АВТОРЕФЕРАТ Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты Streptococcus
advertisement
На правах рукописи Белодед Андрей Васильевич Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus Специальность: 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2008 г. Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева и в ГУ научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Научный руководитель: кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семенович Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Самойленко Игорь Иннокентьевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Складнев Дмитрий Анатольевич доктор биологических наук, вед. научн. сотр. Михальчик Елена Владимировна Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ). Защита состоится 21 октября 2008 г. в 10.30 часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории 443 (конференц-зал), тел. (499) 978-74-66. С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева. Автореферат диссертации разослан ___ сентября 2008 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета Шакир И.В. 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Прогресс в понимании биологических функций гиалуроновой кислоты (ГК) [Toole, 2000] привел и, безусловно, еще приведет к расширению сфер применения данного гликозаминогликана в составе различных медицинских, косметических, ветеринарных препаратов и дальнейшему увеличению спроса на биополимер. При этом уже сейчас наблюдается определенный дефицит ГК высокой и относительно небольшой молекулярной массы, что отражается на высокой цене этого полисахарида, особенно по сравнению с аналогичными соединениями растительного, животного или микробного происхождения. В последнее время появляется все больше сведений о размероспецифичности биологических функций и свойств ГК [McKee et al., 1996; Horton et al., 1998, 1999; Ohkawara et al., 2000]: препараты ГК различной молекулярной массы стимулируют ангиогенез или проявляют антиангиогенные и противовоспалительные свойства, обладают иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. Полисахарид, фракционированный по молекулярной массе, может найти разнообразное применение в медицине, ветеринарии, косметологии, поэтому работы по совершенствованию методов получения ГК и препаратов из ее отдельных фракций с заданной молекулярной массой имеют большое научное и практическое значение. Традиционный способ получения ГК основан на экстракции биополимера из различных органов млекопитающих и птиц, например, из стекловидного тела глаза крупного рогатого скота, гребней кур или пупочных канатиков новорожденных. Даже при беглом анализе животных источников ГК видно, что сырьевая база промышленного получения данного полисахарида весьма ограничена и не может полностью удовлетворить постоянно растущий спрос на ГК. Кроме того, выделение ГК из животного сырья часто осложняется тем, что в тканях и органах млекопитающих и птиц биополимер находится в комплексе с белками; присутствие родственных гликозаминогликанов также затрудняет выделение ГК. Этих недостатков лишен биотехнологический способ получения ГК, основанный на культивировании микроорганизмов-продуцентов ГК. Сырьем для получения полисахарида микробиологическим синтезом являются доступные соединения и компоненты: глюкоза, дрожжевой экстракт (ДЭ), минеральные соли и т. п. Производство ГК на основе микробиологического синтеза не зависит от поставок животного сырья, а также легко масштабируется и перепрофилируется в случае изменения конъюнктуры рынка. В силу данных причин можно полагать, что биотехнологическое производство постепенно будет вытеснять получение ГК методом традиционной экстракции из животного сырья. Следует отметить, что в настоящее время биотехнологическое производство ГК в России отсутствует. Отечественная ГК представлена препаратами, полученными экстракцией из гребней кур, а объем производимой ГК не удовлетворяет внутреннему спросу, что приводит к зависимости от импорта биополимера. Поэтому исследование процессов синтеза и деградации ГК микроорганизмами может лечь в основу создания биотехнологического производства ГК в России. Цель исследований. Изучить физиологические и биохимические аспекты метаболизма (биосинтеза и деградации) ГК бактериями р. Streptococcus, а также раз2 работать научные основы управляемого культивирования и оптимизировать процесс микробиологического синтеза ГК штаммом-продуцентом, подобрав питательную среду, физико-химические условия и режимы культивирования. Исследовать процесс ферментативной деполимеризации ГК стрептококковыми гиалуронатлиазами для получения фракций полисахарида с заданной молекулярной массой и анализа ГК в биопробах сложного состава. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Методом индуцированного мутагенеза получить высокопроизводительный штамм-продуцент ГК. 2. Произвести выбор среды для культивирования штамма-продуцента ГК, оптимизировать состав среды и физико-химические условия культивирования с целью увеличения выхода ГК. 3. Исследовать связь синтеза ГК с физиологическим состоянием культуры микроорганизмов и выявить возможные механизмы регуляции синтеза ГК. Изучить влияние степени аэрации ферментационной среды на биосинтез ГК. 4. Исследовать кинетику деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. Разработать метод получения препаратов ГК различной молекулярной массы, подобрав оптимальные условия проведения деполимеризации как для получения ГК низкой молекулярной массы, так и для осуществления полного гидролиза ГК. 5. Разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные сопутствующие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. Научная новизна работы. 1. Установлено, что потеря капсул, состоящих из ГК, штаммом Streptococcus equi subsp. zooepidemicus В-8014 на поздней экспоненциальной и стационарной фазах культивирования происходит вследствие проявления штаммом гиалуронатлиазной активности. Этим же явлением объясняется снижение концентрации ГК в культуральной жидкости (КЖ) и “немукоидный” характер колоний, формируемых штаммом на агаризованной среде. УФ-индуцированным мутагенезом получен штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся стабильностью формируемых капсул и мукоидной морфологией колоний. 2. Выявлено влияние основных компонентов предложенной питательной среды (источника углерода, азота, фосфора, солей органических и неорганических кислот) на биосинтез ГК. Обнаружено, что наибольшее отрицательное влияние на биосинтез ГК бактериями S. equi subsp. zooepidemicus оказывают ионы Mg2+. 