персистенции стафилококков и malassezia pachydermatis

УДК 579.61; 579.62
1
Уткина Т.М. 1, Попова Л.П. 1, Акжигитов А.С.2
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения
Росскийской академии наук, Оренбург
2
Оренбургский государственный аграрный университет
Email: labpersist@mail.ru
МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ СТАФИЛОКОККОВ
И MALASSEZIA PACHYDERMATIS ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ
Изучена модификация антилизоцимной активности и способности образовывать биопленки
у стафилококков и Malassezia pachydermatis, выделенных от собак с отитами, в условиях их
межмикробных взаимодействий. Установлено преимущественное обоюдное повышение эксп>
рессии антилизоцимной активности и коэффициента биопленкообразования у изученных бакте>
рий и грибов, а также приобретение ими способности образовывать биопленки. Полученные
данные можно рассматривать как один из механизмов, способствующих образованию патобио>
ценоза, на фоне которого возникает заболевание, и его хронизации.
Ключевые слова: стафилококки, Malassezia pachydermatis, антилизоцимная активность, био>
пленки.
Введение
В последнее десятилетие отмечается рост
заболеваемости животных оппортунистически
ми инфекциями, вызываемыми грибковой мик
рофлорой [6]. Особый интерес представляют
грибы рода Malassezia, являющиеся наиболее
распространенными возбудителями отитов у
собак. Грибы рода Malassezia, присутствуя в био
ценозе, взаимодействуют с другими видами ус
ловнопатогенных микроорганизмов (Staphy
lococcus spp., Streptococcus spp., Enterobacteriaceae,
Candida spp., Aspergillus spp.). В настоящее время
накоплен фактический материал по взаимодей
ствию Malassezia spp. с бактериями рода
Staphylococcus [13]. Показано также, что рост
Malassezia in vitro усиливается в присутствии
стафилококков [15]. Однако, остается неизучен
ным вопрос о влиянии данных микроорганиз
мов на персистентные свойства в микробной
ассоциации. Одним из распространенных и ча
сто встречающихся персистентных признаков
является антилизоцимная активность микро
организмов [2]. Важнейшим механизмом дли
тельного выживания в условиях макроорганиз
ма, а также внутрипопуляционной коммуника
ции микроорганизмов, является образование
ими биопленок [9].
В связи с этим, целью данного исследова
ния явилось изучение модификации антилизо
цимной активности и способности образовы
вать биопленки у стафилококков и M. pachyder
matis, выделенных от собак с отитами, в услови
ях их межмикробных взаимодействий.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужи
ли 14 штаммов рода Staphylococcus: Staphy
lococcus intermedius (1 штамм), Staphylococcus
xylosus (4 штамма), Staphylococcus hyicus
(9 штаммов), а также 14 штаммов Malassezia
pachydermatis, выделенных от 14 собак с хро
ническими отитами.
Исследуемый материал получали методом
смывов с помощью тампона из наружного слу
хового прохода собак [7], засевали на среду Ли
мингаНотманна (посевы инкубировали при
37оС в течение 48 часов), а также на кровяной
агар (посевы инкубировали при 37оС в тече
ние 1824 часов).
Идентификацию грибов осуществляли
по морфологическим и культуральным ха
рактеристикам [14], бактерии идентифици
ровали по морфологическим и культураль
ным свойствам, а также биохимическим ха
рактеристикам с использованием тестсис
тем «STAPHYtest».
Способность микроорганизмов к образо
ванию биопленок определяли по степени свя
зывания ими кристаллического фиолетового
в стерильных 96луночных полистироловых
планшетах [16]. Коэффициент биопленкообра
зования (КБ) рассчитывали как отношение оп
тической плотности раствора кристалличес
кого фиолетового, связавшегося с клетками
микроорганизмов, к оптической плотности
раствора в контроле. Положительными счита
ли значения коэффициента более 1,1.
