Лекция 1 - страница

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. К.И.САТПАЕВА
Институт Строительства и Архитектуры
Кафедра «Прикладная экология»
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС
ДИСЦИПЛИНЫ СТУДЕНТА
по дисциплине "Биотехнология микроорганизмов"
для специальности 050701 – Биотехнология
Алматы 2009
Учебно-методический комплекс по дисциплине «Биотехнология микроорганизмов» для
студентов КазНТУ имени К.И.Сатпаева для специальности 050701 – «Биотехнология». Составители Нуркеев С.С., Жубанова А.А., Джамалова Г.А., Алматы: КазНТУ, 2009.
Составитель:
- Нуркеев Самат Сагиевич, заведующий кафедрой «Прикладная экология» доктор технических наук, профессор.
- Жубанова Ажар Ахметовна, профессор, доктор биологических наук.
- Джамалова Гуля Абаевна, доцент, кандидат сельскохозяйственных наук.
Аннотация
УМК дисциплины «Биотехнология микроорганизмов» разработан в соответствии с типовыми и рабочими учебными планами специальности и отражает основное содержание преподаваемой дисциплины. УМК содержит учебную программу дисциплины (Syllabus), тематический план курса, список необходимой литературы, краткий конспект лекций, систему
заданий для самостоятельной работы студентов, график выполнения отчетных работ по дисциплине и тестовые задания для самоконтроля.
В конспектах лекционных занятий проанализированы и обобщены современные технологии биотехнологического производства. Особо рассмотрены вопросы, касающиеся технологической схемы производства продукции микробиологического происхождения, раскрытие их природы в соответствии с законами биологии.
Важнейшая цель дисциплины «Биотехнология микроорганизмов» - дать обучающимся
посредством теоретических и практических занятий навыки по производству биотехнологической продукции микробиологического происхождения. Использование учебнометодического комплекса студентами позволит им правильно распределить учебное время,
организовать самостоятельную работу, будет способствовать активации познавательной и
творческой деятельности студентов. В целом учебно-методический комплекс формирует у
студентов научное мировоззрение, благодаря которым он сможет полученные теоретические
знания применить в практической оценке современного состояния исследований по биотехнологии.
© Казахский национальный технический университет
имени К.И. Сатпаева, 2009
2
1. УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ – SYLLABUS
1.1. Данные о преподавателях:
Преподаватели, ведущие занятия:
- Жубанова Ажар Ахметовна – профессор, доктор биологических наук.
- Джамалова Гуля Абаевна - доцент, кандидат сельскохозяйственных наук.
- Битимшина Гульнара Муратбековна.
- Мусабекова Калима Орынбековна.
Контактная информация 257-71-47, 7343.
Время пребывания на кафедре согласно утвержденному расписанию.
1.2. Данные о дисциплине:
Название «Биотехнология микроорганизмов»
Количество кредитов – 4
Место проведения КазНТУ
Таблица 1
Выписка из учебного плана
Академических часов в неделю
Практ. СРС* СРСП
ЛекЛаб.
*
заняции
занятия/
тия
семинар
1
2
3
4
5
6
7
8
3
5
4
1
2
1
4
4
*Примечания: Каждый кредит сопровождается двумя часами СРС.
Курс
Семестр
Кредиты
Всего
9
12
Форма
контроля
10
Экзамен
1.3. Пререквизиты: философия, математика, экология, микробиология и вирусология,
общая и молекулярная генетика, методика научных исследований и основы лабораторного
дела, биотехнологические ресурсы биотехнологии.
1.4. Постреквизиты: знание по данной дисциплине являются базой для ряда смежных
дисциплин: экологическая биотехнология, биотехнология переработки отходов производства
и потребления, промышленная биотехнология (по рабочему учебному плану специальности).
1.5. Краткое описание дисциплины: курс «Биотехнология микроорганизмов» формирует у студентов биологическое мышление и вооружает знаниями, необходимыми ему для
понимания и изучения дисциплин связанных с его специализацией. Поэтому изучение курса
о принципах производства биотехнологической продукции микробиологического происхождения имеет большое значение в общей структуре подготовки специалистов биотехнологического профиля.
Дисциплина преподается в течение пятого семестра объемом 4 кредита (15 лекционных,
30 лабораторных и 15 практических часов).
Целью преподавания курса «Биотехнология микроорганизмов» является дать обучающимся посредством теоретических и практических занятий навыки по производству биотехнологической продукции микробиологического происхождения.
Задачи изучения дисциплины вытекают из требований к знаниям и умениям будущих
специалистов в соответствии с государственным стандартом по основному высшему образованию.
После окончания курса студенты должны овладеть знаниями, умениями и компетенциями, которые позволят им использовать законы биологии при изучении биотехнологических
принципов производства продукции путем применения новейших технологий.
3
1.6. Перечень, виды заданий и график их выполнения.
Таблица 2
Виды заданий и сроки их выполнения
Виды
контроля
Текущий
Рубежный
Другие
виды
Итоговый
СроСсылки на
ки
рекомендуемую литера- сдачи
(нетуру с указанием страниц деля)
Практическое занятие
Рейтинг контроль
1 осн. [4-16]
1
№1
2 осн. [12-24]
2
Самостоятельная рабо- Характеристика
основных 1 осн. [4-96]
та № 1
продуктов
биотехнологии 2 осн.[12-126]
микробного синтеза
Контрольная работа
По материалам практических
Осн: 1-3
3
№1
занятий 1-2
Доп: 1-3
4
Самостоятельная рабо- Влияние физических факторов 1 осн. [18-45]
та № 2
на рост и развитие микробной 1 доп. [24-61]
клетки в культуре
Лабораторная работа
Получение уксусной кислоты 2 осн. [63-92]
5
№5
1 доп. [129]
Осн: 1-3
6
Контрольная работа
По материалам практических
Доп: 1-3
№2
занятий 3-4 и лабораторных
занятий 1-6
Коллоквиум
По материалам лекций 1-7
Осн: 1-3
7
№1
Доп: 1-3
Контрольная работа
По материалам практических
Осн: 1-3
9
№3
занятий 5-6
Доп: 1-3
Реферат
По выбору студента
Осн: 1-3
10
Доп: 1-3
11
Лабораторная работа
Особенности биосинтеза ли- 1 осн. [46-88]
№ 11
монной кислоты при поверх- 2 осн. [126ностном
культивировании 201]
микроскопических грибов
12
Контрольная работа
По материалам лабораторных Осн: 1-3
№4
занятий 7-12 и практических Доп: 1-3
занятий 1-7
Коллоквиум № 2
По материалам лекций 7-13
Осн: 1-3
13
Доп: 1-3
Рубежный контроль I
По материалам всех видов за- Осн: 1-3
8
нятий модуля I
Доп: 1-3
Рубежный контроль II
По материалам всех видов за- Осн: 1-3
15
нятий модуля II
Доп: 1-3
Курсовая работа
По тематике
Осн: 1-3
14
Доп: 1-3
Экзамен
Весь пройденный материал
Осн: 1-3
По
Доп: 1-3
расписанию
Вид
работы
Тема работы
4
1.7. Учебно-методические материалы по дисциплине
Основная:
1. Б.Глик, Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология. М., Мир, 2002.
2. С.Н.Щелкунов. Генетическая инженерия. Сибирское университетское издательство.
Новосибирск, 2004.
3. В.Г.Дебабов, В.А.Лившиц. Биотехнология. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. В 8-ми книгах, книга 2. Москва, Высшая школа, 1988.
Дополнительная:
1. А.Сассон. Биотехнология: свершения и надежды. М.Мир, 1987.
2. А.А.Баев (отв.ред.). Биотехнология. Москва, Наука, 1984.
3. М.Е.Бекер. Введение в биотехнологию. М., Пищевая промышленность, 1978.
1.8. Контроль и оценка знаний:
По кредитной технологии обучения для всех курсов и по всем дисциплинам Казахского
национального технического университета имени К.И. Сатпаева применяется рейтинговый
контроль знаний студентов. Рейтинг дисциплины оценивается по 100 балльной шкале независимо от итогового контроля. Для данной дисциплины установлены следующие виды контроля: текущий контроль, рубежный контроль, итоговый контроль (таблица 3). Видами текущего контроля являются контрольные работы, рефераты, семестровые задания, коллоквиумы и др. К итоговому контролю по данной дисциплине относится экзамен.
Таблица 3
Распределение рейтинговых баллов по видам контроля
№ вариантов
1
Вид итогового
контроля
Экзамен,
курсовая работа
Виды контроля
Итоговый контроль
Рубежный контроль
Курсовая работа
Текущий контроль
Проценты
100
100
100
100
Таблица 4
Календарный график сдачи всех видов контроля
по дисциплине «Биотехнология микроорганизмов»
Недели
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
15
Недельное 1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
количество
контроля
Виды
П СР К1 СР Л К2 Кл1 РК1 К3
Р
Л К4 Кл2 КР РК2
контроля
Виды контроля: К - контрольная работа, Кл - коллоквиум, СР - самостоятельная работа,
П- практическое занятие, Л - лабораторное занятие, РК - рубежный контроль, Р – рефераты, КР – курсовая работа.
Сроки сдачи результатов текущего контроля должны определяться календарным графиком учебного процесса по дисциплине (таблица 4). Количество текущих контролей определяется содержанием дисциплины и ее объемом, которое указывается в учебно-методическом
комплексе дисциплины.
Студент допускается к сдаче итогового контроля при наличии суммарного рейтингового
балла >30. Итоговый контроль считается сданным в случае набора > 20 баллов. Итоговая
оценка по дисциплине определяется по шкале (таблица 5).
5
Таблица 5
Оценка знаний студентов
Оценка
Отлично
Хорошо
Удовлетворительно
Неудовлетворительно
Буквенный
эквивалент
А
А–
В+
В
В–
С+
С
С–
D+
D
F
В процентах, %
В баллах
95–100
90–94
85–89
80–84
75–79
70–74
65-69
60–64
55–59
50–54
0–49
4
3,67
3,33
3,0
2,67
2,33
2,0
1,67
1,33
1,0
0
Перечень вопросов для проведения контроля по модулям и промежуточной аттестации:
Вопросы для проведения контроля по 1 модулю «Микробиологические аспекты биотехнологии»:
1. Основные принципы классификации микробов.
2. Морфологические и тинкториальные свойства бактерий. Методы окраски.
3. Структура и химический состав бактериальной клетки. Особенности строения
грамположительных и грамотрицательных бактерий.
5. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.
6. Способы получения энергии бактериями /дыхание, брожение/.
7. Типы и механизмы питания бактерий и грибов.
8. Основные принципы культивирования бактерий и грибов.
9. Искусственные питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые
к питательным средам.
10. Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.
11. Ферменты бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.
12. Роль микробов - контаминантов в биотехнологических производствах.
13. Роль грибов в биотехнологических производствах.
14. Санитарно-бактериологические методы исследования воды.
15. Санитарно-бактериологическое исследование воздуха.
Вопросы для проведения контроля по 2 модулю «Промышленная микробиология»:
1. Требования, предъявляемые промышленным микроорганизмам.
2. Стадии промышленного биосинтеза.
3. Выращивание микробной биомассы.
4. Получение продуктов метаболизма микроорганизмов.
5. Получение рекомбинантных продуктов.
6. Биотрансформация веществ.
7. Производство аминокислот.
8. Производство органических кислот.
9. Производство витаминов.
10. Производство спиртов.
11. Производство полиолов.
12. Производство вторичных метаболитов.
13. Производство антибиотиков.
6
14. Биотехнологическое производство лекарственных препаратов.
15. Биотехнологическое производство профилактических препаратов.
Перечень вопросов промежуточного контроля «Важность и разнообразие микробных продуктов»:
1. Биотехнологическое производство антибиотиков.
2. Биотехнологическое производство витаминов.
3. Биотехнологическое производство ферментов.
4. Биотехнологическое производство аминокислот.
5. Биотехнологическое производство нуклеотидов.
6. Биотехнологическое производство лимонной кислоты.
7. Биотехнологическое производство уксусной кислоты.
8. Биотехнологическое производство этанола.
9. Биотехнологическое производство биогаза.
10. Белок одноклеточных: биотехнология производства.
11. Биологически активные вещества: биотехнология производства.
12. Биотехнологическое производство ацетона.
13. Биотехнологическое производство бутанола.
14. Биоэнергия: биотехнология производства.
15. Биополимеры: биотехнология производства.
1.9. Политика и процедура курса. По курсу запланировано 4 контрольные работы.
Учитываются баллы, набранные по результатам коллоквиума и рубежного контроля.
2. СОДЕРЖАНИЕ АКТИВНОГО РАЗДАТОЧНОГО МАТЕРИАЛА
2.1 Тематический план курса
№
1
I
1
2
II
3
4
III
5
6
IV
7
Наименование
раздела и темы
Лекции
Количество академических часов
Лабора- СРСП
Практические занятия торные
занятия
(семинар)
4
5
6
2
3
Основы микробной биотехнологии
Микробиологические аспекты био1
1
технологии
1
1
Промышленные микроорганизмы.
Микробиологические ферментные
системы для промышленных процессов
Основы микробиологического производства
Важность и разнообразие микробных
1
1
продуктов
Основы управления ростом и мета1
1
болизмом микробов
Промышленные микробиологические процессы
Микробиологический синтез
1
1
Белок одноклеточных организмов.
1
1
Выращивание микробной биомассы.
Продукты метаболизма микроорганизмов на макроуровне
Биотехнологическое производство
1
1
аминокислот
7
СРС
7
2
4
4
2
4
4
2
4
4
2
4
4
2
2
4
4
4
4
2
4
4
1
8
9
10
11
12
13
14
15
2
Биотехнологическое производство
органических ксилот
Биотехнологическое производство
вторичных метаболитов
Биотехнологическое производство
антибиотиков
Биотехнологическое производство
лекарственных и профилактических
препаратов
Биотехнологическое производство
энергии
Биотехнология металлов
Биотехнология получения продуктов
питания и напитков
Биотехнология микроорганизмов в
охране окружающей среды
Всего часов
3
1
4
1
5
2
6
4
7
4
1
1
2
4
4
1
1
2
4
4
1
1
2
4
4
1
1
2
4
4
1
1
1
1
2
2
4
4
4
4
1
1
2
4
4
15
15
30
60
60
2.2. Конспект лекционных занятий
I. Основы микробной биотехнологии
Тема лекции 1: Микробиологические аспекты биотехнологии.
Все микроорганизмы подразделяют на три группы: высшие протисты, низшие протисты
и неклеточные формы (рис.1.1).
Микроорганизмы
Высшие
протисты
Водоросли
Грибы
Простейшие
Низшие
протисты
Эубактерии
Архебактерии
Риккетсии
Сине-зеленые
водоросли
Неклеточные
формы
Прионы
Вироиды
Вирусы
Рисунок 1.1. Классификация микроорганизмов
Прионы – белковоподобная инфекционная частица, приводящая к развитию летальных
неврологических заболеваний (губчатый энцефалопатий).
Вирусы – наименьшие по размерам агенты, имеющие геном, окруженный белковой оболочкой.
Вироиды – мелкие кольцевые однонитевые суперспирализованные молекулы РНК без
8
белочной оболочки, патогенные для растений (относят к вирусам).
Бактерии – представители царства прокариот, одноклеточные организмы (бактерии и
сине-зеленые водоросли), существенно отличающиеся от эукариот (табл.1.1):
1) архебактерии (патогенных для человека видов не обнаружено), обитают в биотипах с
экстремальными условиями, к ним относят:
- метанообразующие бактерии,
- экстремально галофильные бактерии (растут в присутствии 12-32% NaCl) и
- термоцидофильные бактерии (растут при 75-90оС и низком рН);
2) эубактерии, свободноживущие сапрофиты, имеются патогенные для растений и животных виды.
Грибы – эукариоты, гетеротрофы, не содержат фотосинтетических пигментов и растут в
аэробных условиях. Выделяют два типа роста грибов: дрожжевой и мицелиальный. Мицелиальный рост дают плесневые грибы. Дрожжи размножаются только почкованием, о дрожжеподобные грибы – почкованием и иногда псевдомицелием. Дрожжи представлены отдельными овальными клетками, морфологически сходными между собой, а плесневые грибы
растут в виде переплетающихся трубок – гиф. Совокупность гиф обозначают термином мицелий.
Простейшие состоят из единственной эукариотической клетки.
Таблица 1.1. Основные различия между про- и эукариотами
Признак
Размер
Анаэробное дыхание
Фиксация азота
Мембранные структуры
Расположение
Ядерная мембрана
Форма
Экстрахромосома
Гистоны
Тип деления
Рибосомы
Место синтеза
Структурные элементы
Стеролы
Прокариотическая клетка
1-10 мкм
Возможно
Возможна
Отсутствуют
Генетический материал
В цитоплазме
Отсутствует
Кольцевая молекула ДНК
Плазмидная ДНК
Отсутствуют
Бинарный
Синтез белка
70 S
Свободно расположенные в
цитоплазме рибосомы
Клеточная стенка
Образована пептидогликанами
Отсутствуют
Эукариотическая клетка
10-100 мкм
Обычно отсутствует
Невозможна
Имеются
В ядре
Имеется
Линейная
хромосомальная
ДНК
Митохондриальная ДНК
Имеются
Митотический
80 S
В составе эндоплазматической сети рибосомы
Содержит хитин или целлюлозу
Имеются
Систематика и номенклатура микроорганизмов.
1. Категории таксономической иерархии – таксоны:
вид → род → трибо или колено → семейство → порядок → класс → отдел → царство.
2. Названия основных таксонов у микроорганизмов: род и выше – обозначаются одним
словом; вид – обозначаются двумя словами: название рода и вида; штамм – культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника; клон – культура микроорганизмов, полученная из одной исходной клетки.
Определение родовой и видовой принадлежности микроорганизмов основывается на результатах морфологических, физиологических и биохимических тестов. Кроме того, для
идентификации некоторых видов микроорганизмов исследуют химический состав и строе9
ние клеточной стенки, серологические свойства, чувствительность к фагам и другие особенности клеток.
В систематике бактерий можно выделить три взаимосвязанных аспекта, это:
- классификация – распределение по группам бактерий со сходными фенотипическими
или генетическими характеристиками;
- номенклатура – наименование бактерий в соответствии с международными принципами, правилами и рекомендациями;
- идентификация – сравнение неизвестных организмов с уже классифицированными
бактериями с целью установления их идентичности или наименования неизвестных организмов.
Категории бактерий
Gracillicutes – виды с тонкой клеточной стенкой,
окрашивающиеся грамотрицательно
Tenericutes – бактерии, лишенные клеточной
стенки (микоплазмы и прочие представители
класса Mollicutes)
Firmicutes – бактерии с толстой клеточной стенкой, окрашивающиеся грамположительно
Mendosicutes - архебактерии
Рисунок 1.2. Категории бактерий по определителю Берджи
Eumycota
Низшие грибы
Высшие грибы
Chrytidiomycetes
Ascomycetes
Hyphochrytidiomycetes
Basidiomycetes
Oomycetes
Deuteromycetes
Zygomycetes
Рисунок 1.3. Особенности систематики грибов
Основной единицей в систематике является вид. В микробиологии под видом обычно
понимают типовой штамм и все остальные штаммы, считающиеся достаточно сходными с
типовым штаммом. Типовой штамм – это штамм, выбранный в качестве постоянного образца того, что подразумевается под данным видом. Общепринятой схемы классификации бактерий не существует, но наиболее популярной и широко применяемой является схема, приведенная в «Определителе бактерий Берджи». Исследователь должен выяснить, является ли
10
организм фототрофным, хемоавтотрофным или хемогетеротрофным. Необходимо также
знать, является ли он аэробом, анаэробом, микроаэрофилом или факультативным анаэробом,
а также определить некоторые морфологические свойства, окраску по Граму, форму клеток,
специфические морфологические признаки (наличие спор, капсул и т. д.).
Принципы систематизации бактерий в определителе Берджи. Определитель Берджи
систематизирует все известные бактерии по принципам идентификации бактерий, основанным на различиях в строении клеточной стенки и отношении к окраске по Грамму.
Определитель Берджи выделяет четыре основных категорий бактерий: Gracillicutes;
Firmicutes;Tenericutes; Mendosicutes (рис.1.2). Описание бактерий дается по группам.
Особенности систематики грибов представлена на рисунке 1.3. Грибы отнесены к царству Mycota, подразделяемые на отделы Myxomycota, Eumycota (истинные грибы).
Простейшие включены в царство Animalia, подцарство Protozoa, разделенное на 7 типов. Всего насчитывают около 30 тыс. видов простейших.
Литература:
Основная – 1 [6-88].
Дополнительная – 1 [20-46].
Контрольные вопросы:
1. Какие типы микроорганизмов Вы изучили из курса микробиология и вирусология?
2. Дать определение терминам и понятиям: штамм, клон, вид, подтип.
Тема лекции 2. Промышленные микроорганизмы. Микробиологические ферментные системы для промышленных процессов.
Требования, предъявляемые промышленным микроорганизмам. Микробные клетки
с различными химико-технологическими свойствами могут быть выделены из природных
источников и далее с помощью традиционных (селекция, отбор) и новейших методов (клеточная и молекулярная биотехнология) существенно модифицированы и улучшены.
При выборе биологического агента и постановке его на производство следует соблюдать
принцип технологичности штаммов (рис.2.1).
В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов
займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы – организмы, развивающиеся в экстремальных условиях
среды (термофильные, алкало- и ацидофильные).
В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами, микробные ассоциации способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных
культур – охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов.
Микробиологический катализ (биокатализ). Биокатализ представляет собой одно из
направлений биотехнологии, в котором рассматриваются процессы, реализующиеся с участием индивидуальных ферментов или ферментных систем. Основными источниками ферментных систем для современных промышленных процессов являются микроорганизмы.
С точки зрения технолога можно говорить о двух подходах к использованию биокаталитического потенциала микроорганизмов:
1. Один из них включает ферментацию или микробиологический синтез, когда продукты
метаболизма образуются при культивировании продуцентов.
11
2. Другой - собственно ферментативный катализ. В этом случае используются микробные клетки, обладающие необходимой для осуществления процесса ферментативной активностью, или выделенные из культуры ферменты.
Технологические требования,
предъявляемые штаммам
Сохранять свои основные физиолого-биохимические свойства в
процессе длительного ведения ферментации
Обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам,
заражению посторонней микрофлорой (контаминации)
Характеризоваться безвредностью для людей
и окружающей среды
Не иметь при выращивании побочных токсичных
продуктов обмена и отходов
Иметь высокие выходы продукта и приемлемые
технико-экономические показатели
Рисунок 2.1. Технологические требования, предъявляемые штаммам
Для биокаталитических реакций в большинстве случаев применяются рекомбинантные
штаммы с модифицированным геномом. К числу процессов ферментативного катализа относят реакции, при которых происходят изменения структуры соединений, участвующих в каталитическом акте. К ним могут быть отнесены как реакции синтеза новых структур, так и
реакции деструкции с целью получения полезных для дальнейшего использования продуктов
или разрушение токсических соединений, нарушающих экологический статус.
Ферментация или микробиологический синтез - один из наиболее распространённых
технологических процессов в биотехнологии. Процессы брожения являются классическим
примером ферментации. Под микробиологическим синтезом понимают синтез структурных
компонентов микробных клеток или продуктов их метаболизма из низкомолекулярных соединений.
Основные особенности микробиологического синтеза заключаются в следующем:
1) синтез осуществляется ферментными системами самой клетки и протекает преимущественно внутриклеточно вне зависимости от локализации целевого продукта после проведения технологических операций по его получению;
2) синтез осуществляется из низкомолекулярных предшественников, которые в ходе реакции, как правило, должны быть активированы;
3) синтез является энергозависимым процессом;
4) пути синтеза связаны с катаболизмом, но могут существенно отличаться от них и в
большинстве своём осуществляются ферментными системами, специфичными для реакций
анаболизма.
Задача микробиологического синтеза состоит в том, чтобы получить максимум целевого
продукта и минимум других продуктов. Для достижения сверхсинтеза необходимо нарушить
нормальную регуляцию путей метаболизма.
12
Все жизненно важные процессы клетки, как и всех организмов, обеспечивает обмен веществ или метаболизм. Обмен веществ определяют два сопряженных взаимодополняющих
процесса - катаболизм и анаболизм.
В катаболической фазе путём окислительных реакций происходит деградация белков,
нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов и других макромолекул. Далее наступает фаза
промежуточного метаболизма или амфиболизма, где низкомолекулярные продукты фазы катаболизма превращаются в органические кислоты, фосфорные эфиры и т.п. Анаболизм характеризуется синтезом метаболитов и структур, обеспечивающих формирование клетки, как
самостоятельной биологической единицы. Для анаболизма более характерны восстановительные процессы.
Известно, что многие промышленно важные продукты биосинтеза накапливаются в
культуре продуцента после того, как основные компоненты среды израсходованы, а скорость
роста биомассы замедлена.
Ферментативный катализ имеет перспективы применения в синтезе органических соединений вместо реакций, принятых в органической химии. Можно отметить несколько основных его особенностей, определяющих преимущества биокатализа в органическом синтезе.
1. Широкий диапазон возможных реакций.
2. В отличие от реакций органического синтеза ферментативные, осуществляемые, в
частном случае, в одну ступень, не требуют защиты функциональных групп.
3. Мягкие условия проведения реакций, подходящие для сложных, химически нестойких молекул.
4. Высокая активность катализатора при его низких концентрациях.
5. Многократное использование катализатора, например, иммобилизованных клеток.
6. Полная деградация биокатализатора (фермента) в окружающей среде (Michels et. al.,
1998) и его безопасность.
7. Возможная автоматизация процесса при проведении реакций.
Компоненты реакции
Процесс
Продукты
Экономика
Получение продукта
Выбор биокатализатора
Масштабирование
Прикладные
проблемы
Характеристика
биокатализа
Инженерный
биокатализ
Рисунок 2.2. Биокаталитический цикл (Schmid et.al., 2001)
В заключение следует отметить, что биокаталитические процессы отличаются от классических химических своими кинетическими характеристиками, возможностью стабилизации белка, выступающего в роли катализатора, а также теми условиями проведения реакции
в биологической среде, которые связаны с физиологическими особенностями клеток. К их
числу могут быть отнесены рост клеточной популяции микроорганизмов-продуцентов, наличие индукторов и т.п.
13
Критическими точками, определяющими целесообразность использования биокаталитического процесса, являются выход продукта и экономические показатели. Оперативное решение, как правило, легко принимается, когда нет необходимости в существенных конструктивных изменениях функционирующих технологических установок. К их числу могут быть
отнесено оборудование, используемое для процессов ферментации и последующего выделения готового продукта, а также системы для иммобилизации клеток или ферментов и т.п.
Функционально биокаталитический цикл имеет несколько позиций, определяющих процесс (рис. 2.2). Они несколько шире, чем то, что принято понимать под метаболической инженерией, хотя последняя может входить как составляющая.
Литература:
Основная – 1 [6-88].
Дополнительная – 1 [20-46].
Контрольные вопросы:
1. Биотехнологические ресурсы микроорганизмов.
2. Требования, предъявляемые промышленным микроорганизмам.
3. Микробиологический катализ (биокатализ): определение, свойства и особенности.
4. Биокаталитический цикл и его позиции.
II. Основы микробиологического производства
Тема лекции 3. Важность и разнообразие микробных продуктов
Началом эры современной промышленной микробиологии можно считать 40-е годы XX
века, когда методами ферментации стали осуществлять биосинтез пенициллина.
Факторы, влияющие на выбор между биосинтезом и химическим синтезом вещества для
промышленности:
1. Экономический (цена сырья).
При микробном брожении сырьем обычно являются полисахариды (крахмал, целлюлоза) или побочные продукты пищевой промышленности (меласса, молочная сыворотка и пр.).
При химическом синтезе сырьем служит нефть или ее производные.