3. Показано, что улучшение аэрации ферментационной среды способствует увеличению удельного выхода ГК, что связано, по-видимому, с окислением избыточных восстановительных эквивалентов NADH2, образующихся в процессе биосинтеза ГК и затрудняющих ее дальнейший синтез, а также нарушающих окислительновосстановительный баланс молочнокислого брожения. 4. Исследована кинетика деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, которая вызвана частичным автопротеолизом фермента. Предложен способ получения препаратов ГК различной 3 молекулярной массы, используя метод ферментативной деполимеризации ГК. Разработан метод определения ГК в сложных биологических образцах, содержащих мешающие примесные биополимеры со сходной с ГК структурой, основанный на ВЭЖХ продуктов энзиматической деградации ГК. Практическая значимость работы. 1. Впервые в России методом микробиологического синтеза получены препараты ГК. В качестве продуцентов биополимера использовались бактерии р. Streptococcus, обладающие естественной способностью к биосинтезу данного гликозаминогликана. Штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, полученный УФиндуцированным мутагенезом родительского штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014, характеризуется стабильностью образуемых капсул на всем протяжении культивирования. Концентрация ГК в КЖ S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04 превышает концентрацию, достигаемую при культивировании штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014 в аналогичных условиях, в 3 – 5 раз. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования позволила многократно увеличить выход ГК. 2. Исследование кинетики деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой позволило предложить схему проведения ферментативной реакции, позволяющую добиться практически полной деполимеризации ГК, что, в свою очередь, позволило разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные мешающие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК. 3. Методом энзиматической деполимеризации получены препараты ГК различной молекулярной массы. Показано, что вискозиметрия может использоваться для наблюдения за ходом расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, поскольку падение вязкости растворов и уменьшение молекулярной массы ГК хорошо коррелируют. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: 15th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis (Флоренция, 2004 г.); международных конференциях “Успехи в химии и химической технологии” (Москва, 2004 г.; Москва, 2005 г.); III и IV Московских международных Конгрессах “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2005 г.; Москва, 2007 г.); VI научно-практической конференции “Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии” (Москва, 2006 г.); Всероссийской научно-технической конференции “Наука-производство-технологии-экология” (Киров, 2008 г.). Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 7 материалов докладов. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 302 наименований. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста и содержит 55 рисунков, 13 таблиц. 4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 1. Объекты и методы исследования Штамм-продуцент ГК. В работе использован штамм S. equi subsp. zooepidemicus (S. zooepidemicus) B-8014 (ATCC 39920) из коллекции ВКПМ ФГУП “ГосНИИгенетика”. Данный штамм обладает естественной способностью к синтезу ГК, не проявляет гемолитической активности, является аттенуированным штаммом IV группы патогенности, не способным в норме вызывать заболевания человека, что и послужило основанием для его выбора в качестве объекта исследования. Стрептококковая гиалуронатлиаза представляет собой очищенный, лиофильно высушенный ферментный препарат, полученный при культивировании Streptococcus pneumoniae, производства филиала “МедГамал” ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Глубинное культивирование S. zooepidemicus осуществляли (а) в стеклянных колбах без отбойников на 100 мл с ватно-марлевыми пробками на качалке “New Brunswick” G10 при скорости вращения платформы 150 об/мин и температуре 37 °C. Аэрацию регулировали степенью заполнения колб питательной средой. (б) В лабораторном биореакторе на 10 л с обечайкой из стекла, (в) в лабораторном биореакторе на 1,5 л с обечайкой из стекла. Культивирование в ферментерах осуществляли при температуре 37 °С с автоматическим контролем рН среды подачей стерильного 10 % раствора NaOH. Для культивирования применяли различные среды: МПБ, L-бульон, модифицированная среда MRS [Нетрусов и др., 2005]. При культивировании в ферментере добавлялся пеногаситель структол (0,02 % от рабочего объема). Объем посевного материала культуры, находящейся в конце экспоненциальной фазы роста, составлял 5 % от объема среды. Ферментативную реакцию деполимеризации ГК проводили следующим образом. Гиалуронат натрия в количестве, учитывающем необходимое содержание ГК, растворяли при температуре 80 °C в 0,05 М ацетатном буфере рН 5,5 с содержанием 10 мМ CaCl2*6H2O и 14,5 мM NaCl в конечном растворе. Охлаждали до 38 °C и добавляли фермент в виде раствора в том же ацетатном буфере до содержания белка 0,08 мг/мл в конечном растворе. За ходом реакции следили 1 – 24 часа с помощью вискозиметрической, спектроскопической и хроматографической техник. ГК определяли по реакции глюкуроновой кислоты с карбазолом [Bitter et al., 1962] и по реакции N-ацетилглюкозамина с реактивом Моргана – Элсона [Reissig et al., 1955]. Молекулярную массу ГК определяли вискозиметрическим методом по уравнению Марка-Хаувинка: М = ([η]/K)1/α, (1) где [η] – характеристическая вязкость ГК, мл/г; М – средневязкостная молекулярная масса ГК, Да; К и α – константы Марка-Хаувинка (для раствора ГК в 0,1 М растворе NaCl при 25 ºС К = 0,016, α = 0,841 [Armstrong et al., 1995]). Микробиологические методы исследований. Окраска капсул осуществлялась по методу Омелянского [Нетрусов и др., 2005]. Определение размеров клеток и капсул, характера гемолиза, способности расти в присутствии NaCl, способности сбраживания углеводов и другие микробиологические, физиологические и биохимические тесты исполнялись по стандартным методикам [Нетрусов и др., 2005]. 