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
125
Естественные науки
Антилизоцимную активность (АЛА) мик
роорганизмов определяли фотометрическим
методом [2].
Модификацию биологических свойств
микроорганизмов исследовали при совместном
культивировании в жидкой питательной среде
LNA [5].
Статистическую обработку данных прово
дили биометрическими методами [8].
Результаты
В результате проведенных исследований
было показано, что у больных животных в 60%
случаев M. pachydermatis высеваются в ассоциа
ции со стафилококками разных видов.
Все изученные штаммы стафилококков об
ладали антилизоцимной активностью. АЛА
S. hyicus колебалась в пределах от 0,1±0,001
мкг/мл до 0,82±0,02 мкг/мл (среднее значение
признака составило 0,39±0,04 мкг/мл); у штам
мов S. xylosus значение признака колебалось
от 0,1±0,003 мкг/мл до 0,7±0,03 мкг/мл (сред
нее значение признака 0,45±0,2 мкг/мл);
у S. intermedius АЛА была равна 0,5±0,01 мкг/мл.
После совместного культивирования с
M. pachydermatis у 88,9% штаммов S. hyicus спо
собность к инактивации лизоцима увеличива
лась на 1868,3%; АЛА 50% штаммов S. xylosus
повышалась на 4278%. Снижение антилизоцим
ного признака отмечено у 11,1% штаммов S. hyicus
и 50% штаммов S. xylosus на 42,9% и 22%, соот
ветственно. Способность к инактивации лизоци
ма не изменялась у штамма S. intermedius.
Антилизоцимная активность штаммов
M. pachydermatis находилась в диапазоне от
0,8±0,01 мкг/мл до 2,0±0,05 мкг/мл, среднее зна
чение признака составило 1,5±0,09 мкг/мл.
Под влиянием стафилококков у 57,1%
штаммов грибов способность к инактивации
лизоцима увеличивалась на 1046%, у 35,7%
штаммов – снижалась на 1853%, а у 7,2% штам
мов антилизоцимный признак оставался на
прежнем уровне.
На следующем этапе работы было изучено
взаимное влияние M. pachydermatis и стафилокок
ков на способность образовывать биопленки.
До эксперимента лишь S. intermedius и 11,1%
штаммов S. hyicus обладали этой способностью,
КБ составлял 1,1 усл. ед. После совместного
культивирования с M. pachydermatis способность
образовывать биопленки приобретали все изу
126
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
ченные штаммы S. xylosus, а также 77,8% штам
мов S. hyicus. Отмечена потеря признака у 11,1%
штаммов S. hyicus. У штамма S. intermedius спо
собность к образованию биопленок сохранялась
на прежнем уровне.
Среди M. pachydermatis 28,6% штаммов харак
теризовались способностью формировать био
пленки, КБ составлял 1,1 усл. ед. После совмест
ного культивирования со стафилококками 35,7%
штаммов M. pachydermatis приобретало способ
ность образовывать биопленки, у 7,1% штаммов
коэффициент биопленкообразования повышал
ся и составлял 1,2 усл. ед. Потеря признака отме
чена у 14,3% штаммов M. pachydermatis.
Таким образом, проведенными исследова
ниями показано, что при межмикробных взаи
модействиях изученные микроорганизмы ока
зывают разнонаправленное действие на фак
торы персистенции (стимулирующее, снижаю
щее, индифферентное) с их преимущественным
повышением.
Обсуждение
В результате проведенной работы установ
лено, что у больных животных в 60% случаев
M. pachydermatis высеваются в ассоциации со
стафилококками разных видов. Полученные
данные подтверждаются исследованиями [12],
показавшими, что в 50% случаев при отите у
собак грибы рода Malassezia выделялись в ассо
циации с бактериями рода Staphylococcus.
В условиях микробных ассоциаций между
бактериями и грибами могут возникать нео
днозначные взаимоотношения, что оказывает
влияние на течение инфекционного процесса [6].
