диссертация Труниной - Саратовский государственный
advertisement
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» На правах рукописи Трунина Наталья Андреевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ИММЕРСИОННЫХ АГЕНТОВ И НАНОЧАСТИЦ МЕТОДАМИ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ И НЕЛИНЕЙНОЙ МИКРОСКОПИИ 03.01.02- биофизика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель доктор физико-математических наук, профессор Тучин Валерий Викторович Саратов - 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений 1. ВВЕДЕНИЕ 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Оптическая когерентная томография 2.2.Нелинейная микроскопия 2.2.1. Микроскопия с использованием генерации второй гармоники 2.2.2. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением 3. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1.Диффузия химических агентов в биотканях 3.2.Просветление биотканей при диффузии иммерсионных агентов 3.3.Строение тканей зуба и использование ОКТ для их исследования 3.3.1. Основные сведения о строении зуба 3.3.2. Использование ОКТ для исследования тканей зуба 3.4.Строение ногтя пальца человека и применение ОКТ для его исследования 3.5.Строение жировой ткани и проблема разрушения адипоцитов 4. ОКТ МОНИТОРИНГ ДИФФУЗИИ ИММЕРСИОННЫХ АГЕНТОВ В ОБРАЗЦАХ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO 4.1.Подготовка образцов 4.2.Схема экспериментальной установки и методика обработки результатов 4.2.1. Описание экспериментальной установки 4 5 21 21 30 31 4.2.2. Обработка полученных данных. Модель формирования сигнала ОКТ 61 4.3.Результаты измерений и их обсуждение 4.3.1. Мониторинг проникновения воды и глицерина в ткани зуба методом ОКТ 4.3.2. Исследование изменений дентина под действием глюкозы методом ОКТ 32 35 35 39 40 40 46 49 52 56 56 57 57 66 66 70 3 5. ОКТ ИЗМЕРЕНИЯ В ТКАНЯХ НОГТЯ IN VIVO И ОБРАЗЦАХ ЖИРОВОЙ ТКАНИ 5.1.ОКТ визуализация тканей пальца человека 74 5.2.ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой ткани 6. МОДЕЛЬНЫЕ РАСЧЕТЫ ПРОНИЦАЕМОСТИ ДЕНТИНА И ФОРМИРОВАНИЯ СИГНАЛА ОКТ В ПРОЦЕССЕ ОПТИЧЕСКОГО ПРОСВЕТЛЕНИЯ 6.1.Модельный расчет проницаемости дентина для химических агентов 6.2.Численное моделирование нестационарного сигнала ОКТ, формирующегося в процессе оптического просветления рассеивающей среды 7. ОПТИЧЕСКИЙ МОНТОРИНГ ПРОНИКНОВЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ В ОБРАЗЦЫ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO 7.1.Изменения формы ОКТ сигнала после ультразвукового воздействия на образцы тканей зуба, погруженные во взвесь наночастиц 7.2.Нелинейная микроскопия проникновения наночастиц в образцы тканей зуба 8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 83 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 126 74 92 92 98 106 108 111 122 4 Список сокращений БЗ - бриллиантовый зеленый (краситель); ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения; ГВГ - генерация второй гармоники; ГРР - гиперрэлеевское рассеяние; ИЗ - индоцианиновый зеленый (краситель); ИК - инфракрасный; ЛКСМ - лазерная конфокальная сканирующая микроскопия; НКИ - низкокогерентная интерферометрия; ОКТ - оптическая когерентная томография; ПЗС - прибор с зарядовой связью; СОКТ - спектроскопическая оптическая когерентная томография; СЭМ - сканирующий электронный микроскоп; УЗ - ультразвук, ультразвуковой; УЗИ - ультразвуковое изображение; ФВДП - флуоресценция, возбуждаемая двухфотонным поглощением; ФД/ТМ - фотодинамический/тепловой метод; ФЭУ - фотоэлектронный умножитель; 5 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Изучение транспорта химических агентов в биологических тканях, в том числе в твердых тканях, является важной задачей по ряду причин. Первой из них является необходимость изучения метаболических процессов, осуществляемых посредством диффузии. Вторая причина связана с диагностикой биоткани оптическими методами, в частности, с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ). Основным препятствием для проникновения оптического излучения вглубь биологической ткани является рассеяние света на структурных элементах, показатель