SUPPLEMENT III

SUPPLEMENT III
Determination of dynamics of virus reproduction in a cell of asynchronous
suspension culture
Одним из важных вопросов в вирусологии и цитологии является изучение
активности размножения вирусов в клетке в разные периоды ее клеточного цикла. Для
этой цели используют синхронизированные клеточные культуры. Так как предполагается,
что синхронизированная клеточная культура представляет собой одну укрупненную
клетку. Такое предположение оправдано, когда клетки популяции делятся одновременно,
но в реальных “синхронизированных” культурах клетки обычно успевают разделиться в
течение трети периода клеточного цикла. Соответственно и расхождение клеток
“синхронизированной” популяции по возрасту достигает обычно трети периода
клеточного цикла. Иначе говоря, параметры реальной “синхронизированной”
суспензионной культуры не являются параметрами одной клетки.
В качестве примера такой “синхронной” культуры рассмотрим работу чилийских
исследователей (Suarez M., Contreras G., Fridlender B., 1975), изучавших интенсивность
синтеза вируса Коксаки B1 в разные периоды клеточного цикла в синхронизированной
культуре клеток HeLa S3 (рис. 1). Определение интенсивности репродукции вируса
Коксаки B1 на уровне одиночной клетки HeLa S3 в зависимости от ее возраста в момент
инфицирования вирусом, производилось в два этапа:
Первый – по динамике численности клеток HeLa S3 суспензионной культуры
определялось распределение клеток популяции HeLa S3 по возрасту или ее возрастной
состав;
Второй – определение интенсивности репродукции вируса Коксаки B1 на уровне
одиночной клетки HeLa S3, в зависимости от ее возраста в момент инфицирования
вирусом (рис. 2).
Обратим внимание на некоторые сходства и различия между интенсивностями
репродукции вируса в клетке синхронной клеточной популяции клеток HeLa S3 и
вычисленной интенсивностью репродукции вируса в клетке HeLa S3. Прежде приведем
значения величины интенсивности репродукции вируса в клетке синхронной популяции,
полученные делением концентрации бляшкообразующих единиц (БОЕ)* на
концентрацию клеток популяции в соответствующий момент времени tj: t0 – 80,645;t1 =
120,968; t2 = 161,290; t3 = 241,935; t4 = 111,732; t5 = 69,556; t6 = 84,928; t7 = 60,484; t8 =
50,403 БОЕ/мл. На рис. 2 данные значения интенсивности репродукции вируса в клетке
синхронной популяции приведены в соответствии с фазами G1, S и G2.
(*При попадании вирусов на плотный однослойный газон клеток, выращиваемых в чашках Петри, на газоне
образуются стерильные пятна, бляшки или БОЕ. Бляшка – участок, где клетки были разрушены колонией
вирусов, развившейся из одного родительского вируса при попадании его на газон клеток. Таким образом,
нанеся на поверхность газона суспензию клеток с вирусом можно по числу бляшек, образовавшихся на
газоне, определить сколько клеток в суспензии были заражены вирусом. Разрушение клетки вирусами
называется лизисом.)
При сравнивании кривой интенсивности репродукции вируса Коксаки B1 в клетке
HeLa S3 с кривой интенсивности репродукции вируса в клетке синхронной популяции
нетрудно заметить три основных различия:
a) амплитуды колебаний вычисленной интенсивности репродукции вируса в клетке (-196
÷706 БОЕ), как и значения их максимумов значительно превышают соответствующие
показатели клетки синхронной популяции(50÷242 БОЕ);
b) имеет место смещения во времени (на 2 ч) максимумов продукции вируса (706 БОЕ –
τi=6 и 242 БОЕ – τi = 7), (рис. 2);
1
c) первая кривая имеет и отрицательные значения (рис. 2), а во второй (рис. 1) их в
принципе не может быть, ибо бляшки (БОЕ) могут присутствовать или отсутствовать
(число БОЕ ≥0), иного не дано.
Преимущество предлагаемого способа вычисления характеристик репродукции
вируса (БОЕ) в клетке заключается не только в возможности формирования больших
амплитуд колебаний с большими значениями максимумов, но и в наличии отрицательных
значений вычисленной репродукции вируса в клетке, что в принципе невозможно
определить иными способами. Отрицательные значения вычисленной репродукции вируса
количественно оценивают временную резистентность клетки к вирусу.
(Резистентность - сопротивление, противодействие).
Физиологически обусловленная резистентность клетки к вирусу приводит к
невозможности инициации вирусной инфекции или к развитию абортативного процесса.
Имеются убедительные данные о существовании временной физиологической
резистентности клетки, которая по мнению некоторых авторов связана с клеточным
циклом. Например, показано, что чувствительность размножающихся клеток почки
зеленной мартышки к ОВ40 резко падает по сравнению с чувствительностью неделящихся
клеток. При этом возникает абортативная инфекция, характеризующаяся отсутствием
структурных вирусных белков. Помимо неодинаковой динамики развития инфекции в
отдельных клетках популяции, наблюдается качественная разница инфекционного
процесса. Так, в одних клетках происходит продуктивный литический процесс, в других –
абортативный нелитический процесс, в третьих – инфекционный процесс не развивается.
