оптимизация условий очистки и концентрирования вируса

С.Сейфуллин атындағы ҚазАТУ-ң Ғылым жаршысы /
Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина. – 2011. - №4(71).
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОЧИСТКИ И
КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ
Тайлакова Э.Т. , Червякова О.В.,
Садикалиева С.О., Султанкулова К.Т.,. Зайцев В.Л.,
Турганбаева А.С., Сансызбай А.Р.
Аннотация
В результате проведенных исследований были подобраны
оптимальные параметры хроматографической очистки вируса гриппа
лошадей. Было определено, что полная адсорбция вируса на
ионообменник проходит при использовании буферного раствора с рН 7,0,
для элюирования необходимо использовать буфер, содержащий 0,5 М
хлористого натрия с рН 7,4. В результате были получены препараты
вируса со степенью очистки от балластных белков 98%. Очистка
вируссодержащих суспензий методом ионообменной хроматографии
позволяет получить вирусный препарат с более высокой степенью
чистоты, по сравнению с методом ультрацентрифугирования в
градиентной плотности сахарозы,
что характеризует большую
перспективность хроматографического метода очистки вируса.
Ключевые слова: грипп лошадей, вирус, хроматография, очистка,
концентрирование
В результате проведенных методом
ионообменной
исследо-вании были подобраны хроматографии позволяет получить
оптимальные
параметры вирусный препарат с более высокой
хроматографической
очистки степенью чистоты, по сравнению с
вируса гриппа лошадей. Было методом ультрацентрифугирования
определено, что полная адсорбция в градиентной плотности сахарозы,
вируса на ионообменник проходит что
характеризует
большую
при использовании буферного перспективность хроматографичесраствора с рН 7,0, для элюирования кого метода очистки вируса.
необходимо использовать буфер,
Грипп лошадей - относится
содержащий 0,5 М хлористого к группе опасных вирусных
натрия с рН 7,4. В результате были болезней животных. Возбудителем
получены препараты вируса со заболевания является
РНКстепенью очистки от балластных содержащий
вирус гриппа А
белков
98%.
Очистка подтипов H7N7 и H3N8, семейство
вируссодержащих
суспензий Orthomyxoviridae, род Influenza.
Анализ
данных
по
распростра-нению заболевания в
странах ближнего и дальнего
зарубежья
за
1990-2010
гг.
свидетельствует о том, что
неблагополуч-ными по данной
болезни являются около 50%
стран европейского, азиатского
и американского континентов
[1,2,3,4].
Постоянная
антигенная
изменчивость ортомиксовирусов и
появление новых штаммов делает
необходимым совершенс-твование
и разработку современных методов
профилактики,
диагностики
и
идентифи-кации вируса гриппа
лошадей и его подтипов. Для этих
целей
необходимо
наличие
очищенных и концентрированных
препаратов данного вируса.
За последнее десятилетие
достигнуты
поистине
знаменательные
результаты
в
изучении природы вирусов, их
морфологии, биохимии, антигенной
структуры и генетики. Одним из
факторов такого прогресса является
разработка современных методов
очистки и концентрации вирусов.
Очистка
и
концентрирование
вирусного материала это основа
для проведения множественных
исследований, направленных на
изучение
морфологических,
химических
и
биологи-ческих
свойств компонентов входящих в
состав вирусного материала.
В настоящее время для
очистки
и
концентрирования
вирусов используют множество
методов такие как: осаждение на
сахарозную подушку, адсорбция
вируса на эритроцитах, очистка
вируса центрифуги-рованием в
градиенте плотности, хроматография. Выбор того или иного
метода зависит от необходимой
степени
чистоты
получаемого
материала.
Ультрацентрифугирование в
гради-ентной плотности сахарозы самый распространенный метод
концентрирования,
очистки
и
фракционирования
вирусов.
Превосходные
препаративные
ультрацентри-фуги
позволяют
обрабатывать большие количества
материала при низкой температуре.
Неотъемлемой
и
существенной частью вирионов
вируса гриппа являются липиды,
углеводы клетки-хозяина и ее
белки,
которые
существенно
различаются по своим размерам и
по плотности. Данный метод
позволяет разделить частицы по
скорости
седиментации
и
плотности в среде [5].
Среди
существующих
методов
очистки
и
концентрирования
пристального
внимания
заслуживает
метод
колоночной хроматографии на
целлюлозных
обменниках.
С
помощью этого метода можно
получить
высокоочищенный
вирусный
материал
и
одновременно
проводить
его
фракциониро-вание.
