Этиология и лабораторная диагностика пневмококковой инфекции
advertisement
Этиология пневмококковых инфекций и основные принципы лабораторной диагностики План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Исторические данные о пневмококке 1875 г. – Э. Клебс впервые описал наличие пневмококка в плевральной жидкости у пациентов с пневмонией 1881 г. – Л. Пастер и Дж. Стернберг независимо друг от друга зафиксировали фатальную септицемию у кроликов, вызванную пневмококком 1886 г. – микроорганизм был назван А. Френкелем пневмококком 1920г. – пневмококк получил название Diplococcus pneumoniae 1974. – микроорганизм получил современное название Streptococcus pneumoniae Медицинское значение возбудителя Группа Виды (подвиды) Истинные патогены III группа патогенности S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiae Условные патогены IV группа патогенности S. milleri, S. mitis, S. sangius S. dysgalactiae, S. gallinaceus, S. equi, S. massiliensis, S. iniae Оппортунистические виды (комменсалы?) IV группа патогенности S. australis, S. canis, S. cricetus, S.lactarius, S. mutans, S. downei, S. vestibularis, S. oligofermentans, S. oralis, S. porcinus, S. rattus, S salivarius, S. sangius, S. sinensis, S. gordonii, S. sobrinus, S. bovis, S. gallolyticus, S. parasanguis, S. infantarius, S. suis и др. Покровский В.И. с соавт., 2006 План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Фенотипическая характеристика Streptococcus pneumoniae Род - Streptococcus Грамположительный кокк сферической или овоидной формы По фенотипическим характеристикам относится к группе β-негемолитических стрептококков Факультативный анаэроб Некоторые виды для роста нуждаются в повышенном содержании СО2 Основой клеточной стенки является пептидогликан со встроенными углеводами, тейхоевые кислоты, липопротеины и поверхностные белки Характерно наличие мощной полисахаридной капсулы Фенотипическая характеристика Streptococcus pneumoniae Было показано, что во время инфекционного процесса капсула способствует нарушению фагоцитоза пневмококков полиморфноядернными лейкоцитами В зависимости от химического строения капсулы выделяют 46 серогруппы и 91 серотип Поверхностный капсулярный полисахарид Наличие капсулы – характеристика пневмококка, имеющая важное медицинское значение Капсула построена из повторяющихся олигосахаридных единиц, состоящих из 20-10 моносахаридов На синтез полисахарида капсулы влияет концентрации кислорода в среде Гены, кодирующие ферменты, необходимые для синтеза специфического полисахарида капсулы, имеют хромосомный контроль и фланкированы генами, общими для всех антигенов капсулы, которые принимают участие в регуляции и транспорте полисахаридов План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Генотипическая характеристика Streptococcus pneumoniae • В 2001 г. были опубликованы данные сиквенса генома двух штаммов пневмококков. • Первый штамм (TIGR4, 4-ый серотип) был изолирован в Норвегии из крови мужчины и являлся высоковирулентным для мышей [Tettelin H. et al., 2001]. • Второй штамм (R6) не обладал капсулой и был авирулентным [Hokins J.et al., 20001]. Генотипическая характеристика Streptococcus pneumoniae • Геном S. pneumoniae TIGR4В представляет собой одну кольцевую хромосому • Состоит из 2-2,2 млн. пар оснований и включает 2236 идентифицированных генов и 6 рРНК оперонов • Пневмококк относится к микроорганизмам с природной хромосомной трансформабельностью Генотипическая характеристика Streptococcus pneumoniae • Вследствие природной хромосомной трансформабельности геном S. pneumoniae «замусорен» генами чужеродного происхождения. • Выявлено 40 открытых рамок считывания, сходные с обнаруженными у грамотрицательных бактерий, но которые не найдены в геноме у других грамположительных микроорганизмов. Генотипическая характеристика Streptococcus pneumoniae • Некоторые гены кодируют факторы вирулентности, которые позволяют пневмококкам преимущественно размножаться в определенных тканях или вызывать инвазию [Silva N.A, et al., 2006; Pettigrew M.M, et al., 2006] План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Факторы вирулентности Streptococcus pneumoniae Классификация факторов вирулентности по основным группам 1.