2. Эффективность процесса:
- количество субстрата, превращаемого в конечный продукт;
- длительность синтеза;
- стоимость отделения продукта от культуральной среды или от искусственных реагентов синтеза;
- стоимость уничтожения отходов или побочных продуктов производственного процесса
и стоимость их возможного использования.
Микроорганизмов, синтезирующих продукты или осуществляющих реакции, полезные
для человека, несколько сотен видов. Их относят к четырем группам: бактерии, актиномицеты (филаментозные бактерии, обитающие в почве), дрожжи и плесени.
Основными элементами, слагающими биотехнологические процессы, являются биологический агент, субстрат, аппаратура и продукт.
Биологический агент является активным началом в биотехнологических процессах и
одним из наиболее важных ее элементов.
Номенклатура биологических агентов бурно расширяется, но до настоящего времени
важнейшее место занимает традиционный объект – микробная клетка (табл. 3.1).
В биотехнологических процессах возможно использование различных биологических
агентов с различным уровнем организации, от клеточной до молекулярной.
Субстраты и среды, используемые в биотехнологии, весьма разнообразны, и их спектр
непрерывно расширяется.
С развитием промышленных процессов происходит накопление новых видов отходов,
которые могут быть обезврежены и конвертированы в полезные продукты методами биотех14
нологии. С одной стороны, развивающиеся бурными темпами биотехнологические промышленные направления, сталкиваются с проблемой исчерпания традиционных видов сырья, поэтому возникает необходимость в расширении сырьевой базы, с другой, – увеличение объемов накапливающихся отходов, делает необходимым разработку нетрадиционных, в том
числе биотехнологических способов их переработки.
Таблица 3.1. Микроорганизмы, используемые в промышленности для получения целевых продуктов
Организм
Saccharomyces cerevisiae
Streptococcus thermophilus
Propionibacterium shermanii
Gluconobacterium suboxidans
Penicillium roquefortii
Aspergillus oryzae
Saccharomyces cerevisiae
Clostridium acetobutylicum
Xanthomonas campestris
Corynebacterium glutamicum
Candida utilis
Propionibacterium
Aspergilus oryzae
Kluyveromyces fragilis
Saccharomycopsis lipolytica
Bacillus
Endothia parasitica
Leocanostoc mesenteroides
Xanthomonas campestris
Penicillium chrysogenum
Chehalosporium acremonium
Rhizopus nigricans
E. coli (рекомбинантные штаммы)
Blakeslea trispora
Phaffia rhodozyma
Bacillus thuringiensis
Bacillus popilliae
Тип
Дрожжи
Бактерии
Бактерии
Бактерии
Плесень
Плесень
Дрожжи
Бактерии
Бактерии
Бактерии
Дрожжи
Бактерии
Плесень
Дрожжи
Дрожжи
Бактерии
Плесень
Бактерии
Бактерии
Плесень
Плесень
Плесень
Бактерии
Плесень
Дрожжи
Бактерии
Бактерии
Продукт
Пекарские дрожжи, вино, эль, саке
Иогурт
Швейцарский сыр
Уксус
Сыры типа рокфора
Саке
Этанол
Ацетон
Полисахариды
L-Лизин
Микробный белок
Витамин В12
Амилаза
Лактаза
Липаза
Протеазы
Сычужный фермент
Декстран
Ксантан
Пенициллины
Цефалоспирины
Трансформация стероидов
Инсулин, гормон роста, интерферон
β-Каратин
Астаксантин
Биоинсектициды
Биоинсектициды
В настоящее время наблюдается рост интереса биотехнологов к природным возобновляемым ресурсам – продуктам фотосинтеза, биоресурсам мирового океана. В состав сред для
биотехнологических процессов входят источники углерода и энергии, а также минеральные
элементы и ростóвые факторы.
Традиционно состав питательной среды, оптимальной для биотехнологического процесса, определяется методом длительного эмпирического подбора, в ходе которого на первых
этапах определяется качественный и количественный состав среды.
Аппаратура. Для различных процессов существует огромное разнообразие аппаратуры:
ферментации, выделения и получения готового продукта. Наиболее сложна и специфична
аппаратура для ферментационной стадии. Технически наиболее сложным процессом ферментации является аэробный глубинный стерильный и непрерывный (или с подпиткой субстратом). Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее сложны и энергоемки. В современной литературе описаны сотни биореакторов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от нескольких литров до нескольких тысяч кубометров).
15
Многочисленность методов культивирования, чрезвычайное многообразие используемых
биологических агентов привели к огромному разнообразию конструктивных решений, которые зависят от ряда факторов: типа продуцента и среды, технологии и масштабов производства, а также целевого продукта и пр. Техническое оснащение биотехнологии базируется на
общих положениях технической биохимии и пищевой технологии, однако имеет свою специфику.
Принципиальное отличие биотехнологических процессов от чисто химических заключается в следующем:
– чувствительность биологических агентов к физико-механическим воздействиям;
– наличие межфазового переноса веществ (по типу «жидкость – клетки», «газ – жидкость – клетки»);
– требования условий асептики;
– низкие скорости протекания многих процессов в целом;
– нестабильность целевых продуктов;
– пенообразование;
– сложность механизмов регуляции роста и биосинтеза.
Биотехнологический продукт. Биологически активные вещества - химические вещества, необходимые для поддержания жизнедеятельности живых организмов, обладающие высокой физиологической активностью при небольших концентрациях по отношению к определенным группам живых организмов или их клеткам, злокачественным опухолям, избирательно задерживая (или ускоряя) их рост или полностью подавляя их развитие.
За единицу биологической активности химического вещества принимают минимальное
количество этого вещества, способное подавлять развитие или задерживать рост определенного числа клеток, тканей стандартного штамма (биотеста) в единице питательной среды.
В настоящее время известен широкий спектр биологически активных веществ различного назначения, которые могут быть либо получены из природных живых организмов, либо
синтезированы с помощью различных химических превращений.
Природные БАВ образуются в процессе жизнедеятельности живых организмов. Они могут образовываться в процессе обмена веществ, выделяясь в окружающую среду (экзогенные) или накапливаться внутри организма (эндогенные). Эффективность синтеза БАВ зависит от физиологических особенностей живых организмов, экологических факторов. Рассмотрим БАВ микробиологического происхождения.
К экзогенным природным БАВ можно отнести:
антибиотики - органические вещества - продукты жизнедеятельности микроорганизмов
в процессе обмена веществ, выделяющиеся в окружающую среду или накапливающиеся
внутри клетки, подавляющие или угнетающие другие виды микроорганизмов;
маразмины - органические вещества, выделяемые микроорганизмами, вызывающие угнетение низших растений;
микотоксины - биологически активные вещества, вырабатываемые грибами (рода Fusarium, Aspergillus и др.) в процессе обмена веществ, которые выделяются в организм высших
растений (злаковых) при их совместном развитии, и вызывающие заболевание последних.
К эндогенным БАВ можно отнести: белки, жиры, углеводы, аминокислоты, витамины,
ферменты, гормоны, красители. Рассмотрим только некоторые из них:
Белки - природные полимеры, молекулы которых построены из остатков аминокислот.
По своему строению белки делятся на простые и сложные. Протеины (от греч. protas - первый, важный) представляют собой простые белки. К ним относятся альбумины, глобулины,
глютемины. Протеиды относятся к сложным белкам, которые кроме белковых макромолекул содержат в своем составе небелковые молекулы. К ним относятся нуклепротеиды (кроме
белка содержат нуклеиновые кислоты), липопротеиды (кроме белка содержат липиды), фосфолипиды (кроме белка содержат фосфорную кислоту). Большинство микроорганизмов способны синтезировать все входящие в их состав аминокислоты из простых веществ - углекислоты, воды и минеральных солей.
16
Витамины - низкомолекулярные органические вещества, обладающие высокой биологической активностью и выполняющие роль биорегуляторов. Организмы человека и животных не способны к синтезу витаминов. Основным источником их поступления в организм
человека и животных являются растения и микроорганизмы, которые синтезируют почти все
витамины (за исключением В12).
Ферменты - биокатализаторы белковой природы, ускоряющие обмен веществ в клетках
и имеющие молекулярную массу от 15000 до 1000000. Ферменты используются в различных
областях практической деятельности человека как биологические катализаторы. Основным
поставщиком ферментов долгое время были грибы. В настоящее время все более широкое
применение находят ферменты бактерий. Уровни накопления ферментов в клетках могут
быть повышены в 100-1000 раз путем генетического обмена и подбора питательных сред.
Лекарственные препараты являются биологически активными веществами эндо- или
экзогенной природы, законодательно разрешенные для профилактики и лечения заболеваний
человека. Эти вещества при определенных концентрациях должны оказывать четко выраженные бактерицидное, антисептическое, наркотическое, дезинфицирующее и другие действия.
Литература:
Основная – 1 [24-29], 2 [80-83; 234-238].
Дополнительная – 3 [23-67].
Контрольные вопросы:
1. Требования, предъявляемые промышленным микроорганизмам.
2. Важность и разнообразие микробных продуктов, получаемых на макроуровне.
Тема лекции 4. Основы управления ростом и метаболизмом микробов.
Культивирование микроорганизмов: методы. Культивирование микроорганизмов
зависит от состава питательной среды, физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий.
Можно выделить методы культивирования на твердых и в жидких питательных средах;
в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях. Характеристики этого процесса устанавливают путем измерения таких показателей как число клеток или их биомасса.
Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:
- культура микроорганизмов;
- питательная среда;
- аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;
- средства контроля и управления.
Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом
определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов. На
стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов
метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.
Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом
является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой - антибиотики,
ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как
внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.
В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной
среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культивирования называют поверхностным,
При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной)
среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби).
При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по
17
всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания.
Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве
большинства препаратов по следующим причинам.
1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время.
2. Процесс легко управляем.
3. Максимальная технологичность.
Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в биореакторах
(ферменторах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из
следующих этапов:
1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.
2. Приготовление посевной микробной культуры.
3. Приготовление и стерилизация питательных сред.
4. Подготовка биореактора к посеву.
Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться
следующей генеральной линии:
• Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой микрофлоры.
• Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого.
• Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней
аэрирования культуры аэробных организмов.
• Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться.
• Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая.
5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования.
Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с
применением:
А. Активной аэрации микробных культур.
Б. В покоящемся состоянии без применения механических мешалок (без аэрации).
С. В состоянии анаэробиоза.
Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации.
Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность, стерильность и
стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор
подают простерилизованную и охлажденную до 25-35°С питательную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма питательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемешивающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл скорость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до
37°С очищенным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды
в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8. Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению
асептических условий.
Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата. Оптимальная температура для разных
микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С.
Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48
ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.
18
Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, р0з, а также путём периодического
отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса).
В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота,
фосфора, биомассы, целевого продукта метаболизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры.
Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации.
Некоторые микроорганизмы относятся к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллёза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательной среды, в которой они выращиваются.
Применяют баллонный и реакторный способы культивирования.
Баллонный способ, в частности для культивирования лептоспир, заключается в том, что
микробные культуры лептоспир каждого серологического варианта выращиваются в 16литровых стеклянных баллонах с 10-12 л сывороточной или альбуминно-сывороточной
(производственной) средами при температуре 27-28°С в течение 5-7 суток.
При реакторном способе культивирование проводят в ферменторах, которые могут быть
объединены в единую технологическую цепочку. Так, на Ставропольской биофабрике при
культивировании лептоспир было смонтировано 54 реактора объёмом от 250 до 5000 л.
Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов.
К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода.
В силу биологических особенностей анаэробов методы культивирования их в промышленности имеют свои особенности.
1. При культивировании анаэробных микроорганизмов нужно в реакторах создать условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путём
заполнения анаэробостатов газовой смесью водорода и двуокиси углерода, а остаточный кислород может быть удалён путём каталитического связывания с воздухом. Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов, таких
как цистина и сульфида натрия, аскорбиновой кислоты.
2. Степень анаэробиоза определяется окислительно-восстановительным потенциалом
(Eh). Для этих целей в среду вводят окислительно-восстановительные индикаторы, чаще всего используют резазурин (диазорезоурин), меняющий цвет от сине-розового до бесцветного.
Бесцветное состояние достигается при Eh около 100 мВ и указывает на наличие анаэробных
условий.
3. При культивировании анаэробов необходимо постоянно корректировать рН среды,
поддерживая её в пределах 7,2-7,8. В процессе роста анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста.
Поддержание (хранение) культур микроорганизмов. Основная задача хранения культур – поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных
признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес для науки и практики.
Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза, т.
е. торможению процессов обмена веществ. Хранение микроорганизмов осуществляется в
специальных коллекциях типовых культур.
В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов поддерживается преимущественно
следующими методами: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием; 4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких
температур. Сравнительный анализ использования различных методов хранения культур
микроорганизмов, приведены в табл. 4.1.
Основы управления ростом и метаболизмом микроорганизмов. Факторы внешней
среды, действующие на микроорганизмы: физические; химические. Их эффект – стимулирование и угнетение роста. Например, химические вещества, используемые клеткой для поддержания жизнедеятельности; определенная температура, обеспечивающая рост и т. д.
19
Таблица 4.1. Время выживания бактерий при использовании различных методов их хранения
Род бактерий
Actinomyces
Bacillus
Bifidobacterium
Частота
пересевов,
месяцы
Под минеральным маслом
–
1
–
1
2 – 12
Еженедельно
Clostridium
6 – 12
1–2
Escherichia
1–4
1–2
Pseudomonas
1–3
–
Примечание: « – » нет данных
Время выживания, годы
После лиоПри заВ
филизации
моражистевании
рильной
почве
1–2
2–3
>30
1–2
2–3
>30
–
–
>30
–
–
–
2–3
–
1
>30
>30
>30
В жидком
азоте
>30
>30
>30
>30
>30
>30
Химические вещества или факторы физической природы, полностью или частично угнетающие рост и задерживающие развитие микроорганизмов, относят к бактериостатическим. Бактерицидные факторы вызывают гибель микроорганизмов.
Характер действия (бактерицидный или бактериостатический) зависит от концентрации
или дозы действующего агента, продолжительности контакта и вида микроорганизма.
Химические соединения по характеру действия на клетку могут быть разделены на:
1) повреждающие поверхностные структуры клетки и нарушающие проницаемость цитоплазматической мембраны (фенолы, крезолы, спирты, нейтральные мыла, поверхностноактивные вещества, некоторые антибиотики);
2) повреждающие ферменты и вызывающие нарушения обмена веществ (ионы тяжелых
металлов, спирты, активные окислители);
3) нарушающие синтез клеточных компонентов (некоторые антибиотики, антиметаболиты).
К физическим факторам, оказывающим выраженное действие на микроорганизмы, принадлежат: температура, осмотическое и гидростатическое давление, ионизирующая радиация, УФ-свет, ультразвук, механические воздействия и т. д.
Действие физических и химических факторов на микроорганизмы определяют по изменению характера роста в сравнении с культурой, не подвергшейся воздействию. Количественные данные относительно действия факторов внешней среды на микроорганизмы можно
получить только для популяции, но не для отдельных клеток.
Литература:
Основная – 1 [24-29], 2 [80-83; 234-238].
Дополнительная – 3 [23-67].
Контрольные вопросы:
1. Требования, предъявляемые промышленным микроорганизмам.
2. Техника культивирования микроорганизмов.
3. Способы и особенности культивирования микроорганизмов.
4. Факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов в культуре.
III. Промышленные микробиологические процессы
Тема лекции 5. Микробиологический синтез
Биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов. Биотехнологические процессы принципиально отличаются от процессов химического синтеза и могут
быть двух типов: периодическими и непрерывными. Специфика биотехнологических про20
цессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное влияние на процессы массопередачи (обмена веществ между различными фазами - перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами). Поэтому одним из важнейших компонентов биореакторов является система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате, оптимальность массопередачи между фазами реактора, между культуральной жидкостью и клетками и т. д.
Другим существенным различием между биотехнологическими и химическими процессами является необходимость создания аэробных или анаэробных условий, требуемых для
культивирования соответствующего организма. Поэтому в определенных случаях необходимо подавать кислород и удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую
очередь двуокись углерода (СО2).
Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны
обеспечить баланс между расходом О2 и его поступлением в нужных количествах, учитывая
тот факт, что потребность в кислороде не одинакова на различных стадиях культивирования.
Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в биореакторах,
поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной
степени от колебаний температуры. Поддержание температуры в определенном узком диапазоне диктуется: 1) резким снижением активности ферментов по мере падения температуры и
2) необратимой инактивацией (денатурацией) макромолекул (в первую очередь белков) при
ее повышении до критических значений.
Температурный оптимум у каждого организма лежит в определенных пределах. Большинство биотехнологических процессов осуществляется в мезофильных условиях (30-500С).
С одной стороны, это имеет преимущество, потому что лишь в редких случаях приходится
обеспечивать повышенный подогрев реакторов. Однако, с другой стороны, возникает проблема удаления избыточного тепла, выделяющегося при интенсивном росте культивируемых
клеток, поэтому биореактор должен быть оснащен эффективной системой охлаждения.
Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно
присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ) продукты распада жиров (мыла) и
белки (составные компоненты субстрата, например, белки соевой и кукурузной муки и т. п.).
Образующийся слой пены опять же, с одной стороны, способствует росту аэробных микроорганизмов, а с другой - сокращает полезный объем реактора и способствует заражению
культуры посторонней микрофлорой. Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения.
Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала,
так и при осуществлении и после окончания.
Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т. п. так называемые вторичные метаболиты).
Микробиологический синтез - промышленный способ получения химических соединений и продуктов, осуществляемый благодаря жизнедеятельности микробных клеток. К
микробиологическому синтезу относят также промышленные процессы, основанные на использовании иммобилизованных клеток.
При микробиологическом синтезе сложные вещества образуются из более простых в результате функционирования ферментных систем микробной клетки. Этим он отличается от
брожения, в результате которого также образуются различные продукты обмена веществ
микроорганизмов (спирты, органические кислоты и др.), но преимущественно в результате
ферментативного распада органических веществ.
21
Микробиологический синтез использует способность некоторых организмов размножаться с большой скоростью (выделены бактерии и дрожжи, биомасса которых увеличивается в 500 раз быстрее, чем у самых урожайных с.-х. культур) и к "сверхсинтезу" - избыточному образованию продуктов обмена веществ (аминокислот, витаминов и др.), превышающему
потребности микробной клетки. Такие микроорганизмы выделяют из природных источников
или получают их мутантные штаммы (напр., мутантные штаммы плесневых грибов продуцируют пенициллин в 100-150 раз быстрее, чем природные). В качестве продуцентов находят
применение культуры, полученные методами генетической инженерии, в которых функционирует чужеродный для них ген, например: в бактерии кишечной палочки (E.соli) - ген гормона роста человека.
Стадии промышленного биосинтеза
подготовка необходимой культуры микроорганизма-продуцента
выращивание продуцента
ферментация – культивирование продуцента в заданных условиях
фильтрация и отделение биомассы
выделение и очистка требуемого продукта (если это необходимо)
сушка
Рисунок 5.1. Стадии промышленного биосинтеза
Для микробиологического синтеза органических соединений в качестве сырья применяют наиболее дешевые источники азота (напр., нитраты или соли аммония) и углерода (напр.,
углеводы, спирты, жиры, углеводороды, в т.ч. газообразные).
Микробиологический синтез включает ряд последовательных стадий, главные из них
представлены на рисунке 5.1.
Ферментацию проводят в специальных реакторах – биореакторах (ферментерах), снабженных устройствами для перемешивания среды и подачи стерильного воздуха. Управление
процессом может осуществляться с помощью ЭВМ. Наиболее удобно ферментацию осуществлять непрерывным способом - при постоянной подаче питательной среды и выводе продуктов микробиологического синтеза. Однако большинство метаболитов получают периодическим способом - с выводом продукта в конце процесса.
Для выделения и очистки веществ, получаемых с использованием микробиологического
синтеза, используют экстракцию из водной фазы органическими растворителями при различных значениях рН, хроматографические методы (в т.ч. ионообменную хроматографию),
кристаллизацию, осаждение. При выделении продуктов белковой природы (ферменты, токсины) предварительно осаждают белки сульфатом аммония или органическими растворителями. Многие операции по выделению проводят на холоду вследствие нестабильности некоторых продуктов обмена веществ.
В настоящее время существуют следующие основные типы биопроцессов, основанных
на производстве: биомассы (например, белок одноклеточных); клеточных компонентов
(ферменты, нуклеиновые кислоты и т.д.), первичных метаболитов (химические продукты ме22
таболической активности), такие как этанол, молочная кислота; вторичных метаболитов;
односубстратных конверсий (превращение глюкозы во фруктозу); многосубстратных конверсий (обработка сточных вод, утилизация лигноцеллюлозных отходов).
Промышленные микробиологические процессы можно разбить на 5 основных групп:
1. Выращивание микробной биомассы.
2. Получение продуктов метаболизма микроорганизмов.
3. Получение ферментов микробного происхождения.
4. Получение рекомбинантных продуктов.
5. Биотрансформация веществ.
Литература:
Основная – 1 [24-29], 2 [239-243].
Дополнительная – 3 [23-67].
Контрольные вопросы:
1. Стадии микробиологического синтеза.
2. Основные типы биопроцессов.
3. Промышленные микробиологические процессы.
Тема лекции 6. Белок одноклеточных. Выращивание микробной биомассы
Выращивание микробной биомассы. Микробные клетки сами по себе могут служить
конечным продуктом производственного процесса.
В промышленном масштабе получают два основных типа микроорганизмов:
1) дрожжи, необходимые для хлебопечения, и
2) одноклеточные микроорганизмы, используемые как источник белков, которые можно
добавлять в пищу человека и животных.
Преимущества микроорганизмов как продуцентов белка состоит в высоком содержании
белка в биомассе и высокой скорости роста микроорганизмов.
Термин белок одноклеточных (БОК) был предложен в 1966 г. для обозначения биомассы
различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов и водорослей). Кроме высокого содержания белка микробная биомасса содержит также жиры, нуклеиновые кислоты, витамины и минеральные компоненты.
Для получения БОК используют самые разнообразные субстраты, включая парафины
нефти, метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку, мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства.
Для промышленного использования перспективными являются термофильные (растущие при высоких температурах до 50о С) микроорганизмы. Качество биомассы оценивается
по трем основным показателям:
- высокому содержанию белка;
- низкому содержанию нуклеиновых кислот и
- отсутствию вредных веществ.
Как пример промышленного производства биомассы можно привести получение хлебопекарных дрожжей, молочнокислых бактерий и др.
По данным ряда специалистов, мировой дефицит белка оценивается в 30-35 млн. т. Причем степень дефицита варьирует в зависимости от страны и должна рассматриваться в рамках каждой национальной экономики. Сдвиг от злаковой к мясной диете в различных странах приобретает разительные масштабы и ведет к увеличению расхода зерна в пересчете на
человека, поскольку требуется от 3 до 10 кг зерна, чтобы произвести 1 кг мяса путем повышения эффективности животноводства и совершенствования кормовых программ.
Поиски дополнительных источников белка предпринимаются постоянно и повсеместно.
Определенные успехи достигнуты в получении белка с помощью микробного синтеза. Это
направление получило название производства одноклеточного белка (SCP), поскольку боль23
шинство микроорганизмов, используемых для этих целей, растут в виде одноклеточных или
мицелиальных (нитевидных) особей, а не как сложные многоклеточные организмы (растения
или животные).
Преимущества микроорганизмов как продуцентов белка состоят в следующем:
- микроорганизмы обладают высокой скоростью накопления биомассы, которая в 5005000 раз выше, чем у растений и животных;
- микробные клетки способны накапливать очень большие количества белка (дрожжи до 60%, бактерии - до 75% по массе);
- в микробиологическом производстве вследствие высокой специфичности микроорганизмов отсутствует многостадийность процесса;
- процесс биосинтеза осуществляется в мягких условиях при температурах 30-45°С, рН
3-6 и давлении около 0,1 МПа;
- микробиологический путь получения богатой белком биомассы менее трудоемкий по
сравнению с получением сельскохозяйственной продукции и органическим синтезом белка.
Основной целью продукции одноклеточного белка является его содержание в препарате.
Однако следует иметь в виду, что помимо белка микроорганизмы содержат также и другие
вещества: углеводы, витамины, нуклеиновые кислоты и различные минеральные соединения,
часть из которых может оказывать и неблагоприятное действие на организм, при использовании в пищу человека или животных. Так, вследствие ограниченной способности человека
деградировать нуклеиновые кислоты, прежде чем использовать одноклеточный протеин в
качестве пищевого продукта, он должен подвергаться специальной обработке.
Природа сырьевого материала, используемого в производстве одноклеточного белка,
представляет известную опасность: например, потенциальная канцерогенность углеводородов нефти и н-парафинов, наличие тяжелых металлов или других загрязняющих примесей в
минеральных солях, присутствие остатков растворителей после экстракции продукта, а также токсинов (в частности, микотоксинов), образуемых некоторыми микроорганизмами (например, определенными грибами), и т. д.
Одноклеточный белок на высокоэнергетических субстратах.
Представляющие существенное коммерческое значение как источники энергии материалы (нефтегаз, метанол, этанол, метан и н-алканы) привлекают внимание биотехнологов как
субстраты ряда биотехнологических процессов, главными участниками которых являются
бактерии и дрожжи.
Наиболее подробно как сырье для получения одноклеточного белка изучался метан, хотя
в настоящее время в его использовании для указанной цели имеется достаточно большое количество трудностей. В противоположность этому, большое значение придается метанолу.
Весьма подходящим сырьем для получения одноклеточного белка, предполагаемого к
использованию в пищу человека, является этанол. В скором времени перспективы производства одноклеточного белка на этаноле будут определяться рядом локальных факторов: возможностями расщепления этилена, наличием излишков углеводов сельскохозяйственного
происхождения, политическими ситуациями в региональной экономической самостоятельности, а также состоянием уровня мирового производства.
Одноклеточный белок на отходах.
Рециклизация отходов растений, появляющихся в различного рода производствах (таких, как солома, выжимки, отходы цитрусовых, сыворотка молока, меласса, навоз животных
и бытовые сточные воды), представляет существенную проблему биотехнологии.
В отдельных местах количество таких отходов достигает значительных величин, что является источником серьезного загрязнения различных водных систем и вообще окружающей
среды. Поэтому использование указанных органических отходов может способствовать достижению двух целей: снижению загрязнения и созданию пищевого белкового препарата.
Привлекательность растительных отходов, содержащих углеводы, состоит в их низкой
стоимости, в результате чего удешевляется биотехнологический процесс, а также в том, что
одноклеточный белок может быть получен при относительно небольшом количестве опера24
ций.
Обоснованием для разработки технологии производства одноклеточного белка на растительных отходах является их пригодность для микробной конверсии, наличие в достаточных
количествах и в течение длительного периода, а также уровень уже имеющихся технологий.
Одноклеточный белок из сельскохозяйственного сырья.
Концепция производства растительной биомассы в качестве материала для биотехнологических процессов крайне актуальна и важна. В настоящее время такого рода программы
используются в большей степени для производства этанола, но вполне обоснованно полагать, что маниока, сахарный тростник и некоторые виды пальм могут явиться перспективным сырьем, которое подвержено быстрым ферментативным обработкам с достаточно высоким экономическим эффектом.
Одноклеточный белок из водорослей (хорошо растут в открытых прудах и нуждаются
только в СО2 как источнике углерода, а также в солнечном свете как источнике энергии для
фотосинтеза). например, водоросли, как Chlorella и Scenedesmus, долгое время использовались в пищу в Японии, a Spirulina широко применялась в Африке и Мексике.
В некоторых странах мира водоросли выращивают в прудах или лагунах для удаления с
их помощью ряда органических загрязнений, а образующуюся массу собирают, высушивают
и добавляют в порошкообразном виде в корм животным.
