ВНЕДРЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В СИСТЕМУ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ БЕЗОПАСНОСТИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ РАМН
ВНЕДРЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В СИСТЕМУ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
БЕЗОПАСНОСТИ
ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
ЕФИМОЧКИНА Н. Р.
Основные задачи при внедрении
молекулярно-генетических методов



выбор адекватного МГ –метода диагностики: подбор
генов-мишеней, дизайна праймеров и зондов,
формата методики, способа регистрации
(визуализации) результатов
гармонизация МГ-метода с действующей системой
микробиологического нормирования и контроля –
возможность «синхронизации» подходов при
проведении анализа и интерпретации результатов
Разработка комплексных схем выделения и
идентификации патогенов, предусматривающих
применение МГ- методов в наиболее эффективной
комбинации с культуральными, биохимическими и
иммунологическими тестами
ДНК-методы, используемые для анализа пищевых
продуктов
ДНК- гибридизация
Полимеразная цепная реакция
Флюоресцентная гибридизация in
situ (FISH)
Традиционная ПЦР
блот-гибридизация ДНК
Мультиплексная ПЦР
ПЦР с обратной транскрипцией
гибридизация на ДНК-чипах
Гнездовая (Nested) ПЦР
Изотермальная амплификация
Real-time ПЦР
LAMB
С флуоресцентными системами:
SYBR Green
TaqMan Probes
Fret probes
Molecular Beacons
NASBA
RSA, SDA
Количественная Rti-ПЦР
Сферы применения ДНК-методов в
санитарно-пищевой микробиологии
Научные исследования
Выявление генов, кодирующих
вирулентность, антибиотикорезистентность, продукцию стрессбелков, прогнозирование поведения
возбудителя в продуктах для оценки
микробиологического риска и целей
нормирования
Расследование
вспышек пищевых
отравлений
и инфекций,
эпидемиологический надзор,
система мониторинга за
возбудителями
Исследования пищевых
продуктов при
проведении контроля за
безопасностью:
выявление и идентификация
патогенных и потенциально
патогенных бактерий
(возбудителей пищевых
инфекций и
токсикоинфекций)
Контроль пробиотических и
ферментированных
продуктов:
оценка подлинности и
идентификация пробиотических
и заквасочных культур
Новые и вновь возникающие возбудители
заболеваний с пищевым путем передачи
(в период 1970-2000 гг.)
Salmonella Enteritidis и
Salmonella Typhimurium DT 104
Campylobacter jejuni
Escherichia coli O157:H7 и другие EHEC
Listeria monocytogenes
Yersinia enterocolitica
Enterobacter sakazakii
Yibrio parahaemolyticus
Vibrio vulnificus
Проблемы применения молекулярногенетических методов в пищевой
микробиологии



