RU 2 553 631 C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
(13)
2 553 631
C1
(51) МПК
A61K 39/104 (2006.01)
A61P 31/04 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
(21)(22) Заявка:
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
2014104885/15, 11.02.2014
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
11.02.2014
(45) Опубликовано: 20.06.2015 Бюл. № 17
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2309767C1, 10.11.2007 . RU
C 1
2 5 5 3 6 3 1
R U
(54) ШТАММ БАКТЕРИИ Pseudomonas aeruginosa № 9 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ
ПСЕВДОМОНОЗА СВИНЕЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и
изготовления вакцины против псевдомоноза
ветеринарии и касается штамма возбудителя
свиней. Изобретение обеспечивает высокую
псевдомоноза свиней, коллекции ФГБУ ВГНКИ,
иммуногенную активность и возможность
депонированного
под
наименованием
изготовления вакцины против псевдомоноза
«Pseudomonas aeruginosa №9» и регистрационным
свиней. 4 пр., 3 табл.
номером «№9-ДЕП», предназначенного для
Стр.: 1
C 1
Адрес для переписки:
350044, г.Краснодар, ул. Калинина, 13,
Кубанский ГАУ, отдел науки
2 5 5 3 6 3 1
1092947C, 27.10.1995 . RU 1092945C, 27.10.1995
. RU 1092946C, 27.10.1995 . RU 2169193
C2,20.06.2001 . RAU H., et al., Efficacy and
functionality of lipoprotein OprI from
Pseudomonas aeruginosa as adjuvant for a
subunit vaccine against classical swine fever.
Vaccine. 2006 May 29;24(22):4757-68. Epub 2006
Mar 31
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего
профессионального образования "Кубанский
государственный аграрный университет"
(RU)
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 11.02.2014
(72) Автор(ы):
Скориков Александр Владимирович (RU),
Терехов Владимир Иванович (RU),
Сусский Евгений Владимирович (RU),
Черных Олег Юрьевич (RU),
Бурдюг Александра Ивановна (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
(13)
2 553 631
C1
(51) Int. Cl.
A61K 39/104 (2006.01)
A61P 31/04 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
(21)(22) Application:
OF INVENTION
2014104885/15, 11.02.2014
(24) Effective date for property rights:
11.02.2014
(45) Date of publication: 20.06.2015 Bull. № 17
C 1
2 5 5 3 6 3 1
R U
Стр.: 2
C 1
(54) STRAIN OF BACTERIA Pseudomonas aeruginosa № 9 FOR PRODUCTION OF VACCINE AGAINST
PSEUDOMONOSIS OF PIGS
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology.
production of a vaccine against pseudomonosis of pigs.
SUBSTANCE: invention relates to a strain of the
EFFECT: invention provides high immunogenic
pathogen of pseudomonosis of pigs of the collection of
activity and the ability of production of the vaccine
Federal state budgetary institution "VGNKI", deposited
against pseudomonosis of pigs.
under the name "Pseudomonas aeruginosa No.9" and
4 ex, 3 tbl
the registration number "No.9-DEP", intended for
2 5 5 3 6 3 1
Mail address:
350044, g.Krasnodar, ul. Kalinina, 13, Kubanskij
GAU, otdel nauki
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego
professional'nogo obrazovanija "Kubanskij
gosudarstvennyj agrarnyj universitet" (RU)
R U
Priority:
(22) Date of filing: 11.02.2014
(72) Inventor(s):
Skorikov Aleksandr Vladimirovich (RU),
Terekhov Vladimir Ivanovich (RU),
Susskij Evgenij Vladimirovich (RU),
Chernykh Oleg Jur'evich (RU),
Burdjug Aleksandra Ivanovna (RU)
RU 2 553 631 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и предназначено для
производства вакцинных препаратов против псевдомоноза свиней.
Псевдомоноз - острая инфекционная болезнь животных и птицы, характеризующаяся
у молодняка септическим процессом, поражением легких, желудочно-кишечного тракта
и суставов, а у взрослых особей репродуктивных органов и молочной железы.
Возбудителем псевдомоноза является грамотрицательная аэробная бактерия Pseudomonas
aeruginosa, которая по антигенной структуре подразделяется на 20 серологических
групп (Псевдомоноз животных / И.А. Болоцкий, А.Г. Шипицын, А.К. Васильев и др. М.: Колос, 2010. - 223 с.).