Получение рекомбинантных продуктов. Технология рекомбинантных ДНК позволяет
включать гены высших организмов в геном бактерий. В результате, бактерии приобретают
способность синтезировать "чужеродные" (рекомбинантные) продукты - соединения, которые прежде могли синтезировать только высшие организмы. На этой основе было создано
множество новых биотехнологических процессов для производства человеческих или животных белков, ранее недоступных или применявшихся с большим риском для здоровья.
Первым рекомбинантным белком, полученным в промышленных масштабах, был человеческий гормон роста. Для лечения гемофилии используют один из белков системы свертывания крови, а именно фактор VIII. До того как были разработаны методы получения этого
белка с помощью генной инженерии, его выделяли из крови человека; применение такого
препарата было сопряжено с риском заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).
Первый рекомбинантный инсулин поступил в продажу в 1982, а к концу 1980-х годов он
практически вытеснил инсулин животных.
Многие другие белки синтезируются в организме человека в очень небольших количествах, и единственный способ получать их в масштабах, достаточных для использования в
клинике, - технология рекомбинантных ДНК. К таким белкам относятся интерферон и эритропоэтин. Эритропоэтин совместно с миелоидным колониестимулирующим фактором регулирует процесс образования клеток крови у человека. Эритропоэтин используется для лечения анемии, связанной с почечной недостаточностью, и может найти применение как средство, способствующее повышению уровня тромбоцитов, при химиотерапии раковых заболеваний.
Литература:
Основная – 1 [24-29], 2 [239-243].
Дополнительная – 3 [23-67].
Контрольные вопросы:
1. Выращивание микробной биомассы.
2. Белок одноклеточных: технология и применение.
3. Рекомбинантный белок.
IV Продукты метаболизма микроорганизмов на макроуровне
Тема лекции 7 Биотехнологическое производство аминокислот
Первичные метаболиты. Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 дальтон), необходимые для роста микробов; одни из
25
них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов.
Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, растворители и
витамины.
Микробные клетки, как и клетки других живых существ, не производят избытка первичных метаболитов, что было бы расточительно и уменьшало способность к выживанию.
Имеются, однако, микробные штаммы с нарушениями регуляции синтеза этих метаболитов,
которые и служат исходными штаммами для промышленных процессов.
В самом деле, многие аминокислоты и нуклеотиды производятся в процессе ферментации, осуществляемых ауксотрофами (т. е. микробами, нуждающимися для воспроизведения в факторах роста), в метаболических путях которых нарушены процессы регуляции синтеза ферментов.
Штаммы Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum превращают более
трети сахаров, содержащихся в культуральной среде, в лизин; так получается не менее 75 г
лизина на 1 л среды.
Лизин — конечный продукт разветвленного метаболического пути, который также
ведет к синтезу метионина и треонина.
Лизин и треонин регулируют этот путь, взаимодействуя с его первым ферментом —
аспартаткиназой; накопление обеих аминокислот ингибирует активность этого фермента.
Первый тип мутаций в гене, кодирующем гомосериндегидроге-назу, нарушает активность
этого фермента и блокирует синтез треонина и метионина; в результате удаляется один из
ингибиторов этого фермента (треонин).
Затем такой ауксотрофный мутант выращивают в среде, содержащей достаточно треонина и метионина для поддержания роста, однако имеющегося треонина мало для прекращения биосинтеза лизина, который продолжается с нормальной скоростью, что приводит к
его накоплению.
Мутации второго типа изменяют аспартаткиназу таким образом, что она перестает
взаимодействовать с лизином и более не чувствительна к ингибированию по принципу обратной связи этой аминокислотой; последняя накапливается в мутантных клетках и затем в
культуральной среде. Мутации второго типа могут быть отобраны, так как они придают
клеткам устойчивость к соединению, называемому АЕС, которое настолько сходно с лизином, что имитирует его регуляторную функцию и полностью блокирует аспартаткиназу. В
присутствии АЕС клетки дикого типа погибают (так как они не способны синтезировать лизин), а мутантные штаммы выживают.
Таким образом, мутагенные факторы могут изменить нормальный биосинтез аминокислот в клетке, воздействуя на генетический аппарат. Если в результате облучения или воздействия химических факторов ДНК не дает информацию для синтеза фермента и в клетке
не синтезируется, например фермент гомосериндегидрогеназа, катализирующий превращение полуальдегида аспарагиновой кислоты в гомосерин, то клетка может синтезировать необходимые для своего существования белки только в том случае, если в питательной среде
уже содержится готовый гомосерин. Так как аспарагиновая кислота является исходным
пунктом биосинтеза не только гомосерина, но и треонина, изолейцина, метионина, а также
лизина, то отсутствие упомянутого фермента влияет на биосинтез всех этих аминокислот.
Прекращение биосинтеза гомосерина одновременно прекращает биосинтез треонина, изолейцина и метионина, поэтому эти аминокислоты также должны содержаться в среде роста
данной культуры. В данных условиях весь ход биосинтеза аминокислот в клетке идет в направлении от аспарагиновой кислоты к лизину.
В результате изучения ауксотрофных мутантов выяснено, что:
- продуценты орнитина являются аргинин - или цитруллиндефицитными;
- продуценты гомосерина или диаминопимелиновой кислоты— треониндефицитными;
26
- продуценты изолейцина — лизин-дефицитными;
- продуценты тирозина — фенилаланиндефицитными.
Иногда встречаемые в природе бактерии способны в процессе роста накопить в среде
до 2—5 г/л свободных аминокислот, но ауксотрофные мутанты продуцируют их в значительно больших количествах — 20—100 г/л.
Схема образования аминокислот семейства аспарагиновой кислоты приведена ниже:
аспарагиновая кислота
диаминопимелиновая
кислота
β-аспартнл-фосфат
полуальдегид
аспарагиновой
кислоты
лизин
реакция блокирована из-за отсутствия фермента гомосериндегидрогеназы
гомосерин
цистин
треонин
цистатин
изолейцин
гомоцистеин
метионин
Из 20 аминокислот, составляющих белки, восемь не могут синтезироваться в организме человека; эти незаменимые аминокислоты должны содержаться в пище. Особенно
важны метионин и лизин.
Метионин производится синтетически, тогда как 80% лизина — биосинтетически (в
1980 г. путем ферментации было произведено 40 000 т лизина). Интерес к микробиологическому синтезу аминокислот объясняется также тем, что этот процесс приводит к получению
биологически активных изомеров (L-аминокислот), в то время как при химическом синтезе
получаются равные количества обоих изомеров. Поскольку их трудно разделить, половина
продукции оказывается биологически бесполезной.
В настоящее время установлено, что лизин в организме является не только структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимических функций — является
предшественником карнитина и оксилизина, способствует транспорту кальция и стронция в
клетки и др. В настоящее время во многих странах препарат лизина добавляют к хлебу для
повышения его биологической ценности, а также для улучшения внешнего вида. Доказано,
что лизин улучшает аппетит, способствует секреции пищеварительных ферментов, предотвращает кариес зубов у детей.
Лизин является самой дефицитной в кормах животных незаменимой аминокислотой.
Установлено, что добавка лизина в количестве 0,1—0,4% к кормам значительно увеличивает
продуктивность домашних животных.
Для биосинтеза лизина используют гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных
бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium и др.
Продуценты лизина культивируются на средах, содержащих углеводы или уксусную
кислоту, источники азота и кислород. В клетках бактерий лизин синтезируется из пировиноградной, аспарагиновой и янтарной кислот.
Для нормального роста и биосинтеза лизина культурой Brevibacterium sp. 22 оптимальной считается концентрация треонина в 800 мг, метионина — 200 мг на литр питательной среды. Кроме того, для развития культуры необходим тиамин в концентрации 200 мкг на
1 л среды. Важным регулятором процесса является биотин. Одна и та же культура Brevibacte27
rium sp. 22 при концентрации биотина в среде, равной 1—4 мкг/л, продуцирует глутаминовую кислоту, а при концентрации 15— 20 мкг/л — лизин. Считают, что биотин изменяет
проницаемость клеточной оболочки. При концентрации биотина 2,5 мг/л стимулируется
также образование молочной кислоты.
Важную роль играет треонин, являясь обязательным фактором роста на начальном
этапе ферментации. Однако концентрация его не должна быть большой, так как на дальнейших этапах ферментации (при синтезе лизина) он может действовать как ингибитор фермента аспартаткиназы. Присутствие лизина усиливает ингибирующие свойства треонина.
Среду для получения лизина готовят из мелассы (7—12% •сахара), кукурузного экстракта (1—2%), солей аммония (1 — 2%), одно- и двузамещенного фосфата калия (по
0,05%). После стерилизации такую среду используют для выращивания посевного материала, а также и для главной ферментации.
Сначала культуру размножают на качалке в колбах, затем в ферментаторах объемом
100 и 3000 л. Количество посевного материала 5—10%, оптимальная температура 30—33°С,
рН 7,4. Длительность ферментации посевного материала на каждой стадии около 24 ч.
Главная ферментация идет 50—70 ч при аналогичных режимах. Концентрация лизина
в растворе достигает 20—40 г/л, а выход по сахару — 25—35%. Концентрация клеточной
биомассы 10—15 г/л (по сухой массе).
Триптофан используют в медицине, а также как реагент в биохимических исследованиях; в небольших количествах он требуется для нужд животноводства. Триптофан получают из антраниловой кислоты, используя особые штаммы дрожжей Candida или Hansunella.
Антраниловая кислота ядовита. Синтезируя триптофан, упомянутые дрожжи освобождают
клетки от этого вредного соединения, превращая его в важную для биосинтеза белков аминокислоту. Для размножения дрожжей можно использовать мелассу, диффузионный сок сахарной свеклы, сахарозу или другие среды, содержащие усваиваемые источники углерода.
Глутаминовая кислота, которая в виде натриевой соли применяется в качестве специи, синтезируется исключительно культурами Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum. В США в 2006 г. в пищевой промышленности нашло употребление 60 000 т
продукта, причем треть была импортирована из Южной Кореи и Японии, где в это время
производилось 300 000 т глутамата (эджайномото) и 200 000 т лизина. Субстратом для этих
видов ферментации служит глюкоза, однако в конце 1960-х гг. использовали n-парафины,
что объяснялось их избытком и дешевизной.
Синтез глутаминовой кислоты имеет место при концентрации биотина 2—3 мкг/л.
Для микробиологического получения глутаминовой кислоты и глутамата натрия
культуру размножают в лаборатории сначала в пробирках, затем в колбах на качалке. Питательная среда содержит 5% сахарозы, 1 % мочевины, 1,5% мелассы и по 0,1% сульфата магния, одно- и двухзамещенного фосфата калия; рН 6,8—7,5, температура 30°С. Инкубация на
каждой стадии длится 24 ч. Инокулят готовят в аэробных условиях на среде такого же состава в ферментаторах объемом 200 л и 5 м3 до получения 6— 8 г/л сухой биомассы. Инокулят в
количестве 5— 6% переносят в главный ферментатор объемом 50 м3, 70% общего объема которого занимает питательная среда. Состав среды следующий: 8,5—10% сахарозы, 1,2% мелассы, 0,5% мочевины, по 0,1% одно- и двухзамещенного фосфата калия, по 0,01% сульфата
марганца и сульфата цинка. Интенсивность аэрации 40—45 мг 02л/мин, рН 7,8—8, температура 30°С. Ферментация длится 2 сут. За это время в среде накапливается глутаминовой кислоты до 50 г/л.
Еще одним потенциальным субстратом, не столь дорогим, как глюкоза, является уксусная кислота (Основным субстратом для производства лизина и глутаминовой кислоты
служит патока (меласса) — отход производства сахара).
Когда Corynebacterium glutamicum растет в среде с меньшей, чем оптимальная,
концентрацией биотина, нарушается синтез мембранных фосфолипидов, в результате глутамат натрия проходит через мембрану и накапливается в среде. То же происходит при добав-
28
лении к культуральной среде пенициллина: этот антибиотик подавляет синтез клеточной
стенки и тем самым способствует выделению аминокислот.
Промышленное производство аминокислот, особенно лизина и метионина, будет развиваться не только для питания людей, но и для получения добавок в комбикорм скота. Компания «Евролизин» в Амьене (Франция) ассигновала 27 млн. долл., чтобы добиться удвоения
производства лизина.
Растет также спрос на глицин, аланин и цистеин: первые две аминокислоты используются как приправы, а третья — для создания пористой структуры хлеба. Повышение спроса объясняется также использованием определенных аминокислот для лечения заболеваний
желудка и печени.
Литература:
Основная – 1 [24-29], 2 [239-243].
Дополнительная – 3 [23-67].
Контрольные вопросы:
1. Что собой представляют первичные метаболиты.
2. Биотехнология производства аминокислот.
3. Какие культуры используются для производства аминокислот?
Тема лекции 8. Биотехнологическое производство органических кислот
Микробиологическим путем из углеводов, спиртов нли даже углеводородов можно
получить различные органические кислоты — уксусную, молочную, лимонную, янтарную,
итаконовую, фумаровую, глюконовую, α-кетоглутаровую и др.
Продуцентами этих кислот могут быть бактерии, плесневые грибы или дрожжи. Микроорганизмы, продуцирующие молочную кислоту, а также вызывающие спиртовое брожение, в ходе эволюции приспособились к анаэробному образу жизни. Уксусная и лимонная
кислоты, в свою очередь, образуются в аэробных условиях. По-видимому, кислоты играют
определенную роль в борьбе с конкурирующей микрофлорой, а также являются резервными
источниками углерода. Так, Aspergillus niger после использования сахара могут использовать
в качестве субстрата лимонную кислоту. В свою очередь уксуснокислые бактерии при отсутствии спирта в среде ассимилируют уксусную кислоту, окисляя ее до воды и СО2.
Уксусная кислота. Важнейшей промышленной органической кислотой является уксусная кислота. Она используется при производстве резины, пластмасс, ацетатных волокон,
фармацевтических препаратов, инсектицидов и т. д. В Японии уксусная кислота применяется
как субстрат при ферментации для производства аминокислот. В США в 2006 г. производилось свыше 2,0 млн. т этой кислоты (не считая уксуса); рыночная стоимость составляла
более 800 млн. долл. Окисление этанола в уксусную кислоту посредством уксуснокислых
бактерий экономически выгодно лишь при получении уксуса. Общепринятый химический
синтез основан на карбонилировании метанола. Проводились исследования по сбраживанию
целлюлозы в уксусную кислоту под действием термофильных бактерий. Кроме того, отметим, что Clostridium aceticum и Acetobacter woodii способны превращать в уксусную кислоту углекислый газ и водород. Однако развитие связанных с этим производственных процессов зависит от дальнейшего изучения упомянутых бактерий.
Для полученного микробиологическим путем уксуса характерны приятный аромат и
вкус за счет образования в процессе брожения небольших количеств эфиров, например этилацетата, а также спиртов и кислот.
Уксуснокислые бактерии принадлежат к роду Acetobacter. Это длиной в 0,5—8,0 мкм
грамотрицательные, образующие споры палочки с жгутиками.
Реакцию образования уксусной кислоты катализирует фермент алкогольоксидаза. Для
этого процесса оптимальны реакция среды рН 3,0 и температура 28°С для культуры Bact.
schutzenbachi, для культуры Bact. curvum — 35—37°С. Концентрация спирта в среде 1—15%.
29
конечная концентрация кислоты 8—14% (в среднем 10%). Если в процессе брожения в среде
кончается спирт, происходит окисление уксусной кислоты
Надо следить за тем, чтобы в конце процесса в среде содержалось 0,3—0,5% неиспользованного спирта. Во время брожения необходимо обеспечить хорошую аэрацию - теоретически на 46 частей по массе спирта необходимы 32 части кислорода.
В промышленности уксуснокислое брожение ведут в вертикальных генераторах по
непрерывному методу. Производительность генератора 2,9 кг 100% уксусной кислоты на 1
м3 стружек за сутки. Теоретически из 100 л безводного спирта можно получить 103 кг уксусной кислоты, практически получают 75—93 кг уксусной кислоты, так как имеют место потери вследствие переокисления, неполного окисления спирта, а также испарения. В настоящее
время широко используют метод рециркуляции, по которому вытекающий раствор многократно возвращают в генератор.
Лимонную кислоту получают из мелассы при помощи Aspergillus niger. В 2006 г.
мировое производство лимонной кислоты составляло более 500 000 т; ее рыночная стоимость составляла более 400 млн. долл. Ферментативное производство может стать экономически более выгодным, если в качестве субстрата использовать целлюлозу. Целлюлозу в
принципе можно разложить под действием штаммов A. niger, в которые будут перенесены
гены целлюлаз.
Рис. 8.1. Схема получения лимонной кислоты:
1 — мелассное хранилище, 2 — насосы, 3 — резервуар для растворения мелассы, 4 — стерилизатор, 5 — камера брожения, 6 — сборник сброженной жидкости, 7 — нейтрализатор, 8
н ю — нутч-фильтры, 9 — реактор, 11 — сборник, 12 — вакуум-аппарат, 13 — повторный
растворитель, 14 — фильтр-пресс, 15 — кристаллизатор, 16 — центрифуга, 17 — сушилка, I8
— сборник, 19 — готовая продукция.
Лимонная кислота СН2СООН—СОНСООН—СН2СООН широко распространена в
фруктах — смородине, клюкве, лимонах и т. д.
Лимонную кислоту микробиологическим методом получают, используя главным образом микроскопические плесневые грибы Aspergillus niger, выращиваемые методом поверхностного культивирования.
Химизм процесса образования лимонной кислоты связан с реакциями цикла Кребса.
Лимонная кислота образуется из уксусной и щавелевоуксусной кислот.
Экспериментально из потребленного сахара получают 98% лимонной кислоты, однако на практике выход продукта меньше, так как всегда имеют место различные побочные
процессы. В культуральной жидкости можно обнаружить не только кислоты цикла Кребса —
аконитовую, янтарную, фумаровую и яблочную, но иногда до 0,5% глюконовой, сахарной,
щавелевой и малоновой кислот.
30
Технология производства лимонной кислоты из мелассы методом поверхностного
культивирования показана на рис. 8.1.
Пропионовую кислоту СНз—СН2—СООН продуцируют пропионовокислые бактерии. В производстве сыра они способствуют образованию специфического вкуса. Пропионовую кислоту как растворитель используют в производстве душистых веществ. В химикофармацевтической промышленности она используется в качестве сырья. Для промышленного получения пропионовой кислоты используют различные культуры бактерий, например
Propionibacterium freudenreichii, P. shermanii, P. rubrum и др. Это грамположительные факультативно анаэробные бактерии, не образующие споры. Бактерии этой группы являются активными продуцентами витамина В12.
Пропионовую кислоту получают в анаэробных условиях методом глубинного культивирования. Используют среду, содержащую 2% глюкозы и источник органического азота,
как, например, дрожжевой экстракт, а также соли молочной кислоты. Процесс идет в нейтральной среде (рН 6,8—7,2), при температуре 30°С, длится 7—12 сут. В процессе брожения
накапливается про-пионовая, уксусная кислоты (5:1) и выделяется углекислый газ. Примерно
75% сахара потребляется на образование кислот, а 20% — на образование углекислого газа.
Молочная кислота — первая из органических кислот, которую начали производить
путем брожения. Она находит широкое применение в качестве окислителя в пищевой промышленности, как протрава в текстильной промышленности, а также в гальваностегии и
производстве пластмасс. По данным 2006 г., в США и Европе ежегодно производилось 120
000 т молочной кислоты на общую сумму 160 млн. долл.. Практически вся производимая в
США молочная кислота синтезируется химическим путем, тогда как в Европе половину общего количества получают при сбраживании глюкозы Lactobacillus delbrueckii (принадлежат к термофильным бактериям с оптимумом температуры развития 45—50°С). В микроскопе они видны в виде длинных палочек.
Молочную кислоту в промышленных условиях получают методом анаэробной глубинной ферментации. В качестве основного сырья используют мелассу, сахарозу, гидролизаты крахмала. Концентрация сахара в среде 5—20%, температура 48—50°С, рН 6,3—6,5. Во
время ферментации рН среды поддерживают при помощи мела, который добавляют 3—4
раза в сутки.
На процесс молочнокислого брожения положительное влияние оказывают биологически активные вещества. С этой целью к среде добавляют вытяжку солодовых ростков. Продолжительность ферментации 7—11 сут.
По окончании ферментации в среде остается 0,5—0,1 % сахара и 11—14% лактата
кальция. Осадок мела и коллоиды отделяют фильтрованием или отстаиванием при 80—90°С.
Фильтрат упаривают до концентрации 27—30%, затем охлаждают до 25—30°С и выдерживают в кристаллизаторах 36—48 ч. Кристаллы лактата отцентрифугировывают (выход их составляет 50—55%). Осуществляя кристаллизацию из слабых растворов, удается увеличить
выход кристаллов до 95%.
Ключевым фактором при нескольких видах брожения является нехватка определенных металлов. Так, производство лимонной кислоты при помощи Aspergillus niger происходит при нехватке железа и марганца, для продуцирования фумаровой кислоты Rhizopus
negricans нужна нехватка цинка.
Литература:
Основная – 1 [], 2 [].
Дополнительная – 1 [].
Контрольные вопросы:
1. Что собой представляют органические кислоты?
2. Какие микроорганизмы используются для производства органических кислот?
3. В каких промышленных условиях получают органические кислоты?
31
Тема лекции 9 Биотехнологическое производство вторичных метаболитов
Вторичные метаболиты, называемые также идиолитами,— низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Они производятся ограниченным
числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе.
К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.
Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию
быстрого роста, тропофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По
мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных
веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период
синтезируются идиолиты. В случае антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе
тропофазы чувствительно к собственным антибиотикам, однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми. Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики,
от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и затем культивировать микроорганизмы в этой фазе.
Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые
агенты, противоопухолевые лекарства и алкалоиды. Экономическая важность антибиотиков
наглядно проявляется в стоимости мирового сбыта четырех наиболее распространенных
групп антибиотиков — пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов и эритромицинов: в
2008 г. она составляла свыше 20 млрд. долл.
Шесть родов филаментозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков,
в том числе цефалоспорины (Cephalosporhun) и пенициллины (Penicillium). Два рода нефиламентозных бактерий синтезируют 500 антибиотиков, а три рода актиномицетов — около 3000 антибиотиков. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces,
включая тетрациклины (один только вид Streptomyces griseus синтезирует более пятидесяти антибиотиков).
В 1945 г. Бротзу из Института гигиены в Кальари (Сардиния) выделил из пробы морской воды плесень Cephalosporium acremonium, синтезирующую несколько антибиотиков;
один из них, цефалоспорин С особенно эффективен против устойчивых к пенициллину
грамположительных бактерий.
В период между концом 1940-х и началом 1970-х гг. количество ежегодно открываемых антибиотиков возрастало линейно: ежегодно описывали примерно 200 новых соединений. В конце 1970-х гг. антибиотики обнаруживали со скоростью 300 соединений в год, из
них 150 продуцировались актиномицетами.
К 1978 г. из 5500 известных антибиотиков в продаже имелись только 100, большая
часть которых (69) была получена из стрептомицетов. Наиболее распространенными с коммерческой точки зрения оказались пенициллины, цефалоспорины и тетрациклины. Из общей
стоимости сбыта антибиотиков, в 2008 г. составляющей 20,2 млрд. долл., около 5 млрд.
долл. приходилось на долю пенициллинов, примерно 2500 млн. долл. — на долю цефалоспоринов и 4 млрд. долл.— на долю тетрациклинов. В 2008 г. мировое производство антибиотиков составляло примерно 85 000 т, из них 40 000 т—пенициллины, 20 000 т— тетрациклины,
15 000 т — цефалоспорины и 10 000 т — эритромицины.
Начиная с середины 1960-х гг. в связи с возросшей сложностью выделения эффективных антибиотиков и распространением устойчивости к наиболее широко применяемым соединениям у большого числа патогенных бактерий исследователи перешли от поиска новых
антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Они стремились повысить эффективность антибиотиков, найти защиту от инактивации ферментами устойчивых бактерий и
улучшить фармакологические свойства препаратов. Большинство исследований было сосредоточено на пенициллинах и цефалоспоринах, структура которых включает четырехчленное
β-лактамное кольцо. Добавление к β-лактамному кольцу метоксильной (СНзО-)-группы при32
вело к появлению цефамицинов, близких к цефалоспоринам и эффективных как против грамотрицательных, так и против пенициллинустойчивых микробов. Полусинтез состоит в замене химическим путем одной боковой цепи β-лактамного кольца на другую в полученной
ферментацией молекуле.
В случае пенициллинов полусинтетический подход реализуется для пенициллина G,
который непрерывно синтезируется Penicillium chrysogenum в присутствии фенилуксусной
кислоты. Например, 14 ферментеров емкостью 100 000 л производят после 200 ч ферментации и 15 ч экстракции и очистки натриевую соль пенициллина G 99,5%-ной чистоты. Фенилуксусная кислота — предшественник бензильной боковой цепи молекулы антибиотика. Пенициллин G вводят в ферментационный бульон бактерий, секретирующих ацилазы. Эти
ферменты удаляют бензильную группу молекулы, в результате появляется 6аминопенициллановая кислота (6-АРК). Эта кислота — слабый антибиотик, но она очень
удобна для присоединения боковых групп, которые повышают активность антибиотика (рис.
9.1).
I
Фенетициллин
Ампициллин
Пенициллин G
Метициллин
II
Оксациллин
Пенициллин F
III
Пенициллин К
Рисунок 9.1. Структура некоторых природных (III) и полусинтетических (I, II) пенициллинов
В случае цефалоспорина С полусинтетический подход состоит в присоединении боковых цепей к 7-а-аминоцефалоспориновой кислоте (7-АСА), которую получают, удаляя
амидную боковую цепь цефалоспорина С. Таким путем получают набор полусинтетических
цефалоспоринов.
33
К 1974 г. производство полусинтетических антибиотиков достигло следующих объемов: пенициллинов — 20 000, цефалоспоринов — 4000, тетрациклинов — 2500, рифамицинов—1000, канамицинов — 500, хлорамфениколов — 500 т.
Устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам связана с наличием ферментов, так
называемых β-лактамаз, которые широко распространены среди бактерий, актино-мицетов,
цианобактерий и дрожжей. Так как гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе
плазмид, устойчивость может передаваться при переносе плазмид от одного бактериапьного
штамма к другому. Исследователи фирмы «Мерк, Шарп и Доум» открыли новый класс βлактамных антибиотиков, тиенамицины, продуцируемых Streptomyces cattleya.
Тиенамицины чрезвычайно эффективны против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также способны ингибировать β -лактамазы, что значительно повышает
возможности этих антибиотиков. К ингибиторам β -лактамаз относятся также клавулановая и
оливановая кислоты, идентифицированные исследователями английской фармацевтической
компании «Бичем». Компания выпустила новый антибиотик, аугментин, который представляет собой комбинацию β -лактамного антибиотика амоксициллина и клавулановой кислоты.
Литература:
Основная – 1 [], 2 [].
Дополнительная – 1 [].
Контрольные вопросы:
1. Что собой представляют вторичные метаболиты?
2. Какие микроорганизмы используются для производства вторичных метаболитов?
3. В каких промышленных условиях получают вторичные метаболиты?
Тема лекции 10. Биотехнологическое производство антибиотиков
Антибиотики - специальные продукты жизнедеятельности микроорганизмов и их модификации, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусам, биктериям, грибам, водорослям) или к злокачественным опухолям. Нужны в очень малых концентрациях (обладают высокой специфичностью). Используются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности как консерванты). Известно около 6000 антибиотиков, которые продуцируются грибами, стрептомицетами (50%), бактериями. В медицинской практике используются
около 100 антибиотиков. Получают аантибиотики путем химической или биохимической
трансформации (Г+ - пенициллин, эритромицин; Г- тетрациклин, стрептомицин).