5 Глава 2. Биосинтез ГК культурой S. zooepidemicus Кинетика роста и синтеза ГК штаммом S. zooepidemicus В-8014 Наибольшее количество работ, связанных с 1 биосинтезом ГК бакте2 8 риями р. Streptococcus, 5 1,5 6 указывает на постоянный характер образования ГК 1 4 4 3 в ходе периодического культивирования, которое 0,5 2 коррелирует с ростом 2 биомассы. На рис. 1 пред0 0 ставлены кривые роста и 0 5 10 15 20 25 30 синтеза ГК и иных метаВремя, ч. болитов штаммом S. Рис. 1. Глубинное периодическое культивирование штамма S. zooepidemicus В-8014 на zooepidemicus В-8014 на сложной питательной среде № 5. 1 – среде № 5 (глюкоза 10 г/л, кривая роста культуры (здесь и далее биомасса выражена че- ДЭ 10 г/л, пептон 5 г/л, рез единицы оптической плотности бактериальной суспензии триптон 5 г/л, NaCl 2 г/л, при длине волны 540 нм); 2 – кривая биосинтеза ГК; 3 – об- K2HPO4 1 г/л, MgSO4 0,1 щая гиалуронидазная активность (ОГА) бактериальной сус- г/л) при глубинном пепензии; 4 – кривая потребления глюкозы; 5 – кривая накопления молочной кислоты (МК). ОГА [мПа*с/мин] выражена риодическом культивирокак скорость падения вязкости раствора 5,0 мг/мл высокомо- вании в биореакторе. Характер кривой рослекулярной (1100 кДа) ГК в ходе ее деполимеризации суспензией клеток в стандартных условиях. та культуры – типичная для роста микроорганизмов S-образная кривая. В ходе всего культивирования из продуктов катаболизма глюкозы образуется преимущественно молочная кислота, что вызывает падение рН с 7,4 до 4,3 – 4,4. ГК в концентрациях, превышающих вносимые с инокулятом, начинает обнаруживаться в КЖ на стадии экспоненциального роста культуры. По ходу всей логарифмической фазы концентрация ГК растет, достигая значения 0,65 мг/мл, однако уже в ходе фазы замедленного роста концентрация ГК в КЖ перестает расти и даже снижается до 0,5 мг/мл. Экономический коэффициент Рис. 2. Микрофотография препарата ферментации составил 0,2 г/г; экономичештамма S. zooepidemicus B-8014 (нега- ский коэффициент по продукту (ГК) на 24 тивное окрашивание тушью) на 24 час час культивирования составил 0,077 г/г. культивирования в аэробных условиях. Микроскопия препаратов бактерий на Клетки микроорганизмов указаны различных стадиях глубинного аэробного стрелками. Увеличение 10х100. 10 Глюкоза, МК, мг/мл Биомасса; ОГА, мПа*с/мин; ГК, мг/мл 2,5 6 культивирования с окрашиванием капсул по Омелянскому показала, что штамм S. zooepidemicus В-8014 характеризуется наличием слабовыраженных капсул, истончающихся по ходу культивирования и полностью исчезающих на стационарной фазе роста культуры (рис. 2). Снижение концентрации ГК в КЖ и истончение капсул клеток S. zooepidemicus В-8014 может быть связано с синтезом микроорганизмами фермента гиалуронатлиазы (бактериальной гиалуронидазы). Проведенные исследования ферментативной активности культуры микроорганизмов на разных фазах роста показали, что штамм S. zooepidemicus В-8014 обладает заметной гиалуронидазной активностью, проявляемой в самом конце экспоненциальной фазы роста культуры, что совпадает по времени с уменьшением концентрации ГК в КЖ (рис. 1). При этом на стационарной фазе ферментативная активность бактериальной суспензии довольно быстро снижается, что позволяет говорить о том, что индукция фермента начинается в фазе замедления роста и прекращается с выходом культуры на стационар, после чего происходит инактивация фермента. Получение мукоидных штаммов S. zooepidemicus При высеве на МПА штамма S. zooepidemicus В-8014 на 24 час инкубирования при 37 °С были получены однотипные небольшие круглые колонии (диаметром 1 – 2 мм) с фестончатым краем и с нетипичной для продуцентов ГК “немукоидной” морфологией: шероховатой матовой поверхностью, невязкой консистенцией. Это, также как и отсутствие выраженных капсул при микроскопировании с негативным окрашиванием (рис. 2), свидетельствовало о низком уровне образования ГК клетками S. zooepidemicus В-8014. Для того чтобы получить мукоидные мутанты S. zooepidemicus, характеризующиеся повышенной секрецией ГК, исходный штамм В-8014 было решено подвергнуть мутагенному воздействию жесткого УФ (λ = 254 нм) с последующей селекцией штаммов, колонии которых отличались бы типичной мукоидной морфологией: крупными размерами, глянцевой поверхностью, вязкой, слизистой структурой. Всего в 20 сериях экспериментов по УФ облучению суспензий клеток S. zooepidemicus В8014 после высева на МПА было исследовано более 30 тысяч колоний, что позволило отобрать 8 Рис. 3. Микрофотография препарата штамма S. zooepidemicus КБ- мутантных штаммов мукоидного типа. Наиболее 04 (негативное окрашивание ту- стабильным в отношении сохранения мукоидной шью) на 24 час культивирования морфологии колоний оказался штамм S. zooepiв аэробных условиях. Хорошо demicus, обозначенный КБ-04. Для выявления видны массивные капсулы, окру- особенностей полученного мукоидного штамма S. жающие цепочки клеток больzooepidemicus КБ-04 были проведены серии эксшим светлым ореолом. Увеличепериментов по сравнению морфологических, финие 15х100. зиологических и биохимических характеристик штаммов S. zooepidemicus В-8014 и КБ-04. Результаты этих исследований продемонстрированы на рис. 3, 4 и сведены в табл. 1. 7 Табл. 1. Сравнение некоторых морфологических, физиологических и биохимических характеристик штаммов S. zooepidemicus В-8014 и КБ-04. Характеристики Штаммы S. zooepidemicus В-8014 S. zooepidemicus КБ-04 Описание колоний, формируемых штаммами на МПА за 24 часа инкубирования Цвет бежевый бежевый Диаметр 1 – 1,5 мм 4 – 4,5 мм Поверхность матовая, слабошероховатая глянцевая, гладкая Края фестончатые ровные Профиль выпуклый выпуклый Консистенция невязкая вязкая Описание препаратов с окрашиванием капсул на 24 час культивирования % капсулированных клеток 1–2 70 ±10 Толщина капсулы за пределами измерительной 2 – 4 мкм способности микрометра Физиологические особенности штаммов при культивировании в жидкой питательной среде Достигаемая оптическая 2,1 2,2 плотность культуры на длине волны λ = 540 нм при культивировании на среде №5 Конечный рН ферментаци4,36 ± 0,05 4,40 ± 0,05 онной среды Устойчивость к рН 9,5 – – Устойчивость к прогрева– – нию при 60 °С в течение 20 мин Гемолиз – – Биохимические особенности штаммов Сбраживание углеводов: Мальтоза + + Лактоза – – Сахароза + + Сорбитол – – Глицерин – – Манитол – – Синтез ГК + + Качественные реакции на ГК, проводимые с выделенным полисахаридом: Реакция преципитации с + + раствором БСА в ацетатном буфере Реакция на глюкуроновую + + кислоту Реакция на N+ + ацетилглюкозамин “–” – признак отсутствует; “+” – признак выражен 8 А Б В Г Рис. 4. Морфология колоний штаммов S. zooepidemicus В-8014 (А и В) и S. zooepidemicus КБ-04 (Б и Г) при посеве на МПА штрихом (А и Б) и методом Коха (В и Г). Биомасса; ГК, мг/мл; ОГА, мПа*с/мин Анализ гиалуронидазной активности суспензии клеток штамма S. zooepidemicus КБ-04 на разных фазах культивирования однозначно показал ее отсутствие (рис. 5). При сравнении рис. 1 и рис. 5 видно, что штамм S. zooepidemicus КБ-04 по характеру роста сущест2,5 венно не отличается от 1 исходного штамма В2 8014, но при этом, повидимому за счет отсут1,5 ствия гиалуронидазной 2 активности, снижения 1 скорости синтеза или па0,5 дения концентрации ГК 3 на пред- и стационарной 0 фазах культивирования не 0 10 20 30 происходит. КонцентраВремя, ч. ция ГК при культивироРис. 