(Литический процесс – вирусная частица прикрепляется к поверхности клетки и затем проникает в
клетку, где она и размножается, образуя множество вирусных частиц-потомков. После разрушения или
лизиса клетки эти частицы выходят в окружающую среду и они готовы к новому заражению.)
Так или иначе, предлагаемый способ позволяет определить как во времени, так и
количественно проявление “иммунитета” клетки к вирусу, в течение ее жизненного
цикла (рис. 2). Нельзя не заметить, что в конце фазы G1 и в первой трети S-фазы не только
не происходит размножение вируса в клетке или он в нее не проникает, а происходит
исчезновение вирусов, введенных в виде вирусной суспензии. То есть, клетка возраста τi =
5 каким-то образом уничтожает почти до 200 вирусов. При этом уже в τi = 6 возрасте
становится чрезвычайно уязвимой и в ней во второй трети S-фазы образуются до 700
вирусов. Попытаемся это объяснить следующим образом. Не исключено, что на
хромосомах клетки HeLa τ4 и τ5-го возрастов появляется множество “открытых” участков
или “репликативных пузырей, т.е. стартовых участков, на которых в течение 2-3-х часов
инициируется репликация ДНК. Например, в ходе эмбриогенеза дрозофилы синтез ДНК
иногда начинается приблизительно в 30.000 – 50.000 различных “открытых”. Именно
через “открытые” участки наиболее легко вирусной ДНК включиться в ДНК клетки и
стать ее частью. По нашему мнению, как раз в период “открытых” участков клеточной
ДНК клетка предпринимает максимум усилий защиты своей ДНК от вирусной ДНК,
вплоть до ее уничтожения на подступах к клетке. И после того как начинается активная
репликация клеточной ДНК и вирусной ДНК трудно включиться в нее, у клетки
значительно ослабевает ее резистентность к вирусу. Резистентность клетки по отношению
к вирусу, по-видимому, не может сохраняться в течение всего ее жизненного цикла на
высоком уровне, так как возможности клетки не безграничны. И поэтому основные
ресурсы защиты клетки, прежде всего, направлены на сохранение чистоты генетической
информации, т.е. на сохранение чистоты вида – основной единицы эволюционного
процесса.
Что же произойдет, если вирус, попавший в клетку, не начнет размножаться в ней и
не разрушит ее, а включится в ее ДНК? Это означает, что в ДНК всех последующих
поколений клеток будет присутствовать и вирусная ДНК, которая может отсоединиться от
клеточной ДНК и начать размножаться внутри клетки. В результате чего клетка
разрушится, а вирусы выйдут наружу. То есть, все потомки клетки в ДНК которой
2
включена вирусная ДНК, это потенциально погибшие клетки и опасные для других клеток
этого же вида.
Поэтому, в первую очередь клетка не допускает включиться вирусное ДНК в ДНК
клетки, и только во вторую очередь она, в силу оставшихся возможностей, пытается
сохранить себе жизнь. То есть, интересы популяции или вида превалируют над
интересами отдельной клетки. Что аналогично современным представлениям: интересы
государства и общества превыше интересов отдельного гражданина.
Независимо от того, правильны ли наши представления о биологических причинах
возникновения отрицательных значений вычисленной интенсивности репродукции вируса
в клетке, тем не менее, ясно одно, что эти значения невозможно выявить каким-либо иным
способом на полусинхронных и асинхронных популяциях. Ибо, если в популяции Xj
присутствуют несколько возрастных групп клеток и в клетках возраста τ α – xα,j
синтезируется 10 г/мл определенного вещества, в клетках возраста τβ - xβ,j происходит
расщепление или утилизация 4 г/мл данного вещества, а в целом на популяцию Xj
приходится 6 г/мл этого вещества, то только по интегральной концентрации вещества (6
г/мл) невозможно количественно оценить “вклад” каждой из этих двух возрастных групп.
Иначе говоря, значение 6 г/мл может сфомироваться из множества вариантов: 11-5 = 6,
12–6 = 6, 13–7 = 6, 14–8 = 6, 15-9 = 6, 16–10 = 6 и т. д., или же 0+6 = 6, 1+5 = 6, 2+4 = 6,
3+3 = 6, 4+2 = 6, 5+1 = 6, 6+0 = 6.
Таким образом, предложенный способ определения динамики репродукции вируса
Коксаки B1 в клетке HeLa позволяет по-новому оценить суть процессов, происходящих на
уровне клетки. В данном случае выявлен так называемый “иммунитет” клетки
относительно вирусов и объяснена “логика” его поведения.
Этот способ пригоден для любых периодических и непрерывных суспензионных
клеточных культур.
Fig. 1. Intensity of B1 Coxsackie virus reproduction in HeLa S3 synchronic
cell population, depending on the moment of it being infected (Suarez et al., 1975)
Plurality is expressed by PFU number - (107 PFU/ml).
X – number of cells (105 cell/ml).
● number of cells
Δ—Δ number of PFU
3
Fig. 2. Intensity of B1 Coxsackie virus reproduction in HeLa S3 cell depending
on its age on the moment of it being infecting, and in the synchronic population cell
— pi – quantity of PFU, falling on a cell, that is infected in i-age (i = 1,9 ).
(Curves are constructed by pi values that are presented in Table 13.)
Δ—Δ values of virus reproduction intensity in a cell of HeLa S3 synchronic
population are presented in accordance with G1, S and G2 phases.
L. Ghazaryan
4