преломления которых отличается от показателя преломления базового вещества. Уменьшить рассеяние можно путем введения в биоткань химических агентов, выравнивающих указанные показатели преломления (метод оптического просветления). Исследование проницаемости биотканей человека по отношению к различным агентам и лекарственным препаратам представляет интерес в широком контексте проблем, связанных с их лечением и косметологическим уходом. Одним из возможных методов изучения распространения химических агентов в биотканях является метод ОКТ, который в настоящее время является одним из наиболее перспективных и развивающихся методов неинвазивной диагностики оптически неоднородных сред. Основой метода является интерферометрическая регистрация низкокогерентного оптического излучения, отраженного от различных слоев биоткани. По сравнению с другими распространенными системами визуализации внутренней структуры объекта, такими как рентгеновская, магнитно-резонансная и ультразвуковая томография, ОКТ имеет преимущества по безопасности использования, стоимости оборудования, контрасту и разрешению получаемых изображений. Метод ОКТ исходно предназначен для визуализации, однако, обработка цифровых ОКТ-изображений позволяет извлечь количественные данные об оптических параметрах рассеивающей биоткани и ее морфологическом и функциональном состоянии. Такие исследования уже проводились, но для 6 ограниченного числа биотканей (кровь, склера глаза, эпителий). Распространение данного подхода на более широкий круг биотканей, к которым относятся эмаль и дентин зуба, ткани ногтя и жировая ткань, является актуальной задачей. Среди применений ОКТ в стоматологии преобладает визуализация структуры тканей зубов и полости рта in vivo для оценки их состояния по полученным изображениям. Мониторинг проникновения химических агентов в ткани зуба на основе математической обработки цифровых ОКТ изображений - новая и актуальная задача. Проникновение в ткани зуба наночастиц - не менее важная проблема, чем транспорт химических агентов. С введением наночастиц в тубулы дентина связана разработка Внедренные усиливать методов наночастицы снижения могут фотодинамическое гиперчувствительности оказывать воздействие, бактерицидное выполнять зуба. действие, косметические функции, способствуя отбеливанию. В связи с этим актуальной задачей является развитие оптических методов для простого и неинвазивного контроля доставки наночастиц в ткань зуба. В качестве таковых представляет интерес использовать ОКТ и нелинейную микроскопию, также дающую послойное изображение, но с более высоким разрешением, достаточным для прямой визуализации наночастиц. В силу доступности и особенностей строения ноготь пальца человека является удобным и популярным объектом ОКТ-визуализации in vivo. Как и в стоматологии, полученные изображения затем используются для дифференциальной диагностики заболеваний ногтя. Актуальной задачей является применить ОКТ для изучения таких внешних воздействий на ткани ногтя in vivo (механическое сжатие, нанесение иммерсионного агента), которые могут вызывать оптическое просветление. Новые возможности можно ожидать от использования как видимых изменений самих ОКТ изображений, так и результатов их цифровой обработки в виде 7 количественных оценок изменений геометрических и оптических параметров биотканей ногтя. Действие оптического излучения, усиленное введением в биоткань красителя, в последнее время широко изучается в связи с целым рядом биомедицинских приложений, одно из которых – снижение количества жировых клеток, что представляет собой важную часть медицинских программ по борьбе с ожирением. Значительные размеры адипоцитов позволяют получать ОКТ изображения жировой ткани, на которых отдельные клетки хорошо видны, что открывает уникальную возможность использовать ОКТ для мониторинга последствий фотодинамического воздействия в реальном времени на клеточном уровне. Такое применение ОКТ является актуальной задачей, а полученные ОКТ-изображения могут быть количественно обработаны с целью ответа на важный вопрос о том, что происходит с отдельными адипоцитами при фотодинамическом или ином