Исследование и разработка криозамороженных бактериальных
advertisement
В настоящей работе рассмотрены бактериальные закваски и концентраты, их свойства, классификация и их влияние на здоровье человека, способы получения бактериальных концентратов. Разработана питательная среда, исследованы и оптимизированы технологические факторы, влияющие на процесс культивирования. Изучен состав защитной среды и подобраны оптимальные параметры для замораживания концентрата лактобактерий. Исследованы показатели замороженного бактериального препарата при его хранении. На основании проведенных исследований разработана технология получения замороженного бактериального концентрата лактобактерий. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................. 4 ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ............................................................... 7 1.1 Влияние лактобактерий на здоровье человека ................................... 7 1.2 Бактериальные закваски и концентраты, их состав и классификация ............................................................................................. 11 1.3 Способы получения бактериальных концентратов ........................... 19 ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .............................................. 35 2.1 Организация выполнения работ .......................................................... 35 2.2 Объекты исследования, оборудование ............................................... 37 2.3 Методы исследований .......................................................................... 38 2.3.1 Культивирование микроорганизмов ................................................ 38 2.3.2 Дифференциация микроорганизмов на среде Ли ........................... 39 2.3.3 Метод определения активной кислотности..................................... 40 2.3.4 Метод определения титруемой кислотности .................................. 41 2.4 Результаты исследований ..................................................................... 42 2.4.1 Разработка питательной среды для культивирования лактобактерий .............................................................................................. 42 2.4.2 Подбор оптимальных условий культивирования лактобактерий . 44 2.4.3 Модификация защитной среды для концентратов лактобактерий .............................................................................................. 46 2.4.4 Получение криозамороженных концентратов лактобактерий и исследование их показателей при хранении .................................................. 50 ГЛАВА 3 ИНЖЕНЕРНЫЙ РАЗДЕЛ ................................................................ 53 Изм. Лист № докум. Разраб. Саломатина Руков. Кригер Н. Контр. Утверд. Сухих Просеков Подпись Дата АТО 00.00.000 ПЗ Исследование и разработка криозамороженных бактериальных концентратов лактобактерий Лит. Лист Листов 5 98 КемТИПП гр. ПБн-111 3.1 Процессуальная схема производства криозамороженного бактериального концентрата ............................................................................... 53 3.2 Технологическая схема производства замороженного бактериального концентрата ......................................................................................... 56 ГЛАВА 4 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ......................................................... 59 4.1 Расчет себестоимости бактериального концентрата ......................... 59 4.2 Экономическое обоснование использования готового бактериального концентрата ......................................................................................... 64 ГЛАВА 5 БЕЗОПАСНОСТЬ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ . 67 5.1 Условия труда ........................................................................................ 67 5.1.1 Соответствие санитарным требованиям микробиологической лаборатории ................................................................................................. 67 5.1.2 Гигиена труда и производственная санитария................................ 68 5.2 Безопасность работы в микробиологической лаборатории.............. 70 5.2.1 Безопасность работы с аппаратурой и оборудованием ................. 71 5.2.2 Безопасность работы со стеклянной посудой ................................. 74 5.2.3 Безопасность работы с реактивами .................................................. 75 5.2.4 Безопасность работы с микроорганизмами ..................................... 77 5.2.5 Электробезопасность ......................................................................... 78 5.2.6 Пожарная безопасность ..................................................................... 79 5.3 Оказание первой медицинской помощи ............................................. 80 ВЫВОДЫ .............................................................................................................. 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................. 83 Лист АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата 3 ВВЕДЕНИЕ В настоящее время в России ведется активная разработка и производство кисломолочных продуктов, обогащенных положительной микрофлорой, расширяется ассортимент за счет создания новых видов кисломолочных продуктов. Общепризнанным фактом является, что кисломолочные продукты оздоровляют организм человека. Производство кисломолочных продуктов основано на использовании стартовых культур микроорганизмов в виде бактериальных концентратов, которые представляют собой специально подобранные и подготовленные комбинации молочнокислых бактерий. На сегодняшний день производство бактериальных концентратов является быстро развивающимся сегментом мирового рынка микробиологических препаратов для пищевой промышленности. Следовательно, совершенствование свойств существующих и создание новых конкурентоспособных бактериальных концентратов является актуальной задачей. Среди сухих, жидких и замороженных бактериальных концентратов, наибольшее распространение получили сухие бакконцентраты, так как они удобны в транспортировки и использовании и имеют высокую концентрацию жизнеспособных клеток в 1 г продукта. В производстве бактериальных концентратов одним из главных этапов является консервирование микробной биомассы. В настоящее время разработаны и усовершенствованы способы длительного консервирования на основе анабиоза (ксероанабиоза, криобиоза), которые направлены на сохранение жизнеспособности клеток и повышение их устойчивости к внешним воздействиям. В производстве сухих бактериальных концентратов на стадии консервирования микробную биомассу смешивают с защит- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 4 ной средой и хранят до использования в замороженном состоянии или подвергают лиофильной сушке. На выживаемость бактериальных клеток при консервировании влияют следующие факторы: исходная концентрация клеток в единице объема, физиологическое состояние клеток (целостность клеточной оболочки и способность к последующей реактивации), химическое и физиологическое состояние криопротекторов, скорость и температура охлаждения и высушивания, сроки и условия хранения. При получении бактериальных концентратов наибольшее распространение получил способ сублимационного высушивания микробной биомассы. Преимуществами этого метода являются: высокая концентрация жизнеспособных микроорганизмов и хорошая их выживаемости при хранении. Метод мгновенного замораживания бактериальных клеток в среде жидкого азота при температуре минус 196 0С позволяет достичь более высокой выживаемости микроорганизмов, т.к. при сверхбыстром охлаждении вода не успевает выйти из клетки, что уменьшает её обезвоживание, структура льда становится мелкокристаллической, уменьшается время действия гиперконцентрированных растворов солей. Воздействие мелких кристаллов льда на клетки не вызывает их гибели. Для увеличения выживаемости микроорганизмов используются криопротекторы: углеводы (глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза и др.), белки (альбумин, желатин), аминокислоты (аланин, валин, глицин и др.), полимеры (декстран). Криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором, поэтому при создании защитных сред для производства бактериальных концентратов, используемых в пищевой промышленности, в качестве криозащитных веществ должны применяться соединения, имеющие статус пищевых. Введение в суспензионные среды ряда веществ (солей, белков, углеводов, аминокислот) позволяет снизить кон- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 5 центрацию криопротектора при сохранении той же либо несколько более высокой криозащитной эффективности; с этой целью применяются комбинации нескольких криопротекторов. Настоящая дипломная работа посвящена исследованию и разработке защитной среды для криозамороженных бактериальных концентратов для кисломолочных продуктов. Для достижения поставленной цели сформулированы задачи исследований: – провести анализ отечественных и зарубежных литературных данных по изучаемой проблеме, сформулировать задачи собственных исследований; – подобрать объекты и методы исследования; – подобрать питательные среды для культивирования молочнокислых бактерий; – модифицировать защитные среды для молочнокислых бактерий; – получить криозамороженные бактериальные концентраты и исследовать их показатели при хранении. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 6 ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР В обзоре литературы рассмотрены: влияние лактобактерий на здоровье человека, типы бактериальных заквасок, их состав, классификация, способы получения бактериальных концентратов. 1.1 Влияние лактобактерий на здоровье человека В естественных условиях организм человека, его органы и системы содержат большое количество микроорганизмов. Естественная микрофлора кишечника поддерживает здоровье не только пищеварительной системы, но и организма в целом. Она начинает формироваться уже при рождении ребенка, во время его прохождения через родовые пути. При этом в организм ребенка попадают и быстро в нем колонизируются бактерии материнской микрофлоры, в первую очередь лактобактерии [12, 16]. Лактобактерии (лат. Lactobacillus) – род грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий. Лактобактерии обычно имеют правильную форму длинной «палочки», реже кокковидные, располагаются в коротких цепочках или поодиночке. В процессе своего нормального метаболизма лактобактерии способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим и вещества с антибиотической активностью: реутерин, плантарицин, лактоцидин, лактолин [27]. На значение микрофлоры для здоровья человека первым в начале ХХ века обратил внимание знаменитый ученый И.И. Мечников. Он полагал, что с возрастом в нижних отделах кишечника накапливаются большие количества гнилостных бактерий, продукты жизнедеятельности которых начинают оказывать на организм токсический эффект. Для снижения количества по- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 7 добных протеолитических микроорганизмов И. И. Мечников предложил ежедневно употреблять большие количества живых молочнокислых бактерий. Практической реализацией этой идеи явилась рекомендация ученого употреблять кисломолочные продукты, ферментированные штаммом Lactobacillus bulgaricus, который он изолировал из болгарской простокваши. Болгарская палочка обладает мощным лечебным эффектом при лечении язвенной болезни и гастритов – она устраняет боль и нейтрализует кислоты. Болгарская палочка совместно со штаммом Streptococcus salivarius subsp. thermophilus в последующем стали основой заквасок подавляющего большинства присутствующих на рынках всего мира йогуртов [16, 42]. В 1903 г. русский врач И.О. Подгородецкий открыл еще более действенную бактерию, обладающую лучшими показателями в сравнении с болгарской палочкой – ацидофильную палочку. Lactobacillus acidophilus – один из видов бактерий рода Lactobacillus. Эта бактерия используется совместно со Streptococcus salivarius и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus для изготовления ацидофилина и других ацидофильных напитков. Ацидофильная палочка не разрушается под действием пищеварительных соков, хорошо приживается в толстых кишках человека, а продукты ее жизнедеятельности обладают широким бактерицидным действием, то есть угнетают рост патогенных микроорганизмов, подавляют гнилостные и бродильные процессы [60]. На данный момент открыто и изучено более 100 видов лактобактерий. Одними из самых распространенных видов этих бактерий являются: – Lactobacillus casei – сырная палочка; – Lactobacillus acidophilus – ацидофильная бактерия; – Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii –дельбрюковская бактерия; – Lactobacillus bulgaricus – болгарская палочка; – Lactobacillus plantarum – молочнокислая лактобактерия. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 8 В настоящее время ученые работают с генами лактокультур и пытаются сделать полезные свойства данных бактерий сильнее и лучше. В связи с этим каждый год появляются новые штаммы [74]. Лактобактерии имеют большое влияние на организм человека, которое заключается в воздействии не только на процесс пищеварения, но и на состояние всех систем в целом. К важным функциям этих полезных бактерий можно отнести: 1. Под действием лактобактерий происходит преобразование лактозы в молочную кислоту, необходимую для обеспечения нормального процесса переваривания пищи. 2. Профилактика и лечение всевозможных кишечных инфекций – энтерококки, которые с трудом поддаются лечению антибиотиками, могут быть вытеснены из микрофлоры кишечника этими дружественными человеку бактериями. Под воздействием полезных микроорганизмов повышается общая сопротивляемость организма всевозможным вирусам [61]. 3. Лактобактерии участвуют в регуляции обмена веществ. Молочная кислота, синтезируемая этими микроорганизмами, активизирует усвоение витамина D, железа, кальция. Под действием бактерий нормализуется процесс обмена холестерина и билирубина. 4. Профилактика раковых заболеваний толстой кишки – еще одна важнейшая функция этих микроорганизмов. Лактобактерии обладают антиканцерогенными и антимутагенными свойствами, препятствуя развитию злокачественных образований [88]. Лактобактерии играют важную роль в иммуномодуляции, в том числе стимулируют фагоцитарную активность нейтрофилов, макрофагов, синтез иммуноглобулинов и участвуют в образовании интерферонов. Так, исследования [12, 18], в которых сравнивали эффекты препаратов, содержащих живые и убитые лактобактерии, показали, что и живые, и убитые лактобактерии стимулировали фагоцитарную активность лейкоцитов мышей. Продемонстри- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 9 ровано также, что включение в рацион здоровых животных L.acidophilus (HN017), L.rhamnosus (HN001) вызывало повышение фагоцитарной активности лейкоцитов крови и перитонеальных макрофагов по сравнению с контролем, а также увеличение продукции интерферона-g спленоцитами [14]. Лактобактерии, как и бифидобактерии, содержат наибольшее число видов и отдельных штаммов пробиотиков. Пробиотики – это живые микроорганизмы и вещества микробного и иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивное влияние на функционирование микрофлоры в организме человека и способствующие лучшей адаптации последнего к окружающей среде в конкретной экологической нише. Выделяют следующие категории пробиотиков: Монопробиотики – субстанции, содержащие представителей только одного вида бактерий; Ассоциированные пробиотики – субстанции, представляющие собой ассоциацию штаммов нескольких видов микроорганизмов (от 2 до 30). В зависимости от назначения пробиотиков их также разделяют на: Синбиотики – комплексные препараты и продукты функционального питания на основе живых микроорганизмов и пребиотиков – соединений различного состава и происхождения, поддерживающих рост «дружественных» человеку кишечных микроорганизмов. Гетеропробиотики – назначаются вне зависимости от видовой принадлежности хозяина, от которого первоначально были выделены штаммы пробиотических бактерий; Гомопробиотики – назначаются только представителям того вида животных или человеку, из биоматериала которых были выделены соответствующие штаммы; Аутопробиотики – штаммы нормальной микрофлоры, изолированные от конкретного индивидуума и предназначенные для коррекции его микроэкологии [44, 56, 78]. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 10 Наиболее перспективными являются пробиотики на основе живых микроорганизмов с установленными специфическими физиолого- биохимическими эффектами. А также генно-инженерных штаммов с заданными медико-биологическими и технологическими характеристиками. Положительный эффект пробиотиков на организм проявляется как на местном уровне через нормализацию микробной экологии пищеварительного тракта, так и системно [18, 90]. Лактобактерии могут обитать на растениях. Например, дельбрюковская палочка обитает на поверхности злаков, овощей. Она принимает главное участие в процессе заквашивания капусты, помидоров, огурцов. Человек может получать лактобактерии с продуктами питания, в первую очередь, с молочнокислыми продуктами. Наибольшее количество молочнокислых бактерий содержат ацидофилин, ряженка, простокваша, йогурт, кефир. Лактобактерии в процессе жизнедеятельности вступают в сложные взаимоотношения с другими микроорганизмами, в результате чего угнетаются гнилостные микроорганизмы и условно-патогенные организмы, возбудители острых кишечных инфекций за счет способности образовывать целый ряд таких веществ, как молочная кислота, лизоцим, лактоцины B, F, J, M, лактоцидин и ацидолин, обладающих антибактериальным эффектом [20, 42, 98]. 1.2 Бактериальные закваски и концентраты, их состав и классификация Бактериальными заквасками называют чистые культуры или смесь культур микроорганизмов, используемых при изготовлении кисломолочных продуктов, кислосливочного масла и сыров. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 11 Бактериальный концентрат – это высококонцентрированная биомасса, где количество клеток на 2–3 порядка выше, чем в заквасках. Применение бактериальных концентратов в молочной промышленности позволяет интенсифицировать процесс сквашивания, снизить рабочие площади и повысить санитарно-гигиенические показатели продукта [60, 64]. В зависимости от способа или технологии получения бактериальные закваски или концентраты подразделяют на: – закваски (БЗ), при производстве которых не проводится концентрирование микробных клеток, поэтому количество колоний образующих единиц в 1 см3 не превышает 10 млрд; – концентраты (БК), при производстве которых обязательным этапом является концентрирование бактериальной массы, поэтому в 1 г бактериального концентрата количество КОЕ более 10 млрд [81, 87, 91]. В зависимости от физического состояния бактериальные закваски и концентраты подразделяются на [34]: – жидкие; – сухие; – замороженные; – на плотных питательных средах. Жидкие закваски представляют собой чистые культуры, находящиеся в активном состоянии и выращенные в стерильном молоке. Срок годности их составляет 2 недели при температуре хранения 4±2 0С. При длительном транспортировании без соблюдения режима охлаждения активность культур, входящих в жидкие закваски, быстро снижается. Для повышения сроков хранения заквасок, их активности и увеличения в заквасках количества бактериальных клеток вырабатываются сухие закваски, а также жидкий и сухой бактериальный концентрат. Жидкий бактериальный концентрат приготавливается путем культивирования молочнокислых АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 12 бактерий в питательной среде, их концентрирования (центрифужным способом) и смешивания полученной биомассы с защитной средой [19, 38]. Сухие закваски вырабатывают из жидких путем их сушки методом распыления или сублимации. При производстве сухих заквасок с помощью распылительных сушилок активность чистых культур сохраняется до 3 месяцев. При сублимационном способе сушки выживаемость клеток достигает 90 % в течение нескольких месяцев и даже лет. Жидкий бактериальный концентрат приготавливается путем культивирования молочнокислых бактерий в питательной среде, их концентрирования и смешивания полученной биомассы с защитной средой. Сухой бактериальный концентрат вырабатывается из жидкого препарата (с защитной средой) путем его сублимационной сушки. Сублимированные (лиофилизированные) бактериальные закваски и концентраты получают при сушке культур в замороженном состоянии. При этом в молочную основу вводят вещества, защищающие микроорганизмы от неблагоприятных факторов, т.е. защитные вещества (глютамат натрия, аспаркам и др.), а также криопротекторы – вещества, защищающие от переохлаждения (глюкоза, сахарно-кукурузный сироп, сахароза, мальтоза и др.). В этой среде микроорганизмы выращивают, затем охлаждают до температуры – 40 0С, высушивают при температуре – 35 0С, т.е. в тот период, когда микроорганизмы находятся в состоянии анабиоза и являются более устойчивыми к действию неблагоприятных факторов [3, 6, 100]. Глубокозамороженные закваски получают замораживанием в жидком азоте (при температуре минус 196 0С в сосудах Дьара). Данный метод является наиболее удачным методом консервирования культур микроорганизмов, так как при таких низких температурах молекулы воды не образуют крупных кристаллов и биохимические процессы в клетках прекращаются, т. е. бактериальная клетка находится в пассивном «мертвом» состоянии. При этом основными факторами, влияющими на активность консервируемых микроорганизмов, яв- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 13 ляются тип среды культивирования, а также используемые криопротекторы. Такие закваски сохраняют свою активность в течение многих месяцев, если их хранить при температуре от минус 40 0С до минус 45 0С и ниже [84, 92]. Глубокозамороженные культуры прямого внесения (DVI) поступают на предприятия в соответствующих контейнерах, обеспечивающих поддержание цепочки холода от производителя до потребителя заквасок, в гранулированной форме с высокой концентрацией замороженных культур микроорганизмов [94]. Преимуществами этих заквасок являются: удобство использования; отсутствие предварительной активизации перед использованием; исчезает необходимость в использовании помещения и оборудования для приготовления закваски, следовательно, сокращается потребление энергоресурсов (пара, воды, электроэнергии); исчезает необходимость подбора композиций культур микроорганизмов, требуемых для выработки конкретного вида продукта и сохраняющих свою активность и постоянство состава на всем протяжении гарантированного срока хранения; отсутствие фагов в заквасках [86]. В зависимости от температурных границ роста микроорганизмов выделяют следующие виды заквасок: – мезофильные с оптимумом от +25 0С до +35 0С; – термофильные с оптимумом от +40 0С до +50 0С; – смешанные. В состав мезофильных заквасок входят следующие группы микроорганизмов: лактококки, лейконостоки, мезофильные молочнокислые палочки, бифидобактерии и др. В состав термофильных заквасок входят термофильные молочнокислые палочки и термофильный стрептококк. В состав смешанных заквасок входят термофильные и мезофильные микроорганизмы. Установлено, что молочнокислые лактококки способны образовывать в среде 0,8–1,0 % молочной кислоты, мезофильные молочнокислые палочки – около 1,5 %, термофильные – около 2–2,5 % [4, 76]. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 14 В зависимости от числа видов микроорганизмов, входящих в состав микрофлоры, закваски делят на два типа: 1) моновидовые (М) – состоят из одного вида микроорганизмов, например лейконостоков; 2) поливидовые (П) – состоят из двух и более видов микроорганизмов. Так, бактериальная формула угличской закваски (СМС) – БЗ:П:С:ЛКДБ – расшифровывается как бактериальная закваска (БЗ), поливидовая (П), сухая (С), в состав которой входят следующие микроорганизмы: Lc. lactis (Л), Lc. cremoris (К), Lc. diacetilactis (Д), Leuc. cremoris (Б) [2, 24]. За рубежом используется другая система информации о составе заквасок. При этом она отличается в разных странах у различных производителей. Чаще всего применяют следующие обозначения: нулевые (0), L, D, LD. Нулевые закваски содержат только Lc. lactis, Lc. cremoris или штаммы одного из одного из этих видов. Селекция штаммов данных заквасок направлена на активное кислотообразование и минимальное газообразование. Закваски L состоят из нулевых заквасок, а также Leuc. cremoris. Наряду с молочной кислотой закваска вырабатывает диацетил, ацетон, летучие кислоты и углекислый газ [7, 34]. В заквасках D кроме представителей нулевой закваски содержится Lc. diacetilactis. Эти закваски производят диацетил и ацетоин в большом количестве, в них более интенсивно образуется углекислый газ. Закваски LD состоят из молочных лактококков, входящих в состав нулевых заквасок, а также Leuc. cremoris и Lc. diacetilactis. В таких заквасках прослеживается тенденция Lc. diasetilactis доминировать над другими микроорганизмами [10, 99]. Бактериальные концентраты прямого внесения фирмы «Sacco» (Италия): М.0,36 L; M.0,30N; М.0,31 R (Lc. lactis, Lc. cremoris, Lc. diacetilactis) – твердые сычужные сыры, мягкие и рассольные сыры, творог, сметана, кисломолочные напитки; MOS 0,62 Е, MOS 0,64 Е (Str. thermophilus, Lc. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 15 lactis, и (или) Lc. cremoris) – мягкие и рассольные сыры, твердые сыры насыпью, творог, сметана ускоренным способом; MS 0,62 CM (Lc. lactis, Lc. cremoris, Str. termophilius, Lc. diacetilactis) – твердые и мягкие сыры; MS 0,64 CP (Lc. lactis, Lc. cremoris, Str. termophilius, Lc. diacetilactis) – твердые и мягкие сыры, творог, сметана. Закваски прямого внесения: закваска «Бифивит» представляет собой микробную биомассу бифидобактерий (B.longum B379M), закваска «Пропионикс» содержит чистые культуры пропионовокислых (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii – КМ 186) – бактерий активно ферментируют молоко и пищевые среды без стимуляторов роста, позволяют интенсифицировать технологический процесс и гарантируют высокое качество готовых продуктов [55, 82]. Закваски применяются для производства кисломолочных пробиотических продуктов на молочных комбинатах. Закваски обладают высокой биохимической активностью и предназначены для прямого внесения в молоко, причем имеется возможность для комбинирования культур друг с другом и (или) в сочетании с молочнокислыми бактериями. Применение данного вида заквасок в условиях производства позволяет интенсифицировать технологический процесс за счет исключения трудоемких этапов изготовления лабораторных, пересадочных и производственных заквасок, гарантирует получение продукта со стабильными свойствами и снижает до минимума возможность его обсеменения посторонней микрофлорой. Применение заквасок концентрированных на заводах не требует дополнительного оборудования для приготовления заквасок. Концентрат бактериальный сухой лактококков СБК–СМ–Мв. Способствует образованию однородной вязкой консистенции продукта. Образует молочную кислоту, ароматические вещества, формирующие традиционный вкус продукта. Рекомендуется использовать для производства сметаны, в том числе низкой жирности [17, 102]. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 16 Концентрат бактериальный сухой лактококков СБК–СМ–Мн/в. Способствует образованию однородной невязкой плотной консистенции продукта. Образует молочную кислоту и ароматические вещества, формирующие традиционный вкус продукта. Концентрат бактериальный сухой лактококков и термофильных стрептококков СБК–СМ–МТв. Способствует образованию однородной вязкой консистенции продукта. При повышении температуры сквашивания происходит ускорение процесса изготовления продукта. Образует молочную кислоту и ароматические вещества, придающие гармоничный вкус продукту. Рекомендуется использовать для производства кисломолочных напитков, сметаны, в том числе низкой жирности [28]. Концентрат бактериальный сухой лактококков и термофильных стрептококков СБК–СМ–МТн/в. Способствует образованию однородной невязкой плотной консистенции продукта. При повышении температуры сквашивания происходит ускорение процесса изготовления продукта. Образует молочную кислоту и ароматические вещества. Концентрат бактериальный сухой термофильного стрептококка СБК– Тн/в. Обеспечивает получение продукта плотной невязкой консистенции с мягким вкусом. Рекомендуется для производства ряженки, простокваши и других кисломолочных напитков. Концентрат бактериальный сухой термофильного стрептококка СБК– Т вязкий. Обеспечивает получение продукта вязкой консистенции с мягким вкусом. Рекомендуется для производства ряженки, простокваши и др. кисломолочных напитков [41, 89]. Концентрат бактериальный сухой ацидофильной палочки КБСАПФ– 1 (н/вязкий). Обеспечивает получение продукта плотной невязкой консистенции с чистым кисломолочным вкусом. Обладает антагонистической активностью к возбудителям кишечных инфекций и гнилостных бактерий. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 17 Рекомендуется для производства ацидофилина, ацидофильного молока, бифитата и других кисломолочных напитков. Концентрат бактериальный сухой ацидофильной палочки КБСАПФ–2 (вязкий). Обеспечивает получение продукта вязкой консистенции с чистым кисломолочным вкусом. Обладает антагонистической активностью к возбудителям кишечных инфекций и гнилостных бактерий. Рекомендуется для производства ацидофилина, ацидофильного молока, бифитата и других кисломолочных напитков [23, 91]. Концентрат бактериальный сухой поливидовой для йогурта СБК–Т ЛбБ. Консорциум специально подобранных культур термофильного стрептококка и болгарской палочки. Способствует получению продукта плотной вязкой консистенции и гармоничного вкуса. Данный концентрат предназначен для изготовления йогурта и других кисломолочных напитков, в том числе для детского питания. Концентрат бактериальный сухой болгарской палочки СБК–ЛбБ. Способствует образованию сгустка однородной невязкой консистенции. Образует молочную кислоту. Данный концентрат предназначен для изготовления казеина, сыров, йогурта и других ферментированных молочных продуктов, в том числе для детского питания [9, 67, 83]. Сравнительный анализ бактериальных заквасок разных фирм- изготовителей заквасок показывает, что хотя закваски могут иметь один и тот же видовой состав, но качество вырабатываемого продукта при этом существенно отличается. Это связано с тем, что производители заквасок осуществляют отбор культур и их подбор в комбинации заквасок, исходя из назначения продукта, с учетом изучения и оценки физиолого- биохимических, экологических и технологических свойств отдельных штаммов и заквасочной комбинации в целом. Последнее зависит от опыта работы, количественного и качественного состава коллекции штаммов микроорга- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 18 низмов, глубины и широты изучения свойств отдельных культур и их комбинаций [21, 30]. При общем сходном качественном составе микрофлоры вырабатываемых заквасок разными фирмами–изготовителями, соотношение между группами, видами и разновидностями используемых микроорганизмов у разных фирм не одинаково. Это касается как соотношения между кислото-, аромато-, газообразующими группами, так и соотношения между отдельными видами и разновидностями внутри этих групп (например, соотношения между Lc. lactis и Lc. cremoris, Lc. diasetilactis и Leuconostoc) [40, 63]. Например, российские закваски БК-У-4, БК-У-5а, БК «Биоантибут» обладают более высокой кислотообразующей способностью и обеспечивают более высокую степень синерезиса сгустка при выработке сыров. Закваска БК-У-7, состоящая из Lc. lactis и Lc. cremoris, не включает ароматобразующую микрофлору, поэтому не может быть использована для сыров, требующих образование рисунка и выраженного аромата [22, 37, 65, 85]. 1.3 Способы получения бактериальных концентратов Бактериальные концентраты используются при производстве ферментированных молочных продуктов двумя методами: путём приготовления производственной закваски беспересадочным способом в специальных заквасочных отделениях молокоперерабатывающих предприятий или путём прямого внесения в молоко или сливки. Наиболее прогрессивным является метод прямого внесения, так как при этом не требуется организация заквасочного отделения, исключается возможность обсеменения закваски посторонней микрофлорой и предотвращается поражение заквасочной микрофлоры бактериофагами [73, 96]. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 19 Основные технологические операции, входящие в технологический процесс производства бакконцентратов представлены на рисунке 1.3.1. Общая технология производства БК включает такие основные операции, как приготовление и стерилизация питательной среды, внесение закваски и наращивание биомассы, отделение культуральной жидкости от биомассы, смешивание бактериального концентрата с защитной средой, замораживание. При получении замороженных БК: фасовка, упаковка и хранение замороженных БК, а для получения сухих БК: сублимационная сушка, фасовка, упаковка и хранение сухих БК. Рисунок 1.3.1 – Технологическая схема производства бактериальных концентратов АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 20 При производстве бактериального концентрата важную роль играет состав питательной среды. Для выращивания любого микроорганизма необходимо создать сбалансированную смесь необходимых питательных веществ в таких концентрациях, при которых рост будет наилучшим [15, 66]. При приготовлении сред сначала целесообразно составить их минеральную основу, которая содержит все те питательные вещества, которые можно дать любому организму в неорганической форме. Далее в эту основу можно ввести нужные добавки – источники углерода, энергии, азота и необходимые ростовые факторы. Культивирование микроорганизмов может осуществляться в стационарных или непрерывно-поточных условиях, что существенно влияет на применяемые аппаратуру и технологические приемы [2, 36]. При периодическом культивировании в питательную среду добавляют культуру, и процесс выращивания посевного материала ведут до тех пор, пока в среде не накопится максимальное количество клеток. При этом культура сначала размножается в условиях избытка питательных веществ, количество которых за время выращивания постепенно снижается. Компоненты питательной среды часто используются неравномерно и некоторые из них могут в процессе развития культуры лимитировать рост биомассы. Одновременно в среде накапливаются и продукты метаболизма, которые также оказывают отрицательное влияние на конструктивный обмен и нормальную физиологию клеток, составляющих единую популяцию [32, 59]. При непрерывном способе культивирования в ферментер постоянно подается свежая среда и одновременно вытекает такой же объем культуры. На рост и размножение микроорганизмов сильное влияние оказывает показатель концентрации водородных ионов (рН). рН среды может изменять активность ферментов, что, в свою очередь, ведет к изменению биохимической активности микроорганизмов и направления вызываемых ими биохимических превращений в среде. Большинство микроорганизмов развивается при АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 21 нейтральной или слабощелочной реакции среды. Есть среди бактерий кислотоустойчивые, например, молочнокислые, и некоторые уксуснокислые бактерии. При подкислении среды до рН 4 развитие большинства бактерий практически прекращается. К колебаниям рН в пределах от 6 до 9 бактерии малочувствительны. Как правило, после стерилизации рН среды изменяется, происходит подщелачивание среды в результате разрушения карбонатов. В среду добавляют буферные системы, чтобы исключить изменение pH. Чаще всего используют фосфатные буферы, состоящие из смеси однозамещенных и двузамещенных фосфатов (К2НРО4 и КН2РО4). Это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне около нейтрального значения рН, так как они малотоксичны для микроорганизмов, также они служат источником фосфора [1, 13, 31]. Кроме того, на размножение микроорганизмов влияют температура культивирования, аэрация и давление. Все эти факторы влияют на скорость роста, выход биомассы, метаболизм и химический состав бактерий. В зависимости от степени влажности, плотности вещества, размера твердых частиц, требований технологического характера в микробиологической промышленности концентрирование бактерий осуществляют двумя основными методами: микрофильтрация и центрифугирование [11, 20, 25, 26]. В