Разработка иммуносенсора для определения Escherichia coli и
advertisement
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина» На правах рукописи Малышева Наталья Николаевна РАЗРАБОТКА ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ESCHERICHIA COLI И АНТИГЕНА ВИРУСА КОРИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe3O4 02.00.02 – Аналитическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Матерн Анатолий Иванович Екатеринбург – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 5 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................................. 15 1. Бактериальные патогены и их определение ............................................... 15 1.1 Обзор стандартных методов идентификации бактерий ...................... 17 1.2 Новые методы и подходы в детекции бактерий .................................. 19 1.3 Биосенсоры: классификация и применение для идентификации бактерий ......................................................................................................... 22 1.4 Иммуносенсоры в детектировании бактерий....................................... 25 1.4.1 Оптическая иммунодетекция бактерий ......................................... 27 1.4.2 Электрохимическая иммунодетекция бактерий ........................... 28 1.5 Наночастицы в детекции бактерий ....................................................... 33 1.6. Нанокомпозиты в детекции бактерий .................................................. 38 1.6.1 Получение полимерных нанокомпозитов ..................................... 40 1.6.2 Применение нанокомпозитов ......................................................... 45 2. Вирусные агенты и их определение ............................................................ 47 3. Постановка задачи......................................................................................... 54 ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА ......................... 57 2.1 Оборудование и средства измерений ........................................................ 57 2.2 Реактивы, рабочие растворы ...................................................................... 59 2.3 Методики эксперимента ............................................................................. 61 2.3.1 Методики получения наночастиц Fe3O4 ............................................ 61 2.3.2 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Fe 3O4. с поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным гетероциклическими соединениями............................................................ 61 2.3.3 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Fe 3O4. с полипиррольным покрытием (Fe3O4-ПП)................................................... 65 3 2.3.4 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Fe 3O4. с ферроценмодифицированной оксидкремниевой оболочкой (Fe 3O4ФЦSiO2) .......................................................................................................... 66 2.3.6 Методики микроскопических исследований .................................... 68 2.3.7 Условия культивирования бактериальных штаммов ....................... 69 2.3.8 Методика постановки ИФА ................................................................ 69 ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ НАНОКОМПОЗИТНЫХ ЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ Fe3O4 ................................. 72 3.1 Нанокомпозиты с полимерным поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным азотсодержащими гетероциклическими соединениями ........................................................................................................ 73 3.2 Нанокомпозиты с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола (Fe3O4-ПП) ...................................................................................... 77 3.3 Нанокомпозиты с ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием (Fe3O4-ФЦSiO2) .................................................................................. 82 3.4 Определение динамики изменения размеров агломератов нанокомпозитных частиц в водных суспензиях ................................................ 84 3.5 Электрохимические исследования синтезированных нанокомпозитных частиц ..................................................................................................................... 87 3.5.1 Нанокомпозитные поливинилбензилхлоридным частицы покрытием, с полимерным модифицированным хинолином ...................................................................................................... 87 3.5.2 Нанокомпозитные частицы с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола ............................................................. 89 3.5.3 Нанокомпозитные частицы с оксидкремниевым покрытием, модифицированным ферроценом ................................................................ 91 3.6 Выбор нанокомпозитных частиц для использования в иммуноанализе 94 ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА БЕСФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С 4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe3O4 ...................................................................................................... 95 4.1 Микроскопические исследования взаимодействия нанокомпозитных частиц с бактериальными клетками .................................................................... 95 4.2 Процедура иммуноанализа......................................................................... 99 4.3 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с полимерным покрытием на основе поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином ............................................................................................................ 101 4.4 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным полипиррольным покрытием ............................................................................. 102 4.5 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием ....................... 103 4.6. Определение правильности, специфичности и селективности метода электрохимического иммуноанализа ................................................................ 107 4.7 Анализ реальных объектов....................................................................... 109 ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ НАНОКОМПОЗИТНЫМИ КОНЪЮГАТОВ ЧАСТИЦАМИ С АНТИТЕЛ С ОКСИДКРЕМНИЕВЫМ ПОКРЫТИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ ................ 112 5.1 Получение конъюгатов антител с НК на основе Fe 3O4 с оксидкремниевым покрытием (Fe3O4 – АТSiO2) ............................................. 112 5.2 Процедура иммуноанализа....................................................................... 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................... 120 СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ ...................... 122 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 124 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы В связи с увеличением плотности населения, проблема инфекционного загрязнения биологических и природных объектов актуальна как для стран «третьего мира», так и для развитых стран. Быстрое обнаружение инфекционных агентов чрезвычайно важно для эффективной профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций. Среди большого разнообразия бактерий, вызывающих инфекционные заболевания у людей и животных, одними из наиболее распространенных являются Escherichia coli. Среди штаммов E. coli встречаются как условнопатогенные, так и патогенные, вызывающие заболевания разной степени тяжести и приводящие к смерти у пожилых людей, детей и лиц с ослабленным иммунитетом. Ввиду сходной внутривидовой физиологии E.coli, для исследовательских целей в качестве модельной системы чаще всего используют условно-патогенные штаммы (например, ATCC 25922). Для моделирования вирусных агентов при проведении исследований во многих случаях (в том числе в целях биобезопасности) целесообразно использовать соответствующие антигены. В медицинской практике для идентификации и определения концентрации бактерий и вирусов в различных объектах используются методы: бактериального посева, ПЦР, ИФА. Основными недостатками метода бактериального посева являются его длительность (от 3-х дней) и высокие требования к стерильности лаборатории. Опосредованное определение возбудителя инфекции методом ИФА путем измерения количества выработавшихся антител может дать искаженный результат в случае запоздалого или слабого иммунного ответа организма. Кроме того, ИФА требует применения нестабильных при хранении ферментов. При анализе методом ложноположительных ПЦР существует результатов, т.к. вероятность данный метод получения не способен 6 «отличить» мертвую инфекцию от живой. Актуальным вопросом является разработка недорогих экспрессных методов, которые возможно реализовать в небольших лабораториях, в полевых условиях или «у постели» больного. Степень разработанности темы исследования Применение для детекции инфекционных агентов электрохимических методов, позволяющих быстро и с высокой точностью определять различные аналиты в объектах биологического и природного происхождения, с использованием относительно недорогого оборудования, активно обсуждается в литературе. С другой стороны, еще одним перспективным направлением является использование в разработке методов обнаружения инфекционных агентов наноматериалов. Особый интерес представляет применение нанокомпозитных частиц, сочетающих в себе магнитное ядро и функциональное полимерное покрытие. Сочетание простоты, доступности и чувствительности электрохимических методов с последними достижениями в области нанотехнологий позволит разработать новые экспрессные, чувствительные и селективные методы и сенсоры, а также исключить применение ферментов при определении бактерий и вирусов. Настоящая диссертационная бесферментного метода использованием нанокомпозитов работа посвящена электрохимического (НК) на разработке иммуноанализа основе с магнитных нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 в качестве сигналообразующей метки. Сочетание магнитных свойств Fe3O4 и электроактивного покрытия нанокомпозита, генерирующего прямой стабильный, хорошо выраженный электрохимический сигнал, даст возможность упростить, удешевить и ускорить процедуру определения бактерий в биологических и природных объектах. Синтез и применение конъюгатов антител с магнитными нанокомпозитными частицами позволит разработать простой и 7 чувствительный метод определения антигенов вирусов в биологических объектах. Работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико-технологического института УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, поддержана грантами РФФИ: 09-03-12242-офи_м, 14-0301017, грантом У.М.Н.И.К. (тема №9, проекта 14151). Цель диссертационной работы Разработка бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода для количественного определения: – бактерий (на примере E.coli ATCC 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4 с электроактивным покрытием в качестве сигналообразующей метки; – антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори NovO/96) с использованием конъюгатов антител и магнитных нанокомпозитных частиц. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: - осуществить выбор метода синтеза позволяющий получить нанокомпозитные частицы постоянного состава с магнитным ядром и электроактивным покрытием, генерирующим стабильный сигнал, с размерами, позволяющими проходить сквозь клеточную мембрану бактерии (не >300 нм); - осуществить выбор способа получениям конъюгатов антител к вирусу с нанокомпозитными частицами; - осуществить выбор нанокомпозитных частиц, генерирующих адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический отклик для использования в качестве «метки»; 8 - исследовать морфологию полученных нанокомпозитных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией, ИК-спектроскопии; - изучить электрохимические свойства синтезированных нанокомпозитных частиц; - осуществить выбор условий и способ иммобилизации электроактивных нанокомпозитных частиц на поверхности бактериальной клетки; - осуществить электрохимического выбор условий аналитического формирования сигнала после «прямого» взаимодействия нанокомпозитных частиц с бактериями; - осуществить разработку алгоритма проведения иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов; - осуществить выбор условий проведения процедуры иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов; - провести анализ модельных растворов, содержащих микроорганизмы; - сравнить результаты анализа проб, полученных с использованием предложенного электрохимического метода иммуноанализа и традиционно используемых методов (ИФА и бактериального посева). Научная новизна работы Методом электронной микроскопии исследованы размер, форма и степень агрегированности синтезированных по оригинальным методикам НК на основе Fe3O4, с электроактивным покрытием (полипиррол; поливинилбензилхлорид, модифицированный хинолином; оксид кремния, модифицированный ферроценом), а также скорость и мера проникновения их в клетку бактерии E.coli. Установлено, что размер НК зависит от используемого метода полимеризации. Метод эмульсионной полимеризации и золь-гель метод, в отличие от метода in-situ, позволили получить НК размером < 100 нм. Показано, что степень и скорость проникновения в клетку зависит от природы покрытия НК. 9 Исследованы электрохимические свойства НК. Показано, что все виды синтезированных НК проявляют электрохимическую активность в рабочем диапазоне потенциалов водных растворов от -1 до +1 В, что позволяет использовать их в качестве сигналообразующей метки в водных средах. Впервые показана возможность использования в электрохимическом бесферментном иммуноанализе синтезированных магнитных НК в качестве «прямой» сигналообразующей метки. Установлена линейная зависимость между величиной прямого электрохимического отклика НК – «метки», входящей в состав иммунокомплекса и концентрацией бактерий в пробе. Установлено оптимальное время инкубации НК с бактериями и время образования иммунокомплекса. Найдены оптимальные условия проведения процедуры иммуноанализа, обеспечивающие экспрессное (tанализа = 60 мин), чувствительное (диапазон линейности 2.3∙102 – 2.3∙107 КОЕ/мл) и специфичное количественное детектирование бактерий E.coli. Показана применимость разработанного подхода к определению содержания E.coli в реальных объектах (пробах воды и воздуха). Установлено, что на результат количественного определения целевого аналита не влияет присутствие в пробе бактерий других видов. Показана и обоснована возможность применения разработанного гибридного варианта иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с магнитными НК, для селективного определения антигена вируса кори в модельной системе. Установлено влияние на величину сигнала времени инкубации конъюгата с антигеном и времени образования «сэндвич» иммунокомплекса. Практическая значимость работы Получены по оригинальным методикам электрохимически активные нанокомпозитные частицы с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры и конъюгаты антител с НК на основе Fe3O4 с оксидкремниевым покрытием. 10 С использованием предложенного иммуносенсора и алгоритма гибридного иммуноэлектрохимического метода анализа с использованием синтезированных электроактивных нанокомпозитных частиц разработан метод иммуноанализа для определения бактерий. Проведены исследования по сравнительному определению содержания бактерии E.coli в модельных и реальных объектах с использованием разработанного иммуносенсора и традиционно-используемых методов ИФА и бактериального посева (проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск)). Разработан подход к определению антигенов вирусов методом электрохимического иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с НК. Положения, выносимые на защиту Оригинальные электрохимически методики активных получения НК на стабильных основе во времени с хинолин- Fe3O4 модифицированным поливинилбензилхлоридным покрытием, покрытием из полипиррола, ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры. Результаты ИК-спектроскопии подтверждающие наличие электроактивного полимерного покрытия на наночастицах Fe3O4. Результаты исследований размеров, формы и морфологии синтезированных НК, полученные с помощью микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией и метода динамического светорассеяния. Результаты электрохимических исследований синтезированных НК. Результаты исследования взаимодействия синтезированных НК на основе Fe3O4 с различными электроактивными полимерными покрытиями с культурой бактерии E.coli. 11 Иммуносенсор и метод электрохимического определения содержания бактерии E.coli. Результаты определения с использованием разработанного иммуносенсора и метода содержания бактерии E.coli в реальных объектах, подтвержденные данными полученными в независимой лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) методами ИФА и бактериального посева. Метод электрохимического иммуноанализа для определения антигенов вирусов на примере антигена вируса кори NovO/96. Методология и методы исследования Методологической основой диссертационного исследования послужили существующие в мире теоретические и экспериментальные наработки по синтезу нанокомпозитных частиц, а также методам подтверждения их состава и установления размерных характеристик. В основе работы лежат современные методы и подходы к определению бактериальных и вирусных агентов в пробах различного происхождения с использованием нанокомпозитных материалов. При синтезе наночастиц и НК использовали методы соосаждения, полимеризации in situ и эмульсионной полимеризации. Морфологию, размерные характеристики НК и взаимодействие бактериальных клеток с НК изучали методом электронной микроскопии. Для исследования электрохимических свойств НК и при разработке метода иммуноанализа, использовали методы циклической, линейной и инверсионной вольтамперометрии. Применение электрохимических методов в сочетании с использованием магнитных нанокомпозитных частиц, а также иммуннореакция, лежащая в основе метода иммуноанализа, позволяет разработать экспрессный, чувствительный и селективный сенсор для определения инфекционных агентов. 12 Апробация работы Основные результаты исследований представлены на следующих мероприятиях: конференции «Аналитическая химия – новые методы и возможности», (Москва, 2010), симпозиуме «Теория и практика электроаналитической химии», г. Томск, 2010), конференции «Актуальные проблемы органического синтеза и анализа» (Екатеринбург, Россия, 2010), XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2011), научной конференции «Достижения в химии и химической технологии» (Екатеринбург, 2011), международной конференции «9-th spring Meeting of the International Society of Electrochemistry, Electrochemical Sensors: from nanoscale engineering to industrial application» (Турку, Финляндия, 2011), научной школе всероссийском аналитической по аналитической симпозиуме химии и химии «Разделение радиохимии» (Краснодар, и 2011), III концентрирование в (Краснодар, 2011), на VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА2012» (Абзаково, 2012), международной конференции «Nanoformulation – 2012» (Барселона, Испания, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Физика и химия наноразмерных систем» (Екатеринбург, 2012), IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа-Абзаково, 2013), «Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), II научно-технической конференции аспирантов и молодых ученых «Химия в федеральных университетах» (Екатеринбург, 2014). На основе результатов работы получены патенты: РФ 2542487. МПК C12Q 1/04, C12N 1/02, G01N 33/53, B82B 1/00 Способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий в анализируемой среде / Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матерн А.И.; заявл. 15.07.2013: опубл. 20.02.2015, бюлл.№5; 13 РФ2550955. МПК G01N33/58, G01N33/53 Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов / Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матерн А.И., Иванова А.В.; заявл. 11.12.2013: опубл. 20.05.2015, бюлл.№14. Публикации По результатам исследований опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 2 патента и 14 тезисов докладов на конференциях различного уровня. Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в решении ключевых задач, проведении основных экспериментальных исследований в области синтеза НК, в изучении их электрохимического поведения, интерпретации, систематизации полученных результатов, разработке метода и сенсора для электрохимического определения бактерии E.coli и антигена вируса кори. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, выводов, списка использованных библиографических источников (194 источника). Диссертация изложена на 147 страницах компьютерной верстки, содержит 37 рисунков, 14 таблиц. Во введении раскрыта актуальность и степень разработанности темы исследования, определены цели и задачи, сформулирована научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту. В первой главе представлен анализ литературных данных о современном состоянии методов определения бактериальных патогенов в модельных и реальных объектах. Особое внимание уделено рассмотрению биосенсоров и их применению для идентификации инфекционных агентов. Рассмотрены варианты использования на различных стадиях иммуноанализа наночастиц и нанокомпозитов типа «ядро-оболочка». Представлен краткий обзор 14 современных способов определения вирусных агентов. Проведен анализ достоинств и недостатков существующих методов, перспективных направлений разработки новых методов и сенсоров. Во второй главе представлены сведения о реагентах, материалах и оборудовании, использованных в работе. Изложены методики синтеза нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола, модифицированного хинолином поливинилбензилхлорида, модифицированного ферроценом оксида кремния. Приведены методики подготовки образцов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии нанокомпозитных частиц и клеток культуры E.coli после взаимодействия с НК. Третья глава посвящена синтезу и результатам ИК-спектроскопии, подтверждающим состав синтезированных нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 с электроактивным полимерным покрытием, результатам определения методом просвечивающей электронной микроскопии размера и формы НК и исследованию их электрохимических свойств. Четвертая глава посвящена разработке бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода определения содержания бактерий E.coli в модельных и реальных объектах с использованием синтезированных нанокомпозитов на основе Fe3O4 с электроактивным полимерным покрытием. Представлены результаты и интерпретация экспериментов по сравнительному определению концентрации E.coli в модельных и реальных объектах разработанным методом и референсными методами: ИФА и бактериального посева. Пятая глава посвящена синтезу и применению для определения антигена вируса кори конъюгатов нанокомпозитных частиц с оксидкремниевым покрытием и антителами. Представлена разработанная схема метода иммуноанализа и результаты определения антигена вируса (на примере антигена вируса кори NovO/96) в модельной статистический анализ полученных результатов. системе. Проведен 15 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1. Бактериальные патогены и их определение Бактерии широко распространены в природе в почве, в морской и пресной воде, в желудочно-кишечном тракте животных и человека. Большинство бактерий играют важную роль в биологических процессах, зачастую вступая в симбиотические отношения с флорой и фауной. Однако, некоторые бактерии (условно-патогенные и патогенные штаммы) являются причиной различных инфекционных заболеваний. При наличии пищи, влаги и благоприятной температуры бактерии могут легко и быстро распространяться. Во всем мире, на инфекционные заболевания приходится почти 40 % от общего объема (50 млн.) смертей в год [1, 2]. Наиболее острой проблемой является загрязнение бактериальными патогенами продовольственных и питьевых ресурсов. Инфекции бактериальной природы составляют около 85 % от общего объема вспышек заболеваний пищевого происхождения [3]. Заболеваемость человека инфекциями, вызванными такими патогенами, как Salmonella sp., Escherichia coli (энтеровирулентные штаммы), Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli and Bacillus cereus в развивающихся странах сохраняется примерно на постоянном уровне. Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium является опасными возбудителями пищевого происхождения. Вспышки сальмонеллеза происходят как в развивающихся, так в развитых и странах. Ещё одним наиболее часто встречающимся возбудителем острых кишечных инфекций является бактерия E.coli O157:H7, заражение которой может приводить к смерти, особенно у детей, пожилых и ослабленных людей вышеперечисленными [4]. Основными патогенными источниками видами кишечной заражения палочки и сальмонеллы являются мясной фарш, сырое молоко и вода из водоемов, загрязненных фекальными стоками, поэтому, тщательный контроль содержания этих патогенов в продуктах питания и воде чрезвычайно важен. Минимальная концентрация Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium и 16 E.coli O157:H7, способных вызвать заражение - 10 клеток. Например, согласно требованиям стандарта, в питьевой воде, подаваемой в сеть хозяйственно-питьевых водопроводов, может содержаться не более 3-х кишечных палочек в 1 л [5]. Для эффективного определения бактерий требуются методы анализа, которые должны отвечать ряду критериев. Время и чувствительность анализа являются важнейшими факторами, определяющими применимость разрабатываемого метода определения. Помимо времени и чувствительности важна селективность методик обнаружения, т.к. малые количества патогенных бактерий часто соседствуют в комплексной биологической среде со многими другими компонентами, в том числе микроорганизмами других видов. Возможность использования разработанного метода в маленьких лабораториях, а также в полевых условиях является большим преимуществом метода. Большинство применяемых в настоящее время методов основанных на принципах ПЦР и ИФА и многие разрабатываемые методы (c использованием таких приборов как кварцевые микровесы, ИКспектрографы, спектрофлуориметры, проточные цитометры) возможно реализовать только в специальных лабораторных условиях (стерильные комнаты реактивов, с большим требующих количеством особых вспомогательное условий хранения) оборудования [6]. и Наиболее перспективной, для определения бактерий в условиях отсутствия специально подготовленной лаборатории, является группа электрохимических методов анализа, использующая компактные приборы, с возможностью работы на аккумуляторных батареях (что дает возможность работать в полевых условиях) и не требующая большого количества нестабильных реактивов, при этом по чувствительности не уступающая дорогостоящим методам. более сложным и 17 1.1 Обзор стандартных методов идентификации бактерий Все стандартные методы обнаружения бактерий в разнообразных объектах (почва, вода, пищевые продукты, пробы от инфицированных людей и животных), широко применяющиеся в настоящее время в медицинских диагностических лабораториях, можно разделить на несколько групп: 1. Бактериологические: - прямое микроскопическое обнаружение бактерий в мазках-отпечатках; - выявление бактерий при окраске пробы по Романовскому-Гимзе, по Граму и др.. - выделение культуры (метод бактериального посева). 2. Серологические: - реакция связывания комплемента; - реакция непрямой гемагглютинации; - метод иммуноферментного анализа (ИФА). 