новые подходы к определению антинуклеарных антител при

ФГБУ “НИИР им. В.А. Насоновой” РАМН
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ АНТИНУКЛЕАРНЫХ
АНТИТЕЛ ПРИ СИСТЕМНЫХ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
Е.Н. Александрова, Ж.Г. Верижникова, А.А. Новиков
Москва
2013
Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа
аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра
и цитоплазмы клеток
ОСНОВНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ В РЕВМАТОЛОГИИ
АНТИНУКЛЕАРНЫЕ АНТИТЕЛА (АНА)
РЕВМАТОИДНЫЙ ФАКТОР (РФ)
АНТИТЕЛА К ЦИТРУЛЛИНИРОВАННЫМ
БЕЛКАМ (АЦБ)
АНТИНЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ
АНТИТЕЛА (АНЦА)
АНТИФОСФОЛИПИДНЫЕ АНТИТЕЛА (АФЛ)
Международные рекомендации по методам
клиническому значению антинуклеарных антител
определения
и
Клиническое значение антинуклеарных антител
• Диагностический критерий ряда аутоиммунных РЗ
(системная красная волчанка, системная склеродермия, синдром
Шегрена, полимиозит/дерматомиозит, смешанное заболевание
соединительной ткани, лекарственная волчанка, аутоиммунный
гепатит)
• Характеристика клинико-лабораторных субтипов
системных РЗ
• Оценка активности патологического процесса
• Оценка прогноза системных РЗ
• Предикторы развития аутоиммунных РЗ у
бессимптомных пациентов
Антинуклеарные антитела: LE-клетки
LE (lupus erythematosus)-клетки: нейтрофилы,
фагоцитировавшие ядерный материал
Низкая чувствительность и специфичность
для диагностики СКВ
В 1950-х г.г. начинается разработка
иммунофлюоресцентных тестов для
диагностики СКВ
Hargraves et al., 1948
Антинуклеарный фактор (АНФ)
1. «Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА
в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ)
с использованием в качестве субстрата криостатных срезов мышиной или
крысиной печени (почек), либо клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака
гортани человека).
2. Применение стандартизованных HEp-2 клеток предпочтительнее, так как
позволяет существенно повысить чувствительность метода и достоверно
описать различные типы свечения ядра. При тестировании АНА методом
НРИФ их традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ).
3. Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра
обнаружения АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа
иммунофлюоресценции.
4. Характер свечения отражает присутствие различных типов АНА, в
определенной степени специфичных для ряда аутоиммунных РЗ.
Схема постановки НРИФ для определения АНФ
Титры АНФ в норме и патологии
Норма < 1:40 при использовании
криостатных срезов печени или почек
лабораторных животных
Норма <1:160 при использовании
HЕp-2 клеток человека
Идентификация 95% больных аутоиммунными
ревматическими заболеваниями и здоровых лиц
АНФ-HЕp-2 в титре 1:40 выявляется у 25-30%,
1:80 у 10 – 15%,1:160 и выше у 5% здоровых людей.
Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин.
Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями
имеют титры АНФ ≥1:40 в 25-30% случаев.
Уровни позитивности АНФ-HЕp-2:
Низко позитивные титры: 1:80/1:160 – 1:320
Умеренно позитивные титры: 1:640
Высоко позитивные титры: >1:1280
E.M.Tan и соавт., Arthritis Rheum 1997;
40: 1 601-1611
ХАРАКТЕРИСТИКА АНФ
Тип свечения
Тип аутоантител
Связь с заболеваниями
Гомогенное
Антитела к ДНК (двух и
односпиральной), ДНП,
гистонам (H1, H2A,H2B, H3,
H4)
СКВ, лекарственная волчанка,
любые аутоиммунные заболевания
Периферическое
(краевое)
Антитела к дс ДНК
СКВ
Крапчатое
Антитела к Sm, РНП, SS-A/Ro,
SS-B/La, Jo-1
СКВ, СЗСТ, синдром Шегрена,
ПМ/ДМ
Сетчатое
крапчатое
Антитела к Scl-70
ССД (диффузная форма)
Дискретное
крапчатое
Антитела к центромере
CREST синдром, синдром Рейно
Нуклеолярное
Антитела к
РНК-полимеразе 1, PM/Scl,
U3РНП
ССД (диффузная форма)
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Y.Shoenfield, M.E. Gershvin, P.L.
Meroni; Autoantibodies,
2nd Edition, Elsevier, 2007.