Псевдомоноз животных, в т.ч. свиней, регистрируется во всех регионах России
независимо от природно-географических условий. В подавляющем большинстве случаев
возбудителем псевдомоноза свиней является Pseudomonas aeruginosa серогрупп O1, O3,
O4, O6, O11, 019 (Пруцаков С.В. Псевдомоноз продуктивных животных в регионе
Северного Кавказа / Автореф. дисс. докт. вет. наук. - Краснодар, 2011. - 37 с.). Учитывая
данные обстоятельства, для профилактики болезни была разработана вакцина
поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных (Пат. РФ
№2308288), которая в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур
Pseudomonas aeruginosa, принадлежащих к 10 серогруппам (O1, O2, O3, O4, O6, O10, O11,
O13, O18, O19), полученных путем отбора паренхиматозных пораженных органов из
местного эпизоотического очага. Существенным недостатком такой вакцины является
использование для ее получения неохарактеризованных (случайных) штаммов с
неизвестными иммуногенными свойствами.
Известен вакцинный штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 5142, используемый
для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей (Пат. РФ 2169193,
прототип). Недостатком данного штамма является то обстоятельство, что он
ориентирован на создание вакцины против псевдомоноза пушных зверей, при этом у
вакцинированных животных формируется иммунитет к экзотоксину А, а не к
соматическому O-антигену, который сохраняется непродолжительное время.
Технического решения, в ходе которого использовался штамм Pseudomonas aeruginosa
для получения вакцины против псевдомоноза свиней с заданным O-антигенным
профилем и иммунногенными свойствами, в доступной научной и патентной литературе
нами не выявлено.
Штамм Pseudomonas aeruginosa №9 выделен от павшего поросенка в 2003 г., в 2011
г. предложен в качестве вакцинного штамма, а в 2013 г. депонирован во Всероссийской
коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве
(Россия, 123022, Москва, Звенигородствое шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ») под
регистрационным номером «№9-ДЕП».
Штамм Pseudomonas aeruginosa №9-ДЕП предназначен в качестве производственного
штамма для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней и хранится в ФГУП
«Армавирская биофабрика».
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается
в расширении арсенала штаммов Pseudomonas aeruginosa, обладающих и длительно
сохраняющих свои иммунногенные свойства и пригодных для изготовления
высокоэффективных вакцинных препаратов.
Технический результат достигается тем, что штамм возбудителя псевдомоноза свиней,
коллекции ФГБУ ВГНКИ, депонированный под наименованием «Pseudomonas aeruginosa
№9» и регистрационным номером «№9-ДЕП», предназначенный для изготовления
вакцины против псевдомоноза свиней.
Стр.: 3
RU 2 553 631 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Штамм Pseudomonas aeruginosa №9-ДЕП характеризуется следующими свойствами.
Культурально-морфологические признаки: грамотрицательная палочка, размерами
2-3×0,5-0,8 мкм, подвижная, спор и капсул не образует, располагается поодиночно.
Растет на простых питательных средах с образованием сине-зеленого пигмента
пиоцианина и слизи. На поверхности мясо-пептонного бульона дает пленку сероватосеребристого цвета, а на поверхности мясо-пептонного агара - шероховатые
неправильной формы колонии.
Физиолого-биохимические признаки: мезофил, аэроб, растет при температуре от 18
до 42°С, но оптимальная температура роста 35-37°С. Окисляет глюкозу, восстанавливает
нитраты до нитритов, ферментирует аргинин, разжижает желатину, свертывает молоко,
разрушает эритроциты барана, образует цитохромоксидазу.
Антигенные свойства: агглютинируется типовой сывороткой 04 до титра 1:1280.
Вирулентные свойства: Вызывает гибель белых мышей при внутрибрюшинном
введении 2-3×106 микробных клеток.
Иммуногенные свойства: при двукратной иммунизации кроликов инактивированными
формалином клетками в дозе 1-2×1010 и взрослых свиней в дозе 4-6×1010 микробных
тел через 14 дней после последней иммунизации в сыворотке крови животных появляются
антитела в титре 1:512-1:1024. Защитный титр антител, равный для данного штамма 1:
64, сохраняется у иммунизированных животных в течение 12 месяцев.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Штамм Pseudomonas aeruginosa №9 выращивают на бульоне Хоттингера
в течение 24-46 ч при 36-37°С с рН 7,2-7,4 и постоянном встряхивании на шуттельаппарате. По истечении срока инкубации культуру проверяют на чистоту путем
окрашивания по Граму, доводят физиологическим раствором до концентрации 10 млрд.
