Министерство здравоохранения Российской Федерации Абакумова Татьяна Олеговна Векторные визуализирующие системы для МРТ диагностики
advertisement
Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральный медицинский центр психиатрии и наркологии имени В.П.Сербского На правах рукописи Абакумова Татьяна Олеговна Векторные визуализирующие системы для МРТ диагностики патологических процессов нервной системы Специальность: 03.01.04 – Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: академик РАН, профессор, доктор медицинских наук В.П. Чехонин Москва 2015 Оглавление Актуальность исследования ................................................................................... 5 Глава 1. Обзор литературы ................................................................................... 10 Глава 2. Материалы и методы .............................................................................. 31 2.1 Реактивы........................................................................................................ 31 2.2 Животные ...................................................................................................... 31 2.3 Культивирование клеток ............................................................................. 32 2.4 Синтез контрастного агента ........................................................................ 33 2.5 Конъюгация контрастного агента с антителами ....................................... 35 2.6 Образование комплекса mAb-PLL-DTPA-Gd ........................................... 35 2.7 Получение флуоресцентно-меченых контрастных агентов .................... 36 2.8 Аминокислотный анализ ............................................................................. 36 2.9 Рентгенофлуоресцентный анализ ............................................................... 37 2.10 Измерение T1-релаксивности. .................................................................. 37 2.11 Получение асцитической жидкости, выделение и очистка моноклональных антител. ................................................................................. 38 2.12 Иммуноферментный анализ (ELISA) ...................................................... 40 2.13 Оценка цитотоксичности конъюгатов (МТТ-тест)................................. 41 2.14 Иммунофлюоресцентный анализ антигенов на срезах ткани мозга и в культуре клеток .................................................................................................. 41 2.15 Проточная цитофлюориметрия ................................................................ 43 2.16 Моделирование и характеристика патологических процессов нервной системы: рассеянный склероз и опухоли головного мозга ........................... 44 2.17 Полимеразная цепная реакция. ................................................................. 46 2.18 Нейрофизиологические тесты .................................................................. 47 2 2.19 МРТ сканирование головного мозга ........................................................ 47 2.20 Анализ данных МР-изображений............................................................. 49 Глава 3. Результаты исследования ...................................................................... 51 3.1. Синтез контрастного агента ....................................................................... 51 3.2 Сравнение физико-химических характеристик ........................................ 52 3.3. Анализ цитотоксичности препаратов с помощью MTT-теста. .............. 57 3.4. Оценка иммунохимической активности конъюгированных антител.... 59 3.5. Иммунофлюоресцентный анализ .............................................................. 60 3.7. Проточная цитофлуориметрия .................................................................. 63 3.8. Оценка эффективности препаратов in vivo: моделирование патологических процессов нервной системы ................................................. 66 3.9. Гистологический анализ ............................................................................. 70 3.10. Полимеразная цепная реакция ............................................................. 71 3.11. Проницаемость гемато-энцефалического барьера при купризониндуцированной демиелинизации ................................................................... 75 3.12. Визуализация глиомы С6 in vivo с помощьюT1-контрастных агентов77 3.13. Визуализация очагов демиелинизации in vivo с помощьюT1контрастных агентов .......................................................................................... 80 3.14. Оценка накопления и распределения контрастного агента .................. 82 Глава 4. Обсуждение ............................................................................................. 90 Выводы: .................................................................................................................. 98 Список литературы ............................................................................................. 101 3 Список сокращений МРТ - магнитно-резонансная томография ЦНС - центральная нервная система ГЭБ –гематоэнцефалический барьер Gd – гадолиний PLL - полилизин DTPA - диэтиленпентауксусная кислота DOTA - 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота DMEM – среда Игла в модификации Дульбекко FBS – сыворотка зародыша теленка ГЭБ – гематоэнцефалический барьер МРТ – магнитно-резонансная томография Т1 - время спин-продольной релаксации протонов Т2 - время спин-поперечной релаксации протонов ВКВ - внеклеточные контрастные вещества Сх43 – коннексин 43 GFAP – глиофибриллярный кислый белок КТ – компьютерная томография PBS - фосфатно-солевой буфер 4 Актуальность исследования В настоящее время особую сложность в плане диагностики с помощью магнитно-резонансной томографии представляют собой заболевания центральной нервной системы (Giesel et al 2010). Для достижения лучшей визуализации патологических очагов используются контрастные агенты вещества, влияющие на скорость релаксации протонов воды в окружающих тканях и, тем самым, увеличивающих контраст изображения. Одними из наиболее хорошо изученных и эффективных контрастных агентов являются препараты на основе ионов гадолиния (III) (Burtea et al 2008). Хелатирование позволяет многократно снизить токсичность Gd3+ и использовать их в качестве контрастного препарата. Начиная с 1980-х годов, применение хелатов Gd3+ позволило значительно улучшить диагностику заболеваний ЦНС. Введение препаратов пациентам с онкологическими заболеваниями позволило выявить метастазирование опухоли в головной мозг, незамеченное другими методами исследования (Claussen et al 1985b). Также с помощью контраст-усиленной МРТ была впервые показана множественность поражения головного мозга у пациентов с рассеянным склерозом (Rocca et al 2013). Однако, несмотря на полученные достижения, высокие дозы препаратов и неспецифическое распределение оставляет открытым вопрос разработки более эффективных контрастных агентов. На сегодняшний день существуют различные подходы к улучшению свойств контрастирующих веществ: от конъюгации хелатов гадолиния с макромолекулами и наночастицами до использования мультифункциональных систем для визуализации различными методами (ПЭТ/МРТ (Kjaer et al 2013), МРТ/флуоресцентная визуализация (Huang et al 2013) и др.). Повышение чувствительности метода и физико-химических свойств препаратов позволит снизить вводимые дозы (Mitsumori et al 2014), однако остается актуальной проблема направленной доставки контрастных агентов и селективности получаемого изображения. Неспецифическое распределение в организме 5 применяемых в клинике препаратов приводит к низкому уровню накопления и недостаточной концентрации контрастных агентов в зоне патологического очага. Создание систем направленной визуализации поражений ЦНС, способных селективно связываться с нейроспецифичными антигенами клеток-мишеней позволит диагностическую и решить новые прогностическую задачи ценность и увеличить магнитно-резонансной томографии (Singh & Lillard 2009). Векторизация контрастных агентов может быть выполнена за счет конъюгации с низкомолекулярными лигандами (фолиевая кислота, RGD пептид, аптамеры) или более крупными молекулами (например, моноклональные антитела). В качестве перспективных мишеней для диагностики патологических процессов ЦНС особый интерес представляют белки, экспрессия которых повышена при повреждении нервной ткани в ходе развития заболевания. Так, диагностика опухолевых заболеваний головного мозга может быть значительно улучшена за счет селективного связывания контрастного агента с коннексином 43 (Сх43) – основным белком коннексонов, структурной единицы щелевых контактов, высокоэкспрессированного на периферии глиомы. В качестве белка-мишени для диагностики поражений ЦНС, в том числе нейродегенеративных изменений ткани, большой интерес представляет глиофибриллярный кислый белок (GFAP). GFAP был впервые выделен у пациента с рассеянным склерозом в 1959 году и является белком промежуточных филаментов в цитоскелете дифференцированных астроцитов, основным маркером реактивного астроглиоза. Высокая селективность моноклональных антител к GFAP позволяет рассматривать их в качестве перспективного вектора для конъюгации с контрастными агентами для специфичной визуализации патологических очагов ЦНС (демиелинизации, воспаления и др.). Таким образом, для улучшения диагностики опухолевых и демиелинизирующих заболеваний головного мозга необходимо создание контрастных агентов, способных селективно высокоэкспрессированными связываться при заболеваниях с белками-мишенями, ЦНС, и обладающих 6 улучшенными физико-химическими свойствами по сравнению с существующими аналогами. Данный подход позволит улучшить не только первичную диагностику социально значимых заболеваний ЦНС, но и оценить их течение и эффективность терапии (Poloni et al 2011, Zhou & Lu 2012). Цель работы: Изучение перспектив применения конъюгатов на основе моноклональных антител (mAb anti-GFAP и mAb anti-Cx43) и хелатных комплексов гадолиния для МРТ диагностики экспериментальных опухолей и демиелинизирующих заболеваний ЦНС. Задачи: Охарактеризовать и валидировать модели рассеянного склероза на мышах линии С67BL/6 и мультиформной глиобластомы на крысах линии Wistar. Разработать метод синтеза высокоселективных контрастных препаратов на основе моноклональных антител (mAb anti-GFAP и mAb antiCx43) и хелатных комплексов гадолиния. Охарактеризовать полученный векторный контрастирующий препарат по следующим параметрам: 1) иммунохимическая активность конъюгата антител с гадолинием; 2) релаксивность; 3) количество гадолиния на молекулу контрастного агента; 4) цитотоксичность; 5) стабильность. Оценить специфичность и эффективность связывания с антигеном антител, конъюгированных с контрастным агентом, на культуре опухолевых клеток глиомы и астроцитов человека in vitro. Оценить селективность накопления синтезированных векторных контрастных препаратов в опухолевой ткани крыс с экспериментальной ортотопической С6 глиомой при системном введении. Оценить эффективность визуализации патологических очагов с помощью полученных контрастных препаратов на мышах с купризон7 индуцированной демиелинизацией. Научная новизна: Продемонстрировано, что конъюгация моноклональных моноклональных антител ;анти-GFAP и анти-Cx-43) с контрастным агентом на основе модифицированных полилизином хелатных комплексов гадолиния позволяет получить векторный контрастирующий препарат, селективно накапливающийся в экспериментальной глиоме С6 и очагах демиелинизации, а также достоверно улучшающих их МРТ визуализацию. Практическая значимость: Разработанный метод синтеза высокоселективных контрастирующих конъюгатов на основе моноклональных анти-GFAP, анти-Cx-43 антител и хелатных комплексов визуализирующие гадолиния препараты позволяет для МРТ получать диагностики эффективные опухолей и демиелинизирующих заболеваний ЦНС. Апробация, внедрение, публикации: Апробация работы. Основные положения работы представлены и обсуждены на 25 российских и международных конференциях, в том числе: на VI-IX Международных Пироговских научных медицинских конференциях студентов и молодых ученых (Москва, 2011-2014), на 2-ой Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Москва, 2011), на международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2012), ХIХXXI международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2012-2014), VII-VIII Всероссийских конференциях с международным участием молодых ученых по химии «Менделеев» (Санкт-Петербург, 2013 г. и 2014 г.), 10-ом Международном симпозиуме «Полимерные терапевтические препараты: из лаборатории в клиническую практику» (Валенсия, Испания, 2014), на 12-ой международной конференции «Наноструктурированные материалы NANO 2014» (Москва, 2014) и 6-ой конференции «Наноматериалы: исследование и применение» 8 (Брно, Чехия, 2014), научной конференции имени Гордона «Наноматериалы в онкологии»(Вест Довер, Вермонт, США, 2015). Апробация работы была проведена на заседании Проблемного совета отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ФМИЦПН имени В.П. Сербского» Минздрава РФ. Публикации По материалам диссертации опубликовано 26 работ, из них 5 статей в ведущих российских рецензируемых журналах, 2 статьи в зарубежном журнале, 19 тезисов в материалах российских и международных конференций и симпозиумов. Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 111 машинописных страницах; состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В основных главах работы приведены данные обзора литературы, характеристика объекта, методов исследования, а также используемого материала, результаты собственных исследований и их обсуждение. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами. 9 Глава 1. Обзор литературы Введение Впервые в 1985 году введение препарата на основе гадолиния (GdDTPA) позволило эффективно визуализировать патологических очаги в центральной нервной системе (Carr et al 1984, Claussen et al 1985a, Runge et al 1985a, Runge et al 1985b). Так, благодаря контраст-усиленной МРТ была впервые установлена многоочаговость поражения головного мозга при рассеянном склерозе (Rocca et al 2013). Применение контрастирующих препаратов для визуализации опухолей головного мозга позволила улучшить визуализацию их границ и метастазов в головном мозге (Claussen et al 1985b), увеличить точность прогноза засчет послеоперационной диагностики роста опухоли (Yoshii et al 1992). За последние 30 лет развитие различных методов диагностики заболеваний ЦНС позволило значительно улучшить качество визуализации не только за счет разработки различных протоколов и подбора оптимальных параметров сканирования (Andersen et al 2002, Miller et al 1998), использования комбинированных техник исследования (Jung et al 2015, Tatsumi et al 2012), но и за счет улучшения физико-химических свойств применяемых контрастных агентов (Caravan et al 2009, Frullano et al 2013). Повышение релаксирующей способности вещества, селективности связывания с патологическим очагом, увеличение времени циркуляции в крови ведет к усилению контраста на МР-изображении между здоровой и патологической тканью, что повышает точность диагноза и, как следствие, эффективность терапии и точность прогноза заболевания. В данном обзоре рассматриваются различные способы улучшения свойств современных контрастных агентов, оценка вклада адресной доставки для улучшения диагностики заболеваний ЦНС, особенности доклинических исследований и перспективы применения разрабатываемых контрастных агентов в клинической практике. 10 МРТ и контрастные агенты Официальным годом изобретения МРТ принято считать 1973 год. Именно тогда в журнале "Nature" была опубликована статья профессора химии и радиологии из Нью-Йоркского университета Пола Лотербура, посвященная созданию трехмерных изображений объектов с помощью спектров протонного магнитного резонанса (Lauterbur 1973). Эта работа легла в основу метода магнитной резонансной томографии (МРТ) и стала фундаментом для дальнейших исследований (Bangert et al 1981, Mansfield & Maudsley 1977). На сегодняшний день МРТ является одним из самых точных методов диагностики, развившихся в целую область медицины. Применение контрастных агентов при проведении МРТ позволяет значительно улучшить контрастирование патологического очага за счет ускорения процессов релаксации протонов воды в окружающей ткани. При этом контрастные агенты можно разделить на два класса: Т1-контрастные агенты (укорачивают спин-решеточное Т1 время релаксации) и Т2-контрастные агенты (укорачивают спин-спиновое Т2 время релаксации). Т1-агенты называют еще позитивными контрастными агентами, потому что доминирующий T 1снижающий эффект приводит к увеличению интенсивности сигнала в ткани (Рисунок 1а). T2-контрастные агенты – или отрицательные контрастные агенты – в значительной степени избирательно увеличивают 1/T2 ткани, что приводит к снижению интенсивности сигнала (Рисунок 1б). Парамагнитные контрастные агенты на основе гадолиния (Huang & Tsourkas 2013) и марганца (Huang et al 2015)– это примеры T1-агентов, в то время как магнитные наночастицы оксида железа (Neuwelt et al 2015) являются примерами T2-контрастных агентов. В настоящее время в клинике при проведении исследований с помощью МРТ используют препараты на основе гадолиния (Caravan 2006). Это связано прежде всего, с ограниченным применением магнитных наночастиц железа у человека в связи с особенностью их биораспределения в организме (Storey et al 2012). Неоднократные инфузии магнитных наночастиц железа могут привести к 11 созданию депо железа и, как следствие, повышению его концентрации и возможному повреждению тканей за счет возникновения окислительного стресса (Neuwelt et al 2015). Кроме того, недостатком является широкий разброс времени выведения железа из организма: так около 50% испытуемых было необходимо до 11 месяцев для удаления избытка железа из организма (Storey et al 2012). Данная особенность позволила рекомендовать магнитные наночастицы для лечения дефицита железа, однако использование его в качестве контраста было ограничено. Медленное выведение (до 11 месяцев) может привести к влиянию накопившегося ранее железа на сигнал от введенного контраста на МРТ или радиографии. Стоит отметить, что железо также обладает высокой магнитной восприимчивостью и его накопление может привести к возникновению артефактов на МР-томограмме (Storey et al 2012). Данные особенности позволяют предположить, что разработка новых контрастных агентов на основе гадолиния и улучшение их свойств (селективность, релаксивность) выглядит более перспективной в аспекте успешного прохождения клинических испытаний. Рисунок 1. Трансверсальный срез головного мозга мыши. Т1взвешенное изображение (А) и Т2-взвешенное изображение (Б). 12 Свойства Т1 контрастных агентов Контрастные агенты на основе гадолиния относятся к парамагнитным контрастным агентам. Они оказывают одинаковое влияние на времена релаксации Т1 и Т2, но поскольку Т1 тканей гораздо больше, чем Т2, то при низких дозах преобладает эффект сокращения Т1. Таким образом, ткани, накапливающие парамагнитные контрастные вещества, становятся яркими на Т1-взвешенных томограммах (Петер Ринкк, Магнитный резонанс в медицине). Низкомолекулярные Т1-контрастные вещества в организме человека распределяются во внутрисосудистом и межклеточном пространствах. Поэтому их называют еще внеклеточными контрастными веществами (ВКВ). Это, как правило, Gd3+ хелаты линейных и макроциклических лигандов полиаминокарбоксилатов, и они составляют наиболее важный класс коммерчески доступных контрастных агентов (Рисунок 2) (Oudkerk et al 1995, WAGONER & WORAH 1993). 