно перемешивают и титруют 0,1Н раствором гидроокиси натрия до появления слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Титруемую кислотность исследуемой пробы (Х) в градусах Тернера определяли по формуле 2.3.3.2. Х = V·10, (2.3.2.2.1) где V – объем 0,1Н раствора гидроокиси натрия, пошедший на титрование для нейтрализации кислот, содержащихся в пробе, мл. 2.3.2.3 Определение аминного азота в питательной среде йодометрическим методом Перед проведением анализа необходимо приготовить суспензию фосфата меди. Суспензию фосфата меди необходимо готовить не менее чем за 24 часа до употребления. Сначала готовят раствор Na 3 PO 4 , для чего растворяют 25,6 г Na 2 HPO 4 в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 180 мл 1Н NaOH и доводят водой до 1 л. К 1 объему полученного раствора Na 3 PO 4 добавляют 1 объем раствора CuCl 2 (27,3 г CuCl 2 в 1 л) и смесь хорошо пере- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 45 мешивают. Затем приливают 4 объема 2,56 %-ного раствора Na 2 HPO 4 и нагревают с обратным холодильником в течение часа. Опыт проводили следующим образом. В мерную колбу объемом 50 мл пипеткой вносят 10 мл молочной сыворотки, добавляют 3–4 капли тимолфталеина и по каплям 1Н раствор NaOH до появления бледно-голубой окраски. К слабощелочному раствору из цилиндра при помешивании приливают 30 мл суспензии фосфата меди (перед этим суспензию необходимо взболтать), содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через плотной фильтр. Фильтрат должен быть совершенно прозрачным. 10 мл фильтрата пипеткой переносят в коническую колбу, добавляют 0,5 мл уксусной кислоты, 1 г йодида калия и перемешивают. Выделившийся йод титруют из микробюретки 0,01Н раствором тиосульфата натрия, прибавляя в конце титрования 1–2 капли раствора крахмала. Окончание титрования определяют по исчезновению синей окраски. Количество аминного азота (Х) вычисляют по формуле (2.3.3.3). Х= а∙0,2∙𝑉𝑉∙10∙100 50 , (2.3.2.3.1) где а – количество 0,01Н раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование, мл; V – объем исследуемой жидкости, взятый на анализ, мл. 2.3.2.4 Метод количественного учета микроорганизмов Определение микроорганизмов в исследуемом материале начинают с приготовления разведений. Для приготовления разведений используют ряд пробирок с 9 мл стерильной воды. В первую пробирку с 9 мл стерильной воды стерильной пипеткой вносят 1 мл исследуемого материала и получаем разведение 1:10. Новой стерильной пипеткой перемешивают содержимое, после чего этой же пипеткой АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 46 отбирают 1 мл разведения 1:10 и переносят во вторую пробирку, получая разведение 1:100. Затем стерильной пипеткой отбирают 1 мл разведения 1:100 и переносят в третью пробирку, получают разведение 1:1000 и т.д. Для приготовления каждого разведения пользуются отдельной стерильной пипеткой. Определение количества микроорганизмов заключается в посеве 1 мл разведений исследуемого материала в 9 мл молока, с последующим культивированием при оптимальной температуре в течение 24 ч. Для каждого разведения используется отдельная пробирка с молоком. Степень активности микроорганизмов определяется визуально, по наличию сгустка. 2.3.2.5 Определение срока годности питательной среды Для определения сроков годности питательных сред можно использовать метод выемок проб, а для сухих питательных сред также метод «ускоренного старения». Метод выемок проб основан на изучении стабильности показателей качества препарата при хранении его в течение определенного срока при определенной температуре. С этой целью на хранение при соответствующей температуре ( 18–25 оС или 2–8 оС) закладываются образцы препарата. Срок годности среды вычисляется как время хранения препарата, при котором все показатели его качества не изменяются или находятся в пределах допустимых значений, минус 3 месяца. Срок годности для большинства сухих питательных сред от 2 до 5 лет, готовых – 1 год. Срок годности приготовленных сред определяют следующим образом. Среду готовят к использованию (вносят добавки, разливают в пробирки, чашки Петри и т.д.), помещают в определенные условия (tо, свет) и устанавливают, в течение какого времени и при каких условиях среда сохраняет свой исковый внешний вид (цвет, прозрачность, отсутствие признаков высыхания), рН и специфическую активность. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 47 2.3.2.6 Определение прозрачности и цветности питательной среды Прозрачность и цветность готовых питательных сред, разлитых во флаконы, определяют визуально в проходящем свете. Раствор препарата, а также готовая среда могут быть либо прозрачными, либо с незначительной опалесценцией, либо непрозрачными. 2.3.3 Методики для изучения морфологических свойств штамма молочнокислых бактерий При изучении морфологических признаков, рассматривают следующие признаки: строение, форма и размер клетки, их взаимное расположение, тинкториальные свойства (особенности при окрашивании различными красителями), способность к образованию спор и капсул, подвижность, наличие жгутиков, присутствие в клетках включений, особенности размножения. С помощью морфологических признаков можно легко и достаточно быстро распределить микроорганизмы на группы. 2.3.3.1 Окраска бактерий по Граму Метод предложен датским ученым Грамом в 1884 г. Сущность метода заключается в различном окрашивании в зависимости от строения и химического состава клеточной стенки бактерий. По отношению к окраске по Граму бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 48 Техника окраски заключается в следующем. На предметном стекле приготавливают фиксированный мазок исследуемой культуры. На фиксированный мазок через полоску фильтровальной бумаги наносят 2–3 капли раствора генцианвиолета на 2–3 мин, затем фильтровальную бумагу снимают с мазка, краску сливают. На препарат наносят 2–3 капли раствора Люголя и через 1–2 мин краску сливают. Мазок обрабатывают 96 % спиртом в течении 30–60 сек и затем быстро промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. Дополнительно окрашивают препарат красителем фуксином в течение 2–3 мин, промывают водой и просушивают водой и просушивают фильтровальной бумагой. На стекло наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют. 2.3.3.2 Окраска спор бактерий по Шефферу-Фултону Сущность метода заключается в комбинированном действии концентрированного раствора красителя бриллиантового зеленого и температуры на малопроницаемую оболочку спор с дальнейшим обесцвечиванием цитоплазмы вегетативной клетки и ее контрастным докрашиванием сафранином. Техника окраски заключается в следующем. На краю предметного стекла (на расстоянии примерно 1,5–2,0 см от края) приготавливают густой нефиксированный мазок культуры спорообразующих бактерий. На мазок наносят водный раствор бриллиантовой зелени и нагревают над огнем спиртовки до появления паров, не допуская прикипания краски к мазку, поэтому препарат периодически отстраняют от пламени. Нагревание мазка с краской проводят в течении 2–3 мин. Краску сливают, препарат быстро промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. На мазок наносят раствор сафранина на 2–3 мин. Краску сливают, мазок промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. На стекло наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 49 препарат. При окрашивании спор бактерий по Шефферу-Фултону споры окрашиваются в зеленый цвет, а клетки – в красный. 2.3.3.3 Определение подвижности бактерий Подвижность бактерий может определяться несколькими методами. Метод «раздавленная капля». Техника определения подвижности заключается в следующем. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю стерильной дистиллированной воды. В нее вносят петлей исследуемую культуру, хорошо размешивают ее до получения равномерной взвеси бактерий. Каплю накрывают чистым покровным стеклом. Рассматривают под микроскопом. Метод «висячая капля». Техника определения подвижности заключается в следующем. Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. Рассматривают под микроскопом. 2.4 Результаты собственных исследований В данном разделе изучаются физиолого-биохимические, морфологические и культуральные свойства молочнокислых бактерий. Так же в этом разделе описан процесс разработки новой питательной среды, представлены результаты собственных исследований и проведены исследования питательной среды до и после культивирования. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 50 2.4.1 Изучение физиолого-биохимических, морфологических и культуральных свойств штамма молочнокислых бактерий Лактобактерии (лат. Lactobacillus) – род грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий. В процессе своего нормального метаболизма лактобактерии способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим и вещества с антибиотической активностью: реутерин, плантарицин, лактоцидин, лактолин. С целью определения морфологических свойств лактобактерий проводили ряд опытов. Лактобактерии являются одними из важных в группе молочнокислых бактерий, большинство членов которой превращают лактозу и другие углеводы в молочную кислоту. В большинстве случаев они непатогенны, многие виды выполняют положительную роль в питании человека. У человека они постоянно присутствуют в кишечнике, во влагалище, где являются симбмонтами и составляют значительную часть микрофлоры кишечника. Многие виды принимают участие в разложении остатков растений. Они продуцируют молочную кислоту, а кислая среда препятствует росту многих патогенных бактерий и грибов. Некоторые виды Lactobacillus нашли применение в промышленности для производства кефира, йогурта, сыров. Результаты исследования морфологических свойств штамма лактобактерий. После проведения окраски по Граму наблюдаем что бактерии окрасились в сине-фиолетовый цвет. Это объясняется тем, что клеточная стенка грамположительных бактерий толстая, однослойная, содержит много пептидогликана – муреина (50–80 %), а также тейховые кислоты, на поверхности цитоплазмы образуется комплекс белка с рибонуклеатом магния. Эти вещества образуют прочное соединение с красителями – генцианвиолетом и йодом, и поэтому сине-фиолетовая окраска удерживается при обесцвечивании спиртом. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 51 При окрашивании спор бактерий по Шефферу-Фултону споры окрашиваются в зеленый цвет, а клетки – в красный. Так как зеленый цвет не проявился, то можно утверждать, что дактобактерии являются неспорообразующими. При определении подвижности бактерий было обнаружено что лактобактерии не являются подвижными. Это означает что у лактобактерий нет органов движения (жгутиков). Проведя ряд опытов, приходим к выводу, что лактобактерии это тонкие неподвижные одиночные или парные неспорообразующие грамположительные палочки. Рисунок 2.4.1.1 – Штамм лактобактерий под микроскопом Изучение физиолого-биохимических свойств лактобактерий. При изучении физиолого-биохимических свойств, рассматривают следующие признаки: отношение микроорганизмов к различным источникам углерода и азота, потребность в кислороде, температурные границы роста, солеустойчивость, чувствительность к антибиотикам и др. Простота внешней формы молочнокислых бактерий и строения их клетки делают классификацию по морфологическим признакам затруднительной. Поэтому физиолого-биохимические признаки занимают важное место при классификации микроорганизмов. Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 52 свидетельствуют об их приспособленности к различным факторам среды. Свойство сбраживать различные углеводы, включая сахара, спирты и органические кислоты лежит в основе отличительных признаков при идентификации молочнокислых бактерий. Результаты исследования физиолого-биохимических свойств культур изучаемых микроорганизмов приведены в таблице 2.4.1.1. Таблица 2.4.1.1 – Физиолого-биохимические признаки штаммов Название штамма Номер Название веществ п/п Lactobacillus plantarum Lactobacillus fermentum 8Р-А3 90Т-С4 1 Трегалаза – – 2 Каталаза – – 3 Меллибиоза + + 4 Мальтоза + + 5 Лактоза + + 6 Сахароза + + 7 Глюкоза + + 8 Фруктоза + + 9 Мелецитоза – – 10 Ксилоза – – 11 Галактоза + + 12 Манноза + + 13 Декстроза + + 14 Целлобиоза + + 15 Салицин + – 16 Маннит + – 17 Рамноза – – 18 Сорбит + – 19 Арабиноза – – 20 Эскулин + – Обозначение: + положительный результат – отрицательный результат АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 53 Известно, что различные штаммы одного и того же вида молочнокислых бактерий могут по-разному относится к одному и тому же источнику углерода, им необходимы разные ростовые факторы, такие как витамины, аминокислоты, пурины и пиримидины. По отношению к молекулярному кислороду бактерии являются факультативными анаэробами. Физиологической особенностью молочнокислых бактерий является их кислотоустойчивость, как следствие характерного для них энергетического обмена. Палочковидные молочнокислые бактерии не способны расти в среде с рН выше 6,0. Рост всех молочнокислых бактерий продолжается до тех пор, пока в процессе брожения углеводов рН в среде не снизится до 5,0 и ниже. Молочнокислые бактерии обладают определенной протеолитической активностью, обуславливаемой действием внеклеточных и внутриклеточных протеиназ и пептидаз. Изучение культуральных свойств лактобактерий. Таблица 2.4.1.2 – Характеристика культуральных свойств штаммов лактобактерий Наименование штамма Показатели Lactobacillus plantarum 8Р-А3 Lactobacillus fermentum 90Т-С4 Характер контура края волнистый ровный Профиль выпуклый плоский Поверхность гладкая Цвет белый кремово-белый Структура однородная Консистенция плотная Прозрачность матовая К культуральным свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных питательных средах. Эти особенности являются наиболее важными исследуемыми признаками, так как постоянны для всех видов бактерий. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием, они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 54 лежности исследуемой культуры. Результаты изучения культуральных свойств штаммов микроорганизмов представлены в таблице 2.4.1.2. При анализе данных, представленных в таблице, можно сделать вывод, о том, что выпуклая форма колоний наблюдалась у штамма Lactobacillus plantarum 8Р-А3, для штамма Lactobacillus fermentum 90Т-С4 характерен плоский профиль колоний. Поверхность выросших штаммов гладкая. Структура колоний у обоих штаммов однородная. Колонии штаммов Lactobacillus plantarum 8Р-А3 имеет белую окраску, в кремово-белый цвет окрашены колонии штамма Lactobacillus fermentum 90Т-С4. Характер контура края колоний у штамма Lactobacillus plantarum 8Р-А3 волнистый, для штамма Lactobacillus fermentum 90Т-С4 характерен ровный край. Консистенция колоний плотная. Колонии всех штаммов имеют матовую прозрачность. 2.4.2 Совершенствование питательной среды для культивирования лактобактерий Известно, что лактобактерии относятся к разряду высокотребовательных к источникам питания. Основными нутриентами, лимитирующими рост и влияющими на физиологическую активность данной бактериальной культуры, являются источники азота и углерода. Для улучшения накопления биомассы ей необходимы также дополнительные ростовые факторы (витамины, аминосахара и др.), которые должны быть представлены в готовом виде, так как эти бактерии неспособны синтезировать все компоненты, входящие в состав клеточного вещества. Этим обусловлено применение производственных сред сложного состава. Для подбора питательной среды с максимальным накоплением лактобактерий приготовили несколько вариантов питательных сред. Состав питательных сред представлен в таблице 2.3.1.1. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 55 Вначале проводили опыты на сухих средах промышленного выпуска, т.е. на питательном бульоне и полужидкой среде с лактозой. Среды были приготовлены согласно способу приготовления, указанному на упаковке, колбы с питательными средами автоклавировали при температуре 121±2 оС в течение 20–30 мин и охлаждали до 40±2 оС. Затем в колбы вносили активизированные лактобактерии в количестве 3 % от объема питательной среды и ставили в термостат при 37 оС на 24 ч, после культивирования готовили разведения и вносили в пробирки с молоком по 1 мл пробы и ставили в термостат на при 37 оС на 24 ч. Результаты представлены в таблице 2.4.2.1. Проведение первой серии опытов позволило выявить то, что оба варианта питательных сред показали невысокие результаты. Исходя из этого, можно сделать вывод, что питательный бульон и полужидкая среда с лактозой являются неблагоприятными для культивирования лактобактерий, количество микроорганизмов составляет лишь 104 КОЕ/см3. Таблица 2.4.2.1 – Результаты культивирования лактобактерий на сухих средах промышленного выпуска Название среды Время культивирования, ч Количество микроорганизмов, КОЕ/см3 Полужидкая среда с лактозой 24,0±0,5 104 Питательный бульон 24,0±0,5 104 Далее проводились опыты с тремя образцами гидролизованного молока. Три образца были приготовлены в соответствии с ГОСТ 10444.11-89, различно было лишь время инкубации, у первого образца оно составляло 24 ч, у второго оно было 48 ч, а у третьего 72 ч. В результате мы получили три разных среды с различными параметрами, которые отображены в таблице 2.4.2.2. Затем в колбы вносили активизированные лактобактерии в количестве 3 % от объема питательной среды и ставили в термостат при 37 оС на 24 ч, после культивирования готовили разведения и вносили в пробирки с молоком по 1 мл пробы АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 56 и ставили в термостат на при 37 оС на 24 ч. После культивирования, параметры среды изменились. Результаты приведены в таблице 2.4.2.3. Таблица 2.4.2.2 – Варианты трех образцов гидролизованного молока до культивирования Образец Время инкубации, ч рН среды Количество сухих ве- Количество аминного ществ, % азота, мг/ 100 см3 1 24,0±0,5 7,17±0,05 9,4±0,5 154±3,0 2 48,0±0,5 7,07±0,05 9,4±0,5 140±3,0 3 72,0±0,5 7,01±0,05 9,4±0,5 95,2±3,0 Таблица 2.4.2.3 – Варианты трех образцов гидролизованного молока до культивирования Образец Время инкубации, ч рН среды Массовая доля Количество Количество сухих веществ, аминного азота, микроорганиз- % мг/ 100 см3 мов, КОЕ/см3 1 24,0±0,5 4,25±0,05 4±0,5 817,6±3,0 104 2 48,0±0,5 4,19±0,05 4±0,5 576,8±3,0 104 3 72,0±0,5 4,13±0,05 4±0,5 291,2±3,0 109 Из таблицы видно, что первые два образца гидролизованного молока невысокие результаты и не пригодны для культивирования лактобактерий, так как на этих средах наблюдается незначительный рост лактобактерий, составляющий всего 104 КОЕ/мл. Проведение второй серии опытов позволило выявить то, что наилучшие результаты показал третий образец среды, приготовленный из гидролизованного молока в соответствии с ГОСТ, с временем инкубации 72 ч. Обобщая полученные результаты, можно отметить, что наилучшие результаты показала среда из гидролизованного молока с временем инкубации 72 ч, то именно ее мы взяли за основу новой питательной среды. В качестве источника углерода в гидролизованное молоко добавили глюкозу, также в среду добавили АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 57 дрожжевой экстракт, который является фактором роста. Компоненты, входящие в состав новой питательной среды указаны в таблице 2.3.1.1. 2.4.3 Анализ физико-химических свойств полученной питательной среды Новая питательная среда готовится следующим образом. Вначале готовим гидролизованное молоко в соответствии с ГОСТ 10444.11-89, с временем инкубации 72 ч. Доводим кислотность до рН 6,0 добавлением СН 3 СООН 10 %, затем добавляем глюкозу 1 % и дрожжевой экстракт 0,5 %. Далее в колбы вносили активизированные лактобактерии в количестве 3 % от объема питательной среды и ставили в термостат при 37 оС на 24 ч, после культивирования готовили разведения и вносили в пробирки с молоком по 1 мл пробы и ставили в термостат при 37 оС на 24 ч. Результаты приведены в таблице 2.4.3.1 и в таблице 2.4.3.2. Таблица 2.4.3.1 – Результаты исследования новой питательной среды перед культивированием рН среды Титруемая кислот- Массовая доля сухих Количество аминного ность, оТ веществ, % азота, мг/ 100 см3 21±0,5 5,6±0,5 364±3,0 6,0±0,05 Таблица 2.4.3.2 – Результаты исследования новой питательной среды после культивированием рН среды Титруемая кис- Массовая доля лотность, оТ сухих веществ, % 95±0,5 5±0,5 3,91±0,05 Количество Количество мик- аминного азота, роорганизмов, мг/ 100 см3 КОЕ/см3 588±3,0 1013 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 58 Из таблицы 2.4.3.2 видно, что новая питательная среда является благоприятной для культивирования лактобактерий. Количество микроорганизмов составляет 1013 КОЕ/см3. Этот результат на несколько порядков превышает результаты культивирования на известных питательных средах. Проведя исследования сроков хранения питательной среды, приходим к выводу, что данная среда хранится 12 мес при температуре 5±3 оС. Для того чтобы наглядно увидеть как растет кислотность от времени построим график. Для этого необходимо приготовить питательную среду. 