Антибиотики вырабатываются микроорганизмами в результате совместного действия
продуктов 10 — 30 генов, что усложняет использование генно-инженерных подходов для
управления их синтезом. Однако данная проблема разрешима в тех случаях, когда синтез антибиотиков определяется мультиферментными комплексами, кодируемыми одним опероном
(например, в случае антибиотиков пептидной природы). Это открывает новые перспективы в
биотехническом получении антибиотиков. Внедрение соответствующих генов из одного
микроорганизма в клетки другого близкородственного может приводить к получению «гибридного» антибиотика, обладающего новыми свойствами. Этот подход был успешно применен в 1988 г. биохимиком Михаэлем Хопвудом в США. При объединении генов биосинтеза
актинородина и медермицина был получен новый антибиотик, получивший название «медерродин». В другом случае этот же автор создал штамм, продуцирующий «гибридный» антибиотик дигидрогранатиродив. Высокая продуктивность штаммов микроорганизмов иногда
достигалась за счет увеличения в клетках количества копий генов биосинтеза антибиотика.
Таким образом, удалось, например, существенно увеличить выход актинородина.
Широко применяют антибиотики в медицине, сельском хозяйстве (для лечения, а
также для улучшения роста и развития молодняка), в пищевой промышленности (консервирующие средства). В 1987 г. за рубежом стоимость всех антибиотиков, использованных в качестве антибактериальных препаратов, составила 3,5 млрд. долл.; в 1992 г. она достигнет 4,2
34
млрд. долл.; в 2006г. – более 7 млрд.дол.
Антибиотики — самый большой класс фармацевтических препаратов, которые синтезируются микроорганизмами. Некоторые из антибиотиков используют в сельском хозяйстве
против различных сельскохозяйственных вредителей (например, полиоксин, баридакицин,
косгалицин), другие — в медицинских целях (пенициллины, тетрациклины, цефалоспорин С
и др.).
Шесть родов феламентозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков.
Много антибиотиков синтезируют актиномицеты (один только вид Streptomyces griscus производит более 50 антибиотиков). В практике реально используют небольшое число из известных пауке антибиотиков, производимых микроорганизмами. Это в первую очередь пенициллины и цефалоспорины, продуцируемые грибами родов Penicillum; стрептомицин, гентамицин, канамицин, эритромицин и тетрациклины, синтезируемые актиномицетами рода
Streptomyces и бактериями родов Micromonospora и Bacillus, и некоторые другие.
До «эры» генной инженерии ценные для промышленности штаммы-продуценты антибиотиков с повышенной продуктивностью получали в основном с помощью мутагенеза и
селекции природных микроорганизмов. Например, в результате селекции и улучшения техники ферментации промышленный выход пенициллина достиг 20 г/л, что в 10 тыс. раз выше
уровня, который имелся в исходном штамме Penicillum chrysogenum.
Разработан также метод так называемого мутасинтеза, позволяющий получать модифицированные антибиотики. В этом случае используют мутантные штаммы-продуценты, в
которых нарушен синтез определенных участков молекулы антибиотика. Для биосинтеза
функционально-активного антибиотика в среду культивирования продуцента вносят аналоги
этих участков. В связи с постепенным приобретением патогенными бактериями устойчивости к антибиотикам созданы методы внесения специальных модификаций в структуры антибиотиков, сохраняющие их антибактернальные эффекты. В настоящее время широко распространены полусинтетические антибиотики, например ампициллин, цефалексин, метициллин
и др.
Антибиотики вырабатываются в результате совместного действия продуктов 10—30
генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые могли бы повысить выход антибиотика с нескольких миллиграммов на литр в штамме
дикого типа до 20 г/л и более пенициллина или тетрациклина в промышленных штаммах
Penicillium chrysogenum или Streptomyces auerofaciens. Эти высокопродуктивные штаммы
были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции. После того
как микробная культура обрабатывалась мутагеном, исследовались и проверялись тысячи
колоний, образованных выжившими клетками. Когда обнаруживали мутанта, дающего
большее количество антибиотика, он становился исходным материалом для новых циклов
мутагенеза и скрининга. Тем самым эволюция микроорганизма направлялась в неестественную для него сторону до тех пор, пока не удавалось получить высокопродуктивные штаммы.
На первом этапе работы по увеличению выхода пенициллина в штамме Penicillium
chrysogenum (NRRL-1951), который производил 60 мг/л пенициллина, была отобрана спонтанная мутация, приведшая к возникновению штамма (NRRL-1951B25) с выходом пенициллина 150 мг/л (Управление сельскохозяйственными лабораториями США, Пеория, шт. Иллинойс). После рентгеновского облучения был выделен мутант (Х-1612), дающий 300 мг/л
пенициллина (Институт Карнеги, Вашингтон, и Миннесотский университет, Миннеаполис).
Исследователи из Висконсинско-го университета подвергли этот штамм ультрафиолетовому
облучению и выделили штамм (WIS Q-176), который давал 550 мг/л пенициллина. Штамм
WIS Q-176 послужил исходным материалом для нескольких циклов мутагенеза и селекции, в
которых помимо ультрафиолетового облучения применяли иприт. В лабораториях фирмы
«Эли Лилли» из одного из штаммов, выведенного в Висконсин-ском университете, удалось
вывести еще более высокопродуктивный штамм (Е-15-1), который производил 7 г/л пенициллина. В качестве мутагена в этом случае выступал иприт.
35
Итак, 21 цикл мутагенеза и селекции, продолжавшийся более двух десятков лет, позволил четырем группам исследователей увеличить выход пенициллина в 55 раз. Такой выход был следствием не только мутационных экспериментов, но и улучшения техники ферментации. С тех пор технологические усовершенствования и дальнейшая селекция позволили добиться промышленного выхода пенициллина 20 г/л и более, что в 10 000 раз превышает
выход, полученный в 1941 г. Флори, Чейном и их коллегами в Оксфордском университете.
Генетический скрининг был также значительно усовершенствован при помощи автоматических методов проверки тысяч выживших после индуцированного мутагенеза клеток для выявления высокопродуктивных мутантов.
В результате мутаций появились новые вторичные метаболиты, в том числе 6деметилхлортетрациклин и 6-деметилтетрациклин. Определенные мутанты, так называемые
идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой ее половиной. Такая форма мутационного биосинтеза привела к
открытию новых производных антибиотиков, среди них принадлежащие к аминоциклитольной группе.
Группа ученых во главе с Хопвудом (Институт Джона Иннеса, Норвич, Великобритания) обнаружила, что синтез некоторых антибиотиков, осуществляемый различными видами
Streptomyces, определяется не хромосомными генами, а плазмидой. Ввведение в одну клетку
Streptomyces нескольких плазмид такого типа могло бы способствовать объединению различных метаболических путей и биосинтезу новых антибиотиков.
Число противоопухолевых веществ микробного происхождения довольно ограниченно. Блеомицин, выделенный Умезавой с сотр. в Токийском институте микробной химии из
культур Streptomyces verticillus, представляет собой гликопептид, который действует, разрывая ДНК опухолевых клеток и нарушая репликацию ДНК и РНК. Другая группа противоопухолевых агентов создана на основе комбинации аминогликозмдной единицы и молекулы антрациклина. Недостатком обоих соединений является их потенциальная опасность для сердца.
Литература:
Основная – 1 [], 2 [].
Дополнительная – 1 [].
Контрольные вопросы:
1. Что собой представляют антибиотики?
2. Какие микроорганизмы используются для производства антибиотиков?
3. В каких промышленных условиях получают антибиотики?
Тема лекции 11. Биотехнологическое производство лекарственных и профилактических препаратов
В середине прошлого века стали внедряться новые подходы в биотехнологии, в связи с
тем, что совершенствование методов микробиологии и химического мутагенеза дало возможность получать высокопродуктивные штаммы. Было обнаружено много полезных для
человека микробиологических продуктов, и, прежде всего — различные лекарственные соединения.
С 80-х гг. активно начались работы по сиквенированию геномов, в середине 90-х гг. был
разработан проект генома человека и животных. Это стимулировало экспоненциональный
рост инноваций для биотехнологических разработок лекарств и другие крупнейшие прорывы
в области геномики микроорганизмов. Возникла новая стадия развития биотехнологии —
суперсовременная биотехнология, ориентированная преимущественно на медицину: более
70% всех исследований и практических результатов связано с получением фармацевтических
и биомедицинских препаратов.
36
Современные биотехнологические процессы держатся на получивших бурное развитие в
последнее десятилетие атлантах: это геномика, протеомика, биоинформатика, биохимия и
физиология. Основные направления медицинской биотехнологии:
· Сиквенирование геномов и валидация мишеней.
· Генно-инженерные препараты (ферменты, гормоны, белки-регуляторы, антитела).
· Векторы для генотерапии.
· Антисенсы — ингибиторы экспрессии генов.
· Стволовые клетки.
· Новые вакцины и иммуномодуляторы.
· Диагностические системы (биосенсоры, биочипы, мультиаррей).
Генодиагностика — наследственные и вирусные болезни, “генетическая” паспортизация
населения.
Именно достижения в этих областях науки плюс накопленный в предыдущие годы опыт
в области физиологии и биохимии привели к новому, революционному, этапу в развитии
биотехнологии.
В получении лекарственных препаратов, производимых биотехнологическим способом,
можно выделить:
1) новые соединения, получаемые с помощью биотехнологических процессов, комбинаторной химии, и
2) новые мишени, которые мы идентифицируем в процессе изучения геномов.
Это дает возможность отбирать молекулы, обладающие новыми биологическими и физиологическими свойствами, которые и будут выполнять роль лекарств.
Технологический взрыв в постгеномной эре повлек за собой существенные изменения в
инфрастуктуре биотехнологической индустрии. Сегодня многие компании занимаются научными исследованиями: разработкой ЛС (лекарственных средств), скринингом геномов, открытием новых мишеней. К ним подключились приборостроительные фирмы, обеспечивающие технический прорыв в современной биотехнологии. В этот процесс вовлекаются
биохимические компании, которые внедряют высокостандартизированные реагенты и комплексные системы анализа.
Масштабы мирового рынка и темпы роста биотехнологических фармацевтических
препаратов. Если говорить о реальном прогрессе в области современной биотехнологии, то
прежде всего обращают на себя внимание гигантские темпы роста продуктов этой области: в
1999 г. разрабатывались 1200 новых молекул для фармацевтических целей, из них более 50%
относились к биотехнологическим продуктам. Рост биотехнологического рынка можно оценить, сравнив следующие показатели: если в 1991 г. общий объем продаж биотехнологической продукции составлял 2 млрд долл., в 2000 г. — 16,5 млрд, то к 2008 г. прогнозируется
объем до 75 млрд долл. Таких темпов роста не знает ни одна из существующих отраслей
промышленности. На сегодняшний день в США зарегистрировано 112 биотехнологических
препаратов, 369 лекарственных средств проходят доклинические и клинические исследования. Основную долю этих лекарств составляют онкологические препараты, объем выпуска
которых составляет практически половину всех производимых биотехнологических ЛС. Для
терапии онкологических заболеваний в стадии разработки находится 175 генно-инженерных
препаратов. Второе место занимают антибактериальные препараты, поскольку знание геномики микробов и человека позволяет осуществить прорыв в создании новых ЛС.
Ниже приводится перечень основных генно-инженерных белковых препаратов, которые
уже сейчас нашли широкое применение в медицинской практике.
Генно-инженерные фармацевтические препараты:
· Инсулин.
· Гормон роста.
· Урокиназа.
· Эритропоэтин.
· Факторы свертывания крови.
37
Интерфероны.
Колониестимулирующие факторы.
Факторы роста.
Супероксиддисмутаза.
Ангиогенин.
Тканевой активатор плазминогена.
Моноклональные антитела.
Вакцины.
Интерлейкины.
Антагонисты TNF.
Значительную часть составляют инсулин, гормон роста, эритропоэтин, урокиназа, факторы свертывания крови. Особое место среди современных генно-инженерных препаратов
составляют моноклональные антитела, терапевтическая роль которых возрастает при решении проблем трансплантологии, лечение многих инфекционных, онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Другим важным классом лекарственных соединений являются генно-инженерные ферменты, соответствующие ферментам человека. По сравнению с ферментами, которые получают из природного сырья, они обладают рядом преимуществ: низкой антигенностью, высокой специфичностью фармакологического действия, отсутствием контаминирующих инфекционных агентов. Генно-инженерные технологии позволяют легко увеличивать промышленное производство ферментов.
Ферменты находят все более широкое применение как биокатализаторы в фармацевтическом производстве.
Особенности, которые следует учитывать при производстве ферментов для фармацевтических целей:
- Многовариантные технологии, сложность очистки и контроля качества.
- Сложность стандартизации.
- Многоцелевое производство.
- Антигенность и иммуногенность.
- Химическая модификация.
- Контаминированность инфекционными агентами.
- Рекомбинантные технологии
- Унификация технологии ферментации, очистки и контроля качества.
- Стандартизация свойств препарата.
- “Одноцелевое” производство, неограниченное масштабирование производства.
- Химическая идентичность с белками человека.
- Возможность направленной модификации структуры методами генной инженерии.
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
Направленная модификация с помощью методов генной инженерии открывает возможности трансформации структуры ферментов таким образом, что они приобретают качественно новые свойства. Так, особый интерес в мире сейчас представляет возможность перехода
от пенициллинов к цефалоспоринам с помощью генно-инженерного фермента экспандазы,
благодаря чему унифицируется биотехнологическая часть получения антибиотиков. Далее с
помощью других биокаталитических процессов и совмещения их с химическими можно
производить класс новых антибиотиков для борьбы с инфекциями.
Биокаталитические подходы открывают большое поле для различных вариантов построения новых фармацевтических процессов. В частности, использование генноинженерных ферментов позволяет получить оптически активные изомеры соединений, которые составляют более 70% всех лекарств. При этом период окупаемости биокаталитических
процессов значительно короче по сравнению с химическим синтезом, а по энергозатратам и
капиталовложениям они тоже имеют большие перспективы. Техноинженерные ферменты
широко используются для создания диагностических тест-систем в биохимическом, иммуноферментном и ДНК-анализах.
38
Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых
осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые
агенты, противоопухолевые лекарства и алкалоиды. В 1980 г. мировое производство антибиотиков составляло примерно 25000 т, из них 17000 т — пенициллины, 5000 т — тетрациклины, 1200 т — цефалоспорины и 800 т — эритромицины. В 1945 г. Бротзу из Института гигиены в Кальари (Сардиния) выделил из пробы морской воды плесень Cephalosporium
acremonium, синтезирующую несколько антибиотиков; один из них, цефалоспорин С, оказался особенно эффективен против устойчивых к пенициллину грамположительных бактерий.
Из нескольких тысяч открытых антибиотиков львиная доля принадлежит актиномицетам. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, включая тетрациклины (один только вид Streptomyces griseus синтезирует более пятидесяти антибиотиков). Наиболее распространенными с коммерческой точки зрения оказались пенициллины, цефалоспорины и тетрациклины.
Антибиотики вырабатываются в результате совместного действия продуктов 10—30 генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые
могли бы повысить выход антибиотика с нескольких миллиграммов на литр в штамме дикого типа до 20 г/л и более пенициллина или тетрациклина в промышленных штаммах
Penicillium chrysogenum или Streptomyces auerofaclens. Эти высокопродуктивные штаммы
были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции. В результате
мутаций появились новые вторичные метаболиты, в том числе 6-деметилхлортетрациклин и
6-деметилтетрациклин. Определенные мутанты, так называемые идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой
ее половиной. Такая форма мутационного биосинтеза привела к открытию новых производных антибиотиков, среди них принадлежащие к аминоциклитольной группе.
Число противоопухолевых веществ микробного происхождения довольно ограниченно.
Блеомицин, выделенный Умезавой с сотр. в Токийском институте микробной химии из культур Streptomyces verticilliis, представляет собой гликопептид, который действует, разрывая
ДНК опухолевых клеток и нарушая репликацию ДНК и РНК. Другая группа противоопухолевых агентов создана на основе комбинации аминогликозидной единицы и молекулы антрациклина. Недостатком обоих соединений является их потенциальная опасность для сердца.
В медицине применяют также аминокислоты, например, аргинин. В сочетании с аспартатом или глутаматом он помогает при заболевании печени. K-Na-аспартат снимает усталость и облегчает боли в сердце, его рекомендуют при заболевании печени и диабете. Цистеин защищает SH-ферменты в печени и других тканях от окисления и оказывает детоксицирующее действие. Он проявляет также защитное действие от повреждения, вызываемых облучением. Дигидроксифенилаланин и D-фенилаланин эффективны при болезни Паркинсона.
Из полиаминокислот получают хороший материал для хирургии.
В медицине также используют зеленую водоросль Scenedesmus. Ее культивируют в
жидкой питательной среде (установки дают до 80 тонн водорослей в год), извлекают и проводят экстракцию этиловым спиртом. Биомассу отделяют и подвергают ферментативному
гидролизу щелочной протеазой. Около 50% белков при этом распадается до пептидов. Гидролизат содержит почти все незаменимые аминокислоты, представляет собой порошок желтовато-зеленого цвета с приятным запахом и вкусом. Используется этот продукт для быстрого восстановления организма, а также как компонент косметических средств. Если вместо
обработки этанолом провести двукратную экстракцию дистиллированной водой, а затем высушить, то получается порошок светло-желтого цвета. Его используют как биостимулятор и
готовят из него препараты для лечения плохо заживающих ран.
Еще в начале 90-х годов появились статьи, в которых рассматривались перспективы использования сапротрофной микрофлоры как продуцента биологически активных веществ
(БАВ). Предполагается вводить в организм сапрофитные микроорганизмы, которые могли
39
бы жить в условиях симбиоза с нормальной микрофлорой организма. Вещества, вырабатываемые бактериальными штаммами включаются в систему биохимических процессов организма. В случае нарушения нормального биохимического статуса организма они корректируют его, а при патологическом процессе – задерживают его или способствуют прекращению. Такое введение получило название «микробиологическая подсадка». К 1992 году было
описано уже более 50 таких штаммов и проанализирован диапазон биологических эффектов
секретируемых БАВ.
Для лечения широкого спектра заболеваний (бактериальные инфекции кишечника, дыхательных путей, гнойных инфекций, аллергий) успешно применяются штаммы Bacillus
subtilis (препарат «Бактисубтил», например, используют при лечении диареи). Штаммами E.
coli лечат ряд кишечных заболеваний. БАВ, секретируемые сапротрофами, могут регулировать ферментативные процессы в организме и вступать во взаимодействие с поступающими
в организм ксенобиотиками. Штаммы можно получать непосредственно от человека, тогда
они будут представлять его естественную микрофлору.
Можно целенаправленно выводить лабораторные мутантные штаммы, в том числе методами генной инженерии и вводить их в организм. Способы введения могут быть различны:
капсулы, растворимые в кишечном соке, культуры штаммов-продуцентов на пленочной основе, в виде свечей, а при легочных заболеваниях – в виде аэрозолей.
В заключении приводится таблица, показывающая мировое производство фармапродукции методами биотехнологии (табл.11.1).
Таблица 11.1. Основные показатели мирового фармацевтического производства
Показатель
Объем мирового фармарынка в 2002 г.
402 млрд.дол.
Объем производства лекарственных био- 16,5 млрд.дол.
технологических средств в 2000 г.
Рост по сравнению с 1997 г
+32%
Данные
Литература:
Основная – 1 [255-257]; 3 [181-190].
Дополнительная – 3 [155-170].
Контрольные вопросы:
1. Какие группы микроорганизмов используются для производства фармацевтических
препаратов?
2. Какие фармацевтические препараты выпускаются методами биотехнологии?
Тема лекции 12. Биотехнологическое производство энергии
Растительный покров Земли составляет более 1800 млрд. т сухого вещества, что энергетически эквивалентно известным запасам энергии полезных ископаемых. Леса составляют
около 68% биомассы суши, травяные экосистемы - примерно 16%, а возделываемые земли только 8%.
Для сухого вещества простейший способ превращения биомассы в энергию заключается
в сгорании - оно обеспечивает тепло, которое в свою очередь превращается в механическую
или электрическую энергию. Что же касается сырого вещества, то в этом случае древнейшим
и наиболее эффективным методом превращения биомассы в энергию является получение
биогаза (метана).
Метановое «брожение», или биометаногенез, - давно известный процесс превращения
биомассы в энергию. Он был открыт в 1776 г. Вольтой, который установил наличие метана в
болотном газе. Биогаз, получающийся в ходе этого процесса, представляет собой смесь из
65% метана, 30% углекислого газа, 1% сероводорода (Н2S) и незначительных количеств азота, кислорода, водорода и закиси углерода. Болотный газ дает пламя синего цвета и не имеет
40
запаха. Его бездымное горение причиняет гораздо меньше неудобств людям по сравнению со
сгоранием дров, навоза жвачных животных или кухонных отбросов. Энергия, заключенная в
28 м3 биогаза, эквивалентна энергии 16,8 м3 природного газа, 20,8 л нефти или 18,4 л дизельного топлива.
Биометаногенез осуществляется в три этапа: растворение и гидролиз органических соединений, ацидогенез и метаногенез. В энергоконверсию вовлекается только половина органического материала—1800 ккал/кг сухого вещества по сравнению с 4000 ккал при термохимических процессах, но остатки, или шлаки, метанового «брожения» используются в сельском хозяйстве как удобрения. В процессе биометаногенеза участвуют три группы бактерий.
Первые превращают сложные органические субстраты в масляную, пропионовую и молочную кислоты; вторые превращают эти органические кислоты в уксусную кислоту, водород и
углекислый газ, а затем метанообразующие бактерии восстанавливают углекислый газ в метан с поглощением водорода, который в противном случае может ингибировать уксуснокислые бактерии. В 1967 г. Брайант и др. установили, что уксуснокислые и метанообразующие
микроорганизмы образуют симбиоз, который ранее считался одним микробом и назывался
Methanobacillus omelianskii.
Для всех метанобактерий характерна способность к росту в присутствии водорода и углекислого газа, а также высокая чувствительность к кислороду и ингибиторам производства
метана. В природных условиях метанобактерии тесно связаны с водородобразующими бактериями: эта трофическая ассоциация выгодна для обоих типов бактерий. Первые используют газообразный водород, продуцируемый последними; в результате его концентрация снижается и становится безопасной для водородобразующих бактерий.
Метановое «брожение» происходит в водонепроницаемых цилиндрических цистернах
(дайджестерах) с боковым отверстием, через которое вводится ферментируемый материал.
Над дайджестером находится стальной цилиндрический контейнер, который используется
для сбора газа; нависая над бродящей смесью в виде купола, контейнер препятствует проникновению внутрь воздуха, так как весь процесс должен происходить в строго анаэробных
условиях. Как правило, в газовом куполе имеется трубка для отвода биогаза. Дайджестеры
изготовляют из глиняных кирпичей, бетона или стали. Купол для сбора газа может быть изготовлен из нейлона; в этом случае его легко прикреплять к дайджестеру, изготовленному из
твердого пластического материала. Газ надувает нейлоновый мешок, который обычно соединен с компрессором для повышения давления газа.
В тех случаях, когда используются отходы домашнего хозяйства или жидкий навоз, соотношение между твердыми компонентами и водой должно составлять 1:1 (100 кг отходов
на 100 кг воды), что соответствует общей концентрации твердых веществ, составляющей 8—
11% по весу. Смесь сбраживаемых материалов обычно засевают ацетогенными и метаногенными бактериями или отстоем из другого дайджестера. Низкий рН подавляет рост метаногенных бактерий и снижает выход биогаза; такой же эффект вызывает перегрузка дайджестера. Против закисления используют известь. Оптимальное «переваривание» происходит в
условиях, близких к нейтральным (рН 6,0—8,0). Максимальная температура процесса зависит от мезофильности или термофильности микроорганизмов (30—40°С или 50—60° С); резкие изменения температуры нежелательны.
Обычно дайджестеры загружают в землю, чтобы использовать изоляционные свойства
почвы. В странах с холодным климатом их нагревают при помощи устройств, которые применяют при компостировании сельскохозяйственных отходов. С точки зрения питательных
потребностей бактерий избыток азота (например в случае жидкого навоза) способствует накоплению аммиака, который подавляет рост бактерий. Для оптимальной переработки соотношение C/N должно быть порядка 30:1 (по весу). Это соотношение можно изменять, смешивая субстраты, богатые азотом, с субстратами, богатыми углеродом. Так, C/N навоза можно изменить добавлением соломы или жома сахарного тростника.
Отходы пищевой промышленности и сельскохозяйственного производства характеризуются высоким содержанием углерода (в случае перегонки свеклы на 1 литр отходов при41
ходится до 50 граммов углерода), поэтому они лучше всего подходят для метанового «брожения», тем более, что некоторые из них получаются при температуре, наиболее благоприятной для этого процесса. Желательно перемешивать суспензию сбраживаемых веществ,
чтобы воспрепятствовать расслаиванию, которое подавляет брожение. Твердый материал необходимо раздробить, так как наличие крупных комков препятствует образованию метана.
Обычно длительность переработки навоза крупного рогатого скота составляет две—четыре
недели. Двухнедельной переработки при температуре 35° С достаточно, чтобы убить все патогенные энтеробактерии и энтеровирусы, а также 90% популяции Ascaris lumbricoides и
Ancylostoma.
Еще в 1979 году конференция ООН по науке и технике для развивающихся стран и эксперты "Экономической и социальной комиссии по странам Азии и Тихого океана" подчеркивали достоинства интегрированных сельскохозяйственных программ, использующих биогаз.
Такие программы направлены на разработку пищевых культур, а также на производство белка культурами водорослей, создание рыбных ферм, переработку отходов и превращение различных отбросов в удобрения и энергию в виде метана. Надо отметить, что 38% от 95миллионного поголовья крупного рогатого скота в мире, 72% остатков сахарного тростника
и 95% отходов бананов, кофе и цитрусовых приходятся на долю стран Африки, Латинской
Америки, Азии и Ближнего Востока. Не удивительно, что в этих регионах сосредоточены
огромные количества сырья для метанового «брожения». Следствием этого явился поворот
некоторых стран с сельскохозяйственно ориентированной экономикой на биоэнергетику.
Например, одним из основных принципов энергетической политики Индии является производство биогаза в сельских районах. В конце 1979 г. в Индии работало менее 100 000 установок. В Китае в этот же период насчитывалось 10 млн. установок. Сырьем для загрузки установок в этих странах являются отходы животноводческих ферм и птицефабрик. В Центральной Америке построены установки, работающие на отходах производства кофе. В Масатенанго была построена фабрика, выпускающая 90 м3 биогаза в сутки и 900 т органических
удобрений в год из отходов кофе. Биогаз обеспечивает работу двигателя мощностью 35 л. с.,
являющегося частью устройства, которое лущит кофе со скоростью 3 т/ч, вырабатывает 1500
Ватт электроэнергии и обеспечивает работу компрессора. В Израиле с 1974 г. производством
биогаза занимается «Ассоциация киббуци индастриз» (KIA). Проведены фундаментальные
исследования процесса метаногенеза при активном участии нескольких университетов и
промышленных исследовательских институтов под эгидой министерства энергетики. Анаэробное брожение происходит при 55° С. Исследователям удалось добиться повышения выхода биогаза до 4—6,5 м3 в сутки на каждый кубометр объема цистерны дайджестера (что в
десять раз превышает обычный выход).
Биогаз состоит из 62% метана и 38% углекислого газа; последний предполагают использовать в теплицах для ускорения фотосинтеза культивируемых растений. Отходы переработки, содержащие только 12% твердого вещества, скармливают рыбам. Это помогло сэкономить половину гранулированных кормов из злаков, которые обычно употребляют при разведении рыб. Как показали эксперименты, богатые белками, минеральными солями и витаминами отходы крупного рогатого скота и овец можно использовать в качестве корма для скота, заменяя ими до 25% сухого вещества поглощаемой пищи.
Производство биогаза путем метанового «брожения» отходов — одно из возможных
решений энергетической проблемы в большинстве сельских районов развивающихся стран.