микробных клеток в 1 мл, после чего инактивируют формалином, содержащим не менее
36% формальдегида до конечной концентрации 0,3-0,4% и выдерживают в течение 14
суток при температуре культивирования. После окончания срока инактивации в культуру
вносят 3%-й раствор гидроокиси алюминия, фасуют во флаконы и укупоривают.
Полученная вакцина представляет собой прозрачную жидкость желтовато-зеленоватого
цвета с беловато-сероватым рыхлым осадком, при встряхивании образуется однородная
суспензия.
Пример 2. Полученную по примеру 1 вакцину проверяют на стерильность и
безвредность.
Стерильность вакцины контролируют по отсутствию роста при посеве на среды
Сабуро (на грибы), Эндо (колиформные бактерии), МПА (мезофильные аэробные
бактерии), Китта-Тароци (на анаэробы). Рост на всех средах отсутствовал, что
свидетельствует о стерильности вакцины.
Безвредность проверяют на 3 белых мышах массой 18-20 г, которым вакцину вводят
подкожно в объеме 0,3 мл и наблюдают в течение 7 дней. Все подопытные животные
остались живы, на месте введения вакцины патологических изменений не было, что
свидетельствует о безвредности препарата.
Пример 3. Иммуногенность вакцины оценивают по протективности при
экспериментальном псевдомонозе на белых мышах и величине накопления титров
специфических антител у иммунизированных вакциной кроликов и свиней.
3 группы белых мышей по 10 животных в каждой за 10 дней до заражения
эпизоотическим штаммом Pseudomonas aeruginosa O4 иммунизировали: мышей 1 группы
вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9 в дозе 0,1 мл подкожно; мышей из 2
Стр.: 4
RU 2 553 631 C1
5
10
15
группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 5142 в дозе 0,1 мл подкожно; мышам
из 3 группы ввели физраствор в объеме 0,1 мл подкожно. Через 10 дней после
иммунизации всех мышей заразили патогенным изолятом Pseudomonas aeruginosa
серогруппы 04 в дозе 100 млн. микробных тел внутрибрюшинно. В течение 14 дней за
мышами вели наблюдение и производили учет павших.
Результаты отражены в таблице 1, из которой видно, что в первой группе выжило
80% экспериментально зараженных животных, что на 30% больше, чем во второй
группе, животные которой иммунизировались вакциной из эпизоотического штамма.
В контрольной группе, где животным вводился физраствор, погибли все мыши.
Следовательно, вакцина против псевдомоноза из штамма Pseudomonas aeruginosa №9
защитила наибольшее количество экспериментально зараженных животных, а значит
она более иммуногенна, чем вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa
5142.
Таблица 1 Защитный эффект вакцин при экспериментальном псевдомонозе, обусловленном Pseudomonas aeruginosa серогруппы O4
20
25
30
35
Группа
Кол-во мышей
Пало
Выжило
Защитный эффект
вакцины, %
1. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa
№9
10
2
8
80
2. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa
5142
10
5
5
50
3. Контроль (вводился физраствор)
10
10
-
-
Иммуногенность штамма Pseudomonas aeruginosa №9 оценивали по способности
стимулировать выработку специфических антител на 10 кроликах и 10 взрослых свиньях.
Для этого животных иммунизируют дважды с интервалом 14 дней кроликов в дозе 1
мл на голову, свиней - 5 мл на голову. По истечении 14, 30, 90, 180, 270 и 360 дней после
последней иммунизации в реакции агглютинации определяют титры антител к
Pseudomonas aeruginosa серогруппы O4.
Результаты отражены в таблице 2, из которой видно, что депонированный штамм
Pseudomonas aeruginosa №9, предназначенный для изготовления вакцины против
псевдомоноза свиней, обладает более выраженными иммуногенными свойствами, чем
вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 5142, поскольку обеспечивает образование
в 3-5 раз большего уровня специфических антител. Кроме того, в организме
иммунизированных животных в группах, где использовалась вакцина из штамма
Pseudomonas aeruginosa №9, защитный уровень антител к соматическому антигену O4
(не менее 1:64) сохранялся в течение 12 месяцев, а у животных, иммунизированных
вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 5142 - только 3-6 месяцев. Отсюда следует,
что вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa №9, обеспечивает более
продолжительный иммунитет, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 5142.