3. Молекулярно-генетический: - полимеразная цепная реакция (ПЦР); - лигазная цепная реакция (ЛЦР). Самые распространенные среди них, это методы ИФА, ПЦР, культуральный и микроскопические методы. Культуральные методы идентификации бактерий обычно включают морфологическую оценку типа микроорганизма, а также тесты на способности бактерии расти в различных средах при различных условиях. Среда подбирается специальным образом для обеспечения роста конкретного вида бактерии (селективная среда), кроме того необходимо поддержание оптимальной для роста температуры и строгое соблюдение стерильности. Одним из главных недостатков этой группы методов является длительность, для того чтобы получить достоверный результат определения требуется порядка72 ч. 18 Для идентификации бактерий используют такие прямые методы как подсчет числа клеток под микроскопом или метод проточной цитометрии. Хотя некоторые микроскопические методы позволяют обнаруживать единичные бактерии, в большинстве случаев требуется «усиление сигнала», которое осуществляется путем предварительного доращивания бактерий, содержащихся в пробе на специальных питательных средах. Результаты таких измерений часто трудно достаточно точно интерпретировать. ИФА широко применяется в современной лабораторной диагностике. Данный метод используется для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций и для определения наличия антител (IgA, IgM, IgG) к возбудителю. ИФА позволяет получать достоверные результаты при условии использования дорогих автоматизированных приборов, что связано, в первую очередь, с многостадийностью анализа. Каждая из основных стадий (иммобилизация антител, инкубация пробы, внесение вторичных антител, ферментативная цветная реакция, и, наконец, спектрофотометрическое определение продукта реакции) зависит от чистоты и качества реактивов, точности их внесения и времени нахождения в лунках планшета, аккуратности при отмывках. Каждая из стадий вносит существенный вклад в суммарную ошибку анализа, что часто приводит к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Ложноположительный результат также возможен, если в анализируемой пробе содержатся соединения тяжелых металлов, которые окисляют хромоген (в частности, широко используемый тетраметилбензидин), что приводит к ложноположительному окрашиванию пробы. Для того чтобы устранить влияние тяжелых металлов, требуется длительный и дорогостоящий подбор условий сорбции и блокировки [7]. Еще одним недостатком метода ИФА является использование большого количества реагентов с малым сроком хранения. Метод ПЦР, широко применяемый в настоящее время наряду с ИФА в лабораторной диагностике, может быть использован для определения малых 19 количеств не только живых бактерий, но даже только лишь их генетического материала. Метод ПЦР на сегодняшний день является самым чувствительным из всех известных, но требует чистых, не загрязненных «посторонним многостадийной генетическим процедуры материалом» обработки образцов материала и для сложной анализа на дорогостоящем оборудовании с использованием специальных реактивов в оборудованном стерильном помещении [8, 9]. 1.2 Новые методы и подходы в детекции бактерий Значительное количество исследований в настоящее время направлено на разработку методов, с помощью которых возможно быстро и селективно обнаружить низкие концентрации патогенов в воде, продовольствии и клинических образцах (кровь, смывы со слизистых человека и животных). Часть публикаций посвящена модернизации методов, описанных в предыдущей разделе (ИФА, ПЦР, бактериального посева). Но, помимо этого, большое количество исследований посвящено альтернативным методам определения бактерий, основанным на получении различных физических сигналов (величина которых обусловлена количеством бактериальных клеток). Самые распространенные среди них это метод кварцевых микровесов, оптические (ИК-, флуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия), электрохимические (амперо- и потенциометрия, импедиметрия), калориметрические и ультразвуковые методы [6, 10-15]. Одним из наиболее развивающихся направлений в области определения микроорганизмов является разработка методов с использованием кварцевых микровесов [16-19]. Принцип действия кварцевых микровесов основан на масс-чувствительности пьезокварцевого резонатора, модифицированного селективно-распознающим бактерии компонентом, фиксирующего изменения массы на поверхности электродов в субнанограммовом диапазоне [20]. 20 Данная группа методов отличается высокой чувствительностью и экспрессностью, однако, основными недостатками являются невысокий ресурс работы сенсора и необходимость высокоточного термостатирования, для обеспечения требуемой чувствительности и воспроизводимости. При идентификации бактерий, использованием c метода ИК- спектроскопии регистрируется спектр поглощения пробы, в котором нужно подтвердить или опровергнуть наличие бактерий. Поглощение излучения веществом приводит к колебательным движениям молекул, регистрируемых в виде колебательного спектра. Для каждой молекулы характерны своя частота и амплитуда колебаний. Установлено, что микроорганизмы обладают индивидуальными спектрами, что обусловлено уникальным для каждого возбудителя набором макромолекул (белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот). Определение спектров микроорганизмов позволяет дифференцировать их на самых разных таксономических уровнях, вплоть до подвидов, сероваров и штаммов [21-24]. Однако, во многих случаях (при анализе проб со сложной матрицей) требуется предварительная выделение бактерий из образца (их высевание и очистка). Кроме того, ИК-Фурье спектрометр является дорогостоящим прибором и требует использования квалифицированного персонала. В отличие от способов, основанных на ИК-спектроскопии, методы с использованием проточной цитометрии [25-27] не собирают данные обо всех отдельных молекулярных цитометрия может компонентах рассматриваться как микроорганизма. форма Проточная автоматизированной флуоресцентной микроскопии, в котором вместо помещения образца на пластинку, он вводится в жидкость, протекающую через чувствительную область в проточной кювете. В проточном цитометре клетки переносятся ламинарным потоком воды через сфокусированный свет, длина волны которого совпадает (насколько это возможно) со спектром поглощения красителя, при помощи которого клетки были предварительно окрашены. 21 Рассеяние света клетками дает информацию об их размере, форме и структуре, клеточной массе [28-30]. Однако, проточная цитометрия более применима для определения эукариотических клеток, в то время как бактериальные являются прокариотами. Исследователи, занимающиеся этим методом, столкнулись с рядом проблем, возникающих при детекции бактерий. Небольшой размер бактерий и небольшое число молекул ДНК, которые метятся красителем, требуют приборов-анализаторов с очень высокой чувствительностью и различных ухищрений при создании проточной ячейки. Также одной из основных экспериментальных проблем при анализе бактерий с помощью метода проточной цитометрии является то, что многие из их биологических характеристик (размер, форма и содержание ДНК) меняются в зависимости от условий роста микроорганизмов, и источника, из которого получены бактериальные клетки [31]. Поэтому воспроизводимые результаты могут быть получены только при анализе одной группы (серии) образцов, выделенной из среды, с примерно одинаковыми условиями. И, наконец, стоимость оборудования для проточной цитометрии также достаточно высока, что является дополнительным фактором, ограничивающим его использование. В литературных источниках представлены публикации в которых детекции бактерий хроматографическими, масс-, ИК-спектроскопическими, электрохимическими методами предшествуют такие методы выделения и концентрирования бактерий как диэлектрофорез, иммуномагнитная сепарация и др. [32-34]. Авторы [35] предложили способ и сконструировали устройство, в котором комбинируются техника диэлектрофоретического концентрирования бактерий с их определением методом импедансной спектроскопии. Устройство имеет камеру с двумя разнозаряжеными микроэлектродами. Бактерии, попадающие в камеру отталкиваются от отрицательно заряженного микроэлектрода и перемещаются в токе жидкости в сторону 22 положительно заряженного микроэлектрода. Сконцентрированные бактерии определяются методом измерения диэлектрофоретического сопротивления. Основной проблемой данного метода является высокие требования к очистке чувствительного элемента, поскольку загрязнение его поверхности приводит к получению недостоверных результатов. Авторы [36] предложили для определения Salmonella typhimurium в сыром мясе птицы метод, комбинирующий иммуномагнитное разделение и метод ПЦР в режиме реального времени. Однако, метод многостадиен (вследствие чего вносится большая погрешность) и достаточно длителен. Анализируя литературные данные можно заключить, что в настоящее время активно разрабатываются новые подходы и процедуры для широко используемых методов ИФА и ПЦР, позволяющие использовать более устойчивые и менее токсичные и дорогие реактивы (например, замена канцерогенного хромогена ортофенилендиамина на тетраметилбензидин в методе ИФА), увеличивающие чувствительность и селективность методов. Помимо этого, ведется непрерывный поиск способов определения бактерий с применением современных методов и технологий. 1.3 Биосенсоры: классификация и применение для идентификации бактерий В последние десятилетия проводятся исследования по разработке методов и сенсоров, которые могут быть применены практически в любом месте (в полевых условиях, у постели больного) [37-40]. Наилучшим образом для этих целей подходят портативные, быстрые и чувствительные биосенсорные технологии с возможностью немедленной интерпретации результатов. Биосенсоры, благодаря их высокой специфичности и чувствительности, позволяют обнаруживать широкий спектр аналитов в образцах со сложной матрицей (кровь, сыворотка, моча или пищевые продукты) с минимальной пробоподготовкой [41-45]. 23 Биосенсоры для обнаружения бактерий включают в себя компонент биологического распознавания, например, рецептор, нуклеиновую кислоту, или антитело в тесном контакте с трансдьюсером. В зависимости от способа передачи сигнала (вида трансдьюсера), биосенсоры могут быть разделены на четыре основные группы: оптические, массовые, электрохимические и тепловые. Кроме того, все биосенсоры можно разделить на две большие группы: с прямым обнаружением аналита (безметочные) и с косвенным (меточные) обнаружением (Рисунок 1.1). Рисунок 1.1 – Классификация биосенсоров Интерес к электрохимическим биодатчикам с использованием недорогих одноразовых расходных материалов привел к применению развития тонко- и толстопленочной технологии в производстве биосенсоров различных типов. В настоящее время биосенсорам посвящается всё большее количество публикаций среди статей, посвященных детекции бактерий. По определяемому компоненту все биосенсоры можно условно разделить на 2 типа: биосенсоры, определяющие непосредственно бактериальную клетку (её специфические белки, компоненты клеточной стенки, ДНК) и биосенсоры, определяющие бактерии опосредованно, путем обнаружения продуктов её метаболизма (выделяемых или потребляемых). 24 Метаболические окислительно-восстановительные реакции, с участием бактерий, возможно преобразовывать в электрохимически-детектируемые сигналы, используя реакции с оксидоредуктазой и соответствующим медиатором [46]. Таким образом, содержание микроорганизмов в образце может быть косвенно определено путем мониторинга содержания продуктов микробного метаболизма. Исследования по определению продуктов метаболизма бактерий, с использованием биосенсоров, встречаются в литературе, начиная с конца 70-х годов прошлого века [47-55]. Круг бактериальных метаболитов, по концентрации которых в пробе возможно качественно и количественно определять сами бактерии, включает в себя такие соединения как кислород сульфат-, нитрат-, карбонат ионы, молочная и масляная кислоты, а также экзоферменты и др [56-59]. Основные недостатки биосенсоров на основе мониторинга микробного метаболизма связаны с их плохой селективностью и низкой скоростью реакции. Этот тип биосенсора может использоваться для определения бактерий в образцах с определенным типом матрицы (не содержащей иных ферментов, кроме как продуцируемых определяемыми бактериями). Начиная с работ Wilkins [60, 61], в середине 70-х годов XX века обнаружившего, что в результате микробного окисления компонентов среды изменяется окислительно-восстановительный потенциал в системе, было выполнено большое число исследований по определению бактерий в различных объектах методом потенциометрии [62-65]. Junter и соавторы [66] в 80-х годах XX века показали, что прямое потенциометрическое определение может быть применимо для широкого спектра бактерий. Тем не менее, на анализ затрачивалось порядка 2-4 часов, и порядок определения составлял 106 клеток/мл - система обладала низкой чувствительностью из-за высокого фонового шума компонентов матрицы. Поэтому для метода необходимо было предварительное концентрирование бактерий. Последующей разработке вариантов потенциометрического метода анализа посвящено немало исследований. Электрохимические биосенсоры 25 для определения бактериальных патогенов на основе кислородного электрода Кларка использовались в работах [67, 68]. Endo и соавторы [69] потенциометрическим методом определяли E.coli, Staphylococcus aureus и Enterococcus serolicida. Образец, содержащий бактериальные клетки, с целью концентрирования фильтровали через нитроцеллюлозную мембрану. Далее, мембрану с концентратом бактерий устанавливали на платиновый катод кислородного электрода Кларка и покрывали диализной мембраной. Затем электрод погружали в буферный раствор, до установления стабильного выходного тока. Была получена линейная зависимость сигнала от концентрации бактерий в диапазоне от 1.4×107-7.2×107 клеток/мл со временем анализа 2 часа. Тем не менее, линейный диапазон кислородного электрода находится в пределах низких концентраций кислорода. Кроме того, реакция колебалась в результате изменений концентрации циркулирующего кислорода. 1.4 Иммуносенсоры в детектировании бактерий Наиболее перспективными среди биосенсоров для определения бактериальных патогенов являются сенсоры и методы, в основе которых лежит использование иммунореакции. Схематически процедуру анализа с использованием иммуносенсора можно представить следующим образом (Рисунок 1.2): Рисунок 1.2 – Принципиальная схема анализа с использованием иммуносенсора. 26 Иммуноаналитические методы обеспечивают высокий уровень специфичности определения, что является одним из важнейших критериев применимости метода к широкому кругу объектов. Бактерии проявляют высокую степень иммуногенности в связи с наличием белков и полисахаридов во внешнем слое клеточной стенки. Это позволяет использовать для определения бактерий методы иммуноанализа. Иммуносенсоры, также как и биосенсоры разделить на 3 группы по типу детектирования: - электрохимический (потенциометрический, амперометрический, импедиметрический); - оптический; - физический. Все иммуносенсоры также можно классифицировать на прямые (без использования метки) и непрямые (с использованием метки). Непрямым методам посвящено гораздо большее число публикаций, чем прямым, возможно в связи с более широкими возможностями их реализации и последующей модификации, зачастую более мягкими требованиями к очистке и подготовке распространение чувствительного получила группа элемента сенсора. иммуносенсоров, Большее использующих сигналообразующую метку, в том числе и вследствие большого разнообразия соединений, которые возможно использовать в качестве метки и огромного количества вариантов реализации. Среди самых распространенных соединений и веществ, которые могут быть использованы в качестве глюкозооксидаза, щелочная электроактивные соединения метки: фосфатаза, ферменты (пероксидаза, каталаза, люцифераза), (гексацианоферраты, ферроцен и его производные, соли In2+), флуоресцентные красители (родамин, флуоресцеин, комплексы диамина рутения, порфириновые красители и др.) и наночастицы. 27 1.4.1 Оптическая иммунодетекция бактерий Оптические иммуносенсоры на сегодняшний день наиболее часто используются в биоаналитических системах, что связано с относительной приборной простотой детекции излучения и большим количеством соединений обладающей оптической активностью в том или ином диапазоне спектра. Однако, при использовании оптического метода детекции, зачастую возникают трудности при анализе окрашенных, либо мутных проб. Большое число публикаций посвящено одному из вариантов ИФА - флуоресцентному методу иммуноанализа (ФИА) [70, 71]. В ФИА молекулы флуорохрома используются для маркировки иммуноглобулинов. Флуорохромом поглощает коротковолновый свет, а затем испускает его при более высокой длине волны, этот сигнал и детектируется при помощи флуоресцентного микроскопа. Если количество бактерий в исходном образце недостаточно для непосредственного обнаружения либо компоненты матрицы дают фоновую флуоресценцию, при определении методом ФИА требуется повышение концентрации бактерий путем доращивания на питательных средах. Такая ситуация зачастую возникает при определении бактерий в продуктах питания и биологических средах (кровь, моча, смывы) [72-74]. Идентификация бактерий методом ФИА высокоспецифична, как и большинство методов, основанных на иммунологических реакциях. Zhu и др. используя флуоресцентный оптоволоконный сэндвич-анализ, реализуемый в стеклянном капилляре, модифицированном антителами к определяемой бактерии [75] достигли предела обнаружения 102 КОЕ/мл E.сoli O157: H7 при времени анализа 2 ч. По предположению авторов, достигнуть более низкого предела обнаружения не удалось вследствие ограниченного диффузионного транспорта компонентов на поверхность сенсора. Главным недостатком разработанного способа является тот факт, что непосредственно перед 3-х стадийной иммобилизацией антител на капилляре требуется его предварительная обработка смесью метанола с 28 соляной кислотой, серная кислотой, продувка азотом. В целом реализация данного метода требует привлечения большого количества реактивов и аппаратуры. Ho и соавторами [76] описан непрямой метод с использованием флуоресцентной метки. Антитела к определяемой бактерии иммобилизовали на внутренней поверхности микрокапилляра, через который пропускали модельный образец, содержащий бактерии. Далее, через капилляр пропускали конъюгат вторичных антител с липосомами (в которых были инкапсулированы флуоресцентные метки), затем, для удаления несвязавшегося конъюгата, капилляр промывали. На заключительный этапе осуществляли лизис липосом с целью высвобождения флуоресцентных меток. Предел обнаружения метода составил 360 клеток в мл, время анализа 45 мин. Потенциальная чувствительность флуоресцентных методов очень высока, но на практике она лимитируется сигналом фона, который может возникать из-за присутствия в растворе других флуорофоров. Также большой проблемой подобных методов является многоступенчатая процедура анализа, включающая в себя многочисленные отмывки от несвязавшихся компонентов. Проблема нестойкости многих реагентов для реализации вариантов ФИА и ИФА и необходимость хранения их в специальных условиях (пониженная температура, отсутствие доступа воздуха) также является ограничивающим применение этих методов факторов. 1.4.2 Электрохимическая иммунодетекция бактерий Разнообразие существующих электрохимических методов детекции (вольтамперометрия, хроноамперо- и хронопотенциометрия, импедансная спектроскопия) позволяет разработать большое количество электрохимических иммунологических методов определения бактерий. Электрохимические датчики при сопоставимой инструментальной чувствительности, имеют ряд преимуществ по сравнению с оптическими системами детекции: могут работать в мутных средах, легче поддаются 29 миниатюризации. Современные электроаналитические методы имеют очень низкие пределы обнаружения (≈ 10-9 М), и требуют для анализа, в отличие от оптических методов, небольших объемов (1-5 мл) образцов. Кроме того, принципы электрохимического определения позволяют проводить контроль в режиме онлайн. Также немаловажным является тот факт, что оборудование, необходимое для электрохимического анализа является простым и дешевым по сравнению с большинством других аналитических методов. Сочетание этих преимуществ электрохимических методов со специфичностью иммунореакции дает возможность для разработки аппаратно-простых, дешевых, быстрых и специфичных методов определения бактерий в различных объектах. Авторы [77] разработали электрохимический метод для обнаружения ооцист паразитических простейших Cryptosporidium parvum. Антитела к определяемым C. parvum иммобилизировали на планарном рабочем электроде, затем инкубировали электрод в пробе, содержащей ооцисты, и далее в систему добавляли антитела, меченные пероксидазой хрена. Далее, посредством определения потенциала системы «перекись водорода/пероксидаза хрена» (в присутствии ортофенилендиамина в качестве донора электронов), рассчитывали концентрацию ооцист. Предел обнаружения метода составил 5×102 ооцист/мл при времени определения 60 мин. Главным недостатком этого метода является использование дорогого и нестабильного при хранении фермента – пероксидазы хрена. Хорошие результаты при иммунологическом определении бактерий показали светоадресуемые потенциометрические датчики (СПД), основанные на технологии полевого транзистора [78-81]. В общем случае СПД состоит из кремния n-типа, легированного фосфором и изолирующего слоя, находящегося в контакте с водным раствором, в котором протекает иммуннореакция. Авторы [82] использовали СПД для обнаружения патогенных бактерий Neisseria meningitidis и Yersinia pestis. Бактерии были сконцентрированы на мембранах из поликарбоната или 30 нитроцеллюлозы, через которые затем фильтровали растворы, содержащие комплементарные определяемой бактерии моноклональные антитела, меченые пероксидазой. Далее посредством измерения потенциала системы (в присутствии в растворе перекиси водорода), определяется активность фермента. На определение 103 клеток N.meningitidis затрачивается порядка 20 мин, в то время как стандартный метод иммуноферментного анализа позволяет обнаруживать только сравнительный метод ИФА требует порядка 2,5 ч. Тем не менее, существует несколько проблем, связанных с устройствами СПД, такие как, разная световая чувствительность материалов, используемых в их конструкции, недостаточная воспроизводимость сигнала. Кроме того, требуется предварительное выделение бактерий из проб посредством например мембранного или диэлектрофоретического разделения. Амперометрически ферментативному бактерии могут быть определены по электроокислению/электровосстановлению, их или опосредованно - по участию в биоафинных реакциях. Чаще всего в качестве материала рабочего электрода в амперометрии используются: благородные металлы, графит, различные углеродсодержащие смеси (углеродная паста, стеклоуглерод, пиролитический графит), и проводящие полимеры. Амперометрическим биосенсорам присущи такие преимущества, как высокая чувствительность, быстрое получение результатов и, как и у других электрохимических методов, относительно низкая стоимость используемого оборудования. В амперометрических анализе зависимость концентрации аналита от сигнала линейна потенциометрических иммуносенсоры очень (в системах), сравнении что с делает привлекательными для логарифмической в амперометрические использования в иммуноанализе [83-86]. Авторами [87] описывается метод определения бактерий, сочетающий иммуномагнитное концентрирование с одновременной амперометрической детекцией. Обнаружение основано на электрохимическом мониторинге 31 активности ферментной метки пероксидазы хрена, в присутствии медиатора гидрохинона. Ферментативная реакция происходит в инкубационной микрокамере, где иммобилизированы магнитные частицы. Продукт ферментативной реакции затем закачивается через микроканал в камеру, где происходит его амперометрическое детектирование с помощью набора микроэлектродов. Такая конструкция позволяет избежать прямого контакта биокомпонентов с электродом, что снижает риск загрязнения электрода. Время анализа составляет 1 час. Эксперименты, показали, что при определении Escherichia coli в молоке диапазон линейности метода составляет 102 - 108 клеток/мл, предел обнаружения 100 клеток/мл (без предварительного концентрирования пробы). Одним из интенсивно развивающихся методов электрохимической детекции бактерий спектроскопии является (ИС). В метод данном электрохимический методе импедансной концентрационно-зависимым параметром в большинстве случаев выступает сопротивление переноса заряда (RCT). Метод ИС применялся авторами [88] для обнаружения патогенного штамма Escherichia coli O157:H7. Поликлональные антитела к E.coli иммобилизировали на золотых электродах с использованием 2-х различных методов: при помощи образования химических связей между амино- группами антител и самоорганизующимся молекулярным монослоем карбоновой кислоты на поверхности электрода, и путем связывания биотинилированных антител к E. coli с нейтравидином иммобилизированным на поверхности электрода. Для суспензий E. coli в фосфатном буферном растворе регистрировали спектры импеданса. Далее, с использованием программного обеспечения анализатора моделировали диаграмма Найквиста. По эквивалентной схеме Рэндлса рассчитывали сопротивление переноса заряда (RCT). Для разработанных сенсоров минимально определяемая концентрация E. coli составила 100 КОЕ/мл. Авторами также показано, что конечный результат сильно зависит от технологии иммобилизации антител на электроде и малейшее отклонение от параметров технологии 32 модификации может привести к невоспроизводимости результатов (различным RCT для одинаковых концентраций аналита). Новый иммуносенсор для обнаружения E.coli O157:H7 с использованием пленки, с иммобилизированными конъюгатами ферроцен Магаинин I, разработан авторами [89]. В данном методе пептид Магаинин I выступает в качестве биораспознающего элемента. Электрохимическую импедансную спектроскопию использовали для исследования поверхностных характеристик биосенсора и контроля взаимодействия между пептидной пленкой и патогенными бактериями. Для оценки селективности предложенного биосенсора были использованы непатогенные штаммы E.coli К12, Staphylococcus epidermidis и Bacillus subtilis. Чувствительность сенсора составила 103 КОЕ/мл, диапазон линейности определяемых концентраций 103-107 КОЕ/мл с коэффициентом корреляции 0.983. Как и у всех методов определения бактерий, в основе которых лежит импедансная спектроскопия, основным недостатком этого метода является тот факт, что вид получаемых кривых, а, следовательно, и результат сильно зависит от подготовки поверхности рабочего электрода и того, какие компоненты раствора, в котором ведется определение, могут неспецифически осаждаться на сенсоре совместно с определяемой бактерий. Авторы [90] реализовали иммуноанализ с использованием «сэндвич»принципа. Тонкую золотую пленку, помещали в ячейку прибора поверхностного плазмонного резонанса, затем на пленке посредством связи авидин-биотин иммобилизировали моноклональные анти- IgG. Далее, последовательно вводились в ячейку образец IgG и щелочной фосфатазы, конъюгированный с анти- IgG. В качестве субстрата фермента применялся парааминофенил фосфат. Концентрацию выделяющегося в результате протекания на золотой пленке реакции антиген-антитело парааминофенола измеряли методом поверхностного циклической плазмонного вольтамперометрии. резонанса контролировали Методом количество иммобилизовавшихся антител, которое в конечном итоге влияет на 33 электрохимический сигнал. Для реализации метода требуется достаточно сложная установка и большое количество реагентов. 