В подобных ситуациях многими исследовате
лями существенным признается определение у
выделенных культур факторов патогенности и
персистенции, а также оценка характера взаи
моотношений [4, 10].
Рядом авторов показано, что для оценки
межмикробных взаимодействий в качестве био
мишеней можно использовать персистентные
свойства микроорганизмов (антилизоцимную
активность и способность образовывать био
пленки) [3].
Известно, что микроорганизмы, обладаю
щие высокими значениями данных факторов
персистенции, выделяются при хроническом
или затяжном течении инфекционновоспали
тельных заболеваний [1].
Уткина Т.М. и др.
Модификация факторов персистенции стафилококков...
Проведенными нами исследованиями уста#
новлено преимущественное обоюдное повыше#
ние экспрессии АЛА и КБ у изученных бакте#
рий и грибов, а также приобретение ими спо#
собности образовывать биопленки при межмик#
робных взаимодействиях.
Взаимная стимуляция антилизоцимной
активности и способности образовывать био#
пленки может быть одним из механизмов, спо#
собствующих формированию патологического
микробиоценоза, на фоне которого возникает
заболевание, и его хронизации.
2.10.2014
Список литературы:
1. Абрамзон О.М., Карташова О.Л., Валышев А.В. и др. Биологические свойства микроорганизмов как основа прогнозиро#
вания тяжести гнойно#воспалительных заболеваний легких и плевры // Журнал микробиологии, эпидемиологии и имму#
нобиологии. – 2004. – №3. – С. 7#9.
2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. – М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999. – 366 с.
3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б. и др. Симбиоз и его роль в инфекции. Екатеринбург: УрО РАН, 2011. – 299 с.
4. Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях.
Автореф. дис…. докт. биол. наук. Санкт#Петербург, 2007. 40 с.
5. Ермоленко Е.И., Ждан#Пушкина С.Х., Суворов А.Н. Взаимодействие Candida albicans и Lactobacillus plantarum in vitro //
Проблемы медицинской микологии. – 2004. – Т.6. – № 2. – С. 49#54.
6. Ершов П.П. Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных. Дис….
канд. вет. наук. Москва, 2008. 165 с.
7. Ивченко О.В. Диагностика малассезиозов животных. Дис. … канд. вет. наук. Москва, 2010. 152 с.
8. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. – 352 с.
9. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Орлова О.Г. Структура и функция бактериальных биопленок симбиотических и
условно#патогенных бактерий // Верхневолжский медицинский журнал. – Т.11. – Вып.4. – С. 37#42.
10. Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях: Автореф.
дис…. канд. биол. наук. Оренбург, 2009. 22с.
11. Уткина Т.М., Акжигитов А.С., Нургалиева Р.М. Видовой состав и факторы персистенции микроорганизмов, выделен#
ных от собак с отитами // Вестник ветеринарии. – 2014. – №2(69). – С.47#49.
12. Bornand V. Bacteriology and mycology of otitis externa in dogs // Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. – 1992. – № 134(7). –
P.341#348.
13. Faergemann J. Atopic Dermatitis and Fungi // Clinical Microbiology Reviews. – 2002. – Vol.1. – №4. – P.545–563.
14. Mason I.S. A review of the biology of canine skin with respect to the commensals Staphylococcus intermedius, Demodex canis
and Malassezia pachydermatis // Vet. Derm. – 1996. – № 7. – P.119#132.
15. O`Toole G. Biofilm formation as microbial development // Annu Rev Microbiol. – 2000. – № 54. – P.49–79.
Сведения об авторах:
Уткина Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов
и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза
Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук,
е#mail: pashkova070782@mail.ru
Попова Лидия Петровна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов
и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза
Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук,
е#mail: ploomy@list.ru
Акжигитов Абай Сансергалиевич, аспирант кафедры кафедры микробиологии и заразных болезней
Оренбургского государственного аграрного университета, е#mail: abaj_akz@mail.ru
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
127