5. Глубинное периодическое культивирование штамма S. вании на среде № 5 достиzooepidemicus КБ-04 на среде № 5. 1 – кривая роста культуры; гает 1,6 мг/мл, что почти в 2 – кривая биосинтеза ГК; 3 – ОГА бактериальной суспензии. 3 раза выше, чем у исходного штамма. Экономиче9 Биомасса; ГК, мг/мл Остаточное содержание глюкозы, г/л ский коэффициент ферментации составил 0,2 г/г; экономический коэффициент по продукту (ГК) составил 0,2 г/г. Таким образом, методом УФ-индуцированного мутагенеза удалось получить стабильный штамм-продуцент ГК, отличающийся от исходного штамма S. zooepidemicus В-8014 отсутствием гиалуронидазной активности и характеризующийся наличием выраженных капсул из ГК, не исчезающих по ходу культивирования, мукоидной морфологией колоний на МПА и большим выходом ГК при культивировании в периодических условиях. Оптимизация состава питательной среды и режимов культивирования S. zooepidemicus КБ-04 На первом этапе исследования влияния состава питательной среды на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04 по методу Плакетта-Бурмана были выявлены значимые компоненты среды MRS, оказывающие наиболее существенное влияние на синтез ГК. Причем установлено, что ДЭ, пептон, триптон, К2HPO4, MnSO4 положительно влияют на синтез ГК, а ацетат натрия и MgSO4 – отрицательно. Дальнейшую оптимизацию питательной среды и режима культивирования было решено проводить по методу раздельной оптимизации каждого фактора при постоянном фоне. Культивирование осуществлялось в колбах на 100 мл (заполнение средой 35 мл) с ватными пробками. По ходу культивирования и через 24 часа инкубирования при постоянном перемешивании на качалке и термостатировании при 37 °С анализировалось содержание ГК, биомассы микроорганизмов, а также остаточное содержание сахаров и рН, если это было необходимо. Исследование влияния концентрации глюкозы на рост культуры и биосинтез ГК проводилось путем варьирования начального содержания глюкозы в питательной среде от 0 до 4,5 50 75 г/л. Результаты экспе45 4 риментов представлены 1 40 3,5 на рис. 6. Оптимальная 35 3 для роста микроорга30 2,5 низмов начальная кон25 2 2 20 центрация глюкозы в пи1,5 15 тательной среде состав1 10 ляет 15 – 20 г/л. При та3 0,5 5 ком начальном содержа0 0 нии глюкозы еще сохра0 20 40 60 80 няется линейная зависиГлюкоза, г/л мость между концентраобразовавшейся Рис. 6. Зависимость выхода биомассы, концентрации ГК и ос- цией таточного содержания глюкозы в КЖ штамма S. zooepidemicus биомассы и потребленКБ-04 от начального содержания глюкозы в питательной сре- ного субстрата: эконоде. 1 – оптическая плотность бактериальной суспензии; 2 – мический коэффициент концентрация ГК; 3 – остаточная концентрация глюкозы. равен 0,2 г/г (рис. 7). С ростом начальной концентрации глюкозы в среде экономический коэффициент по продукту постепенно снижается (рис. 7), и, хотя выход ГК и увеличивается вплоть до концентрации глюкозы 25 г/л (рис. 6), но на каждый следующий потреб10 = 4, M 1 g2 + = 41 C a2 + = C 0 a2 + M = g2 9, C + 0 a2 = 4, + 1 M = g2 45 C a2 + = + 41 = 9, C 0 a2 + = 45 + M g2 M g2 + = 0 Биомасса; ГК, мг/мл Экономический коэффициент, г/г ленный грамм глюкозы синтезируется все меньше полисахарида. Максимумы зависимостей выхода био0,35 массы и концентрации ГК от концентрации 0,3 глюкозы в питательной 0,25 среде практически сов1 падают. Дальнейшее 0,2 увеличение начальной 0,15 2 концентрации глюкозы 0,1 в питательной среде ведет к ингибированию 0,05 роста культуры микро0 организмов и уменьше0 20 40 60 80 нию выхода ГК. Это Глюкоза, г/л проявляется в снижеРис. 7. Зависимость экономического коэффициента (1) и эконо- нии удельной скорости мического коэффициента по продукту (2) от начальной концен- роста культуры, выхода трации глюкозы в питательной среде. биомассы и уменьшении экономического коэффициента. Количество недоутилизированной глюкозы при этом резко возрастает, а концентрация ГК в ферментационной среде снижается (рис. 6). Влияние катионов двухвалентных металлов на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. Предполагается, что оперон синтеза ГК входит в группу генов, определяющих па2,5 тогенность бактерий р. 2 Streptococcus. Для стрептококков группы 1,5 ГК А вероятным эффектоБиомасса 1 ром экспрессии данных генов являются ионы 0,5 Mg2+ [Gryllos et al., 0 2003]. Возможно, что катионы Mg2+ являются эффекторами сенсорнорегуляторной системы, подавляющей экспрессию генов синтеза ГК и Рис. 8. Влияние ионов двухвалентных металлов (Mg2+ и Са2+) на у стрептококков групрост культуры и синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. По пы С, к которым отнооси абсцисс отложена концентрация вводимых в питательную сится S. zooepidemicus. среду ионов Mg2+ и Са2+ в ммоль/л. Для выявления количественной зависимости влияния ионов двухвалентных металлов на синтез ГК было проведено исследование, в котором рост штамма S. zooepidemicus КБ-04 и биосинтез ГК оценивались при различных концентрациях ионов Mg2+ и Ca2+ в питательной среде № 5. Результаты представлены на рис. 8. 11 Высокие концентрации дополнительно вводимых в питательную среду ионов Mg оказывали ингибирующее воздействие на синтез ГК, частично снимающееся присутствием в среде ионов Са2+. Сами катионы Са2+ не оказывали достоверно различимого влияния на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. На выход биомассы изменение концентрации в питательной среде солей MgSO4*7Н2О и СаСl2*6Н2О практически не влияло. Исключение составляет случай совместного присутствия солей в максимальных исследованных концентрациях (10 г/л MgSO4*7Н2О и 10 г/л СаСl2*6Н2О). Влияние аэрации ферментационной среды на синтез ГК. ГК как фактор защиты от токсического действия кислорода. Бактерии р. Streptococcus осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Особенностью метаболизма S. zooepidemicus является то, что при биосинтезе ГК образуются дополнительные восстанови6 тельные эквиваленты в 5 форме НАДН2, что на4 рушает окислительно3 востановительный баланс метаболизма. Это 2 могло бы существенно 1 затруднить дальнейший 0 синтез ГК. В аэробных условиях избыточные восстановительные эквиваленты НАДН2 Объем среды окисляются молекулярБиомасса ГК ОСТ Глюкоза ным кислородом с поРис. 