200 мл обезжиренного молока кипятим и охлаждаем до 37 оС, среда имеет кислотность 17 оТ. В эту среду с помощью пипетки вносим 3 % микроорганизмов от объема питательной среды из молока. И ставим в термостат при 37 оС. Измеряем титруемую кислотность каждый час. Результат представлен на рисунке 2.4.3.1. Титруемая кислотность, оТ 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 Время, ч 20 25 30 Рисунок 2.4.3.1 – Кривая зависимости кислотности от времени Т.о. проведя исследования новой питательной среды для лактобактерий, приходим к выводу, что данная среда является благоприятный для роста молочнокислых бактерий. Количество микроорганизмов, выращенных на этой среде составляет 1013 КОЕ/см3. Этот результат на несколько порядков превышает результаты культивирования на известных питательных средах. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 59 ГЛАВА 3 ИНЖЕНЕРНЫЙ РАЗДЕЛ В данном разделе описаны основные этапы производства питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. 3.1 Процессуальная схема производства питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий При получении бактериального концентрата лактобактерий одной из важных стадий является приготовление питательной среды. Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста испытывают необходимость в источниках азота, фосфора, макро-и микроэлементов. Все вещества этого рода находятся в питательных средах в виде солей, исключением являются лишь среды, где азот и фосфор могут усваиваться растущими культурами из органических источников, например автолизатов или гидролизатов микробного или животного происхождения. В подавляющем большинстве случаев в промышленных средах для культивирования заранее содержатся все необходимые элементы питания, кроме кислорода и, в некоторых производствах, углерода, если последний вводится в виде газообразного соединения. Питательные среды используемые в производстве разнообразны. Это обусловлено разнообразием типов питания микроорганизмов-продуцентов, что позволяет выбирать наиболее подходящее сырье для биосинтеза тех или иных продуктов. Питательные среды должны быть полноценными и отвечать физиологическими особенностями штамма-продуцента. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 60 Типичными являются среды на основе природных субстратов: мелассы, гидрола, пшеничных отрубей, гидролизатов древесины, глюкоза, крахмал. Кроме источников углерода, к основным относят азотсодержащие виды сырья, а также макро- и микроэлементы. Азотсодержащих компонентов питательных сред не так много, как углеродсодержащих. Это либо органические аминосоединения, либо неорганические, содержащие ион аммония или нитрат ион. Полноценные питательные среды должны содержать различные минеральные элементы. Процессуальная схема производства концентрата лактобактерий показана на рисунке 3.1.1. Отделение приготовления питательной среды на современном микробиологическом производстве представляет собой, как правило, цех, оборудованный емкостями для хранения твердых и жидких веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий. При этом питательные соли хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси с заданным соотношением компонентов производится в аппарате с мешалкой, куда подаются непосредственно твердые компоненты в необходимом количестве и далее проводится их растворение, или соединяются заранее приготовленные в специальных аппаратах растворы каждого или нескольких компонентов и производится лишь их окончательное смешение и гемогенизация. Жидкие и твердые источники углерода предпочитают обычно вводить в уже готовую питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность которого, естественно, резко возрастает при хранении готовой питательной смеси. В этой связи при непрерывном культивировании в производстве микробного белка потоки углеводородов и питательных солей вводят в ферментер раздельно по индивидуальным линиям подачи, а смешение и эмульгирование нерастворимых в воде компонентов происходит уже в самом биореакторе. Для приготовления производственной питательной среды предварительно растворяют сыпучие компоненты среды. Для ускорения эти процессы проводят в небольших аппаратах с мешалками (реакторах), а затем растворы смешивают в смесителе-реакторе с плоским дном, снабженным барботажным устройством для АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 61 ввода пара. Концентрат среды, составляющий около одной трети необходимого объема, для окончательного растворения и суспендирования нагревают острым паром до 70–80 ºС. При этой температуре не происходит разложения термолабильных компонентов среды. Необходимое условие успешной стерилизации питательной среды – тщательная гомогенизация ее твердых компонентов. При температуре стерилизации крупные частицы медленно прогреваются, и в них может сохраняться постоянная микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость. Важнейшим элементом приготовления питательных сред является соблюдение требований асептики. В зависимости от жесткости принятых в этом отношении решений возникает необходимость либо только в создании заданного значения рН, обеспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо в полной стерилизации всех подаваемых в биореактор потоков и самого биореактора. В последнем случае для стерилизации газовых потоков, в первую очередь воздуха, используют процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с последовательно расположенными фильтрующими элементами, каждый из которых обеспечивает заданную степень снижения концентрации клеток в газовом потоке. Общее количество фильтров определяется необходимым уровнем (так называемым критерием) стерилизации; нужная производительность по газовому потоку достигается установкой ряда параллельно работающих фильтрующих элементов. Основным требованием к фильтрующему материалу является в этом случае допустимость его периодической стерилизации, обычно осуществляемой подачей острого пара в отключенный фильтр через заданные промежутки времени. Жидкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых практический интерес представляют термический, радиационный, фильтрационный и отчасти химический. Самый распространенный в промышленности термический метод стерилизации жидких и твердых материалов основан на известном факте губительного действия на живые клетки высоких температур. Основным недостатком термической стерилизации, несмотря на ее широкое практическое использование, следует считать неизбежные потери питательных свойств среды, поскольку при температурах, необходимых для стерилизации (порядка 120–150 °С), больАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 62 шинство субстратов, особенно углеводы, оказываются термически нестабильными. Это заставляет очень жестко контролировать время и температуру термического воздействия на субстрат, который обычно поэтому стерилизуют отдельно от остальной питательной среды, где содержатся значительно более устойчивые к нагреву компоненты. Типичным технологическим решением процесса стерилизации является подогрев среды и субстрата острым паром в емкости или глухим паром в теплообменнике, либо одновременное сочетание двух этих приемов. Существует целый ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием; сюда относятся метанол, этанол, крепкая уксусная кислота и др. В этих случаях в принципе можно ограничиться лишь стерилизацией прочих элементов питательной среды. Остальные методы стерилизации в силу различных причин нашли значительно меньшее распространение. В частности, радиационный метод, основанный на облучении материалов большими дозами ионизирующих излучений, главным образом v-излучением, дает хорошие результаты при стерилизации небольшим объектов в основном медицинского назначения (перевязочные материал и т. п.). Промышленное использование v-излучения для стерилизации жидких и газообразных сред безусловно возможно, но применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации необходимых в этом случае мощных источников Y"KBaHTOB. В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты, т. е. вещества с явно выраженным сильным асептическим действием. Основной проблемой в этом случае оказывается необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели посторонней микрофлоры и до внесения инокулята продуцента. Химические антисептики должны быть не только высокоэффективными, но и легко разлагаемыми при изменении условий после завершения стерилизации. К сожалению, выбор таких веществ невелик и их нельзя считать легко доступными; к числу лучших из них относится пропиолактон, обладающий сильнейшим бактерицидным действием и легко гидролизуемый далее в абсолютно нетоксичную молочную кислоту. Химическая стерилизация АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 63 питательных сред не нашла промышленного применения, однако в ряде случаев удачно попользуется в лабораторных и опытных условиях. Нельзя отнести к распространенным и метод стерилизующей фильтрации. Однако это объясняется не недостатками самого способа, а только аппаратурными трудностями. Метод основан на способности полупроницаемых мембран с крупными порами (типа микрофильтрационных мембран) пропускать жидкую фазу и задерживать (концентрировать) клетки микроорганизмов. Известно, что микро- и ультра фильтрация принципиально отличаются от обычной фильтрации тем, что разделяют гомогенные смеси (растворы) и дают не осадок задерживаемого вещества, а его концентрат, тогда как прошедший через мембрану раствор – пермеат – не содержит примесей, задерживаемых мембраной. В этом смысле клетки микроорганизмов, как твердая фаза, затрудняют процессы мембранного разделения, однако, учитывая их относительно крупные размеры по сравнению с диаметром пор мембраны (450 мкм и менее), они могут быть отделены путем концентрирования на достаточно крупнопористых мембранах при интенсивном перемешивании концентрата, устраняющем осаждение клеток на мембране. В принципе метод стерилизующей фильтрации является идеальным средством стерилизации лабильных, в том числе термически неустойчивых жидких и газовых сред, поскольку он может быть проведен при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Это позволяет говорить о больших технологических перспективах мембранной стерилизации, в первую очередь, жидких сред. Основная имевшаяся здесь трудность – наличие термостойких мембран, способных выносить многократную термическую стерилизацию их самих в ходе эксплуатации, сейчас успешно преодолевается путем широкого применения термостойких полимеров в производстве мембран. Можно утверждать, что по мере создания более совершенных конструкций мембранных аппаратов с термостойкими мембранами, рассчитанными на длительную эксплуатацию, и защищенными от налипания клеток, метод стерилизующей фильтрации будет все шире применяться в промышленной биотехнологии, в том числе в крупнотоннажных производствах. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 64 Обработка обезжиренного молока текучим паром t = 120±1 оС, τ = 20 мин Охлаждение молока t = 45±2 °С Установление активной кислотности рН 7,7±0,1 Гидролиз 0,1 % панкреатин, 0,6 % хлороформ, t= 40±2 оС, τ=72±1 ч Фильтрование Разведение стерильной водой в соотношении 1:1 рН 6,0±0,1 Стерилизация питательной среды t=120±1 оС Охлаждение питательной среды t=25±1 оС Фасовка питательной среды в бутыли вместимостью 1 л Хранение питательной среды t=5±3 оС, τ=12 мес Рисунок 3.1.1 – Процессуальная схема производства питательной среды. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 65 3.2 Технологическая линия производства бактериального концентрата лактобактерий Стадии технологического процесса. Основным оборудованием в процессе получения питательной среды лактобактерий является реактор-смеситель. Процесс приготовление питательной среды состоит из 5 стадий: − приготовление гидролизованного молока, гидролиз идет в течении 72 ч при температуре 40±2 °С; − обогащение среды такими компонентами как глюкоза, дрожжевой экстракт; − стерилизация питательной среды; − охлаждение питательной среды; − фасовка питательной среды в бутыли. Технологическая схема производства питательной среды для лактобактерий представлена на рисунке 3.2.1. 1 – насос центробежный; 2 – фильтр трубчатый; 3 – счетчик электронный; 4 – стерилизатор; 5 – кожухотрубный теплообменник; 6 – реактор; 7 – рамный фильтр пресс; 8 – реактор с мешалкой; 9 – смеситель сухих сред; 10 – пароконтактный стерилизатор; 11 – кожухотрубный теплообменник; 12 – фасовочный аппарат; 13, 15, 17, 18, 19, 20 – весы; 14, 16 – сборник для хранения. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 66 Изм. Лист № докум. Подпись Дата АТО 00.00.000 ПЗ Лист 67 Рисунок 3.2.1 – Технологическая схема производства питательной среды Для получения питательной среды используют молоко с массовой долей жира 0,5 %. Молоко обезжиренное с помощью насоса 1 передается через трубчатый фильтр 2, а затем через счетчик 3 в стерилизатор 4, где обрабатывается текучим паром в течении 20 мин, для удаления нежелательной микрофлоры. Затем молоко с помощью насоса передается в охладитель для молока 5, где охлаждается до температуры 45 оС. Охлажденное молоко с помощью насоса передается в реактор 6, где доводится кислотность молока до рН 7,7 прибавлением NaOH 40 %ного. После достижения заданного значения активной кислотности в реактор добавляют 0,1 % порошка панкреатина от общей массы молока, предварительно разведенного небольшим количеством дистиллированной воды. Затем в аппарат добавляют 0,6 % хлороформа от общего объема молока. Молоко выдерживают при температуре 40±2 оС в течении 72 ч. Отводят пары хлороформа. Далее гидролизованное молоко передается с помощью насоса на рамный фильтр пресс 7, осадок отводится, а прозрачный фильтрат самотеком поступает в реактор с мешалкой 9, в нем фильтрат разбавляется стерильной водой в соотношении 1:1, доводится кислотность до рН 6 с помощью уксусной кислоты 10 %-ной. В смесителе 8 перемешиваются сухие компоненты, а именно глюкоза и дрожжевой экстракт и переносятся в реактор 9. Однородная питательная среда проходит через пароконтактный стерилизатор 10, а затем среда охлаждается в теплообменнике 11 до температуры культивирования. Далее питательная среда передается на ферментацию. Культивирование посевной культуры проводят в биореакторах. В подготовленную стерильную среду, охлажденную до оптимальной температуры развития продуцентов 37±1 °С, подают посевной материал из колбы в количестве 5–8 %. Наращивание микроорганизмов ведут в ферментере при температуре 37±1 °С в течение 72 ч, при автоматической поддержке рН. При этом рН культуральной жидкости в пределах 6. Также предполагается продажа новой питательной среды. Для реализации этой цели, в технологической линии предусмотрен фасовочный аппарат 12. Охлажденная питательная среда, поступает в аппарат и разливается по бутылям вместимостью 1 л. Затем готовая продукция поступает на склад, а затем в продажу. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 68 ГЛАВА 4 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Задачей экономической части является расчет себестоимости питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий и экономическое обоснование использования готовой питательной среды. 4.1. Расчет себестоимости питательной среды Расчет себестоимости питательной среды осуществляется укрупнено калькуляционными методами по следующим статьям калькуляции: 1. Сырье и основные материалы. 2. Транспортные расходы. 3. Вспомогательные материалы. 4. Топливо и энергия на технологические цели. 5. Основная и дополнительная заработная плата производственных рабочих. 6. Отчисления на социальные нужды. 7. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования. 8. Цеховые расходы. 9. Общезаводские расходы. 10. Внепроизводственные расходы. 1. Стоимость сырья и основных материалов определяется по нормам расхода всех видов сырья и материалов на единицу готовой продукции, приведенных в рецептуре. Расчет потребности и стоимости сырья и основных материалов представлен в таблице 4.1.1. 2. Транспортные расходы включают затраты на доставку сырья и материалов. Их величина рассчитывается укрупнено 5–10 % от стоимости сырья. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 69 Таблица 4.1.1 – Расчет потребностей и стоимости сырья и основных материалов на 1л питательной среды Расчет сыНаименование продукции и сырья рья на ед. продукции, Общая потребность в сырье, кг кг (л) Оптовая цена ед. Стоимость сырья, сырья, руб. руб. Питательная среда: 1 – – – Вода дистиллированная – 0,5 15,00 15,00 Молоко обезжиренное – 1,0 68,00 68,00 Панкреатин – 0,001 2170,00 2,17 Хлороформ – 0,006 119,00 0,71 Глюкоза – 0,01 1260,00 12,60 Дрожжевой экстракт – 0,005 18000,00 90,00 Гидроксид натрия – 0,0015 300,00 0,45 Уксусная кислота – 0,001 200,00 0,20 Итого: 186,63 3. Расчет на вспомогательные материалы включает стоимость химикатов, текстильных материалов, смазочных материалов, тары, моющих средств, инвентаря, упаковочных материалов, которые необходимы для выпуска единицы продукции. Их стоимость рассчитывается укрупнено в размере 10-15 % от стоимости сырья и основных материалов. Вспомогательные материалы составляют 18,66 руб. 4. Затраты топлива и энергии на технологические цели (электроэнергия, вода, газ и др.) рассчитываются в размере 5–10 % от стоимости сырья и основных материалов. 5. Размер основной и дополнительной заработной платы производственных рабочих на единицу продукции определяется укрупнено в размере 8–15 % от стоимости сырья. Затраты на основную и дополнительную заработную плату производственных рабочих составляют 14,93 руб. 6. Отчисления на социальные нужды включают в себя: АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 70 − отчисления на социальные нужды (ОСН) равный 30 % от фонда оплаты труда производственных рабочих и предназначенный для формирования пенсионного фонда, фонда медицинского страхования и фонда социального страхования; − страхование от несчастных случаев в размере 0,2 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. Отчисления на социальные нужды составляют 4,51 руб. 7. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования определяются в размере 30–50 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. 8. Цеховые расходы включают затраты на амортизацию, содержание и текущий ремонт производственных зданий, расходы на управление и обслуживание цеха в целом: основная и дополнительная заработная плата цехового персонала, расходы на охрану труда и технику безопасности. Эти затраты принимаются в размере 40–50 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. 9. Общезаводские расходы включают затраты на управление и организацию производства по предприятию в целом (заработная плата управленческого персонала, командировочные, почтово-телеграфные расходы, подготовка кадров, охрана и др.). Эти расходы принимаются в размере 50 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. Производственная себестоимость единицы продукции определяются как сумма всех вышеперечисленных статей. 10. Внепроизводственные расходы включают в себя затраты по сбыту готовой продукции и принимаются укрупнено в размере 0,1–0,5 % от производственной себестоимости. Полная себестоимость включает в себя производственную себестоимость и внепроизводственные расходы. Рассчитав полную себестоимость и установив уровень рентабельности можно рассчитать прибыль и оптовую цену продукции. Среднеотраслевой уровень рентабельности предприятий пищевой промышленности укрупненно составляет 15–25 %. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 71 Предполагаемая прибыль (П) рассчитывается по формуле 4.1.1: П= где С·Р , 100 (4.1.1) С – полная себестоимость продукции, руб; Р – среднеотраслевой уровень рентабельности, %. Оптовая цена единицы продукции определяем по формуле 4.1.2: Ц опт = С + П, где (4.1.2) П – предполагаемая прибыль, руб; С – полная себестоимость продукции, руб; Таблица 4.1.2 – Расчет себестоимости единицы продукции Себестоимость 1 л питатель- Статьи затрат ной среды, руб 1. Сырье и основные материалы 186,63 2. Транспортные расходы 9,33 3. Вспомогательные материалы 18,66 4. Топливо и энергия на технологические цели 9,33 5. Основная и дополнительная заработная плата производственных рабочих 14,93 6. Отчисления на социальные нужды 4,51 7. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования 4,48 8. Цеховые расходы 5,97 9. Общезаводские расходы 7,47 10. Производственная себестоимость 261,32 11. Внепроизводственные расходы 0,26 12. Полная себестоимость 261,58 13. Предполагаемая прибыль 73,23 14. Оптовая цена единицы продукции 334,81 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 72 4.2 Экономическое обоснование использования готовой питательной среды Для обоснования экономической эффективности проанализирован рынок питательных сред для культивирования лактобактерий. Данные представлены в таблице 4.2.1. Таблица 4.2.1 – Анализ существующих на рынке питательных сред для культивирования лактобактерий Название Состав Питательной среды Питательной среды Производитель Фасовка Цена, руб Марганец сернокислый 0,1 г; магний сернокислый 0,4 г; калий фосфорнокислый двузамещенный 4 г; цистеин 0,4 г; Среда МРС-4, глюкоза 40 г; пептон 20 г; ав- агаризированная толизат дрожжей пекарских плотная 100 мл; натрий уксуснокислый 10 г; аммоний лимоннокислый двузамещенный 4 г; агар микробиологический 4 г; вода ди- ОАО «Биомед» Россия, Московская обл., Красногорский район, п/о ПетровоДальнее ПЭТ бутылка 405,00 1л Телефон: (495) 635-08-39 стиллированная 1000 мл. Марганец сернокислый 0,1 г; магний сернокислый 0,4 г; ка- ОАО «Биомед» лий фосфорнокислый двуза- Россия, Москов- мещенный 4 г; цистеин 0,4 г; ская обл., Крас- Среда МРС-2, глюкоза 40 г; пептон 20 г; ав- ногорский рай- жидкая толизат дрожжей пекарских он, п/о Петрово- 100 мл; натрий уксуснокислый Дальнее 10 г; аммоний лимоннокислый Телефон: (495) двузамещенный 4 г; вода ди- ПЭТ бутылка 405,00 1л 635-08-39 стиллированная 1000 мл. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 73 Продолжение таблицы 4.2.1 Название Состав биопрепарата биопрепарата Производитель Фасовка Цена, руб Марганец сернокислый 0,1 г; магний сернокислый 0,4 г; калий ОАО «Биомед» фосфорнокислый двузамещен- Россия, Мос- ный 4 г; цистеин 0,4 г; глюкоза ковская обл., Среда МРС, 40 г; пептон 20 г; автолизат Красногорский жидкая, рН 4,3 дрожжей 100 мл; натрий уксус- район, п/о Пет- нокислый 10 г; аммоний лимон- рово-Дальнее нокислый двузамещенный 4 г; Телефон: (495) агар микробиологический 2 г; 635-08-39 ПЭТ бутылка 832,50 1л вода дистиллированная 1000 мл. Марганец сернокислый 0,1 г; магний сернокислый 0,4 г; калий ОАО «Биомед» фосфорнокислый двузамещен- Россия, Мос- ный 4 г; цистеин 0,4 г; глюкоза ковская обл., Среда МРС-2, 40 г; пептон 20 г; автолизат Красногорский полужидкая дрожжей 100 мл; натрий уксус- район, п/о Пет- нокислый 10 г; аммоний лимон- рово-Дальнее нокислый двузамещенный 4 г; Телефон: (495) агар микробиологический 2 г; 635-08-39 ПЭТ бутылка 369,00 1л вода дистиллированная 1000 мл. Марганец сернокислый 0,1 г; магний сернокислый 0,4 г; калий ОАО «Биомед» фосфорнокислый двузамещен- Россия, Мос- Среда МРС-4, ный 4 г; цистеин 0,4 г; глюкоза ковская обл., плотная (для вы- 40 г; пептон 20 г; автолизат Красногорский деления лактобак- дрожжей 100 мл; натрий уксус- район, п/о Пет- терий из фекалий) нокислый 10 г; аммоний лимон- рово-Дальнее нокислый двузамещенный 4 г; Телефон: (495) агар микробиологический 4 г; 635-08-39 ПЭТ бутылка 1173,00 1л вода дистиллированная 1000 мл. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 74 Продолжение таблицы 4.2.1 Название Состав биопрепарата биопрепарата Производитель Капустный бульон 900 мл, дрожжевой экстракт 100 мл, Капустный агар пептон 10 г, глюкоза 20 г, ацетат натрия 3,35 г, марганец сернокислый 0,025 г, агар20 г. Фасовка Цена, руб ЗАО «НИЦФ» Россия, Санкт- Стек- Петербург, ул. лянные Белы куна 30 а флаконы Телефон: 1л 520,00 +7(812)327-5581 ООО «ВИТА Дистиллированная вода 950 Среда Бикфельдта жидкая мл; лактоза 10 г; глюкоза 10 г; пептон 5 г; дрожжевой экстракт 20 мл. РОС», Россия, Герме- Ростов-на-Дону, тичные пер. Семашко, контей- 117 б неры Телефон: 1л 415,00 (863)234-04-31 ООО «ВИТА Дистиллированная вода 1000 РОС», Россия, Герме- Среда мл; лактоза 10 г; глюкоза 10 г; Ростов-на-Дону, тичные Бикфельдта пептон 5 г; дрожжевой экс- пер. Семашко, контей- плотная тракт 10 г; раствор бромкрео- 117 б неры Телефон: 1л золового пурпурного 10 мл. 610,00 (863)234-04-31 Сравнительный анализ затрат на питательную среду для лактобактерий представлен в таблице 4.2.2. Таблица 4.2.2 – Сравнительный анализ затрат на питательную среду для лактобактерий Название биопрепарата Отклонение Стоимость 1 л питательной среды, руб Руб % Среда МРС-4, агаризированная плотная 405,00 70,19 20,96 Среда МРС-2, жидкая 405,00 70,19 20,96 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 75 Продолжение таблицы 4.2.2 Название биопрепарата Отклонение Стоимость 1 л питательной среды, руб Руб % Среда МРС, жидкая, рН 4,3 832,50 463,50 138,44 Среда МРС-2, полужидкая 369,00 34,19 10,21 1173,00 838,19 250,35 Капустный агар 520,00 185,19 55,31 Среда Бикфельдта жидкая 415,00 80,19 23,95 Среда Бикфельдта плотная 610,00 275,19 82,19 Новая питательная среда 334,81 0 0 Среда МРС-4, плотная (для выделения лактобактерий из фекалий) На основании сравнительного анализа существующих на рынке питательных сред для культивирования лактобактерий можно сделать вывод, что в настоящее время полученная питательная среда востребована и ее целесообразно внедрять на рынок, так как она экономически выгодна. Цена полученной питательной среды на 10–250 % ниже, чем представленные на рынке питательные среды. Основная масса представленных на рынке питательных сред произведена в Московской области, что отражается в повышенных затратах, в том числе и на транспортировку в Западную Сибирь. Снижение затрат обеспечивается организацией производства в Сибири. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 76 ГЛАВА 5 БЕЗОПАСНОСТЬ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ Исследования проводилась в лаборатории научно-исследовательского института биотехнологии при ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Проводимые исследования отвечали требованиям безопасности, предъявляемым в нормативных документах. 5.1 Условия труда В данном разделе микробиологической рассмотрены: лаборатории, требования санитарные к гигиене требования труда и производственной санитарии. 5.1.1 Соответствие санитарным требованиям микробиологической лаборатории Лаборатория находится в первом корпусе Кемеровского технологического института пищевой промышленности и состоит из четырех помещений общей площадью 161,56 м2. Площадь одного производственного помещения составляет 40,39 м2, полезная площадь – 30 м2 Максимально возможное количество работающих одновременно в лаборатории 3 человека. Площадь помещения, приходимая на одного работающего – 10 м2 (норма не менее 6 м2) соответствует требованиям санитарных правил СП 118.13330.2012 «Общественные здания и сооружения». Высота помещения составляет 3,0 м. Объем помещения на одного рабочего 28 м3 – (норма – 15 м3 для легких работ). АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 77 Помещения микробиологической лаборатории покрыты кафелем (пол, стены) и масляной краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств в соответствии с СП 118.13330.2012 «Общественные здания и сооружения». Периодичность уборки производственного помещения – 2 раза в смену и УФ облучение 15–20 минут перед началом работы. Работу по подготовке питательных сред для микробологических исследований проводят до доставки в бокс культур микроорганизмов. Во всех помещениях установлены бактерицидные лампы (БУФ-15, БУФ30). Окна плотно закрыты. Для защиты рабочих столов от попадания прямого солнечного света используются светозащитные пленки из материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам. Номенклатура санитарно-технических устройств и санитарно-бытовых помещений соответствует нормам СП 118.13330.2012 «Общественные здания административного назначения». Санитарные узлы выполнены в соответствии с СП 118.13330.2012 «Общественные здания административного назначения». 5.1.2 Гигиена труда и производственная санитария Параметры микроклимата оказывают непосредственное влияние на самочувствие человека и его работоспособность. Они выбираются исходя из категории тяжести выполняемых работ. Параметры микроклимата в производственном помещении соответствуют нормам СанПиН 2.2.4.548-96 «Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений» и ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно- гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». Температура окружающей среды в помещении лаборатории составляет 23±2 оС, относительная влажность воздуха 55 % . В соответствии с СанПиН 2.2.4.548-96 «Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений» оптимальные параметры АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 78 микроклимата для работ категории I б (работы, производимые сидя, стоя или связанные с ходьбой, но не требующие систематического физического напряжения или поднятия и переноски тяжестей) приведены в таблице 5.1.2.1. В соответствии с СП 60.13330.2012 «Отопление, вентиляция и кондиционирование воздуха» помещение лаборатории оснащено вентиляцией в виде вытяжных шкафов для удаления неприятных запахов и вредных испарений. Предусмотрена централизованная система отопления в виде радиатор, теплоноситель в которых – горячая вода с температурой на входе в отопительную систему 95±2 °С. 18–25 22–24 24,1–28/ 20–21,9 Iб 0,2/01 40–60 21–25 Допустимая (выше/ниже оптимальной) 20–24 Скорость движения воздуха, м/с Оптимальная 23,1–24,0/ 19,0–20,9 Допустимая Допустимая 21–23 Относительная влажность, % Оптимальная Оптимальная Теплый период Температура поверхностей, ºC Допустимая (выше/ниже оптимальной) Холодный период Температура воздуха, ºC Оптимальная Период года Категории работ Таблица 5.1.2.1 – Параметры метеорологических условий 15–75 19–29 0,1 0,3/0,1 В помещении бокса также оборудована приточно–вытяжная вентиляция, соответствующая требованиям СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)». В лаборатории организовано естественное и искусственное освещение. Естественное освещение осуществляется за счет двух световых проемов площадью 16,6 м2. Отношение площади световых проемов к площади пола помещения составляет 0,24 (норма 0,1–0,25). Таким образом, естественного светового освещения достаточно для работ в дневное время. Искусственное освещение осуществляется с помощью светильников, расположенных в потолочной области, состоящих из люминесцентных ламп. Уровень освещенности от искусственного освещения 400 лк, соответствует нормам СанПиН 2.2.1/2.1.1.1278-03 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 79 «Гигиенические требования к естественному, искусственному и совмещенному освещению жилых и общественных зданий». 5.2 Безопасность работы в микробиологической лаборатории При работе в микробиологической лаборатории возможны несчастные случаи при работе с электроприборами, а так же при работе с канцерогенными веществами. В помещении лаборатории на основании ГОСТ 12.1.007-76 не допускается: − работать в лаборатории одному; − работать в лаборатории необходимо в халате, защищая одежду и кожу от попадания реактивов и обсемененности микроорганизмами; − оставлять без присмотра зажженные горелки и другие нагревательные приборы, работать на горелках с неисправными кранами, держать вблизи них воспламеняющиеся вещества; − рабочее место следует поддерживать в чистоте, не загромождать его посудой и побочными вещами; − проводить работы при неисправной вентиляции; − во время работы открывать дверь бокса; − перед работой необходимо проверить исправность оборудования, рубильников, наличие заземления и пр.; − убирать случайно пролитые огнеопасные жидкости при зажженных горелках и включенных электронагревательных приборах; − хранить и применять реактивы без этикеток; − хранить запасы ядовитых, сильнодействующих, взрывоопасных веществ и растворов на рабочих местах и стеллажах; − в рабочих помещениях курить, хранить и принимать пищу; − сушить что-либо на отопительных приборах. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 80 5.2.1 Безопасность работы с аппаратурой и оборудованием Причиной несчастного случая могут выступать лабораторное оборудование и приборы, которые необходимы при проведении работ в лаборатории. К ним относятся: весы электрические, рН–метр, химический вытяжной шкаф, электрический сушильный шкаф, микроскоп, термостат электрический. При работе с электрическими приборами нужно помнить, что включать прибор можно только в ту сеть, вольтаж которой соответствует вольтажу прибора. Все неисправности электроприборов, электросети и прочего электрооборудования должны устраняться только электромонтером. При работе с электрооборудованием, находящимся под током, необходимо применять исправные средства индивидуальной защиты (диэлектрические резиновые перчатки, галоши, коврики), а работу проводить с изолирующими рукоятками у инструмента. Запрещается переносить включенные приборы и ремонтировать оборудование, находящееся под током. В случае загорания проводов или электроприборов необходимо их медленно обесточить и гасить огонь при помощи сухого углекислотного огнетушителя и покрывала из асбеста. Взвешивать на весах вредные сухие вещества (нингидрин, ферментные препараты) следует осторожно, чтобы избежать образования пыли этих веществ в воздухе. При работе с сушильными шкафами (температура 105–160 °С), работающий может получить термический ожог. Меры предосторожности: ставить и вынимать бюксы, тигли с помощью металлических щипцов, а стеклянную посуду с помощью полотенца. Термостат электрический предназначен для получения и поддержания внутри рабочей камеры стабильной температуры. При работе с прибором корпус должен быть надежно заземлен. Запрещается: − устанавливать термостат вблизи отопительной системы, рядом с другими приборами и оборудованием, а также в стесненных местах; АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 81 − помещать в камеру материалы, воспламеняющиеся при температуре термостатирования или близкой к ней. При работе с весами нужно придерживаться следующих правил: обращаться с весами нужно осторожно, не передвигать, оберегать от толчков. Весы должны быть всегда чистыми. На чашу весов реактивы не насыпаются, для взвешивания нужно пользоваться специальной емкостью. После взвешивания разновесы оставлять на чашке запрещается. рН-метр является лабораторным прибором, предназначенным для определения величины активной кислотности и окислительно-восстановительных потенциалов. Питание прибора осуществляется от сети переменного тока напряжением 220 В и 50 Гц. Хранить прибор следует в условиях общих для всех лабораторных приборов, в сухих отапливаемых помещениях, в воздухе которых отсутствуют примеси, вызывающие коррозию металлических изделий. Химический вытяжной шкаф предназначен для изолирования и защиты обслуживающего персонала от токсических, зловонных испарений, газов, пыли и т.п., выделяющихся во время проведения работ, путем их непосредственного отвода наружу. Прежде чем приступить к подключению химического вытяжного шкафа к месту эксплуатации следует подвести следующие системы: − систему холодной воды; − систему химических сточных вод; − систему вытяжную; − питание электроэнергией с заземлением. Прежде чем приступить к выполнению каких-либо лабораторных или следует проверить включение вентилятора. Состояние включения сигнализируется. Кроме того, нужно проверить, открыты ли шлюзы для потоков воздуха. Запрещается: − работать лицам, не ознакомленным с инструкцией по эксплуатации; − работать в случае обнаружения каких-либо нарушений в нормальной работе шкафа; АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 82 − работать при отсутствии стеклянного защитного экрана. Электрический сушильный шкаф предназначен для освобождения исследуемого образца от влаги, рассчитан на максимальную температуру 350±2 °С. Загрузку и разгрузку шкафа следует проводить без толчков и ударов. При работе с сушильным шкафом следует помнить: − к работе допускаются лица, ознакомленные с технической инструкцией по эксплуатации; − перед началом работы необходимо убедиться в его полной исправности, правильности подключения и заземления; − при нарушении нормальной работы шкафа следует отключить его и принять меры по устранению неисправностей; − ремонтные работы проводить только после снятия напряжения. Микроскоп необходим для обнаружения и исследования микроорганизмов. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т.п.) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий. Современные световые микроскопы это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности. Запрещается: − применять большие усилия при работе с микроскопом; − касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров; − самостоятельно развинчивать и разбирать объективы. 5.2.2 Безопасность работы со стеклянной посудой Большая часть несчастных случаев при нарушении правил работы со стеклом относится к категории микротравм (после которых можно продолжать работу) и АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 83 легких травм (потеря трудоспособности на один или несколько дней). В первую очередь – порезы рук при поломке стеклянной посуды, деталей приборов и т.п., а также ожоги рук при неосторожном обращении с нагретыми до высокой температуры стеклянными деталями. Также при поломке стеклянной аппаратуры и посуды возможны и другие виды аварий и несчастных случаев – пожары и взрывы (при проливе горючих жидкостей, окислителей и др.), отравления и химические ожоги (при попадании токсических или едких веществ в атмосферу или на кожу). Основные правила работы со стеклянной посудой: − стекло – хрупкий материал, имеющий малое сопротивление при ударе и незначительную прочность при изгибе, поэтому лучше недооценить прочность стеклянной детали, чем переоценить ее. Вероятность ранения рук пропорциональна усилию, приложенному к стеклянной детали; − стеклянная посуда не предназначена для работы при повышенном давлении; − нельзя допускать нагревания жидкостей в закрытых колбах или приборах, не имеющих сообщения с атмосферой; − категорически запрещается использовать посуду, имеющую трещины или отбитые края; − стеклянная посуда должна храниться аккуратно и на постоянном месте, при выдвижении ящиков стола предметы не должны ударяться друг о друга; − осколки разбитой посуды убирают только с помощью щетки и совка, но ни в коем случае не руками; − стеклянные приборы и посуду больших размеров можно переносить только двумя руками. Запрещается поднимать крупные бутыли за горло запрещается не придерживая снизу. При ранениях стеклом нужно удалить его осколки из ранки (если они в ней остались) и, убедившись, что там их больше нет, промыть ранку перманганатом калия, смазать кожу вокруг ранки йодом и перевязать пораненное место. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 84 5.2.3 Безопасность работы с реактивами Контроль безопасности условий труда осуществляется в соответствии с руководством Р.2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда». План контроля условий труда составляется на год, дополняется и изменяется в случае выявления профессиональных заболеваний или отравлений. Однонаправленным действием на организм работников, как правило, обладают: вещества раздражающего типа действия, аллергены, вещества канцерогенные для человека, различные спирты и щелочи, аминосоединения, нитросоединения оксид углерода. Вещества, опасные для развития острого отравления, используемые при разработке питательной среды представлены в таблице 5.2.3.1. Таблица 5.2.3.1 – Перечень веществ опасных для развития острого отравления Наименование Глюкоза ПДК, Агрегатное Класс Особенности мг/м3 состояние опасности действия 10 Аэрозоль 4 Раздражение Ожоги, хрониче- Гидроксид натрия 0,5 Аэрозоль 2 ские заболевания кожных покровов Уксусная кислота 5 Пары 3 Раздражение Наркотические Хлороформ 5 Пары 2 свойства, токсическое действие на организм человека Этанол 100 Пары 4 Раздражение Емкости с реактивами должны быть снабжены надежно наклеенными этикетками с разборчивыми надписями, где указаны название соединения и его АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 85 химическая формула. Запрещается исправлять надписи на этикетках, наклеивать новые этикетки, не удалив старых, наносить на емкости с реактивами легко смывающиеся надписи. Запрещается пользоваться реактивами без этикеток или с сомнительными надписями на них. Необходимо внимательно следить за сохранением чистоты реактивов. Нельзя путать пробки от банок с реактивами. Запрещается выбрасывать в раковины отходы химических реактивов, сливать органические растворители, водные растворы химических веществ. Химические вещества также нельзя выбрасывать вместе с мусором на помойку. Переливать кислоты или щелочи из бутылей в мелкую тару необходимо при помощи сифонов или ручных насосов. Особую осторожность следует соблюдать при обращении с ядовитыми (их запрещается брать ртом через пипетку), огнеопасными или вредными веществами. С огнеопасными реактивами следует работать вдали от огня и работающих нагревательных приборов. Перегонять и нагревать огнеопасные низкокипящие вещества следует в круглодонных колбах из тугоплавкого стекла на водяных банях. При случайных проливах этих жидкостей необходимо выключить все нагревательные приборы, место пролива засыпать песком. В аварийных ситуациях, когда атмосфера лаборатории внезапно оказывается зараженной ядовитыми парами или газами, оставаться в помещении для ликвидации последствий аварии можно только в противогазе. Личные противогазы каждого работника должны находиться в рабочей комнате на видном месте и быть готовыми к немедленному применению. Для предотвращения проникновения опасных веществ в организм через кожные покровы необходимо применять спецодежду (халат из хлопчатобумажной ткани) и соблюдать правила личной гигиены. Снимать спецодежду дома или непосредственно в химической лаборатории запрещается. Нельзя хранить вместе рабочие халаты и личную одежду. При ожогах химическими веществам (главным образом кислотами и щелочами) пораженный участок необходимо быстро промыть большим количеством воды. Затем на обожженное место наложить примочку: при ожогах АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 86 кислотой – из 2 % содового раствора, при ожогах щелочью – из слабого раствора уксусной или борной кислоты. При отравлении химикатами следует немедленно вызвать врача. При попадании химикатов внутрь организма необходимо сделать промывание. 5.2.4 Безопасность работы с микроорганизмами Микроорганизмы – сложные соединения белковой природы бактерии, вирусы, микоплазмы, риккетсии, хламидии и грибы, которые при определенных условиях и в определенных концентрациях могут оказать влияние на здоровье человека. Микробиологические лаборатории работают с микроорганизмами четырех различных групп опасностей. В лаборатории НИИ биотехнологии «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (университет) работают с микроорганизмами первой группы, с которыми случаи заболевания человека не зарегистрированы. Работа может проводиться на обычном лабораторном столе для стандартных микробиологических процедур. Специальное защитное оборудование не требуется и/или не используется. Персонал лаборатории проходит обычное обучение технике безопасности и находится под руководством начальника лаборатории, имеющего опыт работы в стандартной микробиологической лаборатории. Персональная защита работников микробиологической лаборатории: халат, перчатки, маски и очки (по необходимости). При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблюдать все правила микробиологической техники: − работа проводится в чистых халатах, перчатках, бахилах, шапочках для волос, масках защищающих органы дыхания, защитных очках при необходимости; АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 87 − на пробирках, колбах, чашках Петри, матрацах должна быть сделана надпись, содержащая родовые и видовые названия культуры, дату засева; − все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки (петли, иглы), либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели); − все засеянные пробирки, чашки помешаются в термостат или сдаются лаборанту. Отработанный материал (пробирки, чашки Петри) также помещается в определенные емкости для их дальнейшего обеззараживания; − в лаборатории запрещается курение, прием пищи; − в конце работы микробиолог должен привести в порядок рабочее место, вымыть руки. Необходимо иметь индивидуальное полотенце, салфетки для вытирания рук. 5.2.5 Электробезопасность При работе с электрооборудованием и электроприборами возможны случаи поражения людей электрическим током, а также возникновение пожара. Причинами этого являются: работа на неисправном оборудовании, прикосновения руками к металлическим частям электроприборов (оголенные провода), которые вследствие нарушения изоляции могут находиться под напряжением; нарушение правил использования электроприборов, установок, аппаратов (центрифуга, камера для горизонтального электрофореза, трансиллюминатор и др.). Эти приборы по способу защиты человека от поражения электрическим током относятся к классу I согласно ГОСТ 12.1.019-2009 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты». Система электроснабжения лаборатории имеет следующие величины: напряжение – 220 В, количество фаз – 2, способ прокладки – скрытая проводка. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 88 Для защиты работающих от поражения электрическим током применяют следующие меры: все токоведущие части покрывают слоем диэлектрика – изоляции, все электротехнические приборы заземляют, на электрощите устанавливают дополнительные рубильники для обесточивания сети. Величина максимального сопротивления заземления не должна превышать 4 Ом. 5.2.6 Пожарная безопасность Опасность пожара в лаборатории возникает при нагревании, высушивании и других работах, могут произойти от неисправности нагревательных и электрических приборов, а так же несоблюдения мер предосторожности. Все помещения лаборатории должны соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 «Пожарная безопасность. Общие требования безопасности» и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 «Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание» и правилам противопожарного режима. В целях предотвращения пожарных ситуаций предусмотрена система пожарной сигнализации в виде дымовых адресных извещателей, сигнал от которых поступает на пост охраны приемного контроля. При возникновении пожара в лаборатории нужно немедленно использовать все имеющиеся под рукой средства тушения: песок (сухой и рассыпчатый), одеяло, вода. Запрещается тушить водой горящие не растворимые в воде вещества, особенно жидкости, водой так же нельзя тушить подключенные электроприборы. В случае загорания проводов и электроприборов, находящихся под током, необходимо немедленно выключить ток и тушить огонь сухим углекислотным огнетушителем ОП-5, сухим песком. Для профилактики пожаров необходимо обеспечить соблюдение установленного противопожарного режима; электрическая проводка всегда АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 89 должна содержаться в надлежащем состоянии, а нагревательные приборы, газовые краны и газопровод должны быть исправны; все электроустановки должны быть защищены от токов короткого замыкания; нагревательные приборы нельзя оставлять без присмотра. 5.3 Оказание первой медицинской помощи Первая помощь – это комплекс срочных простейших мероприятий, проводимых на месте происшествия самим пострадавшим или другим лицом, находящимся поблизости, для спасения жизни человека и предупреждения осложнений при несчастных случаях. В лабораториях бывают случаи, требующие неотложной медицинской помощи – порезы рук стеклом, термические ожоги, поражении электрическим током, отравление неорганическим и органическими веществами. При ранениях стеклом нужно удалить его осколки из ранки (если они в ней остались) и, убедившись, что там их больше нет, промыть рану 2 % раствором перманганата калия и, смазав кожу вокруг раны 5 % раствором йода, забинтовать. При термических ожогах следует немедленно охладить обожженный участок, это надо делать в прохладной воде. Если степень поражения первая или вторая, то под краном около 10 минут. Если же ожог более сильный, то только в емкости, наполненной водой и наложив сверху повязку. Далее наложите на место поражения влажную тряпочку, дайте пострадавшему успокоительное и вызывайте скорую помощь. При поражении электрическим током, если пострадавший остается в соприкосновении с токоведущими частями, необходимо немедленно выключить при помощи пускателя, или перерубить токопроводящий провод изолированным инструментом. К пострадавшему, пока он находится под током, нельзя прикасаться незащищенными руками (без перчаток). АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 90 При отравлени неорганическими веществами необходимо предпринять следующие меры первой помощи: − азотной кислотой. Свежий воздух, покой,тепло. Вдыхание кислорода. Сульфадимезин или иной сульфаниламидный препарат (2 г), аскорбиновая кислота (0,5 г), кодеин (0,015 г). искусственное дыхание; − серной кислотой. Промыть верхние дыхатедбные пути 2 % расвором питьевой соды. В нос 2–3 капли 2 % расвора эфедрина. Теплое молоко с содой, кодеин (0,015 г) или дионин ( 0,01 г). При попадании в органы пищеварения смазать слизистую рта 2 % раствором дикаина. Промывание желудка большим количеством воды. Внутрь принять: столовую ложку оксида магния на стакан воды каждые 5 минут, яичный белок, молоко, кусочки сливочного масла, кусочки льда. Нельзя вызывать рвоту и применять карбонаты. Проконсультироваться у врача; − щелочами. Вдыхание теплого водяного пара (в воду добавить немного лимонной кислоты). Внутрь – теплое молоко с медом, кодеин (0,015 г) или дионин (0,01 г). Горчичники. При попадании в органы пищеварения смазать слизисты рта и горло 1 % раствором новокаина. Внутрь – по столовой ложке 1 % раствора лимонной кислоты каждые 3–5 минут, крахмальный клейстер с добавлением лимонной или уксусной кислоты, 2–3 столовые ложки растительного масла, кусочки льда. Консультация врача. В случае отравления органическими веществами (эфиром, хлороформом, спиртом) необходимо: свежий воздух, внутрь 0,03 г фенамина или 0,1 г коразол, или 30 капель кордиамина, или 0,5 г камфоры. Искусственое дыхание. В лаборатории в легко доступном месте находится аптечка с постоянным набором необходимых материалов и медикаментов (стерильные бинты и вата, 5 % спиртовой раствор йода, 2 % раствор гидрокарбоната натрия, мазь от ожогов, лейкопластырь, 2 % раствор перманганата калия, 2 % раствор борной кислоты, этиловый спирт). АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 91 ВЫВОДЫ В работе были проведены исследования по разработке новой питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. По результатам исследования были сделаны следующие выводы: 1. Изучены морфологические, культуральные, физиолого-биохимические свойства лактобактерий. Было установлено, что лактобактерии это тонкие неподвижные одиночные или парные неспорообразующие грамположительные палочки. Цвет колоний может быть белым и кремовым, колонии обладают однородной структурой, имеют плотную консистенцию, поверхность колоний гладкая, край колонии у Lactobacillus plantarum 8P-A3 волнистый, а у Lactobacillus fermentum 90T-C4 - ровный. 2. Исследовано пять вариантов известных питательных сред для культивирования лактобактерий. Установлено, что гидролизованное молоко, проинкубированное 72 ч обеспечивает максимальное накопление Lactobacillus plantarum 8P-A3 и Lactobacillus fermentum 90T-C4. 3. Были проведены работы по усовершенствованию питательной среды для Lactobacillus plantarum 8P-A3 и Lactobacillus fermentum 90T-C4. В качестве источника углерода в гидролизованное молоко добавили глюкозу, также в среду добавили дрожжевой экстракт, который является фактором роста. 4. Проводился анализ физико-химических свойств полученной питательной среды. Было установлено, что данная среда является благоприятный для роста Lactobacillus plantarum 8P-A3 и Lactobacillus fermentum 90T-C4. Количество микроорганизмов, выращенных на этой среде составляет 10 13 КОЕ/см 3 . Этот результат на несколько порядков превышает результаты культивирования на известных питательных средах. 5. Разработана технология приготовления питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Разработали процессуальную и технологическую схемы производства питательной средыдля лактобактерий. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 92 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Антипова, Л.В. Прикладная биотехнология: учебное пособие / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, А.И. Жаренов. – Воронеж, 2000. – 332 с. 2. Ананьева, Н.В. Изучение процесса культивирования молочнокислых палочек на питательных средах различного состава / Н.В. Ананьева // Переработа молока. – 2007. – №2. – С. 20-21. 3. Банникова, Л.А. Микробиологические основы молочного производства: учебное пособие / Л.А. Банникова, Н.С. Коралева, В.Ф. Семенихина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 400 с. 4. Банникова, Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности: учебное пособие / Л.А. Банникова. – М.: Пищевая промышленность, 1975. – 255 с. 5. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / М.: Медицина. – 2006. – С. 156. 6. Беспоместных, К.В. Исследование биохимических и морфологических свойств штаммов бактерий рода Lactobacillus / К.В. Беспоместных, А.Г. Галстян, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – №2. – С. 94-98. 7. Биология [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://zadocs.ru/biolog/12905/index.html?page=7 (дата обращения 25.02.2015). 8. Блинов, Н.П. Химическая микробиология / Н.П. Блинов. – М.: Высшая школа. – 1989. – С. 448-450. 9. Бондаренко, В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. 1998. – №5. – С. 109. 10. Бондаренко В.М. Пробиотики и механизмы их лечебного действия / В.М. Бондаренко, Р.П. Чупринина, Ж.И. Альдушева // Эксперименты клининга, гастроэнтерологии. – 2000. – №3. – С.83-87. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 93 Бурлакова, Е.В. Применение углеводных препаратов активации 11. роста бифидобактерий / Е.В. Бурлакова, Т.В. Бархатова // Изв. вузов. Пищевая технология. – 2012. – №2-3. – С. 119-120. Васильев, Д.В. Эффективность использования пародижкостных 12. струйных аппаратов (инжекторов) для стерилизации питательной среды на основе мелассы / Д.В. Васильев // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2008. – №7. – С. 80-81. Глушанова, Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных 13. лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro / Н.А. Глушанова, Б.А. Шендеров // Микробиология. – 2005. - №2. – 153 с. Горбатова, К.К. Биохимия молока и молочных продуктов: учебник / 14. К.К. Горбатова. – М.: Колос, 1997. – 288 с. Горбатова К. К. Физико-химические и биохимические основы про- 15. изводства молочных продуктов / К. К. Горбатова // СПб.: ГИОРД. ‒ 2003. ‒ 352 с. Гореликова, Г.А. Основы современной пищевой биотехнологии: 16. учебное пособие / Г.А. Гореликова. – Кемерово, 2004. – 100 с. Горлов, И.Ф. Биотехнология бактериальных концентратов для 17. профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний в животноводстве / И.Ф. Горлов, М.И. Шрамко, Д.В. Харитонов // Материалы МНТК «Инновационные технологии – основа модернизации отраслей производства и переработки сельскохозяйственной продукции». – Волгоград: ИУНЛ ВолгГТУ, ч.2. – 2011. – 26 с. ГОСТ Р 51758-2001. Среды питательные для ветеринарных целей. 18. Методы биологических испытаний. – Введ. 2001-06-13. – М.: Изд-во стандартов, 2001. – 23 с. 19. Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культиви- рования микроорганизмов: учебное пособие / И.С. Дзержинская. – Астрахан. гос. техн. ун-т. – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2008. – 348 с АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 94 Кантере, 20. В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств: учебное пособие / В.М. Кантере. – М.: Агропромиздат, 1990. – 217 с. Кусь, Г.Н. Методы исследования молока и молочных продуктов: 21. учебник для вузов / Г.Н. Крусь, А.М. Шалыгина, З.В. Волокитина. – М.: Колос, 2000. – 368 с. 22. Конькова Н.К. Питательная среда для выращивания лактобактерий /RU 2216587 C2 // Н.К. Конькова, И.С. Горлова, Н.А. Голубева. – 2003. 23. Конькова Н.К. Пути усовершенствования питательных сред, ис- пользуемых в технологии производства медицинских и ветеринарных пробиотиков / Автореф. дисс. канд. биол. наук. – Н. Новгород, 2002. – 21 с. 24. Классификация питательных сред бактерий, требования к ним [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://biofile.ru/bio/10292.html (дата обращения 25.02.2015). 25. Лысенко, Ю.А. Подбор оптимальной питательной среды для куль- тивирования, концентрирования и высушивания клеток LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS / Ю.А. Лысенко, А.В. Лунева // КубГАУ. – 2014. - №102(8). – С. 2-3. 26. Марьин, В.А. Исследование схем последовательности фаз роста пе- риодической культуры бифидобактерий или лактобактерий / В.А. Марьин, Д.В. Харитонов // Техника и технология пищевых производств. – 2010. – №4. – С.24-28. 27. Медицинская энциклопедия [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.medical-enc.ru/15/pitatelnye-sredy.shtml (дата обращения 25.02.2015). 28. Молочнокислые бактерии [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://vetfac.narod.ru/kielwein0milk/book052.htm (дата обращения 12.02.2015). 29. Методы контроля бактериологических питательных сред: методи- ческие указания / утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко. – М.: Эксмо, 2008. – 23 с. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 95 НИЦФ 30. [электронный ресурс]. – http://www.nicf.spb.ru/index.php?page=sredu_gotovue&r=3 Режим (дата доступа: обращения 15.05.2015). Овсянников Ю. С. Изучение биологических свойств лактобактерий 31. / Ю. С. Овсянников, В. Е. Романов, И. В. Дармов // Современные научные тенденции в животноводстве. Ч. 2. Ветеринарная медицина: Сб. статей Межд. научнопрактической конференции, посвящённой 100- летию со дня рождения П. Г. Петского. – Киров, 2009. - С. 194-197. Овсянников Ю. С. Оценка биологических свойств культур лактобакте- 32. рий и сенной палочки /Ю. С. Овсянников //Ветеринарная медицина№ 1-2. – С. 51-54. Особенности технологии получения бактериальных концентратов 33. [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://propionix.ru/tehnologiya- polucheniya-bakterialnyh-koncentratov (дата обращения 25.03.2015). 34. Остроумов, Л.А. Питательные среды для бифидобактерий / Л.А. Остроумов, А.Ю. Просеков, М.Г. Курбанова, О.В. Козлова // Молочная промышленность. – 2010. – №1. – С. 20-21. 35. Панова Н.В. Разработка нового стимулятора роста микроорганиз- мов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий: дис…канд.биол. наук: 03.00.23, 03.00.07 / Н.В. Панова. – Ставрополь, 2006. – 173 с. 36. Пат. 2415922 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/20, C 12 R 1/225. Питательная среда для культивирования лактобактерий / Тимченко Л.Д., Пенькова Н.И., Катунина Л.С., Вакулин В.Н., Таран Т.В.; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университет. – № 2009140531/10; заявл. 02.11.2009; опубл. 10.04.2011. – 7 с. 37. Пат. 2324732 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/225. Способ производства питательной среды / Марьин В.А., Райдна Е.И.; заявитель и патентообладатель Государственное научное учреждение Всероссийский научно- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 96 исследовательский институт молочной промышленности (ГНУ ВНИМИ). – № 2004134181/13; заявл. 10.05.2006; опубл. 20.05.2008. – 4 с. 38. Пат. 2158302 Российская федерация, МПК7 С 12 N 1/20, A 23 C 9/12, A 23 C 9/127, A 61 K 35/74. Питательная среда для роста бифидо-и лактобактерий / Рахманов Р.С.; заявитель и патентообладатель Нижегородская государственная медицинская академия, Рахманов Рафаил Салыхович. – № 96104676/13; заявл. 11.03.1996; опубл. 27.10.2000. – 5 с. 39. Пат. 2027754 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/20. Питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата казеина / Варушин О.А., Якшина Т.В., Краснова С.П.; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. – № 5014859/13; заявл. 30.08.1991; опубл. 