1.5 Наночастицы в детекции бактерий Одной из тенденций последнего десятилетия является использование в разработке методов обнаружения бактерий наноматериалов с их уникальными оптическими, электрохимическими магнитными свойствами. Устойчивый интерес к наночастицам связан с тем, что объекты с размерами в диапазоне от 1 до 100 нм, имеют существенные отличия в физикохимических характеристиках от частиц микрометрового размера [91]. При иммунохимической детекции бактерий наночастицы могут выступать в качестве: - вспомогательного компонента при предварительной сепарации и концентрировании выделяемой бактерии, - метки (оптической, электрохимической), - модификатора трансдьюсера, увеличивая его проводимость. Наночастицы применяют для увеличения скорости и чувствительности метода анализа, достижения возможности обнаружения инфекционных агентов в сложных средах, таких как продукты питания, кровь, моча, смывы [92]. Липосомы, нанотрубки, квантовые точки, наночастицы металлов и их оксидов, полимерные наночастицы и нанокомпозиты – наиболее часто встречаемые примеры наноматериалов, применяемых в разработках новых методов и сенсоров для определения бактерий или специфичных для них аналитов [93-95]. Анализируя литературные данные, можно заметить, что во многих работах по разработке иммуносенсоров с применением в процедуре анализа наночастиц используются наночастицы золота [96-100]. В ряде исследований они выступают в качестве метки, зачастую в составе конъюгата с антителами к определяемому агенту, в других – как увеличивающий проводимость, а, следовательно, и чувствительность, модификатор поверхности 34 чувствительного элемента сенсора. Также достаточно часто упоминаются однофазные наночастицы: наночастицы серебра, платины, углерода, различные флуоресцентные наночастицы (сульфиды, селениды, теллуриды кадмия и цинка). Также наночастицы могут быть двухфазными: состоять из инертной матрицы (например, аморфный оксид кремния) наполненной оптически- и/или электрохимически активным соединением. Dwarakanath и сотрудники [101] предложили метод количественного определения основанный на частичном изменении длины волны излучения квантовых точек, в случае их конъюгирования с бактериями. Были проведены опыты с Salmonella typhimurium, E. coli, спорами B. subtilis и квантовыми точками CdSe/ZnS. При связывании квантовых точек с бактерией, наряду с основным пиком, в спектре излучения наблюдали пик, смещенный в синюю область, на величину порядка 140 нм. Авторы связывают это смещение с изменением химического окружения и физической деформацией квантовых точек при связывании. При увеличении концентрации бактерий величина смещенного пика растет, а основного уменьшается. Новые синтезируемые флуоресцентные метки являются более стабильными при хранении, но их высокая цена, а зачастую и многоэтапная процедура синтеза не позволяет широко использовать данный метод. Одними из самых популярных наночастиц (особенно в методах с оптической детекцией) являются оксидкремниевые наночастицы, допированные различными соединениями. Матрица наночастиц оксида кремния способна к инкапсулированию различных агентов, таких как органические и металлоорганические флуоресцентные красители, квантовые точки, ионы металлов и наночастицы металлов, без заметного изменения физических и химических свойств самих наночастиц [102]. Наночастицы оксида кремния механически и химически стабильны, гидрофильны и легко диспергируются в водных средах [103, 104]. 35 Tan и сотрудники разработали метод для быстрого выявления Mycobacterium tuberculosis [105]. В этом методе антитела к M. tuberculosis использовали в качестве первичных антител для распознавания микобактерии, а антитела, связанные с белками мечеными наночастицами оксида кремния, допированного рубидийбипиридилом - для генерирования флуоресцентного излучения. Детекцию с использованием флуоресцентных наночастиц проводили методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. С помощью этого метода, проведено селективное определение M. tuberculosis в пробе, содержащей смесь различных бактерий, а также в образце мокроты. На анализ, в том числе на пробоподготовку, затрачивается порядка 4 ч. Приведены данные о детектировании концентраций бактериальных клеток ≈105 -106 КОЕ/мл. Chang и соавторами [106] предложено использовать флуоресцентные аминмодифицированные наночастицы оксида кремния, допированные рубидийбипиридилом, в высокочувствительном методе иммуноанализа для определения стафилококкового энтеротоксина C1 (SEC1). В этом методе для определения энтеротоксина в пище используются наночастицы с пришитыми антителами к SEC1, детектирование проводится при помощи флуоресцентной микроскопии. Диапазон линейности метода 1.0 – 75.0 нг/мл. Помимо наночастиц оксида кремния в качестве носителя для флуоресцентных соединений используют наночастицы полистирола. Группа Hewlett разработала метод иммуноанализа на основе наночастиц полистирола допированных хелатным комплексом Eu (III) и β-дикетона для обнаружения защитного агента сибирской язвы [107]. Анализ может быть выполнен с помощью флуоресцентного спектрофотометра для ИФА. Исследование проводилось на образцах плазмы с внесенным защитным агентом сибирской язвы. Динамический диапазон обнаружения составил 0.01 – 100 нг/мл и чувствительность анализа примерно в 100 раз превысила стандартный метод ИФА. Однако использование дорогого соединения Eu (III) не позволяет широко внедрить этот метод. 36 В таблице 1.1 приведены публикации, посвященные использованию наночастиц в иммуноанализе. Таблица 1.1 – Использование наночастиц в иммуноанализе. Чувствительность/ предел обнаружения Патоген Наноматериал Метод детекции 1 E. coli O157:H7 2 Квантовые точки 3 Флуоресцентная микроскопия Флюориметрия 4 2×10 КОЕ/мл 5 [108] 1×103 КОЕ/мл [109] Флюориметрия Проточная планарная цитометрия Покрытие поверхности ИК спектроскопия 104 бактерий/мл 1–400 клеток E. coli в течение 20 мин [110] [111] 1.6×101 - 7.2×107 КОЕ/мл 4 10 –105 КОЕ/мл [112] Биолюминесценция Микроскопия и визуально Флуоресцентные спектры Детекция магнитных частиц 20 КОЕ/мл 10 нг [114] [115] 0.2 нМ за 2 мин [116] 4×104 КОЕ/мл [117] Увеличение сигнала (качественное определение) Визуальная детекция (качественное определение) 450 КОЕ/мл [118] 7×104 КОЕ/мл в реальном образце (моча) [121] Квантовые точки и магнитные наночастицы Квантовые точки Наночастицы SiO2 допированные красителем Магнитные наночастицы B. anthracis M. tuberculosis Listeria monocytoge nes S. saprophytic us, S. aureus Наночастицы золота Допированные Eu наночастицы SiO2 Парамагнитные наночастицы оксида железа Допированные красителем наночастицы SiO2 Наночастицы золота Флуоресцентная микроскопия УФ - спектроскопия Магнитные наночастицы ПЦР Магнитные наночастицы Массспектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции 7 Ссылка [113] [119] [120] 37 продолжение таблицы 1.1 1 Cholera toxin 2 Липосомы Наночастицы золота Salmonella наночастицы золота Salmonella enteritidis Наночастицы золота и магнитные наночастицы Наночастицы золота H. pylori Staphylococ cus Магнитные наночастицы E. faecalis, S. epidermidis P fimbriated E. coli Магнитные наночастицы E. coli, Salmonella Cholera toxin, ricin, Shinga-like toxin1, staphylococ cal enterotoxin B E. coli, Salmonella, S. aureus Квантовые точки Магнитные наночастицы Квантовые точки Наночастицы SiO2 допированные красителем 3 Флюориметрия Тестовая полоска 4 1 наномоль 10 фг/мл за 20 мин 5 [122] [123] Визуально и УФспектроскопия Тестовая полоска 10 фг/мл за 100 мин [124] Визуально по появлению красных точек 1 нг/мл [125] 10 нг [127] 10 КОЕ/мл в реальном образце (человеческая кровь) - [128] ∼1.9×103 КОЕ/мл [130] 104 КОЕ/мл [131] ∼5 нг/мл [132] Флуоресцентный метод Сканирующая электронная микроскопия Просвечивающая электронная микроскопия Подсчет числа колоний Массспектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции при содействии матрицы Флуоресцентная спектроскопия Флюороиммуноанализ Иммуноанализ с использованием люминофора - [126] [129] [133] 38 1.6. Нанокомпозиты в детекции бактерий Для того, чтобы применить наночастицы в работе с биологическими системами, зачастую, требуется модификация поверхности наночастиц. Например, для улучшения их гидрофильности и биосовместимости, а также получение поверхностных функциональных групп для целей биоконъюгации. Развитая площадь поверхности наноматериалов позволяет осуществлять «пришивку» к ним большого числа целеспецифичных молекул для селективной детекции. Современные нанотехнологии позволяют конструировать на наноразмерном уровне структуры самого различного типа. «Пришивка» биораспознающих элементов, таких как белки, антитела, ДНК и т.д., возможна при помощи традиционных методов, использующихся в биологии для биоконъюгации. Биомолекулы могут быть присоединены к наночастицам посредством химической, либо физической связи. В случае физической адсорбции, гидрофобные и электростатические взаимодействия между биомолекулами и наночастицами преобладают над взаимодействиями наночастиц друг с другом. Ограничением для случая физической адсорбции является затрудненность контроля количества закрепленных на наночастицах биомолекул, ориентации биомолекул, и процессов их спонтанной десорбции. Ковалентная связь в таком случае является более предпочтительной. Ковалентное связывание биомолекул и наночастиц зачастую проводится после модификации поверхности наночастиц полимером или соединением, содержащим в своей структуре функциональные группы, например, сульфиды, амины или карбоксильные группы. В дополнение к выполнению роли «якоря» для биомолекул функциональные группы также играют важную роль в устойчивости наночастиц как дисперсной фазы коллоидной системы [134]. В последние 10 лет использованию нанокомпозитов при определении бактерий уделяют всё больше внимания [135]. Как и наночастицы, нанокомпозиты в иммуноанализе могут выступать в качестве метки при детектировании различными методами (оптический, 39 электрохимический и др.), выступать в качестве агента для концентрирования и сепарации целевого аналита [136]. Для использования нанокомпозиты со в иммуноанализе строением при «ядро-оболочка» определении имеют бактерий значительные преимущества по сравнению с простыми наночастицами. Создавая на их поверхности покрытие можно добиться следующих преимуществ: (I) меньшая цитотоксичность [137]; (II) увеличение/ уменьшение гидрофильности (улучшение способности к диспергации в водной/липофильной среде); (III) био - и цито- совместимость; (IV) возможность образования более прочных связей с биологически активными молекулами; (V) повышенная термическая и химическая стабильность и т.д. [138]. Прочная ковалентная связь с биомолекулами локализованными на поверхности, или с соединениями, выступающими в качестве метки является очень важным фактором для применения нанокомпозитов в иммуноанализе. Во многих случаях наночастица может не иметь функциональных групп для взаимодействия и/или трудно конъюгировать с определенным типом биомолекул; в этом случае нанесение покрытия из подходящего биологически совместимого материала помогает решить эту проблему. Если материал ядра восприимчив к химическим или термическим воздействиям окружающей среды (склонен к самопроизвольным процессам окисления/восстановления и др.), нанесение покрытия из инертного материала увеличивает химическую стабильность частиц ядра [95]. В качестве ядра и оболочки частиц могут выступать: металл - металл, например Pt-Pd [139], оксид металла – металл, например Fe3O4 – Co [140], металл – полимер, например золото – полистирол [141], сульфиды и теллуриды металла, например CdTe-CdS [142], полимер – полимер, например сополимер производного флуорена - аморфный оксид кремния [143]. Получены частицы с 40 иммобилизированными на их поверхности наночастицами, в частности наночастицы серебра на частицах полиметилметакрилат – полиэтиленимин [144]. Представляют особый интерес нанокомпозитные частицы, в которых сочетаются свойства магнитного ядра и функциональные характеристики полимерного покрытия [144-149]. Из литературных источников известны исследования, посвященные синтезу и исследованию морфологии и электрохимических свойств композиционных наночастиц на основе Fe3O4 с полистирольным [150] и поливинилбензилхлоридным [151] покрытием, композитов на основе Y2O3 с полипиррольным покрытием [152], магнитных наночастиц покрытых флуоресцентными метками [153]. 1.6.1 Получение полимерных нанокомпозитов Для применения в биоанализе наиболее часто используют наночастицы состоящие из «неорганического» ядра и полимерной оболочки. Часто в качестве ядра выступает неорганический материал, проявляющий магнитные свойства, а полимерная оболочка, модифицированная различными функциональными соединениями, позволяет получать сигнал от нанокомпозита. Для получения подобных нанокомпозитов, в основном, применяют следующие методы синтеза: Физическая инкапсуляция Метод заключается в одностадийной или последовательной адсорбции полимера на заряженной наночастице. Адсорбция регулируется главным образом процессами электростатического взаимодействия и реализуются с помощью заряженных групп, или специфическими взаимодействиями (например, ионионное взаимодействие, комплексообразование, диполь-дипольное взаимодействие и т.д.). Основная цель такого метода заключается в физическом вовлечении неорганических наночастиц внутрь заряженного полимера, в конечном счете, образующего оболочку нанокомпозитных частиц. Иногда проводят многостадийную процедуру послойного нанесения покрытия. Таким образом часто инкапсулируют «квантовые точки», например, покрывая наночастицы полисахаридом, посредством электростатического взаимодействия [154]. Часто нанокомпозиты, полученные таким методом, не обладают 41 устойчивостью к физическим воздействиям (УЗ, нагревание, изменение pH среды) и поэтому более распространенным способом их синтеза являются полимеризация. Полимеризация Полимеризация является одним из самых широко используемых методов создания покрытия на поверхности наночастиц. В процессе микроэмульсионной полимеризации (применяемой наиболее часто) для получения идентичных субмикронных капелек мономера, которые преобразуются в стабильные коллоидные частицы, осуществляют интенсивное перемешивание фаз. Мономер в большинстве случаев является липофильным веществом, диспергированном в водном растворе ПАВ. Стабильность капель мономера(ов) достигается с помощью различных ПАВ (жирные спирты, или другие гидрофобные агенты (алканы с длинной цепью) [155]. Инициатором может как водо- так жирорастворимое вещество. Большая площадь поверхности мелких капель микроэмульсии (субмикронных размеров) повышает их способность захватывать растущие радикалы, генерируемые используемым инициатором. Следовательно, каждая капля превращается в микрореактор, в котором происходит полимеризация. На заключительном этапе каждая капля превращается в твердую частицу. В отличие от обычной эмульсионной полимеризации, в микроэмульсионной не происходит диффузия мономера(ов) через непрерывную дисперсную фазу, что позволяет добиваться получения моноразмерных частиц [156, 157]. Большое количество работ посвящено покрытию неорганических наночастиц полимером путем радикальной микроэмульсионной полимеризации. В литературе описано подобное покрытие наночастиц: оксида титана (TiO 2), карбоната кальция (CaCO3) , частиц каменного угля , ZnO, квантовых точек (CdSe / CdS) и оксида железа (Fe3O4) [158-161]. Распространена инкапсуляция наночастиц оксида железа в полистирол, для получения магнитных латексов, которые находят применение во многих биомедицинских областях. Для инкапсуляции гидрофильных наночастиц в гидрофильный полимер, кроме прямой микроэмульсионной полимеризации, используют обратную [162], либо проводят 42 предварительную модификацию поверхности наночастиц органическими соединениями, увеличивающими сродство между поверхность наночастицы и мономером. Применение такой модификации позволяет получить более равномерное покрытие, а также увеличить процент выхода покрытых полимером наночастиц [163]. Золь-гель метод Большое количество публикаций статей посвящено синтезу и применению в иммуноанализе нанокомпозитных частиц, с ядром или покрытием на основе неорганического полимера аморфного оксида кремния. Оксидкремниевая поверхность наночастиц может быть легко модифицирована посредством различных силановых реагентов, покрыта другим полимером и т.д. Поверхностная модификация может проводиться для улучшения биоконъюгации. Метод Штобера [164] является классическим методом получения наночастиц диоксида кремния, а также пленок и покрытий на поверхности макро- и микрообъектов. Золь-гель процесс, лежащий в основе метода, основан на гидролизе и последующей конденсации кремнийсодержащих соединений: ≡ SiOR + H2O ↔ ≡ SiOH + ROH ≡ SiOH + RO- Si ↔ ≡ Si-O- Si ≡ + ROH ≡ SiOH + HO- Si ≡ ↔ ≡ Si-O- Si + H2O Как правило, в качестве прекурсоров используют тетраметоксисилан (ТМОС) или тетраэтоксисилан (ТЭОС). Оба эти соединения содержат алкоксидные группы (соответственно, -OCH3 и - OCH2CH3), которые реагируют с водой с образованием промежуточных соединений (Si-OH) и побочных продуктов (R-OH). Si- OH может затем реагировать с другими Si-OH или Si-OR группами, с образованием диоксида кремния и побочных продуктов (ROH и H 2O). Реакцию обычно проводят в водно-спиртовой смеси, в качестве спирта используют метанол, этанол, н-пропанол, н-бутанол, изопропанол. В качестве катализатора коллоидного роста используется кислотный (неорганические кислоты), либо основный катализатор (например, аммиак). Данным методом возможно получить почти монодисперсные частицы размером от десятка нанометров до микрона (в 43 зависимости от использованных соотношений исходных реагентов и условий протекания реакций) [165]. Метод Штобера является одним из наиболее простых методов, позволяющих получить на поверхности наночастицы прочное покрытие с широкими возможностями для функционализации и дальнейшей модификации. Простота синтеза также играет важную роль в привлечении внимания исследователей к этому классу материалов. К преимуществам метода [166], которые позволили найти ему широкое применение в синтезе нанокомпозитов, в частности, относятся: возможность создания различных структур с ультрадисперсной фазой; обеспечение высокой чистоты, как исходного материала, так и получаемого продукта (особенно в случае использования алкоксидов); гомогенность распределения компонентов (в том числе и небольших модифицирующих добавок) и, как следствие этого, возможность снижения микронеоднородности образующихся соединений до молекулярного и ионного уровней; возможность получения новых кристаллических и аморфных фаз, материалов с катионами в несвойственных им степенях окисления, синтез которых традиционными методами затруднителен либо невозможен [167]. Функционализация покрытия наночастиц В некоторых случаях, для получения нанокомпозитных частиц с требуемыми характеристиками требуется модифицировать покрытие. В случае если покрытие (например, полимерное) в своей структуре имеет какие-либо якорные группы, возможно связать их химически с прививаемым веществом (модификатором), проведя реакцию иммобилизации. В простейшем случае у поверхностно-модифицированных наночастиц можно выделить следующие составляющие элементы (Рисунок 1.3.): 1) наночастица; 2) покрытие, к которому происходит присоединение; 44 3) якорные группы, ответственные за фиксацию привитого соединения; 4) функциональная группа (группы), в которой сосредоточены свойства привитого соединения. Рисунок 1.3 – Общая схема поверхностно-модифицированной наночастицы. Существуют различные методы присоединения различных молекул к якорным группам. Наиболее удобны для этих целей следующие якорные группы покрытия: - карбоксильные (–СООН), с возможностью дальнейшего присоединения функциональных соединений через карбодиимидную сшивку; - аминогруппы (–NH2), с возможностью дальнейшего присоединения функциональных соединений посредством сшивки глутаровым альдегидом; - хлоридные (–Сl). Функционализация покрытия используется для создания на поверхности наночастиц функциональных групп, которые могут: - служить для связывания наночастиц с определяемым аналитом (химический или биологический агент), вспомогательным реагентом; - служить для иммобилизации частиц на подложке, мембране, поверхности сенсора (электрод, пьезокварцевый сенсор); - придавать наночастице электроактивность, (флуоресценцию, люминесценцию) [168]. оптическую активность 45 1.6.2 Применение нанокомпозитов Применение нанокомпозитных частиц при разработке иммуносенсоров для обнаружения бактериальных агентов позволяет использовать новые подходы к сепарации и концентрированию определяемого аналита, расширить круг возможных способов детекции сигнала. Иммуносенсоры на основе нанокомпозитных частиц показывают хорошие результаты при непосредственном определении бактерий в биологических средах. Одними из наиболее перспективных являются наночастицы с магнитным ядром. В качестве материала ядра магнитных нанокомпозитных частиц чаще всего используются простые и смешанные оксиды, селениды и сульфиды Fe, Cd и Ni. Применение магнитных нанокомпозитов дает возможность использовать в процедуре анализа магнитное сепарирование и концентрирование, что позволяет увеличить чувствительность и селективность метода. В работах Gorovits и сотр. [169] показано, что диффузия бактерий к поверхности электрода является лимитирующей стадией в процессе гетерогенного электрохимического иммуноанализа. В связи с этим, без применения магнитного концентрирования, время, необходимое для достижения равновесия в реакции между иммобилизованным на поверхности сенсора антителом и бактерией в растворе, составляет, как правило, порядка нескольких десятков минут. Применение магнитных нанокомпозитных частиц позволяет увеличить скорость подвода бактерии из раствора, к поверхности сенсора и сократить это время до 20 минут [1]. В методах иммуноанализа, функционализированные магнитные частицы могут быть связаны с биомолекулами, использованы в качестве метки. С помощью магнита, целевой комплекс аналит – магнитные частицы выделяют для дальнейшего анализа. Для детекции могут использоваться оптические, электрохимические, микрогравиметрические и другие методы. Для мониторинга колиформных бактерий, продуцирующих в результате своей жизнедеятельности фенол, предлагают использовать амперометрический тирозиназный сенсор и аминомодифицированный магнетит, осажденный на углеродных нанотрубках. Фермент тирозиназа катализирует окисление 46 фенольных соединений с получением о-хинонов, которые могут быть восстановлены электрохимически. Однако в данном методе требуется ≈ 4 часа для проведения длительных подготовительных процедур. Отсутствие специфичности реакции также является недостатком данного метода [170]. Предложен метод обнаружения E.сoli при помощи кварцевого сенсора с использованием наночастиц магнетита, покрытых декстраном и наночастиц золота покрытых стрептавидином. Данный метод до момента непосредственного детектирования включает в себя 7 предварительных стадий (таких как инкубирование, сепарирование, декантирование). Помимо значительного увеличения продолжительности анализа, все эти стадии вносят огромный вклад в погрешность измерения [171]. Также для детектирования E.сoli предложено использовать магнитоэластичный сенсор, модифицированный полиуретаном и хитозанмодифицированные наночастицы магнетита. Подготовленный сенсор помещается в кювету с суспензией хитозанмодифицированного магнетита и E.сoli. Затем вся система помещается электростатически в катушку притягиваются соленоида. к При наночастицам, pH бактерии 5-6.5 затем наночастицы примагничиваются к сенсору, уменьшая его резонансную частоту. Однако данный метод также лишен специфичности [172]. Описаны разнообразные вариации метода иммуноферментного анализа (ИФА) с применением нанокомпозитных частиц. Авторами [173] предложен способ детектирования грамположительных и ванкомицинрезистентных грамотрицательных энтерококков бактерий. и других Наночастицы модифицированные ванкомицином конъюгируют с бактериями. Ванкомицин связывается с пептидными цепочками на поверхности клетки. Т.к. модифицированные НЧ занимают не все центры связывания, на незанятые «пришивается» комплекс ванкомицин – биотин, и затем посредством реакции авидин – биотин определяют концентрацию бактерий. Varshney и соавт. использовали покрытые стрептавидином магнитные наночастицы и меченые биотином антитела для обнаружения E. coli O157:H7 47 [112]. Модифицированные наночастицы были смешаны с образцом говяжьего фарша, содержащим определяемый аналит, затем комплекс наночастицы – антитело - E. coli O157:Н7 был отделен от матрицы магнитной сепарацией, промыт и концентрат бактерий количественно распределен по поверхности чашки Петри. При концентрации бактерий в диапазоне от 1.6 × 10 1 до 7.2 × 107 КОЕ/мл около 94% бактерий захватывается в течение 15 минут. В исследовании [113], НЧ Fe3O4, покрытые молочной кислотой функционализировали антителами к E. coli O157: 147 или к S. typhimurium с использованием карбодиимидной пришивки. Наночастицы с пришитыми антителами использовались для выделения E.coli или S. typhimurium из зараженного молока. Комплекс патоген – НЧ детектируется методом инфракрасной (ИК) спектроскопии (затрачиваемое время 30 мин). На ИК-спектре, полученном для образца содержащего определяемые бактерии, наблюдаются характерные спектроскопические «дактилоскопические» отпечатки этих патогенов. Однако, данный метод имеет достаточно высокий предел обнаружения - 104-105 КОЕ/мл. 2. Вирусные агенты и их определение Для современной вирусологии характерно применение самых различных методов обнаружения - как биологических (включая генетические), так и физикохимических. Перед вирусологами в настоящее время стоят две основные задачи: идентификация и изучение свойств новых, неизвестных вирусов, или их штаммов и изучение биологических свойств и строения уже известных видов. Протекание вирусной инфекции в идеализированном случае возможно разделить на следующие этапы: репликация вируса в зараженном организме, проявление клинических симптомов, синтез в организме иммуноглобулинов IgM и IgG (антител), подавление вирусной активности системой гуморального иммунитета и, в зависимости от способности конкретного организма уничтожить вирусный агент, далее может следовать стадия выздоровления (полного или с переходом острой формы инфекции в хроническую) или смерть зараженного 48 (Рисунок 1.4). При реальных случаях заражения происходят отклонения от классического течения вирусной инфекции, такие как задержки иммунного ответа, реактивация вируса в конце заболевания и др. При реактивации вируса или повторном заражении, иммуноглобулин IgM, может быть не обнаружен, вследствие низкой концентрации. Рисунок 1.4 – Типичная картина протекания вирусная инфекция и иммунный ответ организма. Так как вирусное заболевание является следствием вирусной репликации и, как следствие, лизиса клетки-хозяина, диагностические усилия должны быть сосредоточены на раннем выявлении вируса, когда титры вируса в пораженных тканях и органах зараженного организма являются максимальными. На протяжении многих лет, выделение вируса путем заражения клеточной культуры являлось основой вирусной диагностики. Однако, для работы с клеточной культурой требуется специализированное оборудование, и высококвалифицированный персонал. Кроме того, на выращивание зараженной вирусом клеточной культуры необходимо время (2-3 сут.), что приводит к отсроченной постановке диагноза. Использование для диагностики вирусных инфекций метода ПЦР открыло новые возможности для вирусологии. Методы молекулярной амплификации, включающие, но не ограничивающиеся ПЦР являются быстрыми и 49 высокочувствительными, с их помощью стало возможным обнаруживать вирусы, не поддающиеся обнаружению другими методами. Развитие данных методов привело к возможности количественного определения вирусных агентов и автоматизации процесса детекции [174]. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки (Таблица 1.2). Таблица 1.2. – Преимущества и недостатки методов определения вирусов Метод 1 Изоляция вируса 2 Культуральный Быстрый культуральный Определение антител Время анализа 3 1-21 день 1-5 дней Различные 30 мин – варианты ИФА, 24 часа методы иммуноблоттинга, хемилюминисцентный и имунохроматографический анализ. Преимущества Недостатки 4 Позволяет изолировать многие вирусы; более чувствителен, чем детекция антигена 5 Трудно интерпретировать цитопатогенный эффект; требует большого разнообразия культур (некоторые вирусы не растут на обычных лабораторных линиях) и условий для поддержания их в жизнеспособном состоянии; высокая биологическая опасность. Использование иммунофлуоресцентного метода детекции; способен детектировать только целевые вирусы; менее чувствителен, чем обычный культуральный. Интерпретация результатов иммунофлуоресцентного анализа более легкая, чем определение цитопатогенного эффекта. Может использоваться для определения первичных, остаточных и перенесенных пациентом инфекций; определение носительства; возможна автоматизация; определение антигена и антител в одной реакции Перекрестная реактивность между схожими вирусами (например, арбовирусы); получение ложноположительного результата (после перенесенных заболеваний); к некоторым вирусам не вырабатываются антитела. 50 продолжение таблицы 1.2 1 Электронная микроскопия Детекция антигена 2 Тонкий срез 3 3 дня 4 Позволяет визуализировать вирусы; детекция нецелевых патогенов и открытие новых вирусов. Негативная окраска 1 час Позволяет быстро визуализировать вирусы в пузырьках жидкости, выделенной из дыхательных путей или стула, моче; открытие новых вирусов Может быть проведен "по требованию" (сразу как образцы поступят в лабораторию); реагенты, доступны для восьми респираторных и четырех видов вируса герпеса; возможно оценить качество образца Может быть автоматизирован; требует менее квалифицированн ый персонал по сравнению с иммунофлуоресцентным; Не требует дорогостоящего оборудования и большого опыта выполнения. Иммунофлуоресцентный анализ 1-2 часа Твердофазный ИФА / хемилюминисцентный иммуноанализ <2ч Иммунохроматография < 30 мин 5 Дороговизна; трудоемкость; возможно использовать только при высокой вирусной нагрузке; требуется высококвалифицированн ый персонал для идентификации вируса Дороговизна; трудоемкость; Для получения точных результатов требуется высококвалифицированн ый и опытный персонал; трудоемкий и неавтоматизированный; для получения достоверных результатов требуется достаточное количество клетокмишеней. Ограниченный список агентов, которые возможно определить. Невысокая чувствительность; ограниченный список агентов, которые возможно определить. 51 продолжение таблицы 1.2 Амплификация нуклеиновых кислот Общие Традиционный ПЦР ПЦР в режиме реального времени Самый чувствительный метод; детекция вирусов, которые не «растут» на культуре; достаточно быстрый; более биобезопасный, чем культуральный, т.к. происходит инактивация вируса 5-9 часов Использование недорогих амплификаторов; наименее подвержен изменчивости генома вируса; лучший результат при мультиплексном тестировании, чем ПЦР в режиме реального времени. 1-5 часов Быстрый; менее склонен к перекрестной контаминации; быстрое количественное определение; возможность быстрой разработки и модификации методик определения; развитие портативных систем. Требует дорогого специализированного оборудования; большой размах варьирования результатов между лабораториями; затруднение амплификации в некоторых случаях; перекрестная контаминация ведет к ложноположительным результатам; можно обнаружить клинически нерелевантные вирусы; генетическая вариабельность вируса может привести к ложноотрицательным результатам Возможность для загрязнения пробы продуктами амплификации; медленнее, чем ПЦР в режиме реального времени; бромистый этидий, используемый для обнаружения ампликона является токсичным Более склонен к ложноотрицательным или заниженным результатам вследствие генетических вариаций вирусных штаммов; трудности стандартизации; значения, полученные в разных лабораториях могут сильно отличаться; ограниченный возможности для мультиплексирования 52 В настоящее время, вследствие разнообразия доступных методик и протоколов определения вирусов и разнообразных тестовых наборов, выбор метода определения, а также интерпретация и сравнение результатов, полученных разными методами стали серьезной проблемой для врачей и лабораторий. Таким образом, в области создания новых способов и методов диагностики вирусных заболеваний можно выделить 2 основных направления: - высокотехнологичные методы с использованием новейших дорогостоящих приборов с полной специфичностью, автоматизацией, производительностью, высокой с чувствительностью, использованием микро- и нанотехнологий выявления ДНК/РНК, белков или других молекул, желательно мультиплексностью, для использования в крупных лабораториях и научных центрах; - создание быстрых, простых портативных методов с использованием портативных недорогих приборов, также высокой чувствительности и специфичности, но пригодных для использования практически везде, в т. ч. в полевых условиях и у постели больного, с использованием портативных сенсоров. При этом оптимальным считается использование биоматериалов от больных, полученных неинвазивным способом. Достижения в области нанотехнологий широко внедряются при разработке современных методов диагностики инфекционных заболеваний. Некоторые из этих технологий уже сейчас внедряются в используемые на практике методы молекулярной диагностики в виде биочипов. Использование НЧ в качестве метки позволяет определять вирусные агенты в небольшом объеме пробы напрямую, с высокой чувствительностью, специфичностью, быстрее и дешевле, чем существующие стандартные методы. В молекулярной диагностике наиболее часто используют НЧ золота и магнитные НЧ и нанокомпозиты. В качестве меток могут использоваться также наночастицы серебра, кварцевые наночастицы для мечения антител, флюоресцирующие лантаниды (и др. квантовые точки), органические наночастицы и др. 53 Авторами [175] разработан спектроскопический метод, с использование метода поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии, для обнаружения антигенов вирусов лихорадки западного Нила и лихорадки Рифт-Валли, в основе которого лежит образование «сэндвич»-иммунокомплекса «магнитные НЧ, модифицированные антителами – антиген - золотые НЧ, модифицированные антителами и красителем» (Рисунок 1.5). С использованием данного метода возможно специфично обнаружить ≈ 10-9 мг/мл антигена. Однако, основным недостатком методов, основанных на регистрации рамановского излучения, является сложность детекции излучения (использование приставок к прибору) при анализе окрашенных проб. Рисунок 1.5. - Схема метода определения антигена с использованием наночастиц золота и магнетита. Созданы перспективные модели чипов с использованием НЧ для дифференциальной диагностики лихорадочных заболеваний (малярия, корь, лихорадка Денге, тифозные и риккетсиозные инфекции). Разрабатываются и производятся биочипы для диагностики туберкулеза и выявления устойчивости микобактерий к антибиотикам. В целом, направление развития методов определения вирусных агентов, очевидно, будет идти в сторону разработки новых недорогих, удобных, надежных, простых, быстрых методик детекции и количественной характеристики биопроб, создания портативных сенсоров [176]. 54 3. Постановка задачи Анализ литературных данных в области создания иммуносенсоров для определения инфекционных агентов позволяет прийти к выводу, что в настоящее время продолжается поиск простых, экспрессных и недорогих методов их определения. Высокая чувствительность и специфичность метода также являются неотъемлемыми требованиями к нему. Возможность реализации способа анализа в условиях маленьких неспециализированных лабораторий или в «полевых» условиях, сегодня является одной из приоритетных задач разработчиков, поскольку такой портативный метод способен будет конкурировать с широко распространенными методами ИФА и ПЦР. Однако, зачастую, не удается объединить в одном способе простоту выполнения анализа и высокую чувствительность. В последние 20 лет иммуноанализ активно использует новейшие достижения в области нанотехнологий, методы которых позволяют синтезировать новые наноразмерные метки и вспомогательные реагенты для анализа, а также создавать высокочувствительные детектирующие элементы и системы. Синтез и использование электроактивных нанометок в иммуноанализе является весьма перспективным, поскольку позволит с одной стороны, исключить необходимость применения дорогих и быстро теряющих свою активность ферментов, уменьшить время, затрачиваемое на анализ. Сочетание электроактивности покрытия наночастиц с их магнитными свойствами обеспечит необходимую чувствительность сенсора. С другой стороны, электрохимический иммуноанализ совмещает в себе такие преимущества как простота и относительная невысокая стоимость аппаратурного оформления (по сравнению с другими методами), в сочетании с его высокой чувствительностью и селективностью за счет иммунореакции. Таким образом, целью работы являлась разработка бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода для количественного определения: 55 – бактерий (на примере E.coli ATCC 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4 с электроактивным покрытием в качестве сигналообразующей метки; – антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори NovO/96) с использованием конъюгатов антител и магнитных нанокомпозитных частиц. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: - осуществить нанокомпозитные выбор частицы метода постоянного синтеза состава позволяющий получить с ядром магнитным и электроактивным покрытием, генерирующим стабильный сигнал, с размерами, позволяющими проходить сквозь клеточную мембрану бактерии (не >300 нм); - осуществить выбор способа получениям конъюгатов антител к вирусу с нанокомпозитными частицами; - осуществить выбор нанокомпозитных частиц, генерирующих адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический отклик для использования в качестве «метки»; - исследовать морфологию полученных нанокомпозитных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией, ИК-спектроскопии; - изучить электрохимические свойства синтезированных нанокомпозитных частиц; - осуществить выбор условий и способ иммобилизации электроактивных нанокомпозитных частиц на поверхности бактериальной клетки; - осуществить выбор условий формирования «прямого» электрохимического аналитического сигнала после взаимодействия НК с бактериями; - осуществить разработку алгоритма проведения иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов; - осуществить выбор условий проведения процедуры иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов; 56 - провести анализ модельных растворов, содержащих микроорганизмы; - сравнить результаты анализа проб, полученных с использованием предложенного электрохимического метода иммуноанализа и традиционно используемых методов (ИФА и бактериального посева). 57 ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 2.1 Оборудование и средства измерений В технологии синтеза магнитных наночастиц Fe3O4 и нанокомпозитных частиц использовали следующее оборудование: - верхнеприводная мешалка IKA Eurostar digital 2482000 (IKA, Германия) для перемешивания суспензий наночастиц и нанокомпозитов, содержащих магнитное ядро, проведения процесса получения нанокомпозитов методом эмульсионной полимеризации; - магнитная мешалка IKA С-MAG HS7 (IKA, Германия) с термометром ETSD5 для перемешивания и нагрева жидкостей и эмульсий; - ультразвуковой гомогенизатор с микропроцессорным управлением Ultrasonic processor 500W (Sigma-Aldrich, США) для получения эмульсий и суспензий. Образцы, содержащие бактерии E.coli, инкубировали с использованием мини-инкубатора «GFL-4010» (Gesellschaft fur Labortechnik, Германия). Для фотометрических измерений (определения концентрации микроорганизмов E.coli в суспензии) использовали спектрофотометр «Evolution 201» (Thermo-scientific, США) со стеклянной кюветой (толщин слоя 1 см). В синтезе наночастиц Fe3O4 и нанокомпозитов использовали магнит, сконструированный в институте физики металлов УрО РАН (ИФМ УрО РАН), с величиной магнитного поля 37.40×104 А/м. Для магнитной сепарации и магнитного концентрирования нанокомпозитов применяли магнитный штатив «MagneSphere®» для 12 микропробирок типа «Eppendorff» (Promega, США) с величиной напряженности магнитного поля 31.83×103 А/м. Морфологию клеток штаммов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). 58 Микрофотографии нанокомпозитных частиц и конъюгатов бактериальных клеток с наночастицами получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM 1400 (Jeol, Япония). Электрохимические исследования проводились с использованием вольтамперометрического анализатора ИВА-5 («ИВА», г. Екатеринбург) и потенциостата/гальваностата µAutolab type III (Metrohm, Швейцария). Применяли трехэлектродную электрохимическую ячейку объемом 10 см 3. В качестве вспомогательного электрода использовали стеклоуглеродный стержень (Metrohm, Голландия), электродом сравнения служил насыщенный хлоридсеребрянный электрод (Ag / AgCl / 3 моль/дм3 KCl) (Metrohm, Голландия). В качестве твердой подложки для иммобилизации антител и рабочего электрода использовали толстопленочный электрод (ТГЭ), изготовленный на основе графито-эпоксидной пасты. ТГЭ представляет собой дорожку графито-эпоксидной пасты, нанесенную на полимерную пластинку размером 5×40 мм через трафарет из полимерной пленки толщиной 0.2 мм. Общий вид ТГЭ представлен на рисунке 2.1. Рисунок 2.1– Общий вид ТГЭ: 1 – подложка из полимерного материала; 2 – дорожка из графито-эпоксидной пасты (контактная зона электрода); 3 – слой изолятора; 4 – рабочая зона электрода. Взвешивания проводили на аналитических весах «Shimadzu aux 220» («Shimadzu», Япония), точность 0.1 мг. 59 2.2 Реактивы, рабочие растворы Особое внимание уделяли чистоте реактивов, растворов и посуды. В работе применяли реактивы квалификации «ос.ч.» и «х.ч.». Все растворы готовили на деионизированной воде, полученной на комбинированной мембранной установке серии ДВС-М/1НА(18)-N («Медиана-Фильтр», г. Москва). Суспензию нанокомпозитов для инкубации с биоматериалом готовили диспергированием навески нанокомпозита, деионизированной водой и последующей УЗ обработкой. В работе использовали следующие реактивы и растворы: - шестиводный хлорид железа (III) (FeCl3∙6H2O) (Sigma-Aldrich, США); - четырёхводный хлорид железа (II) (FeCl2∙4H2O) (Sigma-Aldrich, США); - олеиновая кислота (Sigma-Aldrich, США); - паравинилбензилхлорид (Sigma-Aldrich, США); - стирол (Sigma-Aldrich, США); - 1,4-дивинилбензол (Sigma-Aldrich, США); - хинолин (Sigma-Aldrich, США); - хинальдин (Sigma-Aldrich, США); - пиррол (Sigma-Aldrich, США); - персульфат натрия (Sigma-Aldrich, США); - тиосульфат натрия (Sigma-Aldrich, США); - додецилсульфат натрия (Sigma-Aldrich, США); - тетраэтоксисилан (Sigma-Aldrich, США); - аминопропилтриэтоксисилан (Sigma-Aldrich, США); - 25% водный раствор аммиака (NH4OH), чда. (OOO «Сигма ТЕК»); - этанол 95% (ООО «Гиппократ»); - ацетонитрил, хроматографически чистый (Panreac); - толуол, хроматографически чистый (Panreac); - микроорганизм бактерии Escherichia coli штамм АТС 25922 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); 60 - кроличьи поликлональные антитела к Escherichia coli титр 1:4000 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); - микроорганизм бактерии Salmonella infantis штамм В-1281 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); - микроорганизм бактерии Micrococcus flavus штамм В-1132 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); - микроорганизм бактерии Bacillus licheniformis штамм В-299 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); - антиген вируса кори (NovO/96), концентрация 2.33 мг/мл (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); - антитела к вирусу кори (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор», г. Новосибирск); - вторичные антитела к вирусу кори (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск); - жидкая среда для культивирования бактерий LB («Difсo», США), рН 7,0-7,2; - агаризованная среда для культивирования бактерий LB («Difсo», США), рН 7,0-7,2; - агаризованная среда Эндо для культивирования бактерий («Difсo», США), рН 7,0-7,2; - глутаровый альдегид 25% (Sigma-Aldrich, США); - серная кислота (H2SO4) 57% ос.ч. (ОАО «Гиредмет» г. Москва); - азотная кислота (HNO3) 57% ос.ч. (ОАО «Гиредмет» г. Москва); - перекись водорода (H2O2) медицинская 36-38% (ООО «Лега» г.Дзержинск); - CH3COONa∙3H2O (Sigma-Aldrich, США); - пирокатехол ос.ч. (Sigma-Aldrich, США); - ГСО ионов Fe(III) (ООО «Экрос», г.Санкт-Петербург); - фосфатный буферный раствор рН=7.2, о.с.ч.; - калия нитрат (Sigma-Aldrich, США); - стерильный 0.9% раствор натрия хлорида (ОАО «Мосфарм», Москва); - деионизированная вода; 61 2.3 Методики эксперимента 2.3.1 Методики получения наночастиц Fe3O4 Наночастицы Fe3O4 получали известным методом соосаждения [177], добавляя по каплям 25% раствор NH4OH к водному раствору, содержащему 4.5% вес. FeCl3 и 2.25% вес. FeCl2. Использовали реагенты в стехиометрических соотношениях (кроме аммиака, который был взят в небольшом избытке) согласно уравнению: Fe2+ + 2 Fe3+ + 8 ОН- → Fe3O4 + 4 Н2О Фазовый состав синтезированных наночастиц контролировали методом электронной микроскопии с помощью электронной дифракции. С использованием стандартных кристаллографических данных была подтверждена структура Fe 3O4. Максимум распределения частиц по размерам приходится на величину 10 нм при узком разбросе величин вокруг этого максимума. 2.3.2 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4. с поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным гетероциклическими соединениями Перед проведением реакции полимеризации поверхность наночастиц магнетита гидрофобизировали. К суспензии 0.5 г наночастиц Fe3O4 в 200 мл деионизированной воды добавляли 3 мл олеиновой кислоты, перемешивали на верхнеприводной мешалке до обесцвечивания водной фазы (перехода наночастиц в капли олеиновой кислоты), затем отмывали избыток кислоты последовательно водой и этанолом с магнитной сепарацией наночастиц. Модифицированные олеиновой кислотой наночастицы магнетита, диспергировали в смеси 1.3 мл паравинилбензилхлорида, 0.13 мл 1,4дивинилбензола и 0.2 мл циклогексана (липофильная фаза), а затем смешивали с 62 водной фазой (раствор 0.1 г эмульгатора додецилсульфата натрия в 50 мл воды) в ультразвуковом поле (Таблица 2.1). Таблица 2.1 – Составы фаз Липофильная фаза Наночастицы Fe3O4, модифицированные олеиновой кислотой Винилбензилхлорид Дивинилбензол Циклогексан Затем инициировали ≈ 0.5 г Водная фаза 50 мл Вода Додецилсульфат 0.1 г натрия 1.3 мл 0.13 мл 0.2 мл радикальную полимеризацию добавлением окислительно-восстановительной системы, содержащей 0.015 г Na2S2O3 и 0.0238 г Na2S2O8 (Схема 1). Процесс проводили при температуре 80 ОС и перемешивании в течение 12 часов. Образец сушили на часовом стекле при комнатной температуре, досушку проводили в вакууме над P2O5. Схема 2.1 Fe3O4 HC CH2 HC CH2 + + Oleic Acid Cl Cl Fe3O4 Na2S2O3 Na2S2O8 HC CH2 HC CH2 H2C CH (I, II) CH CH2 n n HC CH2 Cl Получены образцы при следующих соотношениях НЧ Fe3O4 – мономер (Таблица 2.2). Соотношение водной / липофильной фаз составляло 3:100. Таблица 2.2 – Соотношения исходных компонентов для образцов НЧ (Fe3O4)модифицированный хинолином поливинилбензилхлорид № образца I II m (НЧ Fe 3 O 4 ) / m (винилбензилхлорида) 3:10 1:10 63 Для создания электроактивной метки на поверхности покрытых поливинилбензилхлоридом наночастиц проводили реакцию кватернизации с модифицирующим агентом хинолином (схема 2.2), хинальдином (схема 2.3) или хиноксалином (схема 2.4), для чего к суспензии 0.1 г НК в 3 мл ацетонитрила, добавляли один из модифицирующих агентов (Таблица 2.3) и кипятили в течение 3-х часов. Таблица 2.3 – Количества модифицирующих агентов Модифицирующий агент хинолин хиноксалин хинальдин Объем / масса 1 мл 1г 1 мл Схема 2.2 Fe3O4 Fe3O4 N + Cl Cl- HC CH2 CH n N + CH2 HC CH2 H2C CH HC n CH n CH2 CH2 H2C CH HC n CH2 Cl + N Cl- (I a, II a) 64 Схема 2.3 Fe3O4 N Fe3O4 CH3 + H3C Cl- Cl N + HC CH2 CH CH2 n HC CH2 CH CH2 n H2C CH HC CH2 n H2C CH HC CH2 n (I b, II b) Cl + N ClCH3 Схема 2.4 Fe3O4 Fe3O4 N + N N Cl Cl- N + HC CH2 CH CH2 n HC CH2 CH CH2 n H2C CH HC CH2 n H2C CH HC CH2 n (I c, II c) Cl + N N Cl- 65 После проведения реакции проводили отмывку полученных нанокомпозитов от компонентов реакционной смеси. Для этого осадив нанокомпозитные частицы магнитом, удаляли жидкую фазу, добавляли ацетонитрил, убирали магнит, тщательно перемешивали, вновь осаждали НК и сливали надосадочную жидкость. После этого процедуру отмывки повторяли ещё три раза. Образец высушивали на часовом стекле при комнатной температуре, досушку проводили в сушильном пистолете над P2O5. Полученный нанокомпозит визуально представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета, проявляющий магнитные свойства при наложении поля. 2.3.3 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4. с полипиррольным покрытием (Fe3O4-ПП) В суспензию, содержащую 0.1 г наночастиц магнетита в 50 мл воды, находящуюся в ультразвуковом (УЗ) поле, добавляли по каплям 0.1 мл пиррола и раствор 1.2 г 6-ти водного хлорида железа (III) в 5 мл воды (схема 2.5). Реакцию проводили в ультразвуковом поле. Схема 2.5 Fe3O4 FeCl3 + Fe3O4 N H (III-IX) N H n Для очистки композитных наночастиц от непрореагировавшего в ходе реакции полимеризации мономера пиррола и прочих компонентов реакционной смеси, при помощи магнитной сепарации осаждали нанокомпозит, надосадочную жидкость декантировали, нанокомпозит 5 раз промывали водой, затем 3 раза этанолом. Осадок отделяли магнитной сепарацией. Образец высушивали на часовом стекле при комнатной температуре, досушку проводили в вакууме над P2O5. 66 Полученный нанокомпозит представляет собой угольно-черный мелкодисперсный порошок, проявляющий магнитные свойства при наложении поля. Для получения нанокомпозитов различной размерности на первом этапе варьировали соотношение НЧ (Fe3O4)/мономер, (Таблица 2.4). На втором этапе изменяли объем дисперсионной среды (количество воды, в которой проходит реакция) для выбранного соотношения НЧ (Fe3O4)/мономер 1:1 (Таблица 2.5). Таблица 2.4 – Соотношения исходных компонентов для образцов НЧ (Fe3O4)полипиррол № образца III IV V VI m (НЧ Fe 3 O 4 ) / m (пиррола) 2:1 3:2 1:1 4:5 Таблица 2.5 – Объемы дисперсионной среды в реакции получения нанокомпозитов НЧ (Fe3O4)-полипиррол № образца VII VIII IX m (НЧ (Fe 3 O 4 ) : m д и с п е р с и о н н о й 1:125 1:250 1:500 среды 2.3.4 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4. с ферроценмодифицированной оксидкремниевой оболочкой (Fe3O4-ФЦSiO2) 0.5 г наночастиц магнетита диспергировали в 80 мл 95% этанола, добавляли 0.5 мл тетраэтоксисилана и 1 мл 25% раствора NH4OH (Схема 2.6). Реакционную смесь кипятили при перемешивании в течение 10 часов. Удаляли непрореагировавший тетраэтоксисилан трехкратной промывкой этанолом, затем толуолом. Нанокомпозит отделяли магнитной сепарацией. 67 Схема 2.6 O OEt + Fe 3O4 EtO Si OEt NH4 Si EtO Si O Si O ETOH O Fe3O4 OEt Si Si O O Si OEt Si Получали известного (3-(ферроцениламид)пропил)триэтоксисилан метода [178], основанного на амидировании при помощи хлорангидрида ферроценкарбоновой кислоты различными аминами с высокими выходами (Схема 2.7). К интенсивно перемешенной суспензии ферроценкарбоновой кислоты (1.0 ммоль) в 10 мл сухого CH2Cl2 при 0 oC в атмосфере аргона по каплям добавляли раствор оксалилхлорида (1.5 ммоль), содержащий ДМФА (0.2 ммоль), в 5 мл сухого CH2Cl2. Реакционную массу перемешивали при 0оС в течение 20 минут, раствор стал ярко-красным. Затем растворитель упарили досуха при пониженном давлении. Полученный ферроценоилхлорид растворяли в 25 мл сухого CH2Cl2 и по каплям приливали к смеси аминопропилтриэтоксисилана (1.3 ммоль) и триэтиламина (2 ммоль) в 10 мл сухого CH2Cl2 при 0oC. Суспензию перемешивали при 0оС в течение 20 минут, затем при комнатной температуре еще 2 часа, после этого концентрировали в вакууме. Полученный остаток подвергали колоночной хроматографии на SiO2. Растворитель упарили досуха при пониженном давлении. Желтые кристаллы. Выход 0.26 г (60%), т.пл. 81С. Элюент гексан : этилацетат (2:8) (Rf 0.3). Продукт был идентифицирован как (ферроцениламид)пропил)триэтоксисилан на основании спектров ЯМР 1H, (313 элементного анализа. Полученные данные совпадают с опубликованными [179]. Схема 2.7 С, 68 «Пришивку» производного ферроцена осуществляли в безводном толуоле. Для этого к суспензии 0.1 г покрытых оксидом кремния наночастиц в толуоле добавляли 0.03 г (3-(ферроцениламид)пропил)триэтоксисилана. Реакцию проводили при температуре кипения толуола и перемешивании в течение 12 часов (Схема 2.8). Схема 2.8 O H N EtO OEt Si OEt + OH N Si O Si O O Si Fe3O4 Fe Si EtO Si O O Si O O Si Fe3O4 OEt Si O Si Fe O Si O OEt OEt Si O Si Fe H N (X) O Полученный образец X очищали 3-х кратной промывкой толуолом с магнитной сепарацией нанокомпозита. Образец высушивали в сушильном шкафу при температуре 70о С. Образец визуально представляет собой мелкодисперсный порошок кирпично-коричневого цвета проявляющий магнитные свойства при наложении поля. 2.3.6 Методики микроскопических исследований Микрофотографии нанокомпозитных частиц и конъюгатов бактериальных клеток с наночастицами получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM 1400 (Jeol, Япония) методом негативного контрастирования. Для получения микрофотографий нанокомпозитных частиц каплю суспензии объемом 20 мкл наносили на электронно-микроскопические сеточки, покрытые поддерживающей пленкой из формвара и выдерживали в течение 30 с. Излишки суспензии удаляли фильтровальной бумагой с края сетки. Микроскопические и микродифракционные исследования проводили на одном и том же участке поверхности образца. 69 Для проведения микроскопических исследований культуру бактерий после экспозиции с НЧ (10 и 30 мин), центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5-ти минут, затем для фиксации препарата добавляли 4% раствор параформальдегида и выдерживали при +4оС в течение 24ч. Далее образцы промывали в фосфатном буфере, дофиксировали 1%-ным раствором осмиевой кислоты, обезвоживали по стандартной методике в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на микротоме Райхерт-Янг (Австрия), контрастировали 1%-м водным раствором уранилацета и исследовали в электронном микроскопе. Фотосъемка, анализ и обработка снимков проводилась с помощью цифровой камеры бокового вывода Veleta (SIS, Германия) и программного пакета iTEM (SIS, Германия). 2.3.7 Условия культивирования бактериальных штаммов При культивировании бактерий применяли жидкую и агаризованную среду LB, рН 7.0-7.2, агаризованную среду Эндо. Для приготовления опытных суспензий клеток использовали бульонные культуры штаммов, наработанные в течение 18-24 часов, при температуре 30-37°С на термостатированой качалке (КТ 104, Россия). Для определения титра клеток в суспензиях в иммунологических 96луночных планшетах готовили их последовательные десятикратные разведения и высевали по 10 мкл на агаризованную среду LB в 3-5 повторностях. 2.3.8 Методика постановки ИФА Для детекции бактерий E.coli использовали двустадийный сэндвич-метод иммуноферментного анализа (ИФА). На планшете для ИФА сорбировали кроличьи поликлональные антитела (ПКАТ) разведенные в соотношении 1:500 раствором бикарбоната натрия с концентрацией 0.84 г/л (начальная концентрация ПКАТ 10 мг/мл). 