9. Влияние аэрации ферментационной среды на рост куль- мощью НАДНтуры S. zooepidemicus КБ-04, биосинтез ГК и остаточную кон- оксидазы, поэтому центрацию глюкозы (ОСТ глюкоза) при культивировании в можно предположить, аэробных и анаэробных условиях. что оптимальная аэрация ферментационной среды будет существенно влиять на биосинтез ГК. Исследование влияния аэрации на синтез ГК культурой S. zooepidemicus проводились в колбах на 100 мл с различным заполнением питательной средой (от 5 до 70 мл), что моделировало различную степень аэрации (для проведения процесса в анаэробных условиях использовались колбы с гидрозатвором). Результаты представлены на рис. 9. При достаточно малом объеме питательной среды в колбе (5 мл) результаты эксперимента искажались преждевременным пересыханием, поэтому полученые данные исключены из дальнейшего рассмотрения. Результаты исследования свидетельствуют, что степень аэрации существенно влияет на биосинтез ГК: интенсивная аэрация увеличивает выход ГК в 4 – 5 раз по сравнению с выходом ГК, достигаемым в анаэробных условиях (рис. 9). Необходимо отметить, что для анаэробных по своему метаболизму микроорганизмов кислород играет немаловажную роль, что наглядно демонстрирует увеличение выхода биомассы культуры с ростом степени аэрации. Степень утилиза12 н. Ан аэ ро б мл 70 мл 50 мл 35 мл 25 мл 10 5 мл Биомасса; ГК, ОСТ глюкоза, мг/мл 2+ 13 н. Ан аэ ро б мл 70 мл 50 мл 35 мл 25 10 мл Удельный выход ГК, г/г биомассы ции глюкозы также увеличивается с усилением аэрации среды. Увеличение выхода ГК и биомассы микроорганизмов, а также степени утилизации глюкозы при культивировании в аэробных условиях, по-видимому, связано со снижением внутриклеточного пула восстановительных эквивалентов НАДН2 путем их окисления молекулярным кислородом при участии НАДН-оксидазы. Это существенно облегчает образование предшественников ГК, а также повышает эффективность катаболизма глюкозы. В то же время, для роста S. zooepidemicus существует определенный оптимум аэрации – чрезмерная аэрация начинает подавлять рост культуры (рис. 9). Поэтому одной из стратегий защиты клеток анаэробных по метаболизму микроорганизмов от избыточного количества молекулярного кислорода может быть образование капсул и слизей из ГК [Cleary et al., 1979]. Дело в том, что секреция культурой ГК существенно повышает вязкость ферментационной среды, что затрудняет массоперенос кислорода к клеткам, уменьшая таким образом газообмен. Кроме того, массивные капсулы из ГК, окружающие клетки S. zooepidemicus КБ-04, (рис. 3) затрудняют диффузию растворенного кислорода непосредственно к поверхности клетки и, возможно, нейтрализуют активные радикалы биотического, химического, фотохимического и механохимического происхождения. Действительно, повышение аэрации ферментационной среды в наших экспериментах сопровождается непропорциональным приросту биомассы увеличением концентрации ГК – удельный выход ГК возрастает (рис. 10), что свидетельствует о повышении уровня биосинтеза и секреции 2,5 ГК каждой отдельной 2 клеткой S. zooepidemicus КБ-04, а не 1,5 всей популяцией за счет 1 увеличения ее численности. Возможные при0,5 чины данного феномена 0 обсуждались выше, а следствием является защита от токсического действия активных Объем среды и условия культивирования форм кислорода. Таким Рис. 10. Влияние аэрации ферментационной среды на удельный образом, культуры баквыход ГК при культивировании штамма S. zooepidemicus КБ-04 терий р. Streptococcus, образующие капсулы из в аэробных и анаэробных условиях. ГК, являются своеобразными саморегулирующимися системами: при малой аэрации синтез ГК затруднен, и незначительные количества полисахарида практически не препятствуют диффузии кислорода к клеткам; как только аэрация усиливается настолько, что может негативно сказываться на росте микроорганизмов, то удельный выход ГК возрастает, и клетки приобретают массивные капсулы, частично защищающие их от избытка кислорода. Данный вывод подтверждают исследования, проведенные с родительским акапсулированным штаммом S. zooepidemicus В-8014. В анаэробных условиях выход биомассы акапсулированного штамма практически не отличался от выхода для штамма КБ-04, зато при интенсивной аэрации рост штамма В-8014 существенно подавлен, тогда как выход биомассы для штамма КБ-04 лишь немного ниже, чем при оптимальной для роста данных микроорганизмов аэрации. Таким образом, в результате проведенной работы получен штамм S. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся крупными размерами и мукоидной морфологией колоний, которая обусловлена образованием клетками микроорганизмов массивных капсул, содержащих ГК. В работе также апробированы физикохимические условия, состав сред и режимы глубинного культивирования данного штамма. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования (исключение из питательной среды солей магния, интенсификация аэрации, проведение периодической ферментации с подпитками по глюкозе) позволили повысить выход ГК с 0,6 до 3,4 г/л, то есть в 5,6 раза. Глава 3. Деполимеризация гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронатлиазой Кинетика деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой Для ферментативного расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, исходя из предполагаемого механизма каталитического действия [Li et al., 2000], предложена кинетическая схема, представленная на рис. 11. Рис. 11. Кинетическая схема расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. E – фермент (гиалуронатлиаза); S – субстрат (ГК); Р и Р' – продукты расщепления ГК; D – конечный продукт расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой (дисахарид). Стадии реакции на кинетической схеме соответствуют следующим стадиям механизма реакции расщепления ГК: 1 – образование ферментсубстратного комплекса; 2 – диссоциация фермент-субстратного комплекса; 3, 4 – катализ расщепления цепи ГК; 5 – высвобождение продукта реакции; 6 – протонный обмен; 7, 8 – транслокация субстрата. Математически можно доказать, что данная кинетическая схема описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (2): (2) 14 Вязкость, мПа*с Выражение начальной скорости ферментативной реакции формально аналогично классическому уравнению Михаэлиса-Ментен, где КМ = (k2/k1 + (k3*k5)/(k1*(k4+k5+k6))), а Vmax = ((k3*k5)/(k4+k5+k6))*E0. Нами экспериментально показано, что вязкость водных растворов ГК данной молекулярной массы 500 существенно зависит 450 только от концентрации 400 раствора и температуры, 350 1 в то время как изменение 300 ионной силы и замена 250 2 ионного окружения с 200 4 5 6 NaCl на CaCl2 в ацетат3 150 ном буфере на реологи100 ческие свойства раство50 ров практически не по0 влияли. Поскольку вяз0 50 100 150 200 кость раствора ГК данВремя, мин ной концентрации непоРис. 