массивная контаминация
исследуемых пищевых
продуктов посторонней или
технологической микрофлорой
(до 106 – 108 КОЕ/г), на фоне
которой единичные клетки
возбудителя не всегда могут
быть обнаружены
неоднородность исследуемых
образцов по физикохимическому составу,
присутствие ингибиторов
ПЦР, естеccтвенных или
искусственных консервантов
наличие в термически
обработанных пищевых
продуктах (пастеризованные,
стерилизованные молочные и
мясные продукты, детские
смеси) инактивированных
бактериальных клеток,
содержащих интактную ДНК
Необходимость применения
специальных технологий подготовки
образцов
оптимизация способов пробоподготовки
для конкретных групп пищевых
продуктов
2-х кратное последовательное
селективное обогащение проб
концентрирование бактериальных клеток
(например, иммуномагнитной
сепарацией)
Применение дополнительных контролей
ингибирования
Подбор и отработка режимов экстракции
ДНК из различных пищевых субстратов
Гены, наиболее часто используемые для ПЦРидентификации бактериальных возбудителей пищевых
инфекций
Патогены
Число
Гены и целевые
последовательности
Salmonella spp
21
16s rRNA, oriC, spaQ, fliC, sprC, himA,
his, invA,phoP/Q, stnB, irob, slyA,
hin/H2, afgA, fimC, sefA, pefA, spvA,
spvB, spvC, rep-FLIA
Escherichia coli
O157:H7
20
eaeA, saa, stx1, stx2, stx2b,stx2d, stx2c,
stx2e, stx2f, slt-I, slt-II, flich7, rfbE, uidA,
SilO157,hly933, hly21, ehxA, orfU, EspP
Shigella spp.
17
23SrDNA, LPS, phoP/phoQ, ipaH,
invap, rfc, stx, ial, eaeA, stx1, stx2,
LT1, STIAb, aggR, rrs, virA, malB
Campylobacter jejuni
16
16s rRNA, 23s rRNA, сadF, ceuE,
pVirb11, pVir, cdtA, cdtB, cdtC, flaA, flaB,
hipO, Asp, colF, VS1, peb1A
Listeria monocytogenes
12
16s rRNA, 23s rRNA, hly, actA, inlA,
prfA, ImaA, iaP, plcB, inlA, inlB, inlC,
Yersinia enterocolitica
9
16s rDNA, ERIC, yadA, lcrE, wbcT,
ail, virF, per, yst
Enterobacter sakazakii
4
16s rDNA, ompA, dnaG, gluA,
Выбор генов-мишеней для ПЦР-детекции
пищевых патогенов
Гены- мишени
Группы
Примеры
пищевых
патогенов
Ген РНК-зависимой РНК-полимеразы
РНК-вирусы
Гепатиты А, норовирусы
Гены структурных (капсульных
белков), гемагглютинины
РНК- и ДНКвирусы
Ротавирусы, Норволквирусы, гепатиты
Гены рибосомальной РНК (16S -23S)
Прокариоты
Salmonella, Shigella,
Campylobacter
Поверхностно экспрессируемые
маркеры (липополисахаридов,
антигенных детерминант,
флагеллярные гены)
Прокариоты,
эукариоты
E.coli, Campylobacter,
Vibrio spp., Salmonella
Гены цитоскелетных белков (актины,
джиардины), митохондриальные гены
(цитохромоксидазы, )
Эукариоты
Плесневые грибы,
Giardia, Saccharomyces
cerevisiae
Выбор генов-мишеней для ПЦР-детекции
пищевых патогенов
Гены- мишени
Группы
Примеры
пищевых
патогенов
Гены, кодирующие синтез токсинов,
отдельных вирулентных факторов
или «островов патогенности»:
гемолизины, шигатоксины,
лецитиназы, стафилококковые
энтеротоксины, цереулид,
ботулотоксины микотоксины
Прокариоты
и эукариоты
Listeria, Yersinia,
Shigella, B.cereus,
E.coli O157:H7, S.
aureus, Aspergillus,
Penicillium, Fusarium
Родо – и видоспецифичные гены
(термостабильной ДНК-азы,
карбамил-фосфат-синтазы, rpsUdnaG-rpoD-регион)
Прокариоты
и эукариоты
S. aureus,
Pseudomonas spp.,
Enterobacter sakazakii
Идентификация L.monocytogenes на основе
комбинирования биохимических и генетических тестов
Биохимические
тесты
Бета-гемолиз
Лецитиназная
активность
(хромогенные сред «Rapid-
Факторы патогенности
L.monocytogenes
Молекулярногенетические тесты
Листериолизин О
(кодирующий ген –
Hly A)
Метод ДНК
гибридизации на
участок генома,
кодирующий синтез
листериолизина О
фосфатидилиназитол
- специфичная
фосфолипаза С
ПЦР с
видоспецифическими
праймерами
Plc1- Plc2
L.mono» и ALOA-агар,
лецитин-агар с
активированным углем)
(кодирующий ген – Plc A)
Подвижность
Индуктор
полимеризации актина
(ActA)
(механизмы внутриклеточного
перемещения )
ПЦР с
видоспецифическими
праймерами
Act1- Act2
ПЦР –анализ с праймерами на участки генома,
кодирующие специфические факторы патогенности
L.monocytogenes
Положительные результаты
ПЦР с видоспецифическими
праймерами act3 - act4 и plс1-plс2
были получены только у
штаммов, обладающих
лецитиназной и гемолитической
активностью

 Из 24 штаммов, первоначально
идентифицированных как
L.monocytogenes по комплексу
биохимических признаков, по
данным ПЦР-анализа
подтверждена принадлежность к
данному виду только 8 штаммов
Метод выявления и видовой идентификации Listeria
monocytogenes включен в проект Санитарных правил
«Порядок учета и расследования пищевых отравлений и
вспышек заболеваний с пищевым путем передачи»».
Подготовка проб (гомогенизация,
нейтрализация
первичное обогащение – инкубирование в бульоне
Фрейзера ½ концентрации – 24 часа
вторичное обогащение –
инкубирование в бульоне Фрейзера в течение 24-48 ч
высев на поверхность ПАЛКАМ или Окфорд-агара
отбор 5 колоний, пересев на TSYEA–агар и на хромогенные среды
(ALOA или Rapid L’mono или лецитин-агар) и кровяного агара
проведение ПЦР-анализа c культурами листерий,
продуцирующими гемолизин и лецитиназу,
с праймерами к генам PlcA и ActA.
Обнаружение бактерий рода Salmonella и
L.monocytogenes в пищевых продуктах методом
ДНК- гибридизации
Методические указания 4.2.1955-2005 «Продукты пищевые. «Mетод
выявления
и определения бактерий рода Salmonella и Listeria
%
положительных проб
monocytogеnes
на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа»;
МУК 4.2. -10 «Дополнения и изменения МУК 1955-05».