40
Таблица 2 Иммуногенность вакцин против псевдомоноза
Группа
Титр антител к соматическому антигену O4 Pseudomonas aeruginosa после иммунизации
по дням
14
30
90
180
270
360
Кролики (n=10)
45
1. Иммунизировалась вакциной из
штамма Pseudomonas aeruginosa №9
1:819,2
1:1228,8
1:716,8
1:512
1:232,8
1:64
2. Иммунизировалась вакциной из
штамма Pseudomonas aeruginosa 5142
1:273,1
1:341,3
1:204,8
1:64
1:16
1:8
Свиньи (n=10)
Стр.: 5
RU 2 553 631 C1
5
10
15
20
25
1. Иммунизировалась вакциной из
штамма Pseudomonas aeruginosa №9
1:1024
1:1433,6
1:716,8
1:307,2
1:256
1:83,2
2. Иммунизировалась вакциной из
эпизоотического штамма
Pseudomonas aeruginosa 5142
1:238,9
1:286,7
1:128
1:44,8
1:8
1:2
Пример 4. На свино-товарной ферме, неблагополучной по псевдомонозу,
иммунизируют 30 поросят 2-недельного возраста полученной по примеру 1 вакциной
из штамма Pseudomonas aeruginosa №9 (опытная группа) и 30 поросят аналогичного
возраста вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 5142 (положительный контроль),
30 поросят не иммунизировались (отрицательный контроль). Бактериологическими
исследованиями установлено, что заболевание вызывает Pseudomonas aeruginosa
серогруппы O4. Поросята опытной группы и группы положительного контроля
иммунизировались по одинаковой схеме: дважды с интервалом 14 дней внутримышечно
с внутренней стороны бедра в дозе 1,0 и 1,5 мл. Наблюдение за животными вели в
течение 120 дней, отмечая все случаи заболевания и гибели поросят связанные с
псевдомонозом.
Результаты опыта отражены в таблице 3, из материалов которой видно, что в опытной
группе заболело псевдомонозом 6 поросят, из них 1 пал. В группе положительного
контроля заболело 10 поросят, из которых пало 3. В группе отрицательного контроля
заболело 16 поросят, из которых пало - 7. Следовательно, заболеваемость и смертность
в опытной группе составила соответственно 20 и 3,3%, в группе положительного
контроля - 33,3 и 10%, в группе отрицательного контроля - 50,3 и 23,3%. Сохранность
поросят в опытной группе составила 96,7%, в группе положительного контроля - 90%
и в группе отрицательного контроля - 76,7%.
Таблица 3 Профилактическая эффективность вакцины против псевдомоноза свиней из штамма Pseudomonas aeruginosa №9
Группа
30
35
40
45
Количество поросят, под- Заболело поросят в Пало поросят в груп- Сохранность поровергнутых иммунизации
группе
пе
сят, %
1. Опытная, иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa
№9
30
6 (20%)
1 (3,3%)
96,7
2. Контрольная, иммунизировалась
вакциной из штамма Pseudomonas
aeruginosa 5142
30
10 (33,3%)
3 (10%)
90,0
3. Контрольная, не иммунизировалась
30
16 (50,3%)
7 (23,3%)
76,7
Таким образом, вакцина, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением,
а именно из штамма Pseudomonas aeruginosa №9, обеспечивает наибольшую
выживаемость животных при экспериментальном и спонтанном псевдомонозе, чем
вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 5142, поскольку способна в большей степени
стимулировать выработку и циркуляцию в организме иммунизированных животных
специфических антител к соматическому антигену O4. Следовательно, штамм
Pseudomonas aeruginosa №9 пригоден для изготовления вакцины против псевдомоноза
свиней.
Формула изобретения
Штамм возбудителя псевдомоноза свиней, коллекции ФГБУ ВГНКИ,
депонированный под наименованием «Pseudomonas aeruginosa №9» и регистрационным
номером «№9-ДЕП», предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза
свиней.
Стр.: 6