13 Рисунок 2. Примеры Т1-контрастных агентов, одобренных для применения в клинической практике (Bellin & Van Der Molen 2008) Механизм действия ВКВ обусловлен находящимся в центре ионом металла, содержащим неспаренные электроны (Geraldes & Laurent 2009). Гадолиний (Gd3+) и марганец (Mn2+) являются примерами парамагнитных ионов, которые используются как контрастные агенты для МРТ, потому что их физические свойства подходят для эффективного снижения T1 и T2 времени релаксации протонов. Они обладают, соответственно, семью или пятью неспаренными электронами и симметричными (8S или 6S) основными состояниями, в результате медленной электрон-спиновой релаксации. Теория релаксации парамагнитных систем хорошо описана в литературе (Banci L 1991, Koenig SH 1990). 14 Стоит отметить, что при разработке контрастных агентов следует учитывать не только парамагнитные свойства гадолиния, но и другие, не менее важные параметры, такие как: 1) увеличение релаксивности получаемых соединений 2) длительное время циркуляции препарата (Сорокина К.Н. 2011) 3) высокая тканевая специфичность; 5) низкая токсичность соединений; 6) стабильность Релаксивность - это вклад контрастного агента в скорость релаксации протонов воды в исследуемом растворе, который он дает в концентрации 1 ммоль. Релаксивность зависит от многих параметров: внешнего поля, строения электронной оболочки иона металла, обмена воды, вращательной диффузии, первой и второй координационных сфер гидратации, расстояния от ионов до протонов воды (Caravan 2006). Управляя этими параметрами, современные исследователи пытаются увеличить релаксивность новых контрастных агентов (D'Onofrio et al 2012, Giesel et al 2010). Рекомендованная доза Т1-контрастных агентов применяемых в клинике составляет более 0,1 ммоль Gd/кг веса (0,2-0,3 ммоль Gd/кг для проведения МРТ центральной нервной системы) (Caravan 2006, Frullano & Caravan 2011). Увеличение значений релаксивности контрастных агентов позволит снизить вводимую дозу и обеспечит лучшее контрастирование патологических очагов. На сегодняшний день существует две основные стратегии для увеличения релаксивности: 1) оптимизация физико-химических параметров молекул контрастного агента; 2) связывание нескольких хелатных Gd3+комплексов вместе. На основе этих двух стратегий - последние 25 лет создаются всё новые подходы к синтезу контрастных агентов на основе мультимерных Gd3+-комплексов. Для создания новых макромолекулярных комплексов, несущих контрастные агенты, хелатные Gd3+-комплексы могут быть либо ковалентно пришиты к «носителю» (полимер (Weissleder et al 1993), дендример (Li et al 2013) и др.), либо нековалентно включены в структуру «носителя» (например, липосомы (Saito et al 2004, Zhang 2004)). 15 Оптимизация параметров, с помощью которых можно регулировать релаксивность контрастных агентов, включает в себя относительное время вращения всего комплекса τr, относительное время обмена воды τm и относительное время диффузии воды τd, связанные с релаксацией протонов воды, в которой растворен гадолиний. Вблизи Gd 3+ ионов происходит релаксация протонов воды, а затем быстрый обмен протонов воды с основной массой контрастного агента. Чтобы описать этот процесс воду условно можно разделить на две части: 1) первая (внутренняя) сфера воды, где кислород воды непосредственно координирует с Gd3+ ионами; 2) вторая (внешняя) сфера воды, которая описывает молекулы воды, гидратирующие хелатный комплекс и имеющие ограниченное время жизни, большее, чем время трансляционной диффузии чистой воды. Стоит отметить, что при этом взаимодействие протонов воды с гадолинием (III) определяется только поступательной диффузией и расстоянием наибольшего сближения (Рисунок 3) (Caravan 2006). Рисунок 3. Физический принцип работы Т1-контрастных агентов на примере низкомолекулярного контрастного агента Gd-DTPA. Вода, координированная во внутренней координационной сфере иона Gd3+, испытывает эффективную релаксацию. Важными свойствами релаксации являются относительное 16 время вращения τr всего комплекса, относительное время обмена τm и относительное время диффузии τd. Релаксация протона воды гадолинием (III) происходит через дипольный механизм. Релаксация будет зависеть от числа молекул воды, их расстояния до Gd3+, их ориентации в растворе, и некоторым временем корреляции, τс. Переменные магнитные диполи могут вызвать спиновые переходы и привести к релаксации спина. Время корреляции - постоянная времени, характеризующая эти колебания. Обратной ему (1/τс) является средняя константа скорости колебаний этих диполей. Есть несколько процессов, которые приводят к колебаниям магнитного диполя. Релаксация электронов (1/T1e) на ион Gd3+ создает флуктуационные поля. Вращательная диффузия (1/tR) комплекса создает колебания поля. Обмен протонов воды в первый (1/Tm) или второй (1/tm) координационной сфере создает флуктуационные поля для ядра водорода. Это самый быстрый темп (наименьшая постоянная времени), который определяет степень релаксации. Для воды, находящейся во внешней сфере, соответствующим временем корреляции может быть время жизни этой молекулы воды, которая может составлять порядка 10-12 секунды. Вода во внутренней сфере, как правило, имеет гораздо больше времени жизни (1-10секунды), и время корреляции, соответствующее, как правило, вращательной диффузии или электронной релаксации. Второй стратегией для увеличения релаксивности является связывание нескольких комплексов гадолиния вместе, т.е. создание мультимерных комплексов гадолиния. Это можно сделать, конъюгируя низкомолекулярные хелатные комплексы с различными полипептидами (Opsahl et al 1995), дендримерами (Lim et al 2012), полимерами (Weissleder et al 1993), либо загружая парамагнитные комплексы в различные контейнеры (мицеллы (Torchilin 2002), липосомы и др. (Zhang 2004)). В этом случае увеличение значений релаксивности достигается засчет уменьшения скорости вращения 17 молекулы контрастного агента. Кроме того, конъюгация нескольких хелатных комплексов гадолиния (III) с макромолекулами позволяет также увеличить продолжительность времени циркуляции препарат в крови (см. ниже). Увеличение значений релаксивности возможно также за счет использования хелатирующих агентов с более высоким координационным числом (Рисунок 2) (Granato et al 2011). Так спустя несколько лет после успешного применения Магневиста (гадопентетеновая кислота) в клинике, на рынок вышли новые контрастные агенты на основе гадолиния: Проханс (гадотеридол) (Runge et al 1989), Омнискан (гадодиамид) (Sze et al 1991), Оптимарк (гадоверсетамид) (Rubin et al 1999), и Дотарем (гадотеровая кислота) (Oudkerk et al 1995). В настоящее время разработаны различные хелатирующие агенты, в комплексе с гадолинием позволяющие увеличить значения релаксивности контрастных агентов (Caravan 2006) (Рисунок 3). 18 Рисунок 4. Различные хелатирующие агенты, используемые для комплексообразования с гадолинием. Повышение продолжительности времени циркуляции контрастных агентов обеспечиваются за счет увеличения молекулярной массы (конъюгации с макромолекулами) (Huang & Tsourkas 2013) или возможности связывания контрастных агентов с белками плазмы (альбумином) (Eldredge et al 2006, Mohs & Lu 2007). Конъюгирование хелатных Gd3+ комплексов (Gd19 DTPA или Gd-DOTA с макромолекулами изменяет биофизические и фармакологические свойства Т1-контрастных агентов (Brasch 1991). Высокий молекулярный вес макромолекулярных конъюгатов позволяет им долго циркулировать в сосудистом пространстве из-за больших молекулярных размеров и, таким образом, способствовать визуализации сосудов (Mohs & Lu 2007). Конъюгация хелатов Gd3+ с полимерными материалами способна увеличить вращательное время корреляции и, следовательно, улучшить релаксивность. Сочетание мультимерных хелатных Gd3+ комплексов с тканеспецифичными векторными молекулами позволяет визуализировать рецепторы, которые присутствуют в тканях даже в низкой концентрации. Однако чаще всего цель визуализации - это рецепторы, которые высоко экспрессируются при различных патологиях, в том числе и при опухолях головного мозга. Наиболее общие подходы для создания макромолекулярных структур, содержащих хелаты Gd3+, заключаются в формировании конъюгатов на основе хелатов с дендримерами, биологическими молекулами, полимерами или полипептидами, таких как полиаргинин или полилизин (Aime et al 2006, Schuhmann-Giampieri et al 1991). Полилизин является коммерчески доступным полипептидом с различным молекулярным весом и широко применяется для конъюгации с хелатами гадолиния (Schuhmann-Giampieri et al 1991). Реакционноспособная ε-аминогруппа полилизина, как правило, модифицируется ациклическими и макроциклическими производными полиаминокарбоксилатов. Полилизин может быть конъюгирован фармакокинетических свойств с полиэтиленгликолем таких агентов: для улучшения увеличения времени циркуляции в крови, уменьшения взаимодействия полимера с белками и другими молекулами крови, что ведёт к уменьшению опсонизации и меньшему захвату таких агентов клетками ретикуло-эндотелиальной системы (Bogdanov et al 1993, Gupta et al 1995). Тканевая специфичность разрабатываемых препаратов осуществляется за счет активной и пассивной доставки контрастирующих 20 веществ. Пассивно направленные контрастные агенты включают в себя органоспецифичные вещества для печени (гепатобилиарной системы), селезенки, лимфатических узлов, костного мозга или головного мозга, специфичность которых основана, главным образом, на размере контрастного агента и его химической структуре. Существуют также органоспецифичные агенты, которые не вводят внутривенно (например, препараты для визуализации желудочно-кишечного тракта) (Jacobs et al 2012). Стоит отметить, что все контрастные агенты в некоторой степени органоспецифичные, так как выводятся печенью или почками. Активная доставка контрастных препаратов осуществляется за счет векторных молекул, цель которых различные патологические процессы или состояния, такие, как воспаление, атеросклероз, ангиогенез, апоптоз и злокачественные опухоли. Они являются клеточно-ориетированными контрастами, так как они работают через распознавание конкретных молекулярных маркеров этих процессов на поверхности клеток, такие, как клеточно-специфические рецепторы или транспортные белки. Векторная доставка к рецепторам на поверхности клеток может осуществляться с помощью моноклональных антител или векторных молекул с низким молекулярным весом. В таком случае, визуализация будет осуществляться в результате медленной диффузии к наиболее доступным антигенам. Типичным примером является векторная доставка к рецептору интегрина aVb3, рецептору специфического ангиогенеза (маркер, концентрация которого коррелирует с стадией опухолевого процесса) (Sipkins et al 1998). Другим маркером ангиогенеза является VEGF - фактор роста эндотелия сосудов. Антитела, специфически связывающиеся с данным антигеном, широко применяются в антиангиогенной терапии опухолей. Другими потенциальными мишенями является HER-2 рецептор - белок семейства эпидермального фактора роста (EGFR). Он был впервые выделен из культуры клеток глиобластомы крысы и является в настоящий момент одним 21 из важным маркеров и мишенью для противоопухолевой терапии в клинике (Herceptin® (mAb anti-HER2), NeuVax®). Также специфичность визуализации может быть осуществлена за счет применения стимулчувствительных, «умных» или биоактивированных агентов, контраст которых модулируется физиологическими параметрами (например, pHчувствительные контрастные агенты (Pacheco-Torres et al 2011)). Токсичность контрастных агентов на основе гадолиния является хорошо изученным процессом. Свободные ионы гадолиния накапливаются в почках, печени, селезенке и костях и проявляют высокую токсичность, вследствие чего Хелатирование токсичность они ионов не могут быть гадолиния препаратов. введены позволяет Безопасность без модификации. значительно уменьшить низкомолекулярных хелатных комплексов Gd3+ применяемых в клинике отражает частота возникновения побочных эффектов. Лишь малая доля пациентов (от 1 до 3%) ощущает тошноту, головную боль или изменение вкусовых ощущений (металлический привкус во рту) после введения контрастирующих веществ. Более выраженные реакции организма, в том числе анафилактический шок, незначителен и составляет от 0,0003-0,01%. Такие низкие цифры обусловлены, прежде всего, быстрым выведением препаратов из организма. Это сводит к минимуму побочные эффекты от препарата и уменьшает вероятность того, что интернализация агентов клеткой приведет к высвобождению ионов Gd3+. Также стоит отметить, что низкомолекулярные агенты в основном выводятся в неизменном виде, не подвергаясь окислению или конъюгации с белками плазмы. В связи с этим конъюгация с макромолекулами может привести к более выраженному токсическому действию. Длительная циркуляция в организме ведет не только к повышенному препаратов, но накоплению и к и улучшению возможности контрастирующих неполного выведения свойств препарата. Увеличение доступности препарата ведет к лучшему захвату клетками, а 22 следовательно лучшему перевариванию и потенциально к увеличению токсичных продуктов распада макромолекулряных контрастных агентов. Кроме того, подобные молекулы повышают активность иммунной системы, а следовательно повышают риск возникновения специфических антител, и как следствие анафилактического шока на повторное введение. В связи с этим стабильность вновь разрабатываемых препаратов является важным аспектом при изучении их эффективности и безопасности. Стоит помнить о возможном высвобождении ионов Gd+3 из хелатного комплекса засчет реакции трансметаллирования с ионами других металлов (например, Zn2+, Ca2+, Cu2+). Данные аспекты должны быть приняты во внимание при доклиническом исследовании разрабатываемых препаратов. Таким образом, при разработке новых контрастных агентов стоит учитывать различные параметры. Стоит обратить не только на их эффективность: увеличение релаксивности, повышения специфичности связывания с патологическими очагами, но и оценить безопасность (токсичность, стабильность) потенциальных контрастных препаратов. Глиофибриллярный кислый белок и коннексин 43 как мишени для доставки контрастных агентов Высокая экспрессия нейроспецифичных белков при различных заболеваниях позволяет рассматривать моноклональные антитела к ним в качестве перспективных векторных молекул для транспорта диагностических и лекарственных препаратов. Так, одной из перспективных молекулярных мишеней для адресной доставки наносистем в мозг является глиофибриллярный кислый белок (GFAP) (Hol & Pekny 2015). Этот белок был впервые выделен из ткани мозга пациента с рассеянным склерозом демиелинизирующим заболеванием, характеризующимся интенсивным астроглиозом (Eng & Ghirnikar 1994). GFAP является одним из белков промежуточных филаментов III типа и высокоспецифично экспрессируется в глиальных клетках (Рисунок 5). Его повышенная экспрессия ассоциируется с 23 рядом заболеваний, сопровождающихся поражением глиальной ткани, в том числе рассеянным склерозом (Smith & Eng 1987). Рисунок 5. Иммунофлюоресцентный анализ глиофибриллярного кислого белка на астроцитах человека с помощью антител к GFAP: А) совмещенное изображение б) окраска ядер с помощью DAPI в) вторичные антитела козы, полученные против Fab фрагментов антител мыши и конъгированные с Alexa 594®Fluor (Invitrogen, США) Для диагностики опухолевых заболеваний несомненный интерес представляет коннексин-43 (Cx43). Этот белок — основной структурный компонент щелевых контактов (gap-junction) между астроцитами (Baklaushev et al 2009a), состоящий из 4 экстраклеточных и внутриклеточных доменов (Рисунок 6). Большой интерес вызывает участие Cx43 в развитии инвазивных опухолей глиального происхождения. Существуют экспериментальные данные, показывающие активирующее влияние Cx43 на процессы инвазии мультиформной глиобластомы человека и её аналога у крыс — экспериментальной глиомы С6 (Bates et al 2007). В частности, было продемонстрировано, что Cx43-положительные клетки C6-глиомы обладают более высокой способностью к миграции, чем Cx43-негативные, а также то, что они более устойчивы к оксидативному стрессу и различным другим повреждающим Минздрава РФ факторам. были В ФГБУ получены «ФМИЦПН им.В.П.Сербского» моноклональные антитела к рекомбинантному экстраклеточному домену Е2 Сх43, взаимодействующие с 24 Сх43 в нативной конформации. Эти антитела визуализировали коннексоны на препаратах фиксированных первичных астроцитов и клетках глиомы С6 крысы, равно как и на клетках глиобластомы U251 (Рисунок 6Б) и линии почечного эпителия эмбриона человека (НЕК293) (Baklaushev et al 2011). Рисунок 6. а) Схематическое изображение расположения коннексина 43 в мембране клетки (PM). Коннексин 43 состоит из двух экстраклеточных (EL1 and EL2), одного цитоплазматического (CL) фрагментов и N- и Cтерминальными концами (NT, CT), расположенными внутри клетки. (Omasits et al. 2014). б) Иммунофлюоресцентный анализ клеток глиомы U251, выполненный с помощью антител к экстраклеточному фрагменту ЕL2 коннексина 43 (Baklaushev et al 2009a, Baklaushev et al 2009b). Модели заболеваний ЦНС для доклинических исследований контрастных агентов Важное место при разработке новых контрастных агентов занимают исследования их эффективности in vivo. В случае изучения контрастных агентов, разрабатываемых для диагностики заболеваний ЦНС, весьма обосновано применение интракраниальных моделей патологических процессов. Среди них наиболее хорошо изучены и распространены модели процессов воспалительной демиелинизации, весьма схожие с таковыми при 25 рассеянном склерозе, а также глиальных опухолей (Abakumova et al 2015, Chekhonin et al 2012). Большое разнообразие моделей приводит к выводу о необходимости тщательно подойти к выбору экспериментальной модели для проведения доклинических исследований новых контрастных агентов. Стоит учитывать воспроизводимость модели, экспрессию белков-мишеней, наличие и степень проницаемости гемато-энцефалического барьера. Нужно помнить, что различные модели одного и того же заболевания могут отражать разные процессы, возникающие при данной патологии. Так моделирование патологических процессов, возникающих при рассеянном склерозе (РС), представляется сложной задачей ввиду многофакторности этиологии данного заболевания. Однако известно, что вне зависимости от причины возникновения, РС сопровождается аутоиммунным поражением миелиновой оболочки аксонов. В настоящее время в мире насчитывается более 2,3 миллионов пациентов с РС (MSIF 2013) и разработка препаратов для лечения и диагностики данного заболевания попрежнему остается актуальной задачей. С целью доклинического исследования эффективности разработанных препаратов для терапии и диагностики РС используются различные экспериментальные модели, которые делятся на 3 основные группы: 1) аутоиммунная – модель экспериментального аллергического энцефаломиелита; 2) вирус- индуцированная демиелинизация (вирус энцефаломиелита мышей Тейлора) 3) токсин-индуцированная демиелинизация (системное применение купризона или фокальная демиелинизация с помощью лизолецитина или этидиум бромида) (Ransohoff 2012). Среди них наиболее удобной токсической моделью является купризоновая модель. Купризон добавляют к пище животных, при этом демиелинизация развивается во всех основных структурах белого вещества головного мозга: мозолистом теле, внутренней капсуле, спино-таламических трактах, передней спайке и ножках мозжечка; а также в сером веществе: 26 новой коре и гиппокампе (Geurts et al 2007, Koutsoudaki et al 2009, Papadopoulos et al 2009, Sicotte et al 2008). Механизм его действия заключается в нарушении работы митохондриального комплекса IV, что вызывает апоптоз олигодендроцитов. Наиболее распространенным протоколом является добавление в течение 4-6 недель к измельченному корму 0,2% купризона, что вызывает острую демиелинизацию. При продлении диеты до 12 недель и больше исследователь получает возможность оценивать хроническую демиелинизацию. После устранения токсического агента в очагах запускается процесс восстановления миелина (ремиелинизации). Основное достоинство данной модели - возможность выделять демиелинизацию и ремиелинизацию как отдельные процессы и регулировать их длительность. Выраженность реакции глии в купризониндуцированной модели РС сопровождается повышенной экспрессией GFAP и других маркеров реактивных астроцитов (Gudi et al 2014) отражает течение заболевания у человека. Высокая воспроизводимость, возможность стандартизации и управления процессами де-и ремиенилизации, а также экспрессия белков-мишеней делает данную модель перспективной для исследования препаратов направленных на уменьшение выраженности астроглиальной реакции, а также векторных препаратов, специфически связывающихся с маркерами реактивных астроцитов, в том числе GFAP. Другим из наиболее распространенных заболеваний, представляющих интерес для разработки новых препаратов для диагностики заболеваний ЦНС, является мультиформная глиобластома человека (МФГ). Данная опухоль имеет инфильтрирующий, инвазивный рост, ее быстрое развитие приводит к ухудшению состояния пациента. Медиана выживаемости после постановки диагноза составляет 15 месяцев. Существует несколько моделей МФГ. Всех их можно разделить на три категории: спонтанно возникающие, аллогенные и ксенографтные. Они различаются способом получения опухолевых клеток, их иммуногенностью, особенностями роста 27 (инвазивный/неинвазивный), мутацией или гиперэкспрессией различных генов, присутствием белков-маркеров заболевания. Суммарно различия между различными моделями представлены в Таблице 1. Таблица 1. Различия в экспериментальных моделях мультиформной глиобластомы Среди большого количества представленных моделей одной из наиболее распространенных и агрессивных является глиома С6. Линия клеток глиомы С6 была впервые получена в конце 1960-х г.