70 Вносили по 100 мкл суспензии антител в лунку планшета и оставляли на 18 часов при комнатной температуре, затем удаляли содержимое, вносили по 200 мкл/лунку блокирующего раствора (0.1% казеин и 1% сахароза в воде) на 2 часа, затем удаляли содержимое и сушили 18 часов при комнатной температуре. Хранили в холодильнике в герметичном пакете с осушителем. Подготовка к проведению ИФА: Для разведения образцов использован раствор для разведения образцов (РРО), состоящий из: 0.1 М трисаминометана, 0.1 М NaCl, 0.3 М этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0.1% Тритон Х-100, рН = 8.0. Положительный образец (К+) - суспензия E.сoli 1:100 в РРО. Отрицательный образец (К-) - 0,05% казеин в РРО. Биотинилирование и очистка кроличих поликлональных антител: а) 1 мл раствора 0.5 мг/мл ПКАТ диализовали в течении 20 часов в 1 литре карбонатного буферного раствора, б) добавили 0.18 нг сульфо-NHS-биотина в диметилсульфоксиде и инкубировали 40 мин (Т=37оС при 900 об/мин перемешивании); в) очищали от несвязавшегося избыточного биотина гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-25; г) для хранения биотинилированные антитела смешали с глицерином 1:1 и хранили при -20о С. Рабочий раствор конъюгата №1 (РРК 1) - разведение 0.25 мкг/мл очищенных биотинилированных кроличьих поликлональных антител в растворе для разведения конъюгата (РРК). Рабочий раствор конъюгата №2 (РРК-2) - разведение в фирменном стабилизаторе 1:6000 фирменного конъюгата "стрептавидин-полипероксидаза" (пр-во ООО "Биоген Текнолоджиз" Россия). 71 Процедура ИФА: Первая стадия: Помещали в лунку планшета 100 мкл образца + 100 мкл РРК1. Инкубировали 30 мин при 37оС, перемешивании 700 об/мин. Затем проводили семикратную отмывку фосфатно-солевым промывочным раствором с добавлением Твин-20 по 300 мкл/лунку. Вторая стадия: Помещали в лунку планшета 100 мкл РРК 2, Инкубировали 30 мин при 37 оС, перемешивании 700 об/мин. Затем проводили семикратную отмывку фосфатносолевым промывочным раствором с добавлением Твин-20 по 300 мкл/лунку. Окрашивание: В каждую лунку вносили 100 мкл готового раствора хромогена тетраметилбензидина (ТМБ), выдерживали 3 мин. Затем в каждую лунку вносили по 50 мкл стоп-реагента. Планшет помещали в спектрофотометр и проводили измерение интенсивности окрашивания на мультиканальном спектрофотометре при длинах волн 450 и 655 нм. 72 ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ НАНОКОМПОЗИТНЫХ ЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ Fe3O4 В настоящей работе предложен подход к использованию электроактивных магнитных нанокомпозитов на основе Fe3O4 в качестве детектируемой (электрохимической) сигналообразующей метки в процедуре метода электрохимического иммуноанализа. Задачей этой части работы являлся выбор оптимальных условий синтеза магнитных нанокомпозитов на основе наночастиц Fe3O4. Технология выбранного метода синтеза должна быть недорогой, нетрудоемкой и позволять получать наноматериал с воспроизводимыми целевыми характеристиками: - размером, позволяющим проходить сквозь клеточную стенку бактерии; равномерным - покрытием, позволяющим получать аналитический электрохимический сигнал. После анализа литературных данных были выбраны два способа получения электроактивных нанокомпозитных частиц: 1. На основе Fe3O4 с инертным функциональным полимерным покрытием с последующей «пришивкой» электроактивных «молекул»: a. Покрытие поливинилбезилхлоридом с последующей реакцией кватернизации (глава 2.3.2., стр. 61). b. Покрытие аморфным оксидом кремния с последующей модификацией аминопропилтриэтоксисиланом и ковалентной пришивкой производного ферроцена (главы 2.3.4, стр.66). 2. На основе Fe3O4 с электроактивным полимерным покрытием a. Покрытие полипирролом (смотри главу 2.3.3., стр. 65). В работе использованы подходы к синтезу и модификации нанокомпозитов, которые в совокупности позволяют без применения жестких условий, агрессивных сред и сложной аппаратуры получить магнитные электроактивные нанокомпозитные частицы с равномерным полимерным покрытием. Применение способа ковалентной пришивки модифицирующего соединения 73 («сигналообразующей метки») обеспечивает получение устойчивого покрытия на поверхности наночастиц магнетита и их электроактивность. 3.1 Нанокомпозиты с полимерным поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным азотсодержащими гетероциклическими соединениями В качестве инертного полимерного покрытия для наночастиц Fe3O4 был выбран поливинилбензилхлорид. Данный полимер имеет функциональную хлоридную группу, по которой возможная дальнейшая «пришивка» модификатора - электроактивного соединения. Поливинилбензилхлоридное покрытие получено путем радикальной полимеризации соответствующего мономера (паравинилбензилхлорида) в присутствии гидрофобизированных наночастиц Fe3O4 (схема 2.1, стр. 62). Использование в процессе полимеризации сшивающего агента дивинилбензола позволило получить на поверхности наночастиц Fe3O4 сетчатую полимерную структуру нерастворимую в органических растворителях. Использование в качестве инициатора полимеризации окислительновосстановительной радикалобразующей пары Na2S2O3/Na2S2O8 позволяет понизить температуру процесса инициирования, ускорить процесс радикальную полимеризацию и увеличить выход продукта. Na 2 S 2 O 8 + S 2 O 3 2 - → 2NaSO 4 • + S 2 O 3 2 В результате предварительных исследований электрохимических свойств синтезированных нанокомпозитных частиц было установлено, что, образцы, модифицированные хинальдином (I b, II b) и хиноксалином (I c, II c), не проявляют электроактивные свойства. Поэтому в результате в качестве модифицирующего агента использовали только хинолин (образцы I a и II a). Для образцов I a, II микроскопические исследования. a были проведены спектроскопические и 74 Спектроскопические исследования Для всех синтезированных поливинилбензилхлорида, образцов НК модифицированных с покрытием хинолином на основе (Fe3O4-ПВБХ) зарегистрированы ИК - спектры. В приведенном для примера на рисунке 3.1 спектре образца IIa, выделены следующие характеристические полосы: 2920,1 см 1 – валентные колебания Сsp3-H, 1444,2 - 1605 см-1 – валентные колебания C=C связей бензольного кольца, 1130,2 см-1 – валентные колебания -С-O- группы, что подтверждает химическую связь олеиновой кислоты с Fe3O4, 554,7 см-1 – полоса поглощения магнетита, перекрывается с полосой валентных колебаний –С-Сl. Рисунок 3.1 – ИК-спектр нанокомпозитных частиц Fe3O4-ХПВБХ (образец II а). 75 Микроскопические исследования На рисунке 3.2 представлены электронные микрофотографии нанокомпозитов (образцы Iа и IIа). а) б) в) Рисунок 3.2 – Микрофотографии нанокомпозитных частиц Fe3O4-ХПВБХ: а) m НЧ магнетита/mвинилбензилхлорида =3:10 (Образец I а); б) m НЧ магнетита/ mвинилбензилхлорида =1:10 (Образец II а); в) Образец IIа, дифракционная картина кристаллической решетки магнетитного ядра НК (микроскоп JEM 1400 (Jeol, Япония)). Наночастицы обоих образцов представлены сферическими образованиями, агрегированными в более крупные структуры. Темные области на микрофотографиях – наночастицы магнетита, при большем увеличении видна характерная для кристаллической структуры решетка (Рисунок 3.2 в), которая подтверждена результатами РФА. Светлое «гало» - полимерное покрытие, которое при увеличении не дает характерной картины кристаллической решетки. 76 На микрофотографии образца Iа на рисунке 3.2 а, видно оптически менее плотное «гало» (полимерное покрытие) вокруг более темного центра, соответствующего наночастицам магнетита. Размер нанокомпозитных частиц составляет примерно 20-40 нм, однако покрытие неравномерное, присутствует в виде отдельных включений, толщиной от 5 до 20 нм. По-видимому, в этом случае, количества мономера было недостаточно для равномерного покрытия наночастиц. Об этом же свидетельствовало отсутствие изменения цвета образца после синтеза. На микрофотографии образца II а (Рисунок 3.2 б) с исходным соотношением компонентов m НЧ магнетита/mвинилбензилхлорида =1:10, видно что оптически более светлые области вокруг темных центров расположены равномернее. Толщина покрытия порядка 7-10 нм. Для образца II а получено распределение по размерам композитных наночастиц. Максимум распределения приходится на 20 нм при узком разбросе величин вокруг этого максимума (Рисунок 3.3). Рисунок 3.3 – Распределение по размерам нанокомпозитных частиц (образец II а) Fe3O4-ХПВБХ (m НЧ магнетита/mвинилбензилхлорида =1:10). Просвечивающий электронный микроскоп JEM-1400 (Jeol, Япония). Таким образом, по результатам микроскопических исследований, был сделан вывод, что соотношение массовое соотношение наночастиц магнетита и мономера винилбензилхлорида 1:10 оптимально для получения нанокомпозитов с равномерным покрытием (образец II a). 77 3.2 Нанокомпозиты с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола (Fe3O4-ПП) Полимерные нанокомпозиты, включающие в качестве электроактивного полимерного покрытия – полипиррол синтезировали методом полимеризации insitu (Схема 2.5, глава 2.3.3, стр. 65). Спектроскопические исследования Для всех синтезированных образцов нанокомпозитов Fe3O4-ПП зарегистрированы ИК - спектры. В приведенном для примера на рисунке 3.4 спектре образца VIII, выделены следующие основные характеристические полосы: 3389 см-1 – валентные колебания связи NH, 1574 см-1 – скелетные колебания пятичленного цикла, 1309-1218 см-1 – валентные колебания связей С=С, 571 см-1 – полоса поглощения Fe3O4. Рисунок 3.4 – ИК-спектр нанокомпозитных частиц Fe3O4-ПП. 78 Микроскопические исследования Для образцов, синтезированных при различных массовых соотношениях наночастиц Fe3O4 /пиррол и различном объеме дисперсионной среды, были получены электронно-микроскопические микрофотографии (Рисунок 3.5). Нанокомпозиты Fe3O4-ПП всех составов представлены сферическими образованиями, на большинстве микрофотографий агрегированными в более крупные структуры. Темные области на микрофотографиях – наночастицы магнетита, при большем увеличении видна характерная для кристаллической структуры решетка, которая подтверждена результатами РФА. Светлое «гало», которое наблюдается не для всех образцов, - полимерное покрытие, которое при увеличении не дает такой характерной картины кристаллической решетки. а) б) в) г) Рисунок 3.5 – Микрофотографии НК Fe3O4-ПП: a)образец III (m (НЧ Fe3O4) / mпиррола = 2:1); б) образец IV (m (НЧ Fe3O4) / m пиррола = 3:2); в) образец V (m (НЧ Fe3O4) / m пиррола = 1:1); г) образец VI (m (НЧ Fe3O4) / m пиррола = 4:5) (просвечивающий электронный микроскоп JEM 1400 (Jeol, Япония)). 79 На электронной микрофотографии образца III (Рисунок 3.5а) видно, что наблюдаемый размер частиц, равно как и отсутствие характерного, оптически более светлого, по отношению к наночастицам Fe3O4 «гало», свидетельствуют об отсутствии полимерной оболочки на наночастицах магнетита. Размер частиц порядка 5 – 10 нм (практически равный размеру наночастиц магнетита) также свидетельствует об этом. Таким образом, при двукратном массовом избытке наночастиц, относительно количества мономера, покрытия не происходило. На микрофотографии образца IV (Рисунок 3.5 б) вокруг оптически темных наночастиц магнетита видна более светлая полимерная оболочка. Размер нанокомпозитных частиц составляет порядка 15-20 нм. Однако, также видно, что покрытие неравномерное. Толщина сильно варьируется от 2 до 10 нм. На микрофотографии образца V (Рисунок 3.5в) видно, что полимерная оболочка более равномерная. Размер нанокомпозитных частиц порядка 30-40 нм. Толщина полимерного покрытия порядка 10 - 15 нм. На микрофотографии образца VI, полученного при массовом соотношении НЧ Fe3O4 и пиррола 4:5, (Рисунок 3.5г) видно, что помимо увеличения размера частиц нанокомпозита до порядка 50-70 нм, произошел процесс слияния наночастиц на стадии образовании покрытия. Для образцов НК, полученных в разном объеме дисперсионной среды, также получены микрофотографии (Рисунок 3.6.). 80 а) б) в) Рисунок 3.6 – Микрофотографии НК Fe3O4-ПП (m (НЧ Fe3O4) / mпиррола = 1:1): а) образец VII; б) образец VIII; в) образец IX (просвечивающий электронный микроскоп JEM 1400 (Jeol, Япония)). Как видно на микрофотографии образца VII (Рисунок 3.6 а), нанокомпозитные частицы имеют размеры порядка 20 нм, но достаточно сильно агрегированы. Данный факт, по-видимому, свидетельствует о недостаточном разбавлении (недостатке дисперсионной среды) при проведении реакции. Толщина покрытия порядка 5-7 нм 81 Образец VIII представлен сферическими композитами, каждый из которых состоит из нескольких электронно-плотных наночастиц магнетита и «полупрозрачной» оболочки полипиррола, имеющей низкую электронную плотность. На микрофотографии образца VIII (Рисунок 3.6 б) видно, что частицы образца имеют размер порядка 150-180 нм, равномерное покрытие и низкую степень агрегации. Толщина покрытия порядка 60-80 нм. На микрофотографии образца IX (Рисунок 3.6 в), характерного для полимерного покрытия наночастиц «гало» не наблюдается. Размер НК порядка 10-20 нм. По-видимому, разбавление реакционной смеси было избыточным, и наночастицы магнетита не покрывались полипирролом. Для образца VIII, было рассчитано распределение по размерам НК (Рисунок 3.7). Максимум распределения по размерам нанокомпозитных частиц приходится на 180 нм при узком разбросе величин вокруг этого максимума. Рисунок 3.7 – Распределение по размерам частиц НК Fe3O4-ПП (образец VIII). 82 3.3 Нанокомпозиты с ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием (Fe3O4-ФЦSiO2) Полимерные нанокомпозиты, включающие в качестве электроактивного полимерного покрытия – оксид кремния, модифицированный ферроценом получали с использованием метода Штобера (Схема 2.6, глава 2.3.4, стр. 66). Данный метод позволяет путем регулирования количества вводимого в реакционную смесь алкоксисилана получать требуемую толщину покрытия на поверхности наночастиц магнетита. Последующая модификация производным ферроцена придает нанокомпозитным частицам электроактивность. Спектроскопические характеристики Наличие оксидкремниевого покрытия на Fe3O4, подтверждали данными ИКспектроскопии. На рисунке 3.8 приведен ИК-спектр образца X, на котором выделены следующие характеристические полосы: ν, см-1: 3423 (Si-OH), 1617 (=NH), 1066-1119 (Si-O-C) и циклопентадиенильное кольца молекулы ферроцена, 3500 3000 2500 2000 Wavenumber cm-1 1500 1000 444.14 404.16 635.58 585.23 564.30 1119.98 1066.41 1507.80 1473.39 1457.88 1418.72 1315.76 1617.35 2363.18 2923.92 2852.04 3423.47 55 60 Transmittance [%] 65 70 75 635, 578 см-1 (Fe3O4). 500 Рисунок 3.8 – ИК-спектр НК Fe3O4-ФЦSiO2. C:\IR-spec\TOS\2014\09\11.09.14\MNN-45.0 MNN-45 Instrument type and / or accessory Page 1/1 06/06/2003 83 Микроскопические исследования На рисунке 3.9 представлены электронные микрофотографии образца X. Нанокомпозит с оксид кремниевым покрытием представлен сферическими образованиями размером 15-25 нм с оптически более темным ядром магнетита (кристаллическая структура решетки подтверждена результатами РФА), агрегированными в более крупные структуры. Светлое «гало» - полимерное покрытие на микрофотографии при увеличении не дает характерной картины. Толщина покрытия составляет порядка 5 нм. Рисунок 3.9 – Микрофотография НК Fe3O4-ФЦSiO2. Образец X (просвечивающий электронный микроскоп JEM-1400 (Jeol, Япония). Максимум распределения композитных наночастиц образца X приходится на 20 нм при узком разбросе величин вокруг этого максимума (Рисунок 3.10). 84 Рисунок 3.10 – Распределение по размерам частиц НК Fe3O4-ФЦSiO2 (образец X). 3.4 Определение динамики изменения размеров агломератов нанокомпозитных частиц в водных суспензиях Агрегативная устойчивость нанокомпозитных частиц диспергированных в воде является одним их ключевых факторов при подборе оптимальной концентрации рабочей суспензии для использования в иммуноанализе. Суспензия НК частиц в воде является коллоидной системой. Будучи термодинамически неустойчивыми, коллоидные системы под воздействием различных факторов могут разрушаться. Повышение концентрации частиц приводит к потере устойчивости системы за счет коагуляции и последующей седиментации образовавшихся агрегатов [180]. Для изучения использовали метод кинетики процесса визуального агрегации наблюдения и синтезированных метод НК динамического светорассеяния. Методом визуального наблюдения провели выбор устойчивой системы в серии суспензий нанокомпозитных частиц с разными концентрациями. Для исследования методом визуального наблюдения были приготовлены суспензии НК в воде. В таблице 3.1 представлены результаты наблюдений 85 процессов агрегации для суспензий трех типов нанокомпозитных частиц после обработки ультразвуком в течение 1 мин. Таблица 3.1 – Исследование агрегации нанокомпозитных частиц методом визуального наблюдения. Концентрация, г/л 0.05 0.125 0.25 0.5 Время, мин 10 20 40 60 300 10 20 40 60 300 10 20 40 60 300 10 20 40 60 300 Наличие визуально видимых агрегатов Fe3O4-ПП Fe3O4-ХПВБХ Fe3O4-ФЦSiO2 + + + + + + + + + + + + + + По результатам наблюдений выбраны устойчивые в течение как минимум 1 часа суспензии с концентрацией 0.25 г/л, для которых были проведены более точные измерения методом динамического светорассеяния на универсальном анализаторе суспензий Brookhaven ZetaPlus. Перед измерением каждая суспензия, так же как и в случае метода визуального наблюдения обрабатывалась ультразвуком в течение 1 мин. Динамика изменения средневзвешенного размера агрегатов в суспензии во времени приведена в таблице 3.2. 86 Таблица 3.2 – Динамика изменения средневзвешенного размера агрегатов в суспензиях нанокомпозитных частиц (СНК=0.25 г/л). Момент измерения Fe3O4-ПП Исходный образец (без УЗ обработки) 10 сек после УЗ обработки 5 мин после УЗ обработки 30 мин после УЗ обработки 1 час после УЗ обработки 12 часов после УЗ обработки Средневзвешенный размер агрегата, нм Fe3O4-ХПВБХ Fe3O4-ФЦSiO2 500 102.8 106.3 320.5 40.6 55.2 350.7 42.5 56.7 365.2 41.7 54.3 355.2 41.5 55.6 357.4 44.0 57.4 Данные, полученные методом динамического рассеяния света, показывают, что в изучаемой суспензии присутствуют агломераты. По данным таблицы 3.2 видно, что УЗ обработка эффективно диспергирует агломераты. После УЗ обработки суспензия остается стабильной как минимум в течение 12ч, т.к. регистрируемый средневзвешенный размер частиц (агрегатов) в суспензии практически не изменяется. Отличие в результатах измерения размера частиц полученных микроскопическим методом (глава 3.3) и методом динамического светорассеяния можно связать с особенностями способа измерения. В случае микроскопического измерения определяется размер объектов (НК) жестко закрепленных на специальной сетке. Методом динамического светорассеяния регистрируется размер НК, диспергированных в воде. В такой коллоидной системе происходят флуктуационные образование, распад и перегруппировка агрегатов магнитных частиц дисперсной фазы (нанокомпозитных частиц). Таким образом, методом светорассеяния измеряется размер агрегатов, существующих в момент времени измерения. 87 3.5 Электрохимические исследования синтезированных нанокомпозитных частиц 3.5.1 Нанокомпозитные частицы с полимерным поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным хинолином Электрохимическое поведение хлорида 1-(пара-винилбензил)хинолиния На первом этапе были зарегистрированы циклические вольтамперограммы в широком диапазоне потенциалов хлорида 1-(пара-винилбензил)хинолиния в ацетонитриле (Рисунок 3.11) нанесенного на толстопленочный графитэпоксидный электрод (ТГЭ). Из рисунка 3.11 видно, что на катодной ветви вольтамперной кривой присутствует выраженный электрохимический отклик при потенциале -1.4 В. Рисунок 3.11 – ЦВА хлорида 1-(пара-винилбензил)хинолиния: фон 0.1 М р-р KNO3 в воде (1); ТГЭ с нанесенным хлоридом 1-(п-винилбензил)хинолиния (Снач = 8.84∙10-3 моль/л) (2). νрег-ии = 100 мВ/с. Процесс электрохимических превращений хинолиновой соответствующий полученному сигналу представлен на схеме 3.1. Схема 3.1 + e + N Cl- OHCl- N O Cl+ H N OH группы, 88 Аналитическим сигналом восстановления хинолиновой группы служила величина максимального тока при потенциале -1.4 В. Получена линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации хлорида 1-(пара-винилбензил)хинолиния в исходном модифицирующем растворе (2.47∙10-3; 5.3 ∙10-3; 8.87∙10-3; 1.77∙10-2; 2.47∙10-2 моль/л). I =1∙10-5× C + 2∙10-4, (Sr=16.2%, r=0.97). Электрохимическое поведение нанокомпозита Fe 3 O 4 -ХПВБХ На рисунке 3.12 приведены ЦВА, зарегистрированные с использованием ТГЭ, на рабочую поверхность которого предварительно была нанесена суспензия синтезированных нанокомпозитных частиц Fe3O4-ХПВБХ (образец II а). Рисунок 3.12 – ЦВА нанокомпозита Fe3O4 - ХПВБХ (образец II а), зарегистрированные на ТГЭ: фоновый электролит 0.1 М KNO3 (1); ТГЭ, модифицированный образцом II а (2 – 4): Снач мод = 4 мг/мл (2), Снач мод = 10 мг/мл (3), Снач мод = 14 мг/мл (4). νрег-ии = 200 мВ/с. На катодной ветви вольтамперограммы при потенциале ≈1.15 В наблюдается пик восстановления хлорида 1-(п-винилбензил)хинолиния, который расположен в той же области потенциалов, что и в случае индивидуальной соли (Рисунок 3.11). Сравнение катодных пиков на ЦВА хлорида 1-(пара-винилбензил)хинолиния и нанокомпозита, нанесенных на поверхность электрода, позволяет сделать вывод 89 о том, что процессы, протекающие на поверхности нанокомпозитного образца, соответствуют электрохимическим превращениям хинолиновой группы. Аналитическим сигналом восстановления хинолиновой группы оболочки нанокомпозита, служила величина максимального тока при потенциале -1.2 В. Получена линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации нанокомпозита в исходной модифицирующей суспензии (2; 4; 10; 14; 30 г/л). Уравнение зависимости: I = 8∙10-7 × C – 6∙10-6 (Sr = 15.6%, при n = 5, r = 0.97). 3.5.2 Нанокомпозитные частицы с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола Электрохимическое поведение полипиррола Перед электрохимическим исследованием нанокомпозитов с покрытием из полипиррола были зарегистрированы ЦВА порошка чистого полипиррола, полученного по той же схеме синтеза, что и нанокомпозит, только в отсутствие в растворе наночастиц магнетита. На рисунке 3.13 приведена ЦВА, зарегистрированная с использованием ТГЭ, на рабочую поверхность которого предварительно была нанесена суспензия порошка полипиррола. Рисунок 3.13 – ЦВА порошка полипиррола: фон 0.1 М KNO3 в воде (1); полипиррол, нанесенный на ТГЭ (2) (исходная концентрация суспензии порошка полипиррола 1.5 г/л). νрег-ии = 100 мВ/с. 90 Из рисунка видно, что на анодной ветви присутствует электрохимический отклик при потенциале 0В, а на катодной – при потенциалах -0.4В и 0.35В. Процессы электрохимических превращений полипиррола хорошо изучены [181, 182], в общем виде представлены на схеме 3.2. Схема 3.2 + H N A- N H N H + e - + A H N N H N H x Аналитическим сигналом окисления полипиррола x служила величина максимального тока при потенциале 0В. Получена линейная зависимость аналитического сигнала от концентраций полипиррола в исходной модифицирующей суспензии: 0.25; 0.75; 1.5; 3; 7 г/л. Уравнение зависимости: I = 2∙10-4×C + 7∙10-5, (Sr = 9.6%, r=0.98). Электрохимическое поведение нанокомпозита Fe 3 O 4 -ПП На рисунке 3.10 приведены ЦВА, зарегистрированные с использованием ТГЭ, на рабочую поверхность которого предварительно была нанесена суспензия синтезированных наночастиц (образец VIII) Fe3O4-ПП с полимерным покрытием на основе полипиррола. На анодной и катодной ветвях также, как и в случае полипиррола, видны электрохимические отклики при потенциалах -0.15 В и -0.5В и 0.4 В. Сравнение анодных пиков на вольтамперных кривых полипиррола (рис 3.13) и нанокомпозита с полиппиррольной оболочкой (рис 3.14), позволяет сделать вывод о том, что электрохимические процессы, регистрируемые на кривых для НК, соответствуют электропревращениям полипиррола (схема 3.2). 91 Рисунок 3.14 – ЦВА нанокомпозитных частиц Fe3O4 – ПП (образец VIII): фон 0.1 М KNO3 в воде (1); нанокомпозит Fe3O4 - ПП нанесенный на ТГЭ (2-4): Смод = 0.25 мг/мл (2), Смод = 0.75 мг/мл (3), Смод = 1.5 мг/мл (4). νрег-ии = 100 мВ/с. Аналитическим сигналом превращения полипиррольной оболочки нанокомпозита служила величина максимального тока при потенциале -0.15 В. Получена линейная зависимость величины аналитического сигнала от концентрации нанокомпозита в исходной суспензии (0.25; 0.75; 1.5; 3; 6 мг/мл). Уравнение калибровочной зависимости: I = 2∙10-4 × C – 3∙10-6 (Sr = 10.2%, r = 0.96). 3.5.3 Нанокомпозитные частицы с оксидкремниевым покрытием, модифицированным ферроценом Электрохимическое поведение (3-(ферроцениламид)пропил) триэтоксисилана На первом этапе, с использованием ТГЭ, были зарегистрированы ЦВА в широком диапазоне потенциалов (ферроцениламид)пропил)триэтоксисилана раствора хлорида (модифицирующего нанокомпозитных частиц) в ацетонитриле (Рисунок 3.15). агента (3для 92 Рисунок 3.15 – ЦВА хлорида (3-(ферроцениламид)пропил) триэтоксисилана: фон 0.1 М LiClO4 в ацетонитриле (1); (3-(ферроцениламид)пропил) триэтоксисилана в ацетонитриле (С= 7.25∙10-4 моль/л) (2). νрег-ии = 100 мВ/с. Из рисунка видно, что на катодной и анодной ветвях присутствуют выраженные электрохимические отклики при потенциалах 0.45 и 0.75 В соответственно. Процессы электропревращений ферроценовой группировки, соответствующие полученным сигналам, изучены ранее [183] и в общем виде представлены на схеме 3.3. Схема 3.3 +* Fe Fe Аналитическим сигналом окисления ферроценовой группировки служила величина максимального тока при потенциале 0.75В. Получена линейная зависимость величины аналитического сигнала от концентрации (3- (ферроцениламид)пропил)триэтоксисилана (для концентраций 1.84∙10-4; 3.66∙10-4; 5.46∙10-4; 7.25∙10-4; 2.3∙10-3 моль/л). I =2∙10-5 × C +1∙10-6 (Sr=10%, r = 098). 93 Электрохимическое поведение нанокомпозита Fe3O4-ФЦSiO2 На рисунке 3.16 приведены ЦВА, зарегистрированные с использованием ТГЭ, на рабочую поверхность которого предварительно была нанесена суспензия синтезированных наночастиц с оксидкремниевым покрытием модифицированным (3-(ферроцениламид)пропил)триэтоксисиланом (образец X). На анодной ветви также, как и в случае (3-(ферроцениламид)пропил) триэтоксисилана легко видеть выраженный электрохимический отклик при потенциале 0.55 В. Сравнение анодных пиков на ЦВА (3- (ферроцениламид)пропил)триэтоксисилана и нанокомпозита, нанесенного на поверхность электрода, позволяет сделать вывод о том, что процессы, протекающие в случае использования нанокомпозита, соответствуют электропревращению ферроценовой группы. 5 4 3 2 1 Рисунок 3.16 – ЦВА нанокомпозита Fe3O4 – ФЦSiO2 (образец X): фон 0.1 М KNO3 в воде (1); Fe3O4 – ФЦSiO2, нанесенный на ТГЭ (2-5): Смод = 0.2 мг/мл (2); Смод = 0.3 мг/мл (3); Смод = 0.45 мг/мл (4); Смод = 0.6 мг/мл (5). νрег-ии = 100 мВ/с. Аналитическим сигналом окисления ферроценовой группировки поверхности НК служила величина предельного тока при потенциале 0.55В. на 94 Получена линейная зависимость величины аналитического сигнала от концентрации нанокомпозитных частиц в исходной модифицирующей суспензии (для концентраций 0.2; 0.3, 0.45; 0.6 мг/мл). Уравнение зависимости: I = 7∙10-7 × C – 5∙10-8 (Sr = 8.3%, r = 0.98). 