Метод гетерогенного
твердофазного ДНК-РНК
гибридизационного
анализа позволяет
выявлять Salmonella на
уровне от 10 КОЕ/г при
условии оптимизации
способов пробоподготовки
•
100
80
60
40
20
0
10 КОЕ/г
100 КОЕ/г
микробиологическим методом
1000 КОЕ/г
методом ДНК - рРНК гибридизации
• Метод может
применяться для
экспрессного выявления
бактерий рода Salmonella в
пищевых продуктах и в
объектах окружающей
среды
Оборудование для Real-time ПЦР,
используемое в санитарно-пищевой
микробиологии
Система
Изготовитель
Нагревохлаждение
Время
реакции
Число
ячеек
IQ5
BioRad
Термоэлектриче
ский блок
2ч
96
Smart Cycler
Cepheid
Керамическая
плата
40 – 60
мин
6 – 96
ABI PRISM
Applied
Biosystems
термоблок
2ч
96
Rotor Gene
Corbett
Research
Воздух
50 мин
32
ICycler iQ
BioRad
термоблок
2ч
60, 96,
384
MX 4000
Stratagene
термоблок
90 мин
96
LightCycler
Roche Applied
Biosystems
Воздух
20 мин –
1ч
32
ДТ-96
ДНК-технология
термоблок
96
Критерии стандартизации методов обнаружения и
идентификации патогенных микроорганизмов


Чувствительность: нижний предел определения - не менее 1 КОЕ на 25 г
продукта
селективность (специфичность) в отношении искомого вида (группы)
микроорганизмов

статистически достоверная сходимость результатов

межлабораторная воспроизводимость

Наличие контролей амплификации: реагентный и позитивный контроли

Минимальный риск контаминации ампликонами

Скорость проведения анализа (минимальная или в режиме on-line)



Доступность (использование стандартизованных непатентованных
реагентов и наборов зондов, праймеров)
Универсальность способов пробоподготовки пищевых продуктов
Возможность получения количественной оценки уровней загрязненности
искомым патогеном
Алгоритм исследований адаптации и
стандартизации новых методов детекции патогенов
Обобщение данных по применению ПЦР
в отношении конкретного патогена
Экспериментальная оценка
эффективности метода
1.
2.
3.

Валидация
метода в сравнении со
стандартизованным методом,
подтверждение воспроизводимости

Чувствительность:
определение min числа клеток в пробе
(числа копий ДНК/РНК), обеспечивающего
достоверное обнаружение возбудителя
Специфичность:
тестирование банка типовых штаммов и
штаммов таксономически близких видов,
анализ смешанных ассоциаций
анализ сред обогащения
Сравнительные исследования
экспериментально контаминированных
пищевых продуктов 2 методами
Сравнительные исследования естественно
контаминированных пищевых продуктов 2
методами


Подготовка методического документа
Межлабораторные испытания метода на
экспериментально контаминированных
образцах
Использование ПЦР в реальном времени для
идентификации патогенных микроорганизмов,
выделенных из пищевых продуктов

Salmonella spp.

Campylobacter
jejuni

Listeria
monocytogenes и
Listeria spp

E.coli O157
Использование ПЦР в реальном времени для
идентификации патогенных микроорганизмов,
выделенных из пищевых продуктов





Salmonella spp.
Campylobacter jejuni
Listeria monocytogenes
E.coli O157
Cronobacter spp
пределы обнаружения:
от 1х104 до 1х106 КОЕ/мл
 снижение числа
ложнопозитивных и
ложнонегативных
результатов
 сокращение длительности
этапа идентификации до 4 ч

Методические
рекомендации № 02.036-08
«Идентификация
патогенных бактерий,
выделенных при контроле
пищевых продуктов, с
применением системы
BAX® System Q7»
Метод ПЦР с
электрофоретической детекцией
результатов
Идентификация патогенных
микроорганизмов
Listeria monocytogenes
Salmonella spp.
с применением
тест-систем «АмплиСенс®»
Метод ПЦР
с электрофоретической детекцией