г. из опухоли, развившейся после многократного введения метилнитрозомочевины крысам Вистар-Фурс (Benda et al 1968). Данную модель характеризует инфильтрирующий рост с интенсивной инвазией в ткани головного мозга, что коррелирует с диффузным пропитывающим рисунком роста опухоли у пациентов с МФГ. Основное преимущество данной модели в том, что она хорошо охарактеризована в гистологической и генетической литературе, включая полный анализ картины (Grobben et al 2002). Стоит отметить ее интенсивное использование в исследовании эффективности новых лекарственных и диагностических препаратов (Doblas et al 2008, Solly et al 2008, Zhao et al 2008). Высокая экспрессия различных белков (Сх43, GFAP, ММР2-рецептор хлоротоксина и др.) позволяет рассматривать ее для исследования эффективности высокоселективных контрастных препаратов. 28 Перспективы применения конъюгатов на основе антител в клинической практике. В настоящее время, несмотря на эффективность применения контрастных агентов на основе гадолиния и использование различных режимов и протоколов сканирования, визуализация очагов ЦНС остается важной задачей. Подходы, направленные на увеличение релаксивности препаратов и селективности накопления, позволят создать значимую концентрацию контрастных агентов в патологических очагах, не увеличивая дозу вводимого препарата. Специфичность препаратов, полученных с использованием моноклональных антител в качестве вектора, получила целое направление в разработке новых терапевтических и диагностических препаратов (АntibodyDrug Conjugates) (Sassoon & Blanc 2013). На сегодняшний день более 90 клинических испытаний проводятся с участием различных конъюгатов антител. Адресная доставка нашла свое применение как в терапии опухолевых заболеваний, так и в диагностике с помощью позитронноэмиссионной томографии и МРТ. Также визуализации, Конъюгация стоит отметить прижизненной диагностических развитие интраоперационных спектроскопии, МРТ препаратов векторными с навигации методов и др. молекулами позволяет рассматривать полученные методы в качестве эффективных инструментов в резекции злокачественных опухолей. Однако, несмотря на достоинства селективной доставки препаратов с помощью конъюгатов антител, их применение все же имеет свои ограничения. Так эффективность конъюгатов антител зависит от уровня экспрессии белков-мишеней у конкретного человека, причем экспрессия белка может быть гетерогенной (особенно в солидных опухолях), также стоит уделить внимание изучению иммуногенности разрабатываемых препаратов. 29 Из проведённого обзора литературы следует, что для улучшения эффективности контрастных агентов на основе гадолиния в клинической практике они должны обладать низкой токсичностью и обладать высокими значениями релаксивности. моноклональными Конъюгация антителами позволит контрастных увеличить агентов с селективность накопления в патологическом очаге. Однако также стоит уделить внимание изучение токсичности разрабатываемых препаратов. Несмотря на большое разнообразие работ, посвящённых синтезу и модификации контрастных агентов на основе гадолиния для медицинских применений, лишь малая их часть затрагивает проблему визуализации заболеваний ЦНС, хотя эта проблема не менее актуальна на данный момент времени. Создание векторных Т1 контрастных агентов обладающих высокой специфичностью к нейроспецифичным антигенам позволит улучшить визуализацию патологических очагов ЦНС, что повысит качество и продолжительность жизни пациентов. 30 Глава 2. Материалы и методы 2.1 Реактивы Гексагидрат хлорида гадолиния, диангидрид диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPAda), диэтиленпентауксусная кислота (DTPA), 1,4,7,10-тетраазациклододекан -1,4,7,10- уксусная кислота (DOTA), полилизина гидробромид (PLL, Mw=15-30 кД и Mw=1-5 кДа), 1этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), 3-4,5-диметилтиазол-2ил-2,5-дифенилтераразол (МТТ), диметилсульфоксид (ДМСО) додецил сульфат натрия (ДДС натрия), 4'-фенилспиро[2-бензофуран-3,2'-фуран]-1,3'дион (FLURAM), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфониловая кислота (HEPES), тетраметилбензедин (ТМБ), глицин, натрия хлорид, NaCl, трис, тритон Х-100, твин параформальдегид, дигидрохлорид, 20, натрия сыворотка фильтрующие центрифугирования с пределом цитрат, козы, системы дистиллированная вода, 4,6-диамино-2-фенилиндол Amicon пропускания YM-30 для ультрафильтрационной мембраны (MWCO) 30 000 Да, NAP-10 и PD-10 обессоливающие колонки (Sephadex G-25), Sepharose CL-6B смола были приобретены в Sigma–Aldrich (St Louis, MO, США). Моноклональные антитела к коннексину 43 (mAb antiCx43), моноклональные антитела к глиофибриллярному кислому белку (mAb anti-GFAP) и неспецифические иммуноглобулины (IgG) были получены в лаботории нейрохимии ФГБУ «ФМИЦПН» Минздрава РФ под руководством д.м.н. Ольги Ивановны Гуриной . Магневист® (Gd-DTPA) был приобретен в Bayer (Германия). Омнискан® (Gd(DTPA-BMA)) был приобретен в GE HEALTHCARE (США). 2.2 Животные Животных содержат в условиях лабораторного вивария, адрес Кропоткинский переулок д. 23, заведующая Ионова Клавдия Павловна, тел. 31 6373464, ветеринарное удостоверение 277 №0001701, дата с 16.06.2010, ветеринарный контроль осуществляет Словохотнова Юлия Николаевна. Работа проводилась на 3-ех месячных половозрелых самках беспородных белых крыс весом 250 г, сертификат выдан 02.11.10 №25765, ветеринарное свидетельство от 2.11.10 250№0219995. Мыши линии С57Bl6, 8-ми недельные половозрелые самцы, вес 20-25 г, сертификат выдан 01.12.10 №25786 ветеринарное свидетельство от 1.12.10 250№0263832. Питомник Государственное учреждение Научный центр биомедицинских технологий РАМН, филиал Андреевка (Московская область, Солнечногорский район, пос. Андреевка, директор Афонин Константин Владимирович, тел. главного технолога 89175510081). Крысы и мыши содержались в отдельных боксах, по 10 особей в каждой клетке, при нормальном световом режиме, доступ к воде и питанию свободный. В ежедневный рацион животных входили овощи, хлеб, каша, мясо, сухой корм с необходимым содержанием витаминов и микроэлементов. Санитарный контроль осуществляла Станция по борьбе с болезнями животных Центрального округа г. Москвы (Москва, ул. Красносельская, д. 14, директор Селиверстов В.В., главный врач Старостина Светлана Александровна, тел. (495)2648881). 2.3 Культивирование клеток В данной работе использовали клеточные линии глиомы крысы (С6) и эмбрионального почечного эпителия человека (HEK293), которые культивировали в пластиковых флаконах («Corning», США) при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO2. Базовую среду RPMI-1640 или DMEM («Invitrogen») готовили с добавлением 1% 100 мМ пирувата натрия (Life Technoligies, США), 1% 200мМ L-глутамина («Invitrogen», США), 1% раствора смеси антибиотиков и антимикотика [пенициллин 10000 ед/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл и амфотерицин 25 мкг/мл (Life Technoligies, США)] и 10% сыворотки новорожденных телят (Life Technoligies, Южная Америка). Культивирование продолжали до образования монослоя, после чего проводили ферментативную диссоциацию (0,05% трипсин-ЭДТА, Life 32 Technoligies, США) и последующий пассаж. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева, жизнеспособность определяли с помощью красителя трипановый синий. 2.4 Синтез контрастного агента Для синтеза контрастного агента в качестве полимерного носителя хелатных комплексов Gd-DTPA или Gd-DOTA был использован поли-Lлизина гидробромид. Аминогруппы полилизина модифицировали, используя различные хелатирующие агенты (DTPA, DOTA) в молярном соотношении [DTPA]:[PLL]=1:1 или 1:10, после чего проводили конъюгацию с моноклональными антителами и загружали GdCl3. 2.4.1 Синтез контрастного агента с использованием различного молярного соотношения [DTPA]:[PLL] Для молярного соотношения [DTPA]:[PLL]=1:1 (PLL-DTPA 100%) к 200 мкл водного раствора DTPA (11 мг/мл) добавляли 1,6 мг EDC и перемешивали при комнатной температуре (Тк) в течение 7 минут, после чего добавляли 300 мкл раствора PLL с молекулярной массой 15-30 кДа (3,3 мг/мл) и перемешивали еще 12 часов при Тк. В случае молярного соотношения [DTPA]:[PLL]=1:10 (PLL-DTPA 10%) к 200 мкл DTPA (1,1 мг/мл) добавляли 0,16 мг EDC и дальше проводили реакцию, как описано выше. 2.4.2 Синтез контрастного агента с использованием хелатирующего агента c более высоким координационным числом (DOTA) PLL-DOTA 100% синтезировали аналогично PLL-DTPA 100%, исходя из молярного соотношения [DOTA]:[PLL]=1:1. Для этого к 100 мкл водного раствора DOTA (20 мг/мл) добавляли 1,6 мг EDC, после чего их перемешивали при Тk в течение 5 минут и добавляли 300 мкл раствора PLL (3,3 мг/мл), после чего инкубировали в течение 12 часов при Тk. Избыток несвязавшегося хелатирующего агента DTPA/DOTA отделяли от PLL-DTPA/PLL-DOTA методом гель-фильтрационной хроматографии на 33 обессоливающих колонках PD-10 (0,1 М HEPES). Количество свободных аминогрупп в очищенных конъюгатах было измерено колориметрическим методом с помощью реактива FLURAM для определения белка, действие которого основано на определении свободных аминогрупп путём связывания с флуоресцеинамином (Djozan & Farajzadeh 1992). 2.4.3 Синтез контрастного агента в апротонных растворителях. Чтобы увеличить количество промодифицированных аминогрупп PLL конъюгацию c DTPA проводили в безводной среде. Для этого к раствору 9,9 мг DTPA (20 мг/мл) в ДМСО добавили 6,5 мг PLL (10 мг/мл) и инкубировали в течение 12 часов при Тк. От несвязавшегося DTPA очищали последовательно с помощью центрифугирования (Amicon, 10 кДа) и гельфильтрационной хромотографии на колонках PD-10 (Sephadex G-25, 0,1 M HEPES). Конъюгат PLL-DTPA инкубировали с 3х-кратным избытком GdCl3 (13,5 мг) и инкубировали в течение 12 часов при Tк. Полученный контрастный агент отмывали от несвязавших ионов Gd методом гельфильрационной хромотографии (NAP-10, 0,1 M HEPES) и затем конъюгировали с моноклональными антителами. 2.4.4 Синтез Т1-контрастного агента «ветвистого типа» Контрастный агент «ветвистого типа» синтезировали в 3 этапа. На первом этапе аминогруппы PLL были модифицированы карбоксильными группами ДТПА, исходя из молярного соотношения [DTPA]:[PLL]=1:5 для достижения модификации 20% аминогрупп PLL (PLL-DTPA 20%). Для этого к водному раствору 2,2 мг DTPAda (10 мг/мл) добавляли 1,4 мг EDC (35 мг/мл) и перемешивали в течение 7 минут, затем добавляли 6 мг PLL, и инкубировали в течение 12 часов при Tk. На втором этапе конъюгированные молекулы DTPA были активированы с помощью EDC и вновь модифицированы с помощью PLL (20 мг) (PLL-DTPA 20%-PLL), после чего инкубировали в течение 12 часов при Tk. К полученному соединению PLLDTPA 20%-PLL добавляли избыток DTPA (44 мг, 5 мг/мл), 34 прединкубированный с 28 мг EDC (35 мг/мл), после чего снова инкубировали в течение 12 часов при Тк, и загружали GdCl3 (74 мг), и перемешивали в течение 48 часов при Tk.. От несвязавшихся реагентов и побочных продуктов реакции на каждой стадии отделялись с помощью центрифугирования на фильтрах Amicon, 10 кДа. На заключительной стадии контрастный агент очищали методом гель-фильтрационной хромотографии (PD-10, 0,1 М HEPES). 2.5 Конъюгация контрастного агента с антителами Конъюгацию контрастных агентов с моноклональными антителами проводили с помощью ковалентного связывания 1) карбоксильных групп антител с оставшимися непромодифицированными аминогруппами полилизина 2) аминогрупп антител с карбоксильными группами DTPA конъюгата PLL-DTPA. Для активации карбоксильных групп моноклональных антител, к 200 мкг моноклональных антител (1 мг/мл) добавляли 10 мкг EDC (10 мг/мл) и перемешивали в течение 5 минут. Далее к полученному раствору добавляли комплекс DTPA с полилизином, содержащий свободные аминогруппы. Реакцию проводили в течение 12 часов при +4°C. Полученный конъюгат концентрировали на фильтрах Мillipore 10 кДа, загружали GdCl 3 и хранили при +4ºС. Для второго типа конъюгации было использовано молярное соотношение [mAB]:[EDC]:[PLL-DTPA]=1:10:20. Для этого карбоксильные группы DTPA-PLL (11 мг) были активированы с помощью 13 мкг EDC (5 минут) и проинкубированы с моноклональными антителами при +4ºС, 12 часов. От несвязавшихся реагентов отделялись с помощью гель- фильрационной хромотографии (Sepharose CL-6B, 0,1 M HEPES). 2.6 Образование комплекса mAb-PLL-DTPA-Gd Загрузку контрастного агента GdCl3 с целью образования комплекса Gd-DTPA-PLL-mAb или Gd-DOTA-PLL-mAb осуществляли на последнем 35 этапе с целью избежать преципитации свободных ионов Gd c PO 4- в растворе. Загрузку GdCl3 (4,57 мг) проводили в 0,2 М ацетатном буфере (pH=5,5) и добавляли к раствору mAb-PLL-DTPA 100% (0,457 мг GdCl3 в случае PLLDTPA 10%); перемешивали в течение 12 часов при Тк. Свободные ионы Gd (III) удаляли методом гель-фильтрационной хромотографии (колонки PD-10, 0,1 М HEPES, Tк). 2.7 Получение флуоресцентно-меченых контрастных агентов Для получения флуоресцентно-меченых контрастных агентов были использованы флуоресцеин или сукцинимидилпальмитата эфир Alexa Fluor 647-карбоновой кислоты (Life Technologies, США). Конъюгация PLL-DTPA с Alexa Fluor 647 была проведена в соответствии с инструкциями изготовителя. Меченый PLL-DTPA конъюгировали с mAb и загружали Gd (III), как описано выше. Количество флуоресцеина в контрастном веществе было определено с помощью УФ-спектрометрии (UV-2800, Hitachi, Japan) в HEPES буфере, рН 7,4. Количество Alexa 647 в контрастном веществе определяли по интенсивности флуоресценции при длине волны возбуждения / излучения равной 590/680 нм на планшетном анализаторе Victor X3 (PerkinElmer, США). 2.8 Аминокислотный анализ Для выполнения аминокислотного анализа синтезированных контрастных агентов на основе моноклональных антител навеску конъюгата (2-3 мг) растворяли в 6 М HCl (1% фенола) в концентрации 1 мг/мл, запаивали в ампуле и нагревали при 110ºС в течение 1,5 суток. Далее раствор упаривали на роторном испарителе досуха, перерастворяли в воде до концентрации 1 мг/мл, и аликвоту 100 мкл вводили в анализ. В случае избытка по оптической плотности делали кратное разведение и повторяли анализ. Расчёт содержания аминокислот проводили по эталону. Далее для каждого образца определяли содержание аминокислот в нмоль/г и нормировали всё на глицин. Расчёт количества аминокислот на антитело 36 (N(AA)/mAb) и эквивалент данной аминокислоты относительно глицина (экв.) сделаны на основании mAb мыши, секвенированного Nuno Bandeira (Bandeira et al 2008). 2.9 Рентгенофлуоресцентный анализ Концентрации Gd (III) в образцах были проанализированы рентгенофлюоресцентным методом в лаборатории кафедры геохимии геологического факультета МГУ при помощи анализатора состава вещества «РеСПЕКТ» производства ООО «Предприятие «ТОЛОКОННИКОВ» (Россия). Концентрации Gd в пробах определены методом «высушенной капли» с добавлением молибдена (Mo) в качестве внутреннего стандарта. Для этого в анализируемый раствор добавляли раствор молибдата аммония с известной концентрацией Mo, до содержания 35 мкг/г раствора весовым методом. После тщательного перемешивания 100 мкл аналита наносили на полипропиленовую плёнку толщиной 2 мкм и высушивали в сушильном шкафу при температуре 75ºС. Подготовленные к анализу твердые образцы загружали в камеру на съемную автоматическую карусель на 16 кювет. Анализ производился с использованием рентгеновской трубки с серебряным анодом. Напряжение на трубке составляло 35 кВ, сила тока 0.5 мА. Длительность измерений спектра одного образца – 300 секунд «живого» времени, т.е. времени, в течение которого система действительно регистрирует входные сигналы. Запись спектра производили с помощью программы «eSBS», а последующая его обработка «XRF PRO». Обе программы произведены ООО «ОКБ «ГС». В ходе обработки спектра сначала производилась его деконволюция с целью выяснения, какова интенсивность сигнала для каждого из обнаруженных элементов. Затем, исходя из известной концентрации внутреннего стандарта и полученных интенсивностей, рассчитывалась концентрация Gd. 2.10 Измерение T1-релаксивности. Для определения значений релаксивности были приготовлены соответствующие разведения опытных образцов и коммерческого аналога 37 Магневист® в концентрации Gd (III) 0,1-0,5 ммоль. Т1-релаксивность полученных разведений была измерена на 7T-томографе фирмы Bruker с помощью последовательности инверсия-восстановление (Inversion Recovery) со следующими параметрами: TR=16000, TE=7.1, TI=50, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500. Интенсивность сигнала (SI) каждого образца при различных TI измеряли с помощью программы ImageJ (NIH Image, США). Кривые зависимости TI от интенсивности сигнала для каждой концентрации были построены и аппроксимированы следующим уравнением (Tamura et al 1995) : Время Т1-релаксации определялось из этого уравнения путем апроксимаци с помощью программного обеспечения MathCad (Needham, MA, США). Далее строили график зависимости времени Т1-релаксации от концентрации гадолиния в разведениях. Т1-релаксивность была равна тангенсу угла наклона прямой. 