«Разработка методов микроклонального размножения редких и

Программа прикладных исследований – 9 «Биология»
«Разработкаметодовмикроклонального
размноженияредкихиперспективных
растенийимолекулярная
идентификацияосновныхнематодозов
жвачныхживотных»
Докладчик:
д.б.н.Кучбоев Абдурахим Эргашевич
Исполнители проекта
Сотрудники Лаб. Молекулярной биологии и биотехнологии:
1. Кучбоев А.Э. ‐ Зав. лабораторией, д.б.н.
2. Сафаров К.С. ‐ Вед. научный сотрудник, д.б.н., проф.
3. Никитина Е.B. ‐ Ст. научный сотрудник, к.б.н.
4. Сафарова Н.K. ‐ Ст. научный сотрудник, к.б.н.
5. Мирзаева Г.C. ‐ Ст. научный сотрудник, к.б.н.
6. Амиров О.О. ‐ Ст. научный сотрудник соискатель
7. Абдуллаева Д. А.‐ Мл. научный сотрудник
8. Каримова Р.Р. ‐ Мл. научный сотрудник
9. Абдужалилова Ш. А. ‐ Ст. лаборант
Будут привлечены:
10. Тургунов М. ‐ Мл. научный сотрудник лаб.
11. Старший научный сотрудник (0,5) (ЦГТ при АН РУз)
12. Старший научный сотрудник, (0,5) (ИБХ АН РУз)
•
Объем финансирования на первый год ‐ 300,0 млн. сум
• Проблема сохранения биологического разнообразия на уровне генов, популяции, видов, сообществ и экосистем является весьма актуальной в связи с усиливающимся антропогенным воздействием на биосферу, особенно в республиках Центральной Азии. Одной из первостепенных задач является выбор подходов, технологий и критериев оценки генетического разнообразия на разных уровнях организации биологических систем. • К приоритетным направлениям науки в Узбекистане и за рубежом относятся развитие технологий анализа геномов и микроклонального размножения видов растений и животных, которые часто являются редкими и находящимися под угрозой исчезновения видами.
• Первая часть данного проекта посвящена разработке технологии получения культуры клеток и тканей, наиболее хозяйственно ценных цветочно‐
декоративных, лекарственных и редких, эндемичных растений.
• В рамках данного проекта встала проблема работы с уязвимыми в силу их декоративности видами родов Iris, перспективными видами Ajuga и Lagohilus. Для сохранения представленных генотипов
рекомендуется более широкое введение их в культуру в качестве лекарственных и декоративных растений.
• Вторая часть предлагаемого нами проекта посвящена изучению молекулярно‐
генетического анализа основных и полиморфных видов нематод пищеварительной системы животных. Особенно, это относится к представителям подсемейства Ostertagiinae.
• Различные исследователи по‐разному определяют валидность различных родов и состав их видов. М –ген. анализ широко применяется при решении проблем популяционной биологии, экологии, систематики и эволюции гельминтов, а также проблем молекулярной диагностики и идентификации возбудителей нематодозов. Цель проекта: Разработка методики сохранения in vitro
редких и перспективных растений и молекулярно‐генетическая идентификации основных нематодозов животных.
2015 год
 Выяснение особенностей введения в асептическую культуру
редких видов Iris и Lagohilus
 Подбор оптимальной питательной среды и условий
культивирования для введения в культуру in vitro;
 Изучение видового состава нематод пищеварительной системы животных и их распространения. Определение полиморфных их видов;  Проведение сравнительных морфологических и морфометрических исследований нематод животных;  Оценка пригодности фиксированного материала и оптимальных методов выделения тотальной ДНК из тканей нематод.
2016 год
Изучение влияния гормонального состава среды на процессы морфогенеза in vitro; Особенности культивирования in vitro семян и зародышей исследуемых растений;
Подбор праймеров, проведение ПЦР, фракционирование и очистка фрагментов ДНК нематод с помощью агарозного гель‐электрофореза;
Секвенирование ПЦР продуктов митохондриальных и ядерных генов ДНК основных и полиморфных видов нематод;
Проведение предварительного анализа на предмет сходства или различия нуклеотидных последовательностей вариабельных участков генома изучаемых объектов.
2017 год
Получение посадочного безвирусного материала, адаптация
пробирочных растений к почвенным условиям;
Усовершенствование отдельных приемов технологии микроклонального размножения некоторых «проблемных» видов растений;
Проведение биоинформатического анализа морфологически очень сходных в таксономическом отношении групп нематод животных;
Дизайн праймеров, виртуальная PCR, создание новых молекулярных маркеров основных нематодозов и их дальнейшее усовершенствование;
Разработка методов экспресс-диагностики основных нематодозов животных (на основе ПЦР технологии);
Размещение в международном Генбанке (NCBI) данных, полученных нуклеотидных последовательностей исследуемых объектов.