12. Падение вязкости растворов высокомолекулярной ГК разных концентраций и растворов других биополимеров в ходе средственно зависит от расщепления стрептококковой гиалуронатлиазой. 1 – раствор молекулярной массы поГК 7,6 мг/мл; 2 – раствор ГК 5,0 мг/мл; 3 – раствор ГК 2,7 лимера, то возможно мг/мл; 4 – раствор альгината натрия 10 мг/мл; 5 – раствор хи- проведение кинетичетозана 10 мг/мл; 6 – коллагеновая суспензия 10 мг/мл. ского эксперимента по энзиматическому расщеплению ГК с использованием вискозиметрической техники для контроля молекулярной массы получаемых препаратов. На рис. 12 приведены типичные кривые падения вязкости в ходе энзиматического расщепления ГК. Реакция деполимеризации проводилась в ячейке ротационного вискозиметра РПЭ-1М, термостатированной при 38 °С. В контрольном опыте в аналогичных условиях проведены реакции с использованием в качестве субстратов других биополимеров (альгиновой кислоты, хитозана, коллоидных растворов крахмала и различных белков). Все они демонстрировали стабильность – сохранение вязкости на протяжении 3 – 6 часов эксперимента (рис. 12). Это свидетельствует об отсутствии у препарата существенной протеолитической активности, выявляемой вискозиметрическими методами анализа, и специфичности бактериальной гиалуронатлиазы к ГК. Для определения состава реакционной смеси по ходу процесса деполимеризации ГК была использована ВЭЖХ. На рис. 13 представлена типичная хроматограмма продуктов деполимеризации высокомолекулярной ГК (раствор 5 мг/мл) стрептококковой гиалуронатлиазой спустя 1 час ферментативного воздействия. Наибольшую массовую долю (28,4 % или 1,42 мг/мл) среди продуктов реакции составляет 4,5-ненасыщенный дисахарид – конечный продукт деполимеризации ГК гиалуронатлиазой S. pneumoniae. Также представлен весь спектр олигосахаридов, образующихся в ходе ферментативной реакции, разделяющихся при данных условиях хроматографирования: тетра-, гекса-, и т. д. 15 Рис. 13. ВЭЖХ продуктов расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. Детектирование осуществлялось УФ спектрофотометрией при длине волны 232 нм. Начальная концентрация образца высокомолекулярной ГК 5 мг/мл. Время реакции ферментативной деполимеризации ГК 1 час. 15 – пик 4,5-ненасыщенного дисахарида (4-дезокси-L-треогексозо-4енопиранозилуроновая кислота-β-1,3N-ацетил-D-глюкозамин); 1,2,3 – высокомолекулярные компоненты реакционной смеси (белковая составляющая ферментного препарата и крупные неразделяемые фрагменты ГК); 4 – 14 промежуточные продукты энзиматической деградации ГК. Инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы в ходе деполимеризации ГК Обращено-фазовая ВЭЖХ продуктов реакции расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой показала наличие спектра олигосахаридов (рис. 13). Выход конечного продукта реакции составляет 28 % спустя час проведения ферментативной реакции в случае деполимеризации ГК в растворе 5 мг/мл и 55 % спустя 6 часов – времени полного самопроизвольного прекращения реакции. Остаточная вязкость растворов (рис. 12) и пики высокомолекулярной ГК и различных олигосахаридов на хроматограмме после длительного проведения ферментативной реакции свидетельствуют о неполном протекании реакции расщепления ГК, что может быть вызвано инактивацией фермента либо обратимым или необратимым ингибированием ферментативной реакции продуктами внутримолекулярного гидролиза ГК. Было обнаружено, что реакционная смесь, прошедшая гидролиз, после внесения в раствор ГК не способна катализировать ее расщепление. Чтобы выяснить, не является ли этот эффект обратимым ингибированием продуктами реакции, смесь подвергалась суточному проточному диализу против стабилизирующего ацетатного буфера при 4 ºС. Гиалуронатлиаза, прошедшая один цикл гидролиза и последующий диализ, демонстрировала крайне низкую начальную ферментативную активность. В то же время, внесение достаточно большого количества (до 50 % от начального содержания ГК) продуктов реакции в реакционную смесь в начальный момент времени существенным образом не отражалось на протекании ферментативной реакции, из чего можно заключить, что падение активности вызвано исключительно инактивацией фермента, а не обратимым или необратимым ингибированием продуктами реакции. Кинетика процесса инактивации гиалуронатлиазы в ацетатном буфере в присутствии ионов кальция при температуре 38 °С описывается экспоненциальной функцией, что определено по характерному снижению начальной активности гиалуронатлиазы в ходе предынкубации фермента без субстрата. Такая потеря актив16 ности может происходить вследствие, например, тепловой денатурации фермента или протеолиза. Из литературы [Li et al., 2001] известно, что бактериальные гиалуронатлиазы являются весьма лабильными ферментами, склонными к автодеградации. Возможно, что потеря активности в ходе деполимеризации ГК или инкубации в ацетатном буфере у гиалуронатлиазы происходит за счет автопротеолиза – отрезания небольшой аминокислотной последовательности, переводящего фермент в неактивное состояние. Такой механизм инактивации отвечает кинетической схеме первого порядка (Еa → Еi) и также может описываться экспоненциальной зависимостью активности фермента от времени [Варфоломеев и др. 1982]. Для проверки данного предположения электрофоретическим методом были исследованы пробы гиалуронатлиазы, взятые до проведения реакции деполимеризации ГК и спустя 6 часов реакции. Электрофорез в ПААГ показал (рис. 14), что ферментный препарат гиалуронатлиазы S. pneumoniae представлен в основном двумя белками с молекулярными массами около 110 и 95 кДа. Ферментативная активность может быть связана с одним из них или с обеими формами, на что чаще всего ссылаются в литературе [Li et al., 2001]. В ходе проведения ферментативной реакции белок с молекулярной массой Рис. 14. Электрофорез в ПААГ препа- 95 кДа постепенно переходит в форму с масратов гиалуронатлиазы S. pneumoniae сой около 85 кДа. По-видимому, этим и объдо проведения ферментативной реак- ясняется инактивация стрептококковой гиации деполимеризации ГК (справа) и луронатлиазы: наиболее