27.01.1995. – 7 с. 40. Пат. 2510416 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/20, C 12 R 1/225. Питательная среда для выделения лактобактерий / Терехов В.И., Арушанян А.Я., Сердюченкр И.В. Глущенко С.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет». – № 2012154888/10; заявл. 18.12.2012; опубл. 27.03.2014. – 8 с. 41. Пат. 2326938 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/20, A 61 K 35/74, A 23 C 9/123. Консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов / Зыкова Н.А., Молокеев А.В., Молокеева Н.В.; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество «Вектор-БиАльгам». – № 2006100739/13; заявл. 20.07.2007; опубл. 20.06.2008. – 14 с. 42. Пат. 2326939 Российская Федерация, МПК C 12 N 1/20, A 61 K 35/74. Молочная питательная среда для получения биомассы бактерийпробиотиков / Зыкова Н.А., Молокеев А.В., Ильина Р.М.; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество «Вектор-БиАльгам». – № 2006116711/13/13; заявл. 10.12.2007; опубл. 20.06.2008. – 13 с. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 97 43. Пат. 2213779 Российская Федерация, МПК7 C 12 Q 1/04, C 12 N 1/20. Питательная среда для выделения лактобактерий / Балаклеец В.С., Алиева Х.М.; заявитель и патентообладатель Научно-производственное объединение «Питательные среды». – № 2001123804/13; заявл. 20.06.2003; опубл. 10.10.2003. – 4 с. 44. Пат. 2216587 Российская Федерация, МПК7 C 12 N 1/20, C 12 N 1/20, C 12 R 1:225. Питательная среда для выращивания лактобактерий / Конькова Н.К., Горлова И.С., Голубева Н.А.; заявитель и патентообладатель Нижегородское государственное предприятие по производству бактериальных препаратов - Фирма «ИмБио». – № 2001120857/13; заявл. 27.05.2003; опубл. 20.11.2003. – 4 с. 45. Пат. 2287572 Российская Федерация, МПК C 12 N 1/20. Питатель- ная среда для культивирования бифидо-или лактобактерий / Марьин В.А., Райдна Е.И.; заявитель и патентообладатель Государственное научно-исследовательский институт молочной промышленности (ГНУ ВНИМИ). – № 2004136432/13; заявл. 20.05.2006; опубл. 20.11.2006. – 6 с. 46. Пат. 2202609 Российская Федерация, МПК7 C 12 N 1/20, C 12 R 1:225. Питательная среда для выделения лактобактерий / Терновская Л.Н., Алещукина А.В., Голошва Е.В.; заявитель и патентообладатель Ростовский научноисследовательский институт микробиологии и паразитологии. – № 2000125959/13; заявл.20.10.2002; опубл. 20.04.2003. – 8 с. 47. Пат. 1102810 Союз Советских Социалистических Республик, МПК C 12 N 1/20, C 12 R 1:01. Питательная среда для производственного культивирования лактобактерий штамма Lactobakterium plantorum / Ефимова Н.П., Красик Л.Л., Несчисляев В.А.; заявитель и патентообладатель Пермский орден Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт вакцин и сывороток. – № 3486282/28; заявл. 05.07.1982; опубл. 15.07.1984. – 4 с. 48. Пат. 2544052 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/20, A 61 K 35/74, A 23 C 9/12. Способ получения бактериального концентрата консорциума пробиотических микроорганизмов / Хамагаева И.С., Хазагаева С.Н., Замбалова Н.А.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ВосточАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 98 но-Сибирский государственный университет технологий и управления». – № 2013132696/10; заявл. 15.07.2013; опубл. 20.01.2015. – 12 с. 49. Пат. 2280465 Российская Федерация, МПК A 61 K 35/74, A 23 C 9/12, C 12 N 1/20, C 12 R 1/225, C 12 R 1/25. Способ приготовления пробиотика / Соловьева И.В., Соколова К.Я., Ефимов Е.И.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение науки «Нижегородский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. – № 2004131097/13; заявл. 25.10.2004; опубл. 27.07.2006. – 7 с. 50. Пат. 2137837 Российская Федерация, МПК6 C 12 Q 1/06, C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04, C 12 N 1/20, C 12 R 1:225. Способ определения количесва жизнеспособных клеток молочнокислых микробов в испражнениях людей / Ребров А.Я.; заявитель и патентообладатель Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчства. – № 97119842/13; заявл. 02.12.1997; опубл. 20.09.1999. – 5 с. 51. Пат. 2061037 Российская Федерация, МПК6 С 12 N 1/20. Питатель- ная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий / Шендеров Б.А., Корнева С.А., Левченко Т.А.; заявитель и патентообладатель Акционерное общество «Русский йогурт». – № 94010907/13; заявл. 29.03.1994; опубл. 27.05.1996. – 4 с. 52. Пат. 2087532 Российская Федерация, МПК6 C 12 N 1/20. Питатель- ная среда для накопления биомассы бифидобактерий / Лищенко Н.Н.; заявитель и патентообладатель Акционерное общество «Русский йогурт». – № 94023024/13; заявл. 15.06.1994; опубл. 20.08.1997. – 7 с. 53. Пат. 2169763 Российская Федерация, МПК7 С 12 N 1/20, A 61 K 35/74, A 23 C 9/12. Молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий / Ильина Р.М., Молокеев А.В., Байбаков В.И.; заявитель и патентообладатель Дочернее государственное унитарное экспериментально- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 99 производственное предприятие «Вектор-Биальгам» ГНЦ ВБ «Вектор». – № 2000116318/13; заявл. 26.06.2000; опубл. 27.06.2001. – 10 с. 54. Перфильев Г. Д. Бактериальные закваски и концентраты в биотех- нологии сыроделия. Научные и практические аспекты // Сб. материалов международного специализированного научно-практического семинара «Бактериальные закваски и биологические средства, применяемые в производстве ферментированных молочных продуктов в России». ‒ Углич, 2005. ‒ С. 9-14. 55. Приготовление бактериальных заквасок и концентратов [электрон- ный ресурс]. – Режим доступа: http://studopedia.net/11_86463_prigotovleniebakterialnih-zakvasok-i-kontsentratov.html (дата обращения 12.02.2015). 56. Рамонова, Э.В. Характеристика штаммов лактобактерий / Э.В. Рамонова, Р.Г. Кабисов, Б.Г. Цугкиев // Молочная промышленность. – 2009. – №2. – С. 43. 57. Раскошная, Т.А. Питательные среды для культивирования ацидофильной молочной палочки / Т.А. Раскошная, В.Ф. Семенихина // Молочная промышленность. – 2010. – №11. – С. 39. 58. Степаненко, П.П. Микробиология молока и молочных продуктов / П.П. Степаненко. – М.: Лира, 2002. – 413 с. 59. Сорокина Н. П. Ассортимент бактериальных концентратов «Экспе- риментальной биофабрики» ВНИИМС // Сб. материалов международного специализированного научно-практического семинара «Бактериальные закваски и биологические средства, применяемые в производстве ферментированных молочных продуктов в России». ‒ Углич, 2005. ‒ с.76-79. 60. Технология получения посевных культур лактобактерий / И. В. Тихонов, Ю. С. Овсянников, В. Г. Комоско и др. // Ветеринарная медицина.2009.- № 1-2. – С. 17-20. 61. Ткаченко Е.И. Питание, микробиоценоз и интеллект человека / Е.И. Ткаченко, Ю.П. Успенский. – СПб.: СпецЛит, 2006. – 590 с. 62. ФС 42-252 ВС 89 «Лактобактерин сухой». АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 100 63. Характеристики молочнокислых бактерий [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://bio-x.ru/articles/harakteristika-molochnokislyh-bakteriy (дата обращения 12.02.2015). 64. Accolas J.P. Conservation a letat congele de suspensions de bacteries lactique concentrees sous faible volume I / J.P. Accolas, J. Auclair // Bacteries lactiques mesophiles. – «Le Lait», 1967. Vol. 47, № 465-466. – Р. 253-260. 65. Ali D., Lacroix C.,Thuault D., Bourgeois C.M., Simard R.E. Characteri- zation of diacetin B, a bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. Lactis bv.diacetylactis UL720.//J.Microbiol.- 1995.- № 9.- P.- 841845. 66. Amrane A., Prigent Y. Lactic acid production rates during the different growth phases of Lactobacillus helveticus cultivated on whey supplemented with yeast extract // Biotechnol. Lett. 1998. - 20, № 4. -P.379-383. 67. Arai, S.L. Global view on functional foods: Asian perspectives / S.L. Arai // British J. Nutrition. – 2002. – Vol. 88. – P. 139 – 143. 68. Bergere I.L. Production massive de cellules de streptocoques lactiques / I.L. Bergere // III Production de differenets souches en culture a pH constant. – «Le Lait», 1968. Vol. 48, №1. – Р. 131-139. 69. Bertazzoni M.E., Benni A., Bonamini E., Cinguetti M., Zoppi G. Differ- ent probiotics and in testinal microflora in antibiotic treated children // Microb. Ecol. Health and Disease. 1998. - № 3-4. P.202-222. 70. Corrigan P.J. Pesticide residues in Australian meat / P.J. Corrigan, P. Seneviratna // Veter. Rec. – 1989. – T. 125. – № 8. – P. 181-184. 71. De Vuyst Luc, Callewaert Raf, Pot Bruno. Characterization of the antago- nistic activity of Lactobacillus amylovorus DCE 471 and largescale isolation of its bacteriocin amylovorin L 471 // Syst. And Appl. Microbiol. 1996. - 19. - № 1. - P. 19-20. 72. Hilliam, M. Heart Healthy Foods / M. Hilliam // World Food Ingredi- ents. – 2001. – Vol. 10. – P. 98 – 103. 73. Hubalek , Z. Protectant used in the cryopreservation of microorganisms / Z. Hubalek // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46. – Р. 205 – 229. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 101 74. Fernandez-Espla M.D., Fox P.F., Martin-Hernandez M.C. Purification and characterization of a novel serine aminopeptidase from lactobacillus casei S. casei IFPL 731.//J.Agr. and Food Chem. 1997.-45.- № 5.- P.-1628-1630. 75. Garro Marisa S., De Valdez Graciela F., Oliver Guillermo, de Giori Graciela S. Purification of a-galactosidase from Lactobacillus fermentum // J.Biotechnol. 1996. - 45, № 2. - P. 103-109. 76. Gobbetti M., Fox P.F., Stepaniak L. Esterolytic snd lipolytic activities of mesophilic snd thermophilic Lactobacilli.// J.Food Sci.- 1996.- 8.- № 2.-P.127-130. 77. Gilliland S.E. Antagonistic action of Lactobacillus acidophilus toward intestinal and foodborne pathogens in assotiative cultures // S.E. Gilliland, M.L. Speck. – J. Food Prot. 1977, № 40. – Р. 820-823. 78. Valles E. Preparation dessuspensions concentrees et congelleses de bac- teries lactiques thermophilus destinees a la fromagerie / E. Valles, G. Macquot // «Le lait», 1968. – Vol. 48. - № 397-480. – Р. 631- 643. 79. Waguespack M. Eliminating residue in «Bob» veal calves / M. Waguespack // Anim. Health Nutrit, 1986. – Vol. 41, № 6. – P. 28-30. 80. Odintsova, N.A. Cryopreservation of primary cell cultures of ma-rine inver- tebrates / N.A. Odintsova, K.V. Kiselev // Cryoletters. – 2002. – Vol. 22. – Р. 299 – 310. 81. Schaafsma, G. The Functional Drinks Prophecy / G. Schaafsma, R. Korstanje // World Food Ingredients. – 2004. – .Vol. 4. – P. 44 – 48. 82. Exposure of engineered nanoparticles to human lung epithelial cells: in- fluence of chemical composition and catalytic activity on oxidative Stress / L.K. Limbach, P. Wick, P. Manser, R.N. Grass, A. Bruinink, W.J. Stark // Environ. Sci. Technol. – 2007. – №11. – P. 4158 – 4163. 83. Mohanpuria, P. Biosynthesis of nanoparticles: technological concepts and future applications / P. Mohanpuria // Nanopart Res. – 2008. – № 10. – Р. 507 – 517. 84. Pedahzur, R., Lev, O. The interaction of silver ions and hydrogen perox- ide in the inactivation of E. coli: a preliminary evaluation of a new long acting residual drinking water disinfectant / R. Pedahzur, O. Lev // Water Science and Technology. – 2005. – № 5. – Р. 123 – 129. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 102 85. Sarkar, S. Facile synthesis of silver nanoparticles with higly efficient an- timicrobial property / S. Sarkar // Polyhedron. – 2007. – № 26. – P. 19 – 26. 86. Schreurs, W.J.A. Effect of Silver Ions on Transport and Retention of Phosphate by Escherichia coli / W.J.A. Schreurs // Journal Of Bacteriology. – 2002. – № 1. – P. 7–13. 87. Serpone, N. Inorganic and organic UV filters: Their role and efficacy in sunscreens and suncare products / N. Serpone, D. Dondi, A. Albini // Inorg. Chim. Acta. – 2007. – №360. – P. 794–802. 88. Silver nanoparticles: Environmental and human health impacts : Nano- materials: Risk and Benefits, Series / R.A. Khaydarov, R.R. Khaydarov, Y. Estrin, S. Cho et al. – Netherlands : Science for Peace and Security Series C: Environmental Security, 2009. – P. 287 – 299. 89. Nanoparticles for Applications in Cellular Imaging / K.T. Thurn, E.M.B. Brown, A. Wu, S. Vogt, B. Lai // Nanoscale Res. Lett. – 2007. – №2. – P. 430 –441. 90. Van, H.P. Colloidal silver as an antimicrobial agent: fact or fiction? / H.P. Van, B.A. Gashe, J. Ahmad // J Wound Care. – 2004. – №13(4). – Р. 154 – 155. 91. Zhang, S. Toxic Effects of Ag(I) and Hg(II) on Candida albicans and C. maltosa: a Flow Cytometric Evaluation / S. Zhang, A.Jr. Crow // Applied and Environmental Microbiology. – 2001. – № 9. – Р. 4030 – 4035. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 103 Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)» (ФГБОУ ВО «КемТИПП») Кафедра «Бионанотехнология» СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ К ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЕ на тему «Разработка патента на способ приготовления питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий» выполнил студент гр. ПБн-121 Харитонкина Е.Е. _________________ руководитель доцент, к.т.н. Кригер О.В. _________________ Кемерово 2015 СОДЕРЖАНИЕ ГЛАВА 1 ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК…………………………………………… 5 1.1 Общие данные об объекте исследования ….……………...………... 5 1.2 Основная (аналитическая) часть……………………………………... 7 1.2.1 Технический уровень и тенденции развития объекта хозяйственной деятельности…………………………………………………............... 7 1.2.2 Использование объектов промышленной (интеллектуальной) собственности и их правовая охрана…………………………………….. 8 1.2.3 Исследование патентной чистоты объекта техники……………….. 18 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…..….......................................................................................... 20 Приложение А Задание на проведение патентных исследований…................ 23 Приложение Б Регламент поиска………………………………………………. 25 Приложение В Отчет о поиске………………………………………….……… 29 Приложение Г Рефераты………………………………………………………... 41 ГЛАВА 2 ЗАЯВКА НА ПОЛУЧЕНИЕ ПАТЕНТА…………………........... 49 РЕФЕРАТ….…………………………………….………………….................... 53 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ………………………………………................ 54 Изм. Лист № докум. ХаритонкинаЕ.Е Разраб. Кригер О.В. Пров. Н. Контр. Утв. Сухих С.А. Просеков А.Ю. Подп. Дата АТО 00.00.000 СЧ Исследование и разработка питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий Лит. Д Лист 2 Листов 54 КемТИПП гр. ПБн-121 ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ ВКР – выпускная квалификационная работа ВОИС – Всемирная организация интеллектуальной собственности НИР – научно-исследовательская работа ЕРО – Европейское патентное бюро АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 3 ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ Питательная среда – это вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. Культивирование – это разведение, выращивание растений, злаков, растительных клеток, тканей, микроорганизмов, животных или органов в искусственных условиях. Макроорганизмы – это организмы, величина которых больше 500 мкм (1 мкм (микрометр) = 0,001 мм), для животных – 10 мм. Микроорганизмы (микро́бы) – это собирательное название группы живых организмов, которые слишком малы для того, чтобы быть видимы- ми невооружённым глазом (их характерный размер — менее 0,1 мм). Лактобактерии (лат. Lactobacillus) – это род грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий. Молочнокислые бактерии - группа микроаэрофильных грамположительных микроорганизмов, сбраживающих углеводы с образованием молочной кислоты как одного из основных продуктов. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 4 ГЛАВА 1 ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК 1.1 Общие данные об объекте исследования Патентные исследования проводились в период с 10 марта по 5 апреля 2015 г. Патентный поиск проводился с целью определения патентоспособности планируемых результатов научно-исследовательской работы. Патентный поиск проводился в соответствии с ГОСТ Р. 15.011-96 «Система разработки и постановки продукции на производство. Патентные исследования». Объектом исследования является способ приготовления питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Питательная среда обеспечивает необходимые условия для проведения процесса культивирования. Она обеспечивает жизнедеятельность, рост, развитие, накопление биомассы. Питательные среды используются во многих отраслях. В медицине, в пищевой промышленности, для ветеринарных целей и др. Питательные среды используют для контроля стерильности лекарственных препаратов и объектов внешней среды, для микробиологических анализов, для выделения и культивирования микроорганизмов и для прочих целей. Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк – от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 5 (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка). Область поиска направлена на разработку питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Рубрики МПК РФ охваченные в данном патентном отчете: С12N1/20, C12R1/225, A23C9/12, A23C9/127, A61K35/74, A23C9/123, С12Q1/04, C12R1/25, C12R1:225. Рубрики классификации охваченные в рамках зарубежных патентов: A23L1/20, A23L1/2008, С12N1/20, C12K1/25. Поиск патентной информации проводился в патентных базах данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации (Роспатент, www.fips.ru), бюро по патентным и товарным знакам США (USPTO, www.uspto.gov), Европейского патентного бюро (ЕРО, ep.espacenet.com), Всемирной организации интеллектуальной собственности (ВОИС, www.wipo.int). В патентном законе Российской Федерации не признается патентоспособность научных теорий, математических методов, правил и методов интеллектуальной и хозяйственной деятельности, компьютерных программ, и решений, заключающихся только в представлении информации (патентный закон РФ). Однако, несмотря на это, приоритет международного законодательства позволяет осуществлять и в нашей стране патентование подобного рода изобретений. В последнее время в России появляется все больше такого рода фиктивных патентов, причем все они имеют иностранное происхождение. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 6 1.2 Основная (аналитическая) часть 1.2.1 Технический уровень и тенденции развития объекта хозяйственной деятельности Область исследования – способы получения питательных сред для культивирования бактериального концентрата лактобактерий. Питательная среда обеспечивает необходимые условия для проведения процесса культивирования. Она обеспечивает жизнедеятельность, рост, развитие, накопление биомассы. В Росздравнадзоре по состоянию на 2010 г. зарегистрировано менее 50 % питательных сред отечественных производителей при выпуске около 400 наименований. Хорошие показатели по регистрации выпускаемых препаратов имеют два предприятия – НПО “Питательные среды” (г. Махачкала) и ФБУН “ГНЦ ПМБ” (г. Оболенск), которые зарегистрировали практически весь ассортимент выпускаемой продукции, а это более 120 препаратов. А также питательные среды для молочнокислых бактерий выпускают следующие предприятия: ООО «ГалсМед» (Московская область), OOO «МедикаПлюс» (г. Санкт-Петербург), ЗАО «НПО Биоконт» (г. Москва), ООО «МикроБио» (г. Москва), ОАО «Биомед» (Московская область), ЗАО «НИЦФ» (г. СанктПетербург), ООО «ВИТА РОС» (г. Ростов-на-Дону), ЗАО «Химреактивснаб» (г. Уфа), компания Merck KGaA (Германия). За последние пять лет приняты важные документы, которые существенно изменили правовой статус питательных сред. В 2006 г. питательные среды переведены из класса лекарственных средств, где они присутствовали в статусе медицинских иммунобиологических препаратов, в класс изделий медицинского назначения. Существенный вклад в этом направлении внес Федеральный закон от 01.11.2011 № 323. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 7 Таким образом, за последние годы достигнуты значительные успехи в нормативно-правовом регулировании производства, хранения и распространения питательных сред. Законодательно закреплен порядок государственной регистрации и лицензирования производства питательных сред, определена ответственность производителей, коммерческих структур, потребителей за использование в лабораторной практике диагностических питательных сред». 