осуществляющие адгезию (9) 2.утилизирующие питательные вещества (37) 3.выполняющие функцию транспортеров протеаз (30) 4.ответственные за уклонение от защитных факторов хозяина (25) 5.с неизученными функциями (23) Факторы вирулентности Streptococcus pneumoniae (по Kadioglu A. et al., 2008, с изменениями и дополнениями) Колонизация верхних дыхательных путей Факторы Роль в колонизации Капсула Обеспечивает доступ к эпителиальной поверхности, препятствует опсонофагоцитозу ChoP Связывается с эпителием носоглотки CbpA (PspC) Связывается с секреторным Ig во время первого этапа транслокации через эпителий NanA, BgaA, StrH Последовательно отщепляют сахара из гликоконъюгатов, освобождая рецепторы для адгезии Hyl Расщепляет гиалуронан-содержащие компоненты внеклеточного матрикса. Pva Связывается с фибронектином Eno Lux-контролируемая система quorum-sensing Связывается с плазминогеном Образование биопленки Бактериоцин (пневмоцин) Ply PspA. LytA. PsaA PiaA PiuA NanA and NanB IgA Конкуренция в верхних дыхательных путях Небольшого молекулярно веса пептид, подавляющий других членов ниши Инфекции дыхательного тракта и пневмония Цитотоксин, который также активирует комплемент. В сублитических концентрациях широкий спектр воздействий на иммунную систему Предотвращает связывание С3 с поверхностью пневмококков; связывает лактоферин Расщепляет клеточную стенку, способствуя освобождению Ply Компонент ABC транспортной системы, которая принимает участие в устойчивости к оксидативному стрессу Компоненты ABC транспортной системы Способствуют колонизации, обнажая рецепторы для адгезии, модифицируют поверхность конкурирующих бактерий, занимающих одну нишу и/ил модифицируют функцию хозяина, расщепляя гликопротеины Расщепляет IgA1 человека Принятые сокращения: gaA, β-галактозидаза; CbpA, холинсвязывающий белок A; ChoP, фосфорилхолин; Eno, энолаза; Hyl, гиалуронидаза; IgA, IgA1 протеаза; IgA1, иммуноглобулин A1; LytA, аутолизин A; Nan, нейраминидаза; PavA, фактор адгезии и вирулентности A; PiaA, фактор связывания железа А; PiuA, фактор поглощения железа A; Ply, пневмолизин; PsaA, поверхностный антиген A; PspA, поверхностный белок A; StrH, β-N-ацетилглюкозаминидаза. План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae •На основании изучения химического состава полисахаридов капсулы и иммунологических реакций к настоящему времени выделено 94 серотипа пневмококков. •Близкие серотипы, имеющие наряду с типовыми межтиповые детерминанты, объединены в 47 серогрупп. •Серогруппы обозначают арабскими цифрами, а входящие в их состав серотипы – заглавными латинскими буквами. •Некоторые антигенные варианты не имеют близкородственных и представлены единственной серогруппой, которую называют серотипом Серотипы и серогруппы пневмококков Единственный серотип Серогруппы, содержащие Серотипы (он же серогруппа) близкие серотипы внутри серогрупп 6 6А, 6В, 6С, 6D 7 7F,7A,7B,7C 9 9N,9A,9L,9V 10 10F.10A 11 11 F,11 А, 11В, 11С, 11F, 11E 12 12F.12A 15 15F, 15A, 15B, 15C 17 17F. 17A 18 18F, 18A, 18B, 18C 19 19F, 19A, 19B, 19C 1 -5 8 13-14 16 20 продолжение Единственный серотип Серогруппы, содержащие Серотипы (он же серогруппа) близкие серотипы внутри серогрупп 22 22F.22A 23 23F,23A,23B 24 24F,24A,24B 28 28F.28A 32 32F.32A 33 33F,33A,33B,33C 35 35F,35A,35B,35C 41 41F,41A 47 47F.47A 21 25-27 29-31 34 36-40 42-46 48 Серотипы S. pneumoniae Частота встречаемости различных серотипов зависит от времени, локализации инфекции, возраста и географического местоположения Наиболее часто по всему миру инфекционный процесс вызывают около 20 серотипов пневмококка Существует закономерность между тяжестью пневмококковой инфекции и серотипом S. pneumoniae, вызывающим ее. Выявление серотиповой принадлежности штаммов пневмококка играет важную роль, т.