активная форма после 6 часов реакции (слева). фермента с массой 95 кДа подвергается автодеградации, образуя неактивный белок с массой 85 кДа. Секретируя гиалуронатлиазу, S. pneumoniae размягчает и растворяет матрикс соединительной ткани, облегчая колонизацию межклеточного пространства и дальнейшую инвазию в ткани хозяина. Однако патогенез заболеваний, вызываемых S. pneumoniae, подчиняется и другим закономерностям, исследование которых выходит за рамки данной работы. Можно лишь отметить, что для защиты от клеточного и гуморального иммунного ответа хозяина S. pneumoniae формирует капсулу, содержащую ГК. Вполне возможно, что на определенном этапе развития инфекционного процесса (когда деполимеризация ГК матрикса окружающих тканей уже создала условия для инвазии возбудителя) функция гиалуронатлиазы оказывается исчерпанной, а проявляемая активность даже может снижать защитные свойства бактериальной капсулы из-за деградации содержащейся в ней ГК. Биологическое значение инактивации стрептококковой гиалуронатлиазы по механизму автопротеолиза заключается в том, что молекула фермента в таких случаях самостоятельно выводит себя из дальнейшего участия в жизнедеятельности S. pneumoniae. Таким образом, у патогенных бактерий р. Streptococcus существуют разнообразные механизмы инвазии и преодоления иммунного ответа хозяина, включающие два на первый взгляд противоположных явления – синтез ГК и ее деградацию 17 гиалуронатлиазами. Тонкий баланс между этими двумя механизмами осуществляется при помощи регуляции экспрессии и ферментативной активности гиалуронатсинтазы с одной стороны и регуляции экспрессии, ферментативной активности и автопротеолиза гиалуронатлиазы с другой. Получение фракций низкомолекулярной ГК с заданной молекулярной массой путем энзиматической деполимеризации высокомолекулярной ГК Вискозиметрический метод наблюдения за процессом ферментативной деполимеризации ГК дает возможность определять среднюю молекулярную массу продуктов расщепления ГК, что является, по сути, методом контроля хода деполимеризации в реальном времени. Нами построена математическая модель падения вязкости раствора ГК в ходе расщепления биополимера стрептококковой гиалуронатлиазой, с помощью которой возможно рассчитать изменение относительной молекулярной массы ГК: Mt/M0 = ((ηr0/ηrt)0,875*(dηrt/dt)/(dηr0/dt))0,543, (3) где Mt и M0 – молекулярные массы ГК в момент времени t и до начала реакции соответственно, Да; ηrt и ηr0 – относительные вязкости раствора в момент времени t и до начала реакции соответственно; dηrt/dt и dηr0/dt – скорость падения вязкости раствора ГК в момент времени t и начальная скорость падения вязкости раствора ГК соответственно, мин-1 (определяются графически). В табл. 2 приводится сравнение изменения средней молекулярной массы, определенной экспериментально по характеристической вязкости и рассчитанной по уравнению (3), для растворов с концентрацией ГК 5,0 и 7,6 мг/мл в ходе ее деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой. Табл. 2. Изменение средней молекулярной массы ГК в ходе ее деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой в растворах различной концентрации по данным математической модели и непосредственного измерения. ГК, мг/мл Экспериментально Средняя молекулярная масса ГК, кДа определенная (1) или рассчитанная (2) молекулярная Время, мин масса, кДа 0 5 10 15 20 5,0 (1) 1100 550 320 80 (2) 1100 590 393 290 189 7,6 (1) 1100 650 100 (2) 1100 740 520 360 270 Экспериментально определенная молекулярная масса высокомолекулярной ГК в процессе деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой уменьшилась с 1100 ± 100 кДа до 650 ± 80 кДа за 5 мин при начальной концентрации субстрата 7,6 мг/мл, что хорошо согласуется с рассчитанным по уравнению (3) – 740 кДа. За 20 мин молекулярная масса падает до 100 ± 50 кДа (расчетное значение начинает отклоняться от действительного и составляет 270 кДа, что может объясняться 18 Концентрация дисахарида, мг/мл Средняя молекулярная масса, кДа принятыми допущениями и накоплением дисахарида, искажающим вискозиметрическое определение мо1200 5 лекулярной массы (рис. 15)). Для деполимериза1000 4 ции ГК стрептококковой 800 гиалуронатлиазой в рас3 творах меньших концен600 1 траций, например 5,0 2 400 мг/мл, совпадение экс2 3 периментально установ1 200 ленного значения моле0 0 кулярной массы и рас0 10 20 30 40 50 60 считанного по характеру Время, мин падения вязкости по Рис. 15. Падение молекулярной массы ГК в процессе деполи- уравнению (3) еще лучмеризации стрептококковой гиалуронатлиазой при начальной ше: за 5 мин молекулярконцентрации ГК 5 мг/мл. 1 – молекулярная масса, рассчитан- ная масса падает до 550 ная по уравнению (3); 2 – экспериментально определенная мо- ± 50 кДа, а расчетное лекулярная масса; 3 – дисахарид, определяемый методом значение составляет 590 ВЭЖХ. кДа (рис. 15). Таким образом, контролируя вязкость растворов, методом деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой возможно получение препаратов ГК с заданной молекулярной массой, причем процесс деполимеризации довольно эффективен: уже за 5 мин для раствора ГК 5,0 мг/мл молекулярная масса уменьшается в 2 раза, а за 20 мин – в 14 раз (рис. 15). Определение ГК по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронатлиазой. Помимо получения низкомолекулярных продуктов гидролиза ГК для медицинских препаратов иммуномодулирующего действия метод энзиматической деградации применим для определения содержания ГК в сложных биологических образцах (тканях и жидкостях) по продуктам расщепления полимера. Полученные данные по кинетике инактивации стрептококковой гиалуронатлиазы позволили оптимизировать процесс деградации ГК с целью повышения выхода конечного продукта деполимеризации до 95 – 97 %, для чего была разработана схема проведения реакции, включающая трехкратное внесение фермента через равные промежутки времени (1 час). Последовательность действий при определении концентрации ГК в биологических образцах методом деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой с дальнейшим определением продуктов расщепления ГК методом ВЭЖХ представлена на рис. 16. В табл. 3 приведено сравнение разработанного нами метода анализа ГК с известными химическими методами. Практическое применение данный метод может найти, например, в определении содержания ГК в экстрактах куриных гребней, стекловидных тел глаза, используемых для получения ГК, а также в некоторых тканях и биологических жидкостях человека и животных при диагностике заболеваний, сопровождающихся 19 изменением