Хроматография белков на целюлозных
обменниках,
впервые
успешно примененная Петерсеном
и Собером в 1956 году [6], в
последние годы стала наиболее
распространенным
приемом
в
препаративной химии белков и
вирусов на различных стадиях их
очистки. С целью освобождения
вирусов от посторонних белков
используют
синтетические
ионообменники на целлюлоз-ной
основе. Ионообменники на основе
целлюлозы обладают рядом весьма
благоприятных
для
вирусов
свойств, предо-храняющих их от
возможности инактивации.
Целью данных исследований
был подбор оптимального способа
очистки вируса гриппа лошадей из
вируссодержащей
аллантоисной
жидкости. Для выделения и
очистки вируса были испытаны
следующие
методы:
концентрирование вируса методом
ультрацентрифугирования
с
дальнейшей очисткой в градиенте
плотности
сахарозы
и
ионообменная хроматография на
ДЕАЕ-целлюлозе с последующим
концентриро-ванием
вируса
центрифугированием.
Материалы и методы. Вирус.
В
работе
использовали
следующие
штаммы
вируса
гриппа лошадей:
А/лошадь
1/Киргизия/74
(H7N7);
А/лошадь/Отар /764/07 (Н3N8);
А/Лошадь 2/Майами/63 (H3N8).
Вирус нарабатывали в 11суточных
развивающихся
куриных эмбрионах, которые в
последующем
были
инкубированы 48 часов при 33оС.
Ультрацентрифугирование.А
ллантои-сную
жидкость
инфицированных
куриных
эмбрионов
осветляли
низкоскоростным
центрифугированием при 2100 g в
течение 20 мин при температуре
40С.
Осветленный
вируссодержащий
материал
наслаивали на двухступенчатый
градиент плотностей саха-розы 3560 % и центрифугировали при
106200 g
в течение 2 ч при
температуре 4 0С. От сахарозы
вирусную суспензию отмывали
центрифугированием при 106200 g
в течение 30 мин при температуре 4
0
С. Осадок ресуспендировали в 0,05
М ФБР, рН 7,2.
Хроматография.
Вируссодержащую аллантоисную
жидкость
(ВАЖ)
осветляли
центрифугированием при 2100 g 10
мин, рН осветленной жидкости
доводили с помощью 0,05 М
фосфатного буфера до рН 7,0;
наслаивали на колонку размером
50/30 см, содержавшую 50 г ДЕАЕ
– целлюлозы в Cl- форме,
уравновешенной
0,05
М
фосфатным буфером рН 7,0.
Скорость потока проходящего
через колонку составляла 400
мл/час. Затем колонку промывали
раствором 0,15 М NaCl в 0,05 М
фосфатном буфере рН 7,0. Элюцию
адсорбированного на ДЕАЕ –
целлюлозе вируса осуществляли
0,05 М фосфатным буфером рН 7,4,
содержащим 0,5 М NaCl. Сбор
фракции
вели
с
помощью
автоматического
коллектора
фракций.
При
необходимости
очищенную вирусную суспензию
концентрировали
ультрацентрифугированием
при
106200 g в течение 30 мин. при
температуре 4 0С.
Геммаглютинирующую
активность
определяли
микрометодом, используя 1 %
взвесь куриных эритроцитов [7].
Концентрацию
белка
определяли методом Lowry [8].
Электронная
микроскопия.
Целост-ность
вирионов
в
очищенных препаратах определяли
методом
негативного
контрастирования ФВК с помощью
электронного
микроскопа
JEM-100 CX JEOL (Япония) при
ускоряющем напряжении 80 кV и
увеличении ×100 000.
SDS-форез проводили по
Laemmli
[9]
в
10%
полиакриламидном геле.
Результаты
исследований.
При
использовании
двухступенчатого
градиента
плотности сахарозы в процессе
очистки вирус концентрировался
главным образом над 60% слоем
сахарозы (рисунок 1).
Рисунок 1 - Градиентный профиль вируса гриппа лошадей
Электронномикроскопический анализ показал
отсутствие
контаминации
посторонними микроорганизмами
очищен-ных препаратов вируса
гриппа лошадей (рисунок 2).
Установлено, в процессе очист-ки
вирионы
сохраняют
свою
структуру.
Рисунок 2 - Вирус гриппа лошадей штамм А/лошадь/Отар/764/07,
очищенный методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности
сахарозы. Увеличение ×100 000
Анализ очищенных вирусных
суспен-зий в ПААГ показал
наличие
примесных
белков
(овальбумина) в препаратах с
низкой кратностью очистки-штамм
А/лошадь 1/Киргизия/74, тогда как
в препаратах с высокой кратностью
очистки овальбумин отсутствовал
(рисунок 3).