к. наиболее часто встречающиеся серотипы включены в спектр действия современных пневмококковых вакцин Инвазивный потенциал возбудителя • Серотипы 6В, 14 и 23F в основном вызывают инвазивные пневмококковые инфекции во всех регионах мира и, как правило, несут маркеры устойчивости к антибиотикам • Они в меньшей степени взаимодействуют с другими микроорганизмами, в большей степени подвергаются селективному давлению антибиотиков, но при этом реже претерпевают генетическую изменчивость [Porat N. et al., 2001]. Носительство пневмококков (колонизация) - В России наиболее часто колонизируют носоглотку штаммы пневмококка серотипов 19F, 6B, 14 - В Беларуси наиболее часто колонизируют носоглотку штаммы пневмококка серотипов 3, 19F, 23F - В Украине наиболее часто колонизируют носоглотку штаммы пневмококка серотипов 3, 6B, 23F - В Италии - 3, 19F, 23F, 19A, 6B, и 14 Научный отчет НИИАХ, 2011-2012 гг Streptococcus pneumoniae.O'Brien KL, Nohynek H, World Health Organization Pneumococcal Vaccine Trials Carraige Working Group. Pediatr Infect Dis J. 2003 Feb; 22(2):133-40. Острые средние отиты (ОСО) - В России наиболее часто вызывают ОСО штаммы пневмококка серотипов 19А, 19F, 3 - В Беларуси наиболее часто вызывают ОСО штаммы пневмококка серотипов 6B и 19F - В Украине – серотипы 3, 9V, 19A, 19F - Наиболее частыми серотипами пневмококка, вызывающими ОСО у детей в Европе и США являются 19F, 23F, 14, 6B, 3 Hausdorff WP et al. Multinational study of pneumococcal serotypes causing acute otitis media in children. Pediatr Infect Dis J. 2002 Nov;21(11):1008-16 Научный отчет НИИАХ 2011-2012 гг. Внебольничные пневмонии - В России наиболее часто внебольничные пневмонии вызывают штаммы пневмококка серотипов 19F, 6B, 23F, 19A, 14 - В Беларуси – серотипы 6B, 19F, 20, 23F - В Украине наиболее часто детектировались серотипы 19F, 7, 3 - Согласно данным исследований, проведенных в Европе и США наиболее часто вызывают внебольничные пневмонии штаммы пневмококка серотипов 19F, 2F3, 14, 1, 5, 6B и 3 Научный отчет НИИАХ, 2013 г. Р.С. Козлов, А.Н. Чагарян, Л.В. Козлова, А.А. Муравьёв. Cерологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской Федерации. Клин Микробиол Антимикроб Химиотер. 2011; 13(2):177-187 Инвазивные формы пневмококковой инфекции - В России наиболее часто детектируются штаммы пневмококка серотипов 19А, 19F, 23А и 1 - В Беларуси – серотипы 20, 19, 23 и 11 - В Украине наиболее часто вызывают ИИ штаммы серотипов 19 и 23 - В США - 1, 5, 6A, 6B, 7F, 12F, 15B, 15C, 19A, 19F, и 23F Научный отчет НИИАХ, 2011-2012 гг Jaime Inostroza et al. Influence of Patient Age on Streptococcus pneumoniae Serotypes Causing Invasive Disease. Clin Diagn Lab Immunol. 2001 May; 8(3): 556– 559. План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Материал для бактериологической диагностики пневмококковых инфекций - кровь спинномозговая жидкость плевральная жидкость аспираты из околоносовых синусов аспираты из среднего уха мокрота* др. *При поступлении мокроты следует обратить особое внимание на оценку качества доставленного образца. Критерии качества: наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре, как минимум, 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму. 75 % 75 % полученной мокроты пригодно для микробиологического исследования 60 % В 60 % случаев можно обнаружить рост этиологически значимых микроорганизмов 30 % В итоге только у 30% пациентов можно получить предполагаемую культуру возбудителя План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Принципы выделения пневмококка из клинического материала 1) Использование приемлемых питательных сред – искусственных высокого содержания аминного азота и нативного белка животного происхождения 