1.2.2 Использование объектов промышленной (интеллектуальной) собственности и их правовая охрана Известны различные способы получения питательных сред для культивирования бактериального концентрата лактобактерий. Например, патент №2415922 РФ МПК С12N1/20, С12R1/225 описывает питательные среды для культивирования лактобактерий. Питательная среда для культивирования лактобактерий, содержащая питательную основу, глюкозу, агар микробиологический, стимулятор роста и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса с содержанием аминного азота 0,7–0,9 %, а в качестве стимулятора роста - ферментативный гидролизат каллизии душистой при следующем содержании ингредиентов, мас.%: ферментативный гидролизат говяжьего мяса с содержанием аминного азота 0,7–0,9 % 28,0–30,0 ферментативный гидролизат каллизии душистой 0,9–1,0 глюкоза 18,0–20,0 агар микробиологический 0,9–1,0 дистиллированная вода остальное АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 8 В патенте №2324732 РФ МПК С12N1/20 описывается способ производства питательной среды. Способ производства питательной среды, включающий внесение добавки гидролизата молочного белка в исходную питательную среду, перемешивание компонентов, раскисление раствором аммиака, стерилизацию и охлаждение, отличающийся тем, что в качестве исходной питательной среды используют молочную сыворотку, содержащую 6–15 % сухих веществ, перед внесением добавки исходную питательную среду пастеризуют при 90–95 °С в течение 10–30 мин, охлаждают до 40–45 °С, раскисляют до рН 6,8–7,0, вносят закваску Streptococcus thermophilus и сквашивают при 40–45 °С в течение 3–6 ч, а раскисление питательной среды раствором аммиака проводят после охлаждения стерилизованной питательной среды. В патенте №2158302 РФ МПК7 С12N1/20, A23C9/12, A23C9/127, A61K35/74 описывается питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий. Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий, содержащая белковый гидролизат и агарагар, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит аскорбиновую кислоту, а в качестве белкового гидролизата - белковый гидролизат крови или белковый гидролизат заменителя кровли при следующем соотношении компонентов, г/л: аскорбиновая кислота - 0,01–0,10; агар-агар - 0,70–0,80; белковый гидролизат крови – остальное. В патенте №2027754 РФ МПК6 С12N1/20 описывается питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата казеина. Питательная среда для выращивания микроорганизмов, содержащая источник азота - панкреатический гидролизат козеина, источник углерода - лактозу, источник витаминов - экстракт пекарских дрожжей, цистин и водопроводную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сернокислые соли марганца и магния и аскорбиновую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л: Панкреатический гидролизат казеина - 0,14–0,16; Экстракт пекарских дрожжей - 4,5–5,5; Лактоза - 19–21; АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 9 Цистин - 0,15–0,25; MgSO 4 ·7H 2 O - 0,15–0,25; MnSO 4 ·4H 2 O - 0,04–0,06; Аскорбиновая кислота - 0,4–0,6; Водопроводная вода, л - До 1. Способ получения панкреатического гидролизата казеина, предусматривающий растворение казеина в воде, термическую обработку полученного раствора, охлаждение до температуры гидролиза, внесение панкреатина и гидролиз при заданных температуре и величине pH с последующей его фильтрацией, отличающийся тем, что термическую обработку раствора казеина ведут при 79– 81 oС и pH 8,0–8,2 в течение 2 ч, гидролиз проводят при 49–51 oС в течение 2 ч при pH 8,0–8,2, полученный гидролизат подкисляют до pH 4,0–4,5, прогревают до 100 oС в течение 5–10 мин, охлаждают до 75–85 oС и подвергают ультрафильтрации на мембране с размерами пор 50 мкм. В патенте №2544052 РФ МПК С12N1/20, A61K35/74, A23C9/12 описывается способ получения бактериального концентрата консорциума пробиотических микроорганизмов. Способ получения бактериального концентрата консорциума пробиотических микроорганизмов, включающий приготовление питательной среды, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята, наращивание биомассы, отделение биомассы от культуральной жидкости, смешивание с защитной средой в соотношении 1:1, розлив, укупорку, замораживание, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вносят селенит натрия в количестве 30–50 мкг/мл, а в качестве инокулята используют комбинированную закваску на основе Bifidobacterium bifidum 8 3 , Lactococcus lactis subspecies cremoris 24 4 , Propionibacterium freudenreichii subspecies shermanii AC-2503, взятых в соотношении 40:30:30. Культивирование инокулята осуществляют при 35 °С. В патенте №2510416 РФ МПК C12N1/20, C12R1/225 описывается питательная среда для выделения лактобактерий. Питательная среда для выделения лактобактерий, включающая капустный отвар, глюкозу, агар, отличающаяся АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 10 тем, что в качестве дополнительных источников питания и селективности содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%: молочная сыворотка 9–10,0 дрожжевой аутолизат 9–10,0 глюкоза 1,9–2,0 уксусная кислота 70 % 0,14–0,16 агар-агар 1,8–2,0 капустный отвар остальное В патенте №2326938 РФ МПК C12N1/20, A61K35/74, A23C9/123 описывается консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов. Способ получения препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов, включающий подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение в молочную питательную среду посевной дозы комбинации штаммов бактерий-пробиотиков в количестве не более 5,0 мас.%, сквашивание продукта в течение времени, достаточном для формирования сгустка, и охлаждение готового продукта при температуре не выше 6 °С, отличающийся тем, что в качестве комбинации штаммов бактерий-пробиотиков используют консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 3962), Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 5724), содержащихся в соотношении 2:0,5:0,5, а в качестве молочной питательной среды используют обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку до 13,5–15 %, в которое дополнительно вводят лактопептон и натрий лимонно-кислый при следующем соотношении компонентов, мас.%: АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 11 Лактопептон 3,5–4,5 Натрий лимонно-кислый 0,15–0,25 Обезжиренное молоко остальное до 100 % Патент №2326939 РФ МПК С12N1/20, A61K35/74 описывает молоченую питательную среду для получения биомассы бактерий-пробиотиков. Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащая основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13–14 %, цистеин соляно-кислый или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков, ростовые факторы из дрожжевых клеток и натрий хлористый, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит марганец сернокислый четырехводный и магний серно-кислый семиводный, в качестве гидролизата белков молока содержит лактопептон, а в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток - очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1–2,8 %, общего белка не менее 3–4 % при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%: лактопептон 5,0–7,0 цистеин соляно-кислый или аскорбиновая кислота 0,001–0,002 натрий хлористый 0,03–0,05 марганец серно-кислый четырехводный 0,001–0,005 магний серно-кислый семиводный 0,01–0,02 очищенный дрожжевой экстракт 1,5–2,0 обезжиренное молоко остальное до 100% Патент №2213779 РФ МПК7 С12Q1/04, C12N1/20 описывает питательную среду для выделения лактобактерий. Питательная среда для выделения лактобактерий, содержащая источник азотистого питания, источник витаминов группы В, Д(+) глюкозу, железо сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, цистеин, цитрат аммония, калий фосфорнокислый однозамещенный, агар микробиологический, поваренную соль, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий лимонАТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 12 нокислый трехзамещенный, натрий уксуснокислый плавленный, кристаллвиолет, полимиксин М сульфат, в качестве источника азотистого питания - панкреатический гидролизат казеина сухой, а в качестве источника витаминов группы В-экстракт кормовых дрожжей сухой при следующем соотношении компонентов, в г/л дистиллированной воды: Панкреатический гидролизат казеина сухой - 15,0–30,0 Экстракт кормовых дрожжей сухой - 3,0–7,0 Д(+) глюкоза - 17,0–25,0 Цистеин - 0,1–0,3 Железо сернокислое 7-водное - 0,03–0,06 Магний сернокислый 7-водный - 0,6–1,0 Цитрат аммония - 1,5–3,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный - 4,0–8,0 Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 6,0–8,5 Натрий уксуснокислый плавленный - 7,0–8,0 Агар микробиологический - 7,0–12,0 Поваренная соль - 3,0–8,0 Кристаллвиолет - 0,002–0,0025 Полимиксин М сульфат - 0,04–0,06п В патенте №2216587 РФ МПК7 С12N1/20, C12R1:225 описывается питательная среда для выращивания лактобактерий. Питательная среда для выращивания лактобактерий, содержащая источник азота, глюкозу, автолизат пекарских дрожжей, сульфаты марганца и магния, фосфат калия двузамещенный, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит ацетат натрия и цитрат аммония, а в качестве источника азота панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг % при следующем соотношении компонентов, г/л: Глюкоза - 15,0–25,0; Панкреатический гидролизат казеина - 10,0–20,0; Сульфат марганца - 0,02–0,03; АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 13 Сульфат магния - 0,05–0,15; Автолизат пекарских дрожжей - 15,0–97,5; Фосфат калия двузамещенный - 0,5–1,5; Ацетат натрия - 2,0–3,0; Цитрат аммония - 0,5–1,5; Вода дистиллированная - До 1 л. В патенте №22875772 РФ МПК С12N1/20 описывается питательная среда для культивирования бифидо- или лактобактерий. Питательная среда для культивирования бифидо- или лактобактерий, содержащая дрожжевой автолизат, гидролизат казеина и неорганическую соль фосфорной кислоты, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит молочную сыворотку, содержащую 15 % сухих веществ, с гидролизованной от 50 до 70 % лактозой и обезжиренное молоко, а в качестве соли фосфорной кислоты содержит натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный при следующем соотношении компонентов, мас.%: Дрожжевой автолизат 15–25; Гидролизат казеина 15–25; Молочная сыворотка 35–50; Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 1,0–1,5; Обезжиренное молоко – остальное. В патенте №2202609 РФ МПК7 С12N1/20, C12N1/20, C12R1:225 описывается питательная среда для выделения лактобактерий. Питательная среда для выделения лактобактерий, содержащая питательную основу, глюкозу, пептон, Lцистин солянокислый, сернокислый марганец, сернокислый магний, калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы среда содержит ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов и дополнительно включает стерильный мел и агар-агар при следующем соотношении компонентов, в г/л: Сернокислый марганец - 0,049–0,05; Сернокислый магний - 0,19–0,2; АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 14 L-цистин солянокислый - 0,095–0,1; Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 1,95–0,2; Пептон - 4,9–5,0; Глюкоза - 19,8–20,0; Агар-агар - 15,0±0,1; Стерильный мел - 9,9–10,0; Гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы – остальное. В патенте №2280465 РФ МПК A61K35/74, A23C9/12, C12N1/20, C12R1/225, C12R1/25 описывается способ приготовления пробиотика. Способ приготовления пробиотика на основе живых штаммов лактобактерий с использованием молочнодрожжевой питательной среды, включающей гидролизат обезжиренного молока, дрожжевой автолизат и углевод, путем культивирования лактобактерий при температуре 37±1 °С, расфасовку препарата, отличающийся тем, что питательная среда дополнительно содержит агар-агар, разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока с содержанием аминного азота 130–200 мг %, в качестве углевода используют раффинозу, причем совместное культивирование штаммов лактобактерий L. fermentum 39 и L.plantarum 8 PA 3 ведут в два этапа: на первом этапе разведенные в среде штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют 24±1 ч, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000 и продолжают культивирование в течение 24±1 ч при той же температуре. В патенте №2137837 РФ МПК6 C12Q1/06, C12N1/20, C12Q1/04, С12R1:225 описывается способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых микробов в испражнениях людей. Способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых микробов (МКМ) в испражнениях людей путем использования твердой питательной среды и глубинного выращивания в ней МКМ, без анаэробной аппаратуры, отличающийся тем, что, с целью увеличения точности и надежности способа, в твердую среду на основе неохмеленного пивного сусла добавляют микроэлементы, природный мел и лактозу. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 15 В патенте №2061037 РФ МПК С12N1/20 описывается питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий. Питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий, содержащая питательную основу, пептон, агар-агар, лактозу, хлористый натрий и воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы используют гидролизат гороха, полученный путем разведения последнего водой, необходимой для приготовления питательной среды, и выдержки полученной смеси до содержания аминного азота 130 150 мг при следующем соотношении компонентов, мас. Пептон 0,15–0,25; Агар-агар 0,075–0,1; Лактоза 0,5–2,0; Хлористый натрий 0,2–0,4; Гидролизат гороха, разведенный водой – остальное. В патенте №2087532 РФ МПК С12N1/20 описывает питательную среду для накопления биомассы бифидобактерий. Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий, содержащая питательную основу, источник углерода лактозу, редуцирующее вещество - D,L-цистеин, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит молочную сыворотку, осветленную последовательной обработкой обезжиренного молока кислотой и щелочью, и дрожжевой автолизат сухой или жидкий, и дополнительно натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный, аммоний хлористый и магний сернокислый семиводный, при следующем соотношении компонентов, мас. Молочная сыворотка осветленная 7,5–10,0; Дрожжевой автолизат 0,2–0,3; Лактоза 0,3–0,5; D,L-цистеин 0,05–0,1; Натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный 0,7–0,8; Аммоний хлористый 0,1–0,15; Магний сернокислый семиводный 0,015–0,020; Агар-агар 0,075–0,080; АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 16 Вода – остальное. В патенте №2169763 РФ МПК7 C12N1/20, A61K35/74, A23C9/12 описывается молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий. Молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий, содержащая основу цистеин солянокислый (L-цистин), D(-)лактозу, гидролизат молочных белков и аутолизат дрожжей, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит натрий хлористый, в качестве гидролизата молочных белков используют панкреатический гидролизат обрата молока, в качестве аутолизата дрожжей используют ферментативный аутолизат дрожжей, а в качестве основы используют нормализованный по сухому остатку обрат молока при суммарном содержании аминного азота в питательной среде 260-300 мг % и следующем соотношении ее компонентов, мас.%: Панкреатический гидролизат обрата молока – 5,0–7,0; Цистеин солянокислый (L-цистин) – 0,001–0,003; D(-)-лактоза – 0,03–0,09; Натрий хлористый – 0,01–0,05; Ферментативный аутолизат дрожжей – 1,0–2,0; Обрат молока, нормализованный по сухому остатку – остальное до 100 %. В патенте US 4110477 A A23L1/20; (IPC 1-7): A23L1/20, A23L1/2008 описывается способ получения питательной среды для культивирования молочнокислых бактерий на пару соевых бобов, содержащей гомогенизированную водной суспензию грибов. Состав питательной среды л/г: 50 г глюкозы и лактозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г аминокислоты, 8 г обычной соли и 100 г гомогенизированного сырого гриба. Полученную суспензию разбрызгивают на пару соевых бобов. В патенте №1102810 СССР МПК С12N1/20, C12K1/25 описывается питательная среда для производственного культивирования лактобактерий штамма Lactobakterium Plantarum 8 – РА – 3, содержащая в качестве источников углерода и азота глюкозу, цистеин солянокислый, ацетат натрия и цитрат аммония, минеральные соли: марганец сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокисАТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 17 лый двузамещенный, а также твин-80 и воду, отличающаяся тем, что, с целью увеличения среднего срока годности сухого препарата лактобактерий, а также удешевления среды, в качестве источника азота среда дополнительно содержит гидролизат соевого шрота с содержанием аминного. азота 120–150 мг % при следующем соотношении компонентов, г/л: 10–25 Глюкоза 1,0–2,5 Цистеин солянокислый 1,0–2,5 Цитрат аммония 2,5–6,25 Ацетат натрия 0,10–0,25 Магний сернокислый 0,025–0,075 Марганец сернокислый Калий фосфорнокислый (Л 1,0–2,5 двузамещенный 0,5–1,0 мл Твин-80 100,0-200,0 Вода Гидрат соевого шрота с содержанием аминного азота % Остальное 120–150 мг. 1.2.3 Исследование патентной чистоты объекта техники Патентный поиск (с глубиной поиска 40 лет) с целью проверки способов получения питательных сред для культивирования бактериального концентрата лактобактерий на патентную чистоту проводился по странам: Российская Федерация, США, Китай, Корея, страны Европы. В процессе патентного поиска были использованы следующие источники: a) Российские БД: 1) Федеральный институт промышленной собственности (ФИПС), http://fips.ru/; 2) Всероссийский институт научной и технической информации (ВИНИТИ), http://www.viniti.msk.su/; 3) Международный центр научной и технической информации (МЦНТИ), http://www.icsti.su/; 4) Федеральное государственное научное учреждение «Центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти» (ЦИТиС); 5) ГПНТБ, http://www.gpntb.ru/; б) Зарубежные БД: АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 18 1) United states patent and Trademark Office, http://www.uspto.gov/web/menu/search.html; 2) Европейская патентная организация (ЕПО), http://preview.espacenet.com http://www.espacenet.com; 3) Всемирная организации интеллектуальной собственности (ВОИС), http://www.wipo.int/. В рамках настоящего патентного исследования проведен тематический поиск российской и зарубежной охранной документации, а также мониторинг прочих информационных ресурсов. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 19 ЗАКЛЮЧЕНИЕ После проведения подробного анализа существующих патентов, сделан вывод о том, что на данный момент изучаются и разрабатываются разные способы приготовления питательных сред для культивирования лактобактерий. При создании и усовершенствовании уже выпускающихся бактериальных концентратов необходимы дальнейшие исследования по изучению свойств производственных штаммов, отработке технологических режимов производства, разработке эффективных и экономичных питательных сред. В условиях расширения спроса на бактерийные концентраты особое значение приобретают доступные, стандартные и экономичные питательные среды, используемые для глубинного культивирования продуцентов при получении бактериальных концентратов. Питательная среда, по-существу, является основой бактерийных концентратов. Качественный и количественный состав питательной среды определяет ее способность обеспечивать наиболее эффективный путь наращивания биомассы бактерий, сохранять жизнеспособность клеток в процессе хранения концентратов. Таким образом, качество бактериальных концентратов и эффективность биотехнологии их производства зависит в первую очередь от успешного выбора питательной среды. В этой связи разработка новых способов приготовления питательных сред для культивирования лактобактерий является актуальной и важной научно-технической задачей. Цель патентных исследований – определение способов получения питательных сред для культивирования бактериального концентрата лактобактерий, применяемых в России и за рубежом, обоснование целесообразности правовой охраны объектов интеллектуальной собственности в стране и за рубежом, прогнозирование дальнейшего развития разрабатываемых способов производства питательной среды. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 20 Патентный поиск (с глубиной поиска 40 лет) с целью проверки способов получения глюкозы на патентную чистоту проводился по странам: Российская Федерация, США, Китай, Корея, страны Европы. В процессе патентного поиска были использованы следующие источники: a) Российские БД: 1) Федеральный институт промышленной собственности (ФИПС), http://fips.ru/; 2) Всероссийский институт научной и технической информации (ВИНИТИ), http://www.viniti.msk.su/; 3) Международный центр научной и технической информации (МЦНТИ), http://www.icsti.su/; 4) Федеральное государственное научное учреждение «Центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти» (ЦИТиС); 5) ГПНТБ, http://www.gpntb.ru/; б) Зарубежные БД: 1) United states patent and Trademark Office, http://www.uspto.gov/web/menu/search.html; 2) Европейская патентная организация (ЕПО), http://preview.espacenet.com http://www.espacenet.com; 3) Всемирная организации интеллектуальной собственности (ВОИС), http://www.wipo.int/. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 21 ПРИЛОЖЕНИЯ АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 22 ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное) УТВЕРЖДАЮ Ректор ФГБОУ ВО «КемТИПП» А.Ю. Просеков __________________________ «____» 2015 г. м.п. ЗАДАНИЕ №1 на проведение патентных исследований Наименование работы (темы): Исследование и разработка питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий Этап работы: ВКР, определение уровня технического развития Сроки выполнения: 10.03.2015 г. – 05.04.2015 г. Задачи патентных исследований: установление требований к объекту исследования; выявление охранных документов, препятствующих производству и реализации объекта разработки в РФ и за рубежом; формирование групп патентов-аналогов для дальнейшей оценки перспективности защиты результатов научных исследований. База нормативной документации: www.complexdoc.ru АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 23 Таблица А1 - Календарный план Виды патентных исследований Подразделенияисполнители (соисполнители) Ответственные исполнители (Ф.И.О.) Патентные исследования по определению патентнолицензионной ситуации на рынке, по определению технического уровня разрабатываемых в России и за рубежом способов получения глюкозы. Обоснование целесообразности правовой охраны объектов интеллектуальной собственности в стране и за рубежом. ФГБОУ ВО «КемТИПП» Харитонкина Е.Е. Сроки выполнения патентных исследований. Начало. Окончание 10.03.2015 г. – 05.04.2015 г Отчетные документы Отчет о патентных исследованиях Руководитель подразделения - исполнителя работы «____»____________2015 г. ___________________ О.В. Кригер Руководитель патентного подразделения «____»_____________2015 г. __________________ А.П. Сырцева АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 24 ПРИЛОЖЕНИЕ Б (обязательное) ФОРМА РЕГЛАМЕНТА ПОИСКА Регламент поиска №1 от 10.03.2015 г. Наименование работы (темы): Исследование и разработка питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий Номер и дата утверждения задания №1 от 10.03.2015 г. Этап работы: ВКР Цель поиска информации: определение достигнутого технического уровня в РФ и зарубежных странах в области разработки питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий. Обоснование регламента поиска: получение достаточного количества исходных данных из различных источников информации для оценки технического уровня в области разработки питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий, таблица Б1. Начало поиска: 10.03.2015 г. Окончание поиска: 05.04.2015 г. Таблица Б1 ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, ПО КОТОРЫМ ПРОВЕДЕН ПОИСК Предмет поиска Страна поиска Наименование Получение питательной среды для лактобактерий Питательная среда для лактобактерий Питательная среда для лактобактерий Питательные среды для молочнокислых бактерий Россия научнотехническая информация патентные База данных по изобретениям Федеральной службы по интелектуальной собственности, патентам и товарным знакам (Роспатент) Классификация МПК С12N1/20 C12R1/225 A23C9/12 A23C9/127 A61K35/74 С12N1/20 C12R1:225 C12R1/225 A61K35/74 A23C9/123 С12Q1/04 C12N1/20 C12R1/225 А61K35/74 A23C9/12 C12N1/20 C12R1/225 C12R1/25 конъюнктурные другие Код тоНаиме- Рубрики НаимеНаиме- Кл. вара ГС, нование УДК нование нование инд. СМТК Ретроспективность Наименование информационной базы 20 лет Роспатент www.fips.ru Продолжение таблицы Б1 ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, ПО КОТОРЫМ ПРОВЕДЕН ПОИСК Предмет поиска Питательная среда для выделения лактобактерий Страна поиска Россия научнотехническая информация патентные Наименование Классификация МПК База данных по изобретениям Федеральной службы по интелектуальной собственности, патентам и товарным знакам (Роспатент) C12Q1/06 C12N1/20 C12Q1/04 C12R1:225 A61K35/74 A23C9/12 конъюнктурные другие Код тоНаиме- Рубрики НаимеНаиме- Кл. вара ГС, нование УДК нование нование инд. СМТК Ретроспективность Наименование информационной базы 20 лет Роспатент www.fips.ru Продолжение таблицы Б1 ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, ПО КОТОРЫМ ПРОВЕДЕН ПОИСК Предмет поиска Страна поиска научнотехническая информация патентные Классификация МПК Наименование Получение питательной среды для молочнокислых бактерий США, страны Европы, Китай, Корею и Японию Патентная база данных Бюро по патентам и товарным знакам США (USPTO) Всемирная организация интеллектуальной собственности (WIPO) конъюнктурные другие Код тоНаиме- Рубрики НаимеНаиме- Кл. вара ГС, нование УДК нование нование инд. СМТК A23L1/20 A23L1/2008 С12N1/20 C12K1/25 Руководитель подразделения - исполнителя работы «____»____________2015 г. ___________________ О.В. Кригер Руководитель патентного подразделения «____»_____________2015 г. __________________ А.П. Сырцева Ретроспективность Наименование информационной базы 38 лет USPTO www.uspto.g ovEPO, WIPO www.wipo.i nt ПРИЛОЖЕНИЕ В (обязательное) ОТЧЕТ О ПОИСКЕ В1 Поиск проведен в соответствии с заданием: Исследование и разработка питательной среды для получения бактериального концентрата лактобактерий, Кригер О.В, доцент, к.т.н. №1 от «10» марта 2015 г. и Регламентом поиска №1 от «10» марта 2015 г. В2 Этап работы: определение уровня развития техники В3 Начало поиска:10.03.2015 г. Окончание: 05.04.2015 г. В4 Сведения о выполнении регламента поиска (указывают степень выполнения регламента поиска, отступления от требований регламента, причины этих отступлений): регламент поиска выполнен В5 Предложения по дальнейшему проведению поиска и патентных исследований: В6 Материалы, отобранные для последующего анализа Таблица В 6.1 - Патентная документация Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Получение питательной среды для лактобактерий Получение питательной среды для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2415922 C12N1/20; C12R1/225 Российская Федерация, патент №2324732 C12N1/20 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Автор(ы): Тимченко Людмила Дмитриевна (RU), Пенькова Надежда Ивановна (RU), Катунина Людмила Семеновна (RU), Вакулин Валерий Николаевич (RU), Таран Татьяна Викторовна (RU) Патентообладатель(и): Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университет (RU) Номер заявки: 2009140531/10 Дата подачи заявки: 02.11.2009 Дата публикации: 10.04.2011 Автор(ы): Марьин Виктор Анатольевич (RU), Райдна Евгений ИВо-Свенович (RU) Патентообладатель(и): Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (ГНУ ВНИМИ) (RU) Номер заявки: 2004134181/13 Дата подачи заявки: 24.11.2004 Дата публикации: 10.05.2006 Название изобретения (модели, образца) Сведения о действии охранного документа или причина его аннулирования (только для анализа патентной чистоты) Питательная среда для культивирования лактобактерий Может прекратить свое действие Пошлина: учтена за 5 год с 03.11.2013 по 02.11.2014 Способ производства питательной среды Прекратил действие Пошлина: учтена за 4 год с 25.11.2007 по 24.11.2008 Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Получение питательной среды для лактобактерий Получение питательной среды для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2158302 C12N1/20; A23C9/12; A23C9/127; A61K35/74 Российская Федерация, патент №2027754 C12N1/20 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Заявитель(и): Нижегородская государственная медицинская академия, Рахманов Рафаил Салыхович Автор(ы): Рахманов Р.С. Патентообладатель(и): Нижегородская государственная медицинская академия, Рахманов Рафаил Салыхович Номер заявки: 96104676/13 Дата подачи заявки: 11.03.1996 Дата публикации: 27.10.2000 Заявитель(и): Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии Автор(ы): Вашурин О.А., Якшина Т.В., Краснова С.П., Самойленко В.А., Сигаева Н.Н., Рахимов А.А., Артюхин В.И. Патентообладатель(и): Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии Номер заявки: 5014859/13 Дата подачи заявки: 30.08.1991 Дата публикации: 27.01.1995 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Питательная среда для роста бифидои лактобактерий Питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата кзеина Прекратил действие Пошлина: учтена за 4 год с 12.03.1999 по 11.03.2000 Прекратил действие Пошлина: учтена за 8 год с 31.08.1998 по 30.08.1999 Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Получение питательной среды для лактобактерий Питательная среда для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2027754 C12N1/20; A61K35/74; A23C9/12 Российская Федерация, патент №2510416 C12N1/20; C12R1/225 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Автор(ы): Хамагаева Ирина Сергеевна (RU), Хазагаева Софья Николаевна (RU), Замбалова Наталья Александровна (RU) Патентообладатель(и): Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (RU), Хамагаева Ирина Сергеевна (RU) Номер заявки: 2013132696/10 Дата подачи заявки: 15.07.2013 Дата публикации: 10.03.2015 Автор(ы):Терехов Владимир Иванович (RU), Арушанян Артавазд Ягорович (RU), Сердюченко Ирина Владимировна (RU), Глущенко Сергей Геннадьевич (RU) Патентообладатель(и): Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет» (RU) Номер заявки: 2012154888/10 Дата подачи заявки: 18.12.2012 Дата публикации: 27.03.2014 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Способ получения бактериального концентрата консорциума пробиотических микроорганизмов Действует Действует Питательная среда для выделения лактобактерий Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Питательная среда для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2326939 C12N1/20; A61K35/74 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Автор(ы): Зыкова Наталья Альгимантасовна (RU), Молокеев Алексей Владимирович (RU), Ильина Рома Мирославовна (RU), Никулин Леонид Георгиевич (RU), Куслий Александр Георгиевич (RU), Мироненко Вячеслав Владимирович (RU), Ясудис Галина Владимировна (RU), Гусева Ирина Александровна (RU) Патентообладатель(и): Закрытое акционерное общество «ВекторБиАльгам» (RU) Номер заявки: 2006116711/13 Дата подачи заявки: 15.05.2006 Дата публикации: 20.06.2008 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Молочная питательная среда для получения биомассы бактерийпробиотиков Прекратил действие Пошлина: учтена за 5 год с 16.05.2010 по 15.05.2011 Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Питательная среда для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2326938 C12N1/20; A61K35/74; A23C9/123 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Автор(ы): Зыкова Наталья Альгимантасовна (RU), Молокеев Алексей Владимирович (RU), Молокеева Наталья Валентиновна (RU), Ильина Рома Мирославовна (RU), Карих Татьяна Леонидовна (RU), Соколова Татьяна Васильевна (RU), Никулин Леонид Георгиевич (RU), Куслий Александр Георгиевич (RU), Мироненко Вячеслав Владимирович (RU), Ясудис Галина Владимировна (RU), Гусева Ирина Александровна (RU) Патентообладатель(и): Закрытое акционерное общество «ВекторБиАльгам» (RU) Номер заявки: 2006100739/13 Дата подачи заявки: 10.01.2006 Дата публикации: 20.06.2008 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов Прекратил действие Пошлина: учтена за 6 год с 11.01.2011 по 10.01.2012 Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Питательная среда для лактобактерий Питательная среда для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2213779 C12Q1/04; C12N1/20 Российская Федерация, патент №2216587 C12N1/20; С12R1/225 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Заявитель (и): Научно-производственное объединение «Питательные среды» Автор(ы): Балаклеец В.С., Алиева Х.М. Патентообладатель(и): Научно-производственное объединение «Питательные среды» Номер заявки: 2001123804/13 Дата подачи заявки: 27.08.2001 Дата публикации: 10.10.2003 Заявитель (и): Нижегородское государственное предприятие по производству бактерийных препаратов Фирма «ИмБио» Автор(ы): Конькова Н.К., Горлова И.С., Голубева Н.А. Патентообладатель(и): Нижегородское государственное предприятие по производству бактерийных препаратов Фирма «ИмБио» Номер заявки: 2001120857/13 Дата подачи заявки: 27.08.2001 Дата публикации: 10.10.2003 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Питательная среда для выделения лактобактерий Действует Питательная среда для выращивания лактобактерий Действует Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Питательная среда для лактобактерий Питательная среда для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Российская Федерация, патент №2287572 C12N1/20 Российская Федерация, патент №2202609 C12N1/20, С12R1/225 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Автор(ы): Марьин Виктор Анатольевич (RU), Райдна Евгений Иво-Свенович (RU) Патентообладатель(и): Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (ГНУ ВНИМИ) (RU) Номер заявки: 2004136432/13 Дата подачи заявки: 15.12.2004 Дата публикации: 20.11.2006 Заявитель (и): Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии Автор(ы): Терновская Л.Н., Алещукина А.В., Голошва Е.В., Черкашина Н.Е., Калинина Т.Э., Гапон М.Н. Патентообладатель(и): Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии Номер заявки: 2000125959/13 Дата подачи заявки: 12.10.2000 Дата публикации: 20.04.2003 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Питательная среда для культивирования бифидо- или лактобактерий Прекратил действие Пошлина: учтена за 4 год с 16.12.2007 по 15.12.2008 Питательная среда для выделения лактобактерий Прекратил действие Пошлина: учтена за 6 год с 13.10.2005 по 12.10.2006 Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Питательные среды для молочнокислых бактерий Российская Федерация, патент №2280465 А61K35/74; A23C9/12; C12N1/20; С12R1/225; C12R1/25 Питательные среды для молочнокислых бактерий Российская Федерация патент №2137837 МПК6 С12Q1/06, C12N1/20, С12Q1/04, C12R1:225 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Автор(ы): Соловьева Ирина Владленовна (RU), Соколова Кира Яковлевна (RU), Ефимов Евгений Игоревич (RU), Иванова Татьяна Петровна (RU), Точилина Анна Георгиевна (RU), Белова Ирина Викторовна (RU) Патентообладатель(и): Федеральное государственное учреждение науки «Нижегородский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н.Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU) Номер заявки: 2004131097/13 Дата подачи заявки: 25.10.2004 Дата публикации: 27.07.2006 Заявитель (и): Уральский научноисследовательский институт охраны материнства и младенчества Автор(ы): Ребров А.Я. Патентообладатель(и): Уральский научноисследовательский институт охраны материнства и младенчества Номер заявки: 97119842/13 Дата подачи заявки: 02.12.1997 Дата публикации: 20.09.1999 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Способ приготовления пробиотика Действует Способ определения количества жизнеспособных молочнокислых микробов в испражнениях людей Не действует Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Питательные среды для молочнокислых бактерий Российская Федерация патент №2061037 МПК С12N1/20 Питательные среды для молочнокислых бактерий Российская Федерация патент №2087532 МПК С12N1/20 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Заявитель (и): Акционерное общество "Русский йогурт" Автор(ы): Шендеров Б.А.; Корнеева С.А.; Левченко Т.А.; Головина Н.М. Патентообладатель(и): Акционерное общество "Русский йогурт" Номер заявки: 94010907/13 Дата подачи заявки: 29.03.1994 Дата публикации: 27.05.1996 Заявитель (и): Акционерное общество "Русский йогурт" Автор(ы): Лищенко Н.Н. Патентообладатель(и): Акционерное общество «Русский йогурт» Номер заявки: 94023024/13 Дата подачи заявки: 15.06.1994 Дата публикации: 20.08.1997 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий Не действует Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий Не действует Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Питательные среды для молочнокислых бактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Российская Федерация патент №2169763 МПК7 C12N1/20, A61K35/74, A23C9/12 Заявитель (и): Дочернее государственное унитарное экспериментально-производственное предприятие "Вектор-Биальгам" ГНЦ ВБ "Вектор" Автор(ы): Ильина Р.М., Молокеев А.В., Байбаков В.И., Никулин Л.Г., Карих Т.Л. Патентообладатель(и): Дочернее государственное унитарное экспериментально-производственное предприятие «Вектор-Биальгам» ГНЦ ВБ «Вектор» Номер заявки: 2000116318/13 Дата подачи заявки: 26.06.2000 Дата публикации: 27.06.2002 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного документа Название изобретеили причина его аннуния лирования (только для (модели, образца) анализа патентной чистоты) Молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий Действует Предмет поиска (объект исследования, его составные части) Получение питательной среды для молочнокислых бактерий Питательная среда для лактобактерий Страна выдачи, вид и номер охранного документа. Классификационный индекс Патент US 4110477 A A23L1/20; A23L1/2008 Патент SU 1102810 C12N1/20; С12R1/25 Заявитель (патентообладатель), страна. Номер заявки, дата приоритета, дата публикации Изобретатель(и): Kintaro Naruse, Wataru Naruse Заявитель(и): Kabushiki Kaisha Naruse Fermentation Laboratory Номер заявки: US 05/796,706 Дата подачи заявки: 13.05.1977 Дата публикации:29.08.1978 Заявитель(и): Пермский орден Трудового Красного знамени научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Автор(ы): Ефимова Н.П., Красик Л.Л., Несчисляев В.А. Номер заявки: 3486282 Дата подачи заявки: 05.07.1982 Дата публикации: 15.07.1984 Продолжение таблицы В 6.1 Сведения о действии охранного докуменНазвание изобретения та или причина его (модели, образца) аннулирования (только для анализа патентной чистоты) Method for producing natto containing lactic acid bacteria Прекратил действие Питательная среда для производства культивирования лактобактерий штамма Lactobakterium Plantarum 8 – РА –3 Прекратил действие ПРИЛОЖЕНИЕ Г (обязательное) РЕФЕРАТЫ Патент №2415922 РФ МПК С12N1/20, С12R1/225. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания лактобактерий, и может быть использовано в промышленном производстве лекарственных препаратов. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса с содержанием аминного азота 0,7–0,9 %, ферментативный гидролизат каллизии душистой, глюкозу, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданных количествах. Изобретение позволяет повысить выход лактобактерий. Патент №2324732 РФ МПК С12N1/20. Молочную сыворотку, содержащую 10 % сухих веществ, пастеризуют при 90 °С в течение 20 мин, охлаждают до 45 °С, раскисляют раствором аммиака до рН 7,0. Затем вносят закваску Streptococcus thermophilus и сквашивают смесь при 40 °С в течение 5 ч, вносят добавку в виде гидролизата молочного белка, смесь перемешивают и стерилизуют, охлаждают до 38 °С и раскисляют раствором аммиака до рН 6,8. Полученная питательная среда позволяет сократить продолжительность процесса культивирования бифидо- и лактобактерий до 20–24 ч и повысить их концентрацию при получении жидкого бактериального концентрата. Патент №2158302 РФ МПК7 С12N1/20, A23C9/12, A23C9/127, A61K35/74. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии и медицине, и может быть использовано при производстве лечебнопрофилактических и лекарственных препаратов. Среда содержит белковый гидролизат крови или белковый гидролизат заменителя крови, в качестве АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 41 добавки аскорбиновую кислоту и агар-агар при следующем соотношении, г/л: аскорбиновая кислота 0,01–0,10, агар-агар 0,70–0,80, белковый гидролизат крови или белковый гидролизат заменителя крови - остальное. Среда расширяет арсенал питательных сред для роста бифидо- и лактобактерий, повышает эффективность выращивания при простой технологии его получения. Патент №2027754 РФ МПК6 С12N1/20. Использование: в микробиологической, медицинской, ветеринарной промышленности, в частности при производстве лечебных бакпрепаратов, а также ветеринарных пробиотиков. Сущность изобретения: питательная среда для выращивания бифидумбактерий, лактобактерий и стрептококков содержит источник углерода - лактозу, экстракт пекарских дрожжей, в качестве источника азота - панкреатический гидролизат казеина, цистин, водопроводную воду и дополнительно сернокислые соли марганца и магния и аскорбиновую кислоту при следующем соотношени компонентов, г/л: панкреатический гидролизат казеина 0,14–0,16, экстракт пекарских дрожжей 4,5–5,5, лактоза 19,0–21,0, цистин 0,15–0,25, MgSO 4 ·7H 2 O 0,15–0,25, MnSO 4 ·4H 2 O 0,04–0,06, аскорбиновая кислота 0,4–0,6, водопроводная вода до 1. Для получения панкреатического гидролизата казеина готовят раствор казеина, нагревают при 79–81 °С и величине рН 8,0–8,2 в течение 2 ч, охлаждают его и проводят гидролиз панкреатином при 49–51 °С в течение 2 ч при рН 8,0–8,2, подкисляют его до рН 4,0–4,5, прогревают до 100 °С в течение 5–10 мин, охлаждают до 75–85 °С и подвергают ультрафильтрации на мембране с размерами пор 50 мкм. Патент №2544052 РФ МПК С12N1/20, A61K35/74, A23C9/12. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве закваски прямого внесения для приготовления пробиотической сметаны. Способ включает приготовление питательной среды, в которую дополнительно вносят селенит натрия в количестве 30-50 мкг/мл, стерилизацию и охлаждение до 35 °С. Внесение в полученную питательную среду инокулята, в качестве инокулята используют комбинированную закваску на основе Bifidobacterium bifidum 83 , Lactococcus lactis subspecies cremoris 244 , Propionibacterium freudenreichii subspecies shermanii AC-2503, взятых в соотно- АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 42 шении 40:30:30, наращивание биомассы и отделение биомассы от культуральной жидкости. Смешивание с защитной средой, розлив, укупорку и замораживание. Изобретение позволяет повысить органолептические свойства экзополисахаридного потенциала и срок хранения бактериального концентрата. Патент №2510416 РФ МПК C12N1/20, C12R1/225. Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника. Питательная среда содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат, глюкозу, уксусную кислоту 70 %, агар и капустный отвар в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить селективность питательной среды и упростить ее производство. Патент №2326938 РФ МПК C12N1/20, A61K35/74, A23C9/123. Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии. Консорциум штаммов лактобактерий содержит Lactobacillus acidophilus 57S (ВКПМ В-5863), Lactobacillus plantarum П-75 (ВКПМ В-3962), Lactobacillus casei Сб (ВКПМ В5724), взятые в соотношении 2:0,5:0,5. Способ включает подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение посевной дозы консорциума штаммов лактобактерий в количестве не более 5,0 мас.%. Сквашивают продукт в течение времени, достаточного для формирования сгустка, и охлаждают готовый продукт при температуре не выше +6 °С. В качестве молочной питательной среды используют обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку до 13,5–15 %, лактопептон и натрий лимоннокислый при следующем соотношении компонентов, (мас.%): лактопептон 3,5–4,5, натрий лимоннокислый - 0,15–0,25 и обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку до 13,5–15 % - остальное. Изобретение обеспечивает повышение сроков хранения и начального титра консорциума лактобактерий в приготовляемом препарате. Патент №2326939 РФ МПК С12N1/20, A61K35/74. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 43 промышленности и касается приготовления питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий с целью получения биомассы микроорганизмов и дальнейшего ее использования в производстве заквасок для лечебно- профилактических продуктов, а также для производства биологически активных добавок (БАД). Молочная питательная среда содержит основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13–14 %, цистеин солянокислый или аскорбиновую кислоту, лактопептон, очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1–2,8 %, общего белка не менее 3–4 %, натрий хлористый, марганец сернокислый семиводный и магний сернокислый четырехводный. Питательная среда обеспечивает возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения. Патент №2213779 РФ МПК7 С12Q1/04, C12N1/20. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника. Среда содержит в качестве источника азотистого питания микробов панкреатический гидролизат казеина сухой, в качестве источника витаминов группы В экстракт кормовых дрожжей сухой, в качестве растворителя белковых компонентов натрий лимоннокислый трехзамещенный, в качестве ингибитора сопутствующих грамотрицательных энтеробактерий и кокковой микрофлоры натрий уксуснокислый плавленный, Д(+) глюкозу, железо и магний сернокислые 7-водные, кристаллвиолет и полимиксин М сульфат, цитрат аммония, поваренную соль, цистеин, воду дистиллированную. Среда сохраняет основные биологические свойства лактобактерий, то есть на ней отсутствует, в отличие от контрольной среды Рогозы, полиморфизм выросших колоний. Предлагаемая среда не требует стерилизации и дополнительных условий культивирования, проста в приготовлении. Патент №2216587 РФ МПК7 С12N1/20, C12R1:225. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, медицин- АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 44 ской и ветеринарной промышленности, в частности при производстве лечебных бакпрепаратов. Питательная среда для выращивания лактобактерий содержит следующие компоненты, г/л: глюкоза 15,0–25,0; панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг % 10,0–20,0, сульфат марганца 0,02–0,03, сульфат магния 0,05–0,15, автолизат пекарских дрожжей 15,0–97,5, фосфат калия двузамещенный 0,5–1,5, ацетат натрия 2,0–3,0, цитрат аммония 0,5–1,5, вода дистиллированная до 1 л. Изобретение обеспечивает повышение стандартности и технологичности среды и снижение ее стоимости. Патент №22875772 РФ МПК С12N1/20. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству питательных сред, и может быть использовано при производстве бактериальных препаратов. Питательная среда содержит дрожжевой автолизат, гидролизат казеина, молочную сыворотку, содержащую 15 % сухих веществ, с гидролизованной на 50–70 % лактозой, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, обезжиренное молоко. Изобретение позволяет улучшить ростовые свойства питательной среды и повысить выход биомассы. Патент №2202609 РФ МПК7 С12N1/20, C12N1/20, C12R1:225. Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при исследовании микрофлоры организма человека на дисбактериоз. Среда содержит, г/л: сернокислый марганец 0,049-0,05; сернокислый магний 0,19–0,2; L-цистин солянокислый 0,095–0,1; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 1,95–0,2; пептон 4,9–5,0; глюкоза 19,8–20,0; агар-агар 15,0±0,1; стерильный мел 9,9–10,0; гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов – остальное. Питательная среда не имеет дорогостоящих компонентов, проста в приготовлении, обеспечивает рост и развитие разных штаммов лактобактерий и позволяет судить о кислотообразующей активности, об образовании каталазоподобных ферментов. Патент №2280465 РФ МПК A61K35/74, A23C9/12, C12N1/20, C12R1/225, C12R1/25. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления биологически активных добавок и продуктов АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 46 функционального питания на основе живых бактерий. Способ предусматривает внесение штаммов лактобактерий L. fermentum 39 и L. plantarum 8 PA 3 в питательную среду, совместное их культивирование на питательной среде, содержащей разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока, раффинозу, дрожжевой автолизат, агар-агар. Культивирование ведут в два этапа. На первом этапе разведенные в питательной среде штаммы соединяют в соотношении 1:1, культивируют 24 ч при 37 °С. На втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000. Продолжают культивирование в течение 24 ч при той же температуре. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность бактерий, их антагонистическую активность и выход биомассы. Патент №2137837 МПК6 С12Q1/06, C12N1/20, С12Q1/04, C12R1:225. Изобретение предназначено для диагностики дисбактериоза кишечника людей, т.к. содержание живых клеток молочнокислых микробов (МКМ) в испражнениях людей является важным показателем состояния микробиоценоза кишечника. Численность жизнеспособных клеток определяют на твердой питательной среде на основе неохмеленного пивного сусла определенной концентрации. Среду обогащают лактозой, смесью микроэлементов, дрожжевым экстрактом, ацетатом натрия. Среда также содержит тонкоизмельченный природный мел, являющийся источником углекислого газа для создания анаэробиоза. Кроме того, мел выполняет функции индикатора для выделения колоний МКМ по зоне просветления вокруг них среди колоний других анаэробов в твердой среде. Изобретение позволяет определять содержание МКМ в испражнениях с точностью до сотен и десятков тысяч клеток (0,1–0,001 ед) в течение 2–3 суток без применения специальной анаэробной аппаратуры. Он доступен в любой лаборатории и достаточно точен и надежен для определения численности лактобактерий в испражнениях при диагностике дисбиоза кишечника людей. Патент №2061037 РФ МПК С12N1/20. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактерийных биологических препаратов и продуктов питания. Патент №2087532РФ МПК С12N1/20. Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в производстве эубиотических препаратов и бифидосодержащих продуктов питания. Эубиотики предназначены для восстановления нормальной микрофлоры хозяина, поврежденной под влиянием различных неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды. В комплексе мер для коррекции микрофлоры ведущая роль принадлежит введению в организм эубиотиков, в частности биологических бактерийных препаратов на основе бифидобактерий, и бифидосодержащих продуктов питания. Возрастающая потребность в подобных препаратах и продуктах питания обусловливает необходимость разработки новых эффективных и недорогих производственных питательных сред для накопления биомассы бифидобактерий. Патент №2169763 РФ МПК7 C12N1/20, A61K35/74, A23C9/12. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред, используемых для культивирования бифидобактерий. Питательная среда содержит основу, цистеин солянокислый (L-цистин), D(-)-лактозу, гидролизат молочных белков, аутолизат дрожжей, натрий хлористый. В качестве гидролизата молочных белков используют панкреатический гидролизат обрата молока, в качестве аутолизата дрожжей используют ферментативный аутолизат дрожжей, а в качестве основы используют нормализованный по сухому остатку обрат молока при суммарном содержании аминного азота в питательной среде 260–300 мг % и количественном соотношении ее компонентов, мас.%: панкреатический гидролизат обрата молока 5,0–7,0; цистеин солянокислый (L-цистин) 0,001-0,003; D(-)-лактоза 0,03–0,09; натрий хлористый 0,01–0,05; ферментативный аутолизат дрожжей 1,0–2,0; нормализованный по сухому остатку обрат молока (основа) – остальное до 100 %. В качестве ферментативного аутолизата АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 47 дрожжей используют аутолизат с показателем аминного азота 350–400 мг%. Обрат молока нормализован по сухому остатку до значения 13,0–14 %, а количество вносимой лактозы снижено по сравнению с аналогом в 1,5–2 раза. Причем в питательную среду дополнительно вносят соевый изолят в количестве по массе 0,2–0,3 %, а для активизации соевого изолята в питательную среду дополнительно вводят цитрат натрия в количестве по массе 0,1–0,2 %. Патент US 4110477 A. By growing Bacillus natto and lactic acid bacteria on steamed soybeans in the presence of triturated mushroom and carbon sources for the cultivation of lactic acid bateria, there is obtained a fermentation food of soybeans grown with both live bacteria. As compared with soybeans grown with Bacillus natto alone («Natto»), the present fermentation food lacks objectionable off-flavor or an ammonia odor and keeps its quality unchanged for a longer period. Патент №1102810 СССР МПК С12N1/20, C12K1/25. Питательная среда для производственного культивирования лактобактерий штамма Lactobakterium Plantarum 8 – РА – 3, содержащая в качестве источников углерода и азота глюкозу, цистеин солянокислый, ацетат натрия и цитрат аммония, минеральные соли: марганец сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый двузамещенный, а также твин-80 и воду, отличающаяся тем, что, с целью увеличения среднего срока годности сухого препарата лактобактерий, а также удешевления среды, в качестве источника азота среда дополнительно содержит гидролизат соевого шрота с содержанием аминного. азота 120–150 мг % при следующем соотношении компонентов, г/л: 10–25 Глюкоза 1,0–2,5 Цистеин солянокислый 1,0–2,5 Цитрат аммония 2,5–6,25 Ацетат натрия 0,10–0,25 Магний сернокислый 0,025–0,075 Марганец сернокислый Калий фосфорнокислый (Л 1,0–2,5 двузамещенный 0,5–1,0 мл Твин-80 100,0–200,0 Вода Гидрат соевого шрота с содержанием аминного азота % Остальное 120–150 мг. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 48 ГЛАВА 2 ЗАЯВКА НА ПОЛУЧЕНИЕ ПАТЕНТА МПК С12N1/20 ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания лактобактерий, и может быть использовано в промышленном производстве бактериальных концентратов. Питательная среда содержит гидролизат молока, глюкозу, дрожжевой экстракт и дистиллированную воду в заданных количествах. Изобретение позволяет повысить выход лактобактерий. Известна питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая аминокислотную основу, хлорид натрия, при этом в качестве аминокислотной основы используют аммиачно-ферментативный гидролизат отходов вакцинно-сывороточного производства и инкубаторного производства в виде глобулинов, или куриных эмбрионов, или сгустков крови, или фибрина, полученный путем аммиачного гидролизата измельченных смешанных с деминерализованной водой отходов и последующего гидролиза нативной поджелудочной железой крупного рогатого скота до содержания аминного азота 500–700 мг % при следующем соотношении химических соединений, мас.%: Пептон 1–2; Хлорид натрия 1,0–1,2; Аммонийные соли 0,03–0,1; а также, мг % Общий азот 1100–1400; АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 49 Аминный азот 200–220; Триптофан 80–200. (см. пат. RU № 2103345, кл. C12N 1/00, опубл. 27.01.1998 г.). Недостатком данной питательной среды является высокая стоимость. Известна питательная среда, основой которой является гидролизованное молоко, дрожжевой автолизат, агар, рН 6, при следующем соотношении химических соединений: Гидролизованное молоко 1000 мл; Дрожжевой автолизат 3 %; Агар 3%. (Банникова Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. Москва «Пищевая промышленность», 1975 - с. - 224). Недостатком данной среды является ее низкая продуктивность. Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятая авторами за прототип является питательная среда для поверхностного и глубинного культивирования лактобактерий, содержащая питательную основу, глюкозу, агар-агар, стимулятор роста и дистиллированную воду (RU №2002113739 A1, 27.02.2004). Недостатком данной среды является недостаточная питательная ценность для лактобактерий. Задачей предлагаемого изобретения является получение качественной питательной среды на основе гидролизата молока с добавлением глюкозы и дрожжевого экстракта в качестве стимулятора роста лактобактерий. Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к увеличению количества колоний лактобактерий. Технический результат достигается с помощью питательной среды для культивирования лактобактерий, содержащей глюкозу и дистиллированную воду, а в качестве питательной основы среда содержит гидролизат молока, а в качестве стимулятора роста – дрожжевой экстракт при следующем содержании ингредиентов, мас.%: АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 50 Гидролизат молока – 50; Глюкоза – 1; Дрожжевой экстракт – 0,5; Дистиллированная вода – остальное. Сущность получения питательной среды для культивирования лактобактерий заключается в следующем. Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют молоко содержащее 0,5 %-ной жирности. Естественное содержание макроэлементов и витаминов в 250 мл: натрий – 125 мг; калий – 350; кальций – 200 мг; магний – 25 мг; фосфор – 225 мг; тиамин – 88 мкг; рибофлавин – 0,35 мг. Глюкоза - источник углерода для обеспечения роста лактобактерий. С целью стимулирующего эффекта в питательную среду добавляют дрожжевой экстракт. Приготовление питательной основы предлагаемой питательной среды для выращивания микроорганизмов заключается в следующем. Обезжиренное молоко кипятим и охлаждаем до температуры 45±2 °С. Доводим активную кислотность до рН 7,7±0,1, добавляя водный раствор с массовой долей NaOH 40 %. К 1000 мл молока добавляем от 0,5 до 1,0 г порошка панкреатина. Затем к молоку добавляем от 5 до 6 мл хлороформа. Колбу закрываем корковой пробкой и выдерживаем при температуре 40±2 °С в течение 72 ч. В течение первых 3–5 ч молоко 2–3 раза перемешивают (пробку после перемешивания приоткрывают для удаления хлороформа). Затем гидролизованное молоко фильтруем через бумажный фильтр, разводим дистиллированной водой в соотношении 1:1, устанавливаем активную кислотность рН 7,1±0,1, добавляя водный раствор с массовой долей NaOH 40 %. В случае хранения гидролизованное молоко стерилизуем в автоклаве при температуре 121±1 °С в течение 20–30 мин. Эффективность исследуемых сред оценивали в соответствии с методическими рекомендациями «К контролю питательных сред по биологическим показа- телям. Москва, 1980, с использованием в качестве тест-штаммов лактобактерий L.plantarum 8P-A3, L.acidophilus EP 317-402. Испытуемые культуры выращивают в колбах при рН 6,0±0,1 при температуре 37 °С в течение 3 суток. Из двухсуточных культур готовят 1 млрд взвесь м.т. тест-штаммов, равную 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до содержания в 1 мл 1000 м.к. Из данного разведения взвеси культур высевают по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного агара. Посевы инкубируют при 37°С в течение 5 суток при ежедневном просмотре. Через 24-120 ч учитывают результаты подсчетов выросших колоний. Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества: − высокий выход лактобактерий; − среда экономически выгодна. Авторы: Е.Е. Харитонкина О.В. Кригер АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 52 РЕФЕРАТ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания лактобактерий, и может быть использовано в промышленном производстве бактериальных концентратов. Питательная среда содержит гидролизат молока, глюкозу, дрожжевой экстракт и дистиллированную воду в заданных количествах. Изобретение позволяет повысить выход лактобактерий. Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к увеличению количества колоний лактобактерий. Технический результат достигается с помощью питательной среды для культивирования лактобактерий, содержащей глюкозу и дистиллированную воду, а в качестве питательной основы среда содержит гидролизат молока, а в качестве стимулятора роста – дрожжевой экстракт при следующем содержании ингредиентов, мас.%: Гидролизат молока – 50; Глюкоза – 1; Дрожжевой экстракт – 0,5; Дистиллированная вода – остальное. Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества: − высокий выход лактобактерий; − среда экономически выгодна. АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 53 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Питательная среда для культивирования лактобактерий, содержащая гидролизат молока, глюкозу, дрожжевой экстракт, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит глюкозу и дрожжевой экстракт, а в качестве гидролизата молока, использовалось гидролизованное молоко, инкубация которого продолжалась в течении 72 ч, при следующем содержании ингредиентов, масс.%: Гидролизат молока – 50; Глюкоза – 1; Дрожжевой экстракт – 0,5; Дистиллированная вода – остальное. Авторы: Е.Е. Харитонкина О.В. Кригер АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 54 АТО 00.00.000 СЧ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 51