микрофильтрации разделение компонентов культуральной жидкости протекает под давлением с использованием полупроницаемых перегородок из пористых полимерных или неорганических материалов. Наибольшее распространение получил метод, который основан на непрерывном или периодическом центрифугировании культуральной жидкости с использованием специальных бактофуг [33, 39, 70, 75]. Бактофугирование представляет собой весьма сложный физикомеханический процесс, в ходе которого под действием центробежных сил происходит разделение, отличающихся своей плотностью, компонентов микробной биомассы [45, 68]. В отличие от обычных сепараторов бактофуга АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 22 имеет больший фактор разделения. Под действием центробежной силы поток продукта разделяется на биомассу (более тяжелая фракция) и фугат (более легкая фракция). Для концентрирования бактерий наиболее часто используют бактофуги периодического действия, в которых на стенках вертикального цилиндрического ротора непрерывно образуется осадок с переменной границей и изменяющимися свойствами [15, 69, 72, 80]. При получении бактериальных препаратов существенное влияние на активность и стойкость препаратов, по данным ряда авторов, оказывает продолжительность выращивания молочнокислых бактерий перед их отделением из культуральной среды. Клетки, отделенные в стационарной фазе, более активны и более стойки в замороженном состоянии, чем старые клетки. А клетки, выделенные в логарифмической фазе роста, являются нестойкими в замороженном состоянии [1, 23, 67, 102]. Многочисленными исследованиями [77, 84, 93, 95] установлено, что интервал температур 25–45 0С является оптимальным для роста бактерий, поэтому при выделении бактерий из молока в процессе его очистки рекомендуемые интервалы температур находятся в диапазоне 8–15 0С и 52–58 0С [27]. Что касается концентрирования бактерий в культуральной жидкости, то данные в этом направлении немногочисленны [43, 62, 71, 75] и рекомендуют поддерживать полученные температурные режимы выделения бактерий на уровне не выше 10 0С. В промышленных условиях обычно, после окончания выращивания биомассу охлаждают до 3–6 0С и направляют на концентрирование для получения бактериальной биомассы. Замораживание – самый ответственный этап в технологии. Замораживание биомассы приводит к физическим, биофизическим и биохимическим изменениям в клетке. В результате кристаллообразования при замораживании происходит повреждение и разрушение клеточных мембран и других структур клетки. Эти повреждения могут быть вызваны тремя основными причинами: механическим воздействием на клетки кристаллов льда; повы- шением концентрации электролитов, что вызывает денатурацию мембран; снижением разности концентрации веществ внутри и снаружи клетки [8, 79]. На выживаемость клеток в процессе замораживания бактериальных клеток огромное воздействие оказывает защитная среда. Она предохраняет микроорганизмы при замораживании, высушивании и хранении. Защитные среды состоят из криопротекторов. Криопротекторы – вещества, защищающие живые объекты от повреждающего действия замораживания. Криопротекторы используют при низкотемпературном хранении живых объектов, т.е. при замораживании крови, спермы, эмбрионов, изолированных органов, клеточных культур. Помещение живых объектов в растворы криопротекторов и замораживание в этих растворах снижает или исключает полностью формирование внутриклеточного льда и обезвоживание [57, 58, 97]. Существует большое количество веществ, обладающих криопротекторными свойствами, но в медицинской и лабораторной практике используют не более десятка соединений. Различают криопротекторы двух типов: – проникающие – проникают внутрь клетки; – непроникающие – не проникают внутрь клетки. Проникающие криопротекторы препятствуют формированию кристаллов льда за счёт образования водородных связей с молекулами воды. Наиболее распространенны проникающие криопротекто- ры: глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид. Принцип действия непроникающих криопротекторов до конца не ясен. Вероятно, оно двояко: снижение скорости роста кристаллов и защита клетки от осмотических перепадов. К непроникающим криопротекторам относят две группы веществ: – олигосахариды (наиболее часто используют сахарозу и трегалозу); –высокомолекулярные соединения (наиболее часто использу- ют фиколл, альбумин, поливинилпирролидон) [57, 66]. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 24 Использование непроникающих криопротекторов в отсутствие проникающих неэффективно, то есть непроникающие криопротекторы являются дополнительными компонентами в растворах проникающих криопротекторов. Хранение микроорганизмов в замороженном и высушенном состоянии основано на принципах анабиоза. Анабиоз – состояние временного, обратимого прекращения жизнедеятельности, из которого организм может снова перейти к активной жизнедеятельности [7, 10, 12]. Основными физическими факторами, регулирующими интенсивность обмена веществ – жизненных процессов в живых клетках, являются температура и влажность. При криоанабиозе подавляется активность ферментов, замедляются обмен веществ, развитие, рост, движение. Большое влияние на сохранение жизнеспособности и продуктивности микроорганизмов при замораживании, хранении и последующем оттаивании оказывают условия замораживания: скорость и температура, длительность процесса, наличие и состав защитных сред, продолжительность хранения, условий культивирования, возраста культуры [84, 92]. В сохранении жизнеспособности клеток при замораживании и высушивании главную роль играют защитные среды. Механизм действия защитных сред основан на их способности создавать более прочные связи с молекулами воды, чем связи молекул воды между собой, что препятствует формированию правильной решетки льда и задерживает начало роста кристаллов. В молочной промышленности для получения сухих бакконцентратов в основном применяют сублимационную сушку [68, 89]. Сублимационная сушка идет в два этапа: на первом этапе удаляется свободная вода, сушка идет с постоянной скоростью при температуре минус 35 0С. На втором этапе температура повышается до температуры 30 0С и выше, удаляется связанная вода. Преимущества этого процесса: влага удаляется при низких температурах, что практически исключает термоинактивацию продукта, сохраняется стабильная структура материала, а также облегчается возможность получения сухого про- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 25 дукта в фасованном и стерильном виде. К основным недостаткам сублимационной сушки относятся высокие продолжительность, энергоемкость процесса и сложность сублимационного оборудования [38, 66, 80, 83]. На стойкость замороженных бактериальных концентратов также большое влияние оказывают режимы хранения. Исследования показывают, что при хранении концентрата молочнокислых бактерий в защитной среде в течение 6 месяцев при температуре – 18 0С наблюдается гибель 9 % клеток, а при температуре – 8 0С погибает – 16–28 %. Авторами патента РФ № 2427624 [46] предложен способ замораживания молочнокислых бактерий. Способ предусматривает смешивание суспензии молочнокислых бактерий, полученных после центрифугирования, с защитной средой. Защитная среда приготовлена на основе фосфатного буфера с рН 7,2 с добавлением глицерина, лактозы, лимоннокислого натрия и желатина. При этом биомассу с защитной средой смешивают в соотношении 1:1, выдерживаю в течение 15–20 минут при температуре от 17 до 27 0С, затем перемешивают и подают на замораживание в жидком азоте в виде гранул. Замораживание длится не более одного часа. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики и хранят при температуре–40 0С, но не выше –18 0С. Использование в качестве криопротекторов глицерина, лактозы, лимоннокислого натрия обеспечивает наиболее полное сохранение микроорганизмов. Внесение желатина предотвращает слипание гранул в процессе хранения. Предложенные криопротекторы нетоксичны для организма человека и разрешены к применению, поэтому не требуется процедура удаления криопротектора из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования. Известен способ замораживания бактерий [47]. Получают суспензию молочнокислых бактерий в жидкой питательной среде, состоящей из молочной сыворотки, гидролизованного молока, лимоннокислого или уксуснокислого натрия со стимулятором роста. В период роста клеток проводят нейтра- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 26 лизацию кислоты в культуральной жидкости. Затем бактерии отделяют от суспензии центрифугированием. Полученную биомассу смешивают в соотношении 1:1 с защитной средой и замораживают в виде гранул в жидком азоте, выдерживая их в этой среде около одного часа, после чего расфасовывают во флаконы и хранят при температуре не выше – 18 0С. Для получения защитной среды берут стерильные компоненты в следующем соотношении, мас.%: 10 – 50 глицерина, 5 – 20 сахарозы и 10 лимоннокислого натрия (буфера). Компоненты среды стерилизуют при давлении 1 атм в течение 10–15 мин. При хранении замороженного концентрата в течение 6 месяцев при температуре не выше – 18 0С не наблюдалось снижение активности. Предложен способ получения замороженного бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических бактерий [48]. Способ предусматривает приготовление питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение. В охлажденную питательную среду вносят комбинированную закваску, содержащую отдельно активизированные β-галактозидазой бифидобактерии штамм Bifidobacterium longum В 379 М, пропионовокислые бактерии штамм Propionibakterium Freudenreichii Shermanii subsp. AC–2503 и активизированную бактериальную закваску Lactobacillus acidophilus вязкой расы, взятые в соотношении 9:0,7:0,3 соответственно, в количестве 5 % от объема питательной среды. Культивируют в течение 14–16 часов при заданных параметрах процесса и отделяют клетки от культуральной жидкости с получением бактериальной массы. Смешивают полученную бактериальную массу с защитной средой в соотношении 1:1. Затем разливают во флаконы по 1 см3 (1 доза) и замораживают в морозильной камере при температуре минус 25 0С. Хранение концентрата осуществляют в морозильной камере при минус 18 0С. Замороженный концентрат сохраняет активность сквашивать молоко до 10 месяцев. Авторами патента РФ № 2129794 описан способ получения сухого препарата для производства кисломолочных продуктов. Способ предусматривает приготовление питательной среды и инокулята, заквашивание среды, АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 27 наращивание клеток, получение бактериальной массы, смешивание с защитной средой, розлив во флаконы или в лотки, замораживание, сушку. В качестве инокулята для заквашивания питательных сред используют активированную культуру Bifidobacterium longum В 379 М третьей генерации в количестве 1–5 %. Для получения сухого препарата в виде сухой закваски в качестве питательной среды используют обезжиренное или цельное молоко, при этом количество инокулята составляет 1–2 %. Для получения сухого препарата в виде бактериального концентрата используют питательную среду на основе молочной сыворотки, при этом количество инокулята составляет 3–5 %. Это позволяет повысить биохимическую активность бифидобактерий и создать сухой препарат, активно ферментирующий молоко и пищевые среды без добавления ростовых веществ. При получении сухого препарата в виде бактериального концентрата в составе защитной среды используют следующие компоненты, мас.%: сахароза – 10, натрий лимоннокислый трехзамещенный – 2, дистиллированная вода – 88. Кроме того, особенность способа заключается в том, что бактериальную массу охлаждают до минимальной температуры роста 20 0С и при этой температуре смешивают с защитной средой [49]. Известен способ получения замороженных концентрированных бактериальных культур [101]. Способ включает приготовление питательной среды, культивирование, центрифугирование, смешивание биомассы с защитной средой, замораживание и хранение при температуре минус 40 0С. В состав защитной среды входят следующие компоненты, мас.%: глицерин – 40, сахароза – 40, глутамат натрия – 10, вода – 10. Предложен способ консервирования молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii [50]. Способ предусматривает получение суспензии бактерий в жидкой питательной среде, отделение бактерий от суспензии центрифугированием с получением биомассы, смешивание полученной биомассы с защитной средой и замораживание полученной смеси при температуре –20 0С. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 28 При получении суспензии бактерий используют жидкую питательную среду, состоящую из сахарозы, солодовых ростков и мела, причем указанные компоненты берут в следующем соотношении мас.%: сахароза – 10–12, солодовые ростки – 3–5 и мел – 4–6. Биомассу смешивают с защитной средой, включающей 10%–ный водный раствор сахарозы и 10%–ный водный раствор глицерина. Полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки, охлаждают при температуре 4–6 0С и выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, затем замораживают при температуре минус 20 0С и хранят при данной температуре. Используемые в предлагаемом способе приготовления смеси биомассы молочнокислых бактерий и защитной среды установленного качественного и количественного состава, предварительное охлаждение смеси биомассы с защитной средой до заданной температуры и выдерживание ее при данной температуре в течение определенного времени позволяют получить биомассу с оптимизированной плотностью популяции молочнокислых бактерий, находящихся в стационарной фазе роста, избежать резких осмотических и температурных градиентов, создать условия для максимальной дегидратации клеток до начала фазового перехода вода–лед и, таким образом, предотвратить внутриклеточное льдообразование. В совокупности это обусловливает повышение резистентности клеток продуцента к повреждающим факторам, как при замораживании, так и при хранении в замороженном состоянии и способствует сохранению их морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности. Способ получения бактериального концентрата и применение его в качестве биологически активной добавки к пище или закваски прямого внесения для курунги [51]. Способ предусматривает выращивание симбиотической закваски из кефирной грибковой закваски и термофильных лактобактерий Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus helveticus (1:0,5:0,5:1) на питательной среде при 30±2 0С в течение 8–10 часов. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 29 Питательную среду готовят на основе творожной сыворотки, ржаной муки (2,5 % от объема питательной среды) и ростовых компонентов (натрий лимоннокислый трехзамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, сахароза, аскорбиновая кислота) и стерилизуют при 121 0С в течение 30 минут. После получения закваски производят отделение биомассы с получением жидкого бактериального концентрата. Для приготовления закваски прямого внесения полученный жидкий бактериальный концентрат смешивают с защитной средой в соотношении 1:1 и разливают во флаконы и замораживают в морозильной камере при температуре минус 20 0 С. Срок хранения бактериального концентрата при температуре минус 18 0С составляет 6 месяцев. В состав защитной среды входят следующие компоненты, г/л: дистиллированная вода – 1000, сахароза – 100, натрий лимоннокислый трехзамещенный – 20. Ржаная мука содержит все питательные вещества (углеводы, белковые вещества, минеральные вещества, витамины), необходимые для развития микрофлоры симбиотической закваски. Углеводы ржаной муки состоят из клетчатки, пентозанов, гемицеллюлоз, крахмала, декстринов, мальтозы, глюкозы и других сахаров. Значительная часть полисахаридов и белковых веществ являются водорастворимыми. По аминокислотному составу белки ржаной муки характеризуются высоким содержанием незаменимых аминокислот – лизина, аргинина и треонина. Добавление к среде натрия лимоннокислого создает буферную емкость, а защитное действие сахарозы объясняется способностью гидратироваться, понижать точку замораживания воды и замедлять скорость кристаллизации. Высокая выживаемость пробиотических бактерий после замораживания также связана с присутствием в бакконцентрате ржаной муки, повышающей межклеточную когезию и адгезию. Когезия и адгезия являются эволюционно выработанными механизмами адаптации микроорганизмов к изменениям АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 30 окружающей среды, позволяющие клеткам сохранять жизнеспособность в экстремальных условиях окружающей среды. Авторами патента РФ № 2272548 предложен способ получения бактериального концентрата [52]. Данный способ включает приготовление питательной среды, введение посевной культуры в питательную среду, выращивание культуры до получения готового продукта и последующее его охлаждение до 18 0С. Согласно изобретению питательную среду готовят на основе гидролизата молока, в нее дополнительно вводят лактит, L-цистеин солянокислый, NaCl или КН2РО4 и стабилизирующую добавку с последующей стерилизацией при следующем количественном соотношении ее ингредиентов, мас.%: – гидролизат молока – 43,8–44,2; – лактит – 1,8–2,2; – L-цистеин солянокислый – 0,008–0,03; – КН2РО4 или NaCl соответственно (0,031–0,035) или (0,38–0,42); – стабилизирующая добавка – 0,8–0,95; – вода – остальное. Причем посевную культуру Bifidobacterium или Lactobacillus вводят в количестве соответственно 5 и 3 % от объема питательной среды, а выращивание осуществляют до получения бактериального концентрата с титром от 1010 до 1012 КОЕ/мл и кислотностью в пределах от 70 до 100 0Т. Выбранный состав и соотношение ингредиентов питательной среды, а также режим культивирования обеспечивают получение бактериального концентрата с высокой биологической активностью, обусловленной высоким титром лакто– и бифидобактерий от 1010до 1012 КОЕ/мл, за короткий срок ферментации (4–6 часов) в анаэробных условиях. По показателю оптической плотности контролируют окончание процесса ферментации и получение готового концентрата с заданным титром лакто– и бифидобактерий. Указанные пределы кислотности поддерживают названную концентрацию лакто– и бифидобактерий в готовом концентрате в течение длительного срока хранения. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 31 В качестве посевной культуры могут быть использованы различные виды Bifidobacterium (В.) или Lactobacillus (L.), в частности B. bifidum, B. longum, L. acidophilus, L. bulgaricus, L. plantarum и др. Введение лактита обеспечивает длительный срок хранения готового бактериального концентрата практически без изменения титра лакто– и бифидобактерий. Использование в качестве основы питательной среды гидролизата молока значительно расширяет диапазон использования получаемого концентрата, в частности его с успехом можно применять для приготовления кисломолочных продуктов для детей до года. Гидролизат молока, являющийся основой для приготовления питательной среды, служит источником пептидов – стимуляторов роста бифидо– и лактобактерий. L-цистеин солянокислый используется как антиоксидант при выращивании анаэробов, NaCl или КН2РО4 обеспечивает изотоничность питательной среды и играет роль буфера, сдерживая наращивание концентрации свободных органических кислот, что обеспечивает при дальнейшем хранении оптимальные условия для бифидо– или лактобактерий. В качестве стабилизирующей добавки целесообразно использовать агар–агар, который уменьшает скорость диффузии кислорода из воздуха за счет увеличения плотности среды, тем самым создаются анаэробные условия, обеспечивающие скорость роста бифидо– или лактобактерий и сохранения их жизнеспособности длительное время. Целесообразно в качестве стабилизирующей добавки использовать смесь агар–агара с пектином при массовом соотношении 1:1. Желательно в гидролизат молока дополнительно вводить дрожжевой автолизат в количестве 2 мас.%. Автолизат дрожжевой является поставщиком аминного азота и витаминов группы В и PP. Его включение в питательную среду обеспечивает получение с помощью бактериального концентрата кисломолочного продукта, который при его применении сокращает продол- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 32 жительность диарейного синдрома и симптомов интоксикации, а также улучшает показатели клеточного звена иммунитета. Целесообразно для поддержания высокого титра лакто– и бифидобактерий при длительном хранении вводить в готовый продукт после его охлаждения лактит в количестве 1 мас.%. Консорциум молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus, используемый для приготовления кисломолочных продуктов и бактериальных препаратов, способ получения сухой закваски ацидофильных молочнокислых бактерий и способ производства кисломолочного продукта [53]. Данный способ заключается в следующем: обезжиренное молоко стерилизуют, охлаждают и вносят закваску консорциума L.acidophilus ТНН–92, после сквашивания нейтрализуют 5 %–ным раствором аммиака, смешивают с защитной средой в соотношении 1:1. В составе защитной среды используют сахарозу и глицерин. Разливают во флаконы или лотки и помещают их в сублиматор, предварительно охлажденный до минус 35 0С. Закваску замораживают до –25 0 С и выдерживают при этой температуре 3–5 ч, а затем сушат при +35 0С в течение 16–18 ч. Флаконы укупоривают стерильными резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками, а сухую биомассу с лотков расфасовывают в специальные пакеты, обеспечивающие стерильность и герметичность. Хранят закваску при 6±2 0С в течение 12 мес. Авторами предложен способ получения бактериального концентрата для сквашивания молока [54].Способ получения бактериального концентрата предусматривает приготовление питательной среды на основе гидролизованного восстановленного молока с добавлением глюкозы или лактозы, лимоннокислого натрия, дрожжевого экстракта, сернокислого марганца и воды, внесение закваски, накопление клеток с периодической нейтрализацией, выделение биомассы клеток из культуральной жидкости, смешивание ее с защитной средой, замораживание и сублимационную сушку. При заквашивании питательной среды используют отселекционированные вязкие штаммы АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 33 Streptococcus lactis, S. cremoris и S. diacetilactis с повышенной деацетилобразующей способностью для обеспечения бактериальному концентрату оптимального соотношения диацетила и ацетальдегида (3,0:1–5,0:1). В момент заквашивания и в стадии активного роста клеток в питательную среду дополнительно вводят экстракт подсолнечной лузги в количестве 0,3–0,5 %. В качестве защитной среды используют стерильное молоко с массовой долей сухих веществ 16 % с добавлением к нему 1 % двузамещенного фосфорнокислого натрия. При этом соотношение биомассы выделенных клеток и защитной среды устанавливают равным 1:3–1:5. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 34 ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В настоящей главе рассмотрены вопросы, касающиеся организации выполнения работы, объектов и методов исследования. Представлены результаты собственных исследований и их обсуждение. 2.1 Организация выполнения работ Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждении высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)». Общая схема исследования изображена на рисунке 2.1.1. Весь цикл исследований состоит из нескольких взаимосвязанных этапов. На первом этапе проводили анализ отечественных и зарубежных литературных данных по теме исследования, формулировали цель и задачи собственных исследований. На втором этапе разрабатывали состав питательной среды для культивирования молочнокислых бактерий. Выбирали среду с наибольшим показателем концентрации клеток. На третьем этапе проводили исследования по подбору оптимальных условий культивирования лактобактерий. На четвертом этапе разрабатывали защитную среду для концентратов лактобактерий. Выбирали среду с наибольшим показателем концентрации жизнеспособных клеток. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 35 На заключительном этапе исследовали показатели полученных замороженных бактериальных концентратов при хранении. Исследование и разработка криозамороженных бактериальных концентратов лактобактерий Анализ отечественных и зарубежных литературных данных, формулировка цели и задач собственных исследований Разработка питательной среды для культивирования лактобактерий Подбор оптимальных условий культивирования – концентрация клеток – рН – кислотность – температура культивирования – рН среды лактобактерий – продолжительность культивирования Модификация защитной среды -– концентрация жизнеспособных клеток для концентратов лактобактерий – рН среды – соотношение защитной среды и биомассы клеток Получение криозамороженных – концентрация жизнеспособных клеток концентратов лактобактерий и – температура хранения исследование их показателей при хранении – активность лактобактерий Практическая реализация результатов исследований Рисунок 2.1.1 – Общая схема проведения исследований АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 36 2.2 Объекты исследования, оборудование Объектами исследований на различных этапах являлись: – сухие культуры микроорганизмов: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus; – вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72); – питательная среда Ли (ГОСТ Р 54065-2010); – питательная среда для молочнокислых бактерий (ГОСТ 10444.11-89); – гидролизованное молоко (ГОСТ 10444.1-84); – дрожжевой экстракт (ГОСТ 30134-97); – обезжиренное молоко (ГОСТ 30425-97); – глицерин (ГОСТ 6269); – сахароза (ГОСТ 5833-75); – лимоннокислый натрий (ГОСТ 22280-76); – желатин (ГОСТ 11293-89); – фосфатный буфер с pH 7,2 (ГОСТ 9225). В ходе исследований использовалось оборудование: – шкаф электрический суховоздушный, ШСвЛ-80 – «Касимов» (ТУ 9452-005-07505566-98 №147), производство Россия; – автоклав электрический, DGM Pressure Gauge (ГОСТ 9586-75), производство Китай; – бокс биологической безопасности, оборудованный бактерицидными лампами, класс 2 (тип А), Lamsystems, производство Россия; – инкубатор (Shaking incubator), LabTech LSI–301A, производство Корея; – весы электронные аналитические, AND HR–202, производство Япония; – рН–метр рН–150МИ, производство Россия. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 37 2.3 Методы исследований Для решения задач, поставленных в работе, применяли стандартные, общепринятые методы исследования (микробиологические, химические и физико–химические). 2.3.1 Культивирование микроорганизмов При разработке питательной среды с максимальным накоплением клеток молочнокислых бактерий приготовили пять вариантов питательных сред, варианты питательных сред представлены в таблице 2.3.1.1. Таблица 2.3.1.1 – Варианты питательных сред Вариант питательной среды Компоненты Обезжиренное молоко – обезжиренное молоко Обезжиренное молоко с дрожжевым – обезжиренное молоко; экстрактом – дрожжевой экстракт Гидролизованное молоко – гидролизованное молоко Гидролизованное молоко с дрожжевым – гидролизованное молоко; экстрактом – дрожжевой экстракт – гидролизат казеина; – дрожжевой экстракт; – лактоза; Питательная среда для молочнокислых – глюкоза; бактерий – сахароза; – натрия хлорид; – натрия ацетат; – кислота аскорбиновая АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 38 Колбы с питательными средами автоклавировали при температуре 121±2 0С в течение 20–30 минут и охлаждали до 40±2 0С. В питательные среды вносили Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в количестве 3 % от объема питательной среды и инкубировали при температуре 43±2 0С в течение 24 часов. По окончании культивирования выбрали питательную среду с максимальным накоплением клеток Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus . 2.3.2 Дифференциация микроорганизмов на среде Ли Среда Ли с бромкрезоловым пурпурным предназначена для раздельного подсчета Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в йогуртовых заквасках. Состав питательной среды представлен в таблице 2.3.2.1. Таблица 2.3.2.1 – Состав питательной среды Ли Компоненты Концентрация компонентов, г/л Гидролизат казеина 10,00 Дрожжевой экстракт 10,00 Лактоза 5,00 Сахароза 5,00 Кальция карбонат 3,00 Калия гидрофосфат 0,50 Бромкрезоловый пурпурный 0,02 Агар–агар 18,00 Компоненты среды растворяли в дистиллированной воде, стерилизовали в автоклаве температуре 121±2 0С в течение 15–20 минут и охлаждали до АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 39 40±2 0С. После культивирования Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus готовили разведения в пробирках на физиологическом растворе. Стерильной пипеткой 1 мл исследуемого образца вносили в первую пробирку с 9 мл физиологического раствора, получали разведение 1:10. Новой стерильной пипеткой перемешивали разведение 1:10 и 1 мл, его переносили во вторую пробирку с 9 мл физиологического раствора, получали разведение 1: 100 и т.д. Делали 7 разведений. Из последних трех разведений делали посев на чашки Петри со средой Ли по 1 мл. Среду заливали в чашки слоем 4–5 мм. С целью предохранения посевов от загрязнения посторонними микроорганизмами постановку опытов проводили в стерильном боксе, в стерильных перчатках, шапочке и халате. Посевы инкубировали крышкой вниз в течение 18–24 часов при температуре 37±2 0С. Готовая питательная среда имеет лиловую окраску. Дифференцирующие свойства питательной среды основаны на изменении рН в кислую сторону при росте Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus, которые образуют на среде колонии желтого цвета. По истечении времени вели подсчет колоний, выросших на чашках Петри. 2.3.3 Метод определения активной кислотности Метод основан на измерении концентрации водородных ионов в исследуемом растворе с помощью прибора pH–метра. Определение активной кислотности исследуемых образцов проводили согласно ГОСТ 26781-85 с помощью иономера рН–150 МИ. Перед измерением электрод тщательно промывали дистиллированной водой, остатки воды с электрода удаляли фильтровальной бумагой. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 40 В стеклянный стакан вместимостью 50 или 100 мл наливали 40±5 мл закваски с температурой 20±2 0С и погружали в него электрод прибора. При этом электрод не должен касаться стенок и дна стакана. Показания считывали через 3–5 с после установления значения. 2.3.4 Метод определения титруемой кислотности Метод основан на нейтрализации кислот, содержащихся в продукте, раствором гидроокиси натрия в присутствии индикатора фенолфталеина. Титруемую кислотность исследуемого продукта определяли титрованием по ГОСТ 3624-92. В колбу вместимостью 100 мл вносили 10 мл анализируемого продукта, 20 мл дистиллированной воды и 3 капли фенолфталеина. При анализе остатки продукта переносили из пипетки в колбу путем промывания пипетки полученной смесью 3–4 раза. Смесь тщательно перемешивали и титровали 0,1Н раствором гидроокиси натрия до появления слабо– розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Титруемую кислотность исследуемой пробы (Х) в градусах Тернера определяли по формуле 2.3.4.1. Х=V·10, (2.3.4.1) где V – объем 0,1М раствора гидроокиси натрия, пошедший на титрование для нейтрализации кислот, содержащихся в пробе, мл. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 41 2.4 Результаты исследований В данном разделе представлены результаты собственных исследований и проведен анализ влияния условий культивирования на накопление клеток молочнокислых бактерий и температуры хранения на выживаемость криозамороженных бактериальных концентратов. В качестве объектов исследования выбраны микроорганизмы рода Streptococcus и Lactobacillus. 2.4.1 Разработка питательной среды для культивирования лактобактерий Для подбора питательной среды с максимальным накоплением Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus приготовили пять вариантов питательных сред. Состав питательных сред представлен в таблице 2.3.1.1. После приготовления питательных сред измеряли рН. Из литературных источников известно, что оптимальные значения рН для роста и развития микроорганизмов рода Streptococcus и Lactobacillus колеблется в интервале 7,0±0,2. Приготовленные питательные среды имеют рН, входящий в эти приделы, и подходят для выращивания микроорганизмов. Колбы с питательными средами автоклавировали при температуре 121±2 0С в течение 20–30 минут и охлаждали до 40±2 0С. Затем в колбы вносили Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в количестве 3% от объема питательной среды и ставили в термостат, после культивирования готовили разведения и вносили в чашки Петри по 1 мл пробы из последнего разведения, затем заливали чашки средой Ли. Засеянные чашки Петри инкубировали при температуре 37±2 0С в течение 18–24 часов. По истечении вре- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 42 мени вели подсчет колоний, выросших на чашках Петри. Результаты представлены в таблице 2.4.1.1. Из данных, представленных в таблице 2.4.1.1, видно, что в средах, содержащих дрожжевой экстракт, концентрация культур молочнокислых бактерий увеличивается в среднем в два раза по сравнению со средами, в которых он отсутствует. Следовательно, дрожжевой экстракт является ростовым фактором. Наименьшее количество Streptococcus thermophilus ((1±2)∙107 КОЕ/мл) и Lactobacillus bulgaricus ((2±2)∙107 КОЕ/мл) имеет синтетическая питательная среда. В результате чего, можно сделать вывод, что данные молочнокислые бактерии лучше растут в естественных питательных средах. Таблица 2.4.1.1 – Биохимическая активность закваски Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus Питательная среда Титруемая Обезжиренное молоко с дрожжевым экстрактом Гидролизованное молоко Гидролизованное молоко с дрожжевым экстрактом Питательная среда для МКБ Концентрация, КОЕ/мл кислот- Lactobacillus Streptococcus ность, pH bulgaricus thermophilus 106±2 4,19±0,2 (18±2)∙107 (15±2)∙107 119±2 4,16±0,2 (32±2)∙107 (27±2)∙107 70±2 4,15±0,2 (5±2)∙107 (3±2)∙107 80±2 4,18±0,2 (9±2)∙107 (8±2)∙107 68±2 4,21±0,2 (2±2)∙107 (1±2)∙107 кислотность, 0Т Обезжиренное молоко Активная Для дальнейших исследований выбрали среду обезжиренное молоко с дрожжевым экстрактом. По полученным данным эта питательная среда содержит наибольшее количество Streptococcus thermophilus ((27±2)∙107 КОЕ/мл) и Lactobacillus bulgaricus ((32±2)∙107 КОЕ/мл). АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 43 2.4.2 Подбор оптимальных условий культивирования лактобактерий В колбу с обезжиренным молоком с дрожжевым экстрактом после автоклавирования вносили Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в количестве 3 % от объема питательной среды и ставили в термостат при температуре 30±2 0С и 43±2 0С. Культивирование проводили в течение 12 и 24 часов. По истечение времени готовили 7 разведений и из последних двух разведений делали посев на чашки Петри со средой Ли. Посевы инкубировали крышкой вниз в течение 18–24 часов при температуре 37±2 0С. По истечении времени вели подсчет колоний, выросших на чашках Петри. На рисунках 2.4.2.1 и 2.4.2.2 показана зависимость концентрации Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus от температуры и продолжительности культивирования. Концентрация, ∙10⁷ КОЕ/мл 20 18 16 1 14 12 2 10 8 6 4 2 0 0 4 8 12 16 20 24 Продолжительность культивирования, ч Рисунок 2.4.2.1 – Зависимость концентрации Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus от продолжительности культивирования при температуре 43±2 0С 1 – Lactobacillus bulgaricus, 2 – Streptococcus thermophilus АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 44 В результате установили, что концентрация Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в среде, культивировавшейся при температуре 43±2 0 С максимальна после 12 часов культивирования. После 12 часов культивирования концентрация Streptococcus thermophi- lus – (15±2)∙107 КОЕ/мл, Lactobacillus bulgaricus – (18±2)∙107 КОЕ/мл, а после 24 часов – (13±2)∙107 КОЕ/мл и (16±2)∙107 КОЕ/мл соответственно. Коцентрация, ∙10⁷ КОЕ/мл 12 10 1 8 2 6 4 2 0 0 4 8 12 16 20 24 Продолжительность культивирования, ч Рисунок 2.4.2.2 – Зависимость концентрации Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus от продолжительности культивирования при температуре 30±2 0С 1 – Lactobacillus bulgaricus, 2 – Streptococcus thermophilus Концентрация Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в среде, культивировавшейся при температуре 30±2 0С максимальна после 12 часов культивирования. В последующие часы их концентрация уменьшается. После 12 часов культивирования концентрация Streptococcus thermophilus – (9±2)∙107 КОЕ/мл, Lactobacillus bulgaricus – (11±2)∙107 КОЕ/мл, а после 24 часов – (8±2)∙107 КОЕ/мл и (10±2)∙107 КОЕ/мл соответственно. Проанализировав полученные данные, установили, оптимальные условия культивирования для получения максимальной концентрации Strepto- АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 45 coccus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus в среде: pH среды 7,0±2, продолжительность культивирования – 12 часов, температура – 43±2 0С. 2.4.3 Модификация защитной среды для концентратов лактобактерий В процессе замораживания на живые объекты воздействуют два повреждающих фактора: формирование внутриклеточного льда и обезвоживание. Внесение живых объектов в защитные среды и замораживание в этих средах снижает формирование внутриклеточного льда и обезвоживание. Существует большое количество веществ, которые обладают криопротекторными свойствами, но на практике используют около десяти соединений. Согласно литературным данным использование проникающих криопротекторов в отсутствии непроникающих криопротекторов неэффективно, так как при использовании защитных сред сложного состава выживаемость биологического материала после замораживания выше. Для оценки влияния защитных сред на выживаемость концентратов бактерий Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus были составлены среды сложного состава с различным содержанием глицерина, сахарозы, лимоннокислого натрия и желатина. Содержание компонентов в защитных средах представлено в таблице 2.4.3.1. При приготовлении защитных сред в качестве проникающего криопротектора использовали глицерин, в качестве непроникающих криопротекторов применяли сахарозу и желатин. Фосфатный буфер с pH 7,2 использовали в качестве основы защитных сред. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 46 Таблица 2.4.3.1 – Содержание компонентов в защитной среде Вариант Лимоннокислый Глицерин, % Сахароза, % 1 10 15 5 - 2 10 10 - 10 3 15 - 10 - 4 15 10 - 5 5 20 15 5 5 6 20 10 10 - 7 30 - - 10 8 - 15 5 10 9 - 15 10 - защитной среды натрий, % Желатин, % На рисунке 2.4.3.1 показана зависимость выживаемости Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus от состава защитной среды. 100 90 Выживаемость, % 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Вариант защитной среды Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus Рисунок 2.4.3.1 – Зависимость выживаемости Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus от состава защитной среды АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 47 Согласно данным, представленным на рисунке 2.4.3.1, наиболее высокая выживаемость Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus наблюдается при использовании защитных сред под номерами 4, 5 и 6. При смешивании молочнокислых бактерий с защитными средами под номерами 7, 8 и 9 их выживаемость меньше почти в 2 раза, так как высокая концентрация глицерина оказывает токсическое действие на Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus, а его отсутствие существенно снижает выживаемость исследуемых микроорганизмов. Для дальнейших исследований выбрали среду № 5. Соотношение компонентов в данной среде обеспечивает наиболее полное сохранение Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus. Для оценки влияния соотношения биомассы и защитной среды на выживаемость молочнокислых бактерий нами были исследованы 2 дозировки внесения защитной среды. Результаты представлены в таблице 2.4.3.2. Таблица 2.4.3.2 – Влияние соотношения биомассы и защитной среды на выживаемость Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus Соотношение биомассы и Выживаемость, КОЕ/мл защитной среды Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus 1:0,7 (18±2)∙107 (15±2)∙107 1:1 (30±2)∙107 (26±2)∙107 Согласно данным, представленным в таблице 2.4.3.2, соотношение биомассы и защитной среды оказывает существенное влияние на выживаемость клеток. При уменьшении дозы защитной среды на 30 % снижается количества жизнеспособных клеток в среднем в 1,7 раза. Следовательно, в дальнейшей работе будет применяться соотношение бактериальной массы и защитной среды 1:1. Одними из важных факторов, влияющих на выживаемость микроорганизмов при замораживании, являются активная кислотность (pH) и темпераАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 48 тура смешивания биомассы клеток с защитной средой. С целью определения влияния активной кислотности проводили сравнительное изучение криорезистентности клеток Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus при рН 4,2±0,1 и рН 7,0±0,1. Значение активной кислотности в пределах 4,2±0,1 устанавливается в питательной среде после ферментации, а значение 7,0±0,1 устанавливали с помощью 20 % раствора едкого натра. Для установления влияния температуры смешивания бактериального концентрата с защитной средой на выживаемость молочнокислых бактерий исследовали 3 варианта температурного воздействия. В первом варианте температура смешивания составляла 20±1 0С, что соответствует минимальной температуре роста исследуемых бактерий, во втором – 25±1 0С и в третьем – 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 7 7 4,2 4,2 20 25 30 Активная кислотность, pH Выживаемость, % 30±1 0С. Результаты представлены на рисунке 2.4.3.2. Температура смешивания, °С Рисунок 2.4.3.2 – Влияние активной кислотности и температуры смешивания биомассы с защитной средой на выживаемость бактерий Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus Анализ данных рисунка 2.4.3.2 показал, что значение активной кислотности 4,2±0,1 отрицательно сказывается на выживаемости Lactobacillus bulgaricus (60±5 %) и Streptococcus thermophilus (55±5 %) по сравнению со значением АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 49 7,0±0,1, при котором выживаемость исследуемых бактерий составила около 95 %. Это можно объяснить тем, что при замораживании и хранении бактериальных концентратов продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий, в первую очередь Н+– ионы, образующиеся при диссоциации молочной кислоты и других кислот, оказывают губительное действие на клетки. С понижением температуры смешивания от 30±1 0С до 20±1 0С наблюдается увеличение выживаемости бактерий, что соответствует литературным данным. Так как при минимальной температуре роста молочнокислых бактерий понижается уровень жизнедеятельности бактерий, замедляются обменные процессы и клетки лучше адаптируются к изменившимся условиям. В результате проведенных исследований подобрали защитную среду с определенным содержанием компонентов, включающую глицерин – 20 %, сахароза – 15 %, лимоннокислый натрий – 5 %, желатин – 5 % и фосфатный буфер с pH 7,2 – 55 %. Определили оптимальные условия для получения замороженных бактериальных концентратов: соотношение биомассы и защитной среды – 1:1; значение активной кислотности биомассы клеток – 7,0±0,1; температура смешивания концентратов с защитной средой – 20±1 0С. Так же согласно исследованиям [82, 85] наибольшая криорезистентность микроорганизмов наблюдалась в конце активного роста и начале стационарной фазы развития, а время эквилибрации, т.е. время взаимодействия криопротектора на клетки от момента смешивания составляет 20 минут. 2.4.4 Получение криозамороженных концентратов лактобактерий и исследование их показателей при хранении Биомассу клеток Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus нейтрализовали до 7,0±0,1 ед. pH 20–ным % раствором гидроокиси натрия и АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 50 смешивали с защитной средой в соотношении 1:1 при температуре 20±1 0С. Затем полученную смесь выдерживали в течение 20 минут и замораживали в низкотемпературном шкафу при температуре минус 50±1 0С в течение 5 часов. Из литературных источников известно, что на стойкость бактериального концентрата большое влияние оказывает температура хранения. В связи с этим дальнейшие наши исследования были направлены изучение стойкости замороженной закваски в процессе хранения при температурах минус 18±1 0С и минус 50±1 0С. Полученные результаты представлены в таблицах 2.4.4.1 и 2.4.4.2. Таблица 2.4.4.1 – Изменение биохимической активности замороженного бактериального концентрата в процессе хранения при минус 18±1 0С Продолжительность хранения, суток Кислотность Активная, ед.pH Титруемая, 0 Т Активность, ч Концентрация, КОЕ/мл Lactobacillus Streptococcus bulgaricus thermophilus 0 4,15±0,2 117±2 12 (30±2)∙107 (26±2)∙107 1 4,15±0,2 118±2 12 (30±2)∙107 (27±2)∙107 30 4,14±0,2 117±2 12 (28±2)∙107 (25±2)∙107 Таблица 2.4.4.2 – Изменение биохимической активности замороженного бактериального концентрата в процессе хранения при минус 50±1 0С Продолжительность хранения, суток Кислотность Активная, ед.pH Титруемая, 0 Т Активность, ч Концентрация, КОЕ/мл Lactobacillus Streptococcus bulgaricus thermophilus 0 4,15±0,2 117±2 12 (29±2)∙107 (26±2)∙107 1 4,14±0,2 117±2 12 (30±2)∙107 (26±2)∙107 30 4,14±0,2 116±2 12 (28±2)∙107 (26±2)∙107 Согласно данным, представленным в таблицах 2.4.4.1 и 2.4.4.2, хранение в течение 30 суток при температурах – 18±1 0С и – 50±1 0С оказывает незначительное влияние на количество жизнеспособных клеток Streptococcus thermophАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 51 ilus и Lactobacillus bulgaricus. После активизации замороженных бактериальных концентратов при данных температурах хранения время сквашивания не изменилось и составило 12 ч. Практически не изменились титруемая кислотность и активная кислотность. Таким образом, результаты исследований указывают на возможность хранения замороженных концентратов Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus, как при температуре минус 18±1 0С, так и при минус 50±1 0С. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 52 ГЛАВА 3 ИНЖЕНЕРНЫЙ РАЗДЕЛ В данном разделе описаны основные этапы производства криозамороженного бактериального концентрата лактобактерий. 3.1 Процессуальная схема производства криозамороженного бактериального концентрата На основании полученных данных разработана технология получения криозамороженного бактериального концентрата лактобактерий. Технологический процесс производства концентрата состоит из стадий, представленных на рисунке 3.1.1. Приготовление посевного материала осуществляется в лаборатории. Для приготовления первичной лабораторной закваски сухие культуры молочнокислых бактерий активизируют путем внесения части сухой закваски в стерилизованное при температуре (121±2) 0С молоко, перемешивают и помещают в термостат при температуре (43±2) 0С до образования сгустка. Из лабораторной закваски готовят пересадочную лабораторную закваску, внося в стерилизованное при температуре (121±2) 0С молоко 3 % инокулята. Полученную закваску отправляют в производство. Культивирование посевной культуры проводят в ферментере. После проверки на герметичность ферментер стерилизуют при 120±5 0С в течение 60 мин, затем в него вводят питательную среду. Для наращивания биомассы Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus использовуют обезжиренное молоко с добавлением дрожжевого экстракта. Ферментер снабжен мешалкой и автоматическим регулированием температуры и АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 53 pH на заданном уровне. Среду стерилизуют при температуре 121±2 0С в течение 20–30 минут и охлаждают до 40±2 0С. Рисунок 3.1.1 – Процессуальная схема производства замороженных бактериальных концентратов лактобактерий АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 54 В стерильную питательную среду в асептических условиях вносят посевной материал в количестве 3 % от объема питательной среды. Культивирование ведут при температуре 43±2 0С в течение 12 часов, при автоматическом поддержании рН в пределах 7,0±0,1. После культивирования проводят контроль биомассы. Количество посторонней микрофлоры должно соответствовать нормам, активная кислотность должна быть на заданном уровне. После получения биомассы лактобактерий, проводят ее охлаждение до 20±2 0С и направляют на бактофугирование для получения бактериальной массы. Отделение клеток от среды осуществляют в конце логарифмической фазы роста, когда в культуральной жидкости содержатся сотни миллионов – единицы миллиардов активных клеток. Бактериальную массу из культуральной жидкости выделяют на бактофуге. Для этой цели можно использовать центрифугу при 3000 об/мин в течение 15 минут. Для приготовления защитных сред в основу среды, в качестве которой используют фосфатный буфер с рН 7,2, вносят криопротекторы в соответствии с рецептурой среды. Компоненты среды перемешивают, стерилизуют при температуре 121±2 0С в течение 15 минут и охлаждают до 20±2 0С. Полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, выдерживают в течение 20 мин, разливают во флаконы по 2 мл и замораживают в низкотемпературном шкафу при температуре минус 50±1 0С в течение 5 часов. Флаконы с замороженным концентратом лактобактерий закрывают резиновыми пробками и металлическими колпачками. Хранение замороженных бактериальных концентратов осуществляют в морозильной камере при температуре минус 18±1 0С. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 55 3.2 Технологическая схема производства замороженного бактериального концентрата Технологическая схема производства бактериального концентрата с применением криозамораживания представлена на рисунке 3.2.1. В соответствии с компонентным составом питательной среды производят ее предварительную подготовку и смешивание. Компоненты среды поступают в смеситель 1 для приготовления производственной питательной среды. Среда стерилизуется в смесителе 1 путем подачи в рубашку аппарата насыщенного пара. Затем питательная среда с помощью насоса 2 поступает в инокулятор 3 и ферментер 5, где она охлаждается путем подачи в рубашку аппаратов холодной воды. Так же в инокулятор 3 поступает исходная культура и выращивается в нем, после чего выращенный посевной материал с помощью насоса 4 передается в ферментер 5. После культивирования культуральная жидкость, содержащая биомассу клеток, с помощью насоса 6 поступает в центрифугу 7, где происходит отделение клеток от культуральной жидкости. После центрифугирования концентрат клеток подают в смеситель 11. Компоненты защитной среды поступают в смеситель 8, где происходит растворение компонентов и стерилизация защитной среды за счет подачи в рубашку аппарата насыщенного пара. После стерилизации среда охлаждается в теплообменнике 10, затем поступает в смеситель 11, в котором происходит смешивание биомассы клеток с защитной средой и выдерживание в течение 20 мин. Затем полученную смесь замораживают в низкотемпературном шкафу 12 и далее замороженный бактериальный концентрат направляют на склад. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 56 Изм. Лист № докум. Подпись Дата АТО 00.00.000 ПЗ Лист 57 Рисунок 3.2.1 – Технологическая схема производства замороженного бактериального концентрата 1 – смеситель питательной среды; 2, 4, 6, 9 – насос; 3 – инокулятор; 5 – ферментер; 7 – центрифуга; 8 – смеситель защитной среды; 10 – теплообменник; 11 – смеситель биомассы с защитной средой; 12 – низкотемпературный шкаф; 13 – весы. Таблица 3.1 – Качественная характеристика разработанного бактериального концентрата Наименование показателя Консистенция и внешний вид Цвет Показатель Столбик замороженной суспензии Кремовый Время сквашивания, ч Активная кислотность, ед. pH 12 4,15±0,2 Количество, КОЕ/мл: Streptococcus thermophilus (25±2)∙107 Lactobacillus bulgaricus (28±2)∙107 Объем продукта (см3), в котором не допускаются: БГКП 2 Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) 10 Дрожжи в 1 см3, не более 5 Плесени в 1 см3, не более 5 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 58 ГЛАВА 4 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Задачей экономической части является расчет себестоимости бактериального концентрата лактобактерий с применением криозамораживания и экономическое обоснование использования готового бактериального концентрата. 4.1 Расчет себестоимости бактериального концентрата Расчет себестоимости бактериального концентрата осуществляется укрупнено калькуляционным методом по следующим статьям калькуляции: 1. Сырье и основные материалы. 2. Транспортные расходы. 3. Вспомогательные материалы. 4. Топливо и энергия на технологические цели. 5. Основная и дополнительная заработная плата производственных рабочих. 6. Отчисления на социальные нужды. 7. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования. 8. Цеховые расходы. 9. Общезаводские расходы. 10. Внепроизводственные расходы. 1. Стоимость сырья и основных материалов определяется по нормам расхода всех видов сырья и материалов на единицу готовой продукции, приведенных в рецептуре. Расчет потребности и стоимости сырья и основных материалов представлен в таблице 4.1.1 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 59 Таблица 4.1.1 – Расчет потребности сырья и основных материалов Наименование продукции и Выпуск про- видов сырья дукции, л Расход сырья Оптовая це- на ед. продук- на ед. сырья, ции, кг (л) руб. Стоимость сырья, руб. Бактериальный концентрат: 1 - - - Молоко обезжиренное - 1,000 30,0 30,0 Дрожжевой экстракт - 0,100 500,0 50,0 Глицерин - 0,100 110,0 11,0 Сахароза - 0,075 175,0 11,25 Натрий лимоннокислый - 0,025 140,0 3,5 Желатин - 0,025 160,0 4,0 Фосфатный буфер с pH 7,2 - 0,275 155,0 42,63 Lactobacillus bulgaricus - 0,0015 2800,0 4,2 Streptococcus thermophilus - 0,0015 2800,0 4,2 Итого: 160,78 2. Транспортные расходы включают затраты на доставку сырья и материалов. Их величина рассчитывается укрупнено 15–20 % от стоимости сырья. Транспортные расходы составляют 24,12 руб. 3. Расход на вспомогательные материалы включает стоимость химикатов, текстильных материалов, смазочных материалов, тары, моющих средств, инвентаря, упаковочных материалов, которые необходимы для выпуска единицы продукции. Расчет ведется методом прямого счета и оформляется в виде таблицы 4.1.2. Таблица 4.1.2 – Расход на вспомогательные материалы Наименование вспомогательных материалов Расход материалов на ед. продукции, шт. Цена за ед. Стоимость материала, вспомогательных руб. материалов, руб. Флакон 500 0,6 300,0 Пробка 500 0,3 150,0 Колпачок 500 0,2 100,0 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 60 Продолжение таблицы 4.1.2 Наименование вспомогательных Расход материалов на материалов ед. продукции, шт. Цена за ед. Стоимость материала, вспомогательных руб. материалов, руб. Коробочка 50 1,7 85,0 Коробка 1 4,0 4,0 Итого: 639,0 4. Затраты топлива и энергии на технологические цели (электроэнергия, вода и др.) рассчитываются прямым счетом с учетом соответствующих норм расходов технологического оборудования в размере 15 % от стоимости сырья и основных материалов. Затраты топлива и энергии на технологические цели составляют 24,12 руб. 5. Размер основной и дополнительной заработной платы производственных рабочих на единицу продукции определяется укрупнено в размере 8–15 % от стоимости сырья и составляет 12,86 руб. 6. Отчисления на социальные нужды включают в себя: – отчисления на социальные нужды (ОСН) равные 30 % от фонда оплаты труда производственных рабочих и предназначенные для формирования пенсионного фонда, фонда медицинского страхования и фонда социального страхования; – страхование от несчастных случаев в размере 0,2 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. Отчисления на социальные нужды составляют 3,85 руб. Страхование от несчастных случаев составляют 0,03 руб. 7. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования определяются укрупнено в размере 30–50 % от фонда оплаты труда производственных рабочих и составляют 5,14 руб. 8. Цеховые расходы включают затраты на амортизацию, содержание и текущий ремонт производственных зданий, расходы на управление и обслужиАТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 61 вание цеха в целом: основная и дополнительная заработная плата цехового персонала, расходы на охрану труда и технику безопасности. Эти затраты принимаются в размере 40–50 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. Цеховые расходы составляют 5,79 руб. 9. Общезаводские расходы включают затраты на управление и организацию производства по предприятию в целом (заработная плата управленческого персонала, командировочные, почтово-телеграфные расходы, подготовка кадров, охрана и др.). Эти расходы принимаются укрупнено в размере 150–200 % от фонда оплаты труда производственных рабочих. Общезаводские расходы составляют 22,51 руб. Производственная себестоимость единицы продукции определяются как сумма всех вышеперечисленных статей и составляет 898,2 руб. 10. Внепроизводственные расходы включают в себя затраты по сбыту готовой продукции и принимаются укрупнено в размере 0,1–0,5 % от производственной себестоимости и составляют 2,69 руб. Полная себестоимость включает в себя производственную себестоимость и внепроизводственные расходы и составляет 900,89 руб. Рассчитав полную себестоимость и установив уровень рентабельности можно рассчитать прибыль и оптовую цену продукции. Среднеотраслевой уровень рентабельности предприятий пищевой промышленности укрупнено составляет 15–25 %. Таким образом, предполагаемая прибыль (П) рассчитывается по формуле 4.1.1: П= где С∙Р , 100 (4.1.1) С – полная себестоимость продукции, руб.; Р – среднеотраслевой уровень рентабельности, %. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 62 900,89 ∙ 25 =225,22 руб. 100 П= Оптовая цена единицы продукции определяется по формуле 4.1.2: Цопт = С + П, (4.1.2) Цопт = 900,89 + 225,22 = 1126,11 руб. Затраты по статьям калькуляции при расчете себестоимости бактериального концентрата лактобактерий представлены в таблице 4.1.3. Таблица 4.1.3 – Расчет себестоимости единицы продукции Статьи калькуляции Затраты на 1 л бактериального концентрата лактобактерий, руб. Сырье и основные материалы 160,78 Транспортные расходы 24,12 Вспомогательные материалы 639,00 Топливо и энергия на технологические цели 24,12 Основная и дополнительная заработная плата производственных рабочих Отчисления на социальные нужды Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования 12,86 3,88 5,14 Цеховые расходы 5,79 Общезаводские расходы 22,51 Производственная себестоимость 898,20 Внепроизводственные расходы 2,69 Полная себестоимость 900,89 Предполагаемая прибыль 225,22 Оптовая цена единицы продукции 1126,11 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 63 Стоимость одного флакона бактериального концентрата лактобактерий с применением криозамораживания составляет 2,25 руб. 4.2 Экономическое обоснование использования готового бактериального концентрата Для обоснования экономической эффективности проанализирован рынок бактериальных концентратов. Данные представлены в таблице 4.2.1. Таблица 4.2.1 – Обзор рынка бактериальных концентратов Наименование бактериального Производитель Фасовка ООО «Био-Веста», Флакон г. Новосибирск 12 мл Жидкий бактериальный ООО «Био-Веста», Флакон концентрат «Биовестин» г. Новосибирск 12 мл концентрата Бактериальный концентрат «Биовестин-лакто» Цена, руб. 55 50 ФГБНУ «Всероссийский научКонцентрат бифидобактерий КБСБ-500 но-исследовательский институт Пакет молочной промышленности», 12,5 г 300 г. Москва Концентрат бактериальный ФГБНУ «Всероссийский науч- лактококков и термофиль- но-исследовательский институт Флакон ных молочнокислых молочной промышленности», 1,0 г стрептококков КЛТ г. Москва Закваска бактериальная лактококков Лс Бактериальный концентрат термофильных молочнокислых палочек КА ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности», г. Москва Флакон 0,65 г 220 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности», г. Москва Пакет 10,0 г 300 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. 270 Подпись Дата Лист 64 Продолжение таблицы 4.2.1 Наименование бактериального Производитель Фасовка Цена, руб. Микроген НПО ФГУП (НПО Биомед г. Пермь) (НПО Вирион г. Томск) (НПО Имунопрепарат г. Уфа) Флакон 5,0 г 218 219 280 ООО «Пропионикс», г. Москва Флакон 12,0 мл 100 ООО «НПФ Пробиотика», Флакон 300,0 мг 75 Пакет 300,0 мг 15 концентрата Лактобактерин Концентрат бифидобактерий жидкий (КБЖ) Сухая закваска «Эвиталия» Сухая закваска «Нарине» г. Москва «Нарэкс», Республика Армения Для сравнения уровня цен на бактериальные концентраты необходимо данные цены привести к общей единице. Данные представлены в таблице 4.2.2. Таблица 4.2.2 – Сравнительный анализ затрат на производство бактериального концентрата Название бактериального концентрата Стоимость 1 л бактериального концентрата, руб. Бактериальный концентрат «Биовестин-лакто» 4583,33 Жидкий бактериальный концентрат «Биовестин» 4166,67 Концентрат бифидобактерий КБСБ-500 24000,00 Концентрат бактериальный лактококков и термофильных молочнокислых стрептококков КЛТ Закваска бактериальная лактококков Лс Бактериальный концентрат термофильных молочнокислых палочек КА 270000,00 338461,53 30000,00 Лактоберин 47800,00 Концентрат бифидобактерий жидкий (КБЖ) 8333,33 Сухая закваска «Эвиталия» 250000,00 Сухая закваска «Нарине» 50000,00 Полученный бактериальный концентрат 1126,11 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 65 Таблица 4.6 – Сравнительный анализ цен на бактериальные концентраты на примере ООО «Аптека 36,6» Наименование бактериального концентрата Цена, руб. Бактериальный концентрат «Биовестин-лакто» 12 мл №1 55 Жидкий бактериальный концентрат «Биовестин» 12 мл №1 55 Лактобактерин сух. фл. 5 доз №10 225 Сухая закваска «Эвиталия» 300 мг №10 790 На основании сравнительного анализа существующих на рынке бактериальных концентратов, можно сделать вывод, что полученный бактериальный концентрат целесообразно внедрять на рынок, так как он экономически выгоден, а так же на рынке присутствуют только жидкие и сухие бактериальные концентраты. Цена полученного бактериального концентрата в среднем на несколько порядков дешевле представленных на рынке. Производство большей части представленных на рынке бактериальных концентратов сосредоточено в г. Москва, следовательно повышаются затраты на транспортировку в Западную Сибирь, что отражается на увеличении цены. Снижение затрат происходит в результате организации производства бактериального концентрата в Сибири. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 66 ГЛАВА 5 БЕЗОПАСНОСТЬ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ Исследования проводились в лаборатории научно- исследовательского института биотехнологии при ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)». Проводимые исследования отвечали требованиям безопасности, предъявляемым в нормативных документах. 5.1 Условия труда В данном микробиологической разделе рассмотрены: лаборатории, требования санитарные к гигиене требования труда и производственной санитарии. 5.1.1 Соответствие санитарным требованиям микробиологической лаборатории Лаборатория находится в первом корпусе Кемеровского технологического института пищевой промышленности и состоит из четырех помещений общей площадью 161,56 м2. Площадь одного производственного помещения составляет 40,39 м2, полезная площадь – 30 м2 Максимально возможное количество работающих одновременно в лаборатории 3 человека. Площадь помещения, приходящаяся на одного работающего – 10 м2 (норма не менее 6 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 67 м2) соответствует требованиям санитарных правил СП 118.13330.2012 «Общественные здания и сооружения». Высота помещения составляет 3,0 м. Объем помещения на одного рабочего 28 м3 – (норма – 15 м3 для легких работ). Помещения микробиологической лаборатории покрыты кафелем (пол, стены) и масляной краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств в соответствии с СП 118.13330.2012 «Общественные здания и сооружения». Во всех помещениях установлены бактерицидные лампы (БУФ–15, БУФ–30). Окна плотно закрыты. Для защиты рабочих столов от попадания прямого солнечного света используются светозащитные пленки из материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам. Номенклатура санитарно-технических устройств и санитарно-бытовых помещений соответствует нормам СП 118.13330.2012 «Общественные здания административного назначения». Санитарные узлы выполнены в соответствии с СП 118.13330.2012 «Общественные здания административного назначения». 5.1.2 Гигиена труда и производственная санитария Параметры микроклимата оказывают непосредственное влияние на самочувствие человека и его работоспособность. Они выбираются исходя из категории тяжести выполняемых работ. Параметры микроклимата в производственном помещении соответствуют нормам СанПиН 2.2.4.548-96 «Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений» и ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». Температура окружающей среды в помещении лаборатории составляет 23±2 0С, относительная влажность воздуха 55 % . В соответствии с СанПиН 2.2.4.548-96 АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 68 «Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений» оптимальные параметры микроклимата для работ категории I б (работы, производимые сидя, стоя или связанные с ходьбой, но не требующие систематического физического напряжения или поднятия и переноски тяжестей) приведены в таблице 5.1.2.1. Таблица 5.1.2.1 – Оптимальные параметры микроклимата Теплый Iб период 22–24 19,0–20,9 24,1–28/ 20–21,9 оптимальной) (выше/ниже воздуха, м/с 0,2/01 40–60 21–25 движения Допустимая 18–25 Скорость Оптимальная 20–24 влажность, % Допустимая оптимальной) (выше/ниже Допустимая 23,1–24,0/ C Допустимая 21–23 0 Оптимальная период Оптимальная Категории работ Период года Холодный поверхностей, воздуха, 0C Относительная Оптимальная Температура Температура 15–75 19–29 0,1 0,3/0,1 В соответствии с СП 60.13330.2012 «Отопление, вентиляция и кондиционирование воздуха» помещение лаборатории оснащено вентиляцией в виде вытяжных шкафов для удаления неприятных запахов и вредных испарений. Предусмотрена централизованная система отопления с использованием радиаторов, теплоноситель в которых – горячая вода с температурой на входе в отопительную систему 95±2 0С. В помещении бокса также оборудована приточно-вытяжная вентиляция, соответствующая требованиям СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)». В лаборатории организовано естественное и искусственное освещение. Естественное освещение осуществляется за счет двух световых проемов площадью 16,6 м2. Отношение площади световых проемов к площади пола АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 69 помещения составляет 0,24 (норма 0,1–0,25). Таким образом, естественного светового освещения достаточно для работ в дневное время. Искусственное освещение осуществляется с помощью светильников, расположенных в потолочной области, состоящих из люминесцентных ламп. Уровень освещенности от искусственного освещения 400 лк, соответствует нормам СанПиН 2.2.1/2.1.1.1278-03 «Гигиенические требования к естественному, искусственному и совмещенному освещению жилых и общественных зданий». 5.2 Безопасность работы в микробиологической лаборатории При работе в микробиологической лаборатории возможны несчастные случаи при работе с электроприборами, а так же при работе с канцерогенными веществами. В помещении лаборатории на основании ГОСТ 12.1.007-76 не допускается: – работать в лаборатории одному; – работать в лаборатории необходимо в халате, защищая одежду и кожу от попадания реактивов и обсемененности микроорганизмами; – оставлять без присмотра зажженные горелки и другие нагревательные приборы, работать на горелках с неисправными кранами, держать вблизи них воспламеняющиеся вещества; – рабочее место следует поддерживать в чистоте, не загромождать его посудой и побочными вещами; – проводить работы при неисправной вентиляции; – во время работы открывать дверь бокса; – перед работой необходимо проверить исправность оборудования, рубильников, наличие заземления; АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 70 – убирать случайно пролитые огнеопасные жидкости при зажженных горелках и включенных электронагревательных приборах; – хранить и применять реактивы без этикеток; – хранить запасы ядовитых, сильнодействующих, взрывоопасных веществ и растворов на рабочих местах и стеллажах; – в рабочих помещениях курить, хранить и принимать пищу; – сушить что-либо на отопительных приборах. 5.2.1 Безопасность работы с аппаратурой и оборудованием Причиной несчастного случая могут выступать лабораторное оборудование и приборы, которые необходимы при проведении работ в лаборатории. К ним относятся: термостат электрический, весы технические, электрические, рН–метр, химический вытяжной шкаф, электрический сушильный шкаф. При работе с электрическими приборами нужно помнить, что включать прибор можно только в ту сеть, вольтаж которой соответствует вольтажу прибора. Все неисправности электроприборов, электросети и прочего электрооборудования должны устраняться только электромонтером. При работе с электрооборудованием, находящимся под током, необходимо применять исправные средства индивидуальной защиты (диэлектрические резиновые перчатки, галоши, коврики), а работу проводить с изолирующими рукоятками у инструмента. Запрещается переносить находящееся включенные под приборы током. В и ремонтировать случае загорания оборудование, проводов или электроприборов необходимо их медленно обесточить и гасить огонь при помощи углекислотного огнетушителя. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 71 При работе с сушильными шкафами (температура 105–160 0 С), работающий может получить термический ожог. Меры предосторожности: ставить и вынимать бюксы, тигли с помощью металлических щипцов, а стеклянную посуду с помощью полотенца. Термостат электрический предназначен для получения и поддержания внутри рабочей камеры стабильной температуры. При работе с прибором корпус должен быть надежно заземлен. Запрещается: – устанавливать термостат вблизи отопительной системы, рядом с другими приборами и оборудованием, а также в стесненных местах; – помещать в камеру материалы, воспламеняющиеся при температуре термостатирования или близкой к ней. Весы технические, аналитические. При работе с весами нужно придерживаться следующих правил: – обращаться с весами нужно осторожно, оберегать от толчков; – весы должны быть всегда чистыми. – на чашу весов реактивы не насыпаются, для взвешивания нужно использовать специальную емкость; – после взвешивания разновесы оставлять на чашке запрещается. рН–метр является лабораторным прибором, предназначенным для определения величины активной кислотности и окислительно– восстановительных потенциалов. Питание прибора осуществляется от сети переменного тока напряжением 220 В и 50 Гц. Хранить прибор следует в условиях общих для всех лабораторных приборов, в сухих отапливаемых помещениях, в воздухе которых отсутствуют примеси, вызывающие коррозию металлических изделий. Химический вытяжной шкаф предназначен для изолирования и защиты обслуживающего персонала от токсических, зловонных испарений, газов, пыли, выделяющихся во время проведения работ, путем их АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 72 непосредственного отвода наружу. Прежде чем приступить к подключению химического вытяжного шкафа к месту эксплуатации следует подвести следующие системы: – систему холодной воды; – систему химических сточных вод; – систему вытяжную; – питание электроэнергией с заземлением. Прежде чем приступить к выполнению каких-либо лабораторных или научно-исследовательских работ следует проверить включение вентилятора. Состояние включения сигнализируется. Кроме того, нужно проверить, открыты ли шлюзы для потоков воздуха. Запрещается: – работать лицам, не ознакомленным с инструкцией по эксплуатации; – работать в случае обнаружения каких-либо нарушений в нормальной работе шкафа; – работать при отсутствии стеклянного защитного экрана. Электрический сушильный шкаф предназначен для освобождения исследуемого образца от влаги, рассчитан на максимальную температуру 350±2 0С. Загрузку и разгрузку шкафа следует проводить без толчков и ударов. При работе с сушильным шкафом следует помнить: – к работе допускаются лица, ознакомленные с технической инструкцией по эксплуатации; – перед началом работы необходимо убедиться в его полной исправности, правильности подключения и заземления; – при нарушении нормальной работы шкафа следует отключить его и принять меры по устранению неисправностей; – ремонтные работы проводить только после снятия напряжения. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 73 5.2.2 Безопасность работы со стеклянной посудой Большая часть несчастных случаев при нарушении правил работы со стеклом относится к категории микротравм (после которых можно продолжать работу) и легких травм (потеря трудоспособности на один или несколько дней). В первую очередь – порезы рук при поломке стеклянной посуды, деталей приборов, а также ожоги рук при неосторожном обращении с нагретыми до высокой температуры стеклянными деталями. Также при поломке стеклянной аппаратуры и посуды возможны и другие виды аварий и несчастных случаев – пожары и взрывы (при проливе горючих жидкостей, окислителей), отравления и химические ожоги (при попадании токсических или едких веществ в атмосферу или на кожу). Основные правила работы со стеклянной посудой: – стекло – хрупкий материал, имеющий малое сопротивление при ударе и незначительную прочность при изгибе, поэтому лучше недооценить прочность стеклянной детали, чем переоценить ее. Вероятность ранения рук пропорциональна усилию, приложенному к стеклянной детали; – посуда не предназначена для работы при повышенном давлении; – нельзя допускать нагревания жидкостей в закрытых колбах или приборах, не имеющих сообщения с атмосферой; – категорически запрещается использовать посуду, имеющую трещины или отбитые края; – стеклянная посуда должна храниться аккуратно и на постоянном месте, при выдвижении ящиков стола предметы не должны ударяться друг о друга; – осколки разбитой посуды убирают только с помощью щетки и совка, запрещаетя убирать осколки посуды руками; АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 74 – стеклянные приборы и посуду больших размеров можно переносить только двумя руками. Запрещается поднимать крупные бутыли за горло запрещается не придерживая снизу. При ранениях стеклом нужно удалить его осколки из ранки (если они в ней остались) и, убедившись, что там их больше нет, промыть ранку перманганатом калия, смазать кожу вокруг ранки йодом и перевязать пораненное место. 5.2.3 Безопасность работы с реактивами Контроль безопасности условий труда осуществляется в соответствии с руководством Р.2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда». План контроля условий труда составляется на год, дополняется и изменяется в случае выявления профессиональных заболеваний или отравлений. Однонаправленным действием на организм работников, как правило, обладают: вещества раздражающего типа действия, аллергены, вещества канцерогенные для человека, различные спирты и щелочи, аминосоединения, нитросоединения оксид углерода. Вещества, опасные для развития острого отравления, используемые в работе, представлены в таблице 5.2.3.1 и соответствуют ГН 2.2.5.1313-03 – ПДК вредных веществ в воздухе рабочей зоны. При работе с реактивами следует исходить из того, что любые химические вещества, даже самые «безобидные», в большей или меньшей степени ядовиты. Работая с ними необходимо знать основные свойства, особенно степень их ядовитости и способность к образованию взрывоопасных и огнеопасных смесей с другими реактивами. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 75 Таблица 5.2.3.1 – Вещества, вызывающие острое отравление Наименование ПДК, мг/м3 Агрегатное Класс Особенности состояние опасности действия Глюкоза 10 аэрозоль 4 раздражение Желатин 10 аэрозоль 4 раздражение Калий гидрофосфат 10 аэрозоль 4 раздражение Натрий хлорид* 1 аэрозоль 3 раздражение Сахароза 10 аэрозоль 4 раздражение Трихлорметан* 10/5 пары 2 раздражение Этанол 100 пары 4 раздражение 4 раздражение Калий фосфорнокислый 1-зам * кристаллический 10 порошок – вещества, при работе с которыми требуется специальная защита. Емкости с реактивами должны быть снабжены надежно наклеенными этикетками с разборчивыми надписями, где указаны название соединения и его химическая формула. Запрещается исправлять надписи на этикетках, наклеивать новые этикетки, не удалив старых, наносить на емкости с реактивами легко смывающиеся надписи. Запрещается пользоваться реактивами без этикеток или с сомнительными надписями на них. Необходимо внимательно следить за сохранением чистоты реактивов. Нельзя путать пробки от банок с реактивами. Запрещается выбрасывать в раковины отходы химических реактивов, сливать органические растворители, водные растворы химических веществ. Химические вещества также нельзя выбрасывать вместе с мусором. Переливать кислоты или щелочи из бутылей в мелкую тару необходимо при помощи сифонов или ручных насосов. Особую осторожность следует соблюдать при обращении с ядовитыми (их запрещается брать ртом через пипетку), огнеопасными или вредными веществами. С огнеопасными реактивами следует работать вдали от огня и работающих нагревательных приборов. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 76 Для предотвращения проникновения опасных веществ в организм через кожные покровы необходимо применять спецодежду (халат из хлопчатобумажной ткани) и соблюдать правила личной гигиены. При ожогах химическими веществам (главным образом кислотами и щелочами) пораженный участок необходимо быстро промыть большим количеством воды. Затем на обожженное место наложить примочку: при ожогах кислотой – из 2 % содового раствора, при ожогах щелочью – из слабого раствора уксусной или борной кислоты. При отравлении химикатами следует немедленно вызвать врача. При попадании химикатов внутрь организма необходимо сделать промывание. 5.2.4 Безопасность работы с микроорганизмами Микроорганизмы – сложные соединения белковой природы, бактерии, вирусы, микоплазмы, риккетсии, хламидии и грибы, которые при определенных условиях и в определенных концентрациях могут оказать влияние на здоровье человека. Микробиологические лаборатории работают с микроорганизмами четырех групп «Кемеровский опасностей. В технологический лаборатории НИИ институт пищевой биотехнологии промышленности (университет)» работают с микроорганизмами первой группы, с которыми случаи заболевания проводиться на человека обычном не зарегистрированы. лабораторном столе для Работа может стандартных микробиологических процедур. Специальное защитное оборудование не требуется и/или не используется. Персонал лаборатории проходит обычное обучение технике безопасности и находится под руководством начальника АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 77 лаборатории. Персональная защита работников микробиологической лаборатории: халат, перчатки, маски и очки (по необходимости). При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблюдать все правила микробиологической техники: – работа проводится в чистых халатах, перчатках, бахилах, шапочках для волос, масках защищающих органы дыхания, защитных очках при необходимости; – на пробирках, колбах, чашках Петри, должна быть сделана надпись, содержащая родовые и видовые названия культуры, дату засева; – все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки (петли, иглы), либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели); – все засеянные пробирки, чашки помешаются в термостат или сдаются лаборанту. Отработанный материал (пробирки, чашки Петри) также помещается в определенные емкости для их дальнейшего обеззараживания. 5.2.5 Электробезопасность При работе с электрооборудованием и электроприборами возможны случаи поражения людей электрическим током, а также возникновение пожара. Причинами этого являются: работа на неисправном оборудовании, прикосновения руками к металлическим частям электроприборов (оголенные провода), которые вследствие нарушения изоляции могут находиться под напряжением; нарушение правил использования электроприборов, установок, аппаратов (центрифуга и др.). Эти приборы по способу защиты человека от поражения электрическим током относятся к классу I согласно АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 78 ГОСТ 12.1.019-2009 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты». Система электроснабжения лаборатории имеет следующие величины: напряжение – 220 В, количество фаз – 2, способ прокладки – скрытая проводка. Для защиты работающих от поражения электрическим током применяют следующие меры: все токоведущие части покрывают слоем диэлектрика – изоляции, все электротехнические приборы заземляют, на электрощите устанавливают дополнительные рубильники для обесточивания сети. Величина максимального сопротивления заземления не должна превышать 4 Ом. 5.2.6 Пожарная безопасность Опасность пожара в лаборатории возникает при нагревании, высушивании и других работах, от неисправности нагревательных и электрических приборов, а так же несоблюдения мер предосторожности. Все помещения лаборатории должны соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 «Пожарная безопасность. Общие требования безопасности» и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 «Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание» и правилам противопожарного режима. В целях предотвращения пожарных ситуаций предусмотрена система пожарной сигнализации в виде дымовых адресных извещателей, сигнал от которых поступает на пост охраны приемного контроля. При возникновении пожара в лаборатории нужно немедленно использовать все имеющиеся под рукой средства тушения: песок (сухой и рассыпчатый), одеяло, вода. Запрещается тушить водой горящие не АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 79 растворимые в воде вещества, особенно жидкости, водой так же нельзя тушить подключенные электроприборы. В случае загорания проводов и электроприборов, находящихся под током, необходимо немедленно выключить ток и тушить огонь сухим углекислотным огнетушителем ОП–5 , сухим песком. Для профилактики пожаров необходимо обеспечить соблюдение установленного противопожарного режима; электрическая проводка всегда должна содержаться в надлежащем состоянии, а нагревательные приборы, газовые краны и газопровод должны быть исправны; все электроустановки должны быть защищены от токов короткого замыкания; нагревательные приборы нельзя оставлять без присмотра. 5.3 Оказание первой медицинской помощи В лабораториях бывают случаи, требующие неотложной медицинской помощи – порезы рук стеклом, термические ожоги, поражении электрическим током, отравление неорганическим и органическими веществами. При ранениях стеклом нужно удалить его осколки из ранки (если они в ней остались) и, убедившись, что там их больше нет, промыть рану 2 % раствором перманганата калия и, смазав кожу вокруг раны 5 % раствором йода, забинтовать. При термических ожогах следует немедленно охладить обожженный участок, это надо делать в прохладной воде. Если степень поражения первая или вторая, то под краном около 10 минут. Если же ожог более сильный, то только в емкости, наполненной водой и наложив сверху повязку. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 80 Далее наложить на место поражения влажную тряпочку, дайть пострадавшему успокоительное и вызывайть скорую помощь. При поражении электрическим током, если пострадавший остается в соприкосновении с токоведущими частями, необходимо немедленно выключить при помощи пускателя, или перерубить токопроводящий провод изолированным инструментом. К пострадавшему, пока он находится под током, нельзя прикасаться незащищенными руками (без перчаток). При отравлени неорганическими веществами необходимо предпринять следующие меры первой помощи: – серной кислотой. Промыть верхние дыхательные пути 2 % расвором питьевой соды. В нос 2–3 капли 2 % расвора эфедрина. Теплое молоко с содой, кодеин (0,015 г) или дионин ( 0,01 г). При попадании в органы пищеварения смазать слизистую рта 2 % раствором дикаина. Промывание желудка большим количеством воды. Внутрь принять: столовую ложку оксида магния на стакан воды каждые 5 минут, яичный белок, молоко, крахмальный клейстер, кусочки сливочного масла, кусочки льда. Нельзя вызывать рвоту и применять карбонаты. Проконсультироваться у врача. – щелочами. Вдыхание теплого водяного пара, внутрь – теплое молоко с медом, кодеин (0,015 г) или дионин (0,01 г). Горчичники. При попадании в органы пищеварения смазать слизисты рта и горло 1 % раствором новокаина. Внутрь – по столовой ложке 1 % раствора лимонной кислоты каждые 3–5 минут. Консультация врача. При отравлении органическими веществами (эфиром, хлороформом, спиртом) необходимо: свежий воздух, внутрь 0,03 г фенамина или 0,1 г коразол, или 30 капель кордиамина, или 0,5 г камфоры. Искусственое дыхание. В лаборатории в легко доступном месте находится аптечка с постоянным набором необходимых материалов и медикаментов (стерильные бинты и вата, 5 % спиртовой раствор йода, 2 % раствор гидрокарбоната натрия, мазь от ожогов, 2 % раствор борной кислоты, этиловый спирт). АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 81 ВЫВОДЫ В работе были проведены иследования по подбору питательной среды и оптимальных условий для культивирования лактобактерий. Подобрана защитная среда бактериального и оптимальные концентрата. параметры Исследованы для показатели замораживания замороженного бактериального препарата при хранении. По результатам исследования были сделаны следующие выводы: 1. Исследовано пять вариантов питательных сред для культивирования Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus. Установлено, что среда, содержащая обезжиренное молоко и дрожжевой экстракт обеспечивает максимальное накопление Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus. 2. Подобраны оптимальные условия для культивирования Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus: pH среды 7,0±2, продолжительность культивирования – 12 часов, температура – 43±2 0С. 3. Изучено 9 вариантов защитных сред, влияющих на выживаемость бактериальных концентратов при замораживании. Установлено, что наиболее высокую выживаемость концентратов бактерий обеспечивает среда, в состав которой входят следующие компоненты масс.%: глицерин – 20, сахароза – 15, натрий лимоннокислый – 5, желатин – 5, фосфатный буфер с pH 7,2 – 55. 4. Определены оптимальные параметры для замораживания Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus: соотношение защитной среды и концентрата бактерий 1:1; возраст – конец активного роста и начало стационарной фазы развития; значение активной кислотности биомассы клеток – 7,0±0,1; температура смешивания концентратов с защитной средой – 20±1 0 С; время эквилибрации – 20 минут. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абросимов, М.А. Потребление молока и молочной продукции / М.А. Абросимов // Молочная промышленность. – 2006. – № 1. – С. 11– 13. 2. Антипова, Л.В. Прикладная биотехнология: учебное пособие / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, А.И. Жаренов. – Воронеж, 2000. – 332 с. 3. Аркадьев, З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения / З.А. Аркадьев // Научн. докл. высш. школы. Сер. биол. Науки. – 1983. – № 4. С. 51 – 54. 4. Артюхов, В.Г. Биофизика: учебное пособие / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. – Воронеж: ВГУ, 1994. – 336 с. 5. Асонов, Н.Р. Микробиология: учебное пособие / Н.Р. Асонов. – М.: Колос – Пресс, 2002 – 352 с. 6. Банникова, Л.А. Микробиологические основы молочного производства: учебное пособие / Л.А. Банникова, Н.С. Коралева, В.Ф. Семенихина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 400 с. 7. Банникова, Л.A. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности: учебное пособие / Л.A. Банникова. – М.: Пищевая промышленность, 1975. – 255 с. 8. Белоус, A.M. Замораживание и криопротекция: учебное пособие / A.M. Белоус, Е.А. Гордиенко. – М.: Высшая школа, 1987. – 80 с. 9. Березов, Т.В. Биоорганическая химия: учебное пособие / Т.В. Березов, Б.Ф. Коровин. – М.: Медицина, 1990. – 380 с. 10. Бобылин, В.В. Теоретическое обоснование и исследование закономерностей формирования мягких кислотно-сычужных сыров: дис. … д–ра техн. наук: 05.18.04 / Бобылин Владимир Васильевич. – Кемерово, 1999. – 342 с. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 83 11. Брык, М.Т. Мембранная технология в пищевой промышленности: учебное пособие / М.Т. Брык, В.Н. Голубев, А.П. Чагаровский. – Киев: Урожай, 1991. – 224 с. 12. Бугаец, Н.А. Продукты функционального назначения на основе натуральных структурообразователей / Н.А. Бугаец, М.Ю. Тамова, И.А. Бугаец // Известия вузов. Пищевая технология. – 2005. – № 3. – С. 14–15. 13. Вайнберг, И.А. Исследование и оптимизация непрерывного культивирования мезофильных молочнокислых стрептококков с целью создания управляемого процесса получения биомассы: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 35.26.05 / Вайнберг Игорь Александрович. – Москва, 1978. – 24 с. 14. Гаврилова, Н.Б. Биотехнологические основы производства комбинированных кисломолочных продуктов: дис. ... д–ра. техн. наук: 05.18.04 / Гаврилова Наталья Борисовна. – Семипалатинск, 1996. – 350 с. 15. Ганина, В.И. Влияние различных криопротекторов на выживаемость пробиотических культур: научное издание / В.И. Ганина, М.М. Сониева. – М.: МГУПБ, 2005. – 187 с. 16. Ганина, В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии: монография / В.И. Ганина. – М.: МГУПБ, 2001. – 169 с. 17. Ганина, В.И. Техническая микробиология продуктов животного происхождения: учебное пособие для вузов / В.И. Ганина, Н.С. Королева, С.А Фильчакова. – М.: ДеЛи принт, 2008. – 352 с. 18. Герасимова, Т.В. Технология кисломолочных напитков: применение экстрактов растительного сырья / Т.В. Герасимова, И.А. Евдокимов, Д.В. Харитонов // Молочная промышленность. – 2012. – № 2. – С. 83 – 84. 19. Глушанова, Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro / Н.А. Глушанова, Б.А. Шендеров // Микробиология. – 2005. – № 2. – С. 75–79. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 84 20. Голубев, В.Н. Основы микрофильтрационной очистки пектиносодержащих экстрактов / В.Н. Голубев, С.Ю. Беглов // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2000. – № 1. – С. 41 – 44. 21. Горбатова, К.К. Биохимия молока и молочных продуктов: учебник / К.К. Горбатова. – М.: Колос, 1997. – 288 с. 22. Горина, Т.А. Разработка технологий поликомпонентной закваски с бифидобактериями для сметаны: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 05.18.04 / Горина Тамара Александровна. – Москва, 1998. – 21 с. 23. Горлов, И.Ф. Биотехнология бактериальных концентратов для профилактики и лечения желудочно–кишечных заболеваний в животноводстве / И.Ф. Горлов, М.И. Шрамко, Д.