Чувствительность метода (100%
достоверная детекция) - от 1 х 107
кл/мл
высокая специфичность метода
при анализе смешанных
ассоциаций различных видов
листерий
установлена пригодность
метода для подтверждения
принадлежности бактерий,
выделенных на
дифференциальнодиагностических средах в виде
чистых культур, к
L.monocytogenes
Использование различных
моделей амплификаторов
отечественного и импортного
производства обеспечивает в
достаточной степени
воспроизводимость и
сопоставимость результатов
Уровни открываемости проб при различных
концентрациях L.monocytogenes
120
100
80
%%60
40
20
0
lg 8
lg7
lg6
lg 5
lg 4
%положительных проб
lg 3
lg 2
Применение ПЦР в реальном времени с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией для
прямого обнаружения патогенов в пищевых продуктах
- Salmonella,
-E.coli O157:H7,
- Campylobacter spp.,
- Listeria monocytogenes
Подтверждена чувствительность на
уровне 1 х102 – 5 х 102 клеток;
Метод позволяет подтверждать
соответствие исследуемого
продукта нормативу «отсутствие в
25 г продукта»
% по ло жи тель ны х
пр о б
подбор
оптимальных способов
селективного обогащения
Обнаружение L.monocytogenes в экспериментально
зараженны х пробах (дозы - 1 - 100 КОЕ/25 г)
- проведен
100
80
60
посев
ПЦР-FRT
40
20
0
молочные продукты
соевые продукты
Алгоритм анализа пищевых продуктов на наличие
патогенных микроорганизмов рода Salmonella и
L.monocytogenes с применением real-time ПЦР
Пищевой продукт
Выявление Salmonella
Посев в RVS – бульон
25 г продукта в 225 см3 среды
Выявление L.monocytogenes
Посев в бульон Фрейзера ½
25 г продукта в 225 см3 среды
Инкубирование при
температуре 37оС –
24ч
Экстракция проб с наборами «ДНК-В-сорб» или «Рибо-преп»
Амплификация на приборе «Rotor-Gene 6000» с
детекцией результатов в режиме «real-time»
Разработка метода прямого обнаружения
патогенных бактерий в пищевых продуктах
Методические указания МУК 4.2. – 10 «Экспресс-метод определения
патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с
пищевым путём передачи в пищевых продуктах и штаммах,
выделенных из пищевых продуктов, на основе ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией» (проект)





включающие комбинированные схемы анализа пищевых продуктов на
наличие патогенных микроорганизмов
рода Salmonella,
L.monocytogenes,
Cronobacter (E. sakazakii),
Escherichia coli О157:Н7,
Campylobacter spp
с применением ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией в
режиме реального времени
Методические указания 2.3.2. -10 «Санитарно эпидемиологическая оценка безопасности и
функционального потенциала пробиотических
микроорганизмов, используемых для производства
пищевых продуктов» (проект)


Сформулированы основные требования и критерии отбора
штаммов-продуцентов пробиотиков и заквасочных культур для
производства пробиотических пищевых продуктов и БАД к пище
Алгоритм проведения санитарно - эпидемиологической оценки
пробиотических микроорганизмов предусматривает:
- исследования таксономической принадлежности штаммов
(микробиологическими и молекулярно-генетическими методами),
- исследования безопасности пробиотических штаммов в
тестах in vitro и in vivo ,
- оценку пробиотического потенциала штаммов
- оценку технологических свойств штаммов
Методы подтверждения видовой
принадлежности и подлинности для
пробиотиков на основе полифазного
таксономического подхода
1
2
3
4
ПЦР-анализ видоспецифичных
генов лактобактерий
+
биохимическая идентификация
L.rhamnosus GG
Lactobacillus spp. - 4,7
маркер м.м. 470 bp - 3
Методы генетического типирования
«пищевых» патогенов
Методы рестрикционного анализа
(фингерпринтирования)
Варианты
гель-электрофорез в
переменном поле (PFGE)

анализ полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов
(ПДРФ)

комбинированный метод ПДРФПЦР


Риботипирование
Область применения
установление эпидемических
связей и подтверждение вспышек
пищевых инфекций;

изучение происхождения и
дифференциация возбудителей на
видовом и подвидовом уровнях;

Выявление мутаций в геноме
патогенных бактерий

 изучение вирулентных свойств
ПЦР на основе коротких
и механизмов патогенности
повторяющихся фрагментов (REP мониторинг и создание баз
PCR)
данных о генетических профилях
 метод случайно амплифиэпидемиологически значимых
цированной полиморфной ДНК
штаммов патогенов
(RAPD)

Методические документы,
разработанные и внедренные в практику





Методические указания МУК 4.2.1955-2005 «Продукты пищевые. «Mетод
выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogеnes на
основе гибридизационного ДНК-РНК анализа»;
Методические указания 4.2. -10 «Метод выявления и определения бактерий
Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе
гибридизационного ДНК-РНК-анализа. Дополнение к Методическим указаниям
МУК 4.2.1955-05»
Методические рекомендации № 02.036-08 «Идентификация патогенных бактерий,
выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением системы BAX®
System Q7»;
МУК 4.2. – 10 «Экспресс-метод определения патогенных бактерий - возбудителей
инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в пищевых продуктах и
штаммах, выделенных из пищевых продуктов, на основе ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией» (проект)
Методические указания 2.3.2.
-10 «Санитарно - эпидемиологическая оценка
безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов,
используемых для производства пищевых продуктов» (проект)
Благодарю за внимание!