2.11 Получение асцитической жидкости, выделение и очистка моноклональных антител. Получение асцита С целью получения асцитической жидкости содержащей анти-Сх43 или анти-GFAP антитела, отобранные и клонированные гибридомы вводили интраперитонеально самкам мышей линии Balb/с (5106 клеток). За 7 дней до введения гибридом, животным интраперитонеально вводили 0,5 мл вазелинового масла. Перед введением в брюшную полость, клетки отмывали от ростовой среды методом центрифугирования (1000 g, 5 минут), после чего клеточный осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (pH=7.4). Асцит собирали через 10-15 дней после имплантации гибридных клеток путем прокола брюшной полости иглой. Собранную асцитическую жидкость центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g. Супернатант 38 замораживали и хранили при −80 С, а клеточный осадок криоконсервировали в протекторной среде (90% сыворотки новорожденных телят («Invitrogen», Южная Америка) и 10% ДМСО («Helicon», Россия) или подсаживали мышам для наработки асцитов. Титр моноклональных антител в асцитах подтверждали методами ELISA и ИЦХ. Очистка моноклональных антител Моноклональные антитела очищали из асцита с помощью иммуноаффинной хроматографии на протеин А-агарозе («Invitrogen», USA, № 15918-014). Основной принцип метода заключается в специфичном связывании протеином А Fc-фрагментов иммуноглобулинов класса G. С этой целью асцит центрифугировали при 5000g в течение 10 мин и фильтровали (0,22 мкм, Millipore, США). После фильтрации асцит наносили на колонку объемом 12 мл, содержащим 4 мл протеин А-агарозы и оставляли на рециркуляцию в течение 1 часа со скоростью 20 мл/ч. Далее колонку последовательно промывали фосфатным (0,2 M NaHPO4. pH 7,4; 1 час) и трис буфером (0,03 М трис, 0,01 М NaCl, pH=6.8; 30 мин) со скоростью 30 мл/ч. Элюирование связавшихся с носителем антител, проводили глициновым буфером (0,2 М глицин-HCl, рН 3) со скоростью 40 мл/ч. Элюцию проводили по-фракционно и нейтрализовали кислый pH раствора с помощью 1 M триса (200 мкл на 1 мл). Очищенные моноклональные антитела 4-х кратно диализовали против 500 мл охлажденного PBS по 40 мин с использованием полупроницаемой мембраны. Препараты антител концентрировали методом ультрафильтрации на центрифужных мембранах (100 кДа, «Millipor», USA). Очищенные анти-BSAT1-АТ криоконсервировали в 50% глицерине с добавлением 0,1% азида натрия и хранили при −20С либо лиофилизировали и сухой препарат моноклональных антител хранили при +4 С. Полученные фракции, содержащие пик антител, проверяли на наличие белка методом Брэдфорд. Фракции содержащие белок смешивали, диализовали напротив фосфатно-солевого буфера (100 кД, рН=7,4), концентрировали (Amicon, 39 30кДа, 3000 rpm) , анализировали на присутствие антител методом иммуноферментного анализа и хранили при -20°С. 2.12 Иммуноферментный анализ (ELISA) Иммунохимическая контрастным агентом, иммуноферментного полистироле активность в была анализа. 96-ти С луночных антител, изучена этой конъюгированных методом целью на планшетах с твердофазного высокоадгезивном («Sarstedt», Германия) иммобилизовали белок Cx43 или GFAP в концентрации 4 мкг/мл в карбонатном буфере (0,1 M, pH 9.6) в течение 12 часов при 4°С. После тщательно промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,2 % Твин20 (PBST), на автоматическом вошере (PW40 «Biorad», США). Для предотвращения неспецифической сорбции антител фазу забивали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина («Amresco», США) в течение 30 мин на шейкере и трехкратно отмывали PBST. Исследуемые образцы (векторные контрастные агенты, контрастные агенты, конъюгированные с неспецифическими IgG, невекторные контрастные агенты) вносили в начальные лунки по 100 мкл из расчета концентраций 10 мкг антител/мл, после чего титровали методом двухкратных разведений. В качестве положительного контроля использовали нативные анти-Сх43/анти-GFAP антитела. Для отрицательного контроля брали неспецифические мышиные IgG в эквивалентной концентрации (очищенные из асцита Sp2/0-Ag14) и вторичные меченные антитела без первичных антител. Далее инкубировали при постоянном перемешивании в течение часа при 37°С, трехкратно отмывали PBST и добавляли вторичные антитела. В качестве вторичных антител использовали иммуноглобулинов козьи мыши, антитела конъюгированные к с F(ab)2 фрагментам пероксидазой хрена, предабсорбированные сывороткой крысы (А9917, «Sigma», США) в разведении 1:10000. Инкубировали 1 час на шейкере при 37°С и трехкратно отмывали рабочим буфером. Реакцию проявляли раствором тетраметилбензидина "ready-to-use" («Amresco», США) по 100 мкл на лунку, 40 останавливали – 0,5 М раствором соляной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность регистрировали с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм (Bio-tec ELx800, США). 2.13 Оценка цитотоксичности конъюгатов (МТТ-тест) Культуры клеток высаживали в 96-луночные культуральные плашки (glС6 – 2х104 клеток на лунку, HEK293 – 2,5х104 клеток на лунку) в 100 мкл среды DMEM с 10% FBS и культивировали 24 часа в CO2-инкубаторе (Memmert, США). Далее готовили разведения конъюгатов в среде DMEM с 10% FBS. В каждую лунку к 150 мкл ростовой среды добавляли 30 мкл препарата, используя по 4 параллельных лунки для каждого разведения. Далее клетки с добавленными туда конъюгатами культивировали 24 часа в CO2-инкубаторе. Далее готовили рабочий раствор MTT (25 мг MTT, 5 мл PBS, pH 7.4). После чего ростовую среду удаляли, в лунки добавляли рабочий раствор МТТ (50 мкл на лунку) и инкубировали 3 часа в CO 2инкубаторе. Далее супернатант удаляли и в каждую лунку вносили 100 мкл лизирующего буфера (99,4 мл DMSO, 0,6 мл HCl???, 10 г ДДС натрия). Клетки лизировали 5-10 минут, поместив плашки в шейкер, до полного растворения осадка. Измерения проводили на спектрофотометре (Bio-tec ELx800) при длине волны 490 нм. 2.14 Иммунофлюоресцентный анализ антигенов на срезах ткани мозга и в культуре клеток Иммунофлюоресцентный анализ проводили на срезах головного мозга крыс и мышей с моделированными патологическими процессами (глиома /демиелинизированные нервные волокна), а также на культуре клеток (С6, астроциты человека). Иммуноцитохимический анализ Для оценки специфического взаимодействия конъюгированных антител (mAb anti-GFAP/ mAb anti-Cx43) с соответсвующми антигенами проводили иммуноцитохимический анализ на фиксированных и живых 41 культурах клеточных линиях глиомы С6 или астроцитов человека. Для иммуноцитохимического анализа на фиксированной культуре клетки, выращенные на высокоадгезивном полистироле или на покровных стеклах до 50-100% конфлюентности монослоя, обрабатывали раствором 4% параформальдегида в PBS (pH 7.4) 30 мин при Tk, после чего трехкратно отмывали. В качестве рабочего буфера использовали PBS с 0,2% Твина-20 и 0,2% Тритона X-100 (PBSTT). Чтобы заблокировать неспецифические сайты связывания на мембране клеток перед последующей процедурой их инкубировали с 10% сывороткой крови козы. После этого препараты полученных контрастных агентов инкубировали с фиксированной культурой клеток (С6/астроциты) в течение 2 часов при 37 С. Затем промывали PBSTT, добавляли флуоресцентно-меченые вторичные антитела (Anti-goat anti-mouse -Alexa 488 или (Anti-goat anti-mouse-Alexa 594)) в разведении 1:500 в PBSTT и инкубировали в течение часа при 37oC. После чего клетки отмывали от не связавшихся антител (3 раза, PBSTT) и инкубировали с красителем DAPI (1:500, 5 мин), затем отмывали от красителя DAPI и монтировали на предметное стекло (Corning, CША). Для препараты иммуноцитохимического полученных анализа живой флуоресцеин-меченых культуры контрастных клеток агентов инкубировали с клетками в течение 45 минут, отмывали с помощью PBSTT и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при 4 0С. Фиксированные клетки инкубировали с 5% сывороткой козы 30 минут, после чего снова промывали PBST и добавляли вторичные антитела (Antigoat anti-mouse -Alexa 594) и DAPI, как описано выше. Иммуногистохимический анализ Иммунофлуоресцентный анализ на срезах головного мозга мышей с очагами демиелинизации на различных стадиях моделирования заболевания был проведен для количественной оценки уровня GFAP (1 и 4 неделя – период демиелинизации, а также 2 недели после окончания процедуры 42 моделирования - период ремиелинизации). Для этого были приготовлены срезы на замораживающем микротоме (MNT «Slee», Германия) толщиной 30 мкм. Иммуногистохимический анализ был проведен по стандартному протоколу фирмы Abcam с небольшими модификациями: было увеличено время инкубации с первичными антителами (pAb GFAP), что способствовало их более глубокому проникновению и равномерному распределению в толще среза. После этого антивидовыми срезы трижды отмывали PBSTT и инкубировали с антителами, конъюгированными с Alexa 594 (Life Technologies, CША) в концентрации 1:500. После чего монтировали на предметные стекла посредством 50% глицерина. Анализ проводили на флюоресцентном микроскопе Leica DMLB 100S (Германия) . 2.15 Проточная цитофлюориметрия Для количественного анализа специфического накопления контрастных агентов к живым клеткам глиомы С6 добавляли контрастные агенты, конъюгированные со специфическими антителами, а также контрастные агенты, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами, в концентрации 1, 3 и 5 мкмоль контрастного агента. Препараты инкубировали с клетками в течение 30 минут или 1 часа при 37°С. Затем двукратно промывали фосфатно-солевым буфером, добавляли раствор 0,1 М трипсина0,1 М версена и инкубировали в течение 5 мин, после чего суспензию клеток фиксировали 1% параформальдегидом и переносили в пробирки. Измерения проводили на проточном цитофлюориметре (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Процентное содержание позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывали при помощи программного обеспечения MACSQuantify (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). В каждом эксперименте использовали три независимых образца и все эксперименты повторяли 2-4 раза. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (стандартная ошибка среднего). 43 2.16 Моделирование и характеристика патологических процессов нервной системы: рассеянный склероз и опухоли головного мозга 2.16.1 Mоделирование глиобластомы Эксперименты соответствии с выполняли «Правилами на половозрелых проведения работ самках с крыс в использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства высшего и среднего образования Моделирование глиобластомы внутримозговой стереотаксической СССР in vivo от 13.11.1984г. выполняли имплантации клеток с №742). помощью С6. Крысе предварительно проводили премедикацию седуксеном (50 мкг/мл), затем глубоко наркотизировали внутрибрюшинным введением золетила (100 мкг/кг). Иммобилизовали на стереотаксическом столике фиксацией головы по методике (Chekhonin et al 2007), удаляли шерсть в месте планируемой операции, производили разрез в области планируемого введения по выбранным координатам размером длиной 2 мм. Подготовленные клетки глиомы (5х105 клеток на крысу) имплантировали в область каудопутамена с помощью стереотаксического аппарата Narishige (Japan) по следующим координатам Ар -1; L 3,0; V 4,5, TBS -2,4 мм (W. 1998). Клетки вводили с помощью гамильтоновского микрошприца, соединенного с инфузоматом, со скоростью 3 мкл/мин в объёме 1015кл/мл. После введения клеток рану послойно ушивали, обрабатывали 2% раствором бриллиантового зеленого. Животное помещали в чистую клетку. Длительность имплантации не превышала 10-15 минут. Животное самостоятельно просыпалось через 30 минут после наркотизации. Болевых или иных неприятных проявлений при этом не отмечалось. Результаты стереотаксической имплантации оценивали по данным МРТ сканирования мозга на томографе Clinscan 7Т («Bruker», Германия) в Т2 режиме. 2.16.2 Моделирование рассеянного склероза Все эксперименты проводились на самцах и самках мышей линии С57Bl6 в возрасте 8 недель в соответствии с «Правилами проведения работ с 44 использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства высшего и среднего образования СССР от 13.11.1984г. №742). Моделирование рассеянного склероза проводилось путем введения в рацион животных хелатора меди купризона (Химмед, Россия). На основании анализа литературных данных была выбрана диета измельченным кормом, содержащим 0,2 % купризона в течение 6 недель (n=10). Параллельно была набрана группа животных (n=25), которая получала увеличенную дозу нейротоксина с кормом в течение 4 недель (0,6 % купризона). После чего купризон изымался из ежедневного рациона, и подопытные животные возвращались к стандартному режиму питания. В качестве контроля были взяты животные, получавшие измельченный корм без добавления купризона (n=10). 2.16.3 Перфузия головного мозга На финальной стадии эксперимента производят фиксацию головного мозга и остальных забуференном трансаортальной органов физиологическом перфузии, по раствором растворе 4% параформальдегида (PBS, общепринятой рН 7,4) методике в методом (М. 1983). Предварительно животному интраперитонеально вводят летальную дозу Кетамина (100 мг/кг) и Седуксена (10 мг/кг). Срединным надрезом вскрывают брюшную полость, грудную клетку рассекают с двух сторон поперек ребер. На нисходящий отдел аорты накладывается зажим. Вскрывают полость правого предсердия и далее в области апекса сердца делают надрез, через который в полость левого желудочка до аортального синуса вводят канюлю, присоединенную к шприцу Жане (150 мл). Перфузию мозга проводят 300 мл 4% раствором параформальдегида. После чего снимают зажим с нисходящей аорты и проводят перфузию внутренних органов. Затем животное декапитируют и извлекают мозг, печень, селезенку, почки, сердце. Органы выдерживают в фиксирующем растворе в течение 24 часов при 4°С. Серийные срезы толщиной 20-40 мкм готовят на замораживающем микротоме (MNT «Slee», Германия). 45 2.16.4 Гистологическое окрашивание Гистологическое окрашивание срезов проводили с помощью красителя люксолевый прочный синий по модифицированной нами методике Kluver и Barrera. Для этого приготавливали замороженные срезы с помощью криостата (30 мкм, MNT SLEE Cryostat, Германия) и монтировали их на предметное стекло. После чего погружали в 0,1 % раствор люксолевого прочного синего (0,1 г люксолевый прочный синий, 100 мл 95% этанола, 0,5 мл ледяной уксусной кислоты) в течение 4 часов при 57ºС и последовательно промывали от избытка красителя в 95% этаноле и H2 O дист. Дифференцировку проводили в 0,05 % растворе карбоната лития (0,05 г карбоната лития, 100 мл 95 % этанола) в течение 30 сек, промывали дважды в 95 % этаноле и монтировали с помощью канадского бальзама. Миелинизированные нервные волокна окрашивались ярким синим цветом. 2.17 Полимеразная цепная реакция. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени проводилась оценка экспрессии генов, кодирующих основной белок миелина (MBP) и протеолипидный белок (PLP), составляющих более 90% от суммы всех белков миелина, а также оценивалась экспрессия глиофибриллярного кислого белка (GFAP), выбранного в качестве белка мишени. Методом ПЦР были исследованы препараты из гомогенатов ткани головного мозга мышей находящихся на 1, 3 и 4 неделе купризоновой демиелинизации), а также спустя 2 недели диеты (в период после прекращения моделирования заболевания (период ремиелинизации). Соответствующие препараты готовили путем гомогенизации образцов ткани мозга области больших полушарий с помощью магнитных частиц в TissueLyser LT (Qiagen, США), последующая очистка и выделение РНК проводилось методом хлороформ-фенольной экстракции c помощью автоматизированной системы Qiacube (Qiagen, США). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя 500 нг матричной РНК и 20 мкл случайного декануклеотидного 46 праймера для синтеза первой цепи кДНК на матрице РНК (MMLV RT kit. Евроген, Россия). Последующий ПЦР в реальном времени проводили с помощью системы StepOne (Applied Biosystems, США). 2.18 Нейрофизиологические тесты Для анализа процессов демиелинизации при моделировании рассеянного склероза была проведена оценка нарушения поведенческих и двигательных функций до начала эксперимента, на 4 неделе воздействия купризона (период демиелинизации) и через 2 недели после отмены купризоновой диеты (период ремиелинизации). Данные полученные до начала эксперимента использовались в качестве контроля. Оценка выраженности агрессивных реакций проводилась в тесте «социальное взаимодействие» («СВ»). Для этого каждую мышь предварительно высаживали в индивидуальную клетку за 4 дня до проведения теста. После этого к каждой мыши подсаживали молодую особь (младше на 1,5 месяцев). После чего регистрировали число и время агрессивных и социальных контактов в течение 10 минут с помощью программы ANY-MAZE Labirynth (Stoelting, США). Уровень тревожности животного был исследован в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» («ПКЛ») в течение 8 минут. Регистрировалось общее время, проведенное в освещенных и затемненных зонах. Для оценки двигательно-координационного дефицита был проведен тест «Ротарод», где детектировали время удержания мышей на вращающемся барабане (21 оборот/мин). 2.19 МРТ сканирование головного мозга МРТ в диагностике глиомы С6 Моделирование мультиформной глиобластомы было проведено путем стереотаксической инъекции клеток глиомы С6 в cтриатум головного мозга 8-недельных крыс линии Вистар (n = 12). Через две недели после имплантации клеток C6 рост опухоли был подтверждён с помощью МРТ. 47 Специфические контрастные соотвествующие контроли агенты mAb anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd (неспецифические IgG-PLL-DTPA-Gd и и Магневист®) вводили в бедренную вену в дозе 0,05 ммоль Gd/кг. МРТ сканирование проводилось на 7 T томографе (Clinscan, Bruker BioSpin) до и через 5 мин, 1, 4, 6, 24 часа после инъекции при следующих параметрах МРтомографии (последовательность Turbo spin echo): TR = 5000, TE = 57, разрешение 320 х 288, толщина среза = 0,7 мм, FOV = 40 мм, Turbo фактор = 9. Накопление контраста была изучено в режиме в FLASH 2D со следующими параметрами: TR = 400, TE = 4, Flip angle = 70°, разрешение 256 х 256, толщина среза = 0,7 мм, FOV= 35 мм. МРТ в диагностике рассеянного склероза С целью изучения процессов демиелинизации было проведено МРТ сканирование мышей, получавших 0,2 % купризона (2, 6, 8, 10 неделя диеты), 0,6 % купризона (1, 2, 4 неделя диеты), а также для обеих групп через 2 недели после прекращения диеты с целью исследования процессов ремиелинизации. В качестве контроля были получены изображения мышей, не получавших купризон с кормом. Т2-изображения получали в режиме Turbo Spin Echo со следующими параметрами: TR = 3250 мс, TE=47 мс, FOV=20 мм, толщина среза 0,6 мм, базовое разрешение 192х192, разрешение по фазе 85 %. Кроме того, для каждого животного получали диффузионновзвешенные изображения головного мозга (ДВИ), которые позволяют количественно оценить степень демиелинизации (Zhang et al 2012). ДВИ получали, используя следующие параметры: b1=0, b2=1000, количество направлений=30, TR=10000мс, ТЕ=40 мс, FOV=40 мм, толщина среза 1 мм, базовое разрешение=100х100. Введение контрастных агентов осуществляли на 4 неделе моделирования (период демиелинизации). Специфические контрастные агенты mAb anti-GFAP-PLL-DTPA-Gd и соотвествующие контроли (неспецифические IgG-PLL-DTPA-Gd и Магневист®) вводили в бедренную 48 вену в дозе 0,2 ммоль Gd/кг. МРТ сканирование проводилось на 7 T томографе (Clinscan, Bruker BioSpin) до и через 1, 4, 24 часа после инъекции при следующих параметрах МР-томографии (последовательность Turbo spin echo): TR = 5000, TE = 57, разрешение 320 х 288, толщина среза = 0,7 мм, FOV = 40 мм, Turbo фактор = 9. Накопление контраста была изучено в режиме в FLASH 2D со следующими параметрами: TR = 400, TE = 4, Flip angle = 70°, разрешение 256 х 256, толщина среза = 0,7 мм, FOV= 35 мм. МР-сканирование тела до и после введения контраста было проведено в режиме FLASH 2D с подавлением жира, используя следующие параметры: TR = 409 ms, TE = 4.09 ms, Flip angle = 70°, толщина среза = 1 мм, FOV = 50x42 мм, разрешение 384x324. 