М - маркер молекулярных масс, 1 - вируссодержащая аллантоисная
жидкость штамм А/лошадь/Киргизия/74, 2 - очищенный вирус
А/лошадь/Киргизия/74, 3 - вируссодержащая аллантоисная жидкость
штамм А/лошадь/Майами/63, 4 - очищенный вирус А/лошадь/Майами/63,
5 - вируссодержащая аллантоисная жидкость штамм А/лошадь/
Отар/764/07, 6 - очищенный вирус А/лошадь/Отар/764/07.
Рисунок 3 - Полипептидный состав вируссодержащих суспензий
Результаты по определению ультрацентрифугирования
в
опти-мальных параметров очистки градиентной плотности сахарозы
вируса методом
представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристика очищенных препаратов вируса гриппа
методом ультрацентрифугирования
Наимено
вание
штамма
Выход
вируса
Кратн
по
ость
ГАА,
очист
% от
ки
исходн
ой
Объем,
мл
Титр
ГАА
Белок,
мг/мл
А/лошад
Исходная ВАЖ
ь
Градиентное
1/Киргиз
ультрацентрифугиро
ия/74
вание
300
1:512
1,00
100
1
7
1:8192
0,25
37
64
А/лошад
Исходная ВАЖ
ь2/
Градиентное
Майами/
ультрацентрифугиро
63
вание
300
1:256
1,20
100
1
6
1:8192
0,28
64
137
А/лошадь
/
Отар/764/
07
Исходная ВАЖ
450
1:256
5,25
100
1
Градиентное
ультрацентрифугиро
вание
5
1:8192
0,21
35
796
Этап очистки
Из данных таблицы 1 видно,
вируса
гриппа
резко
что
выход
вируса
по отличается, что вероятно связано со
гемагглютинирующей активности штаммовыми
особенностями
для
штаммов вируса.
А/лошадь1/Киргизия/74 и А/лоРезультаты по определению
шадь/Отар/764/07 не превышает опти-мальных
параметров
40%, тогда как для штамма хроматографии-ческой
очистки
А/лошадь/Майами/63 он составил вируса гриппа лошадей представболее 60%. Кратность очистки
лены в таблице2.
Таблица 2 - Характеристика очищенных препаратов вируса гриппа
лошадей
на разных этапах очистки методом ионообменной
хроматографии
Выхо Белок, Кратност
д по мг/мл ь очистки
ГАЕ,
%
100
0,350
0
Этапы очистки
Исходная ВАЖ
200
64
Адсорбция ВАЖ
200
0
0
0
0
Отмывка 0,05М ФБР рН
7,0
Отмывка 0,15М NaCl
250
0
0
0
0
300
0
0
0
0
Элюция 0,5М NaCl
200
64
100
0,007
50
Исходная ВАЖ
200
512
100
2,500
0
Адсорбция ВАЖ
200
64
12,5
0
0
Отмывка 0,05М ФБР рН
7,0
250
128
31,5
0
0
Отмывка 0,15М NaCl
300
256
75
0,270
4,64
Элюция 0,5М NaCl
200
256
50
0,360
3,5
Исходная ВАЖ
200
128
100
1,375
0
Адсорбция ВАЖ
250
64
62,5
0
0
2
Отмывка 0,05М ФБР рН
7,0
3
300
4
128
5
150
6
0,050
7
27,52
Отмывка 0,15М NaCl
200
64
50
0,735
0,93
Элюция 0,5М NaCl
200
64
50
0
0
А/Лошадь
2/Майами/
63 (H3N8)
Штам
м
А/лошадь А/лошадь/Отар/764/07
1/
(Н3N8)
Киргизия
/74
(Н7N7)
Объем, Титр
мл
в
РГА
Продолжение таблицы 2
1
Из данных таблицы 2 видно,
что
выход
вируса
по
гемагглютинирующей активности
для штамма А/ло-шадь/Отар/764/07
составляет 100%, а для штаммов
А/лошадь 1/Киргизия/74 и А/лошадь 2/Майами/63 он составил 50
%.
При заданных параметрах
хроматографического
процесса
полная адсорбция вируса наблююдается у штамма
А/лошадь/Отар/764/07.
Штаммы
А/лошадь
1/Киргизия/74
и
А/лошадь
2/Майами/63
адсорбировались не полностью.
Электрофоретический анализ
в ПААГ (рисунок 5) показал,
отсутствие примесных белков в
препаратах, как с низкой так и с
высокой
кратностью
очистки.
Данный метод позволяет получать
высокоочищенный
вирусный
материал.