И хотя при использовании коровьего навоза только четверть органического материала превращается в биогаз, последний выделяет тепла на 20% больше, чем его можно получить при
полном сгорании навоза.
Производство биогаза имеет следующие достоинства: это источник энергии; отходы
процесса служат высококачественными удобрениями и в довершение сам процесс способствует поддержанию чистоты окружающей среды. Чтобы обеспечить крупномасштабное развитие и экономическую выгоду предприятий по производству биогаза, необходимо решить
целый ряд биохимических, микробиологических и социальных проблем. Усовершенствова42
ния касаются следующих областей: сокращения числа стальных элементов в используемом
оборудовании; создания оборудования с оптимальной конструкцией; разработки эффективных нагревателей; нагрева дайджестеров за счет солнечной энергии; объединения систем
производства биогаза с другими нетрадиционными источниками энергии; конструирования
крупномасштабных производственных единиц для сельских или городских общин; оптимального использования переработанных отходов и, наконец, усовершенствования процессов брожения и начальной деградации отходов.
Биотехнология в состоянии внести крупный вклад в решение проблем энергетики посредством производства достаточно дешевого биосинтетического этанола, который кроме
того является и важным сырьем для микробиологической промышленности при получении
пищевых и кормовых белков, а также белково-липидных кормовых препаратов. Крупнейшие
мировые производители спирта (по данным на 2000г.): Бразилия – 10,6 млрд.л; США – 6,5
млрд.л; Китай – 3 млрд.л; Индия – 1,7 млрд.л; Россия – 1,3 млрд.л. Стратегическую роль в
бразильской экономике спирт приобрел в середине 70-ых годов с введением программы
Proalcool, запущенной в 1975 году после мирового нефтяного кризиса в начале 70-ых. В Бразилии производится два вида этилового спирта: негидрированный – используется в качестве
добавки к бензину в пропорции 20-24% и не требует изменений в двигателе; гидрированный
– используется в качестве топлива и требует специального двигателя, работающего на спирте. Бразилия является первой страной, начавшей использовать негидрированный спирт в качестве добавки к топливу.
Источником углеводородов также могут служить водоросли. У широко распространенной зеленой водоросли Botryococcus braunii (обитающей в пресной и солоноватой воде умеренных и тропических зон) углеводороды в зависимости от условий роста и разновидностей
могут составлять до 75% сухой массы. Они накапливаются внутри клеток, и водоросли, в которых их много, плавают на поверхности. После сбора водорослей эти углеводороды легко
отделить экстракцией каким-нибудь растворителем или методом деструктивной отгонки. Таким путем может быть получено вещество, аналогичное дизельному топливу и керосину.
Встречается несколько разновидностей B.braunii, отличающихся пигментацией и структурой синтезируемых углеводородов. Зеленая разновидность содержит линейные углеводороды с нечетным (25-31) числом атомов углерода, бедных двойными связями. Красная водоросль содержит углеводороды с 34-38 атомами углерода и несколькими двойными связями;
это так называемые "ботриококкцены". Смысл существования двух разновидностей в настоящее время изучается. Углеводороды накапливаются в клеточной стенке, их синтез связан
с метаболической активностью водоросли в фазе роста. Выход углеводородов при создании
оптимальных условий культивирования может достигать 60 т/га/год для культуры водорослей, выращиваемой в толще воды в природных или искусственных условиях. Для определения перспективности использования B.braunii необходимо провести следующие исследования:
- определить условия, обеспечивающие максимальную скорость роста и образования углеводов в лабораторных и полевых условиях;
- выяснить, можно ли добиться скорости роста B.braunii, сопоставимой с известной для
других водорослей;
- разработать соответствующие методы выращивания, сбора и переработки;
- оценить применимость получаемого продукта как альтернативного источника топлива
и смазочных веществ. Исследования, связанные с выделением и возможностью утилизации
углеводородов B.braunii, могут также способствовать лучшему пониманию вопроса о происхождении нефти.
Клеточные мембраны некоторых галобактерий также рассматриваются как альтернативные источники получения энергии. Были получены фотогальванические элементы на основе бактериородопсина, генерировавшие электрический ток. Кроме того, отличным экологически чистым и возобновляемым источником энергии является фотоводород, который
получают с использованием мембран хлоропластов.
43
Литература:
Основная – 1 [255-257]; 3 [181-190].
Дополнительная – 3 [155-170].
Контрольные вопросы:
1. Что подразумевают под биоэнергетикой?
2. Какие микроорганизмы принимают участие в получении биоэнергии?
3. Что собой представляет биогаз и его практическое применение?
Тема лекции 13. Биотехнология металлов
Биотехнология металлов - технология извлечения металлов из руд, концентратов,
горных пород и растворов с использованием микроорганизмов или их метаболитов (продуктов обмена в живых клетках). В области биогидрометаллургии наиболее изучены и освоены
процессы кучного и подземного выщелачивания меди, цинка, урана и др. металлов из бедных (забалансовых) руд. Себестоимость меди, получаемой этим способом, в 1,5—2 раза ниже известных технологий. В процессах чанового выщелачивания металлов биотехнология
металлов применяется при переработке мышьяковистых Аu- и Sn-содержащих метаколлоидных Cu-Zn концентратов, которые невозможно перерабатывать традиционными способами. Биотехнологические схемы замкнуты, что снижает или исключает загрязнение окружающей среды.
К новым тенденциям в развитии миотехнологии металлов следует отнести обогащение горных пород и руд, например, бокситов (выщелачивание Si), сульфидизацию окисленных руд, биосорбцию металлов из растворов. Использование бактериально-химических способов позволяет расширить сырьевые ресурсы, обеспечить комплексность использования
сырья без создания сложных горнодобывающих комплексов, автоматизировать процессы,
повысить производительность труда и культуру производства, решить многие проблемы охраны окружающей среды.
Возрастающая стоимость извлечения и переработки металлов из руд, наряду с истощением запасов высококачественного минерального сырья и усилением природоохранных мер,
способствовали развитию новых технологий в горнодобывающей промышленности. микробное выщелачивание было признано привлекательной альтернативой традиционным физическим и химическим методам обогащения руд благодаря сокращению потребления энергии,
транспортных затрат и менее пагубному воздействию на окружающую среду.
За последние десятилетия промышленное применение железо- и сероокисляющих микроорганизмов с целью извлечения ценных компонентов из руд достигло широких масштабов
в разных странах. В настоящее время различными компаниями стран Северной и Южной
Америк, Африки, Австралии используются бактериально-химические технологии добычи
меди, кобальта, никеля, золота, цинка, урана.
Механизм биовыщелачивания. Обычно использование микроорганизмов при извлечении металлов преследует одну из двух целей: превращение (или окисление) нерастворимых
сульфидов металлов в растворимые сульфаты или создание условий для лучшего взаимодействия химических веществ с поверхностью минерала и растворения необходимого металла.
Примером первого процесса является превращение таких нерастворимых соединений меди,
как ковеллин (CuS) или халькозин (Cu2S), в растворимые сульфаты. Примером второго процесса служит извлечение железа, мышьяка и серы из золотоносного арсенопирита (FeAsS),
вследствие чего оставшееся в минерале золото легче выделяется при помощи цианирования.
Оба этих процесса являются окислительными. Если добываемый металл переводится в раствор, речь идет о биовыщелачивании. Когда же металл остается в руде — о биоокислении.
Тем не менее, термин «биовыщелачивание» часто используется в обоих случаях.
Биологическое выщелачивание может быть применено к рудам, содержащим железо или
восстановленные формы серы (Rawlings, 2005).
44
Роль, которую играют микроорганизмы в биовыщелачивании, до сих пор остается не
выясненной до конца. По данным (Rodriguez et al., 2003), Сильверман и Эрлих в 1964 г. сделали первую попытку объяснить механизм биовыщелачивания, предложив два возможных
пути: прямой и непрямой.
Прямое бактериальное выщелачивание происходит при физическом контакте бактериальных клеток с поверхностью минерала в несколько стадий, катализируемых ферментами:
4FeS2 + 14O2 + 4H2O -> (бактерии) →4FeSO4 + 4H2SO4
(1)
4FeSO4 + O2 + 2H2SO4 → (бактерии) → 2Fe2(SO4)3 + 2H2O
(2)
В сумме:
4FeS2 + 15O2 + 2H2O -> (бактерии) → 2Fe2(SO4)3 + 2H2SO4
(3)
По данным (Bosecker, 1997), исследования Торма показали, что при прямом взаимодействии Acidithiobacillus ferrooxidans могут быть окислены следующие не содержащие железа
сульфиды металлов: ковеллин (CuS), халькозин (Cu2S), сфалерит (ZnS), галенит (PbS),
молибденит (MoS2), стибнит (Sb2S3), кобальтин (CoS), миллерит (NiS).
Таким образом, прямое бактериальное выщелачивание может быть описано следующей
реакцией:
MeS + 2O2→ (бактерии) → MeSO4
(4)
где MeS - сульфид металла.
Очевидно, что бактерии должны находиться в тесном контакте с поверхностью минерала. Механизм бактериального прикрепления и инициации растворения металлов пока не
полностью понятен. Предположительно, бактерии прикрепляются не ко всей поверхности
минерала, а предпочитают специфические участки дефектов кристаллической решетки.
При непрямом биовыщелачивании бактерии генерируют «окислитель», который химически окисляет сульфидный минерал. В кислых растворах таким окислителем служит Fe3+, и
раство -рение металла может быть описано следующей реакцией:
MeS + Fe2(SO4)3 → MeSO4 + 2FeSO4 + S0
(5)
Для поддержания достаточного количества железа в растворе химическое окисление
сульфидов металлов должно проводиться в кислых условиях при рН < 5.0. Двухвалентное
железо, выделяющееся в данной реакции, может быть заново окислено до трехвалентного
железоо-кисляющими бактериями (At. ferrooxidans или L. ferrooxidans). При непрямом выщелачивании бактерии не нуждаются в контакте с поверхностью руды. Они выполняют
только каталитическую функцию, ускоряя окисление Fe2+ до Fe3+. При рИ 2.0-3.0 бактериальное окисление Fe2+ примерно в 105-106 раз быстрее, чем химическое окисление.
Выделяющаяся в процессе сера может быть окислена до серной кислоты бактериями At.
ferrooxidans. Ио окисление серы бактериями At. thiooxidans, которые часто встречаются вместе с At. ferrooxidans, происходит гораздо быстрее:
2S0 + 3O2 + 2H2O → (бактерии) → 2H2SO4
(6)
Роль At. thiooxidans, вероятно, состоит в создании благоприятных условий для роста железоокисляющих бактерий, таких как At. ferrooxidans или L. ferrooxidans.
Таким образом, биовыщелачивание основывается на взаимодействии биологических и
химических окислительных процессов.
Общая характеристика микроорганизмов, участвующих в процессе биовыщелачивания сульфидных руд.
Мезофильные, умеренно термофильные и термофильные ацидофильные железо- и сероокисляющие бактерии и археи осуществляют процесс бактериального выщелачивания сульфидов металлов - биологического превращения нерастворимых соединений металлов в растворимые формы. Данные микроорганизмы участвуют в окислении сульфидов до ионов металлов и сульфата.
1. Мезофильные и умеренно термофильные ацидофильные эубактерии.
1.1. Грамотрицательные эубактерии:
Тионовые бактерии. Основные процессы, связанные с окислением серы, осуществляют
тионовые (Acidithiobacil-lus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans - ацидофильные мезо45
фильные бактерии) бактерии.
Acidithiobacillus thiooxidans - хемолитотроф-ная ацидофильная аэробная бактерия, которая окисляет элементную серу и сульфиды до серной кислоты.
Acidithiobacillus ferrooxidans занимает исключительное положение среди тионовых бактерий, так как помимо способности к автотрофному росту за счет окисления соединений серы она может использовать энергию окисления закисного железа в окисное.
Acidithiobacillus caldus. Наряду с At. ferrooxi-dans и At. thiooxidans, играющих важную
роль в окислении сульфидов металлов, в кислых условиях выделяют еще один не менее важный микроорганизм - Acidithiobacillus caldus. Это умеренно термофильная сероокисляющая
бактерия, активно развивающаяся при температурах 40-50С, не способная окислять железо
(II), относительно близкая к мезофилу At. thiooxidans. At. сaldus - такой же аэроб, грамотрицательный и хемолитоавтотрофный микроорганизм, который использует энергию от окисления восстановленных соединений серы.
Железобактерии. Основными представителями железобактерий с энергетическим метаболизмом хемолитотрофного типа являются виды Leptospirillum. Большинство изученных
штаммов Leptospirillum принадлежат к обли-гатным хемолитоавтотрофам, использующим
энергию окисления железа для ассимиляции СО2, служащего основным или единственным
источником углерода.
Род Leptospirillum включает железоокис-ляющие бактерии - Leptospirillum ferrooxidans,
Leptospirillum thermoferrooxidans и Leptospirillum fer-riphilum - которые играют важную роль
в биовыщелачивании и биоокислении. Лептоспириллы доминируют в условиях с высоким
содержанием железа, что делает данные микроорганизмы перспективными для использования в процессах биоокисления в промышленных масштабах.
1.2. Грамположительные эубактерии.
Грамположительные бактерии, окисляющие сульфиды металлов, принадлежат к родам
Alicyclobacillus, Sulfobacillus и еще не описанному роду «Cadibacillus». Физиологически эти
бактерии являются разносторонними, способными расти литотрофно с ионами железа (II)
и/или соединениями серы и/или органотрофно с различными органическими веществами.
Рост может быть автотрофным, гетеротрофным (например, на экстракте дрожжей) или миксотрофным (СО2 + дрожжевой экстракт). Могут формировать эндоспоры. Мезофильные и
умеренно термофильные виды были выделены из сульфидных руд и термальных источников,
многие из них подробно еще не описаны.
2. Мезофильные и умеренно термофильные ацидофильные археи.
Отдельного внимания требует перспективное для использования в практике биовыщелачивания семейство Ferroplasmaceae, представители которого составляют обычно значительную долю в естественных местообитаниях. Ferroplasma spp., которые входят в состав этого
семейства, принадлежат к порядку Thermoplasmales - ацидофильным археям, которые обладают одной периферической мембраной. Ferroplasma spp. разделяет некоторые метаболические и экофизиологические свойства с представителями архей порядка Sulfolobales и классическими мезофильными бактериями Acidithiobacillus spp. и Leptospirillum spp., но лучше
адаптированы к окружающей среде, характеризующейся низким уровнем рН и высокими
концентрациями Fe2+ и других металлов. Данные микроорганизмы способны использовать
металлы из сульфидных минералов (пирит, арсенопирит, медьсодержащие сульфиды) и более устойчивы к кислоте, нежели железо- и сероокисляющие бактерии (в частности, тионовые бактерии), подверженные сходным эколого-физиологическим условиям.
Отличительной чертой Ferroplasma spp. является наличие железосодержащих металлопротеинов, которые обеспечивают поддержание трехмерной структуры у этих микроорганизмов. Различные штаммы Ferroplasma имеют четкий температурный оптимум для роста в
пределах 37-50°С, то есть они представлены мезофильными и умерено термофильными микроорганизмами.
46
Литература:
Основная – 1 [255-257]; 3 [181-190].
Дополнительная – 3 [155-170].
Контрольные вопросы:
1. Что подразумевают под биотехнологией металлов?
2. Какие микроорганизмы принимают участие в биовыщелачивании?
Тема лекции 14. Биотехнология получения продуктов питания и напитков
Биотехнология получения продуктов питания. Основная информация о сельскохозяйственной биотехнологии, которой мы обладаем, восходит к первому поколению биотехнологических продуктов, а именно к сельскохозяйственным культурам с улучшенными агрономическими характеристиками, такими, как сопротивляемость к вредителям или гербицидная толерантность. Такие продукты облегчают жизнь фермера, снижая производственные затраты или увеличивая урожайность.
В настоящее время в коммерческом обращении находится лишь около одной трети
биотехнологических продуктов первого поколения; гораздо больше таких продуктов, как
ожидается, будет использоваться в будущем, пройдя стадии разработки и одобрения. Второе
поколение биотехнологических продуктов, которое разрабатывается в настоящее время, это, главным образом, продукты питания, имеющие преимущества не только с точки зрения
удобства или выгодности для фермера, а и такие преимущества, как питательная ценность.
«Золотой» рис, например, содержит бета-каротин, источник витамина А. Продукты третьего
поколения будут также иметь преимущества для потребителей и всех остальных, связанные с
их широким непищевым использованием – здесь и съедобные вакцины, и средства наведения
«экологической чистоты» и борьбы с комарами, распространяющими малярию.
Большинство фермеров, использующих продукты первого поколения, в общем выиграли от скромного повышения урожайности и чистой прибыли вследствие уменьшения использования инсектицидов и гербицидов. Те, кто использовал сельскохозяйственные культуры, устойчивые к гербицидам, отметили возросшие урожаи и увеличение прибыли.
Продукты биотехнологии, находящиеся в стадии разработки и одобрения. Процесс
слияний и приобретений среди фармацевтических и химических фирм, имевший место в
1990-х годах, подогревался верой в то, что в конечном итоге агробиотехнология является хорошим бизнесом. Крупные аграрные биотехнологические компании, такие как Монсанто,
Сингента, Дюпон, Доу Агросайенсес, Байер и БАСФ обладали значительными возможностями для проведения исследований и разработок, финансовыми активами, а также патентами
для поддержания длительных, высокозатратных и рискованных циклов разработки новых
продуктов. Эти компании находятся на гребне новой волны аграрных биотехнологических
исследований, лелея надежду о том, что их продукты, особенно те, которые относятся ко
второму и третьему поколению, дадут значительные социальные выгоды потребителям и солидный возврат на вложенный капитал.
1. Первое поколение. Эти продукты способны противостоять вредителям и/или проявлять устойчивость к гербицидам, поэтому процесс выращивания таких культур становится
легче и/или не столь затратным. Эти продукты в основном используются в кормах для животных либо идут на изготовление побочной продукции, такой как масло, и поэтому они не
потребляются человеком непосредственно в первоначальном виде. В дополнение к существующим разновидностям продуктов, устойчивых к гербицидам, и Bt культурам (bacillus
thuringiensis crops – сельскохозяйственные культуры, которые являются токсичными для
опеределенных вредителей), новые продукты биотехнологии, находящиеся в стадии разработки и одобрения, включают следущее:
Люцерна Roundup Ready®
Bt яблоки, которые являются токсичными для насекомых
Бананы, устойчивые к вредителям
47
Канола, устойчивая к вредителям
Кукуруза, устойчивая к листоеду
Кукуруза YieldGard®
Кукуруза, устойчивая к глифосату
Кукуруза, устойчивая к насекомым-вредителям
Хлопок, защищенный от насекомых
Хлопок следующего поколения Roundup Ready®
Хлопок с растительными протеинами-инсектицидами
Салат-латук Roundup Ready®
Рис LibertyLink®
Соевые бобы, защищенные от насекомых
Соевые бобы LibertyLink®
Сахарная свекла Roundup Ready®
Полевица ползучая Roundup Ready®
Пшеница Roundup Ready®
Пшеница, устойчивая к фузариозу
Соевые бобы Roundup Ready®
Канола Roundup Ready®
2. Второе поколение. Эти продукты, в своей окончательной форме, обладают такими качествами, которые делают их привлекательными и для потребителей, и для остальных; это
такие качества, как более высокая пищевая ценность либо другие функциональные характеристики:
Фрукты и овощи, которые могут дольше сохранять свой товарный вид на полках магазинов
«Золотой» рис
Фитаза для кормов животных (уменьшает загрязнение окружающей среды фосфором,
содержащимся в отходах животноводства)
Кукуруза с увеличенной энергетической ценностью
Кукуруза, устойчивая к засухам
Кукурузная амилаза, необходимая для увеличения производства этанола
Соевые бобы, имеющие усиленную протеиновую функциональность
3. Третье поколение. В настоящее время биотехнологические исследования начинают
по-новому использоваться в непищевых продуктах, создавая новые рынки для сельскохозяйственной продукции:
Фармацевтические средства, изготовленные на основе растений. Для создания протеинов используются растения, затем из этих протеинов производят съедобные вакцины и антибиотики. Из растений можно также изготовить анти-коагулянты, заменители крови и гормоны.
Продукты, имеющие экологические преимущества. Среди них – растения, которые могут поглощать и удерживать токсичные и вредные для здоровья человека вещества. Для того,
чтобы помочь восстановить деревья, которым угрожают болезни, такие, например, как каштан американский, прибегают, кроме прочего, к использованию методов генной инженерии.
Кроме того, ведутся исследования, направленные на снижение способности комаров к распространению болезней, таких, например, как малярия.
Промышленное использование. В этой сфере можно отметить производство специальных
машинных масел и других продуктов, которые могут быть использованы на промышленных
предприятиях.
Биотехнология получения продуктов питания и напитков. Получение алкогольных
напитков при помощи различных штаммов микроорганизмов основано на спиртовом брожении, в процессе которого сбраживаемый сахар исходного субстрата (крахмала или фруктового сока) превращается в этанол и дополнительные продукты. Такой тип брожения, приводящий к производству первичного метаболита, может быть непосредственно использован для
48
крупномасштабного производства этанола вместо алкогольных напитков; в данном случае
этанол можно использовать как промышленное сырье или топливо. Это справедливо и для
других спиртов, таких, как глицерин, который можно получить в одном из вариантов спиртового брожения, или n-бутанол, являющийся конечным продуктом ацетонобутанолового
брожения.
Как показали археологические раскопки, уже 6000 лет назад процессы брожения в
экстрактах зерен хлебных злаков были подлинным искусством; 5000 лет назад началось развитие виноделия. Пиво варят из ячменного солода (в меньшей степени для этого пользуются
другими злаками, например просом и сорго). Соложение индуцирует в семенах ферменты,
которые либо в процессе соложения, либо позднее катализируют гидролиз крахмала. В дальнейшем ячменный солод размельчают и смешивают с водой при температуре не выше 67° С;
в течение нескольких часов цепи крахмала разрываются, и происходит частичный протеолиз.
Водный экстракт, называемый солодовым суслом, кипятят вместе с хмелем. В процессе кипячения прекращается ферментативная активность, осаждаются белки из сусла и экстрагируются вкусовые компоненты хмеля. Затем в сусло засевают штамм Sac-charomyces cerevisiae, который сбраживает сахара в спирт и углекислый газ (в процессе брожения дрожжевая биомасса увеличивается в пять раз). Ряд других соединений, придающих пиву его особенный вкус, образуются в незначительных количествах. Среди них амиловый, изоамиловый и фенилэтиловый спирты, концентрация которых составляет около нескольких
миллиграммов на 1 л, уксусная и масляная кислоты, а также эфиры. По окончании брожения
дрожжи отделяют от пива, которое после необходимого периода созревания фильтруют и
пастеризуют. Большинство видов легкого пива получают при помощи дрожжей, которые
оседают на дно ферментера. Такие дрожжи низового брожения были в 1880 г. выведены в
чистую культуру датским ботаником Хансеном, работавшим в Карлсбергском институте в
Копенгагене (отсюда название Saccharomyces carlsbergensis). Дрожжи верхового брожения, не оседающие в процессе ферментации, являются штаммами S. cerevisiae и используются для получения разновидностей пива с повышенной концентрацией спирта. В 1980 г.
мировое производство пива составило 700 млн. гл (гектолитров) в год.
Виноделие в большинстве регионов остается мелкомасштабным процессом, в котором
традиционные навыки и способы культивирования способствуют приготовлению вина с особыми свойствами. Модернизация процесса спиртового брожения заключается в отборе более
эффективных штаммов S. cerevisiae, которые добавляют к виноградному соку, в регулировании температуры брожения в диапазоне 7—14° С, а также в попытках достигнуть непрерывного брожения для получения ординарных вин.
Производство сакэ, или рисовой водки (в Японии в 1980 г. произведено 17 млн. гл),
похоже скорее на пивоварение, чем на виноделие, поскольку сбраживаемым углеводом является крахмал. Последний превращается в сбраживаемые сахара под действием Aspergillus
oryzae, споры которого смешивают с размолотым и сваренным на пару рисом и инкубируют
пять-шесть дней при 35° С. Полученный продукт смешивают с распаренным рисом и засевают штаммом S. cerevisiae (мото). Брожение продолжается не менее трех недель. Приготовление сакэ — сложный и труд нерегулируемый процесс, требующий освоения различных
способов брожения (в полутвердом и затопленном состоянии) и последовательного регулирования микробных популяций: сначала плесени (Aspergillus oryzae), затем бактерий (Lactobacillus и Leuconostoc spp.) и наконец дрожжей (S. cerevisiae). Концентрация спирта перед выходом в торговую сеть доводится обычно до 16% по объему, однако к концу брожения
сакэ содержит не менее 20% спирта. Устойчивость дрожжевых штаммов к таким концентрациям спирта, возможно, связана с гетерогенным характером брожения. В Японии проводятся
активные исследования по селекции устойчивых к спирту и температуре штаммов дрожжей с
целью усовершенствовать экономическую конкурентоспособность ферментационного производства спирта.
В отличие от пивоварения для производства спиртов из зерна не нужно кипятить сусло, поэтому хотя брожение продолжается дольше, зато спирта производится больше. Харак49
тер последующей перегонки зависит от вида алкогольных напитков. Например, шотландское
ячменное виски перегоняют в небольших перегонных кубах, тогда как для большинства других видов виски процесс перегонки проводят в постоянно действующих агрегатах. Для многих алкогольных напитков ферментируемая жидкость помещается в перегонные кубы вместе
с дрожжами; последние наряду с компонентами, экстрагированными из деревянных бочонков, в которых выдерживаются спиртные напитки, придают вкус конечному продукту.
Одним из лимитирующих факторов в ферментационном производстве этанола являются неспособность микроорганизмов переносить высокие концентрации спирта и вызываемая этим остановка процесса брожения по достижении относительно высокого уровня
концентрации спирта. Мы пока мало знаем о факторах, влияющих на устойчивость микробов
к спирту, однако, по-видимому, она связана с ненасыщенными жирными кислотами клеточной мембраны; жирные кислоты могут сделать мембрану более проницаемой для спирта, что
приведет к уменьшению его концентрации внутри клетки.
Литература:
Основная – 1 [255-257]; 3 [181-190].
Дополнительная – 3 [155-170].
Контрольные вопросы:
1. Что подразумевают под биотехнологией производства продуктов питания и напитков?
2. Какие микроорганизмы принимают участие в производстве продуктов питания и напитков?
Тема лекции 15. Биотехнология микроорганизмов в охране окружающей среды
Биодеградация ксенобиотиков. В удалении ксенобиотиков из окружающей среды важны несколько факторов:
· устойчивость ксенобиотиков к различным воздействиям;
· растворимость их в воде;
· летучесть ксенобиотиков;
· рН среды;
· способность ксенобиотиков поступать в клетки микроорганизмов;
· сходство ксенобиотиков и природных соединений, подвергающихся естественной
биодеградации.
Для биодеградации ксенобиотиков лучше использовать ассоциации микроорганизмов,
так как они более эффективны, чем отдельно взятые виды. При этом типы связей в подобной
ассоциации могут быть различны. Один вид микроорганизмов может непосредственно участвовать в разложении ксенобиотиков, а другой – поставлять недостающие питательные вещества. Это может быть метаболическая «атака» на субстрат, когда синтезируются разные
компоненты ферментативного комплекса, или же цепочка ферментативных реакций (многосубстратные конверсии) и т.д.
Особенно трудно разлагаются такие биоциды, как детергенты, пластики и углеводороды.
Самыми способными к борьбе с загрязнителями различного типа являются представители
рода Pseudomonas – они практически «всеядны». Клетки этих микроорганизмов содержат оксидоредуктазы и гидроксилазы, способные разлагать большое число молекул углеводородов
и ароматических соединений, таких как бензол, ксилол, толуол.