2.20 Анализ данных МР-изображений Интенсивность сигнала в патологических и нормальных тканях мозга были измерены с помощью программного обеспечения SyngoFastViewer (Siemens, Германия) и MultiVox Viewer (Гаммамед, Россия). Усиление контраста в патологическом очаге было определено по соотношению контраст/шум (CNR), которое было рассчитано для каждого изображения по следующей формуле: CNR=(SI пат-SI норм)/SI шума, где SI опухоли - усредненные значения интенсивности сигнала в пределах патологического очага, SI норм - усредненная значения интенсивности сигнала в здоровой ткани головного мозга, SI шума усредненный сигнал интенсивности шума за пределами головы (в воздухе). Относительные значения соотношения контраст/шум для каждого животного (% CNR) были рассчитаны по отношению к значению СNR до введения контрастного агента по формуле: %CNR=CNR после/CNR до *100% , где CNR до - значение CNR до введения контрастного агента, CNR после - значение CNR после введения контрастного вещества. 49 Относительное увеличение площади опухоли была получено на основе измерения ROI на МР-изображения на эквивалентных стезах головного мозга крыс до и после введения контрастного агента по формуле: ∆V опухоли (%)=(V после-V до)/V до, где V после- усредненные значения объема опухоли после введения контрастного вещества, V до - усредненный значения объема опухоли до введения контрастного вещества Оценка накопления препарата Для оценки накопления синтезированных препаратов крысам с моделью интракраниальной глиомы С6 внутривенно вводили Alexa 647меченые контрастные агенты (Cx43- и неспецифические IgG-контрастных агенты, конъюгат PLL-DTPA) в дозе 8 мг/кг. Через 24 ч после введения проводили транскардиальную перфузию с помощью 4% раствором параформальдегида с забором головного мозга и основных органов (почки, печень, селезенка, легкие). Измерения интенсивности флуоресценции органов и мозга были выполнены с помощью системы IVIS Spectrum СТ (Perkin Elmer, Waltham, MA, США) при длине возбуждением / длина волны излучения, а фильтры на 600, 640 нм / 620, 640, 660 и 680 нм. Разделение сигналов от ткани и контрастных агентов проводили с помощью программного обеспечения Living Image 4.4 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Интенсивность сигнала органов и мозга были измерены как среднее значения флуоресценции, нормированное на площадь органа (P / S / см² / SR). После этого готовили криостатные срезы образцов ткани мозга с помощью криостата (30 мкм, MNT SLEE Cryostat, Майнц, Германия), докрашивали DAPI и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (DMI 6000, Leica, Германия). Методы статистической обработки данных. Сравнение релаксивности частиц проводилось при помощи однофакторного дисперсионного анализа для 5 выборок численностью n=3. 50 Анализ зависимости % загрузки гадолиния от значений релаксивности проводился с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена для n=9. Оценка цитотоксичности формуляций Т1-контрастного агента была проанализирована с помощью критерия Крускала-Уоллиса для 8 групп. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsoft Office Excel 2007. Уровень значимости для всех критериев принимался равным 0,05 Глава 3. Результаты исследования 3.1. Синтез контрастного агента Данный раздел работы посвящен созданию векторного Т1-контрастного агента на основе моноклональных антител для направленной визуализации патологических очагов ЦНС методом МРТ. Было разработано пять различных методических протоколов синтеза, в результате которых были получены следующие конъюгаты: 1) mAb-PLL-DTPA-Gd 10%; 2) mAb-PLLDTPA-Gd 100%; 3) mAb-PLL-DOTA-Gd 100%; 4) mAb-PLL-DTPA-Gd 100% (ДМСО) и 5) контрастный агент «ветвистого типа». Для синтеза контрастных агентов была использована различная степень модификации амино групп PLL молекулами хелатирующего агента, DTPA или DOTA (10% или 100% степень модификации). Далее нами была поставлена задача сравнить методические протоколы по основным критериям: 1) релаксивности; 2) % загрузки гадолиния; иммунохимической 3) цитотоксичности; активности антител. На 4) стабильности; основании 5) полученных результатов предполагалось выбрать наилучший контрастный агент и оценить его эффективность в экспериментах in vitro и in vivo. Синтез специфического контрастного агента для визуализации очагов ЦНС был осуществлен в 2 этапа (Рисунок 7): 1) был проведен синтез конъюгатов на основе PLL-DTPA/PLL-DOTA с использованием различных методик (различные соотношения [DTPA]:[Lys]= 51 1:10 и 1:1, хелатирующие агенты (DTPA или DOTA) и условия реакции (H20 или ДМСО), увеличение молекулярного веса контрастного агента за счет присоединения дополнительных цепей полимера с хелатирующим агентом (контрастный агент «ветвистого типа») 2) проведена конъюгация полученных аддуктов PLL и DTPA/DOTA с моноклональными антителами к Сх43 или GFAP (мольное соотношение [mAb]: [PLL-DTPA] 1: 5 или 1:10). Полученные mAb anti-Cx43 и mAb anti-GFAP-PLL-DTPA-конъюгаты в комплексе с GdCl3 очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии (Cефароза CL-6B, 0,1 M HEPES), фильтровали (шприцевые фильтры Fisherbrand, 0,45 мкм) и хранили при +4ºС. Рисунок 7. Схема синтеза контрастного агента 3.2 Сравнение физико-химических характеристик Одним из самых важных параметров для разработки новых контрастных агентов является их релаксивность. Релаксивность - это удельная способность вещества изменять времена релаксации протонов вещества, являющаяся основным параметром, характеризующим эффективность контрастного агента. Как видно из Таблицы 2, релаксивность полученных контрастных агентов сопоставима или превосходит значения релаксивности коммерческого аналога Магневист®, и, следовательно, они 52 могут быть использованы в качестве контрастного агента для МРТ. Статистичеcкая достоверность полученных результатов была подтверждена с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Было показано, что PLLDTPA-Gd 10%, PLL-DTPA-Gd 100% и PLL-DOTA-Gd 100% имеют статистически значимо более высокие значения релаксивности, чем остальные препараты и могут быть использованы для дальнейших экспериментов in vitro и in vivo. Таблица 2. Значения релаксивности для препаратов Т1-контрастного агента PLL-DTPA-Gd 10%, PLL-DTPA-Gd 100%, КА "ветвистого типа", PLL-DTPAGd 100% (ДМСО), а также PLL-DOTA-Gd. № Название R1, ммоль1 сек R1, ммоль- R1, ммоль1 сек-1 1 сек-1 -1 Среднее значение релаксивно- Стандартное отклонение сти, ммоль1 сек-1 1 Магневист 4,00 4,20 4,30 4,17 0,15 2 PLL-DTPA- 5,52 5,71 5,38 5,5 0,17 6,10 6,50 6,80 6,5 0,35 3,70 4,70 4,00 4,13 0,51 Gd 10% 3 PLL-DTPAGd 100% 4 КА "ветвистого типа" 53 5 PLL-DTPA- 5,00 3,50 4,20 4,23 0,75 7,95 7,70 8,20 8,0 0,25 Gd 100% ДМСО 6 PLL-DOTAGd 100% Оценка емкости загрузки (массы гадолиния/массу контрастного вещества) контрастных агентов PLL-DTPA-Gd 10%, PLL-DTPA-Gd 100%, а также PLL-DOTA-Gd 100% была измерена с помощью определения концентрации гадолиния в полученных образцах методом рентгенофлуоресцентного анализа и последующей лиофилизации. Было обнаружено, что наибольшими значениями емкости загрузки обладает PLL-DTPA-Gd 100% (до 20% Gd в образце) по сравнению с PLL-DOTA-Gd 100% (до 1215%) и PLL-DTPA-Gd 10% (до 5%). После чего была изучена иммунохимическая активность антител, конъюгированных с полученными контрастными агентами с помощью иммуноферментного анализа. Было обнаружено, что после конъюгации моноклональные антитела сохраняют до 85% своей активности (PLL-DTPA-Gd 10%, PLL-DTPA-Gd 100%, и PLLDOTA-Gd 100%). Кроме этого, антитела в полученных конъюгатах сохраняли свою активность при хранении на +4°С в течение 10 дней, а также после лиофилизации и хранения при -20°С в течение месяца (до 75-80% активности). (Рисунок 11) На следующем этапе было решено дополнить физико-химическую характеристику выбранных контрастных агентов, конъюгированных с моноклональными антителами (mAb-PLL-DTPA-Gd 10%, mAb-PLL-DTPAGd 100%, и mAb-PLL-DOTA-Gd 100%) аминокислотным анализом. Данные представлены в Таблице 3. 54 Таблица 3. Аминокислотный анализ контрастных агентов, конъюгированных с моноклональными антителами. mAb- PLL- mAb- PLL- Aмин DTPA-Gd (10 DTPA-Gd (100 о%) %) кисло нмол нмоль/ та экв. экв. ь/мг мг Gly (G) Ala (A) Val (V) Leu (L) Lys (K) mAb-PLLDOTA-Gd mAb (100 %) нмоль/ мг экв. N(AA)/ mAb экв. 10,8 1.00 72,1 1.00 48,6 1.00 76 1.00 8,8 0.81 72,1 1.00 42,6 0.88 62 0.82 16,3 1.50 108,1 1.50 60,8 1.25 108 1.42 11,0 1.02 86,5 1.20 54,7 1.13 82 1.08 168 15.6 1873 26.0 1611 33.1 90 1.18 N (PLL)/mAb (количество цепей полилизина на 1 молекулу антитела) N 11±2 13±3 17±4 M.W. 450 kDa 850 kDa 920 kDa Было показано, что в случае конъюгации - PLL-DOTA-Gd 100% с моноклональными антителами к одной молекуле антитела присоединяется порядка 17 цепочек полилизина, что сопровождается увеличением молекулярной массы контрастного агента (920 кД). Высокий молекулярный 55 вес, а также большее количество цепей полилизина на одну молекулу антитела может объяснять повышение значений релаксивности для данного конъюгата (до 8 ммоль-1сек-1) по сравнению со значениями релаксивности коммерческого аналога Магневист® (4 ммоль-1сек-1). Для конъюгатов контрастного агента с 10% или 100% модификацией остатков лизина диэтиленпентакусусной кислотой (mAb-PLL-DTPA-Gd 10%, mAb-PLLDTPA-Gd 100%) на одно антитело приходится около 12 цепей полилизина с DTPA, что в зависимости от количества DTPA соответствует молекулярному весу 450 кД (для 10% модификации остатков лизина) и 850 кД (для 100% модификации остатков лизина). Для оценки степени модификации полилизина молекулами DTPA также был проведен ЯМР-анализ спектра структуры контрастного агента PLL-DTPA-Gd 100% (Рисунок 9). Было показано, что в случае максимальной пришивки DTPA (100%), происходит модификация около 50% аминогрупп PLL, что объясняет полученные выше значения емкости и эффективности загрузки контрастного агента гадолинием. 56 Рисунок 9. 1H-ЯМР спектр ДТПА (1), ПЛЛ (2) и ПЛЛ-ДТПА 100% (3).Растворитель D2O. Группы: а- (HOOC-CH2-N)*4;б-(HOOC-CH2-N)*1; вСH2-N; г-N-CH-C=0; д-CH2-NH2; e-2*CH2; ж-CH2 3.3. Анализ цитотоксичности препаратов с помощью MTT-теста. Следующим шагом на пути к применению гадолиний-содержащих препаратов в качестве Т1-контрастного цитотоксичности. Цитотоксичность агента является оценка их полученных препаратов оценивали с помощью МТТ-теста. МТТ-тест основан на способности восстанавливать бесцветную соль тетразолия (МТТ-реагент) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток до нерастворимого остатка – формазана. Полученные препараты (mAb-PLL-DTPA-Gd 10%, mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAb-PLL-DOTA-Gd 100%) инкубировали в концентрации до 0,5 мг Gd\мл с клетками эмбрионального почечного эпителия человека (HEK293, 2,5*104 клеток на 57 лунку) в течение 24 часов. После этого к клеткам добавляли рабочий раствор МТТ (50 мкл на лунку, инкубация 3 часа) и определяли значения оптической плотности при длине волны 490 нм (Bio-tec ELx800, CША). В качестве контроля (100% выживших клеток) использовали клетки, которые не подвергались действию контрастных агентов. Рисунок 10. Цитотоксичность препаратов контрастных агентов mAb-PLLDTPA-Gd 10%, mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAb-PLL-DOTA-Gd 100% по отношению клеткам культуры HEK293. Было показано, что среди полученных препаратов контрастного агента только mAb-PLL-DTPA-Gd 10% является токсичной (IC50 = 4 мкг Gd/мл). Препараты mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAb-PLL-DOTA-Gd 100% оказались нетоксичны при максимальной концентрации гадолиния 0,5 мг/мл, что в несколько раз превышает концентрацию Gd в крови при применении рекомендуемых доз в клинике у пациентов. Таким образом, для дальнейших экспериментов были выбраны два препарата mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAb-PLL-DOTA-Gd 100%, обладающие наименьшей токсичностью и высокими значениями релаксивности. 58 3.4. Оценка иммунохимической активности конъюгированных антител Иммунохимическая активность (ИХА) соответствующих антител, конъюгированных с контрастными агентами, была исследована методом иммуноферментного анализа сразу после конъюгации, через неделю и после сразу же после размораживания (месяц, -20ºС). В исследовании было изучено сохранение иммунохимической активности конъюгированных с контрастным агентом антител при различном соотношении соотношение [mAb]:[PLLDTPA]=1:5 или 1:10. Было показано, что сразу после конъюгации ИХА конъюгированных с контрастным агентом антител соответствовала до 85% от таковой у нативных антител (Рисунок 11а,б). После хранения при +4ºС и после замораживания не наблюдалось значительного снижения иммунохимической активности конъюгатов, что позволяет рассматривать данные условия хранения в качестве рекомендуемых (Рисунок 11в). Рисунок 11. ИХА полученных препаратов контрастных агентов, конъюгированных с моноклональными антителами, в различных соотношениях [mAb]:[PLL] a) 1:5 and б) 1:10 в HEPES, где (1) свободные 59 mAb, (2) IgG-PLL-DTPA-Gd и (3) mAb-PLL-DTPA-Gd. в) сохранение специфической аффинности (1) свободных mAb и (3) mAb-PLL-DTPA-Gd после хранения в буфере HEPES при -20˚C в течение 3 недель (1a, 3а) и при 4˚C в течение недели (1б, 3б). 3.5. Иммунофлюоресцентный анализ Для получения четкого контрастного изображения патологических очагов ЦНС, вводимый Т1-контрастный агент должен иметь не только высокие значения релаксивности, но и способность специфически связываться с рецепторами, высоко экспрессированными на клетках, формирующих патологический очаг. C этой целью был проведен иммунофлюоресцентный анализ синтезированных препаратов на культуре астроцитов человека, экспрессирующих глиофибриллярный кислый белок, и клетках глиомы С6, гиперэкспрессирующих белок щелевых контрактов Cx43. Для этого клетки фиксировали, инкубировали с экспериментальными образцами в течение часа, добавляли флуоресцентно-меченые вторичные антитела (Anti-goat anti-mouse -Alexa 594, Life Technologies) и монтировали на предметное стекло. Микроскопирование проводили с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica DMI6000, Германия). 60 Рисунок 12. Иммунофлюоресцентный анализ Т1 контрастного агента на клетках глиомы С6. Cпецифический контрстный агент mAb anti-Cx43-PLLDTPA-Gd (А) и неспецифический IgG-PLL-DTPA-Gd (Б) агенты инкубировали с вторичными козьими анти-мышиными антителами с Alexa 488. Были показано, что контрастный агент, конъюгированный со специфическими антителами к коннексину 43 накапливается клетками гораздо лучше, чем препарат, конъюгированный с неспецифическими иммуноглобулинами, или контрастный агент без антител (Рисунок 12). Аналогичные результаты были получены для контрастного агента, конъюгированного со специфическими антителами к GFAP (Рисунок 13А), по сравнению с неспецифическим контрастным агентом (IgG-PLL-DTPAGd), Рисунок 13Б. 61 Рисунок 13. Иммунофлюоресцентный анализ Т1 контрастного агента, конъюгированного со специфическими антителами mAb anti-GFAP(А) и неспецифическими IgG (Б) на культуре астроцитов человека. (коньюгат козьих антител к IgG мыши , коньюгированных с Alexa 594). Мы провели двойной иммунофлуоресцентный анализ на живых клетках глиомы С6 для того, чтобы подтвердить, что вся конструкция полученного контрастного агента способна связываться с клетками. Для этого флюоресцентно-меченый контрастный агент добавляли к культуре опухолевых клеток, инкубировали в течение 45 минут, и добавляли вторичные антитела (козьи антитела к Fc-фрагменту антител мыши, конъюгированные с Alexa 594). Полученные данные подтвердили предыдущие результаты иммунофлюоресцентного анализа на фиксированной клеточной культуре: mAb anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd показал специфическое связывание с антигеном на мембране клеток глиомы С6 по сравнению с IgGPLL-DTPA-Gd. Ко-локализация двух меток (флуоресцеина и Alexa 594) подтверждает стабильность контрастного агента, конъюгированного с антителами: PLL-DTPA-Gd остается стабильно связанным с антителом (Рисунок 14). 62 Рисунок 14. Иммунофлюоресцентный анализ флуоресцеин-меченого Т1 контрастного агента на живых клетках глиомы С6. Клетки инкубировали в течение 45 минут с контрастными агентами (флуоресцеин-меченые специфические препараты конъюгатов anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd и IgG-PLLDTPA-Gd, зеленая флюоресценция), после чего инкубировали с коньюгатом козьего IgG с Alexa 594 (красная флюоресценция). 3.7. Проточная цитофлуориметрия Для количественной оценки связывания полученных конъюгатов с клетками использовали метод проточной цитофлуориметрии. Метод заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клеток в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии (H.M. 1985). В данном эксперименте к Т1-контрастному флуоресцеин, конъюгировали со агенту ковалентно специфическими присоединяли моноклональными 63 антителами и оценивали специфичность связывания опытного образца, по сравнению с тем же контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими иммуноглобулинами мыши. В результате эксперимента были получены данные среднего значения флуоресценции и дисперсии для всех клеток (p8) и клеток, связавшихся с образцом (позитивных клеток, p17). Как видно, из Рисунка 15 захват клетками контрастного агента, конъюгированного со специфическими антителами, значительно превышает захват, контрастного агента, конъюгированного с неспецифическими иммуноглобулинами. Это свидетельствует о высокой аффинности полученного векторного контрастного агента. Также стоит отметить, что данный эффект зависит от времени инкубации и концентрации контрастного агента. Так захват клетками специфического конъюгата был в 4 раза выше, чем препарата, конъюгированного с неспецифическими IgG через 30 минут инкубации (Рисунок 15а). Как и ожидалось, разница в накоплении уменьшалась при возрастании концентрации контрастного агента ( с 1 до 5 ммоль), Рисунок 15а. Более того, увеличение времени инкубации привело к уменьшению разницы между специфическими и неспецифическими конъюгатами, что объясняется насыщением клеток глиомы С6, Рисунок 15б. 64 Рисунок 15. Анализ захвата клетками глиомы С6 контрастного агента, конъюгированного со специфическими антителами (красным цветом) и контрастного агента, конъюгированного c неспецифическими иммуноглобулинами (синим цветом) после а) 30 минут и б) 1 часа инкубации Кроме таких важных параметров, как сохранение иммунохимической активности и увеличение релаксивности препаратов, важным аспектом является стабильность контрастных агентов. Нами было показано, что полученные конъюгаты способны сохранять иммунохимическую акивность 65 конъюгированных антител в буфере при различных условиях хранения (4°С, 10 дней или -20°С, месяц), а также после лиофилизации. Однако помимо, этого крайне важно оценить стабильность полученных препаратов не только в буферном растворе, но также в сыворотке крови. В связи с этим, полученные контрастные агенты были проинкубированы с сывороткой крови крысы (10%, 24 часа, 37°С), а также в буфере ( HEPES, 4°С, 10 дней). В течение указанного срока в растворе не наблюдалось преципитации, а также видимых агломератов препаратов, что позволяет рассматривать исследуемые условия в качестве рекомендаций по хранению контрастных агентов. Таким образом, для дальнейших экспериментов были выбраны два препарата - mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAb-PLL-DOTA-Gd 100%. Данные контрастные агенты обладают наибольшими значениями релаксивности (до 8 ммоль-1сек-1), стабильностью, не токсичны в концентрациях, используемых для диагностики (до 0.5 мг Gd/мл) и специфично связываются с клетками, гиперэкспрессирующими белки-мишени для направленной визуализации (Сх43-позитивными опухолевыми клетками или GFAP-положительными астроцитами человека). 