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ: для микроклонального размножения: ценные лекарственные и декоративные виды природной флоры Узбекистана
Iris (Juno) korolkovii, J. vicaria
декоративные растения флоры Узбекистана Lagohilus proskorjakovii, L.
inebrians, лекарственные
растения, редкие эндемики
Памиро‐Алая (флоры Узбекистана)
Для молекулярно‐генетических исследований:
нематоды пищеварительной системы жвачных животных (разных фаз развития)
яйца
личинки
половозрелые особи
Методы исследований
•
•
•
•
•
Процедура молекулярно‐генетического
исследования по этапам:
(1) Выделение ДНК из биологического материала; (2) Выбор эффективных стабильных молекулярных маркеров; Внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2) ядерных генов рДНК и митохондриальный ген COI. (3) ПЦР‐реакции; (4) Определение первичной последовательности (секвенирование) ДНК; (5) Биоинформатический анализ. 1.Выделение ДНК
2. Амплификация ДНК генов посредством ПЦР
4. Биоинформатический
анализ
3. Анализ первичный последовательности ДНК генов
В конце 1970‐х годов был изобретён относительно
быстрый и дешёвый метод экспериментального определения последовательности оснований в ДНК
...TGCCACAAATCAC...
выделение
Организм
секвенирование
ДНК «в пробирке»
Последовательность
Программы для первичной обработки последовательностей «Sequencher 4.9», «Bioedit» и др.
Работа генетическими базами данных NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Филогенетический анализ будет проведен при помощи программного
обеспечения Mega 5, ClustalX 2.0 и др.
Дизайн праймеров для PCR
Общая схема ДНК-баркодинга (с изменениями по
http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dna-barcoding).
Таким образом, на основе последовательностей
ДНКбудут анализированы криптические в таксономическом отношении виды нематод, а также будет разработаны аллель специфичные маркеры для экспресс ПЦР диагностики этих нематод, которые могут использоваться для видовой идентификации возбудителей нематодозов на разных стадиях жизненного цикла. Данные значительно повышает эффективность санитарно‐эпидемиологических мероприятий, направленных на выявление природных очагов нематодозов и разработку методов борьбы с ними. Микроклональное размножение –
размножение растений in vitro, «в
пробирке».
Его преимущества перед традиционными способами размножения растений:
 получение генетически однородного посадочного материала;
 освобождение растений от вирусов; высокий коэффициент размножения (от 104 для хвойных до 106 ‐ для травянистых растений);  сокращение продолжительности селекционного процесса;  размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;  возможность проведения работ в течение всего года;  возможность автоматизации процесса выращивания. Этапы размножения:
1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и
получение хорошо растущей стерильной культуры.
2. Собственно микроразмножение, когда достигается
получение максимального количества
меристематических клонов.
3. Укоренение размноженных побегов с последующей
адаптацией их к почвенным условиям.
4. Выращивание растений в условиях теплицы и
подготовка их к реализации или посадке в поле.
Необходимые оборудования для микроклонирования
СТЕРИЛИЗАТОР SterileMax
АВТОКЛАВ Tuttnauer 3870
ЛАМИНАРНЫЙ БОКС (ЛАМИНАР) Помещение (фитотрон), где ведутся работы с культурами тканей растительности
МАТЕРИАЛ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ:
Питательная среда
Витамины
Жидкие и твердые среды Освещение и фотопериод
Температура
Риски и пути их преодоления
• Главным риском является слабая изученность рост и развития in vitro
дикорастующих видов;
• Эта проблема будет решатся с помощью привлечения в наши исследования физиолого‐
биохимических методов оценки биологического потенциала изученных видов, что позволит более тщательно подобрать условия, оптимальные для их роста in vitro.
Таким образом, микроклональное размножение растений на сегодня представляет большой теоретический и практический интерес. Методики по этой теме находятся в постоянном совершенствовании, что позволяет с полной уверенностью говорить о том что данное направление является одной из передовых разделов современной биотехнологии.
Ожидаемые результаты
1.Уточнение полиморфных таксонов подсемейства Ostertagiinae;
2.Разработка методов экспресс диагностики основных нематодозов животных (на основе ПЦР технологии);
3.Разработка рекомендаций по технологиям получения культуры тканей in vitro и микроклонального размножения редких, декоративных и лекарственных растений.
4.Получение большого количества безвирусных растений, ничем не отличимых от родительских форм.
Питательная среда ‐ основной фактор, обуславливающий успех клонального микроразмножения. Основой всех питательных сред являются минеральные соли, необходимые растению: макроэлементы ‐ N, P, K, Ca, Mg; микроэлементы ‐ B, Mn, Zn, Cu, Co, Mo, I, Fe. Кроме того, в состав питательных сред входят аминокислоты, витамины, регуляторы роста. Поскольку питание культивируемых тканей гетеротрофно, необходимо присутствие углеводородов: сахарозы, глюкозы или фруктозы.
Витамины
В состав многих сред включают витамины, которые продлевают срок жизни эксплантата, нормализуют некоторые ростовые процессы, протекающие при регенерации, но не являются фактором, определяющим развитие эксплантатов.
Жидкие и твёрдые среды
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений‐регенерантов.
Освещение и фотопериод
Очень важной особенностью при микроразмножение является поддержание необходимого уровня освещения для пролиферации эксплантов.
Температура
Особым фактором, оказывающим влияние на размножение растений in vitro, является температура. Она оказывает значительное влияние на рост и регенерацию растительных тканей растений, способствуя активации метаболических процессов. Для большинства тканей температурный оптимум составляет 24‐28 0С . Однако существуют различия между растениями в отношении их требованиям к условиям температуры.