М - маркер молекулярных масс, 1 - ВАЖ А/лошадь/Отар/764/07, 2 очищенный вирус штамм А/лошадь/Отар/764/07, 3 – ВАЖ А/лошадь
1/Киргизия/74, 4 - очищенный вирус А/лошадь 1/Киргизия/74, 5 – ВАЖ
А/лошадь 2/Майами/63, 6 - очищенный вирус штамм А/лошадь
2/Майами/63.
Рисунок 5 - Полипептидный состав вируссодержащих суспензий
Электронномикроскопический
анализ
очищенных препаратов вируса
показал, что данный способ очистки
позволяет
получать
цельновирионную суспензию, не
содержащую примесей белковой
породы (рисунок 6).
А
Б
В
А - Электронная микроскопия очищенного вируса гриппа лошадей,
штамм А/лошадь/Отар/764/07 (Н3N8), Б - Электронная микроскопия
очищенного вируса гриппа лошадей, штамм А/лошадь 1/Киргизия/74
(Н7N7), В - Электронная микроскопия очищенного вируса гриппа
лошадей, штамм А/лошадь 2/Майами/63 (H3N8).
Рисунок 6 - Вирус гриппа лошадей. Увелечение х 100 000
Обсуждение
Для каждого штамма вируса из вируссодержащей алан-тоисной
гриппа
нужно
подбирать жидкости с помощью распределиоптимальные условия, при котором тельной
хроматографии
на
можно
получить
максимально нейтральных
полимерных
очищенный вирусный концентрат. фильтрующих
элементах,
Это связано с особенностями связи состоящих
из
мочевины
и
вирионов с белками аллантоисной формальдегидной
смолы,
с
жидкости [10].
использованием
Орешков А.Б. и соавт. полиэтиленгликоля. В результате
исследовали возможность очистки достигнуто
концентрирование
и концентрирования вируса гриппа исходной
вируссодержащей
аллантоисной жидкости в 15 раз с
одновременным
удалением
не
менее 90-95% примесей белковой
породы [11].
Для очистки вируса гриппа
Кузнецов
Д.П.
и
соавт.
апробировали ряд методов. Были
получены препараты с 88,1-97,7%
очисткой при использовании ПЭГ с
молекулярной массой 6000 дальтон
в концентрации 7,5%. Высаливание
сульфатом аммония позволило
удалить 91,6-89,7% балластных
белков.
Очистка и концентрирование
вируса
ультрафильтрацией
с
использованием мембран УПМ 10 с
пределом
исключения
10кД,
позволило получить вирусный
препарат со степенью очистки от
балластных белков 85,0-87,1%.
Наряду
с
очисткой
и
концентрированием вируса гриппа
А вышеописанными методами
испытывался
также
метод
осаждения
вируса
высокоскоростным
ультрацентрифугиро-ванием.
Очистка при этом достигала 97,197,2% [12]. Однако эти методы
харак-теризуются низким выходом
и недостаточной степенью очистки
вирионов.
Ранее нами были подобраны
оптимальные
параметры
для
хромато-графической
очистки
рекомбинантного штамма вируса
гриппа, позволяющие получать
высокоочищенную цельновирионную вирусную суспензию [13].
Использо-вание
аналогичных
условий для очистки вируса гриппа
лошадей не дало положительных
результатов.
Поэтому мы провели ряд
опытов по данной работе, в
результате
которого
было
установлено, что оптимально для
адсорбции исследуемых штаммов
на ДЕАЕ - целлюлозе использовать
фосфатно-солевой буфер с рН 7,0.
Также было установлено, что
наиболее полная десорбция вируса
штамма
А/лошадь/Отар/764/07
происходит при использовании 0,5
М NaCl в 0,05 М фосфатного
буфера с рН 7,4. В результате были
получены препараты вируса со
степенью очистки от балластных
белков
98%.
Полученные
препараты
могут
быть
использованы
для
изучения
структуры и физико-химических
свойств вирионов вируса гриппа
лошадей с целью получения
отдельных структурных белков и
разработки современных средств
профилактики.
По полученным результатам
можно отметить, что очистка
вируссодержащих
суспензий
методом ионообменной хроматографии
позволяет
получить
вирусный препарат с более высокой
степенью чистоты, чем очистка
вируса методом ультрацентрифугирования
в
градиентной
плотности
сахарозы,
что
характеризует
большую
перспективность
хроматографического
ме-тода
очистки вируса.
Список литературы
1. Jacquet A., Cheyroux M., Plateau E . Surveillance de la grippe equine
en France //Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz. - 1987. - 6. - №1. - P. 141-162.