2) Наличие в среде дефибринированной крови (сыворотки крови животных (лошади, барана) 3) Инкубация в атмосфере с повышенным содержанием CO2 План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Принципы идентификации S. pneumoniae - Морфологические особенности роста - Фенотипические характеристики - чувствительность к оптохину - растворимость в присутствии солей желчи - набор биохимических реакций - Антигенная структура Морфологические особенности роста колоний S. pneumoniae - характерен α-гемолиз – зеленое окрашивание агара вокруг колоний - сероватый оттенок колоний - выпуклая поверхность и влажная «сметанообразная» консистенция - при длительной инкубации (48 часов) центральная часть колонии может опускаться, давая характерную блюдцеобразную форму Колонии S. pneumoniae на кровяном агаре Козлов Р.С., 2013 Тест с оптохином Принцип: Рост S. pneumoniae ингибируется 5 мкг оптохина, содержащегося в диске, помещенном на поверхность кровяного агара Интерпретация: Отсутствие роста в зоне > 14 мм (диск 6 мм) > 16 мм (диск 10 мм) интерпретирует культуру как S. pneumoniae Козлов Р.С., 2013 Тест лизиса S. pneumoniae Принцип: - Соли желчи обладают способностью избирательно лизировать колонии S. pneumoniae на агаре или бульоне. - Метод основан на активации пневмококковых аутолизинов – ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки. - Соли желчных кислот активирую аутолизины большинства штаммов, что приводит к визуальному лизису S. pneumoniae в течение 0,5-2 часов. Тест лизиса S. pneumoniae Процедура: суспендировать культуру в 1-2 мл Ф.Р. разделить на 2 пробирки пробирка I – 3-4 капли р-ра Na дезоксихолата пробирка II – 3-4 капли Ф.Р. инкубировать 3—120 мин при 350 С Интерпретация: пробирка I «тест» - просветление пробирка II «контроль» - нет просветления Тестируемая культура - S. pneumoniae Альтернативные методы идентификации - Серологический - основан на выявлении пневмококковых полисахаридных антигенов с использованием поливалентной специфической пневмококковой сыворотки. - ПЦР - основан на выявлении выявлении фрагментов специфических генов, кодирующих ферменты аутолизин (lytA), пневмолизин (ply), поверхностные белки клеточной стенки (PspA, PsaA) и др. План • Общая характеристика Streptococcus pneumoniae – – – – Фенотипическая характеристика Генотипическая характеристика Факторы вирулентности Серотиповой пейзаж S. pneumoniae • Принципы лабораторной диагностики – Материал для лабораторной диагностики – Принципы выделения пневмококка из клинического материала – Принципы идентификации пневмококков – Определение серотиповой принадлежности Определение серотиповой принадлежности S. pneumoniae Метод основан на отличии строения капсулы пневмококка Серотипирование проводится с помощью групповых диагностических сывороток (например, PNEUMOTEST LATEX). Образование крупных хлопьев на фоне полного просветления агглютинационного поля указывает на положительную реакцию специфического взаимодействия Козлов Р.С., 2013 PNEUMOTEST-LATEX kit Сыворотки PNEUMOTEST-LATEX Определение серотиповой принадлежности S. pneumoniae * - серотипы, входящие в 7-валентную конъюгированную пневмококковую вакцину (Prevnar 7) # - серотипы, входящие в 10-валентную конъюгированную пневмококковую вакцину (Synflorix) ◊ - серотипы, входящие в 13-валентнуб конъюгированную пневмококковую вакцину (Prevnar 13) Выводы • • • • S. pneumoniae в зависимости от локализации инфекционного процесса можно выделить из многих сред организма. Для выделения S. pneumoniae необходимо соблюдать ряд условий – использование специализированных сред и инкубация в атмосфере с повышенным содержанием CO2 Для идентификации S. pneumoniae необходимо учитывать морфологическую особенность роста, фенотипические характеристики, а также антигенную структуру возбудителя. Для определения серотиповой принадлежности пневмококка используется метод латекс-агглютинации, метод ПЦР.