Для большей эффективности создают микроэмульсию, содержащую бактериальные
штаммы и капсулы со смесью основных питательных элементов - азота, фосфора и калия
внутри. Добавление этих веществ стимулирует размножение бактриальных штаммов. Применение такого метода позволяет очистить от 70 до 90% загрязненной поверхности, за это же
время очищается всего порядка 10-20% необработанной поверхности.
Преимущество бактериальной очистки по сравнению с химической в том, что она не вызывает появления нового загрязняющего агента в окружающей среде. Плотность фитопланк50
тона после бактериальной очистки повышается. Некоторые микроорганизмы способны изменять молекулу ксенобиотика и делать ее доступной и привлекательной для других микроорганизмов («кометаболизм»). Примером может служить разложение инсектицида паратиона
под действием двух штаммов Pseudomonas – P. aeruginosa и P. stuzeri. В некоторых случаях
происходит неполное превращение молекулы ксенобиотика - фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д., результатом которого является утрата этим веществом токсичности.
Одним из сильных загрязнителей является ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота).
Причина в том, что ЭДТА связывает тяжелые металлы, способствуя их накоплению в почве.
Бактрии родов Pseudomonas и Bacillus способны за две недели разрушить все связи комплекса Fe-ЭДТА. Эти бактерии успешно применяются для очистки бытовых сточных вод, куда
попадают детергенты моющих средств. Кроме Pseudomonas, биодеградацию ксенобиотиков
могут осуществлять и представители родов Acinetobacter, Metviosinus.
Еще эффективнее, чем бактерии, справляются с посвенными загрязнителями грибы. Они
могут разрушать такие вещества, как пентахлорбензол, пентахлофенол. В одном из экспериментов грибами обработали около 10000 тонн почвы с территории деревоперерабатывающего комплекса. В этой почве содержание пентахлорфенола достигало 700 мг/кг, но за год деятельности оно снизилось до 10 мг/кг, что является допустимой нормой. Бактерии смогли бы
переработать эту почву лишь за 4-5 лет. Грибы активны и зимой, разрушают высокомолекулярные полиароматические углеводороды, действуют внеклеточно, выделяя неспецифические ферменты. Стоимость грибной и бактериальной очистки одинаковы, но применение
грибов позволяет сокращать сроки деградации и существенно удешевляет ее.
Аэробная очистка сточных вод. Биологическая переработка отходов опирается на ряд
дисциплин: биохимию, генетику, химию, микробиологию, вычислительную технику. Усилия
этих дисциплин концентрируются на трех основных направлениях:
· деградация органических и неорганических токсичных отходов;
· возобновление ресурсов для возврата в круговорот веществ углерода, азота, фосфора,
азота и серы;
· получение ценных видов органического топлива.
При очистке сточных вод выполняют четыре основные операции:
1. При первичной переработке происходит усреднение и осветление сточных вод от механических примесей (усреднители, песколовки, решетки, отстойники).
2. На втором этапе происходит разрушение растворенных органических веществ при
участии аэробных микроорганизмов. Образующийся ил, состоящий главным образом из
микробных клеток, либо удаляется, либо перекачивается в реактор. При технологии, использующей активный ил, часть его возвращается в аэрационный тенк.
3. На третьем (необязательном) этапе производится химическое осаждение и разделение
азота и фосфора.
4. Для переработки ила, образующегося на первом и втором этапах, обычно используется процесс анаэробного разложения. При этом уменьшается объем осадка и количество патогенов, устраняется запах и образуется ценное органическое топливо - метан.
На практике применяются одноступенчатые и многоступенчатые системы очистки. Одноступенчатая схема очистки сточной воды представлена на рис. 15.1.
Биологическая очистка воды происходит в аэротенках. Аэротенк представляет собой открытое железобетонное сооружение, через которое проходит сточная вода, содержащая органические загрязнения и активный ил. Суспензия ила в сточной воде на протяжении всего
времени нахождения в аэротенке подвергается аэрации воздухом. Интенсивная аэрация суспензии активного ила кислородом приводит к восстановлению его способности сорбировать
органические примеси.
В основе биологической очистки воды лежит деятельность активного ила (АИ) или биопленки, естественно возникшего биоценоза, формирующегося на каждом конкретном производстве в зависимости от состава сточных вод и выбранного режима очистки. Активный ил
51
представляет собой темно-коричневые хлопья, размером до нескольких сотен микрометров.
На 70% он состоит из живых организмов и на 30% - из твердых частиц неорганической природы. Живые организмы вместе с твердым носителем образуют зооглей - симбиоз популяций
микроорганизмов, покрытый общей слизистой оболочкой. Микрооганизмы, выделенные из
активного ила относятся к различным родам: Actynomyces, Azotobacter, Bacillus, Bacterium,
Corynebacterium, Desulfomonas, Pseudomonas, Sarcina и др. Наиболее многочисленны бактерии рода Pseudomonas, о всеядности которых упоминалось ранее. В зависимости от внешней
среды, которой в данном случае является сточная вода, та или иная группа бактерий может
оказаться преобладающей, а остальные становятся спутниками основной группы.
Рисунок 15.1. Принципиальная схема очистных сооружений:
1 - пескоуловители; 2 - первичные отстойники; 3 - аэротенк; 4 - вторичные отстойники; 5
- биологические пруды; 6 - осветление; 7 - реагентная обработка; 8 - метатенк; АИ - активный ил
Существенная роль в создании и функционировании активного ила принадлежит простейшим. Функции простейших достаточно многообразны; они сами не принимают непосредственного участия в потреблении органических веществ, но регулируют возрастной и
видовой состав микроорганизмов в активном иле, поддерживая его на определенном уровне.
Поглощая большое количество бактерий, простейшие способствуют выходу бактериальных
экзоферментов, концентрирующихся в слизистой оболочке и тем самым принимать участие в
деструкции загрязнений. В активных илах встречаются представители четырех классов простейших: саркодовые (Sarcodina), жгутиковые инфузории (Mastigophora), реснитчатые инфузории (Ciliata), сосущие инфузории (Suctoria).
Показателем качества активного ила является коэффициент протозойности, который отражает соотношение количества клеток простейших микроорганизмов к количеству бактериальных клеток. В высококачественном иле на 1 миллион бактериальных клеток должно приходиться 10-15 клеток простейших. При изменении состава сточной воды может увеличится
численность одного из видов микроорганизмов, но другие культуры все равно остаются в
составе биоценоза.
На формирование ценозов активного ила могут оказывать влияние и сезонные колебания
температуры, обеспеченность кислородом, присутствие минеральных компонентов. Все это
делает состав или сложным и практически невоспроизводимым. Эффективность работы очистных сооружений зависит также от концентрации микроорганизмов в сточных водах и возраста активного ила. В обычных аэротенках текущая концентрация активного ила не превышает 2-4 г/л.
Увеличение концентрации ила в сточной воде приводит к росту скорости очистки, но
требует усиления аэрации, для поддержания концентрации кислорода на необходимом уровне. Таким образом, аэробная переработка стоков включает в себя следующие стадии: 1) адсорбция субстрата на клеточной поверхности; 2) расщепление адсорбированного субстрата
52
внеклеточными ферментами; 3) поглощение растворенных веществ клетками; 4) рост и эндогенное дыхание; 5) высвобождение экскретируемых продуктов; 6) "выедание" первичной популяции организмов вторичными потребителями. В идеале это должно приводить к полной
минерализации отходов до простых солей, газов и воды. На практике очищенная вода и активный ил из аэротенка подаются во вторичный отстойник, где происходит отделение активного ила от воды. Часть активного ила возвращается в систему очистки, а избыток активного
ила, образовавшийся в результате роста микроорганизмов, поступает на иловые площадки,
где обезвоживается и вывозится на поля. Избыток активного ила можно также перерабатывать анаэробным путем. Переработанный активный ил может служить и как удобрения, и как
корм для рыб, скота.
Анаэробные системы очистки. Как уже упоминалось, избыток активного ила может
перерабатываться двумя способами: после высушивания как удобрение или же попадает в
систему анаэробной очистки. Такие же способы очистки применяют и при сбраживании высококонцентрированных стоков, содержащих большое количество органических веществ.
Процессы брожения осуществляются в специальных аппаратах - метатенках.
Распад органических веществ состоит из трех этапов:
· растворение и гидролиз органических соединений;
· ацидогенез;
· метаногенез.
На первом этапе сложные органические вещества превращаются в масляную, пропионовую и молочную кислоты. На втором этапе эти органические кислоты превращаются в усксусную кислоту, водород, углекислый газ. На третьем этапе метанообразующие бактерии
восстанавливают диокись углерода в метан с поглощением водорода. По видовому составу
биоценоз метатенков значительно беднее аэробных биоценозов.
Насчитывают около 50 видов микроорганизмов, способных осуществлять первую стадию - стадию кислотообразования. Самые многочисленные среди них - представители бацилл и псевдомонад. Метанообразующие бактерии имеют разнообразную форму: кокки, сарцины и палочки. Этапы анаэробного брожения идут одновременно, а процессы кислотообразования и метанообразования протекают параллельно. Уксуснокислые и метанообразующие
микроорганизмы образуют симбиоз, считавшийся ранее одним микроорганизмом под названием Methanobacillus omelianskii.
Процесс метанообразования - источник энергии для этих бактерий, так как метановое
брожение представляет собой один из видов анаэробного дыхания, в ходе которого электроны с органических веществ переносятся на углекислый газ, который восстанавливается до
метана. В результате жизнедеятельности биоценоза метатенка происходит снижение концентрации органических веществ и образование биогаза, являющегося экологически чистым топливом. Для получения биогаза могут использоваться отходы сельского хозяйства, стоки перерабатывающих предприятий, содержащих сахар, бытовые отходы, сточные воды городов,
спиртовых заводов и т.д.
Метатенк представляет собой герметичный ферментер объемом в несколько кубических
метров с перемешиванием, который обязательно оборудуется газоотделителями с противопламенными ловушками. Метатенки работают в периодическом режиме загрузки отходов
или сточных вод с постоянным отбором биогаза и выгрузкой твердого осадка после завершения процесса. В целом, активное использование метаногенеза при сбраживании органических отходов - один из перспективных путей совместного решения энергетических и экологических проблем, который позволяет агропромышленным комплексам перейти на автономное энергообеспечение.
Показатели загрязненности сточных вод. На всех этапах очистки сточных вод ведется
строгий контроль за качественным составом воды. При этом проводится детальный анализ
состава сточной воды с выяснением не только концентраций тех или иных соединений, но и
более полное определение качественного и количественного состава загрязнителей. Необходимость такого анализа определяется спецификой системы переработки, так как в сточных
53
водах могут присутствовать токсические вещества, способные привести к гибели микроорганизмов и вывести систему из строя.
Определение таких показателей, как органолептические (цвет, вид, запах, прозрачность,
мутность), оптическая плотность, рН, температура не вызывает трудностей. Сложнее определить содержание органических веществ в сточной воде, которое необходимо знать для
контроля работы очистных сооружений, повторного использования сточных вод в технологических процессах, выбора метода очистки и доочистки, окончания процесса очистки, а
также оценки возможности сброса воды в водоемы.
Биохимическое потребление кислорода измеряется количеством кислорода, расходуемым микроорганизмами при аэробном биологическом разложении веществ, содержащихся в
сточных водах при стандартных условиях за определенный интервал времени. Определение
биохимического потребления кислорода требует специальной аппаратуры. В герметичный
ферментер помещается определенное количество исследуемой сточной воды, которую засевают микроорганизмами. В процессе культивирования регистрируется изменение количества
кислорода, пошедшего на окисление соединения, присутствующего в сточных водах. Лучше
всего культивировать микроорганизмы из уже работающих биологических систем, адаптированных к данному спектру загрязнений. Т.о., биотехнология будет оказывать многообразное и все возрастающее влияние на способы контроля за окружающей средой и на ее состояние.
Литература:
Основная – 1 [255-257]; 3 [181-190].
Дополнительная – 3 [155-170].
Контрольные вопросы:
1. Какую роль играет биотехнология микроорганизмов в охране окружающей среды?
2. Какие микроорганизмы принимают участие в биодеградации ксенобиотиков?
3. Какие методы используют для очистки сточных вод и из каких этапов складывается
биотехнология очистки сточных вод?
2.3. Планы практических (семинарских) занятий:
Задание 1. Биотехнологическая сущность продуцентов спирта.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов спирта: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[14-28]; 2[12-30]; 4. Доп.: 1[4-12]; 2 [4-22].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства спирта?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 2. Биотехнологическая сущность продуцентов органических кислот.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов органических кислот: биологию, условия культивирования, технология производства,
применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[14-28]; 2[12-30]; 4. Доп.: 1[24-40]; 2 [12-18].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства органических кислот?
54
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 3. Биотехнологическая сущность продуцентов аминокислот.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов аминокислот: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 4. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства аминокислот?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 4. Биотехнологическая сущность продуцентов фермента эндонуклеазы
рестрикции.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов эндонуклеазы рестрикции: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 4. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства эндонуклеазы рестрикции?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 5. Биотехнологическая сущность продуцентов фермента субтилина.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов субтилина: биологию, условия культивирования, технология производства, применение
продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 4. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства субтилина?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 6. Биотехнологическая сущность продуцентов фермента глюкоамилазы.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов глюкоамилазы: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 4. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства глюкоамилазы?
2. Биологическая сущность продуцента.
55
Задание 7. Биотехнологическая сущность продуцентов фермента грибного солода.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов грибного солода: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 3. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства грибного солода?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 8. Биотехнологическая сущность продуцентов липидов.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов липидов: биологию, условия культивирования, технология производства, применение
продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 3. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства липидов?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 9. Биотехнологическая сущность продуцентов полисахаридов.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов полисахаридов: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 3. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства полисахаридов?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 10. Биотехнологическая сущность продуцентов витаминов.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов витаминов: биологию, условия культивирования, технология производства, применение
продукции.
Литература:
Осн.: 1[30-42]; 2[32-38]; 3. Доп.: 1[т.1]; 2 [т.1].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства витаминов?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 11. Биотехнологическая сущность продуцентов антибиотика.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов антибиотика: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[44-56]; 2[40-52]; 4. Доп.: 1[т.2]; 2 [т.2].
56
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства антибиотика?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 12. Биотехнологическая сущность продуцентов пинециллина.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов антибиотика: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[44-56]; 2[40-52]; 4. Доп.: 1[т.2]; 2 [т.2].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства антибиотика?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 13. Биотехнологическая сущность продуцентов хлортетрациклина.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов антибиотика: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[44-56]; 2[40-52]; 4. Доп.: 1[т.2]; 2 [т.2].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства антибиотика?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 14. Биотехнологическая сущность продуцентов актинородина.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов антибиотика: биологию, условия культивирования, технология производства, применение продукции.
Литература:
Осн.: 1[44-56]; 2[40-52]; 4. Доп.: 1[т.2]; 2 [т.2].
Контрольные вопросы:
1. Охарактеризовать биотехнологию производства антибиотика?
2. Биологическая сущность продуцента.
Задание 15. Сравнительная характеристика продуцентов.
Краткие методические указания. Раскрыть биотехнологическую сущность продуцентов в сравнительном аспекте.
Литература:
Осн.: 1[44-56]; 2[40-52]; 4. Доп.: 1[т.2]; 2 [т.2].
Контрольные вопросы:
1. Биологическая сущность продуцента.
2.4. Планы лабораторных занятий:
Тема 1. Правила безопасной работы в лаборатории «Биотехнология микроорганизмов».
Цель: Ознакомление с техникой и правилами безопасной работы. Организация лабо57
раторной работы при клеточных технологиях.
Иллюстрационный материал:
1. Таблица «Схема проведения лабораторных работ».
2. Рисунок «Аппараты и приборы, применяемые в биотехнологии».
Краткие методические рекомендации. Занятие (1 час) в условиях учебной лаборатории проходит два этапа: на первом этапе студенты знакомятся с организацией лаборатории и
правилами безопасной работы; на втором этапе студенты зарисовывают технологию проведения лабораторного исследования.
Материалы и оборудование: культуры клеток, микроскоп, дистиллятор, сушильный
шкаф, термостат, автоклав.
Задание 1. Правила и техника безопасности при работе в лаборатории.
Ход работы:
1. Ознакомиться с оснащением лаборатории.
Лаборатории по биотехнологии микроорганизмов обычно снабжены следующим оборудованием:
A. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей.
B. рН-метрами, дистилляторами, центрифугами, техническими и аналитическими весами, аппаратурой для фильтрования и др.
C. Набором инструментов: бактериологическими петлями, микробиологическими шпателями, пинцетами, спиртовками и др.
D. Лабораторной посудой: пробирками, чашками Петри, флаконами, пипетками и др.
E. Приборами для стерилизации оборудования, питательных сред и реактивов.
F. Необходимыми средствами пожарной и химической безопасности (огнетушителями,
дезинфицирующими растворами и т. д.).
2. Ознакомиться с правилами работы в лаборатории.
Основное правило работы в лаборатории – правильная организация работы. При этом
следует придерживаться следующего:
A. К работе в лаборатории допускаются лица после прохождения инструктажа по технике безопасности.
B. Все должны работать в медицинских халатах. Вход без халата воспрещен.
C. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
D. Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке, а личные вещи храниться
в специально отведенных местах.
E. При случайном попадании биологического материала на стол и т. д. это место необходимо тщательно вытереть дезинфицирующим раствором.
F. Результаты работы следует заносить в рабочий журнал.
G. После окончания работы следует вымыть руки.
3. Зарисовать технологию проведения исследования в условиях лаборатории.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[28-42]; 2 [16-34].
Контрольные вопросы:
1. Какие основные лабораторные приборы и оборудования, применяются при клеточных технологиях?
2. Какие правила безопасной работы Вами изучены при использовании тех или иных
приборов и оборудований, применяемых при клеточных технологиях?
Тема 2. Получение уксусной кислоты.
Цель: Изучение культивирования уксуснокислых бактерий и определение количества
образовавшейся уксусной кислоты.
58
Иллюстрационный материал:
1. Таблица «Биосинтез уксусной кислоты».
2. Рисунок «Схема биосинтеза уксусной кислоты».
Краткие методические рекомендации. Задание выполняется одним из двух вариантом
(5 часов): в первом варианте получают уксусную кислоту на синтетической среде Лойцянской, во втором варианте – получают фруктовый уксус из сухого вина.
Материалы и оборудование: пробы, культуры клеток, лабораторная посуда, микроскоп, дистиллятор, сушильный шкаф, термостат, автоклав.
Задание 2. Подготовка синтетической среды Лойцянской.
Ход работы:
1. В колбы вместимостью 500 мл внести 50 мл указанной среды.
2. Определите рН среды при помощи рН-метра. Для этого прибор через адаптер подключите к сети переменного тока 220 В.
Электроды (сравнения, вспомогательный и термокомпенсации) промыть дистиллированной водой, осушить и погрузить в исследуемую жидкость. Уровень погружения электрода в жидкость, для бесперебойной работы рН-метра, должен быть выше 16 мм.
Включить прибор нажатием кнопки On/Off, а кнопкой mV/рН выбрать режим измерения рН.
Через 30.. .60с снять показания и выключить прибор кнопкой On/Off.
3. Колбы со средами, закрыв ватной пробкой и бумажным колпачком, простерилизовать
в автоклаве в течение 30 мин при температуре 121 °С.
4. В охлажденную стерильную среду внести 0,5 мл посевного материала. В среду Лойцянской добавить 2-3 капли 96 % этилового спирта.
5. Колбы поместить в термостат при 30°С. В среду Лойцянской ежедневно вносить 2-3
капли 96 % этилового спирта.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[26-54]; 2 [32-41].
Контрольные вопросы:
1. Почему органические кислоты, полученные микробиологическим синтезом, предпочтительнее использовать в пищевой промышленности, чем кислоты, полученные органическим синтезом?
2. Какие микроорганизмы являются продуцентами уксусной кислоты?
3. Какие методики вы применили в работе?
Задание 3. Изучение культуры Acetobacter aceti на 7 день культивирования.
Ход работы:
6. Первую колбу извлечь из термостата через семь дней.
7. По окончании выращивания Acetobacter aceti описать культуральные признаки (наличие пленки, ее вид, осадок, запах и т. д.) и микроскопическую картину (форму, размер бактерий).
8. Отделить накопившуюся биомассу фильтрованием через складчатый фильтр.
9. Определить рН фильтрата при помощи рН-метра.
10. Провести качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого 10 мл фильтрата
перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить одну - две капли фенолфталеина и нейтрализовать 10 %-ным раствором соды (до появления устойчивой бледно-розовой окраски). Если в фильтрате присутствует уксусная кислота, то при добавлении раствора хлорида железа
(III), раствор приобретет красно-бурое окрашивание вследствие образования ацетата железа
(III).
59
11. Определить количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах. Для этого 10
мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить 10 мл воды и 2-3 капли фенолфталеина, титровать 0,1н раствором NaOH до слаборозовой неисчезающей окраски. Количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах вычислить по формуле (2.1):
0.006aK
100% (2.1)
X=
б
где a - число миллилитров 0,1 н раствора NaOH, пошедшего на титрование; б - число
миллилитров культуральной жидкости, взятой для титрования; K - поправка щелочи; 0,006 количество граммов уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора NaOH.
12. Последующие колбы извлечь из термостата через 14 (21, 28) дней и повторить пункты 7 - 11.
13. Все полученные результаты свести в табл. 2.1.
14. Построить графики зависимости накопления уксусной кислоты и уровня рН от длительности культивирования.
Таблица 2.1. Экспериментальные данные
Время культивирования, сут.
Культуральные
признаки
Морфологические
признаки
7
Уровень рН
Количество уксусной кислоты,
%
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[49-53].
Контрольные вопросы:
1. Приведите уравнение процесса образования уксусной кислоты.
2. Перечислите товарные формы уксусной кислоты. Чем отличаются технологии получения различных товарных форм?
Задание 4. Изучение культуры Acetobacter aceti на 14 день культивирования.
Ход работы:
1. Первую колбу извлечь из термостата через 14 дней.
2. По окончании выращивания Acetobacter aceti описать культуральные признаки (наличие пленки, ее вид, осадок, запах и т. д.) и микроскопическую картину (форму, размер бактерий).
3. Отделить накопившуюся биомассу фильтрованием через складчатый фильтр.
4. Определить рН фильтрата при помощи рН-метра.
5. Провести качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого 10 мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить одну - две капли фенолфталеина и нейтрализовать 10 %-ным раствором соды (до появления устойчивой бледно-розовой окраски). Если в
фильтрате присутствует уксусная кислота, то при добавлении раствора хлорида железа (III),
раствор приобретет красно-бурое окрашивание вследствие образования ацетата железа (III).
6. Определить количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах. Для этого 10
мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить 10 мл воды и 2-3 капли фенолфталеина, титровать 0,1н раствором NaOH до слаборозовой неисчезающей окраски. Количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах вычислить по формуле (2.1):
0.006aK
100% (2.1)
X=
б
где a - число миллилитров 0,1 н раствора NaOH, пошедшего на титрование; б - число
миллилитров культуральной жидкости, взятой для титрования; K - поправка щелочи; 0,006 количество граммов уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора NaOH.
60
7. Последующие колбы извлечь из термостата через 14 (21, 28) дней и повторить пункты 7 - 11.
8. Все полученные результаты свести в табл. 2.2.
9. Построить графики зависимости накопления уксусной кислоты и уровня рН от длительности культивирования.
Таблица 2.2. Экспериментальные данные
Время культивирования, сут.
Культуральные
признаки
Морфологические
признаки
Уровень рН
14
Количество уксусной кислоты,
%
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[63-81]; 2 [65].
Контрольные вопросы:
1. Как производится выпрашивание Acetobacter aceti в лабораторных условиях на синтетической среде Лойцянской и на основе сухого вина?
2. Перечислите культуральные и морфологические признаки Acetobacter aceti.
Задание 5. Изучение культуры Acetobacter aceti на 21 день культивирования.
Ход работы:
1. Первую колбу извлечь из термостата через 21 день.
2. По окончании выращивания Acetobacter aceti описать культуральные признаки (наличие пленки, ее вид, осадок, запах и т. д.) и микроскопическую картину (форму, размер бактерий).
3. Отделить накопившуюся биомассу фильтрованием через складчатый фильтр.
4. Определить рН фильтрата при помощи рН-метра.
5. Провести качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого 10 мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить одну - две капли фенолфталеина и нейтрализовать 10 %-ным раствором соды (до появления устойчивой бледно-розовой окраски). Если в
фильтрате присутствует уксусная кислота, то при добавлении раствора хлорида железа (III),
раствор приобретет красно-бурое окрашивание вследствие образования ацетата железа (III).
6. Определить количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах. Для этого 10
мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить 10 мл воды и 2-3 капли фенолфталеина, титровать 0,1н раствором NaOH до слаборозовой неисчезающей окраски. Количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах вычислить по формуле (2.1):
0.006aK
X=
100% (2.1)
б
где a - число миллилитров 0,1 н раствора NaOH, пошедшего на титрование; б - число
миллилитров культуральной жидкости, взятой для титрования; K - поправка щелочи; 0,006 количество граммов уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора NaOH.
Таблица 2.3. Экспериментальные данные
Время культивирования, сут.
Культуральные
признаки
Морфологические
признаки
21
61
Уровень рН
Количество уксусной кислоты,
%
7. Последующие колбы извлечь из термостата через 14 (21, 28) дней и повторить пункты 7 - 11.
8. Все полученные результаты свести в табл. 2.3.
9. Построить графики зависимости накопления уксусной кислоты и уровня рН от длительности культивирования.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[81-92].
Контрольные вопросы:
1. Какие факторы влияют на процесс культивирования уксуснокислых бактерий и количество образовавшейся уксусной кислоты?
2. Какой способ используют для промышленного получения уксусной кислоты и чем он
отличается от используемых ранее способов?
Задание 6. Изучение культуры Acetobacter aceti на 28 день культивирования.
Ход работы:
1. Первую колбу извлечь из термостата через 28 дней.
2. По окончании выращивания Acetobacter aceti описать культуральные признаки (наличие пленки, ее вид, осадок, запах и т. д.) и микроскопическую картину (форму, размер бактерий).
3. Отделить накопившуюся биомассу фильтрованием через складчатый фильтр.
4. Определить рН фильтрата при помощи рН-метра.
5. Провести качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого 10 мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить одну - две капли фенолфталеина и нейтрализовать 10 %-ным раствором соды (до появления устойчивой бледно-розовой окраски). Если в
фильтрате присутствует уксусная кислота, то при добавлении раствора хлорида железа (III),
раствор приобретет красно-бурое окрашивание вследствие образования ацетата железа (III).
6. Определить количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах. Для этого 10
мл фильтрата перенести пипеткой в стакан на 100 мл, добавить 10 мл воды и 2-3 капли фенолфталеина, титровать 0,1н раствором NaOH до слаборозовой неисчезающей окраски. Количество образовавшейся уксусной кислоты в процентах вычислить по формуле (2.1):
0.006aK
X=
100% (2.1)
б
где a - число миллилитров 0,1 н раствора NaOH, пошедшего на титрование; б - число
миллилитров культуральной жидкости, взятой для титрования; K - поправка щелочи; 0,006 количество граммов уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора NaOH.
7. Последующие колбы извлечь из термостата через 14 (21, 28) дней и повторить пункты 7 - 11.
8. Все полученные результаты свести в табл. 2.4.
9. Построить графики зависимости накопления уксусной кислоты и уровня рН от длительности культивирования.
Таблица 2.4. Экспериментальные данные
Время культивирования, сут.
Культуральные
признаки
Морфологические
признаки
Уровень рН
28
Вариант 2. Получение фруктового уксуса из сухого вина.
62
Количество уксусной кислоты,
%
1. Приготовить сухое вино с концентрацией спирта 6 . . . 7 % об. Для этого с помощью
спиртометра определить содержание алкоголя и довести его количество до требуемого путем
добавления кипяченой водопроводной воды.