В. Харитонов // Материалы МНТК «Инновационные технологии – основа модернизации отраслей производства и переработки сельскохозяйственной продукции». – Волгоград: ИУНЛ ВолгГТУ, ч.2. – 2011. – С. 12 – 15. 24. Доронин, А.Ф. Функциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. – М.: Изд–во «Гранть», 2002. – 295 с. 25. Дытнерский, Ю.И. Баромембранные процессы. Теория и расчет / Ю.И. Дытнерский. – М.: Химия, 1986. – 272 с. 26. Евдокимов, И.А. Мембранные технологии в молочной промышленности / И.А. Евдокимов, Е.Р. Абдулова. – Переработка молока. – 2001. – № 5. – С. 38 – 41. 27. Евдокимов, И.А. Технология функциональных кисломолочных напитков с комплексным пребиотиком / И.А. Евдокимов, Д.В. Харитонов, В.В. Крючкова // Сборник научных трудов. «Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ – 75 лет)». – Москва: ГНУ ВНИМИ, 2004. – С. 105 – 111. 28. Евдокимов, И. А. Кисломолочный напиток с пребиотиком «Лаэль» / И.А. Евдокимов, В.В. Крючкова, А.В. Серов // Молочная промышленность. – 2004. – № 5. – С. 31 – 33. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 85 29. Егорова, Н.С. Метаболизм микроорганизмов: практикум / Н.С. Егорова. – М.: МГУ, 1986. – 252 с. 30. Залашко, М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки: учебное пособие / М.В. Залашко. – М.: Агропромиздат, 1990. – 190 с. 31. Зябрев, А.Ф. Применение мембранных процессов при переработке молочных продуктов / А.Ф. Зябрев. – Переработка молока. – 2001. – № 12. – С. 57 – 58. 32. Кантере, В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств: учебное пособие / В.М. Кантере. М.: Агропромиздат, 1990. 271 с. 33. Карпов, A.M. Состояние и перспективы мембранной техники в микробиологической, медицинской и пищевых отраслях промышленности / A.M. Карпов, В.Н. Лялин, А.А. Свитцов // Биотехнология. – 1989. – № 3. – С. 21 – 24. 34. Кисломолочные продукты нового поколения / Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Сундукова М.Б. и др. // Молочная промышленность. – 1999. – № 7. С. – 29 – 30. 35. Королева, Н.С. Способ приготовления сухих заквасок / Н.С. Королева, И.Н. Пятницына, Л.А. Банникова // Молочная промышленность. – 1984. – № 5. – С. 27 – 29. 36. Кригер, О.В. Влияние аскорбиновой кислоты на рост бифидобактерий в молоке при совместном культивировании с молочнокислыми бактериями / О.В. Кригер // Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых. – М.: МГУПБ. – 2005. – С. 16 – 18. 37. Крусь, Г.Н. Методы исследования молока и молочных продуктов: учебник для вузов / Г.Н. Крусь, А.М. Шалыгина, З.В. Волокитина. – М.: Колос, 2000. – 368 с. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 86 38. Лагода, И.В. Сублимационная сушка производственно–ценных штаммов молочнокислых бактерий / И.В. Лагода // Молочная промышленность. – 2003. – № 3. – С. 4 – 7. 39. Лобасенко, Б.А. Концентрирование суспензий молочнокислых бактерий мембранными методами: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 04.18.05 / Лобасенко Борис Алексеевич. – Москва, 1987. – 21 с. 40. Морозов, В.Г. Цитамины. Биорегуляторы клеточного метаболизма: монография / В.Г. Морозов, Г.А. Рыжак, В.В. Малинин. – Санкт–Петербург: Фолиант, 2001. – 102 с. 41. Нечаев, А.П. Ингредиенты разные, а задачи участников СППИ– общие / А.П. Нечаев, Т.В. Коткова // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2005. – № 2. – . С. 12 – 13. 42. Нилов, Д.Ю. Современное состояние и тенденции развития рынка функциональных продуктов питания и пищевых добавок / Д.Ю. Нилов, Т.Э. Некрасова // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2005. – № 2. – С. 28 – 29. 43. Новик, Г.И. Сохранение жизнеспособности и физиологических свойств бифидобактерий при криоконсервации и лиофилизации / Г.И. Новик // Микробиология. – 1998. – № 5. – С. 45 – 48. 44. Осипенко, М.Ф. Применение пробиотиков в лечении патологии внутренних органов / М.Ф. Осипенко // Фарматека. – 2005. – № 14. – С. 16 –20. 45. Панченко, Ю.Б. Влияние центробежной очистки молока на его качество / Ю.Б. Панченко // Молочная промышленность. – 1997. – № 4. – С. 17–20. 46. Пат. 2427624 Российская Федерация, МПК 7 C 12 N 1/04, C 12 N 1/20. Способ замораживания молочнокислых бактерий / Кузьмина О.М., Харитонов В.Д.; заявитель и патентообладатель Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России), Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (ИОГен РАН), АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 87 Государственное научное учреждение «Всероссийский научно– исследовательский институт молочной промышленности» (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии). – № 2010120515/10; заявл. 24.05.2010; опубл. 27.08.2011, Бюл. № 25. – 5 с. 47. Пат. 457727 СССР, МПК7 C 12 K 3/00. Способ замораживания бактерий / Банникова Л.А., Ладога И.В.; заявитель и патентообладатель Всесоюзный научно–исследовательский институт молочной промышленности. – 1934850; заявл. 15.06.1973; опубл. 25.01.1975, Бюл. № 37. – 6 с. 48. Пат. 2524432 Российская Федерация, МПК7 A 23 C 9/12, C 12 N 1/20, C 12 R 1/0. Способ получения замороженного бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических бактерий / Хамагаева И.С., Тумунова С.Б., Ханхалдаева С.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно–Сибирский государственный университет технологий и управления», Хамагаева Ирина Сергеевна. – № 2013113520/10; заявл. 26.03.2013; опубл. 27.07.2014, Бюл. № 24. – 10 с. 49. Пат. 2129794 Российская Федерация, МПК7 A 23 C 9/12, C 12 N 1/20. Способ получения сухого препарата для кисломолочных продуктов / Хамагаева И.С.; заявитель и патентообладатель Восточно–Сибирский государственный технологический университет, Хамагаева Ирина Сергеевна. – № 97113240/13; заявл. 31.07.1997; опубл. 10.05.1999, Бюл. № 12. – 6 с. 50. Пат. 2475527 Российская Федерация, МПК7 C 12 N 1/04, C 12 N 1/20, C 12 R 1/225. Способ консервирования молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii / Никулина И.Д., Каменькова Н.В., Евелева В.В., Черпалова Т.М.; заявитель и патентообладатель Государственное научное учреждение Всероссийский научно–исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии). – № 2011129519/10; заявл. 15.07.2011; опубл. 20.02.2013, Бюл. № 42. – 5 с. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 88 51. Пат. 2524435 Российская Федерация, МПК7 A 23 C 9/12 , A 23 C 9/127 , C 12 P 1/00 .Способ получения бактериального концентрата и применение его в качестве биологически активной добавки к пище или закваски прямого внесения для курунги / Хамагаева И.С., Занданова Т.Н., Хурхесова Т.Е.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления», Хамагаева Ирина Сергеевна. – № 2012156993/10; заявл. 25.12.2012; опубл. 27.07.2014, Бюл. № 44. – 9 с. 52. Пат. 2272548 Российская Федерация, МПК7 A 23 L 2/00 , A 23 C 9/127. Способ получения бактериального концентрата / Шапошникова Л.И., Лагунова У.З.; заявитель и патентообладатель Шапошникова Лариса Ивановна. – № 2004106019/13; заявл. 02.03.2004; опубл. 27.03.2006, Бюл. № 31. – 5 с. 53. Пат. 2067994 Российская Федерация, МПК7 C 12 N 1/20, A 23 C 9/12. Консорциум молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus, используемый для приготовления кисломолочных продуктов и бактериальных препаратов, способ получения сухой закваски ацидофильных молочнокислых бактерий и способ производства кисломолочного продукта / Терещенко Н.Н., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф., Калугин В.В., Савченко Ю.Ф., Тарасюк О.П.; заявитель и патентообладатель Терещенко Николай Николаевич – № 93015913/13; заявл. 26.03.1993; опубл. 20.10.1996, Бюл. № 14. – 4 с. 54. Пат. 1510350 СССР, МПК C 12 N 1/20, A 23 C 9/12. Способ получения бактериального концентрата для сквашивания молока / Ибрагимова А.З., Стеценко А.В., Шамраева Н.Д., Авдонина К.П., Ловцова Л.Б., Степанова А.П., Прохорова Л.Т.; заявитель и патентообладатель Научно– производственное объединение масложировой промышленности. – № 4301801/13; заявл. 07.09.1987; опубл. 20.01.1996, Бюл. 8. – 4 с. 55. Перфильев, Г.Д. Бактериальные закваски и концентраты в биотехнологии сыроделия. Научные и практические аспекты / Г.Д. Перфильев // АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 89 Сборник материалов международного специализированного научно– практического семинара «Бактериальные закваски и биологические средства, применяемые в производстве ферментированных молочных продуктов в России». – Углич, 2005. – С. 9 – 14. 56. Политика здорового питания. Федеральный и региональный уровень / В.И.Покровского, Г.А. Романенко, В.А. Княжев и др. – Новосибирск: Сиб. Унив. Из–во, 2002. – 344 с. 57. Пушкарь, Н.С. Криопротекторы: монография / Н.С. Пушкарь, М.И. Шраго, Ю.В. Белоус. – Киев: Наук. думка. – 1978. – 204 с. 58. Разработка технологий заквасок прямого внесения / В.Ф. Семенихина, В.Г. Будрик, И.В. Рожкова и др. // Сборник научных трудов. «Научное обеспечение молочной промышленности». – М.: ВНИМИ, 2010. – С. 211 – 218. 59. Рогов, Г.Н. Разработка технологии производства и способов применения бактериальных концентратов мезофильных молочнокислых бактерий с целью улучшения качества мелких сычужных сыров: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 637.354.05 / Рогов Григорий Новомирович. – Углич, 1994. – 24 с. 60. Семенихина, В.Ф. Кисломолочные продукты нового поколения / В.Ф. Семенихина, И.В. Рожкова, М.Б. Сундукова // Молочная промышленность. – 1989. – №7. – С. 29 – 30. 61. Семенихина, В.Ф. Развитие микробиологии кисломолочных продуктов / В.Ф. Семинихина // Молочная промышленность. – 1994. – № 1. – С. 9 – 11. 62. Семенов, Е.В. Количественное моделирование процессов массопереноса в перерабатывающих отраслях АПК / Е.В. Семенов, Н.И. Акулов О.С. Журба. – М.: Компания спутник, 2006. – 287 с. 63. Снятковский, М.В. Закваски прямого внесения фирмы «Хр. Хансен» для производителей кисломолочных продуктов в России / М.В. Снятковский. – Молочная промышленность. – 2004. – № 10. – С. 30 – 31. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 90 64. Соловьева, Е.А. Новые заквасочные культуры для кисломолочных продуктов и сыров / Е.А. Соловьева. – Молочная промышленность. – № 9. – 2005. – С.14 – 15. 65. Степаненко, П.П. Микробиология молока и молочных продуктов / П.П. Степаненко. – М.: Лира, 2002. – 413 с. 66. Столярова, А.С. Разработка лиофилизированных препаратов бифидобактерий: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 637.140.33 / Столярова Анна Сергеевна. – Улан–Уде, 1995. – 22 с. 67. Сундукова, М.Б. Разработка закваски бифидобактерий для производства кисломолочных продуктов: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 22.54.33 / Сундукова Мария Борисовна. – Москва. – 1986. – 22 с. 68. Сурков, В.Д. Изменение дисперсного состава бактериальных взвесей под действием центробежного поля / В.Д. Сурков, Н.Н. Мизерецкий // Молочная промышленность. – 1999. - № 1. – С. 11 – 13. 69. Сурков, В.Д. Исследование центробежного способа бактериальной очистки в тарельчатых очистителях / В.Д. Сурков, Н.Н. Мизерецкий // Пищевая технология. – 2002. – № 5. – С. 19 – 23. 70. Сурков, В.Д. Мизерецкий Н.Н. Процесс бактофугирования молока / В.Д. Сурков, Н.Н. Мизерецкий // Молочная промышленность. – 1999. – № 4. – С. 45 – 49. 71. Сурков, В.Д. Центрофугирование бактерий составляющих микрофлору молока / В.Д. Сурков // Молочная промышленность. – 2001. – № 2. – С. 22 – 26. 72. Талибов, А.Р. Мембранные технологии в молочной промышленности / А.Р. Талибов. – Переработка молока. – 2001. – № 12. – С. 5 – 7. 73. Тумунова, С.Б. Разработка технологии производства сухого концентрата бифидобактерий: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 637.146.33 / Тумунова Сэсэгма Баторовна. – Улан–Уде. – 1995. – 20 с. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 91 74. Тутельян, В.А. От концепции государственной политики в области здорового питания населения России к национальной программе здорового питания / В.А. Тутельян, А.В. Шабров, Е.И. Ткаченко // Клиническое питание. – 2004. – № 2. – С. 2 – 4. 75. Фетисов, Е.А. Мембранные и молекулярно–ситовые методы переработки молока: монография / Е.А. Фетисов, А.П. Чагаровский. – М.: Агропромиздат. – 1991. – 272 с. 76. Филатов, Ю.И. Перспективы производства лечебно- профилактических молочных продуктов и специализированных пищевых добавок функционального назначения нового поколения / Ю.И. Филатов, Л.Н. Карабанова, Д.В. Харитонов // Российская лактулоза. Чудо из молока. Сборник научных трудов. – М.: МИИТ. – 1999. – С. 4 – 8. 77. Хамагаева, И.С. Кисломолочный напиток «Целебный» / И.С. Хамагаева, Л.М. Качанина // Молочная промышленность. – 2005. – № 5. – С. 66 – 68. 78. Харитонов, Д.В. ВНИМИ в области производства заквасок и бактериальных концентратов / Д.В. Харитонов // Материалы Международной научно–практической конференции «Молочная индустрия мира и РФ». – М., 2011. – С. 50 – 54. 79. Харитонов, Д.В. Изучение некоторых аспектов криозамораживания микробной массы / Д.В. Харитонов, Е.И. Райдна // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2003. – № 9. – C. 67 – 69. 80. Харитонов, В.Д. Концентрирование сыворотки методом мембранной дистилляции / В.Д. Харитонов // Хранение и переработка сельхозсырья. – 1999. – № 8. – С. 34 – 36. 81. Харитонов, Д.В. Повышение качества бакконцентратов на основе их предварительного замораживания / Д.В. Харитонов, М.И. Шрамко, Е.В. Евдокимова // Международная научно–практическая конференция «Инновационные технологии здорового питания, их качество и безопасность». – Казахстан, Алматы: АТУ, 2010. – С. 167 – 169. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 92 82. Харитонов, Д.В. Принципы создания технологии бакконцентратов с криозамораживанием микробной массы / Д.В. Харитонов, М.И. Шрамко, О.И. Белова // Материалы 1 международной научно–практической конференции «Современная наука: теория и практика». – Ставрополь: СевКавГТУ, 2010, т. 1. – С. 505 – 506. 83. Харитонов, Д.В. Научно-практические аспекты совершенствования технологий пробиотических бактериальных концентратов и пребиотика лактулозы для создания синбиотических молочных продуктов: автореф. дис. ... д–ра техн. наук: 06.18.05 / Харитонов Дмитрий Владимирович. – Кемерово, 2012. – 49 с. 84. Харитонов, Д.В. Некоторые особенности замораживания микроорганизмов в среде жидкого азота / Д.В. Харитонов // Сборник научных трудов. «Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ–80)». – М.: ВНИМИ, 2009. – С. 393 – 397. 85. Харитонов, В.Д. Научно–инновационный подход при моделировании технологического процесса производства заквасок прямого внесения / В.Д. Харитонов, В.Ф. Семенихина, Д.В. Харитонов // Сборник материалов Всероссийской научно–практической конференции «Принципы пищевой комбинаторики – основа моделирования поликомпонентных пищевых продуктов». – Угли, 2010. – С. 284 – 285. 86. Цуцаева, A.A. Криоконсервирование клеточных суспензий / A.A. Цуцаева, В.А. Аграненко. – Киев: Наук.думка. – 1983. – 240 с. 87. Шатнюк, Л.Н. Пищевые микроингредиенты в создании продуктов здорового питания / Л.Н. Шатнюк // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2005. – № 2. – С. 18 – 22. 88. Шабетник, Г.Д. Новое в производстве сухих бакконцентратов и биологически активных добавок / Г.Д. Шабетник // Молочная промышленность. – 1999. – № 8. – С. 27 – 29. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 93 89. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. т.3. Пробиотики и функциональное питание / Б.А. Шендеров. – М.: «Гранть», 2001. – 288 с. 90. Шендеров, Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции «Функциональное питание» / Б.А. Шендеров // Пищевая промышленность. – 2003. – № 5. – С. 4 – 7. 91. Шендеров, Б.А.Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Общие и избранные разделы проблемы / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2005. – № 2. – С. 23 – 26. 92. Шрамко, М.И. Биотехнология бактериальных концентратов с криозамораживанием микробной массы для животноводства и молочной промышленности / М.И. Шрамко, Д.В. Харитонов // Сборник научных трудов «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока». – Барнаул: СибНИИС. – 2011. – С. 191 – 195. 93. Шрамко, М.И. Изучение эффективной вязкости бактериальных концентратов перед криозамораживанием / М.И. Шрамко, И.Ф. Горлов, Д.В. Харитонов // Сборник материалов Международной научно- практической конференции «Перспективы производства продуктов питания нового поколения». – Омск: ОмГАУ, 2011. – С. 295 – 296. 94. Шрамко, М.И. Применение методов криоконцентрирования в молочной промышленности / М.И. Шрамко, Д.В. Харитонов, М.В. Головкина // Материалы 1 международной научно–практической конференции «Современная наука: теория и практика». – Ставрополь: СевКавГТУ, 2010. – С. 507 – 509. 95. Шрамко, М.И. Реологические характеристики бактериальных концентратов / М.И. Шрамко, Д.В. Харитонов, О.В. Жигулина // Сборник материалов Международной научно–практической конференции «Современные достижения биотехнологии». Научно–практический семинар «Феномен молочной сыворотки: синтез науки, теории и практики». – Ч.2. – Ставрополь: НОУ ОНТЦМП. – 2011. – С. 204 – 205. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 94 96. Яркина, Я.А. Разработка технологии бактериального концентрата бифидобактерий Lactobacillus casei: автореф. дис. ... канд. техн. наук: 05.18.04 / Яркина Яна Алксеевна. – Москва, 2005. – 26 с. 97. Arai, S.L. Global view on functional foods: Asian perspectives / S.L. Arai // British J. Nutrition. – 2002. – Vol. 88. – P. 139 – 143. 98. Hilliam, M. Heart Healthy Foods / M. Hilliam // World Food Ingredients. – 2001. – Vol. 10. – P. 98 – 103. 99. Hubalek , Z. Protectant used in the cryopreservation of microorganisms / Z. Hubalek // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46. – Р. 205 – 229. 100. Odintsova, N.A. Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebrates / N.A. Odintsova, K.V. Kiselev // Cryoletters. – 2002. – Vol. 22. – Р. 299 – 310. 101. Pat. 4226940 US, CIC C 12 N 1/04, A 23 C 9/1236. Non–frozen concentrated bacterial cultures / Solon Mills; Assignee Great Lakes Biochemical Co, Milwaukee. – № 871231; Filing Date 23.01.1978; Filed 21.06.1979. – 4 р. 102. Schaafsma, G. The Functional Drinks Prophecy / G. Schaafsma, R. Korstanje // World Food Ingredients. – 2004. – .Vol. 4. – P. 44 – 48. АТО 00.00.000 ПЗ Изм. Лист № докум. Подпись Дата Лист 95