3.6 Выбор нанокомпозитных частиц для использования в иммуноанализе Разработаны методики синтеза нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 с полимерным покрытием на основе полипиррола; с поливинилбензилхлоридными покрытием, модифицированным хинолином; с ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием. На основе микроскопических характеристик нанокомпозитных частиц и их электрохимического поведения, для дальнейших исследований выбраны образцы: II a (Fe3O4 – ХПВБХ), VIII (Fe3O4 – ПП) и X (Fe3O4 – ФЦSiO2) и нанокомпозиты, синтезируемые в тех же условиях и при аналогичных соотношениях реагентов, что и у данных образцов. НК Fe3O4-ФЦSiO2 и Fe3O4-ХПВБХ имеют гораздо меньший размер (≈25 нм) по сравнению с Fe3O4-ПП, однако, полипиррол лучше совместим с живой тканью и клетками, что может значительным образом повлиять на результаты определения бактерий с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4-ПП. 95 ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА БЕСФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe3O4 4.1 Микроскопические исследования взаимодействия нанокомпозитных частиц с бактериальными клетками В различных литературных источниках [184, 185] приведены вероятные механизмы проникновения наночастиц в клетки. На начальном этапе происходит слияние клетки и наночастицы за счет сил Ван-дер-Ваальса, электростатического притяжения, сил поверхностного натяжения. Механизм дальнейшего проникновения наночастиц сквозь клеточную мембрану не изучен в достаточной степени. Задачей данной части работы являлось оценка скорости проникновения нанокомпозитных частиц на основе магнетита с электроактивным полимерным покрытием внутрь клеток E.coli. Для оценки скорости поглощения бактериями нанокомпозитных частиц, получены микрофотографии клеточной культуры E.coli до и после инкубирования в суспензии нанокомпозитов разных типов. Проведены эксперименты, в которых были получены микрофотографии препарата, зафиксированного по истечении 10 и 30 минут взаимодействия клеток с НК. Процедуру инкубации проводили следующим образом: 2 мл суспензии клеток E.сoli (С= 8∙109 КОЕ/мл) помещали в пластиковую пробирку, добавляли 0.25 см 3 суспензии нанокомпозитов (≈1 г/л), в 0.9% стерильном растворе NaCl (0.125 г/дм3), предварительно обработанной ультразвуком, и выдерживали при температуре Т = (37±0.1)0С. Далее проводилась консервация и подготовка препарата непосредственно к микроскопическому исследованию. На рисунках 4.1 – 4.4 представлены микрофотографии препаратов клеток E.coli до и после взаимодействия с нанокомпозитами с различными видами покрытия. 96 Рисунок 4.1 – Микрофотография ультратонкого среза клеточной культуры E.coli (микроскоп JEM 1400 Jeol, Япония). a) б) Рисунок 4.2 – Микрофотографии ультратонкого среза клеточной культуры E.coli после 10-ти (a) и 30-ти (б) минутной инкубации с нанокомпозитными частицами Fe3O4 – ХПВБХ (микроскоп JEM 1400 Jeol, Япония). 97 а) б) Рисунок 4.3 – Микрофотографии ультратонкого среза клеточной культуры E.coli после 10-ти (а) и 30-ти (б) минутной инкубации с нанокомпозитными частицами Fe3O4 – ПП (микроскоп JEM 1400 Jeol, Япония). б) a) Рисунок 4.4 – Микрофотографии ультратонкого среза клеточной культуры E.coli после 10-ти (a) и 30-ти (б) минутной инкубации с нанокомпозитными частицами Fe3O4 – ФЦSiO2 (микроскоп JEM 1400 Jeol, Япония). На микрофотографиях нанокомпозитные частицы всех трех типов представлены темными скоплениями сферических образований (на рисунках 4.24.4 выделены стрелками). 98 На микрофотографиях среза бактериальных клеток после инкубации клеток E.coli с НК Fe3O4 – ХПВБХ (Рисунок 4.2) наблюдается, что после 10-ти минутной инкубации нанокомпозитные частицы практически не адсорбируются на клетке (Рисунок 4.2 а). После 30-ти минутной инкубации (Рисунок 4.2 б) наблюдается адсорбция единичных наночастиц на клеточной мембране. На микрофотографиях среза бактериальных клеток после инкубации клеток E.coli с нанокомпозитными частицами Fe3O4 – ПП (Рисунок 4.3) видно, что после 10-ти минутной инкубации нанокомпозитные частицы адсорбировались на мембране клетки (Рисунок 4.3 а). После 30-ти минутной инкубации (Рисунок 4.3 б) наблюдается глубокое проникновение частиц в цитоплазму клетку. Известно, что полипиррол обладает хорошей совместимостью с живыми клетками различных типов, что обуславливает его быстрое и глубокое проникновения через мембрану бактерии [186]. На микрофотографиях среза бактериальных клеток после инкубации клеток E.coli с нанокомпозитами Fe3O4 – ФЦSiO2 (Рисунок 4.4) видно, что после 10-ти минутной инкубации НК адсорбируются на клетке и частично проникают в клеточную мембрану (Рисунок 4.4 а). После 30-ти минутной инкубации (Рисунок 4.4 б) видно проникновение сквозь мембрану в цитоплазму, но (при одном и том же времени инкубации) не столь глубокое, по сравнению с НК покрытыми полипирролом. Проведенные исследования показали, что степень поглощения зависит от природы покрытия нанокомпозитных частиц. Кроме того, с увеличением времени инкубации от 10 до 30 минут количество нанокомпозитных частиц, поглощенных клетками, возрастает. После прохождения клеточной стенки (иногда с её повреждением) частицы локализуются в объеме цитоплазмы клетки или во внутреннем примембранном пространстве. 99 4.2 Процедура иммуноанализа Проведены исследования возможности использования магнитных нанокомпозитов на основе Fe3O4 в качестве электрохимической «метки» для определения бактерий с использованием предложенной процедуры иммуноанализа (Рисунок 4.5): на первой стадии на поверхность ТГЭ наносили 10 мкл сыворотки морской свинки, содержащей антитела к бактерии E.сoli и высушивали при температуре Т = (37±0.1)0С в течение 15 минут; на второй стадии в пластиковую пробирку объемом 2 см3 вносили 0.5 см3 анализируемой суспензии, содержащей микроорганизм бактерии E.сoli, добавляли 0.25 см3 суспензии НК в 0.9% стерильном растворе NaCl (0.25 г/дм3) и инкубировали в течение 30 мин при Т = (37±0.1)0С. Затем, поместив пробирку в магнитный штатив, отделяли несвязавшиеся с бактериями НК. на третьей стадии помещали ТГЭ с иммобилизированными антителами в пробирку, содержащую конъюгат нанокомпозитных частиц с микроорганизмами и инкубировали в течение 30 мин при Т=(37±0.1) 0С. На этом этапе образование иммунокомплекса вели в условиях магнитного поля, для этого пробирку с ТГЭ помещали в магнитный штатив. затем ТГЭ с образовавшимся иммунокомплексом помещали в трехэлектродную электрохимическую ячейку (в качестве рабочего электрода) и выполняли регистрацию циклической вольтамперограммы на анализаторе. В качестве фонового электролита использовали 0.1 М водный раствор нитрата калия. 100 t = 30 мин T=37 oC t = 30 мин T=37 oC Рисунок 4.5 – Схема иммуноанализа для определения бактерий. В качестве холостого использовали опыт, когда ТГЭ с иммобилизированными антителами инкубировали в растворе, не содержащем бактерий E.coli. Принимая во иммунокомплекса внимание «антитело предлагаемый – бактерия, ход меченая анализа: образование нанокомпозитом» на поверхности ТГЭ - можно ожидать, что ток восстановления/окисления электроактивной полимерной оболочки нанокомпозита даст информацию о наличии и количестве бактерий, локализованных на поверхности трансдьюсера. В случае раствора содержащего бактерии E. сoli на вольтамперограмме наблюдались сигналы соответствующие процессам восстановления/окисления электроактивной полимерной оболочки нанокомпозита в составе иммунокомплекса. В случае холостого опыта в исследуемом интервале потенциалов ток восстановления/окисления на кривой пробы не появлялся, т.к. образование иммунокомплекса отсутствовало (соответствующие рисунки для каждого типа нанокомпозитов приведены далее в главах 4.4 - 4.6). 101 В процедуру иммуноанализа включили магнитное концентрирование, т.к. ранее было показано [187], что применение магнитного поля на стадии образования иммунокомплекса увеличивает скорость подвода бактерий, меченных магнитными нанокомпозитами, к антителам на поверхности ТГЭ. Таким образом ускоряется процесс образования иммунокомплекса и сокращается время анализа, а также увеличивается чувствительность предлагаемого метода. 4.3 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с полимерным покрытием на основе поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином Несмотря на то, что для НК Fe3O4-ХПВБХ был зарегистрирован аналитический электрохимический отклик, в ходе проведения процедуры иммуноанализа с данным типом НК было установлено, что при длительном нахождении его (более 10 мин) в водных растворах происходит потеря электроактивности НК, по-видимому, вследствие взаимодействия с водой и протеканием следующего процесса (схема 4.1): Схема 4.1 CH2Cl +e N + HOH N Cl- Переход нанокомпозита в неактивную форму происходит фактически скачкообразно после 5 минут присутствия в воде, либо в водных растворах электролитов (NaCl, KNO3). Так как дальнейшее использование нанокомпозита в иммуноанализе взаимодействие предполагает с водными его достаточно растворами, длительное становится (≈30 мин) очевидным нецелесообразность дальнейшей работы с образцом II а в частности, и со всей группой нанокомпозитов Fe3O4-ХПВБХ. 102 4.4 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным полипиррольным покрытием На этом этапе работе регистрировали циклические вольтамперограммы после проведения процедуры иммуноанализа по описанной выше схеме с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4-ПП. На вольтамперной кривой (Рисунок 4.6) зарегистрированной после инкубирования (согласно процедуре иммуноанализа) ТГЭ, модифицированного соответствующими антителами в суспензии, содержащей бактерии E.coli (кривая 3 на рисунке 4.6) видно увеличение значений величин анодных токов при потенциале -0.25 В по сравнению с фоновой кривой 3. При потенциале 0.8 В на анодной ветви вольтамперограммы (кривая 1, Рисунок 4.6) наблюдали сигнал, соответствующий, по-видимому, процессам окисления клеток бактерий. Рисунок 4.6 – ЦВА, зарегистрированные после проведения процедуры иммуноанализа в суспензиях содержащих (СE.coli = 6.4∙107 КОЕ/мл) (1) и не содержащих (2) бактерии E.coli меченые НК Fe3O4-ПП; фон 0.1 М KNO3 (3). ν = 250 мВ/с. Как видно из вольтамперограммы, сигналы плохо выражены, несмотря на большую исходную концентрацию бактерий E.coli (6.4∙107 КОЕ/мл), что не позволит применить их в качестве сигналообразующей метки в дальнейших исследованиях. Невыраженность сигнала может являться следствием быстрого и 103 глубокого проникновения НК Fe3O4-ПП внутрь бактериальной клетки (что согласуется с данными полученными микроскопическим методом (глава 4.1, стр. 97)), и, как следствие, экранированием электроактивного соединения на поверхности частиц клеточным веществом. 4.5 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием На данном этапе регистрировали циклические вольтамперограммы после проведения процедуры иммуноанализа по описанной выше схеме с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4-ФЦSiO2 (Рисунок 4.7.). Рисунок 4.7 – ЦВА зарегистрированные после проведения процедуры иммуноанализа в суспензиях содержащих (концентрация E.coli 2.3∙106 КОЕ/мл) (1) и не содержащих (2) бактерии E.coli меченые НК Fe3O4-ФЦSiO2; фон 0.1 М KNO3 (3). ν = 250 мВ/с. Как видно из рисунка 4.7, на вольтамперограмме наблюдается хорошо выраженный отклик при потенциале ≈ 0.55 В, выбранный в качестве аналитического сигнала. 104 Исследование влияния на аналитический сигнал времени инкубации нанокомпозитных частиц Fe3O4 c ферроценмодифицированной оксидкремниевой оболочкой с бактериями E.сoli Для выбора оптимального времени получения конъюгата нанокомпозитов этого типа с микроорганизмами была получена зависимость величины аналитического сигнала нанокомпозитных частиц в составе иммунокомплекса от времени инкубации нанокомпозитных частиц с бактериями E.coli (Рисунок 4.8). Рисунок 4.8 – Зависимость величины аналитического сигнала, полученного при анализе суспензии конъюгатов бактерий E.coli с нанокомпозитными частицами Fe3O4-ФЦSiO2 от времени инкубации. С E.coli = 2.3∙106 КОЕ/мл. n=5. Из рисунка 4.8 видно, что величина сигнала возрастает в первые 30 мин образования конъюгата нанокомпозитных частиц с микроорганизмами, а затем уменьшается. По-видимому, увеличение сигнала связано с увеличением количества адсорбированных на бактериальных клетках нанокомпозитных частиц, что также подтверждается микрофотографиями бактериальных клеток после их инкубации с данным типом нанокомпозита (глава 4.1, стр. 97). После 30 мин величина сигнала выходит на постоянное значение. Поэтому в дальнейших опытах образование конъюгата бактерий с нанокомпозитными частицами проводили в течение 30 мин. 105 Исследование влияния на аналитический сигнал времени образования иммунокомплекса между меченными нанокомпозитом бактериями E.сoli и антителами к E.сoli иммобилизированными на поверхности ТГЭ Для выбора оптимального времени образования иммунокомплекса получена зависимость величины аналитического сигнала от времени формирования иммунокомплекса между мечеными НК бактериями E.сoli и антителами к E.сoli иммобилизированными на рабочей поверхности ТГЭ (Рисунок 4.9). Рисунок 4.9 – Зависимость величины аналитического сигнала, зарегистрированного после проведения процедуры иммуноанализа с использованием НК Fe3O4-ФЦSiO2 от времени формирования иммунокомплекса «антитело - меченая бактерия» на поверхности ТГЭ. С E.coli = 2.3∙106 КОЕ/мл. n=5. Кривая выходит на насыщение при времени образования иммунокомплекса, более 30 мин, что, по-видимому, связано с максимальным заполнением мечеными бактериями рабочей поверхности ТГЭ. В дальнейших опытах формирование иммунокомплекса проводили в течение 30 мин. Полученная в оптимальных условиях градуировочная зависимость величины аналитического сигнала от десятичного логарифма концентрации бактерий E.coli в исходной суспензии описывается следующим уравнением: I (мкА) = 0.0732±0.0013×log CE.coli - 0.203±0.007 в интервале концентраций E.coli 2.3∙102 – 2.3∙107 КОЕ/мл (r = 0.98). Предел обнаружения 1.2 ∙101 КОЕ/мл. По результатам оценки результатов микроскопических (глава 4.1, стр. 95) и электрохимических исследований (главы 4.3 – 4.5, стр. 101) взаимодействия 106 бактериальных клеток с нанокомпозитными частицами был проведен выбор нанокомпозита для применения его в методе электрохимического иммуноанализа. Как видно из микрофотографий (Глава 4.1, рисунок 4.3, стр. 97) НК Fe3O4-ПП достаточно быстро и глубоко проникают в клетку, в свою очередь, НК Fe3O4ФЦSiO2 после 30-ти минутной инкубации остаются в примембранном пространстве клетки. По всей видимости, в случае НК Fe3O4-ПП происходит сильное экранирование электроактивного соединения на их поверхности клеточным веществом, что приводит к невыраженности сигнала на ЦВА, зарегистрированной после проведения процедуры иммуноанализа (Рисунок 4.6). Сигнал на ЦВА в случае использования НК Fe3O4-ФЦSiO2 (Рисунок 4.7), несмотря на меньшую абсолютную величину, более выражен. Поэтому для реализации метода иммуноанализа был выбран НК Fe3O4-ФЦSiO2. В таблице 4.2 приведены аналитические сигналы, зарегистрированные в результате определения разработанным методом бактерии E.coli с использованием НК Fe3O4-ФЦSiO2. Величины относительного стандартного отклонения не превышают 15%. Таким образом, предложенный обеспечивает воспроизводимые результаты измерения бактерий метод E.coli в диапазоне концентраций (2.3∙102 - 2.3∙107) КОЕ/мл. Таблица 4.2 – Аналитические характеристики метода определения бактерии E.coli, полученные в разные дни (n = 5, P = 0.95) Концентрация E.coli, КОЕ/мл 2.3·10 2 2.3·103 2.3·104 2.3·105 2.3·106 2.3·107 Аналитический сигнал I±∆I, мкА 1 день 0.0273±0.0100 14.79 0.0533±0.0190 14.23 0.1237±0.0314 10.24 0.1707±0.0397 9.38 0.2393±0.0448 7.54 0.3613±0.0658 7.33 Sr, % 2 день 0.0271±0.0105 14.89 0.0538±0.0186 14.11 0.1185±0.0310 10.11 0.1910±0.0385 9.31 0.2480±0.0480 8.62 0.3820±0.0621 6.35 3 день 0.0270±0.0106 14.95 0.0530±0.0194 14.5 0.1232±0.0320 10.47 0.1803±0.0391 9.70 0.2289±0.0491 9.1 0.3508±0.0661 7.55 107 4.6. Определение правильности, специфичности и селективности метода электрохимического иммуноанализа С целью определения электрохимического правильности иммуноанализа ферроценмодифицированным с разрабатываемого использованием оксидкремниевым покрытием метода НК с проведен сравнительный анализ модельных суспензий, содержащих микроорганизм E. coli ATCC 25922 выполненными в независимой лаборатории методами ИФА и бактериального посева и разработанным электрохимическим методом. Для этого была приготовлена серия суспензий клеток E.coli в стерильном физиологическом растворе с концентрациями 5∙106, 5∙105, 5∙104, 5∙103, 5∙102, 5∙10 КОЕ/мл. Затем каждый образец делили на три равных части и каждую анализировали одним из методов. Эксперимент проводили в трех параллельных опытах. В таблице 4.3 представлены результаты сравнительного анализа. Таблица 4.3 – Сравнительные результаты тестирования модельных проб, содержащих E.coli, с помощью различных методов (n = 3, P = 0.95) Концентрация E.coli, КОЕ/мл 5∙106 ИФА*, КОЕ/мл 4.70 ∙106 Бактериальный посев*, КОЕ/мл 5∙106 Электрохимический метод, КОЕ/мл (4.6±0.3) ∙106 5∙105 5.32 ∙105 5∙105 (4.9±0.4) ∙105 5∙104 4.65 ∙104 5∙104 (4.7±0.4) ∙104 5∙103 5.65 ∙103 5∙103 (5.2±0.5) ∙103 5∙102 5.20∙102 - (4.8±0.6) ∙102 5∙101 - - - *проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск). Из полученных результатов видно, что минимальная концентрация для бактерии E.coli, определяемая электрохимическим методом, составляет ≈5∙102 КОЕ/мл, что совпадает с возможностями ИФА анализа. Также были проведены исследования специфичности разрабатываемого метода. Для этого анализ проводили по разработанной схеме: 108 ТГЭ с иммобилизованными антителами к бактерии E. сoli, инкубировали в двух суспензиях, одна из которых содержала микроорганизмы 5∙104 КОЕ/ мл E. coli ATCC 25922, а другая 5∙104 КОЕ/ мл Salmonella infantis В-1281. При инкубации в суспензии, не содержащей E.Coli, откликов не наблюдалось (Рисунок 4.10), поскольку иммунокомплекс на поверхности ТГЭ не формировался, что показывает отсутствие влияния неспецифических взаимодействий и адсорбции на результат анализа. Рисунок 4.10 – Вольтамперные кривые зарегистрированные после проведения процедуры иммуноанализа в суспензиях содержащих бактерии E. coli ATCC 25922 (1); бактерии Salmonella infantis В-1281 (2); фон 0.1 М KNO3 (3). С целью определения селективности электрохимического метода иммуноанализа были проанализированы модельные системы, в которых помимо бактерий E.сoli (СE.coli ≈7∙104 КОЕ/мл) содержались бактерии других видов (Сбакт ≈1∙104 КОЕ/мл): Salmonella infantis В-1281, Micrococcus flavus В-1132, Bacillus licheniformis В-299 (Таблица 4.4). Каждая проба была разделена на три части и проанализирована методом разработанного электрохимического иммуноанализа и референсными методами: ИФА и посева на селективную бактериальную среду. 109 Таблица 4.4 – Сравнительные результаты определения концентрации микроорганизмов E. coli в смесях с бактерией другого вида (n = 3, P = 0.95) Состав смеси С E.coli = 7∙104 КОЕ/мл C 2 компонента смеси ≈104 КОЕ/мл Escherichia coli ATCC 25922 + Salmonella infantis В-1281 Escherichia coli ATCC 25922 + Micrococcus flavus В-1132 Escherichia coli ATCC 25922 + Bacillus licheniformis В-299 ИФА* 8∙104 ∙ Содержание бактерии E.сoli, КОЕ/мл Метод бактериального Электрохимический посева* метод ≈7∙104 (7.5±0.3)∙104 6∙104∙ ≈6∙104 (6.6±0.3)∙104∙ 6∙104 ≈8∙104 (7.1±0.5)∙104 *проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск). Из таблицы видно, что результаты определения содержания E.coli в модельных смесях с использованием разработанного иммуносенсора удовлетворительно согласуются с результатами определения методом ИФА и методом посева. Разработанный электрохимический метод по чувствительности не уступает ИФА, но не требует применения дорого оборудования и неустойчивых реагентов. 4.7 Анализ реальных объектов Для определения применимости разработанного метода к анализу реальных объектов, три образца были проанализированы с использованием метода электрохимического иммуноанализа, метода бактериального посева и ИФА. Отбор образцов воздуха и воды из природного и искусственных водоемов был произведен в соответствии с ГОСТ [188]. Процедура иммуноанализа была аналогичной вышеописанной для модельных систем. Пробоподготовки образцов не производилось. Таблица 4.5 иллюстрирует сравнительные результаты определения концентраций микроорганизмов E.coli в пробах. 110 Таблица 4.5 – Сравнительные результаты определения концентрации микроорганизмов E. coli в пробах воды и воздуха (n = 3, P = 0.95) Проба Проба воздуха Вода из природного водоема (р.п. Кольцово, Новосибирская область) Дата пробоотбора 30.07.2014. Вода из искусственного водоема (г. Новосибирск) Дата пробоотбора 30.07.2014. Результат определения бактерии E.сoli, КОЕ/мл ИФА Метод Электрохимический бактериального метод посева Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено 1∙103 ≈103 (9.4±0.3) ∙102 5∙102 (5.2±0.3) ∙102 - *проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Новосибирск). Полученные результаты электрохимического анализа образцов показали наличие бактерий E.coli в пробах воды из водоемов. Результаты удовлетворительно согласуются с результатами, полученными с использованием метода бактериального посева и ИФА. Методом бактериального посева (Рисунок 4.12) установлено, что пробах воды, помимо E.coli, содержатся другие виды бактерий, титр сапрофитных микроорганизмов, выявленных при высеве воды из природного водоема на рыбно-пептонный агар (РПА, 37 °С, 24 часа роста) составляет в среднем 1.1-1.5∙103 кл/мл, титр для воды из искусственного водоема 6.1-2.3∙102 кл/мл. В образцах преобладают спорообразующие бактерии, неспороносные наблюдаются в количестве 35 клеток/мл. Таким образом, установлена селективность электрохимического метода анализа при анализе реальных образцов при его удовлетворительной чувствительности. На рисунке 4.11 представлены фотографии чашек Петри с высеянными пробами воды из природного водоема. 111 б) а) Рисунок 4.11 – Фотографии бактерий и грибов, содержащихся в пробе воды из природного водоема, после высева на питательную среду агар: а) 2-е суток после посева; б) 3-е суток после посева. Результаты электрохимического иммуноанализа показали отсутствие бактерий E.coli в пробе воздуха. Результаты согласуются с результатами, полученными с использованием метода бактериального посева и ИФА. Приведенные данные подтверждают корректность использования для определения бактерий E.coli в реальных объектах разработанного электрохимического метода. Использование магнитных нанокомпозитных частиц в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе обеспечивает предел обнаружения ≈102 КОЕ/мл. 112 ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С НАНОКОМПОЗИТНЫМИ ЧАСТИЦАМИ С ОКСИДКРЕМНИЕВЫМ ПОКРЫТИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ На основе работ [187] был разработан подход к определению антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори) с использованием синтезированных конъюгатов антител с нанокомпозитными частицами Fe3O4-модифицированный оксид кремния. 5.1 Получение конъюгатов антител с НК на основе Fe3O4 с оксидкремниевым покрытием (Fe3O4 – АТSiO2) Нанокомпозитные частицы получали, покрывая наночастицы Fe3O4 оксидом кремния [189]. 0.5 г наночастиц Fe3O4 диспергировали в смеси 40 мл 95% этанола и 10 мл H2O. Добавляли 0.5 мл Si(OEt)4 (ТЭОС) и 1 мл 25% раствора NH3∙H2O. Кипятили при перемешивании в течение 10 часов. Удаляли непрореагировавший ТЭОС трехкратной нанокомпозита. промывкой Затем этанолом покрытые оксидом с магнитным кремния отделением наночастицы вновь диспергировали в 50 мл 95% этанола, обрабатывали УЗ в течение 1 мин, добавляли 1 мл аминопропилтриэтоксисилана (АПТЭОС), после чего кипятили 10 часов при перемешивании. Непрореагировавший АПТЭОС удаляли трехкратной промывкой этанолом с магнитным отделением нанокомпозита при помощи постоянного магнита с величиной поля 37.40∙104 А/м. (Схема 5.1). Схема 5.1 EtO Si O Fe3O4 EtO Si OEt H2N O Si OEt + Si O NH4OH O EtOH OEt Si Si O Si OEt + O Si Si EtO OEt EtO Si OEt C3H6 NH2 NH4OH Si O O Si O O Si EtOH OEt O Si Si O Si NH2 113 По известной методике [190] синтезировали конъюгаты антител и НК с оксидкремниевым покрытием (Схема 5.2). Нанокомпозит диспергировали в 50 мл H2O. Отбирали мерной пипеткой 10 мл суспензии и обрабатывали УЗ в течение 1 мин. Добавляли 1 мл 25% глутарового альдегида, затем добавляли 0.2 мг антител к вирусу кори. Перемешивали в течение 8 часов при температуре примерно 10 оС. Проводили очистку конъюгатов антитела - нанокомпозитные частицы от непрореагировавших компонентов реакционной смеси методом магнитной сепарации. Рабочую суспензию конъюгатов получали диспергируя навеску 0.005 г в 10 мл стерильного физиологического раствора. Затем обрабатывали суспензию УЗ в течение 30 секунд. Схема 5.2 H 2N Si EtO Si O O Si O O Fe3O4 H H N (CH2)3 C H H NH2 O Si N H2N + OEt Si O Si O O + Si C H2 Si EtO Si O O Si O O Si Fe3O4 O Si OEt Si NH O Si N (CH2)3 C H2 C H 114 5.2 Процедура иммуноанализа Ориентируясь на подход, предложенный авторами [191], для определения антигена вируса была разработана следующая схема иммуноанализа (Рисунок 5.1). Рисунок 5.1 Процедура иммуноанализа На рабочую зону толстопленочной графитовой подложки (ТГП) наносили 10 мкл антител IgG к вирусу кори (концентрация 1 мг/мл) и высушивали до полного испарения дисперсионной среды (стадия 1 на рисунке 5.1). Готовили растворы антигена вируса кори (NovO/96) в стерильном физиологическом растворе (концентрации 2.33∙10-1, 2.33∙10-2, 2.33∙10-3, 2.33∙10-4 мг/мл). Затем в пробирки вносили по 200 мкл раствора каждой концентрации, помещали в них ТГП с предварительно иммобилизированными IgG к вирусу кори и инкубировали при (37±0.1) 0С в течение 20 мин (стадия 2 на рисунке 5.1). После этого в каждую пробирку добавляли 200 мкл суспензии конъюгатов антител к вирусу кори с нанокомпозитными частицами. Образование 115 иммунокомплекса проводили при помощи магнитного штатива расположенного за ТГП с иммунокомплексом при (37±0.1) 0С в течение 30 мин (стадия 3 на рисунке 5.1). После промывки ТГП, с образовавшимся на поверхности «сэндвич» иммунокомплексом нанокомпозитом», «IgG – помещали антиген в вируса термостойкий – коньюгат стеклянный IgG с стакан и проводили разрушение иммунокомплекса методом кислотного разложения [187]. В результате разложения магнетитное ядро НК переходит в ионы Fe(III), концентрация которых определяется на следующей стадии. Определяли концентрацию ионов Fe(III) ИВ методом с использованием ТМГЭ [187]. Максимальный катодный ток восстановления комплексного соединения пирокатехола с ионами Fe(III), образующегося в растворе, прямо пропорционально зависит от содержания ионов Fe(III) в пробе. В холостом опыте проводили процедуру иммуноанализа по приведенной выше схеме, однако на стадии 2 (Рисунок 5.1) ТГП, модифицированный антителами инкубировали в растворе, не содержащем антиген вируса. Принимая во внимание предлагаемый ход анализа: образование «сэндвич» иммунокомплекса включающего антитело – антиген - конъюгат антител с нанокомпозитных частицами Fe3O4–SiO2 на поверхности ТГП, и последующую кислотную обработку - можно ожидать, что ток восстановления ионов Fe(III) даст информацию о наличии и количестве антигена в пробе. В случае, если в анализируемом растворе содержался искомый антиген, на вольтамперограмме наблюдали появление пика тока восстановления ионов Fe(III) (Рисунок 5.2а). В холостом опыте (проба не содержала антиген вируса кори) в указанной области потенциалов изменения фонового тока не происходило (Рисунок 5.2б), вследствие отсутствия образования иммунокомплекса. Также полученные результаты свидетельствуют об отсутствии неспецифического связывания конъюгатов вторичных антител с нанокомпозитными частицами с рабочей частью ТГП, модифицированной антителами. 