3.8. Оценка эффективности препаратов in vivo: моделирование патологических процессов нервной системы Для оценки эффективности разработанных контрастных агентов было проведено моделирование патологических очагов ЦНС: интракраниальной глиомы С6 и купризон-индуцированной модели рассеянного склероза по описанным выше методикам. Характеристика данных моделей была проведена с помощью комплекса методов: МРТ, гистологического и иммунохимического анализов срезов головного мозга животных. Интракраниальная глиома С6 Для оценки динамики развития заболевания на 1, 3, 15 и 28 сутки после имплантации была выполнена МРТ в Т2-взвешенном режиме (Рисунок 18) и проведен гистологический анализ срезов глиомы С6. Было показано, что 66 через 2 часа после имплантации площадь опухоли составляет 1,9 ± 0,2% от площади полушария. На 21 день площадь увеличивается более чем в 30 раз (61,8 ± 9,8% от площади полушария). Чтобы оценить рост опухоли и ее локализацию ранее была проведена МРТ на 14, 21, 28 дней в Т2- взвешенном режиме (Chekhonin et al 2007). В настоящем исследовании верификация роста опухоли и локализация имплантированных клеток глиомы была выполнена методом МРТ на 14-й день после клеточной имплантации (Рисунок 17). Рисунок 17 Сравнение Т1- и Т2-взвешенных изображений глиомы С6 на 14 день развития опухоли. Размер опухоли составляет примерно 14± 2% от общей площади полушария на данном срезе. Данные изображения получены до введения исследуемых контрастных агентов: 1) mAb anti-Cx43специфических и 2) IgG-неспефичных контрастных агентов, 3) коммерческого аналога Магневист®. Купризон-индуцированная модель рассеянного склероза В качестве стандарта для моделирования рассеянного склероза была выбрана диета с содержанием 0,2 % купризона (Benardais et al 2013). Однако МРТ сканирование не выявило значительных патологических изменений в 67 ткани головного мозга мышей вплоть до 10 недели моделирования. В связи с этим было решено увеличить ежедневную дозу до 0,6 % купризона и сократить период моделирования. Данные МРТ показали у мышей на 4 неделе диеты уменьшение объема мозолистого тела и появление в его области гиперинтенсивных очагов, свидетельствующих о возникших процессах демиелинизации и воспаления (Рисунок 18). Стоит отметить, что данная картина наблюдалась у всех животных (n=7), что свидетельствует о высоком уровне воспроизводимости данной модели. Через 2 недели после прекращения диеты, было обнаружено уменьшение или отсутствие очагов демиелинизации на Т2-взвешенных изображениях головного мозга, что позволяет судить о запуске процессов ремиелинизации пораженных участков (Рисунок 19.3). Рисунок 18. МРТ изображение головного мозга мышей с моделированными участками демиелинизации, характерными для рассеянного склероза 68 Рисунок 19. Изменения на снимках МРТ мышей с диетой, содержащей 0,6 % купризона на 4 неделе демиелинизации (2) и через 2 недели после прекращения диеты (3-период ремиелинизации) по сравнению с контролем (1). Диффузионно-взвешенные изображения головного мозга с купризониндуцированной демиелинизацией свидетельствуют о нарушении проводимости в нервных волокнах (Рисунок 18, DWI). Кроме того, для оценки степени нарушения проводимости были рассчитаны показатели фракционной анизотропии (FA), уменьшение которых свидетельствует о демиелинизации и потере аксонов. Полученные изменения были зафиксированы при моделировании демиелинизации как у самцов, так и самок мышей. Максимум снижения фракционной анизотропии был отмечен на 4 неделе демиелинизации, причем для самок степень снижения FA была в 1,5 раза выше. Стоит отметить, что после прекращения диеты, в период ремиелинизации, уровень фракционной анизотропии у мышей обоего пола возвращался к норме (Рисунок 20). 69 Рисунок 20. Изменения показателей фракционной анизотропии на диффузионно-взвешенных изображениях головного мозга самок и самцов мышей с купризон-индуцированной демиелинизацией до начала диеты (контроль), а также на 2 и 4 недели диеты, и в период ремиелинизации (через 2 недели после прекращения диеты). Данные на графике являются статистически достоверными (p<0,05). 3.9. Гистологический анализ Гистологическое окрашивание срезов головного проводилось с помощью красителя люксолевый мозга мыши прочный синий по модифицированной нами методике Kamps et al. Результаты окрашивания срезов головного мозга представлены на Рисунке 21. Как видно из рисунка, снижение интенсивности окрашивания мозолистого тела свидетельствует о феномене демиелинизации нервных волокон и атрофии мозолистого тела. 70 Рисунок 21. Гистологическое окрашивание миелина в мозолистом теле (Мт) на срезах головного мозга мышей красителем люксолевый прочный синий, получавших а) стандартный корм (контроль) и б) 0,6% купризона с кормом (4 неделя моделирования демиелинизации) 3.10. Полимеразная цепная реакция С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени было показано уменьшение экспрессии основного белка миелина (MBP) и протеолипидного белка (PLP), которые в сумме составляют до 90% от всех белков миелина. На протяжении всего периода кормления (4 недели) наблюдалось уменьшение экспрессии данных белков и возвращение к норме после прекращения диеты (Рисунок 22). 71 Рисунок 22. ПЦР анализ основного белка миелина (MBP) и протеолипидного белка (PLP) Для анализа экспрессии глиофибриллярного кислого белка были проведены как ПЦР, так и иммунофлюоресцентный анализ срезов головного мозга мышей с помощью поликлональных антител к глиофибриллярномукислому белку. Следует отметить, что диета на основе 0,6 % купризона способствовала повышению экспрессии GFAP на 4 неделе, после чего его уровень достигал максимума на 2 неделе после прекращения диеты, в период ремиелинизации. Последнее, по-видимому, связано с клеточным глиозом, который возникает в связи с активным процессом восстановления миелина (Рисунок 23). 72 Рисунок 23. Анализ экспрессии GFAP методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (A) у мышей на 4 неделе диеты, содержавшей 0,6% купризона (период демиелинизации), а также через 2 и 4 недели после прекращения диеты (6 и 8 неделя, соответственно; период ремиелинизации), и последующий иммунофлуоресцентный анализ (Б) c помощью поликлональных антител к GFAP на срезах мышей, подвергшихся и не подвергшихся вынужденной диете, содержащей 0,6% купризона. Оценка нейропсихических функций и двигательного дефицита у мышей в купризоновой модели РС проводилась с помощью теста «СВ», «ПКЛ» и «Ротарод». В тесте «СВ» было показано, что на 4 неделе моделирования процессов демиелинизации наблюдалось увеличение количества и времени 73 агрессивных контактов (в 2 раза), что свидетельствует о повышенной раздражительности и, предположительно, увеличении тревожности. Эти данные коррелируют с данными психологического исследования пациентов с рассеянным склерозом (Jones et al 2012). Спустя 2 недели после прекращения нейротоксического воздействия купризона доля продолжительности агрессивных контактов по отношению к общему времени взаимодействий (как социального, так и агрессивного характера) возвращалась к норме (Рисунок 24А). Для оценки уровня тревожности был проведен тест «ПКЛ». На 4 неделе после начала моделирования процессов демиелинизации животные стали значительно больше времени находится в затемненных рукавах лабиринта (370 сек) по сравнению с контролем (300 сек), что говорит о повышенном уровне тревожности животных. Спустя 2 недели после окончания диеты и возвращения к нормальному рациону питания, мышей тестировали повторно, однако не наблюдали восстановления нормального эмоционального фона (время нахождения в затемненных рукавах 420 сек), а наоборот, мыши практически все время находились в темном рукаве лабиринта, проявляя тревожность (Рисунок 24Б). Это подтверждает тот факт, что после токсического воздействия купризона, период ремиелинизации сопровождается процессом, так называемой, хронической демиелинизации, и прогрессирующим расстройством психоэмоционального фона, что отражает таковое течение у пациентов и подтверждает правильность выбора данной модели [24]. Для оценки двигательнокоординационного дефицита был проведен тест «Ротарод». На 4 неделе тестирования координация и выносливость была ослаблена по сравнению с контролем в 2 раза (Рисунок 24В). В период ремиелинизации двигательный дефицит достиг максимума (ни одна мышь не смогла удержаться на барабане), что связано с продолжающейся демиелинизацией, несмотря на частичное восстановление, и соответствует литературным данным [25]. 74 Рисунок 24. Нейрофизиологическое тестирование мышей линии С57Bl6, получавших диету, содержащую 0,6% купризона, проводилось до начала эксперимента (контроль), на 4 неделе эксперимента по моделированию рассеянного склероза, через 2 недели после прекращения «купризоновой» диеты: а) тест «социальное взаимодействие», б) тест «приподнятый крестообразный лабиринт», в) тест «Ротарод», г) изменения в весе 3.11. Проницаемость гемато-энцефалического барьера при купризон-индуцированной демиелинизации 75 Ранее проницаемость ГЭБ в направлении кровь-мозг в купризоновой модели РС была изучена Akira Kondo и Bakker в 1987 году. Они показали, что ГЭБ в области демиелинизированных нервных волокон не проницаем для пероксидазы хрена или протеинов (Kondo et al 1987). В 1969 году Suzuki вводил Trypan Blue двум мышам с купризоновой моделью, когда увидел признаки энцефалопатии, однако не увидел накопления в головном мозге, по сравнению с накоплением красителя в теле (Suzuki & Kikkawa 1969). Нами было выдвинуто предположение, что данные результаты были связаны с низкой чувствительностью используемых авторами методов. С целью подтверждения или опровержения достоверности полученных данных был запланирован эксперимент по оценке проницаемости ГЭБ для макромолекул в направлении «кровь-мозг». Для этого мышам с моделью рассеянного склероза вводили флуоресцентно-меченые антитела к GFAP и оценивали накопление через 12 и 24 часа после введения. Неспецифические иммуноглобулины, конъюгированные с сукцинимидным эфиром карбоновой кислоты Alexa 488, были взяты в качестве контроля. Было показано,что в случае введения специфических и неспецифических флуоресцентно-меченых иммуноглобулинов, наблюдается флуоресценция в мозолистом теле (Рисунок 25). При введении препаратов антител животным с интактным барьером флуоресценции предположение о не возможной наблюдалось, проницаемости что ГЭБ позволяет для сделать конъюгатов моноклональных антител с флюорофором. 76 A Б Рисунок 25 .Флюоресцентный анализ срезов головного мозга мышей с а) интактным ГЭБ и б) купризон-индуцированной демиелинизацией через 24 часа после введения коньюгата анти- GFAP антител с флюорофором (mAb anti-GFAP-Alexa488). (Увеличение х100). 3.12. Визуализация глиомы С6 in vivo с помощьюT1-контрастных агентов Для исследования возможностей диагностирования глиомы с помощью созданного векторного Т1-контрастного агента мы использовали экспериментальную модель глиомы С6 на крысах и различные типы агентов: специфический mAb anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd 100%, неспецифический IgGPLL-DTPA-Gd 100% и коммерческий препарат Магневист®. Все агенты вводили в бедренную вену в концентрации гадолиния 0,05 ммоль/кг и анализировали динамику накопления контрастного агента в головном мозге методом МРТ (Рисунок 26). МР-сканирование головного мозга крыс после в/в введения специфического контрастного агента показало значительное усиление контраста на Т1-взвешенных изображениях глиомы С6 по сравнению с контролем (Рисунок 26). 77 Рисунок 26. Т1-взвешенные изображения мозга крыс до и спустя 24 часа после введения Сх43-специфичесго контрастного агента, IgG- неспецифичекого контрастного агента и коммерческого аналога Магневист. T2-взвешенные изображения были получены на 14 день после имплантации глиомы с целью верификации развития опухоли. Количественную оценку эффективности контрастных веществ проводили путем измерения показателя контраст/шум (CNR). На ранних сроках (до 1 ч после инъекции) не было существенных различий в накоплении между Cx43-специфческим контрастным агентом и введенными контролями (все показали повышение CNR примерно в 1,5 раза по сравнению с первоначальной интенсивностью сигнала), Рисунок 27А. Для Cx43-специфического агента CNR значения увеличивались с течением времени, что указывает на более контрастную визуализацию опухолевой ткани, и имели максимальное различие с контрольной группой (более чем в 78 2 раза) через 24 ч после инъекции (Рисунок 27А). Интересно, мы отметили резкое снижение CNR значений для неспецифических IgG-конъюгатов через 1 ч после их инъекции, в то время как в случае Магневист это снижение CNR было более замедленное. Измерения объема опухоли с помощью МРТ позволяет выявить границы глиомы для последующей хирургической резекции. Через 24 ч после введения было отмечено значительное увеличение визуализируемых границ опухоли на МР-изображении после введения Cx43-специфического контрастного агента (175 % от первоначальнго размера опухоли до введения препарата) (Рисунок 27Б) по сравнению с коммерческим аналогом Магневист и неспецифическим контрастным агентом (120 % и 95 % от размера опухоли до введения препарата, соответственно). Интересно, что в первые 4 часа не было никаких существенных различий в визуализируемой площади опухоли между Cx43-специфическим агентом и Магневист (оба улучшали визуализацию границ опухоли на 30%), в то время как несцефический контрастный агент не изменил визуализируемый объем глиомы (95% от начального объема), (Рисунок 27Б). Эти данные подтверждают, что векторные Т1 контрастные агенты способны улучшать визуализацию глиомы С6 через 24 часа после в/в введения и более четко определелять реальные границы опухоли. Хотя в первые часы эти агенты визуализируют опухоль наравне с коммерческими аналогами (по контрастности и по визуализируемой площади). 79 Рисунок 27. Графики изменения во времени: а) коэффициента контрастность/шум (СNR) и б) относительной визуализируемой области глиомы после в/в введения 1) Сх43-специфичесго контрастного агента, 2) коммерческого аналога Магневист и 3) IgG-неспецифичекого контрастного агента. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3), * р <0,05, ** р <0,01, NS - не имеет значения. 3.13. Визуализация очагов демиелинизации in vivo с помощьюT1контрастных агентов На 4 неделе моделирования рассеянного склероза исследовали эффективность визуализации очагов демиелинизациия путем введения контрастного агента в дозе 0,2 ммоль Gd/кг. В качестве контроля использовали контрастные агенты, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши, а также коммерческий аналог Омнискан®. Для этого были получены Т2-взвешенные изображения и Т1-взвешенные изображения до введения препарата, а также через 1, 5, 24 часов после введения. С целью количественной оценки на Т1-взвешенных изображениях анализировали отношение контраст/шум (contrast-to-noise ratio, CNR) при 80 помощи программы ImageJ, как описано выше. Полученные значения CNR до введения были взяты за ноль, а последующие значения (1, 5, 24 часы после введения контрастного агента) представлены в процентном соотношении по отношении к значению CNR до введения контраста. Было показано, что через 5 часов после введения наблюдается максимум накопления контрастного агента контрастного агента в области мозолистого тела. При увеличение значений отношения контраст/шум в 3 раза выше для специфического контрастного агента, контъюгированного antiGFAP антителами, по сравнению с контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими IgG, или коммерческим аналогом Омнискан® (Рисунок 28). 81 Рисунок 28. Графики изменения во времени: а) коэффициента контрастность/шум (СNR) в течение до введении и 24 часов после введения б) гистограмма значений CNR через 5 часов после введения GFAP- специфичесго контрастного агента в дозе 0,2 ммоль Gd/кг (GFAP 0,2), коммерческого аналога Омнискан® (Omniscan 0,2) и IgG-неспецифичекого контрастного агента (IgG 0,2). ] 3.14. Оценка накопления и распределения контрастного агента 82 Для предварительной оценки распределения контрастных агентов на основе полилизина и хелатов гадолиния в животных мы использовали прижизненное МРТ сканирование внутренних органов, а также анализ накопления флуоресцентно меченных агентов ex vivo с помощью системы IVIS Spectrum СT. Для МРТ анализа здоровым мышам вводили векторный контрастный агент из расчета 0.2 ммоль Gd/кг веса и проводили сканирование до введения и через 1, 4, 24 часа после в/в введения (Рисунок 24). Видно, что в основном накопление агента происходит в почках, при этом максимум наблюдается через 4 часа после введения. Рисунок 29. МРТ сканирование мышей до и через 1, 4, 24 часа после введения контрастного агента, конъюгированного с моноклональными антителами. Для анализа распределения флюоресцентной метки в организме с помощью системы IVIS Spectrum СT крысам с экспериментальной глиомой С6 вводили флуоресцентно меченные контрастные агенты из расчета 2 мг антител/кг. Для этого полилизин конъюгировали с флуоресцентной меткой Alexa 647, удаляли несвязавшиеся флуоресцентные метки методом гельфильтрационной хроматографии и конъюгировали с моноклональными 83 антителами к Сх43 и несцецифическими иммуноглобулинами IgG, как было описано в прошлом отчете. Через 24 часа после в/в введения препаратов (Alexa647-ПЛЛ-ДТПА-IgG, Alexa647-ПЛЛ-ДТПА-Mab-anti-Cx43 и Alexa647ПЛЛ-ДТПА) животных перфузировали раствором 4% параформальдегида и анализировали основные органы и мозг. Из Рисунка 30 (верхняя панель) видно, что через 24 ч после введения максимальное накопление контрастного агента происходит в почках, хотя есть некоторое накопление и в других органах (печень, легкие, селезенка). Таким образом, разными методами (МРТ и IVIS) было продемонстрировано, что накопление контрастного агента происходит главным образом в почках, что указывает о преимущественной экскреции препарата через мочевыделительную систему (Рисунок 30), и связано, по всей видимости, с малым физическим размером исследуемых препаратов (менее 10 нм) (Gaumet et al 2008) 84 Рисунок 30. Распределение контрастного агента в органах крысы (24 часа, IVIS Spectrum, CT) и мыши (4 часа, МРТ сканирование). Интенсивность флуоресценции на обоих рисунках соответствует представленной шкале. Кроме этого, мы сравнили накопление специфических и неспецифических контрастных агентов в очаге экспериментальной глиомы С6 у крыс через 24 часа после в/в введения с помощью IVIS Spectrum CT. Из Рисунка 33 видно преимущественное накопление в опухоли и периопухолевом пространстве Сх43-специфических контрастных агентов по сравнению с контролем 85 (Alexa647-ПЛЛ-ДТПА-IgG, Alexa647-ПЛЛ-ДТПА). Стоит отметить, что при моделировании глиомы С6 на ряду с интракраниальными иногда образуются экстракраниальные опухоли. Мы нашли, что при наличии экстракраниальной опухоли накопление контрастного препарата происходит в большей степени в ней (Рисунок 32). Если сравнить интенсивности в области интереса (ROI), то видно, что при одинаковом накоплении агентов в интракраниальной глиоме (Рисунок 32, нижняя панель), накопление в экстракраниальной глиоме выше в 7,5 и 25 раз для неспецифического и Сx43-специфического агентов, соответственно. При этом Сx43-специфического агента накопилось в экстракраниальной глиоме в 3 раза больше, чем неспецифического. Рисунок 31. Сравнительное неспецифического контрастных накопление агентов в Сх43-специфического головном мозге крыс и с экспериментальной глиомой С6 через 24 часа после в/в введения. Контроль мозг крысы, которой не вводили никакие агенты. 