2. В колбы вместимостью 500 мл цилиндром налить 100 мл подготовленного сухого
вина, внести пипеткой 1 мл посевного материала и закрыть ватной пробкой.
3. Колбы поместить в термостат при 30 °С. Далее выполнять работу согласно пунктам
6 - 14 варианта 1.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[99-120].
Контрольные вопросы:
1. Какие факторы влияют на процесс культивирования бактерий и количество образовавшейся фруктовой кислоты?
2. Какой способ используют для промышленного получения фруктовой кислоты и чем
он отличается от используемых ранее способов?
Тема 3. Получение безалкогольного напитка при выращивании комплекса микроорганизмов чайного гриба.
Цель: Ознакомиться с симбиозом микроорганизмов в природе с использованием этого
явления в практических целях.
Иллюстрационный материал:
1. Таблица «Биология (генетика и физиология) чайного гриба».
2. Рисунок «Чайный гриб».
Краткие методические рекомендации. Задание выполняется в два этапа (4 часа): на
первом этапе готовят среду для развития чайного гриба и его посев, на втором проводят анализ готового напитка.
Материалы и оборудование: пробы, культуры клеток, лабораторная посуда, микроскоп, дистиллятор, сушильный шкаф, термостат, автоклав.
Задание 7. Биология чайного гриба.
Ход работы: Изучить биологию чайного гриба.
В природе широко распространен симбиоз микроорганизмов, и это можно наблюдать
в чайном грибе, в котором совместно развиваются дрожжи (дрожжевые грибки) и уксуснокислые бактерии. Таким образом, чайный гриб - это культура двух одновременно живущих
микроорганизмов, образующих толстую слизистую пленку на поверхности подсахаренного
чайного настоя. В результате их жизнедеятельности и образуется чайный квас, приобретающий слегка газированный кисловато-сладкий вкус. В банке готового чайного настоя можно
видеть, что на поверхности прозрачно-буроватой жидкости "плавает" толстый диск: сверху
белый, плотный и блестящий, снизу - сероватый и рыхлый. Научное название чайного гриба
- медузомицет - обусловлено сходством с медузой.
Тело чайного гриба представляет собой колонию дрожжей и уксуснокислых бактерий.
Дрожжи, занимающие нижнюю часть слоевища гриба, перерабатывают содержащиеся в растворе сахар на спирт и углекислый газ (диоксид углерода), тем самым подготавливая питательную среду для уксуснокислых бактерий, которые склеены между собой особым веществом и образуют верхнюю, плотную часть гриба. Состав уксуснокислых бактерий неодинаков,
а поэтому и вырабатываемые ими вещества неоднородны. Одни из них окисляют образованный дрожжами этиловый спирт в уксусную кислоту, другие превращают сахарозу в глюкозу
и фруктозу и окисляют моносахара до глюконовых кислот. Образовавшиеся кислоты используются дрожжами для синтеза витаминов, необходимых для развития уксуснокислых бактерий.
63
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[99-120].
Контрольные вопросы:
1. Что собой представляет чайный гриб?
2. Какую продукция получают от чайного гриба?
Задание 8. Условия культивирования чайного гриба.
Ход работы: Изучить условия культивирования чайного гриба.
Для того чтобы получить качественный "чайный гриб", необходимо тщательно соблюдать чистоту на стадии его приготовления. Для создания оптимальных условий рекомендуется концентрация сахара в напитке 10 %, температура окружающей среды 25.. .30 °С,
продолжительность настаивания - одна-две недели.
Обязательный компонент жидкости, в которой развивается гриб, - настой чая, который служит источником азотистых веществ для дрожжей и уксуснокислых бактерий и сахарозы - источник углерода.
1. Вскипятить 1 л воды, добавить в воду одну чайную ложку (или один пакетик) чая.
2. Через 1 5 - 2 0 мин, когда раствор настоится, добавить в него 100 г сахарозы (сахарного песка), тщательно перемешать, остудить до температуры 2 5 - 3 0 °С.
3. Подготовленный раствор отфильтровать через капроновое или металлическое ситечко непосредственно в подготовленную банку (объемом 2-3 литра).
4. Внести в подготовленный чайный раствор слой чайного гриба, отделенного от уже
растущего и используемого в качестве маточной культуры чайного гриба. Культивирование
проводить при комнатной температуре ( 2 0 - 2 5 °С), накрыв банку с грибом салфеткой.
Полученный напиток может быть использован для определения в нем некоторых продуктов
метаболизма. В банку по мере необходимости заливают раствор чая и сахарный песок для
получения новой порции чайного напитка. Разросшийся чайный гриб в дальнейшем можно
разрезать на мелкие кусочки, как по горизонтали, так и по вертикали и засевать новые емкости с подготовленным чайно-сахарным раствором.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[99-120].
Контрольные вопросы:
1. Какие методы культивирования используются для чайного гриба?
2. Какие условия следует учитывать при культивировании чайного гриба?
Задание 9. Определение количества накопившихся кислот (молочной кислоты).
Ход работы:
Для оценки качества напитка определяют количество накопившихся кислот.
1. Определить уровень рН (см. лабораторную работу 2-3). Обычно рН настоя имеет кислую реакцию в зоне рН от 5 до 3.
2. Определить массовую долю молочной кислоты титрометрическим методом.
Метод основан на нейтрализации молочной кислоты гидроокисью натрия (омыление
ангидридов лактилмолочных кислот щелочью) при нагревании и нейтрализации избытка щелочи серной кислотой.
В коническую колбу со шлифом объемом 250 мл внести 10 мл настойки чайного гриба, 80 мл дистиллированной воды и 20 мл раствора 1 н NaОН, перемешать и кипятить с обратным холодильником в течение 5 мин.
Затем охладить, предварительно закрыв колбу пробкой с трубкой, наполненной натронной известью, добавить 3 капли раствора фенолфталеина и титровать раствором 1н
Н2SО4 до обесцвечивания.
64
Параллельно провести контрольный опыт. В коническую колбу со шлифом объемом
250 мл внести 20 мл 1 н NaОН, 90 мл дистиллированной воды; кипятить с обратным холодильником в течение 5 мин; охладить, закрыв ее пробкой с трубкой, наполненной натронной
известью; добавить 3 капли раствора фенолфталеина и титровать 1 н Н2SО4 до обесцвечивания.
3. Массовую долю молочной кислоты X, % вычислить по формуле (9.1):
(V - V )K × 0.09 (9.1)
X = on k
100
где Von - объем 1 н Н2SО4, израсходованной на титрование избытка 1 н NaОН опытной
пробы, мл;
VК - объем 1 н Н2SО4, израсходованной на титрование избытка 1 н NaОН контрольной
пробы, мл;
K - поправочный коэффициент для раствора 1 н NaОН;
0,09 - масса молочной кислоты, соответствующая 1 см3 1 н NaОН, г/см3;
V - объем раствора чайного гриба, взятого на анализ, мл;
100 - коэффициент пересчета на 100 мл раствора чайного гриба.
4. Определить массовую концентрацию уксусной кислоты (титруемую кислотность)
по количеству гидроокиси натрия, израсходованной на титрование уксусной кислоты, содержащейся в растворе чайного гриба.
В стакан пипеткой внести 5 мл раствора чайного гриба, добавить 10 мл дистиллированной воды и две-три капли раствора фенолфталеина и титровать раствором 0,1 н NaОН до
появления неисчезающего в течение 30 с розового окрашивания.
5. Массовую концентрацию уксусной кислоты (титруемую кислотность Р) в г/100 мл
вычислить по формуле
0.06 ×100V1
P=
(9.2)
V2
где 0,06 - количество уксусной кислоты в г, соответствующее 1 мл раствора 0,1 н
NaОН; V1 - количество раствора 0,1 н NaОН, пошедшего на титрование; V2 - количество раствора чайного гриба, взятого на титрование, мл.
За окончательный результат принять среднеарифметическое Р двух параллельных определений Р1 и Р2.
6. В виде табл. 9.1 записать, как в процессе культивирования менялись физикохимические и органолептические показатели настоя чайного гриба (задания 7-9).
7. Сделать заключение по лабораторной работе о продолжительности культивирования чайного гриба для получения качественного слегка газированного напитка.
Таблица 9.1. Результаты анализа физико-химических и органолептических показателей настоя чайного гриба
Время культивирования, сут
уровен ь рН
Показатели
количество молочной кислоты,
%
количество уксусной кислоты,
%
Органолептическая
оценка
5
7
10
14
Литература: Осн.: 5. Доп.: 1[120-140]; 2 [96-144].
Контрольные вопросы:
1. Симбиоз каких микроорганизмов представляет собой биомасса чайного гриба?
2. Чем вызвано научное название чайного гриба – медузомицет?
65
3. Какие условия необходимо поддерживать в процессе культивирования биомассы
чайного гриба?
Тема 4. Изучение особенностей биосинтеза лимонной кислоты при поверхностном культивировании микроскопических грибов.
Цель: Изучить влияние состава питательной среды на биосинтез лимонной кислоты
при культивировании микроскопических грибов Aspergillus niger.
Иллюстрационный материал:
1. Таблица «Биология (генетика, морфология и физиология) Aspergillus niger».
2. Рисунок «Схема биосинтеза лимонной кислоты».
Краткие методические рекомендации. Задание выполняется в два этапа (4 часа): на
первом этапе готовят питательную среду и посев, на втором – анализируют биохимическую
активность продуцента.
Материалы и оборудование: пробы, культуры клеток, лабораторная посуда, микроскоп, дистиллятор, сушильный шкаф, термостат, автоклав.
Задание 10. Культивирование микроскопических грибов Aspergillus niger
Ход работы:
1. Приготовить 100 мл жидкой питательной среды в конической колбе из компонентов
по одному из вариантов, указанных в табл. 10.1.
Взвесить на технических весах пустой стаканчик, поместить в него необходимое количество мелассы, навеску перенести в коническую колбу, смывая остатки мелассы со стенок и дна стаканчика указанным в таблице количеством воды, затем добавить в колбу мерным цилиндром 10 мл раствора солей.
2. Измерить кислотность питательной среды рН-метром. Для этого включить прибор
в сеть; промыть электроды дистиллированной водой, просушить фильтровальной бумагой и
опустить в стаканчик с питательной средой; установить переключатель вида компенсации
(КТ-Р) в положение "КТ"; переключатель вида измерения (рН, °С, mV) установить в положение "рН"; после установления показаний считать результат измерения.
3. Перелить питательную среду из стаканчика рН-метра в коническую колбу; закрыть
колбу ватной пробкой и бумажным колпачком, подписать и стерилизовать 15 мин при 1 атм.
в автоклаве.
4. Внести в остывшую до температуры 30 °С питательную среду посевной материал.
Для этого в пробирку с культурой Aspergillus niger на сусло-агаре залить стерильную воду до
верхнего края косяка. Проводя бактериологической петлей по поверхности косяка, перенести
в воду часть темного конидиального слоя. Полученную водную суспензию конидий перемешать, отобрать стерильной пипеткой 0,5 мл и вылить в колбу со стерильной средой. Поместить колбу в термостат с температурой 30 °С на семь суток.
Компоненты питательной среды
1
Меласса, г (содержание сахарозы 46%)
Раствор солей, мл, концентрацией, мг/мл:
NH4NO3 - 2,3;
KH2PO4 - 0,2;
MgSO4 х 7H2O - 1,0;
ZnSO4 - 0,02;
FeSO4 х 7H2O - 0,06
Вода водопроводная, мл
66
2
60
50
60
65
Варианты
3
4
40
30
10
70
75
5
20
80
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[121-163].
Контрольные вопросы:
1. Назовите органические кислоты, которые получают микробиологическим синтезом.
2. Какие микроорганизмы являются продуцентами лимонной кислоты?
3. Какие вещества, входящие в состав питательной среды, являются источниками углерода, азота, фосфора, макро- и микроэлементов?
4. Напишите суммарное уравнение процесса образования лимонной кислоты.
Задание 11. Биохимическая активность культуры Aspergillus niger
Ход работы:
1. Изучить биохимическую активность культуры. Для этого отделить мицелий от
культуральной жидкости фильтрованием и определить массу мицеллиальной пленки взвешиванием на технических весах. Измерить объем культуральной жидкости мерным цилиндром, измерить рН культуральной жидкости рН-метром. Определить содержание лимонной
кислоты в культуральной жидкости путем титрования щелочью: поместить пипеткой 2 мл
фильтрата в коническую колбу; добавить мерным цилиндром 200 мл дистиллированной воды, 3-4 капли фенолфталеина и титровать из бюретки 0,1 н NaOH до слаборозовой окраски.
Таблица 11.1. Экспериментальные и расчетные показатели
Биохимические показатели
1
2
Варианты
3
4
5
Количество сахара в питательной среде, г/л
рН питательной среды
рН культуральной жидкости
Объем культуральной жидкости, мл
Объем 0,1 н NaOH на титрование, мл
Масса мицеллиальной пленки, г
Содержание лимонной кислоты в 1 мл культуральной жидкости, г/мл
Выход лимонной кислоты от исходного сахара, %
Продуцирующая способность, г/г
2. Рассчитать содержание лимонной кислоты в 1 мл культуральной жидкости по формуле (3.1), выход лимонной кислоты в процентах от исходного сахара по формуле (см. метод.) и продуцирующую способность культуры по формуле (см. метод.). Построить графические зависимости этих показателей от концентрации сахарозы в питательной среде.
3. Результаты измерений и расчетов свести в табл. 11.1.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[121-163].
1.
боте?
2.
3.
4.
Контрольные вопросы:
Какие методы изучения биохимической активности культуры применяются в этой раНазовите основные технологические стадии производства лимонной кислоты.
Как рассчитать выход лимонной кислоты?
Что такое продуцирующая способность культуры?
67
5. Как будет отличаться величина продуцирующей способности пленок гриба Aspergillus
niger одинаковой массы, используемых для биосинтеза лимонной кислоты, если на титрование одной культуральной жидкости пошло 10 мл 0,1 н раствора NaOH, а другой - 2,5 мл?
6. Какие методы используют для выделения лимонной кислоты из культуральной жидкости?
Тема 5. Влияние состава питательной среды на накопление амилазы при твердофазном культивировании микомицета.
Цель: Изучить влияние состава питательной среды на накопление амилолитических
ферментов при твердофазном культивировании микроскопического гриба Aspergillus oryzae.
Иллюстрационный материал:
1. Таблица «Биология (генетика, морфология и физиология) Aspergillus oryzae».
2. Рисунок «Схема биосинтеза амилазы».
Краткие методические рекомендации. Задание выполняется в два этапа (4 часа): на
первом этапе готовят питательную среду и посев, на втором – экстрагируют ферменты и анализируют активность амилазы в вытяжке.
Материалы и оборудование: пробы, культуры клеток, лабораторная посуда, микроскоп, дистиллятор, сушильный шкаф, термостат, автоклав.
Задание 12. Подготовка питательной среды и выполнение посева.
Ход работы:
1. Определить влажность сырьевых компонентов - пшеничных отрубей и опилок.
Просушить бумажные конверты (16 х 16 см) при 160 °С в течение трех минут и охладить в эксикаторе. Взвесить пустой пакет, заполнить отрубями или опилками и взвесить навеску 5 г. Распределить материал тонкими слоем и сушить при 160 °С шесть минут, охладить
в эксикаторе и взвесить.
2. Рассчитать влажность по формуле
a -c
X =
100%
a -b
где а - масса конверта с влажной навеской, г; с - масса конверта с высушенной навеской, г; b
- масса пустого конверта, г.
3. Среднюю величину влажности пшеничных отрубей и опилок рассчитать по результатам двух параллельных опытов и внести в табл. 12.1.
Таблица 12.1. Результаты определения влажности
№ Наименование среды
опыта
1
2
Пшеничные отруби
Пшеничные отруби
3
4
Опилки
Опилки
Масса навески, г
влажной
высушенной
Количеств о Влажность, Средняя
W, %
влажность
испаренной
Wср, %
влаги, г
4. Приготовить шесть вариантов питательной среды по 20 г, отличающихся соотношением пшеничных отрубей и древесных опилок, которые участвуют в разрыхлении среды, и регулировании содержания крахмала, согласно табл. 12.2.
68
5. Рассчитать массу компонентов для каждого варианта, взвесить на технических весах.
Высыпать на гладкую поверхность (стекло) опилки, отруби и смешать.
6. Рассчитать количество воды, необходимое для увлажнения среды до 60 % влажности.
Уменьшить расход воды на 1 мл, учитывая посевной материал вводимый в виде суспензии
конидий. Результаты расчета внести в табл. 12.3.
Таблица 12.2. Содержание компонентов
Компоненты, %
1
2
Варианты
3
4
5
6
Пшеничные отруби
Древесные опилки
Таблица 12.3. Результаты определения расхода воды для увлажнения среды
Варианты
1 2 3
Промежуточные данные
4
5
6
7. Отмерить необходимое количество воды мерным цилиндром, медленно приливая ее
к массе; перемешивать для равномерного увлажнения частиц.
Увлажненную массу перенести в коническую колбу. Во избежание загрязнения поверхности горлышка колбы следует использовать металлическую воронку.
Колбы закрыть ватной пробкой, бумажным колпачком и стерилизовать 30 мин при
120°С в автоклаве. Содержимое колбы после стерилизации и охлаждения интенсивно встряхнуть.
7. Для изучения влияния влажности питательной среды на накопление ферментов приготовить шесть вариантов сред по 20 г с разным содержанием влаги, согласно табл. 12.4.
Взвесить навески пшеничных отрубей и древесных опилок по варианту 4 табл. 12.2. Рассчитать влажность среды и расход воды до достижении влажности уменьшая его на 1 мл суспензии посевного материала согласно заданию 3. Результаты расчета внести в табл. 12.3.
Дальнейшие операции выполнить как в п. 8.
Таблица 12.4. Рекомендуемая влажность питательной среды
Показатели влажности
Заданная влажность, %
Влажность среды до увлажнения,
%
Расход воды на 20 г среды, мл
Варианты
1
2
3
4
5
6
45 50 55 60 65 70
8. Засеять питательную среду суспензией спор гриба. Для этого в пробирку с культурой
гриба на скошенной агаризованной среде налить стерильную воду до верхнего края косяка.
Конидий перевести концом стерильной пипетки во взвешенное состояние и отобрать 1 мл
суспензии спор, перенося ее затем в колбу со стерильной средой. После засева среду тщательно перемешать путем встряхивания и пересыпать в стерильную кювету, потом закрыть
ее крышкой. Кювета имеет перфорации для воздухообмена. Операции по засеву среды необходимо производить, соблюдая асептические условия, возле пламени спиртовки. Кюветы с
69
засеянной средой поместить в термостат. Выращивание проводить в течение 4 8 . 5 4 ч при
температуре 33 °С в течение первых 12 ч роста и 2 8 . 3 0 °С - в последующие.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[96-142].
Контрольные вопросы:
1. Почему не рекомендуют выращивать в условиях твердофазного культивирования
бактерии и дрожжи?
2. Какие параметры технологического процесса влияют на уровень накопления ферментов при твердофазном культивировании микроскопических грибов?
2. Каким методом можно воспользоваться для выделения ферментов из поверхностной
культуры?
3. Что представляет собой биошрот?
4. Какова химическая природа крахмала?
Задание 13. Экстрагирование фермента и анализ активности амилазы в вытяжке.
Выросшая культура имеет вид коржа с пушистой поверхностью. Для каждого коржа
следует определить влажность (для высушивания брать 3 г культуры) и амилолитическую
активность.
Порядок выполнения работы:
1. Провести экстракцию ферментов из выросшей культуры гриба. Корж тщательно
измельчить в кювете с помощью шпателя и на технических весах взвесить 5 г поверхностной
культуры. Шпатель обязательно погрузить в дезинфицирующий раствор. Взвешенную порцию поместить в фарфоровую ступку и тщательно растереть пестиком со 100 мл забуференной дистиллированной воды, которую получают путем смешивания 10 мл ацетатного буфера
(рН 4,7) и 90 мл дистиллированной воды.
После чего поместить в термостат на 30 мин при 30 °С. По истечению времени экстракции содержимое фарфоровых ступок перенести на капроновый фильтр и хорошо отжать
для отделения экстракта от биошрота (остатков питательной среды и мицелия).
2. Определить влажность выросшей культуры, аналогично п.1 занятия 12 данной лабораторной работы, оформить табл.12.4.
3. Осветлить полученный экстракт (вытяжку) путем центрифугирования. Для этого
мерным цилиндром отмерить 25 мл фильтрата и перенести в центрифужные стаканчики, которые устанавливают на роторе центрифуги попарно напротив друг друга. Центрифугирование длится 5 мин при 3 тыс. оборотах. Осветленный экстракт слить в колбу для дальнейшего
анализа.
4. Определить амилолитическую способность (АС) экстракта, используя капельный
метод (по Климовскому и Родзевич).
В основе метода лежит способность фермента амилазы, находящегося в вытяжке, катализировать гидролиз крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов.
Для определения АС важно строго соблюдать температурные условия реакции. Для
этого все растворы - субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до 30 °С в ультратермостате в течение 10 мин.
В широкую пробирку залить 25 мл раствора крахмала. Не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавить воду, а затем вытяжку от 1 до 25 см3. Общий объем
реакционной смеси должен составлять 50 см3. Если ферментная вытяжка малоактивна, то
можно внести только ее в количестве 25 см3, а воду вообще не добавлять.
Содержимое в пробирке перемешать палочкой и отметить время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала:
• каждые 60 с из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирать палочкой каплю
пробы;
70
• каплю помещать на белую фарфоровую пластину, соединяя эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдать окраску;
• реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать
изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 с;
• изменение окраски йода отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель йода и реакционной смеси. Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах 1 0 - 2 0 мин.
Если время гидролиза крахмала менее 10 мин, то определение повторяют, уменьшая
объем вытяжки, а увеличивая объем воды. Если гидролиз крахмала не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, увеличивая объем ферментной вытяжки и уменьшая
объем воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный
анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.
5. Рассчитать амилолитическую активность по формуле.
6. Результаты расчетов для различных вариантов питательных сред свести в табл.
12.5.
Таблица 13.5. Результаты исследования
Вариант
среды
Состав среды, %
Влажность
пшеничные отруби древесные опилки вода культуры, %
АС,
ед/г
7. Построить графики зависимостей амилолитической активности полученных методом твердофазного культивирования ферментных препаратов от содержания пшеничных отрубей (крахмала) и влажности питательной среды.
Литература:
Осн.: 5. Доп.: 1[96-142].
Контрольные вопросы:
1. К какому классу ферментов относится амилаза? В чем заключается механизм ее
действия?
2. Как определяют количество фермента в исследуемом образце?
3. Какая величина принимается за единицу активности фермента?
4. Как можно уменьшить или увеличить время гидролиза при определении амилолитической способности?
5. Как изменяется окраска реакционной смеси при добавлении раствора йода в процессе реакции гидролиза крахмала?
Задание 14. Проведение семинара, посвященного обсуждению результатов лабораторного практикума.
Цель: Обсуждение результатов лабораторных исследований.
Краткие методические рекомендации. Студенты по подготовленным отчетам знакомят присутствующих с полученными результатами (2 часа).
Литература:
Осн.: 1 [72-96]; 2[58-74]; 3. Доп.: 1[т.3]; 2 [т.3].
Контрольные вопросы:
1. Какие методы биотехнологии Вами были использованы при проведении лабораторных исследований?
2. Какие приборы и оборудования Вами были использованы при проведении лабораторных работ?
3. Какие основные методики Вами были использованы при проведении лабораторного
практикума?
71
Задание 15. Проведение семинара, посвященного обсуждению результатов лабораторного практикума (продолжение задания 14).
Цель: Обсуждение результатов лабораторных исследований.
Краткие методические рекомендации. Студенты по подготовленным отчетам знакомят присутствующих с полученными результатами (4 часа).
Литература:
Осн.: 1 [72-96]; 2[58-74]; 3. Доп.: 1[т.3]; 2 [т.3].
Контрольные вопросы:
1. Какие методы биотехнологии Вами были использованы при проведении лабораторных исследований?
2. Какие приборы и оборудования Вами были использованы при проведении лабораторных работ?
3. Какие основные методики Вами были использованы при проведении лабораторного
практикума?
2.5. Планы занятий в рамках самостоятельной работы студентов под руководством
преподавателя (СРСП)
Таблица 2.4.1.
Рекомен№
Задание
Методические
Форма
дуемая
рекомендации
провелитератудения
ра
занятий
1
2
3
4
5
Осн: 1-3
1. Микробиологический синтез: Получить общее представ- Беседа
Доп: 1-2
основные понятия
ление о микробиологическом синтезе
Осн: 1-3
2. Характеристика
основных Охарактеризовать основные ПисьДоп: 1-2
продуктов
биотехнологии продукты микробиологиче- менная
работа
микробного синтеза. Основ- ского синтеза
ные направления их использования.
роль
влияния Решение Осн: 1-3
3. Роль внешних факторов в ре- Изучить
Доп: 1-2
гуляции жизнедеятельности внешних факторов в регу- задач
микроорганизмов, закон ми- ляции жизнедеятельности
микроорганизмов
нимума
4. Влияние физических факто- Изучить влияние физиче- Презен- Осн: 1-3
Доп: 1-2
ров на рост и развитие мик- ских факторов на рост и тация,
развитие микробной клетки тренинг
робной клетки в культуре
в культуре
Осн: 1-3
5. Химические вещества. Спе- Изучить специфичность и Опрос
Доп: 1-2
цифичность и механизм их механизм действия химичедействия. Химические веще- ских веществ на рост и разства, используемые на пред- витие микробной клетки в
приятиях биотехнологической культуре
промышленности
6. Биологические
факторы. Изучить влияние биологи- Тренинг Осн: 1-3
Доп: 1-2
Симбиоз, антагонизм, парази- ческих факторов и их знатизм; их значение в процессе чение в процессе производпроизводства и хранения био- ства и хранения биотехнологических продуктов
технологических продуктов
72
1
7.
2
Взаимосвязь и регуляция обменных процессов в микробной клетке
Технологические
аспекты
производства продуктов микробного синтеза
Типовые схемы производства
микробных метаболитов
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
3
Изучить взаимосвязь и регуляцию обменных процессов в микробной клетке
Освоить технологические
аспекты производства продуктов микробного синтеза
Изучить типовые схемы
производства микробных
метаболитов
Биосинтез антибиотиков и их Изучить типовые схемы
роль в организме
биосинтеза антибиотиков
Биосинтез витаминов: вита- Изучить типовую схему
биосинтеза витаминов
мины групп В и D.
Каратиноиды, аскорбиновая
кислота.
Характеристика
промышленных методов получения
Биосинтез липидов и их про- Изучить типовую схему
изводных: биосинтез насы- биосинтеза липидов и их
щенных
и ненасыщенных производных
жирных кислот, триацилглицеринов, фосфолипидов, стероидов. Регуляция биосинтеза
Биосинтез аминокислот и Изучить типовую схему
белка
биосинтеза аминокислот и
белка
Биотехнология
микробных Изучить типовую схему
ферментных препаратов
биосинтеза
ферментных
препаратов
Перспективные технологии и Ознакомиться с перспекпродуценты в микробном тивными технологиями и
продуцентами
синтезе
4
Опрос
5
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Круглый Осн: 1-3
стол
Доп: 1-2
Презентация
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Опрос
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Семинар Осн: 1-3
Доп: 1-2
Презентация,
тренинг
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Отчет
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Презен- Осн: 1-3
Доп: 1-2
тация,
тренинг
Семинар Осн: 1-3
Доп: 1-2
2.6. Планы занятий в рамках самостоятельной работы студентов (СРС)
№
Задание
Методические
рекомендации
1
1
2
Генетика микроорганизмов и
микробиологическая
промышленность
Технология
производства
микробной биомассы
БОК: белок одноклеточных
микроорганизмов
БАВ: биологически активные
вещества
Биосинтез аминокислот
3
Изучить генетику микроорганизмов
2
3
4
5
Ознакомиться с технологией производства микробной биомассы
Получить общее представление о
БОК
Получить общее представление о
БАВ
Изучить типовую схему биосинтеза
аминокислот
73
Таблица 2.5.1.