116 Рисунок 5.2 – Производные вольтамперограмм Fe(III), полученные в растворах, содержащих (а) и не содержащих антиген вируса кори (б): фон - 0.1 моль/дм3 раствор СН3СООNa (рН 7.5), содержащий 5×10-4 моль/дм3 пирокатехола (1); проба (2); проба + добавка ГСО Fe(III) (3). Концентрация антигена 2.33∙10-2 мг/мл. Eнак = 0.1 В, tнак = 60 с, νрег-ии = 0.5 В/с. Изучали влияние времени проведения двух стадий инкубации на величину аналитического сигнала (Рисунок 5.2, стадии 2 и 3). На рисунке 5.3 приведена зависимость величины аналитического сигнала от времени формирования «сэндвича» между иммунокомплексом на поверхности ТГП и конъюгатом антител с нанокомпозитными частицами (стадия 3 на рисунке 5.1). Кривая выходит на насыщение при времени образования «сэндвич» иммунокомплекса, порядка 30 мин, что, по-видимому, связано с максимальным заполнением всех сайтов связывания. В связи с этим, в дальнейших исследованиях формирование «сэндвич» - иммунокомплекса проводили в течение 30 мин. 117 Рисунок 5.3 – Зависимость величины dI/dE, полученной при анализе растворов после кислотной обработки «сэндвич» - иммунокомплекса от времени его формирования. Концентрация антигена 2.33∙10-2 мг/мл. n=5. На рисунке 5.4 приведена зависимость величины аналитического сигнала от времени формирования иммунокомплекса между антигеном вируса кори и антителами иммобилизированными на поверхности ТГП (стадия 2 на рисунке 5.1). Рисунок 5.4 – Зависимость величины dI/dE, полученной при анализе растворов после кислотной обработки «сэндвич» - иммунокомплекса от времени формирования иммунокомплекса между антигеном вируса кори и антителами иммобилизированными на поверхности ТГП. Концентрация антигена 2.33∙10-2 мг/мл. n=5. 118 Кривая выходит иммунокомплекса антителами, на между что, насыщение антигеном по-видимому, в первые вируса связано с кори 20 и мин образования соответствующими максимальным заполнением поверхности ТГП. В связи с этим в дальнейших исследованиях формирование иммунокомплекса проводили в течение 20 мин. В дальнейших исследованиях вольтамперограммы регистрировали, используя выбранные условия проведения иммуноанализа. Получена линейная зависимость изменения величины аналитического сигнала от логарифма концентрации антигена вируса кори в интервале концентраций (2.33∙10-4 – 2.33) мг/мл в соответствии со следующим уравнением: dI/dE [мкА/В] = 2.441±0.002×log Cантигена - 11.63±0.05 (r = 0.967). Предел обнаружения составляет 1.87∙10-5 мг/мл. В таблице 5.1 приведены аналитические характеристики определения антигена вируса кори в различные дни после приготовления иммунореагентов. Таблица 5.1 – Аналитические характеристики электрохимического метода определения антигена вируса кори Концентрация антигена, мг/мл -4 2.33∙10 2.33∙10-3 2.33∙10-2 2.33∙10-1 2.33 1 день 2 день 3 день 1 день 2 день 3 день 1 день 2 день 3 день 1 день 2 день 2.21 2.22 2.21 5.25 5.22 5.27 8.12 8.21 8.17 10.26 10.17 2.23 2.20 2.20 5.26 5.20 5.25 8.13 8.21 8.22 10.08 10.10 2.20 2.24 2.22 5.20 5.24 5.20 8.10 8.05 8.14 10.18 10.08 Коэффициент воспроизводимости 0.007 0.009 0.005 0.006 0.004 0.007 0.002 0.010 0.005 0.009 0.005 3 день 1 день 2 день 3 день 10.20 12.15 12.32 12.31 10.15 12.27 12.00 12.13 10.14 12.30 12.25 12.31 0.003 0.006 0.010 0.009 Дни dI/dE, мкА/В Коэффициент повторяемости 0.006 0.005 0.007 0.006 0.009 119 Установленные значения коэффициентов воспроизводимости и повторяемости не превышают 0.01. Таким образом, предложенный метод обеспечивает воспроизводимые результаты определения содержания антигена вируса кори в диапазоне концентраций (2.33∙10-4 – 2.33) мг/мл. Для оценки специфичности разработанного метода ТГП с иммобилизованными антителами к вирусу кори, инкубировали в растворе, содержащем антиген вируса клещевого энцефалита. Затем, согласно схеме иммуноанализа, добавляли конъюгаты антител к кори с нанокомпозитными частицами и измеряли аналитический сигнал. После инкубации в данном растворе (не содержащем антиген вируса кори) откликов не наблюдалось, поскольку иммунокомплекс на поверхности ТГП не формировался, что показывает отсутствие влияния на аналитический сигнал неспецифических взаимодействий и адсорбции. Таким образом, на основании полученных данных, можно заключить, что данная процедура анализа, с использованием конъюгатов антител с нанокомпозитными частицами, позволяет определять антиген вируса кори в модельном растворе в концентрации 1.87∙10-5 мг/мл. Исходя из принципов, на которых основан метод, и процедуры анализа, можно предположить, что возможен перенос метода на другие вирусные агенты. 120 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. С использованием оригинальных методик синтезированы НК на основе магнетита (Fe3О4) с полимерным покрытием из полипиррола (средний размер 170 нм); поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином (средний размер 20 нм); оксида кремния модифицированного ферроценом / антителами (средний размер 20 нм). Структура и размерность каждого вида НК подтверждены методом ИК-спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией [192]. 2. Исследована возможность применения магнитных нанокомпозитных частиц на основе Fe3О4 с электроактивным полимерным покрытием в качестве «метки», генерирующей адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический электрохимический отклик. 3. Показано взаимодействие синтезированных нанокомпозитов всех типов с клетками бактерии E.coli. 4. Разработаны новый электрохимический иммуносенсор и метод определения бактерий (на примере E.coli штамм ATC 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4 – ферроценмодифицированный оксид кремния в качестве метки в диапазоне концентраций 2.3∙102 - 2.3∙107 КОЕ/мл Предел обнаружения составляет 1.2∙101 КОЕ/мл [193]. 5. Надежность и правильность результатов определения содержания E.coli в модельных системах и реальных объектах (пробы воды и воздуха) подтверждены сравнением данных полученных с применением разработанного и стандартных методов (бактериального посева и ИФА). 6. Разработан метод электрохимического определения антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори) с использованием конъюгатов антител с нанокомпозитными частицами Fe3O4 – SiO2 в диапазоне концентраций 2.33∙10-4 – 2.33 мг/мл. Предел обнаружения составляет 1.87∙10-5 мг/мл [194]. 121 Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в проведении испытаний с использованием разработанного электрохимического метода иммуноанализа и сенсора для количественного определения бактерий других видов (помимо E.coli). Уверенность в успешном достижении цели основана на применении оригинальной высокоспецифичную схемы иммунореакцию иммуноанализа, на поверхности включающей сенсора и высокочувствительную электрохимическую детекцию. Кроме того, будет проведена адаптация разработанного метода и сенсора для определения содержания различных патогенов в реальных объектах (кровь, слюна, испражнения, назальные смывы и др.) с целью аттестации методики количественного определения в сравнении со стандартно-используемыми методами. Основные исследования по определению вирусных агентов, с использованием синтезированных конъюгатов «антитела – нанокомпозитные частицы» будут направлены на перенос метода с модельных систем на реальные объекты и, также на расширение круга определяемых вирусов. Таким образом, в дальнейшем разработанные иммуносенсоры и методики определения инфекционных агентов могут быть применены в следующих научных областях: Медицинская диагностика: в лечебно-профилактических учреждениях для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний на ранних стадиях. Экологический контроль и безопасность жизнедеятельности (учреждения Роспотребнадзора): мониторинг среды обитания и контроль бактериологического загрязнения водоемов. Исследования на базе научных организаций и учебных заведений химического, биологического и медицинского профилей 122 СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ АПТЭОС – аминопропилтриэтоксисилан; ВА – вольтамперометрия; ИК-спектроскопия – инфракрасная спектроскопия; ИФА – иммуноферментный анализ; ЛЦР – метод лигазной цепной реакции; НК – нанокомпозит (нанокомпозитные частицы); НЧ – наночастица; ПАВ – поверхностно-активное вещество; ПЦР – метод полимеразной цепной реакции; РНГА – реакция непрямой гемагглютинации; СДС – додецилсульфат натрия; ТГЭ – толстопленочный графито-эпоксидный электрод; NUG – толстопленочная графитовая подложка; ТМГЭ – толстопленочный графито-содержащий электрод; ТУЭ – толстопленочный углеродсодержащий электрод; ТЭОС – тетраэтоксисилан; модифицированный каломелью; ТГП – толстопленочная графитсодержащая подложка; УЗ обработка – ультразвуковая обработка; ЦВА – циклическая вольтамперометрия; Е – потенциал; E. coli – Escherichia coli штамм ATCC 25922; S. typhimurium – Salmonella typhimurium; Fe3O4 – АТSiO2 – конъюгаты антител с нанокомпозитными частицами на основе магнетита с оксидкремниевым покрытием; Fe3O4 - ПП – нанокомпозитные частицы на основе магнетита, с покрытием из полипиррола; 123 Fe3O4 – ФЦSiO2 – нанокомпозитные частицы на основе магнетита, с оксидкремниевым покрытием, модифицированным ферроценом; Fe3O4 – ХПВБХ – нанокомпозитные частицы на основе магнетита, с поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным хинолином; I – ток; IgG – иммуноглобулины группы G; IgM – иммуноглобулины группы M. 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ivnitski, D. Biosensors for detection of pathogenic bacteria / D. Ivnitski, I. A. Hamid, P. Atanasov, E. Wilkins // Biosensors and bioelectronics. – 1999. – Vol. 14. – P. 599–624. 2. Percival, S. L. Microbiology of Waterborne Diseases. Microbiological Aspects and Risks. second edition / S. L. Percival, M. V. Yates, D. Williams, R. Chalmers. Amsterdam: Academic press, 2013. – 696. 3. Bridle H. Waterborne pathogens. Detection methods and applications / H. Bridle. Amsterdam: Academic press, 2014. – 416. 4. Sánchez, S. Aspectos clínicos y patogénicos de las infecciones por Escherichia coli O157:H7 y otros E. coli verotoxigénicos / S. Sánchez, R. Martínez, J. M. Alonso, J. Rey // Enfermedades infecciosas y microbiología clínica. – 2010. – Vol. 28. – P. 370-374. 5. СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Гигиенические требования к обеспечению безопасности систем горячего водоснабжения. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 2002. – 68 с. 6. Lee, K.-M. Review of Salmonella detection and identification methods: Aspects of rapid emergency response and food safety / K.-M. Lee, M. Runyon, T. J. Herrman, R. Phillips, J. Hsieh // Food control. – 2015. – Vol. 47. – P. 264-276. 7. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, Е. М. Гаврилова. – М.: Высшая школа, 1991. – 288 с. 8. Херрингтон, С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. / С. Херрингтон, Д. Макги. – М.: Мир, 1999. – 558 с. 9. Uyttendaele, M. PCR Applications in Food Microbiology / M. Uyttendaele, A. Rajkovic, S. Ceuppens, L. Baert, E. V. Coillie, L. Herman, V. Jasson, 125 H. Imberechts // Encyclopedia of food microbiology (Second Edition) / C. A. Batt. Amsterdam: Academic press, 2014. – 3248. 10. Baumgartner, V. A new application technique for luminescent bacteria on highperformance thin-layer chromatography plates / V. Baumgartner, C. Hohl, W. Schwack // Journal of chromatography A. – 2011. – Vol. 1218. – Issue 19. – P. 2692-2699. 11. Buyer, J.S. Rapid sample processing and fast gas chromatography for identification of bacteria by fatty acid analysis / J.S. Buyer // Journal of microbiological methods. – 2002. – Vol. 51. – Issue 2. – P. 209-215. 12. Schäwe, R. Evaluation of FT-IR spectroscopy as a tool to quantify bacteria in binary mixed cultures / R. Schäwe, I. Fetzer, A. Tönniges, C. Härtig, W. Geyer, H. Harms, A. Chatzinotas // Journal of microbiological methods. – 2011. – Vol. 86. – Issue 2. – P. 182-187. 13. Langerhuus, S. N. Gram-typing of mastitis bacteria in milk samples using flow cytometry / S. N. Langerhuus, K. L. Ingvartsen, T. W. Bennedsgaard, C. M. Rontved // Journal of dairy science. – 2013. – V. 96. – Issue 1. – P. 267-277. 14. Malacrinò, P. Rapid detection of viable yeasts and bacteria in wine by flow cytometry / P. Malacrinò, G. Zapparoli, S. Torriani, F. Dellaglio // Journal of microbiological methods. – 2001. – Vol. 45. – Issue 2. – P. 127-134. 15. Wang Y. Monitoring of Escherichia coli O157:H7 in food samples using lectin based surface plasmon resonance biosensor / Y. Wang, Z. Ye, C. Si, Y. Ying // Journal of food chemistry. – 2013. – Vol. 136. – I. 3–4. – P. 1303-1308. 16. Luppa, P.B. Immunosensors—principles and applications to clinical chemistry / P.B. Luppa, L.J. Sokoll, D.W. Chan // Clinica chimica acta. – 2001. – Vol. 314. – Issue 1–2. – P. 1-26. 17. Cai, J. Rapid parallelized and quantitative analysis of five pathogenic bacteria by ITS hybridization using QCM biosensor / J. Cai, C. Yao, J. Xia, J. Wang, M. Chen, J. Huang, K. Chang, C. Liu, H. Pan, W. Fu // Original sensors and actuators B: Chemical. – 2011. – Vol. 155. – Issue 2. – P. 500-504. 126 18. Salam, F. Real-time and sensitive detection of Salmonella Typhimurium using an automated quartz crystal microbalance (QCM) instrument with nanoparticles amplification / F. Salam, Y. Uludag, I. E. Tothill // Talanta. – 2013. – Vol. 115. – P. 761-767. 19. Jiang, X. Evaluation of different micro/nanobeads used as amplifiers in QCM immunosensor for more sensitive detection of E. coli O157:H7 / X. Jiang, R. Wang, Y. Wang, X. Su, Y. Ying, J. Wang, Y. Li // Biosensors and bioelectronics. – 2011. – V. 29. – Issue 1. – P. 23-28. 20. Lu F. Quartz crystal microbalance with rigid mass partially attached on electrode surfaces / F. Lu, H. P. Lee, S. P. Lim // Sensors and actuators A: Physical. –2004. – Vol. 112. – Issue 2–3. – P. 203-210. 21. Уткин, Д. В. Применение методов спектроскопии для индикации и идентификации патогенных биологических агентов / Д. В. Уткин, В. Е. Куклев, П. С. Ерохин, Н. А. Осина // Проблемы особо опасных инфекций. – 2011. – № 108. – c.68-71. 22. San-Blas, E. Characterization of Xenorhabdus and Photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR) / E. San-Blas, N. Cubillán, M. Guerra, E. Portillo, I. Esteves // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and biomolecular spectroscopy. – 2012. – Vol. 93. – P. 58-62. 23. Alvarez-Ordóñez, A. Fourier transform infrared spectroscopy as a tool to characterize molecular composition and stress response in foodborne pathogenic bacteria / A. Alvarez-Ordóñez, D. J. M. Mouwen, M. López, M. Prieto // Journal of Microbiological methods. – 2011. – Vol. 84. – Issue 3. – P. 369-378. 24. Davis, R. Evaluation of Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and chemometrics as a rapid approach for sub-typing Escherichia coli O157:H7 isolates / R. Davis, G. Paoli, L. J. Mauer // Food microbiology. – 2012. – Vol. 31. – Issue 2. – P. 181-190. 127 25. Matos, C. T. Using multi-parameter flow cytometry as a novel approach for physiological characterization of bacteria in microbial fuel cells / C. T. Matos, T. L. da Silva // Process biochemistry. – 2013. – Vol. 48. – Issue 1. – P. 49-57. 26. Trevathan-Tackett, S. Detachment and flow cytometric quantification of seagrassassociated bacteria / S. Trevathan-Tackett, P. Macreadie, P. Ralph, J. Seymour // Journal of microbiological methods. – 2014. – Vol. 102. – P. 23-25. 27. Duan, N. A dual-color flow cytometry protocol for the simultaneous detection of Vibrio parahaemolyticus and Salmonella typhimurium using aptamer conjugated quantum dots as labels / N. Duan, S. Wu, Y. Yu, X. Ma, Y. Xia, X. Chen, Y. Huang, Z. Wang // Analytica chimica acta. – 2013. – V. 804. – P. 151-158. 28. Brehm-Stecher, B.F. Flow cytometry / B.F. Brehm-Stecher // Encyclopedia of Food Microbiology (Second Edition) / C. A. Batt. Amsterdam: Academic press, 2014. – 3248. 29. Geng, J. Rapid and specific enumeration of viable Bifidobacteria in dairy products based on flow cytometry technology: A proof of concept study / J. Geng, C. Chiron, J. Combrisson // International dairy journal. – 2014. – Vol. 37. – Issue 1. – P. 1-4. 30. Giesen, C. D. Performance of flow cytometry to screen urine for bacteria and white blood cells prior to urine culture / C. D. Giesen, A. M. Greeno, K. A. Thompson, R. Patel, S. M. Jenkins, J. C. Lieske // Clinical biochemistry. – 2013. – Vol. 46. – Issue 9. – P. 810-813. 31. Allman, R. Flow cytometry: principles and application / R. Allman // Clinical flow cytometry. Principles and application / K. D. Bauer, R. E. Duque, T. V. Shankey / New York: Igaku-shoin medical publishers, Inc. 1993. – Vol. 28. – №2. – P. 45-54. 32. Wang, X.-H. Direct identification of bacteria causing urinary tract infections by combining matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry with UF-1000i urine flow cytometry / X.-H. Wang, G. Zhang, Y.-Y. Fan, X. Yang, W.-J. Sui, X.-X. Lu // Journal of microbiological methods. – 2013. – Vol. 92. – Issue 3. – P. 231-235. 128 33. Manti, A. Experimental improvements in combining CARD-FISH and flow cytometry for bacterial cell quantification / A. Manti, P. Boi, S. Amalfitano, A. Puddu, S. Papa // Journal of microbiological methods. – 2011. – Vol. 87. – Issue 3. – P. 309-315. 34. Yulong, Z. Rapid and sensitive detection of Enterobacter sakazakii by crosspriming amplification combined with immuno-blotting analysis / Z. Yulong, Z. Xia, Z. Hongwei, L. Wei, Z. Wenjie, H. Xitai // Molecular and cellular probes. – 2010. – Vol. 24. – Issue 6. – P. 396-400. 35. Hamada, R. A rapid bacteria detection technique utilizing impedance measurement combined with positive and negative dielectrophoresis / R. Hamada, H. Takayama, Y. Shonishi, L. Mao, M. Nakano, J. Suehiro // Sensors and actuators B: Chemical. – 2013. – Vol. 181. – P. 439-445. 36. Zheng, Q. Real-time PCR method combined with immunomagnetic separation for detecting healthy and heat-injured Salmonella typhimurium on raw duck wings / Q. Zheng, M. Mikš-Krajnik, Y. Yang, W. Xu, H.-G. Yuk // International journal of food microbiology. – 2014. – Vol. 186. – P. 6-13. 37. Xiao, R. Portable evanescent wave fiber biosensor for highly sensitive detection of Shigella / R. Xiao, Z. Rong, F. Long, Q. Liu // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and biomolecular spectroscopy. – 2014. – Vol. 132. – P. 1-5. 38. Grossi, M. An embedded portable biosensor system for bacterial concentration detection / M. Grossi, M. Lanzoni, A. Pompei, R. Lazzarini, D. Matteuzzi, B. Riccò // Biosensors and bioelectronics. – 2010. – V. 26. – Issue 3. – P. 983-990. 39. Jiang, J. Smartphone based portable bacteria pre-concentrating microfluidic sensor and impedance sensing system / J. Jiang, X. Wang, R. Chao, Y. Ren, C. Hu, Z. Xu, Liu L. G. // Sensors and actuators B: Chemical. – 2014. – Vol. 193. – P. 653-659. 40. Aliofkhazraei, M. Recent developments in miniaturization of sensor technologies and their applications / M. Aliofkhazraei, N. Ali // Comprehensive materials processing. – 2014. – Vol. 13. – P. 245-306. 129 41. Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors / V. Velusamy, K. Arshak, O. Korostynska, K. Oliwa, C. Adley // Biotechnology advances. –2010. – Vol. 28. – Issue 2. – P.232-254. 42. Sharma, H. Review of biosensors for foodborne pathogens and toxins / H. Sharma, R. Mutharasan // Sensors and actuators B: Chemical. – 2013. – Vol. 183. – P. 535-549. 43. Abdalhai, M. H. Rapid and sensitive detection of foodborne pathogenic bacteria (Staphylococcus aureus) using an electrochemical DNA genomic biosensor and its application in fresh beef / M. H. Abdalhai, A. M. Fernandes, M. Bashari, J. Ji, Q. He, X. Sun // Journal of agricultural food chemistry. –2014. – Vol. 62. – P. 12659–12667. 44. Arora, P. Biosensors as innovative tools for the detection of food borne pathogens / P. Arora, A. Sindhu, N. Dilbaghi, A. Chaudhury // Biosensors and bioelectronics. – 2011. – Vol. 28. – Issue 1. – P. 1-12. 45. Wei, H. Direct detection of Yersinia pestis from the infected animal specimens by a fiber optic biosensor / H. Wei, Y. Zhao, Y. Bi, H. Liu, Z. Guo, Y. Song, J. Zhai, H. Huang, R. Yang // Sensors and actuators B: Chemical. – 2007. – Vol. 123. – Issue 1. – P. 204-210. 46. Takayama, K. Mediated electrocatalysis at biocatalyst electrode based on a bacterium Gluconobacter industrius / K. Takayama, T. Kurosaki, T. Ikeda // Journal of electroanalytical chemistry. – 1993. – Vol. 356. – P. 295-301. 47. Tait, E. Use of volatile compounds as a diagnostic tool for the detection of pathogenic bacteria / E. Tait, J. D. Perry, S. P. Stanforth, J. R. Dean // Trends in analytical chemistry. – 2014 – Vol. 53. – P. 117-125. 48. Matsunaga, T. Electrode system for the determination of microbial populations / T. Matsunaga, I. Karube, S. Suzuki // Applied environmental microbiology. – 1979. – Vol. 37. – P. 117–121. 49. Holland, R. L. Automated detection of microbial growth in blood cultures by using stainless steel electrodes / R. L. Holland, B. H. Cooper, N. G. P. Hegelson, 130 A. W. McCracken // Journal of clinical microbiology. – 1980. – Vol. 12. – P.180-184. 50. Ding, T. Control of microbial activity by flow injection analysis during high cell density cultivation of E. coli / T. Ding, U. Bilitewski, R. D. Schmid, D. J. Korz, E. A. Sanders // Journal of biotechnology. –1993. – Vol. 27. – P. 143-157. 51. Hitchens, G. D. Bacterial activity measurements by mediated amperometry in a flow-injection system / G. D. Hitchens, D. Hodko, D. R. Miller, O. J. Murphy, T. D. Rogers // Russian journal of electrochemistry. – 1993. – Vol. 29. – P. 1344-1349. 52. Terry, L. A. The application of biosensors to fresh produce and the wider food industry / L. A. Terry, S. F. White, L. J. Tigwell // Journal of agriculture food chemistry. – 2005. – Vol. 53. – P. 1309-1316. 53. Gehring A. G. Enzyme-linked immunomagnetic electrochemical detection of Salmonella typhimurium / A. G. Gehring, C. G. Crawford, R. S. Mazenko, L. J. Van Houten, J. D. Brewster // Journal of immunological methods. – 1996. – Vol. 195. – P.15-25. 54. Zhang, G. Screening for in vitro metabolites of kakkalide and irisolidone in human and rat intestinal bacteria by ultra-high performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry / G. Zhang, T. Gong, Y. Kano, D. Yuan // Journal of chromatography B. – 2014. – Vol. 947–948. – P. 117-124. 55. Yang, J. Identification of the major metabolites of hyperoside produced by the human intestinal bacteria using the ultra performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry / J. Yang, D. Qian, J. Guo, S. Jiang, E. Shang, J. Duan, J. Xu // Journal of ethnopharmacology. – 2013. – Vol. 147. – Issue 1. – P. 174-179. 56. Нетрусов, А.И. Микробиология / А. И. Нетрусов, И. Б. Котова. - М.: Academia, – 2009. – 352 с. 131 57. Wan, Y. Selective and specific detection of sulfate-reducing bacteria using potentiometric stripping analysis / Y. Wan, D. Zhang, B. Hou // Talanta. – 2010. – Vol. 82. – Issue 4. – P. 1608-1611. 58. Clotilde, L. M. A 7-plex microbead-based immunoassay for serotyping Shiga toxin-producing Escherichia coli / L. M. Clotilde, C. Bernard IV, A. Salvador, A. Lin, C. R. Lauzon, M. Muldoon, Y. Xu, K. Lindpaintner, J. M. Carter // Journal of microbiological methods. – 2013. – Vol. 92. – Issue 2. – P. 226-230. 59. Zhang, X. Established a new double antibodies sandwich enzymelinked immunosorbent assay for detecting Bacillus thuringiensis (Bt) Cry1Ab toxin based single-chain variable fragments from a naïve mouse phage displayed library / X. Zhang, C. Xu, C. Zhang, Y. Liu, Y. Xie, X. Liu // Toxicon. – 2014. – Vol. 81. – P. 13-22. 60. Wilkins, J. R. Use of platinum electrodes for electrochemical detection of bacteria / J. R. Wilkins // Journal Appl. Environ. Microbiol. – 1979. – Vol. 36. – P. 683–687. 61. Wilkins, J.R. Multichannel electrochemical microbial detection unit / J. R. Wilkins, R. Young, E. Boykin // Journal of applied environmental microbiology. – 1978. – Vol. 35. – P. 214–215. 62. Hernández, R. Graphene-based potentiometric biosensor for the immediate detection of living bacteria / R. Hernández, C. Vallés, A. M. Benito, W. K. Maser, F. X. Rius, J. Riu // Biosensors and bioelectronics. – 2014. – Vol. 54. – P. 553-557. 63. Zelada-Guillén, G. A. Label-free detection of Staphylococcus aureus in skin using real-time potentiometric biosensors based on carbon nanotubes and aptamers / G. A. Zelada-Guillén, J. L. Sebastián-Avila, P. Blondeau, J. Riu, F. X Rius // Biosensors and bioelectronics. – 2012. – Vol. 31. – Issue 1. – P. 226-232. 64. Ercole, C. Escherichia coli detection in vegetable food by a potentiometric biosensor / C. Ercole, M. Del Gallo, L. Mosiello, S. Baccella, A. Lepidi // Sensors and actuators B: Chemical. – 2003. – Vol. 91. – Issue 1–3. – P. 163-168. 132 65. Rishpon, J. Immunoelectrodes for the detection of bacteria / J. Rishpon, Y. Gezundhajt, L. Soussan, I. Rosen-Margalit, E. Hadas // Biosensor design and application. Chapter 6. / Ed: P. R. Mathewson, J. W. Finley. Washington, DC: American Chemical Society, – 1992. – Vol. 511. – P. 59-72 66. Junter, G. A. Electrochemical detection and counting of E. coli in the oresence of a reducible coenzyme, lipoic acid / G. A. Junter, J. F. Lemeland, E. Selegney // Journal of applied environmental microbiology. – 1980. – V.39. – P.307-316. 67. Pisoschi, A. M. Ethanol determination by an amperometric bienzyme sensor based on a Clark-type transducer / A. M. Pisoschi, A. Pop, A. I. Serban, G. P. Negulescu // Journal of electroanalytical chemistry. – 2012. – Vol. 671. – P. 85-91. 68. Yamanaka, K. Electrochemical detection of specific DNA and respiratory activity of Escherichia coli / K. Yamanaka, T. Ikeuchi, M. Saito, N. Nagatani, E. Tamiya // Electrochimica acta. – 2012. – Vol. 82. – P. 132-136. 69. Endo, H. A biosensor system for the determination of cell number of EnteroccusSeriolicida / H. Endo, K. Fujisaki, Y. Ohkubo, T. Hayashi, E. Watanabe // Fisheries science. – 1996. – Vol. 62, – P.235–239. 70. Duan, N. A universal fluorescent aptasensor based on AccuBlue dye for the detection of pathogenic bacteria / N. Duan, S. Wu, X. Ma, Y. Xia, Z. Wang // Analytical biochemistry. – 2014. – Vol. 454. – P. 1-6. 71. Zhu, P. Detection of E. coli O157:H7 by immunomagnetic separation coupled with fluorescence immunoassay / P. Zhu, D. R. Shelton, S. Li, D. L. Adams, J. S. Karns, P. Amstutz, C.-M. Tang // Biosensors and bioelectronics. – 2011. – Vol. 30. – Issue 1. – P. 337-341. 72. Langer, V. Rapid quantification of bioaerosols containing L. pneumophila by Coriolis® μ air sampler and chemiluminescence antibody microarrays / V. Langer, G. Hartmann, R. Niessner, M. Seidel // Journal of aerosol science. – 2012. – V. 48. – P. 46-55. 73. Zhang, F. Lanthanide-labeled immunochromatographic strips for the rapid detection of Pantoea stewartii subsp. stewartii / F. Zhang, M. Zou, Y. Chen, 133 J. Li, Y. Wang, X. Qi, Q. Xue // Biosensors and bioelectronics. – 2014. – Vol. 51. – P. 29-35. 74. Barton, L. L. Suitability of fluorescence measurements to quantify sulfatereducing bacteria / L. L. Barton, C. M. Carpenter // Journal of microbiological methods, – Vol. 93. – Issue 3. – 2013. – P 192-197. 75. Zhu, P. Detection of waterborne E. coli O157 using the integrating waveguide biosensor / P. Zhu, D. R. Shelton, J. S. Karns, A. Sundaram, S Li., P. Amstutz // Biosensors and bioelectronics. – 2005. – Vol. 21. – P.678-83. 76. Ho J. A. Liposome-based microcapillary immunosensor for detection of Escherichia coli O157:H7 / J. A. Ho, H.-W Hsu., M.-R. Huang // Analytical biochemistry. – 2004. – Vol. 330. – Issue 2. – P. 342-349. 77. Laczka, O. Application of an ELISA-type screen printed electrode-based potentiometric assay to the detection of Cryptosporidium parvum oocysts / O. Laczka, L. Skillman, W. G. Ditcham, B. Hamdorf, D. K. Y. Wong, P. Bergquist, A. Sunna // Journal of microbiological methods. – 2013. – Vol. 95. – Issue 2. – P. 182-185. 78. Thompson, H. G. Rapid immunofiltration assay of Francisella tularensis / H. G. Thompson, W. E. Lee // Suffield Memorandum. – 1992. – № 1376. – P. 1-17. 