86 Рисунок 32. Сравнительное неспецифического контрастных накопление агентов в Сx43-специфического головного мозге крыс и с экспериментальной глиомой С6 раздельно с экстракраниальной (верх) и интракраниальной (низ) частью. Эти данные были также подтверждены с помощью флуоресцентного анализа срезов головного мозга крыс на микроскопе DMI 6000 (Leica) (Рисунок 33). Видно, что Сх43-направленные агенты накапливаются в опухоли и особенно интенсивно накапливаются в периопухолевом простанстве, где, как известно, происходит наибольшая экспрессия Сх43 [Baklaushev VP, et al, 2011]. Такой картины не наблюдалось ни для невекторных Alexa647-PLL-DTPA, ни для неспецифических агентов 87 Alexa647-PLL-DTPA-IgG. Важно отметить, что обнаружен захват векторных контрастных агентов опухолевыми клетками перитуморального пространства, где происходит инфильтрация и миграция глиомных клеток в окружающие ткани (Рисунок 33). Следовательно, Сх43-направленные агенты накапливаются не только в опухолевом очаге, но и доходят до удаленных участков, где также активно захватываются злокачественными клетками. После хирургического удаления опухолей мозга, именно сохранившиеся клетки периопухолевого пространства являются причиной рецидивов. Интенсивная инвазия и миграция глиомных клеток в паренхиму нервной ткани обеспечивает резистентность и быструю прогрессию опухолей мозга. Поэтому возможность селективной диагностики таких областей может значительно повысить эффективность лечения. Все приведенные данные подтверждают, что векторные контрастные агенты в значительно большей степени способны накапливаться в глиоме С6 (как интра- так и экстра- краниальной) по сравнению с неселективными контрастными агентами. При этом Т1 контрастный агент интенсивно выводится через почки. 88 Рисунок 33. Флюоресцентный анализ накопления Т1 контрастных агентов в опухолевой ткани и периопухолевом пространстве при в/в введении крысам с интракраниальной глиомой С6 через 24 ч. Сх43-специфические и неспецифические контрастные агенты , конъюгированы с флуоресцентной меткой Alexa647, ядра докрашены DAPI («Life technologies», США). 89 Глава 4. Обсуждение Диагностика заболеваний головного мозга является важным аспектом на пути к улучшению качества и продолжительности жизни пациента. Эта непростая задача может быть успешно решена с помощью МРТ с применением Т1- или Т2-контрастных агентов. Низкомолекулярные контрастные агенты (Магневист®, Гадовист®, Омнискан®) не могут проходить через интактный ГЭБ (Hesselink et al 1988, Hesselink & Press 1988), однако при патологических процессах в головном мозге проницаемость ГЭБ повышается, что приводит к накоплению препарата в пораженных органах и визуализации патологических нарушений. Основной проблемой этих агентов является их низкая локальная концентрация в патологическом очаге, и, как следствие, недостаточный уровень контраста на МР-изображении (Geraldes & Laurent 2009). Для повышения локальной концентрации контрастного вещества можно использовать конъюгацию с лигандами, которые могут избирательно взаимодействовать с молекулярными маркерами заболеваний (Bogdanov et al 1993, Langer 1998). По сравнению с низкомолекулярными агентами, часто применяемыми в клинической практике, макромолекулярные контрастные агенты, (в частности используемые для ангиографии) могли бы значительно увеличить время циркуляции агента в патологическом очаге (вместо нескольких минут до 1 часа) вследствие высокой молекулярной массы и высоких значений релаксивности по сравнению с коммерческими аналогами (Knopp et al 1999). Более того, нарушение структуры ГЭБ при опухолевых или воспалительных заболеваниях может позволить векторным высокомолекулярным агентам и наночастицам проникать в пораженную ткань и связываться с белками-мишенями (Maeda 2001, Wolburg et al 2012). Таким образом, сочетание таких важных свойств контрастных агентов как селективность действия и высокая релаксивность позволяет получить синергическое повышение эффективности визуализации патологического очага in vivo и снижение эффективной дозы (например, для Т1-агентов < 0.1 90 ммоль Gd/кг). Кроме того, низкие значения токсичности препаратов позволяют увеличить терапевтический диапазон применяемых доз, понижая риск возникновения побочных эффектов. Тем не менее, эти контрастные вещества имеют ряд ограничений, в частности их быстрая элиминация из кровеносного русла и неспецифическое проникновение в окружающие ткани приводят к уменьшению накопления в патологическом очаге и, как следствие, к ухудшению контрастности изображения. Для увеличения времени циркуляции контрастных веществ и усиления их накопления в опухоли можно проводить конъюгацию контрастных агентов с различными макромолекулами, такими как белки, декстраны, полиаминокарбоновые кислот и т.д. (Zhou & Lu 2012). Например, конъюгат поли-L-лизина с хелатными комплексами Gd-DTPA (PLL-DTPAGd) был использован для диагностики аденокарциномы молочной железы (Kornguth et al 1990, Opsahl et al 1995) и МФГ в моделях грызунов (Kornguth et al 1990). В настоящий момент PLL-DTPA-Gd исследуется в доклинической стадии в качестве контрастного агента для ангиографии (Bayer Schering Pharma AG). Улучшение визуализации демиелинизирующих заболеваний достигается в основном за счет применения различных методик и протоколов МРТ сканирования: получения диффузионно-взвешенных изображения, МРспектроскопии, проведения, МР-термометрии. Введение контрастных агентов позволяет оценить степень развития заболевания, его течение и эффективность терапии, так как накопление контраста происходит, главным образом, в активных, т.е. «свежих» очагах. В отличие от диагностики опухолевых заболеваний, при демиелинизации важно не столько увидеть границы патологического хирургической резекции), очага (ввиду сколько отсутствия увидеть необходимости значимое накопление контрастного агента в пораженном участке головного мозга. При этом эффективность исследования находится в прямой зависимости от дозы контрастного вещества, которая коррелирует со стоимостью исследования и 91 риском возникновения побочных эффектов [Yousry, I.,2000]. Для решения этой проблемы в мире проводится множество исследований, посвященных разработке различных режимов и протоколов МР-сканирования рассеянного склероза [Grabner, G. 2011, Livshits, I. 2012], а также созданию новых форм контрастных агентов [Ferre, J.C. 2012, Granato, L, 2011]. Одним из способов улучшения свойств контрастирующих веществ является их конъюгация с векторными молекулами [Caravan, P. and Zhang, Z., 2013]. Так Luchetti A. et al. была показана возможность эффективной визуализации патологических очагов в мышиной модели рассеянного склероза с помощью наночастиц железа, конъюгированных с антителами к CD3+ клеткам, [Luchetti A., et al., 2012]. Также в качестве векторных групп для доставки контрастных агентов были исследованы моноклональные антитела к anti-VCAM-1 [Mardiguian S., et al, 2013, Serres S. et al., 2011] и anti-ICAM1 [Zhang H., 2004]. Serres и соавт. показали, что векторные контрастные агенты способны визуализировать очаги демиелинизации до появления клинических признаков заболевания (на 8 день после иммунизации), что может быть полезно при ранней диагностике рассеянного склероза. Также направленная доставка молекул контрастного агента была показана Zhang и соавт. путем конъюгации к поверхности парамагнитных липосом хелатных комплексов гадолиния и антител к белкам адгезивных контактов ICAM-1 [Zhang, H., 2004]. Полученные парамагнитные липосомы имели высокие значения релаксивности 8,7 мМ-1сек-1 при 2.0 Т (например, релаксивность коммерческого препарата Магневист® 3,4 мМ1сек-1 при 1,0 T) и эффективно накапливались в пораженном очаге при введении очень низких доз контрастного агента (0,007 ммоль Gd/кг против 0,1 ммоль Gd/кг в клинике). Учитывая все эти факторы (селективность, релаксивность, токсичность) нами был предложен подход для создания векторных T1-контрастных агентов на основе хелатных комплексов гадолиния для визуализации патологических очагов головного моза in vivo. Полученные контрастные агенты при конъюгациии с моноклональными антителами к антигенам, 92 гиперэкспрессированным при конкретном заболевании, позволят увеличить концентрацию контрастного агента в патологическом очаге и тем самым улучшить визуализацию. Нами было разработано пять различных конструкций на основе полилизина и хелатных комплексов гадолиния. Полученные конструкции отличались степенью модицификации аминогрупп полилизина и использованием различных хелатирующих агентов (DTPA или DOTA). Разработанные нами Т1-контрастные агенты имеют достаточно высокую релаксивность по сравнению с их соответствующими коммерческими аналогами. Это было достигнуто за счет конъюгации нескольких хелатных комплексов с полилизином, в результате чего уменьшилась вращательная динамика молекулы. Последующее увеличение релаксивности было достигнуто за счет связывания около 10 синтезированных цепей полилизина с хелатными комплексами гадолиния (PLL-DTPA-Gd) с антителом. При данной конъюгации активность, а также антитела позволяли сохраняли свою иммунохимическую высокоселективно транспортировать молекулу коньюгата к клетке-мишени по сравнению с невекторными или неспецифическими контрастными агентами. Более того важно отметить, что полученные контрастные агенты были нетоксичны в исследуемых концентрациях. Все синтезированные препараты не проявляли токсичность, за исключением препарата конъюгата полилизина с соотношением [DTPA]:[Lys]=1:10. Токсичность данного контрастного агента можно связать с высоким положительным зарядом свободных амино групп полилизина (Arnold et al 1979). Благодаря высокой молекулярной массе контрастный агент позволил увеличить время циркуляции в крови по сравнению с коммерческим аналогом. Однако главной задачей было показать возможность диагностики патологических очагов в головном мозге на примере моделей глиомы С6 и купризон-индуцированной демиелинизации с помощью синтезированных 93 контрастных агентов, конъюгированных с моноклональными антителами к Cx43 или GFAP соответственно. Применение препарата анти-Cx43-PLL-DTPA-Gd позволило улучшить контраст на МР-изображениях интракраниальной глиомы благодаря селективному накоплению в опухоли по сравнению с Магневистом и неспецифическим контрастным агентом, а применение контрастного агента у мышей с купризон-индуированной демиелинизацией позволило достоверно увеличить соотношение контраст/шум после введения препаратов, конъюгированных со специфическими антителами к глиофибрилярному кислому белку, по сравнению с контрастными агентами, конъюгированными с неспецифическими иммуноглобулинами. Высокий агентов, уровень накопления конъюгированных с макромолекулярных моноклональными контрастных антителами, можно объяснить с помощью совместного эффекта двух механизмов доставки препаратов: пассивной доставки за счет длительного времени циркуляции контрастного агента в крови и активной доставки за счет специфического связывания контрастного агента с соответствующим антигеном-мишенью на клетках (Cx43 или GFAP). Недостаточное накопление коммерческого аналога Магневист® может быть связано с его быстрой элиминацией из мозга, и неспецифическим контрастного накоплением агента, иммуноглобулинами в окружающих конъюгированного феномен снижения с тканях. В случае неспецифическими соотношения коэффициента контраст/шум может быть связано с неспецифическим распределением контрастного агента и его захватом клетками ретикуло-эндотелиальной системы. Однако, в случае контрастирования опухоли с помощью препарата анти-Cx43-PLL-DTPA-Gd было показано не только улучшение качества контрастирования изображения, но и увеличение визуализируемой площади по сравнению с контрольными образцами (Рисунок 28). В литературе представлены результаты демонстрирующие возможность улучшения качества визуализации границ опухоли с помощью парамагнитных липосом, 94 конъюгированных с моноклональными антителами к эндоглину (CD105), ключевому белку опухолевого ангиогенеза (Qiu et al 2014), а также улучшение параметров визуализации глиом методом МРТ в случае применения дендритных макромолекул на основе лизина, модифицированных с помощью хлоротоксина (Huang et al 2011). Наши результаты достоверно подтверждают возможность улучшения качества диагностики глиом с использованием векторных агентов, конъюгированных с моноклональными антителами к коннексину 43. Однако, одна из самых важных задач - выявление границ глиомы - остается нерешенной. Мы количественно продемонстрировали, высокоселективной визуализации что приводит контрастирования опухолевой ткани применение к повышению систем уровня и сопровождается увеличением визуализируемых границ опухоли. В нашем исследовании мы смогли не только улучшить контраст, но и значительно детализировать область анализа. Сх43-векторные агенты позволили диагностировать не только опухолевый очаг, но и перитуморальное пространство, где происходит инфильтрация и миграция глиомных клеток в окружающие ткани (именно эти клетки являются основной причиной последующих рецидивов). Флюоресцентный анализ перитуморального пространства подтвердил выраженное накопление векторных агентов в мигрирующих глиомных клетках, а также в астроцитах, что свидетельствует об эффективности направленной доставки и создании высокой концентрации векторизованных контрастов в данной области глиомы. Возможно, такой подход окажется эффективным в отношении инвазивной популяции клеток, в том числе при диагностики и терапии резистентных опухолевых фенотипов. Кроме этого, данный агент позволил значительно уменьшить вводимую дозу при сохранении уровня визуализации (0,05 по сравнению с 0,1 ммоль Gd/кг), используя в качестве вектора моноклональные антитела к Сх43. В случае диагностики опухолевых процессов наиболее важной задачей является визуализация размера поражённого очага, а также локализация 95 границ опухоли, тогда же как в случае демиелинизирующих заболеваний основным требованием, предъявляемым к контрастному агенту является сама возможность накопления контрастного препарата в очаге демиелинизации с целью диагностировать его наличие. заболевания очаги демиелинизации Поскольку в начальной стадии могут характеризоваться малым размером, то используемые контрастные агенты иногда не могут достоверно выявить заболевание, так как не достигается эффективно концентрации внутри патологического очага. Предложенный нами подход с использованием препарата анти-GFAP-PLL-DTPA-Gd может позволить обеспечить накопление в патологическом очаге не только за счёт пассивной диффузии, но и за счёт связывания с GFAP-позитивным клетками, активно образующимися в процесс развития склеротической бляшки. В случае изучения визуализации демиелинизирующих очагов нами было показано достоверное увеличение сигнала в области мозолистого тела. Накопление контрастного агента в очаге демиелинизации позволила увеличить контраст изображения и повысить згначения контраст/шум более чем 2 раза, что ведет к более точной оценке размеров очага, его локализации и т.д. Полученные данные позволяют предположить эффективность препаратов на основе конъюгатов антител к GFAP и хелатных комплексов гадолиния для улучшения диагностики рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний. Тем не менее, несмотря на достоинства разработанных контрастных агентов (высокую релаксивность, низкую цитотоксичность, селективное накопление in vitro и in vivo), данные препараты имеют ряд ограничений. Несомненно, для клинического использования контрастность изображения (значения контраст/шум) должны быть улучшены. В свою очередь, это может привести к еще лучшей визуализации, как следствие, более точному диагнозу. Мы считаем, что это возможно за различных модификаций синтезированного контрастного агента (например, использование ПЭГилированных полимеров с оптимальной длины и/или топологией в 96 комплексе с Gd(III), а также использование других хелатирующих агентов, например, DOTA, DO3Aи т.д.). Кроме того, необходимо проанализировать биораспределение, системную токсичность и оценить стабильность полученных агентов после введения в кровоток для лучшего понимания поведения этой системы в организме и оценки его безопасности для дальнейшего использования. Также стоит отметить, что успешное использование всех конъюгатов на основе антител зависит от уровня экспрессии антигенов, что должно быть проанализировано до их использования. Все эти ограничения должны быть приняты во внимание при дальнейшем применении препаратов. Таким образом, использование векторных молекул к целевым белкам для направленной доставки контрастных агентов и молекулярной визуализации является многообещающим направлением в диагностике заболеваний ЦНС. Векторные контрастные агенты обладают важными преимуществами, такими как антиген-направленное накопление в патологическом очаге, низкая токсичность, высокие значения релаксивности и стабильность. Применение таких контрастных направленных систем позволит улучшить качество молекулярной визуализации и неинвазивной диагностики заболеваний ЦНС. 97 Выводы: 1. Ковалентная конъюгация анти-GFAP и Сх43 моноклональных антител и комплекса PLL-DTPA-Gd позволяет получать стабильные в растворе первоначальной активности антител) и обладающие высокими значениями -1сек-1. 2. Иммунофлюоресцентный анализ GFAP выявил высокий уровень его экспрессии в реактивных астроцитах в процессе ремиелинизации при купризоновом моделировании рассеянного склероза на мышах линии С57Bl/6J, а также гиперэкспрессию Сх43 в культуре глиомных клеток, а также на периферии опухоли при моделировании глиобластомы на крысах линии Wistar. 3. Иммунофлюоресцентный анализ взаимодействия конъюгатов контрастного агента на основе PLL-DTPA-Gd с Сх43 и анти-GFAP моноклональными антителами выявил высокую специфичность и эффективность связывания с соответствующими антигенами-мишенями, экспрессированными на клетках глиомы С6 и астроцитах человека соответственно. 4. Векторные Т1-контрастные агенты на основе анти-Cx43 моноклональных антител способны улучшать визуализацию глиомы С6 через 24 часа после в/в введения и эффективнее контрастировать реальные границы опухоли. MРТ контрастных - количественная веществ, оценка проведенная эффективности путем измерения векторных показателя контраст/шум (CNR), показала более чем двукратное увеличение этого показателя в глиоме по отношению к контрольной группе через 24 ч после введения. Иммунофлюоресцентный анализ показал увеличение накопления препарата в головном мозге в 5 раз по сравнению с невекторным контрастным агентом и в 3 раза по сравнению с контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими иммуноглобулинами. 98 5. Векторные Т1-контрастные агенты на основе анти-GFAP моноклональных антител способны улучшать эффективность визуализации очагов демиелинизации при введении контрастного агента в дозе 0,2 ммоль Gd/кг на 4 неделе моделирования рассеянного склероза. MРТ - количественная оценка эффективности векторных контрастных веществ, проведенная путем измерения показателя контраст/шум (CNR), показала более чем трехкратное увеличение этого показателя в области мозолистого тела через 5 часов после введения по сравнению с контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими IgG, или коммерческим аналогом Омнискан®. 99 Благодарности Я хотела бы выразить глубокую благодарность Чехонину Владимиру Павловичу грамотное и чуткое руководство и Нуколовой Наталии Владимировне за методическую помощь, отзывчивость, внимание и поддержку в течение всего времени моей работы. выразить благодарность Шеину С.А. - Также я хотела бы за помощь в моделировании глиобластомы, Гриненко Н. Ф. - за помощь в оценке цитотоксичности изучаемых препаратов, Абакумову М.А. - за помощь в МРТ сканировании и измерении релаксивности, Бычкову Д. и Челушкину П. - в проведении рентгенофлуоресцентного и аминокислотного анализов. Работа была выполнена с использованием оборудования отдела медицинских нанобиотехнологий РНИМУ им.Н.