содержания ГК. Нами показана хорошая точность и воспроизводимость разработанной методики на модельных системах, включающих ГК и мешающие белки и полисахариды, а также на реальных биообъектах (гребнях кур). Гомогенизация и растворение (экстракция в случае твердого образца) 80 °С 100 мМ NaCl Грубое фильтрование или центрифугирование при 500 – 1000 g Диализ против ацетатного буфера рН=5,5 ВЭЖХ анализ продуктов энзиматического расщепления ГК в пермеате Ультрафильтрация (полисульфонные мембраны менее 15 кДа) Обработка стрептококковой гиалуронатлиазой: трехкратное внесение ферментного препарата, 38 °С, рН 5,5, 3 часа Рис. 16. Схема определения содержания ГК в биологических образцах методом энзиматической деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой. Табл. 3. Содержание ГК в некоторых биологических образцах и модельных смесях, определенное различными методами. А – карбазольный метод анализа ГК; Б – метод анализа по реакции Nацетилглюкозамина с реактивом Моргана-Элсона; В – метод определения концентрации ГК по продуктам деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой. Образец, содержащий ГК, Концентрация ГК Содержание ГК, определенное методом или модельная смесь биопо(если известна) А Б В лимеров Высокомолекулярная ГК 95 % 95 % 95 % 94 % Низкомолекулярная ГК 99 % 99 % 99 % 96 % Белок-альгинат-хитозан-ГК 25 % 60 % 74 % 24,5 % КЖ S. zooepidemicus КБ-04* 1,46 мг/мл 2,1 мг/мл 1,52 мг/мл Куриные гребни** 1,6 % 6,6 % 1,45 % *ГК осаждалась спиртом. Результат пересчитывался на содержание ГК в КЖ. **ГК при определении методами А и Б экстрагировалась горячим водно-солевым раствором, осаждалась спиртом. Результат пересчитывался на массу образца естественной влажности. 20 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Полученный с помощью УФ-индуцированного мутагенеза штамм S. zooepidemicus КБ-04, характеризуется крупными размерами и мукоидной морфологией колоний, формируемых на богатых питательных средах. Установлено, что мукоидная морфология штамма S. zooepidemicus КБ-04 обусловлена повышенным уровнем биосинтеза ГК и образованием стабильных капсул, что связано с отсутствием у штамма S. zooepidemicus КБ-04 какой-либо гиалуронатлиазной активности. 2. Оптимизирован состав питательной среды для культивирования S. zooepidemicus КБ-04 с целью микробиологического синтеза ГК. Определено, что наибольшее влияние на рост культуры и синтез ГК оказывает концентрация источника углерода. Показано, что на выход ГК положительно влияют ДЭ, пептон, триптон, ионы Mn2+; отрицательно – ацетат натрия и сульфат магния. 3. Обнаружено, что улучшение массообменных характеристик ферментационного процесса и повышение аэрации питательной среды увеличивает как конечную концентрацию ГК, так и ее удельный выход. Повышение секреции ГК при интенсивной аэрации носит регулируемый адаптивный характер, поскольку ГК может участвовать в защите клеток бактерий р. Streptococcus от токсичных форм кислорода. 4. Предложена кинетическая схема расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и показано, что данная схема описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Вискозиметрическим методом исследован процесс деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. 5. Показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, что обусловлено частичным автопротеолизом фермента. Подобраны оптимальные условия функционирования стрептококковой гиалуронатлиазы. 6. Впервые разработан метод анализа ГК в сложных биопробах по продуктам энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой с использованием ВЭЖХ. Предложен способ получения фракций ГК со средней и низкой молекулярной массой с помощью деполимеризации гликозаминогликана стрептококковой гиалуронатлиазой и показана применимость вискозиметрического метода контроля молекулярной массы ГК в ходе ее энзиматической деполимеризации. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Белодед, А.В. Деполимеризация гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронатлиазой / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко, Р.Н. Цепилов // Биотехнология. – 2007. – №5. – С. 80-87. 2. Beloded, A.V. HPLC Quantification of Hyaluronic Acid by the Products of Its Enzymatic Degradation with Streptococcus Hyaluronate Lyase / A.V. Beloded, S.A. Mulyashov, N.S. Markvichev, I.I. Samoylenko, F.S. Sirovski // New Research on Biotechnology in Biology and Medicine / Eds. Egorov, A.M., Zaikov, G. – New-York: Nova Science Publishers, 2006. – Ch. 14. – Р. 133-143. 3. Белодед, А.В. Исследование ферментативной деградации гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронидазой / А.В. Белодед, С.А. Муляшов, Н.С. Марквичев // Успехи в химии и хим. технол. – 2004. – Т. XVIII. – № 6. – С. 53-55. 4. Белодед, А.В. Культивирование Streptococcus zooepidemicus – продуцента гиалуроновой кислоты на средах, содержащих мясные экстракты / А.В. Белодед, И.Г. Филиппов, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Успехи в химии и хим. технол. – 2005. – Т. XIX. – № 5. – С. 82-85. 5. Белодед, А.В. Анализ гиалуроновой кислоты по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронидазой методом HPLC / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Тез. докл. III-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005. – М.: “Экспо-Биохим-Технологии”, 2005. – Ч. 1. – С. 192-193. 6. Белодед, А.В. Культивирование мукоидного штамма Streptococcus equi subsp. zooepidemicus – продуцента гиалуроновой кислоты / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Тез. докл. IV-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007. – М.: “ЭкспоБиохим-Технологии”, 2007. – Ч. 2. – С. 44-45. 7. Grechishkina, O. HPLC Quantification of Hyaluronic Acid by the Products of Its Enzymatic Degradation / O. Grechishkina, S. Mulyashov, A. Beloded, F. Sirovski // Proceedings of the 15-th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, May 2-6 2004. – Florence: PBA, 2004. – P. 114. 8. Самойленко, И.И. Изучение свойств гиалуроновой кислоты для применения в дерматокосметологии / И.И. Самойленко, А.В. Белодед, Р.Н. Цепилов, О.И. Самойленко // Труды VI-ой научно-практической конференции “Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика”, 28-29 сентября 2006 г. – М., 2006. – С. 153-154. 9. Белодед, А.В. Синтез гиалуроновой кислоты мукоидным штаммом Streptococcus zooepidemicus / А.В. Белодед, И.И. Самойленко // Сб. мат. Всероссийской научнотехнической конференции “Наука-производство-технологии-экология”. – Киров: Изд-во ВятГУ, 2008. – Т. 1. – С. 231-233. 22