79. Menking, D. G. Evaluation of cocktailed antibodies for toxin and pathogen assays on the light addressable potentiometric sensor / D. G. Menking, M. T. Goode // Proceedings of the 1992 ERDEC Scientific Conference on Chemical Defense Research // J. D. Williams, D. A. Berg, P. J. Reeves. – 1993. – P. 103-109. 80. Wagner, T. Light-addressable potentiometric sensors (LAPS): recent trends and applications / T. Wagner, M. Schoning // Comprehensive analytical chemistry. – 2007. – Vol. 49. – P. 87–128. 81. Wagner, T. “LAPS Card” A novel chip card-based light-addressable potentiometric sensor (LAPS) / T. Wagner, C. Rao, J. P. Kloock, T. Yoshinobu, R. Otto, M. Keusgen, M. J. Schöning // Sensors and actuators B: Chemical. – 2006. – Vol. 118. – Issue 1–2. – P. 33-40. 134 82. Libby, J. M. Detection of Nesseria meningitides and Yersinia pestis with a novel silicon-based sensor / J. M. Libby, H. G. Wada. // Journal of clinical microbiology. – 1999. – Vol. 27. – P. 1456-1459. 83. Gehring, A. G. Immunologic biosensing of foodborne pathogenic bacteria using electrochemical or light-addressable potentiometric sensor (LAPS) detection platforms / A. G. Gehring // High throughput screening for food safety assessment / Ed: A. K. Bhunia, M. S. Kim C. R. Taitt. – Oxford: Woodhead Publishing, – 2015. – P. 301-314. 84. Santos, M. B. Label-free ITO-based immunosensor for the detection of very low concentrations of pathogenic bacteria / M. B. Santos, S. Azevedo, J. P. Agusil, B. Prieto-Simón, C. Sporer, E. Torrents, A. Juárez, V. Teixeira, J. Samitier // Bioelectrochemistry. – 2015. – Vol. 101. – P. 146-152. 85. Shang, F. One step preparation and electrochemical analysis of IQS, a cell–cell communication signal in the nosocomial pathogen Pseudomonas aeruginosa / F. Shang, E. Ó. Muimhneacháin, F. J. Reen, A. Buzid, F. O’Gara, J. H. T. Luong, J. D. Glennon, G. P. McGlacken // Bioorganic & medicinal chemistry letters. – 2014. – Vol. 24. – Issue 19. – P. 4703-4707. 86. Shinde, S. B. Recent trends in in-vitro nanodiagnostics for detection of pathogens / S. B. Shinde, C. B. Fernandes, V. B. Patravale // Journal of controlled release. – 2012. – V. 159. – Issue 2. – P.164-180. 87. Laczka, O. Improved bacteria detection by coupling magneto-immunocapture and amperometry at flow-channel microband electrodes / O. Laczka, J.-M. Maesa, N. Godino, J. Campo, M. Fougt-Hansen, J. P. Kutter, D. Snakenborg, F.-X. Munoz-Pascual, E. Baldrich // Biosensors and bioelectronics. – 2011. – Vol. 26. – P.3633-3640. 88. Santos, M. B. Detection of pathogenic bacteria by electrochemical impedance spectroscopy: influence of the immobilization strategies on the sensor performance / M. B. Santos, C. Sporer, N. Sanvicens, N. Pascuald, A. Errachid, E. Martinez, M.-P. Marcod, V. Teixeira, J. Samiter // Procedia chemistry. – 2009. – Vol. 1. – P. 1291-1294. 135 89. Li, Y. Impedance based detection of pathogenic E. coli O157:H7 using a ferrocene-antimicrobial peptide modified biosensor / Y. Li, R. Afrasiabi, F. Fathi, N. Wang, C. Xiang, R. Love, Z. She, H.-B. Kraatz // Biosensors and bioelectronics. – 2014. – Vol. 58. – P. 193-199. 90. Toda, K. Electrochemical enzyme immunoassay using immobilized antibody on gold film with monitoring of surface plasmon resonance signal / K. Toda, M. Tsuboi, N. Sekiya, M. Ikeda, K.-I. Yoshioka // Analytica chimica acta. – 2002. – Vol. 463. – P. 219-227. 91. Gilmartina N. Nanobiotechnologies for the detection and reduction of pathogens / N. Gilmartina, R. O’Kennedy // Enzyme and microbial technology. – 2012. – Vol. 50. – P. 87-95. 92. Urbanova, V. Nanocrystalline Iron Oxides, Composites, and Related Materials as a Platform for Electrochemical, Magnetic, and Chemical Biosensors / V. Urbanova, M. Magro, A. Gedanken, D. Baratella, F. Vianello, R. Zboril // Chemical materials. – 2014. – Vol. 26. – P. 6653-6673. 93. Yin, T. Applications of nanomaterials in potentiometric sensors / T. Yin, W. Qin // Trends in analytical chemistry. – 2013. – Vol. 51. – P. 79-86. 94. Narayanan, R. Chapter 10. Nanoparticles of different shapes for biosensor applications / R. Narayanan // Functional nanoparticles for bioanalysis, nanomedicine, and bioelectronic devices / Ed: M. Hepel1, C. J. Zhong. New York: American Chemical Society, – 2012. – Vol. 1112. – P 281-292. 95. Chatterjee, K. Core/shell nanoparticles in biomedical applications / K. Chatterjee, S. Sarkar, K. J. Rao, S. Paria // Advances in colloid and interface science. – 2014. – Vol. 209. – P. 8-39. 96. Su, H. Gold nanoparticles as colorimetric sensor: A case study on E. coli O157:H7 as a model for Gram-negative bacteria / H. Su, Q. Ma, K. Shang, T. Liu, H. Yin, S. Ai // Sensors and actuators B: Chemical. – 2012. – Vol. 161. – P. 298-303. 97. Liu, C.-C. Salmonella detection using 16S ribosomal DNA/RNA probe-gold nanoparticles and lateral flow immunoassay / C.-C. Liu, C.-Y. Yeung, 136 P.-H. Chen, M.-K. Yeh, S.-Y. Hou // Food chemistry. – Vol. 141. – Issue 3. – 2013. – P. 2526-2532. 98. Ma, S. Visible paper chip immunoassay for rapid determination of bacteria in water distribution system / S. Ma, Y Tang, J. Liu, J. Wu. // Talanta. – 2014. – Vol. 120. – P. 135-140. 99. Sun, A. L. Sensitive label-free electrochemical immunoassay based on a redox matrix of gold nanoparticles/Azure І/multi-wall carbon nanotubes composite / A. L. Sun, G. R. Chen, Q. L. Sheng, J. B. Zheng // Biochemical engineering journal. – 2011. – Vol. 57. – P. 1-6. 100. Cao, X. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing / X. Cao, Y. Ye, S. Liu // Analytical biochemistry. – 2011. – Vol. 417. – Issue 1. – P. 1-16. 101. Dwarakanath, S. Quantum dot–antibody and aptamer conjugates shift fluorescence upon binding bacteria / S. Dwarakanath, J. G. Bruno, A. Shastry, T. Phillips, A. John, A. Kumar, L. D. Stephenson // Biochemical and biophysical research communications. – 2004. – Vol. 325. – P. 739–743. 102. Tallury, P. Silica-based multimodal/multifunctional nanoparticles for bioimaging and biosensing applications / P. Tallury, K. Payton, S. Santra // Nanomedicine. – 2008. – Vol. 3. – P. 579-592. 103. Wang, L. Bioconjugated silica nanoparticles: development and applications/ L. Wang, W. Zhao, W. Tan // Nano Research. 2008. – Vol. 1. – P. 99-115. 104. Wang, L. Watching silica nanoparticles glow in the biological world / L. Wang, K. M. Wang, S. Santra, X. J. Zhao, L. R. Hilliard, J. E. Smith, J. R. Wu, W. H. Tan // Analitical chemistry. – 2006. – Vol. 78. – P. 646-654. 105. Qin, D. L. Fluorescent nanoparticle-based indirect immunofluorescence microscopy for detection of Mycobacterium tuberculosis / D. L. Qin, X. X. He, K. M. Wang, X. J. J. Zhao, W. H. Tan, J. Y. Chen // Journal of biomedicine and biotechnologies. – 2007. – Vol. 9. – P. 1-9. 137 106. Hun, X. A novel sensitive staphylococcal enterotoxin C, fluoroimmunoassay based on functionalized fluorescent core–shell nanoparticle labels / X. Hun, Z. J. Zhang // Food chemistry. – 2007. – Vol. 105. – P. 1623-1629. 107. Tang, S. Detection of anthrax toxin by an ultrasensitive immunoassay using Europium nanoparticles / S. Tang, M. Moayeri, Z. Chen, H. Harma, J. Zhao, H. Hu, R. H. Purcell, S. H. Leppla, I. K. Hewlett // Clinical vaccine immunology. –2009. – Vol. 16. – P. 408-413. 108. Hahn, M.A. Detection of single bacterial pathogens with semiconductor quantum dots / M. A. Hahn, J. S. Tabb, T. D. Krauss // Analytical chemistry. – 2005. – Vol. 77. – P. 4861-4869. 109. Su, X. L. Quantum dot biolabeling coupled with immunomagnetic separation for detection of Escherichia coli O157: H7 / Su X. L., Li Y. // Analytical chemistry. – 2004. – Vol. 76. – P. 4806-4810. 110. Mukhopadhyay, B. Bacterial detection using carbohydrate-functionalised CdS quantum dots: a model study exploiting E. coli recognition of mannosides / B. Mukhopadhyay, M. B. Martins, R. Karamanska, D. A. Russell, R. A. Field // Tetrahedron letters. – 2009. – Vol. 50. – P. 886-889. 111. Wang, L. Dual-luminophore-doped silica nanoparticles for multiplexed signaling / L. Wang, C. Yang, W. Tan // Nano Letters. – 2005. – V. 5. – P. 37-43. 112. Varshney, M. Magnetic nanoparticle–antibody conjugates for the separation of Escherichia coli 0157: H7 in ground beef / M. Varshney, L. J. Yang, X. L. Su, Y.B. Li // Journal of food protection. – 2005. – Vol. 68. – P. 1804-1811. 113. Ravindranath, S. P. Biofunctionalized magnetic nanoparticle integrated midinfrared pathogen sensor for food matrixes / S. P. Ravindranath, L. J. Mauer, C. Deb-Roy, J. Irudayaraj // Analytical chemistry. – 2009. – Vol. 81. – P. 2840-2846. 114. Cheng, Y. Combining biofunctional magnetic nanoparticles and ATP bioluminescence for rapid detection of Escherichia coli / Y. Cheng, Y. Liu, J. Huang, K. Li, W. Zhang, Y. Xian, L. Jin // Talanta. – 2009. – Vol. 77. – P. 1332-1336. 138 115. Lin, F. Y. H. Development of a nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay for detection of pathogenic microorganisms / F. Y. H. Lin, M. Sabri, J. Alirezaie, D. Li, P. M. Sherman // Clinical diagnostic laboratory immunology. – 2005. – Vol.12. – P. 418-425. 116. Kelong Ai, B.Z. Europium-based fluorescence nanoparticle sensor for rapid and ultrasensitive detection of an anthrax biomarker / B. Z. Kelong Ai // Angewandte сhemie international edition. – 2009. – Vol. 48. – P. 304-308. 117. D. B. Wang Rapid detection of Bacillus anthracis spores using a superparamagnetic lateral-flow immunological detection system / D. B. Wang, B. Tian, Z. P. Zhang, J. Y. Deng, Z. Q. Cui, R. F. Yang, X. Y. Wang, H. P. Wei, X. E. Zhang // Biosensors and bioelectronics. – 2013. – Vol. 42. – P. 661-667. 118. Qin, D. L. Fluor escent nanoparticle-based indirect immunofluorescence microscopy for detection of Mycobacterium tuberculosis / D. L. Qin, X. X. He, K. M. Wang, X. J. J. Zhao, W. H. Tan, J. Y. Chen // Journal of biomedical biotechnology. – 2007. – Vol. 9. – P. 254. 119. Baptista, P. V. Gold nanoparticle–probe-based assay for rapid and direct detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in clinical samples / P. V. Baptista, M. Koziol-Montewka, J. Paluch-Oles, G. Doria, R. Franco // Clinical chemistry. – 2006. – Vol. 52. – P. 1433-1434. 120. Yang, H. Detection of Listeria monocytogenes in biofilms using immunonanoparticles / H. Yang, L.W. Qu, Y. Lin, X.P. Jiang, Y.P. Sun // Journal of biomedical nanotechnologies. – 2007. – V. 3. – P. 131-138. 121. Lin, Y. S. Affinity capture using vancomycin-bound magnetic nanoparticles for the MALDI-MS analysis of bacteria / Y. S. Lin, P. J. Tsai, M. F. Weng, Y. C. Chen // Analytical chemistry. – 2005. – Vol. 77. – P. 1753-1760. 122. Singh, A. K. Gangliosides as receptors for biological toxins: development of sensitive fluoroimmunoassays using ganglioside-bearing liposomes / A. K. Singh, S. H. Harrison, J. S. Schoeniger // Analytical chemistry. – 2000. – V. 72. – P. 6019-6024. 139 123. Ahn-Yoon, S. Ganglioside–liposome immunoassay for the ultrasensitive detection of cholera toxin / S. Ahn-Yoon, T. R. DeCory, A. J. Baeumner, R. A. Durst // Analytical chemistry. – 2003. – Vol. 75. – P. 2256-2261. 124. Schofield, C. L. Glyconanoparticles for the colorimetric detection of cholera toxin / C. L. Schofield, R. A. Field, D. A. Russell // Analytical chemistry. – 2007. – Vol. 79. – P. 1356-1361. 125. Fang, S.B. Identification of Salmonella using colony-print and detection with antibody-coated gold nanoparticles / S. B. Fang, W. Y. Tseng, H. C. Lee, C. K. Tsai, J. T. Huang, S. Y. Hou // Journal of microbiological methods. – 2009. – Vol. 77. – P. 225-228. 126. Zhang, D. Fluorescent bio-barcode DNA assay for the detection of Salmonella enterica serovar Enteritidis / D. Zhang, D. J. Carr, E. C. Alocilja // Biosensors and bioelectronics. – 2009. – Vol. 24. – P. 1377-1381. 127. Lin, F.Y.H. Development of a nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay for detection of pathogenic microorganisms / F.Y.H. Lin, M. Sabri, J. Alirezaie, D. Li, P.M. Sherman // Clinical diagnostic laboratory immunology. – 2005. – Vol. 12. – P. 418-425. 128. Gao, J. Combining fluorescent probes and biofunctional magnetic nanoparticles for rapid detection of bacteria in human blood / J. Gao, L. H. Li, P. L. Ho, G. C. Mak, H. W. Gu, B. Xu // Advansed material. – 2006. – Vol. 1. – P. 3145-3148. 129. Kell, A. J. Vancomycin-modified nanoparticles for efficient targeting and preconcentration of Gram-positive and Gram-negative bacteria / A. J. Kell, G. Stewart, S. Ryan, R. Peytavi, M. Boissinot, A. Huletsky, M. G. Bergeron, B. Simard // ACSNano. –2008. – Vol. 2. – P. 1777-1788. 130. Liu J. C. Affinity capture of uropathogenic Escherichia coli using pigeon ovalbumin-bound Fe3O4@Al2O3 magnetic nanoparticles / J. C. Liu, P. J. Tsai, Y. C. Lee, Y. C. Chen // Analytical chemistry. – 2008. – Vol. 80. – P. 5425-5432. 140 131. Yang, L. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhimurium using quantum dots as fluorescence labels / L. Yang, Y. Li // Analyst. –2006. – Vol. 131. – P. 394-401. 132. Goldman, E. R. Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents / E. R. Goldman, A. R. Clapp, G. P. Anderson, H. T. Uyeda, J. M. Mauro, I. L. Medintz, H. Mattoussi // Analytical chemistry. – 2004. – Vol. 76. – P. 684-688. 133. Wang L. Fluorescent nanoparticles for multiplexed bacteria monitoring / L. Wang, W. J. Zhao, M .B. O'Donoghue, W. H. Tan // Bioconjugation chemistry. – 2007. – Vol. 18. – P. 297-301. 134. Tallury, P. Nanobioimaging and sensing of infectious diseases / P. Tallury, A. Malhotra, L. M Byrne, S. Santra // Advanced drug delivery reviews. – 2010. –Vol. 62. – P. 424-437. 135. Xu, H. Bioanalysis and bioimaging with fluorescent conjugated polymers and conjugated polymer nanoparticles / H. Xu, L. Wang, C. Fan // Functional nanoparticles for bioanalysis nanomedicine, and bioelectronic devices/ M. Hepel, C. J. Zhong. – New York: ACS Symposium Series, – 2012. – P. 81-117. 136. Radecka, H. Electrochemical Sensors and Biosensors Based on Self-Assembled Monolayers: Application of Nanoparticles for Analytical Signals Amplification H. Radecka, J. Radecki, I. Grabowska, K. Kurzątkowska // Functional nanoparticles for bioanalysis nanomedicine, and bioelectronic devices/ M. Hepel, C. J. Zhong. – New York: ACS Symposium Series, – 2012. – P. 293-312. 137. Law, W. C. Optically and magnetically doped organically modified silica nanoparticles as efficient magnetically guided biomarkers for two-photon imaging of live cancer cells / W. C. Law, K. T. Yong, I. Roy, G. Xu, H. Ding, E. J. Bergey // Journal of physical chemistry C. – 2008. – Vol. 112. – P. 7972-7980. 141 138. Sounderya, N. Use of core/shell structured nanoparticles for biomedical applications / N. Sounderya, Y. Zhang // Recent pathology and biomedical engineering. – 2008. – Vol. 1. – P. 34-42. 139. Long, N. V. Synthesis and characterization of Pt–Pd alloy and core-shell bimetallic nanoparticles for direct methanol fuel cells (DMFCs): Enhanced electrocatalytic properties of well-shaped core-shell morphologies and nanostructures / N. V. Long, T. D. Hien, T. Asaka, M. Ohtaki, M. Nogami // Journal of alloys and compounds. – 2011. – Vol. 509. – P. 7702-7715. 140. Wang, G. Synthesis, characterization and microwave absorption properties of Fe3O4/Co core/shell-type nanoparticles / G. Wang, Y. Chang, L. Wang, C. Liu // Advanced powder technology. – 2012. – Vol. 23. – P. 861-870. 141. Chen, Y. Enhanced stability and bioconjugation of photo-cross-linked polystyrene-shell, Au-core nanoparticles / Y. Chen, J. Cho, A. Young, T. A. Taton // Langmuir. – 2007. – Vol. 23. – P. 7491-7497. 142. Zhiguo, G. An ultrasensitive electrochemical biosensor for glucose using CdTeCdS core–shell quantum dot as ultrafast electron transfer relay between graphene-gold nanocomposite and gold nanoparticle / G. Zhiguo, Y. Shuping, L. Zaijun, S. Xiulan, W. Guangli, F. Yinjun, L. Junkang // Electrochimica acta. – 2011. – Vol. 56. – P. 9162-9169. 143. Lee, C. S. A novel fluorescent nanoparticle composed of fluorene copolymer core and silica shell with enhanced photostability / C. S. Lee, H. H. Chang, J. Jung, N. A. Lee, N. W. Song, B. H. Chung // Colloids and surfaces B: Biointerfaces. – 2012. – Vol. 91. – P.219-230. 144. Jenjob, S. Facile synthesis of silver immobilized-poly(methyl methacrylate)/ polyethyleneimine core-shell particle composites / S. Jenjob, T. Tharawut, P. Sunintaboon // Materials science and engineering C. – 2012. – Vol. 32. – P. 2068. 145. Mahdavian, A. R. Nanocomposite particles with core–shell morphology. An investigation into the affecting parameters on preparation of Fe 3O4-poly (butyl acrylate–styrene) particles via miniemulsion polymerization / A. R. Mahdavian, 142 Y. Sehri, H. S. Mobarakeh // European polymer journal. – 2008. – Vol. 44. – P. 2482. 146. Huang, Z. Morphology control and texture of Fe3O4 nanoparticle-coated polystyrene microspheres by ethylene glycol in forced hydrolysis reaction / Z. Huang, F. Tang, L. Zhang // Thin solid films. – 2005. – Vol. 471. – P. 105. 147. Lien, Y. H. Preparation and characterization of thermosensitive polymers grafted onto silica-coated iron oxide nanoparticles / Y. H. Lien, T.M. Wu // Journal of colloid and interface science. – 2008. – Vol. 326. – P.517. 148. Zhang, Q. Using a bifunctional polymer for the functionalization of Fe 3O4 nanoparticles / Q. Zhang, L. Luan, S. Feng, H. Yan, K. Liu // Reactive & functional polymers. – 2012. – Vol. 72. – P. 198. 149. Scott, R. W. J. Synthesis, characterization, and applications of dendrimerencapsulated nanoparticles / R. W. J. Scott, O. M. Wilson, R. M. Crooks // Journal of physical chemistry B. – 2005. – V. 109. – P.692. 150. Yan, F. Preparation of Fe3O4/polystyrene composite particles from monolayer oleic acid modified Fe3O4 nanoparticles via miniemulsion polymerization / F. Yan, J. Li, J. Zhang, F. Liu, W. Yang // Journal of nanoparticles research. – 2009. – Vol. 11. – P. 289. 151. Darwish, M. S. A. Magnetite core-shell nano-composites with chlorine functionality: preparation by miniemulsion polymerization and characterization / M. S. A. Darwish, S. Machunsky, U. Peuker, U. Kunz, T. Turek // Journal of polymer research. – 2011. – Vol. 18. – P. 79. 152. Vishnuvardhan, T. K. Synthesis, characterization and a.c. conductivity of polypyrrole/Y2O3 composites / T. K. Vishnuvardhan, V. R. Kulkarni, C. Basavaraja // Bulletin material science. – 2006. – Vol. 29. – P. 77-83. 153. Yan, H. Preparation and formation mechanism of nanocomposites with fluorescent and magnetic properties / H. Yan, J. C. Zhang, B. W. Yu, Y. Shen // Acta materialia. – 2010. – Vol. 58. – P. 726-733. 143 154. Chen, Y. Synthesis of glyconanospheres containing lumi-nescent CdSe−ZnS quantum dots / Y. Chen, T. Ji, Z. Rosenzweig // Nano letters. – 2003. – Vol. 3. –P. 581-584. 155. Landfester, K. Miniemulsion polymerization and the structure of polymer and hybrid nanoparticles / K. Landfester // Angewandte сhemie international edition. – 2009. – Vol. 48. – P. 4488-4507. 156. Antonietti, M. Polyreactions in miniemulsions / M. Antonietti, K. Landfester // Progress in polymer science. – 2002. – Vol. 27. – P. 689-757. 157. Behrend, O. Influence of continuous phase viscosity on emulsification by ultrasound / O. Behrend, K. Ax, H. Schubert // Ultrasonic sonochemistry. –2000. –Vol. 7. – P. 77-85. 158. Al-Ghamdi, G.H. Encapsulation of titanium dioxide in styrene/n-butyl acrylate copolymer by miniemulsion polymerization / G. H. Al-Ghamdi, E. D. Sudol, V. L. Dimonie, M. S. El-Aasser // Journal of applied polymer science. – 2006. – Vol. 101. – P. 3479-3486. 159. Dou, J. Magnetic nanoparticles encapsulated latexes prepared with photo-initiated miniemulsion polymerization / J. Dou, Q. Zhang, L. Jian, J. Gu // Colloid polymer science. – 2010. – Vol. 288. – P. 1751-1756. 160. Esteves, A. C. C. Polymer encapsulation of CdE (E = S, Se) quantum dot ensembles via in-situ radical poly-merization in miniemulsion / A. C. C. Esteves, A. Barros-Timmons, T. Monteiro, T. Trindade // Journal of nanoscience and. nanotechnology. – 2005. – Vol. 5. – P. 766-771. 161. Kobitskaya, E. Narrowly size distributed zinc-containing poly(acrylamide) latexes via inverse miniemulsion polymerization / E. Kobitskaya, D. Ekinci, A. Manzke, A. Plettl, U. Wiedwald, P. Ziemann, J. Biskupek, U. Kaiser, U. Ziener, K. Landfester // Macromolecules. – 2010. – Vol. 43. – P. 3294-3305. 162. Medeiros, S. F. Thermally-sensitive andmagnetic poly(N-vinylcaprolactam)based nanogels by inverse miniemulsionpolymerization / S. F. Medeiros, A. M. Santos, H. Fessi, A. Elaissari // Journal of colloid science biotechnology. – 2012. – Vol. 1. – P. 99-112. 144 163. Ladj, R. Polymer encapsulation of inorganic nanoparticles for biomedical applications / R. Ladj, A. Bitar, M. M. Eissa, H. Fessi, Y. Mugnier, R. Le Dantec, A. Elaissari // International journal of pharmaceutics. – 2013. – Vol. 458. – P. 230-241. 164. Stöber, W. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range / W. Stöber, A. Fink, E. Bohn // Journal of colloid and interface science. –1968. – Vol. 26. – P. 62-69. 165. Suri, S. Microparticles and nanoparticles / S. Suri, G. Ruan, J. Winter, C. E. Schmidt // Biomaterials Science (Third Edition) / Edited by: B. D. Ratner, A. S. Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons. Amsterdam: academic press, – 2013. 166. Помогайло, А. Д. Наночастицы металлов в полимерах / А. Д. Помогайло, А. С. Розенберг, И. Е. Уфлянд. – М: «Химия», 2000. – 672 с. 167. Бакеева, И. В. Cовременные нанокомпозитные материалы ― органонеорганические гибридные гели. Учебное пособие. / И. В. Бакеева, И. В. Морозова. – М: Издательско-полиграфический центр (ИПЦ МИТХТ), 2006. –40 с. 168. Лисичкин, Г. В. Химия привитых поверхностных соединений / Г. В. Лисичкин. – М.: Физматлит, 2003. –592 с. 169. Gorovits, B. M. New antibody technique using antibody immobilized on a membrane and a flow cuvette as reaction vessel / B. M. Gorovits, A. P. Osipov, A. M. Egorov // Journal of immunological methods. – 1993. – Vol. 157. – P. 11–17. 170. Cheng, Y. Amperometric tyrosinase biosensor based on Fe 3O4 nanoparticlescoated carbon nanotubes nanocomposite for rapid detection of coliforms / Y. Cheng, Y. Liu, J. Huang // Electrochimica acta. – 2009. – Vol. 54. – P. 2588-2594. 171. Shen, Z.-Q. QCM immunosensor detection of Escherichia coli O157:H7 based on beacon immunomagnetic nanoparticles and catalytic growth of colloidal gold / Z.-Q. Shen, J.-F. Wang, Z.-G. Qiu // Biosensors and bioelectronics. – 2011. – Vol. 26. – P. 3376-3381. 145 172. Lin, H. Detection of pathogen Escherichia coli O157:H7 with a wireless magnetoelastic-sensing device amplified by using chitosan-modified magnetic Fe3O4 nanoparticles / H. Lin, Q. Lu, S. Ge, Q. Cai // Sensors and actuators B. –2010. – Vol. 147. – P. 343-349. 173. US 20060292555 A1 Biofunctional magnetic nanoparticles for pathogen detection / Bing Xu, Pak Ho, Hongwei Gu. 28.12.2006. 174. Pearer D. R. Chapter 5 Laboratory diagnosis of viral infection. / D. R. Pearer, M. L. Landry // Handbook of Clinical Neurology Vol. 123 (3rd series) / Ed: A. C. Tselis, J. Booss. – Amsterdam: Elsevier, – 2014. – P. 123 -147. 175. Nenga, J. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) detection of multiple viral antigens using magnetic capture of SERS-active nanoparticles / J. Nenga, M. H. Harpster, W. C. Wilson, P. A. Johnson // Biosensors and bioelectronics. – 2013. – Vol. 41. – P. 316-321. 176. Белая, О. Ф. Специфическая лабораторная диагностика инфекционных заболеваний: достижения и перспективы / О. Ф.Белая // Справочник заведующего клинико-диагностической лабораторией. – 2011. – № 1. – С. 3-10. 177. Liu, Z. L. Synthesis and magnetic properties of Fe3O4 nanoparticles / Z. L. Liu, Y. J. Liu, K. L. Yao, Z. H. Ding, J. Tao, X. Wang // Journal of materials synthesis and processing. – 2002. – Vol. 10. – P. 83-87. 178. Sammakia, T. Highly diastereoselective ortho lithiations of chiral oxazoline substituted ferrocenes / T. Sammakia, H. A. Latham, D. R. Schaad // Journal of organic chemistry. – 1995. – Vol. 60. – P.10. 179. Delacote, C. Voltammetric response of ferrocene-grafted mesoporous silica / C. Delacote, J.-P. Bouillon, A. Walcarius // Electrochimica acta. – 2006. – Vol. 51. – P. 6373-6383. 180. Зимон, А. Д. Коллоидная химия / А. Д. Зимон. – М.: Агар, 2003. – 320 с. 181. Kumar, A. M. Electrochemical and in vitro bioactivity of polypyrrole/ceramic nanocomposite coatings on 316L SS bio-implants / A. M. Kumar, S. Nagarajan, 146 S. Ramakrishna, P. Sudhagar, Y. S. Kang, H. Kim, Z. M. Gasem, N. Rajendran // Materials science and engineering: C. – 2014. – Vol. 43. – P. 76–85. 182. Ramanavicius, A. Electrochemical formation of polypyrrole-based layer for immunosensor design / A. Ramanavicius, Y. Oztekin, A. Ramanaviciene // Sensors and actuators B: Chemical. – 2014. – Vol. 197. – P. 237-243. 183. Несмеянов, A. H. Химия ферроцена / A. H. Несмеянов. – М.: Наука, 1969. 184. Nel, A.E. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface / A. E. Nel, L. Mädler, D. Velegol, T. Xia, E. M. V. Hoek, P. Somasundaran, F. Klaessig, V. Castranova, M. Thompson // Nature materials. –2009. – Vol. 8. – P. 543-557. 185. Liu, L. Self-assembled cationic peptide nanoparticles as an efficient antimicrobial agent / L. Liu, K. Xu, H. Wang, P. K. Tan, W. Fan, S. S. Venkatraman, L. Li, Y. Y. Yang // Nature nanotechnologies. – 2009. – Vol. 4. – P. 457-463. 186. Razal, J. M. Wet-spun biodegradable fibres on conducting platforms: novel architectures for muscle regeneration / J. M. Razal, M. Kita, A. F. Quigley, E. Kennedy, S. E. Moulton, R. M. I. Kapsa, G. M. Clark, G. G. Wallace // Advanced functional materials. – 2009. – Vol. 19. – P. 3381-3388. 187. Brainina, K.Z. Hybrid electrochemical /magnetic assay for Salmonella typhimurium detection / K. Z. Brainina, A. N. Kozitsina, Y. A. Glazyrina // IEEE sensors journal. – 2010. – Vol. 10. – P. 1699-1704. 188. ГОСТ 31862-2012. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Отбор проб. – Введ. 2014-01-01. –М.: Стандартинформ, 2013. – 12 с. 189. Lei Z. A facile two-step modifying process for preparation of poly(SStNa)grafted Fe3O4/SiO2 particles / Z. Lei; Y. Li; X. Wei // Journal of solid state chemistry. – 2008. – Vol. 181. – P. 480-486. 190. Liu, Z.-M. Core-shell magnetic nanoparticles applied for immobilization of antibody on carbon past electrode and amperometric immunosensing / Z.-M. Liu, H.-F. Yang, Y.-F. Li, Y.-L. Liu, G.-L. Shen, R.-Q. Yu // Sensors and actuators B: Chemical. – 2006. – Vol. 113. – P. 956. 147 191. Nourani, S. Magnetic nanoparticle-based immunosensor for electrochemical detection of hepatitis B surface antigen / S. Nourani, H. Ghourchian, I. Boutorabi // Analytical biochemistry. – 2013. – Vol. 441. – P. 1-7. 192. Козицина, А.Н. Бесферментный электрохимический метод определения E.сoli с использованием нанокомпозитов Fe3O4 с оболочкой SiO2, модифицированной ферроценом / А. Н. Козицина, Н. Н. Малышева, И. А. Утепова, Ю. А. Глазырина, А. И. Матерн, Х. З. Брайнина, О. Н. Чупахин // Журнал аналитической химии. – 2015. – Т. 70. – № 5. – С. 1-7. 193. Козицина, А. Н. Синтез и исследование электрохимических превращений магнитных нанокомпозитов на основе Fe3O4 / А. Н. Козицина, Н. Н. Малышева, Е. В. Вербицкий, И.А. Утепова, Ю.А. Глазырина, Т. С. Митрофанова, Г. Л. Русинов, А. И. Матерн, О. Н. Чупахин, Х. З. Брайнина // Известия Академии наук. Серия химическая. – 2013. – № 1. – С. 2327-2336. 194. Малышева, Н.Н. Бесферментный электрохимический метод определения антигена вируса кори с использованием синтезированных конъюгатов IgG – (Fe3O4 – SiO2) в качестве сигналообразующей метки / Н. Н. Малышева, Ю. А. Глазырина, В. О. Ждановских, Т. С. Свалова, А. И. Матерн, А. Н. Козицина // Известия Академии наук. Серия химическая. – 2014. – № 7. – С. 1633-1638.