И. Пирогова и отдела фундаментальной нейробиологии ФГБУ “ФМИЦПН” Минздрава РФ (НОЦ “Медицинские нанобиотехнологии”). Я благодарна заведующей вивария ФГБУ “ФМИЦПН” Минздрава РФ Ионовой Клавдии Павловне и всем моим коллегам за помощь в осуществлении данной работы. Данная работа была выполнена при финансовой поддержке гранта УМНИК Фонда содействия малых форм предприятий и гранта РНФ №14-1500698 (разработка протоколов МРТ сканирования). 100 Список литературы 1. Abakumova TO, Kuz'kina AA, Zharova MV, Pozdeeva DA, Gubskii IL, et al. 2015. Cuprizone Model as a Tool for Preclinical Studies of the Efficacy of Multiple Sclerosis Diagnosis and Therapy. Bulletin of experimental biology and medicine 159: 111-5 2. Aime S, Gianolio E, Uggeri F, Tagliapietra S, Barge A, Cravotto G. 2006. New paramagnetic supramolecular adducts for MRI applications based on non-covalent interactions between Gd(III)-complexes and beta- or gammacyclodextrin units anchored to chitosan. Journal of inorganic biochemistry 100: 931-8 3. Andersen IK, Szymkowiak A, Rasmussen CE, Hanson LG, Marstrand JR, et al. 2002. Perfusion quantification using Gaussian process deconvolution. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine 48: 351-61 4. Arnold LJ, Jr., Dagan A, Gutheil J, Kaplan NO. 1979. Antineoplastic activity of poly(L-lysine) with some ascites tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76: 3246-50 5. Baklaushev VP, Gurina OI, Yusubalieva GM, Dmitriev RI, Makarov AV, Chekhonin VP. 2009a. Isolation of extracellular recombinant fragment of rat connexin-43. Bulletin of experimental biology and medicine 148: 389-93 6. Baklaushev VP, Gurina OI, Yusubalieva GM, Grinenko NF, Cytrin EB, et al. 2009b. Immunofluorescent analysis of connexin-43 using monoclonal antibodies to its extracellular domain. Bulletin of experimental biology and medicine 148: 725-30 7. Baklaushev VP, Yusubalieva GM, Tsitrin EB, Gurina OI, Grinenko NP, et al. 2011. Visualization of Connexin 43-positive cells of glioma and the periglioma zone by means of intravenously injected monoclonal antibodies. Drug delivery 18: 331-7 101 8. Banci L BI, Luchinat C. . 1991. Nuclear and Electronic Relaxation. 9. Bandeira N, Pham V, Pevzner P, Arnott D, Lill JR. 2008. Automated de novo protein sequencing of monoclonal antibodies. Nature biotechnology 26: 1336-8 10.Bangert V, Mansfield P, Coupland RE. 1981. Whole-body tomographic imaging by NMR. The British journal of radiology 54: 152-4 11.Bates DC, Sin WC, Aftab Q, Naus CC. 2007. Connexin43 enhances glioma invasion by a mechanism involving the carboxy terminus. Glia 55: 1554-64 12.Bellin MF, Van Der Molen AJ. 2008. Extracellular gadolinium-based contrast media: an overview. European journal of radiology 66: 160-7 13.Benardais K, Kotsiari A, Skuljec J, Koutsoudaki PN, Gudi V, et al. 2013. Cuprizone [bis(cyclohexylidenehydrazide)] is selectively toxic for mature oligodendrocytes. Neurotoxicity research 24: 244-50 14.Benda P, Lightbody J, Sato G, Levine L, Sweet W. 1968. Differentiated rat glial cell strain in tissue culture. Science 161: 370-1 15.Bogdanov AA, Jr., Weissleder R, Frank HW, Bogdanova AV, Nossif N, et al. 1993. A new macromolecule as a contrast agent for MR angiography: preparation, properties, and animal studies. Radiology 187: 701-6 16.Brasch RC. 1991. Rationale and applications for macromolecular Gd-based contrast agents. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine 22: 282-7; discussion 300-3 17.Burtea C, Laurent S, Vander Elst L, Muller RN. 2008. Contrast agents: magnetic resonance. Handbook of experimental pharmacology: 135-65 18.Caravan P. 2006. Strategies for increasing the sensitivity of gadolinium based MRI contrast agents. Chem Soc Rev 35: 512-23 19.Caravan P, Farrar CT, Frullano L, Uppal R. 2009. Influence of molecular parameters and increasing magnetic field strength on relaxivity of gadolinium- and manganese-based T1 contrast agents. Contrast media & molecular imaging 4: 89-100 102 20.Carr DH, Brown J, Bydder GM, Weinmann HJ, Speck U, et al. 1984. Intravenous chelated gadolinium as a contrast agent in NMR imaging of cerebral tumours. Lancet 1: 484-6 21.Chekhonin VP, Baklaushev VP, Yusubalieva GM, Belorusova AE, Gulyaev MV, et al. 2012. Targeted delivery of liposomal nanocontainers to the peritumoral zone of glioma by means of monoclonal antibodies against GFAP and the extracellular loop of Cx43. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine 8: 63-70 22.Chekhonin VP, Baklaushev VP, Yusubalieva GM, Pavlov KA, Ukhova OV, Gurina OI. 2007. Modeling and immunohistochemical analysis of C6 glioma in vivo. Bulletin of experimental biology and medicine 143: 501-9 23.Claussen C, Laniado M, Kazner E, Schorner W, Felix R. 1985a. Application of contrast agents in CT and MRI (NMR): their potential in imaging of brain tumors. Neuroradiology 27: 164-71 24.Claussen C, Laniado M, Schorner W, Niendorf HP, Weinmann HJ, et al. 1985b. Gadolinium-DTPA in MR imaging of glioblastomas and intracranial metastases. AJNR. American journal of neuroradiology 6: 669-74 25.D'Onofrio M, Gianolio E, Ceccon A, Arena F, Zanzoni S, et al. 2012. High relaxivity supramolecular adducts between human-liver fatty-acid-binding protein and amphiphilic Gd(III) complexes: structural basis for the design of intracellular targeting MRI probes. Chemistry 18: 9919-28 26.Djozan DJ, Farajzadeh MA. 1992. The use of fluorescamine (Fluram) in fluorimetric trace analysis of primary amines of pharmaceutical and biological interest. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 10: 1063-7 27.Doblas S, Saunders D, Kshirsagar P, Pye Q, Oblander J, et al. 2008. Phenyltert-butylnitrone induces tumor regression and decreases angiogenesis in a C6 rat glioma model. Free radical biology & medicine 44: 63-72 28.Eldredge HB, Spiller M, Chasse JM, Greenwood MT, Caravan P. 2006. Species dependence on plasma protein binding and relaxivity of the 103 gadolinium-based MRI contrast agent MS-325. Investigative radiology 41: 229-43 29.Eng LF, Ghirnikar RS. 1994. GFAP and astrogliosis. Brain Pathol 4: 229-37 30.Frullano L, Caravan P. 2011. Strategies for the preparation of bifunctional gadolinium(III) chelators. Current organic synthesis 8: 535-65 31.Frullano L, Zhu J, Miller RH, Wang Y. 2013. Synthesis and characterization of a novel gadolinium-based contrast agent for magnetic resonance imaging of myelination. Journal of medicinal chemistry 56: 1629-40 32.Gaumet M, Vargas A, Gurny R, Delie F. 2008. Nanoparticles for drug delivery: the need for precision in reporting particle size parameters. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V 69: 1-9 33.Geraldes CF, Laurent S. 2009. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast media & molecular imaging 4: 1-23 34.Geurts JJ, Bo L, Roosendaal SD, Hazes T, Daniels R, et al. 2007. Extensive hippocampal demyelination in multiple sclerosis. Journal of neuropathology and experimental neurology 66: 819-27 35.Giesel FL, Mehndiratta A, Essig M. 2010. High-relaxivity contrast-enhanced magnetic resonance neuroimaging: a review. European radiology 20: 246174 36.Granato L, Laurent S, Vander Elst L, Djanashvili K, Peters JA, Muller RN. 2011. The Gd3+ complex of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10tetraacetic acid mono(p-isothiocyanatoanilide) conjugated to inulin: a potential stable macromolecular contrast agent for MRI. Contrast media & molecular imaging 6: 482-91 37.Grobben B, De Deyn PP, Slegers H. 2002. Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. Cell and tissue research 310: 257-70 104 38.Gudi V, Gingele S, Skripuletz T, Stangel M. 2014. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in cellular neuroscience 8: 73 39.Gupta H, Wilkinson RA, Bogdanov AA, Jr., Callahan RJ, Weissleder R. 1995. Inflammation: imaging with methoxy poly(ethylene glycol)-poly-Llysine-DTPA, a long-circulating graft copolymer. Radiology 197: 665-9 40.H.M. S. 1985. Practical Flow Cytometry. .N.Y.: Alan Liss. 41.Hesselink JR, Healy ME, Press GA, Brahme FJ. 1988. Benefits of GdDTPA for MR imaging of intracranial abnormalities. Journal of computer assisted tomography 12: 266-74 42.Hesselink JR, Press GA. 1988. MR contrast enhancement of intracranial lesions with Gd-DTPA. Radiologic clinics of North America 26: 873-87 43.Hol EM, Pekny M. 2015. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Current opinion in cell biology 32C: 121-30 44.Huang CH, Tsourkas A. 2013. Gd-based macromolecules and nanoparticles as magnetic resonance contrast agents for molecular imaging. Current topics in medicinal chemistry 13: 411-21 45.Huang H, Yue T, Xu K, Golzarian J, Yu J, Huang J. 2015. Fabrication and evaluation of tumor-targeted positive MRI contrast agent based on ultrasmall MnO nanoparticles. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces 131: 148-54 46.Huang R, Han L, Li J, Liu S, Shao K, et al. 2011. Chlorotoxin-modified macromolecular contrast agent for MRI tumor diagnosis. Biomaterials 32: 5177-86 47.Huang Y, Hu L, Zhang T, Zhong H, Zhou J, et al. 2013. Mn(3)[Co(CN)(6)](2)@SiO(2) core-shell nanocubes: novel bimodal contrast agents for MRI and optical imaging. Scientific reports 3: 2647 105 48.Jacobs KE, Behera D, Rosenberg J, Gold G, Moseley M, et al. 2012. Oral manganese as an MRI contrast agent for the detection of nociceptive activity. NMR in biomedicine 25: 563-9 49.Jones KH, Ford DV, Jones PA, John A, Middleton RM, et al. 2012. A largescale study of anxiety and depression in people with Multiple Sclerosis: a survey via the web portal of the UK MS Register. PloS one 7: e41910 50.Jung JH, Choi Y, Jung J, Kim S, Lim HK, et al. 2015. Development of PET/MRI with insertable PET for simultaneous PET and MR imaging of human brain. Medical physics 42: 2354 51.Kjaer A, Loft A, Law I, Berthelsen AK, Borgwardt L, et al. 2013. PET/MRI in cancer patients: first experiences and vision from Copenhagen. MAGMA 26: 37-47 52.Knopp MV, von Tengg-Kobligk H, Floemer F, Schoenberg SO. 1999. Contrast agents for MRA: future directions. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI 10: 314-6 53.Koenig SH BR. 1990. Field-cycling relaxometry of protein solutions and tissue: implication for MRI. Prog. Nucl. Magn.Reson. Spectr. 22: 487–567 54.Kondo A, Nakano T, Suzuki K. 1987. Blood-brain barrier permeability to horseradish peroxidase in twitcher and cuprizone-intoxicated mice. Brain research 425: 186-90 55.Kornguth S, Anderson M, Turski P, Sorenson J, Robins HI, et al. 1990. Glioblastoma multiforme: MR imaging at 1.5 and 9.4 T after injection of polylysine-DTPA-Gd in rats. AJNR. American journal of neuroradiology 11: 313-8 56.Koutsoudaki PN, Skripuletz T, Gudi V, Moharregh-Khiabani D, Hildebrandt H, et al. 2009. Demyelination of the hippocampus is prominent in the cuprizone model. Neuroscience letters 451: 83-8 57.Langer R. 1998. Drug delivery and targeting. Nature 392: 5-10 58.Lauterbur PC. 1973. Image Formation by Induced Local Interactions: Examples Employing Nuclear Magnetic Resonance. Nature 242: 190 - 91 106 59.Li K, Wen S, Larson AC, Shen M, Zhang Z, et al. 2013. Multifunctional dendrimer-based nanoparticles for in vivo MR/CT dual-modal molecular imaging of breast cancer. International journal of nanomedicine 8: 2589-600 60.Lim J, Turkbey B, Bernardo M, Bryant LH, Jr., Garzoni M, et al. 2012. Gadolinium MRI contrast agents based on triazine dendrimers: relaxivity and in vivo pharmacokinetics. Bioconjugate chemistry 23: 2291-9 61.Maeda H. 2001. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: The key role of tumor-selective macromolecular drug targeting In Advances in Enzyme Regulation, Vol 41, ed. G Weber, pp. 189207 62.Mansfield P, Maudsley AA. 1977. Medical imaging by NMR. The British journal of radiology 50: 188-94 63.Miller DH, Grossman RI, Reingold SC, McFarland HF. 1998. The role of magnetic resonance techniques in understanding and managing multiple sclerosis. Brain : a journal of neurology 121 ( Pt 1): 3-24 64.Mitsumori LM, Bhargava P, Essig M, Maki JH. 2014. Magnetic resonance imaging using gadolinium-based contrast agents. Top Magn Reson Imaging 23: 51-69 65.Mohs AM, Lu ZR. 2007. Gadolinium(III)-based blood-pool contrast agents for magnetic resonance imaging: status and clinical potential. Expert opinion on drug delivery 4: 149-64 66.MSIF. 2013. Atlas of Multiple Sclerosis. p. 6 67.Neuwelt A, Sidhu N, Hu CA, Mlady G, Eberhardt SC, Sillerud LO. 2015. Iron-based superparamagnetic nanoparticle contrast agents for MRI of infection and inflammation. AJR. American journal of roentgenology 204: W302-13 68.Opsahl LR, Uzgiris EE, Vera DR. 1995. Tumor imaging with a macromolecular paramagnetic contrast agent: gadopentetate dimegluminepolylysine. Academic radiology 2: 762-7 107 69.Oudkerk M, Sijens PE, Van Beek EJ, Kuijpers TJ. 1995. Safety and efficacy of dotarem (Gd-DOTA) versus magnevist (Gd-DTPA) in magnetic resonance imaging of the central nervous system. Investigative radiology 30: 75-8 70.Pacheco-Torres J, Calle D, Lizarbe B, Negri V, Ubide C, et al. 2011. Environmentally sensitive paramagnetic and diamagnetic contrast agents for nuclear magnetic resonance imaging and spectroscopy. Current topics in medicinal chemistry 11: 115-30 71.Papadopoulos D, Dukes S, Patel R, Nicholas R, Vora A, Reynolds R. 2009. Substantial archaeocortical atrophy and neuronal loss in multiple sclerosis. Brain Pathol 19: 238-53 72.Poloni G, Minagar A, Haacke EM, Zivadinov R. 2011. Recent developments in imaging of multiple sclerosis. The neurologist 17: 185-204 73.Qiu LH, Zhang JW, Li SP, Xie C, Yao ZW, Feng XY. 2014. Molecular imaging of angiogenesis to delineate the tumor margins in glioma rat model with endoglin-targeted paramagnetic liposomes using 3T MRI. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI 74.Ransohoff RM. 2012. Animal models of multiple sclerosis: the good, the bad and the bottom line. Nature neuroscience 15: 1074-7 75.Rocca MA, Anzalone N, Falini A, Filippi M. 2013. Contribution of magnetic resonance imaging to the diagnosis and monitoring of multiple sclerosis. La Radiologia medica 118: 251-64 76.Rubin DL, Desser TS, Semelka R, Brown J, Nghiem HV, et al. 1999. A multicenter, randomized, double-blind study to evaluate the safety, tolerability, and efficacy of OptiMARK (gadoversetamide injection) compared with Magnevist (gadopentetate dimeglumine) in patients with liver pathology: results of a Phase III clinical trial. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI 9: 240-50 108 77.Runge VM, Clanton JA, Price AC, Wehr CJ, Herzer WA, et al. 1985a. The use of Gd DTPA as a perfusion agent and marker of blood-brain barrier disruption. Magnetic resonance imaging 3: 43-55 78.Runge VM, Kaufman DM, Wood ML, Adelman LS, Jacobson S. 1989. Experimental trials with Gd(DO3A)--a nonionic magnetic resonance contrast agent. International journal of radiation applications and instrumentation. Part B, Nuclear medicine and biology 16: 561-7 79.Runge VM, Schoerner W, Niendorf HP, Laniado M, Koehler D, et al. 1985b. Initial clinical evaluation of gadolinium DTPA for contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Magnetic resonance imaging 3: 27-35 80.Saito R, Bringas JR, McKnight TR, Wendland MF, Mamot C, et al. 2004. Distribution of liposomes into brain and rat brain tumor models by convection-enhanced delivery monitored with magnetic resonance imaging. Cancer research 64: 2572-9 81.Sassoon I, Blanc V. 2013. Antibody-drug conjugate (ADC) clinical pipeline: a review. Methods Mol Biol 1045: 1-27 82.Schuhmann-Giampieri G, Schmitt-Willich H, Frenzel T, Press WR, Weinmann HJ. 1991. In vivo and in vitro evaluation of Gd-DTPApolylysine as a macromolecular contrast agent for magnetic resonance imaging. Investigative radiology 26: 969-74 83.Sicotte NL, Kern KC, Giesser BS, Arshanapalli A, Schultz A, et al. 2008. Regional hippocampal atrophy in multiple sclerosis. Brain : a journal of neurology 131: 1134-41 84.Singh R, Lillard JW, Jr. 2009. Nanoparticle-based targeted drug delivery. Exp Mol Pathol 86: 215-23 85.Sipkins DA, Cheresh DA, Kazemi MR, Nevin LM, Bednarski MD, Li KC. 1998. Detection of tumor angiogenesis in vivo by alphaVbeta3-targeted magnetic resonance imaging. Nature medicine 4: 623-6 109 86.Smith ME, Eng LF. 1987. Glial fibrillary acidic protein in chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice. Journal of neuroscience research 18: 203-8 87.Solly F, Fish R, Simard B, Bolle N, Kruithof E, et al. 2008. Tissue-type plasminogen activator has antiangiogenic properties without effect on tumor growth in a rat C6 glioma model. Cancer gene therapy 15: 685-92 88.Storey P, Lim RP, Chandarana H, Rosenkrantz AB, Kim D, et al. 2012. MRI assessment of hepatic iron clearance rates after USPIO administration in healthy adults. Investigative radiology 47: 717-24 89.Suzuki K, Kikkawa Y. 1969. Status spongiosus of CNS and hepatic changes induced by cuprizone (biscyclohexanone oxalyldihydrazone). The American journal of pathology 54: 307-25 90.Sze G, Brant-Zawadzki M, Haughton VM, Maravilla KR, McNamara MT, et al. 1991. Multicenter study of gadodiamide injection as a contrast agent in MR imaging of the brain and spine. Radiology 181: 693-9 91.Tamura H, Yanagawa I, Hikichi T, Matsumoto K, Takahashi S, Sakamoto K. 1995. T1 measurements with clinical MR units. The Tohoku journal of experimental medicine 175: 249-67 92.Tatsumi M, Yamamoto S, Imaizumi M, Watabe T, Kanai Y, et al. 2012. Simultaneous PET/MR body imaging in rats: initial experiences with an integrated PET/MRI scanner. Annals of nuclear medicine 93.Torchilin VP. 2002. PEG-based micelles as carriers of contrast agents for different imaging modalities. Advanced drug delivery reviews 54: 235-52 94.W. SL. 1998. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. Amsterdam: Elsvier Science Publishers B. V. 95.WAGONER MV, WORAH D. 1993. Gadodiamide Injection: First Human Experience with the Nonionic Magnetic Resonance Imaging Enhancement Agent. Investigative radiology 28: S44-S48 110 96.Weissleder R, Wang YM, Papisov M, Bogdanov A, Schaffer B, et al. 1993. Polymeric contrast agents for MR imaging of adrenal glands. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI 3: 93-7 97.Wolburg H, Noell S, Fallier-Becker P, Mack AF, Wolburg-Buchholz K. 2012. The disturbed blood-brain barrier in human glioblastoma. Molecular aspects of medicine 33: 579-89 98.Yoshii Y, Komatsu Y, Yamada T, Hyodo A, Nose T, Kobayashi E. 1992. Malignancy and viability of intraparenchymal brain tumours: correlation between Gd-DTPA contrast MR images and proliferative potentials. Acta neurochirurgica 117: 187-94 99.Zhang H. 2004. Anti-ICAM-1 antibody-conjugated paramagnetic liposomes In Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). Bethesda (MD) 100. Zhang J, Jones MV, McMahon MT, Mori S, Calabresi PA. 2012. In vivo and ex vivo diffusion tensor imaging of cuprizone-induced demyelination in the mouse corpus callosum. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine 67: 750-9 101. Zhao S, Zhang X, Zhang J, Zou H, Liu Y, et al. 2008. Intravenous administration of arsenic trioxide encapsulated in liposomes inhibits the growth of C6 gliomas in rat brains. J Chemother 20: 253-62 102. Zhou Z, Lu ZR. 2012. Gadolinium-based contrast agents for magnetic resonance cancer imaging. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol 103. М. Б. 1983. Концепция гематоэнцефалического барьера. 104. Петер РА. Магнитный резонанс в медицине. 105. Сорокина К.Н. ТАА, Толстикова Т.Г., Усов В.Ю. 2011. Современные подходы к созданию контрастных препаратов для магнитно-резонансной томографической диагностики. Бюллетень сибирской медицины № 6: с.79-86 111 112