Высокая чувствительность
Возможность автоматизации
Значительный процент ложноположительных и
ложноотрицательных результатов
Типы тест-систем на основе ИФА в зависимости от
используемых антигенов:
1) экстракт ядер HEp2 клеток (1-е поколение тестсистем)
2) экстракт ядер HEp2 клеток с экстраантигенами
(2-е поколение тест-систем)
3) рекомбинантные антигены
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИНУКЛЕАРНЫХ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ
СУСПЕНЗИОННЫХ МИКРОЧИПОВ (МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ XMAP)
SSB
RiboP
Scl70
Sm
YY
RNP
SSA
dsDNA
SSA
Sm
Control
SSB
RNP
CenB
Scl70
dsDNA
•ANA Screen*
•dsDNA•Chromatin
•Ribosomal Protein
•SS-A (52 and 60)
•SS-B•Sm•Sm/RNP
•RNP (A and 68)
•Scl-70
•Jo-1
•Centromere B
НРИФ vs. ИФА vs. Multiplex
Позиция
ACR
и
EULAR
в
отношении определения АНФ
•
Тестирование АНФ с помощью НРИФ при использовании в качестве субстрата HEp-2
клеток человека (содержащих 100-150 различных аутоантигенов)- «золотой стандарт»
и первичный скрининговый метод определения АНА в сыворотке крови
•
Другие скрининговые методы определения АНА (ИФА, мультиплексные технологии,
устанавливающие наличие в сыворотках антител к ограниченному количеству
очищенных/рекомбинантных антигенов или смеси ядерных антигенов с
измененными либо утраченными эпитопами, увеличивают процент
ложноотрицательных результатов и не могут заменить тестирование АНФ с
помощью НРИФ
•
Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием
различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные
диагностические платформы) должны предоставить данные о такой же или более
высокой чувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИФ.
•
У пациентов с положительными результатами определения АНФ рекомендуется
проведение подтверждающих тестов на специфические АНА к отдельным ядерным
антигенам (нДНК, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, РНП), используя методы ИФА,
иммуноблота (ИБ), двойной иммунодиффузии (ДИД), контриммуноэлектрофореза
(КИЭФ) и др.
•
Некоторые типы АНА (антицентромерные, PCNA, антитела к митотическому аппарату
клетки-NUMA) обнаруживаются только методом НРИФ на HEp-2 клетках, что
исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью
подтверждающих тестов.
•
Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-Sm и др. должны быть валидированы
согласно национальным (CDC) или международным ( WHO) стандартам.
•
В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА.
НЕДОСТАТКИ НЕПРЯМОЙ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ - ОСНОВНОГО
СКРИНИНГОВОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИНУКЛЕАРНЫХ АНТИТЕЛ
Y.Shoenfield, M.E. Gershvin,
P.L. Meroni; Autoantibodies,
2nd Edition, Elsevier, 2007.
» СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА
» НЕОБХОДИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
ТИПОВ СВЕЧЕНИЯ
» ОТСУТСТВИЕ КВАЛИФИЦИРОВАННОЙ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ
» ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СВЕЧЕНИЯ В ТИТРАХ
» ОТСУТСТВИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СУБСТРАТОВ, РЕАГЕНТОВ, МИКРОСКОПА
http://www.euroimmun.us
Автоматизированные системы интерпретации
клеточных флюоресцентных тестов
способствуют стандартизации и улучшению
воспроизводимости НРИФ при определении
АНА у больных РЗ
http://www.aklides.com/
http://www.immcodiagnostics.com
http://www.aesku.com
Цель исследования
Сравнительный анализ автоматизированной и визуальной
интерпретации результатов НРИФ-HEp-2 при определении
антинуклеарных антител (АНА) в сыворотках больных
ревматическими заболеваниями (РЗ).
*Работа выполнена в рамках договора о научно-практическом
сотрудничестве ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН (директор –
академик Е.Л. Насонов), ГБОУ ВПО «ЯГМА» (ректор – профессор А.В.
Павлов) и компании MEDIPAN GMBH (директор – Д. Роггенбук) по теме
НИОКР ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН «Значение мультиплексных
молекулярно-клеточных
технологий
в
лабораторной
диагностике
ревматических заболеваний», регистрационный номер 01201180902
(2012-2016 г.г.).
Материалы и методы
Исследованы сыворотки 1178 больных (185 – СКВ, 148 - СШ, 181 – ССД, 44 –
ПМ/ДМ, 60 – перекрестным синдромом, 35 - антифосфолипидным синдромом,
525 – другими РЗ), наблюдавшихся в ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН
в 2012 г.
АНА определяли методом НРИФ-НЕр-2 с помощью коммерческого набора
реагентов AKLIDES®ANA («Medipan GmbH», Германия) согласно инструкции
фирмы-изготовителя.
Обработку результатов НРИФ-HЕp-2 проводили:
-с использованием автоматизированной платформы
AKLIDES («Medipan GmbH», Германия) на основе
многопараметрического анализа внутриклеточных
структур
- методом визуальной оценки образцов флюоресценции
под микроскопом AXIOSKOP 40 (“Zeiss”, Германия)
двумя экспертами
Согласованность
позитивных/негативных
результатов
выявления АНА по данным автоматизированной и
визуальной оценки НРИФ-HEp-2
Автоматизированная интерпретация
n (%)
Визуальная интерпретация
n (%)
Позитивный
≥ 1:160 (%)
Негативный
< 1:160 (%)
n (%)
Позитивный
≥ 1:160 (%)
784 (66,6%)
158 (13,4 %)
942 (80,0%)
Негативный
< 1:160 (%)
60 (5,1%)
176 (14,9 %)
236 (20,0%)
n (%)
844 (71,6%)
334 (28,4 %)
1178
Позитивные/негативные результаты определения АНФ на анализаторе AKLIDES и
рутинным методом совпадали в 81,5% случаев (позитивные – у 66,6%, негативные – у
14,9% пациентов) (κ=0,5).