Рекомендуемая литература
4
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
1
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2
Биосинтез белка
3
Изучить типовую схему биосинтеза
белка
Биосинтез ферментов
Изучить типовую схему биосинтеза
ферментов
Биосинтез витаминов
Изучить типовую схему биосинтеза
витаминов
Биосинтез органических ки- Изучить типовую схему биосинтеза
слот
органических кислот
Изучить типовую схему микробиоМикробиологическая транслогической трансформации оргаформация органических сонических соединений
единений
Биосинтез алкалоидов
Изучить типовую схему биосинтеза
алкалоидов
Биосинтез антибиотиков
Изучить типовую схему биосинтеза
антибиотиков
Иммобилизованные клетки
Изучить технологию получения
микроорганизмов
иммобилизованных клеток микроорганизмов
Иммобилизованные ферменПолучить общее представление об
ты
иммобилизованных ферментах
Перспективы биотехнологии
Ознакомиться с перспективами
микроорганизмов
биотехнологии микроорганизмов
4
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
Осн: 1-3
Доп: 1-2
2.7. Тематика курсовых работ:
1. Микробиологические аспекты биотехнологии.
2. Промышленные микроорганизмы.
3. Микробиологические ферментные системы для промышленных процессов.
4. Основы микробиологического производства.
5. Важность и разнообразие микробных продуктов.
6. Промышленные микробиологические процессы.
7. Управление ростом и метаболизмом микроорганизмов в промышленных условиях.
8. Белок одноклеточных: технология производства на макроуровне.
9. Продукты метаболизма микроорганизмов на макроуровне.
10. Микробиологическое производство антибиотиков.
11. Микробиологическое производство аминокислот.
12. Микробиологическое производство белков.
13. Микробиологическое производство рекомбинантных белков.
14. Микробиологическое производство органических кислот.
15. Микробиологическое производство витаминов.
16. Микробиологическое производство липидов.
17. Микробиологическое производство алкалоидов.
18. Микробиологическое производство ферментов.
19. Генетика микроорганизмов и микробиологическая промышленность.
20. Ферменты микроорганизмов и их применение.
Структура и содержание курсовых работ:
Цель и задачи курсовой работы. Курсовая работа выполняется студентами самостоятельно с целью закрепления и углубления знаний, выработки умения применять теоретический материал для решения конкретных практических задач.
Каждая работа должна решать три основные задачи: показать знания и состояние изу74
ченности избранной темы, пути решения биотехнологических задач, путем применения математических методов, вытекающие из избранной темы и определить ожидаемый экономический эффект, обоснованный расчетами.
Порядок выполнения и защиты курсовой работы. После получения темы в первую очередь следует осуществить поиск и отобрать литературу, содержащую новейшие достижения
науки и практики по данной теме. В этом могут оказать помощь преподаватели кафедры, работники библиотеки института и центральной научной библиотеки.
Руководствуясь данными методического указания и на основании изучения соответствующей литературы студент составляет предварительный план написания курсовой работы и
согласует его с тьютером, после чего приступает к его выполнению. В процессе выполнения
работы студент может получить систематическую консультацию у преподавателя кафедры.
По завершению оформления курсовая работа сдается на кафедру и регистрируется в специальном журнале. Курсовая работа к защите допускается после проверки и положительного
заключения.
Порядок подготовки курсовой работы. Работа над курсовой работой не должна откладываться на последние дни. Относиться к ней надлежит со всей ответственностью и добросовестностью. Только систематический, правильно спланированный и организованный труд
позволит добиться хорошего результата точно к установленному сроку
Порядок подготовки работы обычно включает следующие основные этапы.
Составление примерного плана. В процессе написания работы план может корректироваться.
Подбор литературы в соответствии с целями, отраженными в плане. При этом одинаково
важно как прислушиваться к советам научного руководителя, так и проявлять должную самостоятельность. Не существует единственного источника, в котором студент мог бы найти
полную библиографию по интересующей его проблеме. Появление новых публикаций непрерывный процесс, за которым следует научиться постоянно следить.
Подбор литературы является ответственным этапом написания любой научной работы,
требующим определенных усилий. В составлении библиографии большую помощь могут
оказать систематические каталоги и специальные обзоры новой литературы научных библиотек, периодические информационные издания (например, Вестник МГУ серия «Журналистика», Библиографический указатель Института научной информации по общественным
наукам (ИНИОН), аналитические издания, журнал «Среда» , реферативные сборники и т. п.)
Необходимо самостоятельно ознакомиться с публикациями в специальных журналах.Большой объем полезной информации можно найти на сайгах в сети Интернет. Данный
этап завершается составлением библиографии - списка публикаций по выбранной теме, с которыми надлежит ознакомиться.
3. Изучение подобранной литературы. Работу на этом этапе целесообразно сопровождать записями, в той или иной форме фиксирующими главную мысль и систему доказательств автора, изучением статистического и фактологического материала с соответствующими пометками, составлением кратких аннотаций просмотренных источников. Подобные
усилия значительно облегчают дальнейшую работу, делают ненужным повторное обращение
к одному и тому же источнику информации.
4. Написание текстового варианта работы. Перед тем, как перейти к написанию текста,
следует досконально продумать логику изложения, систему аргументов для доказательства
главной мысли. Этот этап заканчивается формулировкой основных тезисов.
Здесь необходимо помнить ряд важных моментов:
Не следует допускать дословного копирования, переписывания прочитанной литературы. Изложение должно вестись самостоятельно, своими словами и свидетельствовать том,
что автор разобрался в существе рассматриваемых вопросов, имеет свою точку зрения и умеет ее изложить так, чтобы было понятно другим. Это не исключает возможности цитирования, каждая цитата должна соответствующим образом оформляться.
Изложение должно вестись грамотным языком, без стилистических и логических
75
ошибок. Важно заранее определить четкую структуру работы.
Сноски, ссылки на различные источники, примечания оформляются в соответствии с
существующими правилами.
Требования к оформлению работы. Работа выполняется на бумаге форматом А4. Параметры страниц: верхнее-2 см, нижнее- 2 см, правое – 1,5 см, левое – 3 см. Номер страницы
ставится в середине нижнего поля. Объем работы – 20-25 страниц. Курсовая работа должна
быть иллюстрирована графиками, таблицами, фотографиями, которые имеют название и номер. Не следует допускать излишних рассуждений, повторений. Работа может быть написана
от руки, отпечатана на машинке или набрана компьютерным текстом. Работа оформляется в
твердую обложку. Курсовая работа с грамматическими ошибками, небрежно оформленная к
проверке не принимается.
Методические рекомендации по выполнению курсовой работы. Курсовая работа включает в себя следующие разделы: титульный лист; введение, материал и методика исследования, основная часть, заключение и список литературы.
В главе «Введение» студент дает краткую характеристику выбранной теме, её актуальность, новизну, практическую значимость с указанием цели и основных задач.
В главе «Материал и методика исследования» студентом дается характеристика объекту
исследования. Кроме того, в этой главе дается разъяснение всем методикам, используемым
им в работе.
В главе «Основная часть» студент описывает всю проделанную им научноисследовательскую и экспериментальную работу с заполнением таблиц и вычерчиванием
графиков. Расчеты проводятся с использованием математического метода анализа биотехнологических данных.
В заключении следует:
Во-первых: раскрыть общие принципы построения моделей для познания биопроцессов
на практике:
1. Раскрыть научные и практические знания о изучаемой системе в целом.
2. Описать практическую значимость проведенным исследованиям.
3. Изложить технологию и аппаратурное оформление эксперимента.
Во-вторых: вкратце изложить выводы по проделанной работе.
Оформление списка использованной литературы:
1.Нумерация всей использованной литературы сплошная - от первого до последнего источника.
2.Оформление списка использованной литературы рекомендуется выполнять по принципу алфавитного именного указателя (в общем, алфавите авторов и заглавий) в следующей
последовательности:
литература на русском языке,
литература на языках народов, пользующихся кириллицей.
литература на языках народов, пользующихся латиницей
3.Описание источников, включенных в список, выполняется в соответствии с существующими библиографическими правилами.
Фамилия автора или фамилии авторов с прописной буквы.
Основное заглавие. Подзаголовочные данные.
Сведения об издании. - Напр.: 2-е изд., доп.
Место издания: Издательство или издающая организация. Дата издания. - В отечественных изданиях приняты сокращения: Москва - М., Санкт-Петербург - СПб., Ленинград - Л. В
иностранных изданиях сокращаются: London - L., Paris - Р., New York -N.Y. Остальные города приводятся полностью. Объем (в страницах текста издания).
Каждая область описания отделяется от последующей специальным разделительным
знаком "точка, тире" (. - ). После названия города перед названием издательства ставится
знак (:). Указание объема книги является обязательным. Следует помнить о том, что в списке
указываются конкретные названия произведении, статьи, названия законов. Выступления на
76
конференциях и т.п.
Если использованный материал был опубликован таким образом, что он является частью
какого-либо издания (например, используется статья, опубликованная в журнале), то имеет
место аналитическое описание, т.е. после специального знака "две косые черты" (//) приводится библиографическое описание данного издания с указанием места материала в издании.
При описании статьи из периодического издания (журнала, газеты) место издания не указывается, а при описании статьи из сборника место издания указывается, а издательство опускается Описание, литературы на иностранных языках выполняется, но тем же правилам.
Защита работы:
После завершения окончательного варианта работы научный руководитель готовит
свое заключение и выставляет предварительную оценку. Окончательная оценка выставляется
студенту по результатам защиты работы. Во время защиты автор должен быть готов за 5 минут устно изложить результаты проведенного исследования и ответить на вопросы. Умение
отвечать на вопросы емко и четко является очевидным достоинством любого студента, претендующего на высокую оценку.
Основные критерии оценки курсовой работы вытекают из предъявляемых к ней требований. Такими критериями являются следующие:
1) Глубина анализа, умение разобраться в затронутых проблемах.
2) Самостоятельность, творческий подход к рассматриваемой проблеме.
3) Использование новейшего фактологического и статистического материала.
4) Полнота решения всех тех задач, которые автор сам поставил себе в работе.
5) Грамотность, логичность в изложении материала
6) Качество оформления.
Разумеется, при подготовке к защите автор должен иметь копию текста работы, поскольку ее первый экземпляр за несколько дней до защиты сдается на кафедру, на которой
она была выполнена.
Оценка курсовой работы.
Каждая курсовая работа с учетом ее содержания оценивается по шкале таблицы 5.
Курсовая работа должна быть написана в сроки, устанавливаемые кафедрой.
Работу, которую преподаватель признал неудовлетворительной, возвращается для переработки с учетом высказанных в отзыве замечаний. Несвоевременное предоставление курсовой работы на кафедру приравнивается к неявке на экзамен, поэтому студентам, не сдавшим
без уважительной причины в срок курсовую работу, ставится неудовлетворительная оценка.
Студент, не сдавший курсовую работу в срок, считается имеющим академическую задолженность и не допускается к сдаче экзамена по данной дисциплине.
2.8. Тематика письменных работ по курсу:
Тематика рефератов:
1. Биотехнология микроорганизмов в пищевой промышленности.
2. Биотехнология микроорганизмов в экологии.
3. Биотехнология микроорганизмов в медицине.
4. Биотехнология микроорганизмов и фарматехнологии.
5. Биотехнология микроорганизмов в промышленности.
6. Биотехнология микроорганизмов в растениеводстве.
7. Биотехнология микроорганизмов в животноводстве.
8. Иммобилизованные ферменты.
9. Ферменты микроорганизмов и их применение.
10. Биологически активные вещества.
Тематика контрольных работ:
1. Микробиологическое производство аминокислот, белков.
77
2. Микробиологическое производство органических кислот, липидов.
3. Микробиологическое производство антибиотиков и витаминов.
4. Микробиологическое производство ферментов.
2.9. Тестовые задания для самоконтроля:
$$$ 1. Стерильная культура:
а) содержит бактерии преимущественно 1 вида
б) свободна от любых посторонних микроорганизмов
в) содержит микомицеты преимущественно 1 вида
г) свободная от всех видов бактерий
д) свободна от всех видов грибов
$$$ 2. Стерилизацией называется:
а) выделение бактерий и природного источника
б) уничтожение патогенных микроорганизмов
в) уничтожение всех микроорганизмов и их покоящихся форм
г) уничтожение всех бактерий
д) уничтожение всех вирусов
$$$ 3. На микроорганизмы и их споры губительно действуют:
а) видимая часть солнечного спектра
б) ультрафиолетовое излучение
в) g-лучи
г) ультрафиолетовое излучение, g-лучи
д) α-лучи
$$$ 4. Микроорганизм, относящийся к прокариотам:
а) бактерии
б) простейшие
в) вирусы
г) протозоа
д) микроскопические грибы
$$$ 5. Микроорганизмы, имеющие истинное ядро:
а) вироиды
б) простейшие
в) бактерии
г) спирохеты
д) вирусы
$$$ 6. Какой из факторов влияет на рост бактерий
а) давление кислорода
б) содержание в окружающей среде неорганических ионов, наличие ростовых факторов
в) парциальное давление двуокиси углерода
г) содержание в окружающей среде органических соединений
д) все перечисленные факторы
$$$ 7. Укажите, какое из перечисленных уравнений отражает химизм биосинтеза уксусной кислоты:
a) C6H12O6 — 2C2H5OH + 2 CO2 + E
б) C2H5OH + O2 — CH3COOH + H2O + E
в) C6H12O6 — 2C2H4OHCOOH + E
78
г) C12H22O11 — 2C6H8Ov + 3H2O + E
д) C6H12O6 — 2C2H4OHCOOH + E
$$$ 8. Основным видом сьпрья для биотехнологического способа получения лимонной
кислоты является
а) этанол
б) сахароза
в) мальтоза
г) меласса
д) глюкоза
$$$ 9. Укажите, для получения какой из органических кислот в качестве продуцентов
используют бактерии Bacterium curvum:
а) молочной
б) лимонной
в) уксусной
г) яблочной
д) пропионовой.
$$$ 10. Укажите, какой фермент катализирует процесс получения молочной кислоты:
а) алкогольоксидаза
б) лактатдегидрогеназа
в) лактатоксидаза
г) праймаза
д) полимераза.
$$$ 11. Продолжительность культивирования при производстве уксусной кислоты составляет, сут
а) 1-2
б) 3-4
в) 5-6
г) 7-8
д) 20-30.
$$$ 12. Оптимальной температурой биосинтеза молочной кислоты является температура, °С.
а) 26-28
б) 34-36
в) 40-43
г) 48-50
д) 60-90
$$$ 13. Содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости в конце культивирования составляет, %.
а) 3-4
б) 5-12
в) 0,5-4,0
г) 18-20
д) 25-40
$$$ 14. Оптимальное значение рН при получении молочной кислоты составляет
а) 3,0-3,2
79
б) 4,4-4,6
в) 6,3-6,5
г) 7,0-7,2
д) 8-9
$$$ 15. Оптимальное значение рН при получении лимонной кислоты составляет
а) 3,0-3,2
б) 4,4-4,6
в) 6,3-6,5
г) 7,0-7,2
д) 8-9
$$$ 16. Укажите, каким из перечисленных способов можно получить концентрированный раствор уксусной кислоты:
а) упаривание
б) осветление
в) перегонка
г) вымораживание
д) фильтрация
$$$ 17. Укажите, каким способом очищают культуральную жидкость в производстве уксуса столового:
а) упаривание
б) осветление
в) перегонка
г) вымораживание
д) фильтрация
$$$ 18. Укажите, какое вещество используют для осветления уксусной кислоты:
а) активированный уголь
б) сульфид бария
в) гипс
г) бентонит
д) стерильный воздух
$$$ 19. Какую концентрацию имеет уксусная эссенция, %:
а) 9
б) 70
в) 98
г) 99,9
д) 100
$$$ 20. Какую концентрацию имеет товарная форма молочной кислоты, %
а) 20
б) 40
в) 60
г) 80
д) 100
$$$ 21. Укажите, какое вещество используют для очистки молочной кислоты:
а) активированный уголь
б) серную кислоту
80
в) гипс
г) бентонит
д) стерильный воздух
$$$ 22. На какой технологической стадии в производстве молочной кислоты образуется лактат кальция:
а) первое упаривание
б) фильтрация
в) кристаллизация
г) сушка
д) второе упаривание
$$$ 23. Технологический упрощенный процесс получения молочной кислоты из сброженного раствора:
а) фильтрация – кристаллизация – очистка – фильтрация – упаривание – фильтрация –
разлив
б) фильтрация – кристаллизация – очистка – фильтрация – упаривание – фильтрация –
разлив – брожение –упаривание
в) фильтрация –упаривание – брожжение – разлив
г) брожение –упаривание – разлив
д) все варианты применимы.
$$$ 24. Укажите название соли, которая не образует осадка при нейтрализации культуральной жидкости в производстве лимонной кислоты:
а) оксалат кальция
б) цитрат кальция
в) глюконат кальция
г) первое и второе
д) первое и третье
$$$ 25. Какой реактив используют на стадии химической очистки, чтобы получить
раствор лимонной кислоты:
а) активированный уголь
б) сульфид бария
в) гипс
г) оксалат кальция
д) глюконат кальция
$$$ 26. Укажите, к какому классу относятся ферменты, катализирующие реакции окисления и восстановления:
а) лиазы
б) лигазы
в) гидролазы
г) оксидоредуктазы
д) трансферазы
$$$ 27. Укажите, к какому классу относятся ферменты, катализирующие реакции гидролитического расщепления сложных органических соединений:
а) оксидоредуктазы
б) трансферазы
в) гидролазы
г) лиазы
81
д) изомеразы
$$$ 28. Укажите, к какому классу относятся ферменты, катализирующие реакции переноса атомных группировок от одного соединения к другому:
а) оксидоредуктазы
б) трансферазы
в) гидролазы
г) лиазы
д) изомеразы
$$$ 29. Укажите, к какому классу относятся ферменты, катализирующие реакции негидролитического расщепления:
а) оксидоредуктазы
б) трансферазы
в) гидролазы
г) лиазы
д) лигазы
$$$ 30. Какие функции выполняет воздух, подаваемый на аэрацию при твердофазном
культивировании:
а) снабжение кислородом
б) отвод тепла
в) перемешивание
г) отвод СО2
д) передавливание
Коды правильных ответов
Номер вопроса
1
Правильный ответ б
Номер вопроса
16
Правильный ответ а
2
в
17
д
3
б
18
г
4
а
19
б
5
б
20
г
6
д
21
а
7
б
22
б
8
а
23
а
9 10
в
а
24 25
б
а
11
г
26
г
2.10. Экзаменационные вопросы по курсу.
1. Принципы классификации прокариот.
2. Принципы классификации микроорганизмов эукариот.
3. Морфологические и тинкториальные свойства бактерий.
4. Методы окраски микроорганизмов.
5. Структура и химический состав бактериальной клетки.
6. Особенности строения грамположительных бактерий.
7. Особенности строения грамотрицательных бактерий.
8. Рост и размножение бактерий.
9. Фазы размножения бактерий..
10. Способы получения энергии бактериями /дыхание, брожение/.
11. Типы и механизмы питания бактерий.
12. Типы и механизмы питания грибов.
13. Основные принципы культивирования бактерий.
14. Основные принципы культивирования грибов.
15. Искусственные питательные среды, их классификация.
16. Требования, предъявляемые к питательным средам.
17. Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.
18. Ферменты бактерий.
82
12
г
27
в
13
б
28
б
14
в
29
г
15
г
30
а
19. Идентификация бактерий по ферментативной активности.
20. Роль микробов - контаминантов в биотехнологических производствах.
21. Роль грибов в биотехнологических производствах.
22. Биотехнология микроорганизмов: предмет и задачи.
23. Биотехнология микроорганизмов: методы исследования.
24. Методы биотехнологии микроорганизмов в металлургической промышленности.
25. Методы биотехнологии микроорганизмов в горнодобывающей промышленности.
26. Методы биотехнологии микроорганизмов в пищевой промышленности.
27. Методы биотехнологии микроорганизмов в медицине.
28. Методы биотехнологии микроорганизмов в фармацевтической промышленности.
29. Методы биотехнологии микроорганизмов в охране окружающей среды.
30. Методы биотехнологии микроорганизмов в очистке сточных вод.
31. Методы биотехнологии микроорганизмов в биоремедиации антропогенно нарушенных почв.
32. Методы биотехнологии микроорганизмов в животноводстве.
33. Методы биотехнологии микроорганизмов в ветеринарии.
34. Методы биотехнологии микроорганизмов в растениеводстве.
35. Методы биотехнологии микроорганизмов в космических исследованиях.
36. Методы биотехнологии микроорганизмов в генной инженерии.
37. Методы биотехнологии микроорганизмов в клеточной инженерии.
38. Методы биотехнологии микроорганизмов в генной терапии.
39. Микробиологические аспекты биотехнологии.
40. Требования, предъявляемые промышленным микроорганизмам.
41. Микробиологический катализ (биокатализ).
42. Основные особенности микробиологического синтеза.
43. Преимущества биокатализа в органическом синтезе.
44. Биокаталитический цикл.
45. Важность и разнообразие микробных продуктов.
46. Микробиотехнологическая продукция аэробного происхождения.
47. Микробиотехнологическая продукция анаэробного происхождения.
48. Факторы, влияющие на выбор между биосинтезом и химическим синтезом вещества
для промышленности.
49. Основные элементы, слагающие биотехнологический процесс.
50. Микроорганизмы, используемые в промышленности для получения целевых продуктов
51. Принципиальное отличие биотехнологических процессов от чисто химических.
52. Биотехнологический продукт.
53. Биологически активные вещества.
54. Культивирование микроорганизмов: методы.
55. Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации.
56. Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации.
57. Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов.
58. Поддержание (хранение) культур микроорганизмов.
59. Биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов.
60. Микробиологический синтез.
61. Стадии промышленного биосинтеза.
62. Промышленные микробиологические процессы.
63. Микробиологические ферментные системы для промышленных процессов.
64. Основы микробиологического производства.
65. Важность и разнообразие микробных продуктов.
66. Управление ростом и метаболизмом микроорганизмов в промышленных условиях.
83
67. Методы и технология культивирования.
68. Биореакторы: назначение.
69. Биореакторы: классификация.
70. Биореакторы: применение.
71. Технология приготовления питательных сред для биосинтеза.
72. Основы культивирования микроорганизмов.
73. Промышленное получение биомассы.
74. Белок одноклеточных: технология производства на макроуровне.
75. Продукты метаболизма микроорганизмов на макроуровне.
76. Генетика микроорганизмов и микробиологическая промышленность.
77. Ферменты микроорганизмов и их применение.
78. Получение рекомбинантных продуктов.
79. Биотрансформация веществ.
80. Биотехнологическое производство антибиотиков.
81. Биотехнологическое производство витаминов.
82. Биотехнологическое производство ферментов.
83. Биотехнологическое производство аминокислот.
84. Биотехнологическое производство нуклеотидов.
85. Биотехнологическое производство лимонной кислоты.
86. Биотехнологическое производство уксусной кислоты.
87. Биотехнологическое производство этанола.
88. Биотехнологическое производство биогаза.
89. Белок одноклеточных: биотехнология производства.
90. Биологически активные вещества: биотехнология производства.
91. Биотехнологическое производство ацетона.
92. Биотехнологическое производство бутанола.
93. Биоэнергия: биотехнология производства.
94. Биополимеры: биотехнология производства.
95. Биотехнологическое производство лекарственных препаратов.
96. Биотехнологическое производство профилактических препаратов.
97. Производство метаболитов микробиологического происхождения.
98. Производство первичных метаболитов.
99. Производство вторичных метаболитов.
100. Биоконверсия лигноцеллюлозных отходов.
84
Глоссарий
Автоклав – прибор, в котором производится стерилизация паром под давлением.
Асептика – способ борьбы с хирургической инфекцией, основанный на предупреждении попадания микробов в рану путем полного обеззараживания всех предметов, которые
соприкасаются с раной.
Аминокислота (Amino acid) Мономерная единица (строительный блок) белковых
молекул.
Анаэробные микроорганизмы (Anaerobes) Микроорганизмы, растущие в отсутствие
кислорода.
Антибиотик (Antibiotic) Вещество, синтезируемое одним микроорганизмом и оказывающее ингибирую-щее действие на другие микроорганизмы и раковые клетки.
Антиген (Antigen) Вещество, воспринимаемое организмом как чужеродное и вызывающее специфический иммунный ответ — выработку антител.
Бинарное деление (Binary fission) Прямое, не связанное с половым процессом разделение прокариотической клетки на примерно одинаковые по размерам дочерние клетки.
Биодеградация (Bioremediation) Разрушение загрязняющих веществ, попавших с окружающую среду, с помощью живых микроорганизмов.
Биоконтроль (Biocontrol) Процесс, в котором используются живые организмы для
ограничения роста и развития патогенных микроорганизмов.
Биомасса (Biomass)
1. Клеточная масса, образующаяся в результате жизнедеятельности живых организмов.
2. Органическое вещество, которое может использоваться как источник энергии или
химических соединений.
Биореактор, ферментер (Bioreactor) Устройство, в котором протекают биохимические реакции при участии живых микроорганизмов, клеточных экстрактов или ферментов.
Часто этот термин относится к сосуду, в котором растут микроорганизмы.
Вторичный метаболит (Secondary metabolite) Вещество, не являющееся обязательным для роста или функционирования клетки, но синтезирующееся в стационарной фазе
(обычно участвует в защите клеток или микроорганизмов от тех или иных воздействий).
Гибридный белок, химерный белок (Fusion protein) Продукт клонированных совместно двух или более кодирующих последовательностей из разных генов. Представляет
собой одну полипептидную цепь.
Ксенобиотик (Xenobiotic) Соединение, полученное искусственным путем, а не синтезированное живым организмом.
Культура (Culture) Популяция клеток или микроорганизмов, выращиваемых в контролируемых условиях in vitro.
Культуральная среда (Culture medium) Твердая или жидкая среда, использующаяся
для выращивания микроорганизмов in vitro.
Метаболизм (Metabolism) Совокупность физических и химических процессов, протекающих в организме и обеспечивающих его существование. Продукты метаболизма называются метаболитами.
Плазмида (Plasmid) Внехромосомный генетический элемент, способный к длительному автономному существованию и репликации. Обычно это двухцепочеч-ная кольцевая
ДНК длиной 1—200 т.п.н.
Селекция (Selection) Отбор нужных организмов (клеток) в смешанной популяции.
Эндонуклеаза (Endonuclease) Фермент, гидролизую-щий внутренние фосфодиэфирные связи и расщепляющий молекулы ДНК и РН К. Эндонуклеазы участвуют в рекомбинации, репарации и рестрикции; в последнем случае называются рестриктазами (рестрицирующими эндонуклеазами).
85
УМК ДС обсужден на заседании кафедры
«Прикладная экология»
Протокол № _____« ___» ________________ 2009г.
УМК ДС одобрен на заседании учебно-методического
Совета________________________института
Протокол № _____ от «____» _____________ 2009г.
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС
ДИСЦИПЛИНЫ ДЛЯ СТУДЕНТОВ
по дисциплине «Биотехнология микроорганизмов»
для специальности 050701 - Биотехнология
Нуркеев Самат Сагиевич,
Жубанова Ажар Ахметовна,
Джамалова Гуля Абаевна
_________________________________________________________
Подписано в печать___.___.2008г. Формат 60х84 1/16. Бумага книжножурнальная. Объем ___.___уч.-изд.л. Тираж___экз. Заказ №___.
______________________________________________________________
Отпечатано в типографии издательства КазНТУ имени К.И. Сатпаева
г.Алматы, ул.Ладыгина, 32
86