2. Книзе А.В., Степанов А. В., Стрижаков А.А. и др. Анализ
эпизоотологической ситуации по морбилливирусным инфекциям животных //
Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными,
экзотическими и зооантропонозными болезнями животных: Сб. статей
Междунар. научн. - практ. конф. - Покров. - 2000. - С. 19-22.
3. Шров К.П. Профилактика гриппа лошадей. // Ветеринария. 1991. №1, - С. 34-36.
4. Равилов А. З., Сметанин М. А.. Грипп сельскохозяйственных
животных. Москва, 1989. С. 19-21.
5. А.С. Гринин, И.Н. Титов. Очистка, концентрирование и
фракционирование вирусов животных. Москва, «Колос»-1971 стр.58-61.
6. Peterson E.A., Sober H.A. Chromatography of proteins cellulose ionexchange adsorbents, J. Amer. Chem. Soc.,78,751-755 (1956).
7. Соколов М.И., Синицкий А.А, Ремезов П.И. Вирусологические и
серологические исследования при вирусных инфекциях. – Л.: Медицина,
1972.- 62 с.
8. Lowry O.H., Rosebraugh N.J. et.al. Protein measurement with the Folin
phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. – Vol.193. – P. 265-275
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the
head of bacteriophage T4 –Nature. – 1970. – Vol.227. – P. 681-683.
10. Г.К.С. Чепулис, А.Ф. Бочаров, В.М. Жданов. Ионообменная
хроматография вируса классической чумы птиц на целлюлозных
обменниках. Ж., Ветеринарная вирусология – 1967.- №4.- С. 439-444.
11. А.Б. Орешков, Н.В. Катушкина, В.М. Коликов и др. Очистка и
концентрирование суспензий вируса гриппа с помощью распределительной
хроматографии
на
полимерных
фильтрующих
элементах.
Ж.,
Биотехнологическая теория и научная практика – 1991.- №3.- С. 39-42.
12. Д.П. Кузнецов, Е.И. Ярыгина, И.В. Румянцева, И.И. Кочиш.
Концентрирование и очистка вируса гриппа А птиц. Сб. статей Междунар.
научн. - практ. конф. - 2000. - С. 96-102 .
13. О.В.Червякова, Э.Т.Тайлакова, С.О.Садикалиева, В.Л.Зайцев,
Н.Т.Сандыбаев. Использование ионообменной хроматографии для очистки
вируса гриппа NIBRG-121xp (H1N1). Ж., Актуальные вопросы ветеринарной
биологии-2011.-№1.- С. 23-27.
Түйін
Жүргізілген зерттеулер нәтижесінде жылқы тұмауы вирусын
хроматографиялық тазалаудың тиімді параметрлері таңдалып алынды.
Ионалмастырғышқа вирустың толық адсорбциясы рН 7,0 буферлі ерітіндіні
қолдану арқылы жүзеге асатыны анықталды. Элюирлеу үшін құрамында 0,5
М хлорлы натрийі бар рН 7,4 буферді қолдану қажет. Нәтижесінде қоспа
белоктардан тазару дәрежесі 98% тең вирусты препарат алынды. Құрамында
вирусы бар суспензияны тазалаудың ионалмастырғыш хроматография әдісі
сахарозаның градиентті тығыздығында ультрацентрифугирлеу әдісіне
қарағанда тазалық дәрежесі жағынан жоғары вирусты препарат алуға
мүмкіндік береді. Ол вирусты тазалаудың хроматографиялық әдісін
қолдануының перспективтілігінің жоғарылығын сипаттайды.
Алынған вирусты препараттар заманауи алдын алу құралдарын жасап
шығару және бөлек құрылымдық белоктарды алу мақсатымен жылқы тұмауы
вирусы вириондарының құрылымын және физика – химиялық қасиеттерін
зерттеу үшін қолданылуы мүмкін.
Summary
The optimal parameters of chromatographic purifying of an equine flu virus
were collected and they were considered as a result of the given researches. It has
been defined that the full adsorption of a virus on an ion exchanger passes at use of
a buffered solution with рН 7,0, for the elution it is necessary to use the buffer
containing the 0,5 M of chloride sodium with рН 7,4. The preparations of a virus
with a degree of clearing of ballast proteins of 98 % have been as a result received.
Purifying of virus containing suspensions by a method of an ion-exchange
chromatography allows receiving a virus preparation with higher degree of purity,
in comparison with an ultracentrifugation method in gradient sucrose densities that
characterizes the big perspectivity of a chromatographic method of clearing of a
virus.
The obtaining virus preparations can be used for studying of structure and
physical and chemical properties of virions of an equine flu virus for the purpose
of obtaining of separate structural proteins and development of modern agents of
preventive maintenance.