Чувствительность определения АНА с помощью автоматизированной платформы
AKLIDES была выше, чем при использовании визуальной микроскопической техники
(80,0% и 71,6%, соответственно, p<0,05).
А.А. Новиков, 2012
Ж.Г. Верижникова, 2013 г.
Сравнение результатов автоматизированной и визуальной
интерпретации типов свечения в сыворотках
784 АНФ-позитивных больных РЗ (I)
Тип свечения
Автоматизированная
интерпретация
n (%)
295 (37,6%)
Визуальная
интерпретация
n (%)
61 (7,8%)
253 (32,3%)
100 (12,8%)
24 (3,1%)
9 (1,1%)
44 (5,6%)
43 (5,5%)
Недифференцированное
168 (21,4%)
0
Homogeneous + Speckled
(смешанное)
0
571 (72,8%)
ИТОГО:
784
784
Homogeneous
(гомогенное)
Speckled
(крапчатое)
Nucleolar
(нуклеолярное)
Centromere
(центромерное)
Автоматизированным методом наиболее часто определялось гомогенное и крапчатое
свечение (в 37,6% и 32,3% случаев); у 21,4% больных встречался недифференцированный
тип свечения. Визуальным методом в сыворотках большинства пациентов (72,8%)
выявлялся смешанный тип свечения АНФ.
А.А. Новиков, 2012 г.
Ж.Г. Верижникова, 2012 г.
Сравнение результатов автоматизированной и визуальной
интерпретации типов свечения в сыворотках
АНФ-позитивных больных РЗ (II)
√ Смешанное свечение (n=571) распознавалось анализатором AKLIDES как гомогенное
у 231 (40,5%) больных, крапчатое - у 187 (32,7%), нуклеолярное - у 14 (2,4%),
центромерное - у 5 (0,9%), недифференцированное - у 134 (23,5%).
√ При визуальном исследовании образцов флюоресценции (n=168) с
недифференцированным типом свечения в 134 (79,8%) из них было
идентифицировано смешанное, в 10 (5,9%) – гомогенное, в 24 (14,3%) – крапчатое
свечение.
√ Совпадение по типам свечения при автоматизированной и визуальной интерпретации
результатов НРИФ-HEp-2 у 179 больных РЗ (после исключения
недифференцированного и смешанного свечения) наблюдалось в 143 (80,0%) случаях;
согласованность типов свечения была «хорошей» (κ=0,7).
А.А. Новиков, 2012 г.
Ж.Г. Верижникова, 2013 г.
Взаимосвязь между титрами АНФ и
интенсивностью сигналов флюоресценции
Титры
Интенсивность свечения
<1:160
1:160
1:320
1:640
≥ 1:1280
«0 / ±»
«0 / ±», «+» и «++»
«+» и «++»
«++» и «+++»
«+++» и «++++»
Степень соответствия
72,2%
99,6%
80,7%
83,2%
100%
Степень согласованности титров и интенсивности свечения АНФ у 1178
больных РЗ оценивалась как «хорошая» (κ=0,45).
Ж.Г. Верижникова, 2013 г.
Причины несовпадения результатов определения
АНА при автоматизированной и визуальной
обработке НРИФ-HEp-2
Расхождения в оценке отрицательных/низких титров АНФ и
интенсивности сигнала флюоресценции
Учет цитоплазматического свечения системой AKLIDES
Возможные артефакты, связанные с некачественной окраской препаратов
Комбинация различных типов свечения в одном образце
(смешанное свечение)
Наличие редких типов свечения (антител к ядерной мембране, аппарату
Гольджи и др.)
ВЫВОДЫ
•
Непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием в
качестве субстрата клеток линии HЕp-2 (НРИФ-HEp-2) - «золотой
стандарт» и первичный скрининговый метод определения
антинуклеарных антител (АНА) в сыворотках больных РЗ
•
В рутинной практике автоматизированная платформа «AKLIDES»
позволяет:
1) эффективно идентифицировать позитивные и негативные
результаты определения АНА сопоставимо с «классическим»
визуальным методом интерпретации НРИФ-HEp-2
2) прогнозировать максимальный конечный титр АНА в сыворотках
больных РЗ по интенсивности сигнала флюоресценции.
•
Для подтверждения результатов автоматизированной оценки типов
ядерного свечения и уточнения титров АНА рекомендуется
дополнительное экспертное визуальное исследование позитивных
образцов флюоресценции.
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