воздействии. Цель работы - изучить процессы доставки химических агентов и наночастиц в биоткани путем ОКТ-визуализации с цифровой обработкой изображений для количественного определения диффузионных и оптических свойств биотканей и их изменений под действием внешних факторов, а также с помощью нелинейной микроскопии. Основные объекты - образцы тканей зуба человека и жировой ткани in vitro, а также ткани ногтя пальца человека in vivo. Задачи исследования: ОКТ-мониторинг проникновения вызывающих оптическое просветление химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы in vitro дентина зуба человека и оценка коэффициентов проницаемости по скорости изменения среднего наклона А-скана. Оценка оптических параметров эпителиальных и фиброзных тканей под ногтем пальца человека in vivo и их изменений под действием 8 просветляющего агента и механического сжатия с помощью цифровой обработки ОКТ изображений. ОКТ-мониторинг последствий фотодинамического воздействия на образцы жировой ткани in vitro в реальном времени на клеточном уровне Расчет проницаемости дентина по отношению к воде и перекиси водорода как функции размеров тубул и плотности их числа на основе простой модели тубулярной структуры. Разработка модели и численный расчет пространственно-временного поведения сигнала ОКТ при диффузии иммерсионного агента в макроскопически-неоднородной рассеивающей среде на основе численного решения уравнения диффузии с учетом зависимости сечения рассеяния назад от концентрации агента. Определение глубины проникновения наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека методами ОКТ и нелинейной микроскопии. Научная новизна работы: • Методика оценки коэффициента проницаемости по скорости изменения среднего наклона сигнала ОКТ во времени впервые применена к проникновению оптически просветляющих химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы in vitro дентина зуба человека. • Оценки коэффициентов ослабления света эпителиальными и фиброзными тканями под ногтем пальца человека in vivo впервые получены по результатам обработки ОКТ-изображений, продемонстрированы и оценены их изменения под действием просветляющего агента (глицерин) и механического сжатия. • Впервые осуществлен ОКТ-мониторинг долговременных (десятки и сотни минут) последствий совместного воздействия света и красителя на образцы жировой ткани in vitro на клеточном уровне. 9 • С помощью простой модели тубулярной структуры дентина впервые рассчитаны зависимости коэффициентов проницаемости дентина по отношению к воде и перекиси водорода от диаметра и плотности числа тубул. • На основе численного решения уравнения диффузии и известной теории формирования ОКТ сигнала в рассеивающей среде с заданными параметрами построена математическая модель эволюции ОКТ сигнала в процессе диффузии иммерсионного агента. В отличие от известных аналитических решений, модель применима к макроскопически неоднородным средам. Показано, что уменьшение сечения рассеяния назад при оптическом просветлении может приводить к немонотонному поведению сигнала ОКТ даже в макроскопически однородной среде. • Впервые обнаружены заметные изменения формы усредненного сигнала ОКТ после длительной ультразвуковой обработки образца дентина зуба человека, погруженного во взвесь наночастиц TiO2. Впервые исследовано проникновение наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека методами нелинейной микроскопии. Научная и практическая значимость результатов работы заключается в следующем: Доказана возможность использования серийного портативного оптического когерентного томографа THORLABS Spectral Radar OCT, исходно предназначенного для получения изображений биотканей in vivo в условиях медицинского учреждения, для решения фундаментальной биофизической задачи - мониторинга оптических, диффузионных и морфологических характеристик дентина и эмали зуба человека, тканей ногтя и жировой ткани в реальном времени при воздействии внешних факторов (аппликация иммерсионного агента или взвеси наночастиц, механическое сжатие, фотодинамическое воздействие). Исследования диффузии просветляющих агентов в образцах дентина зуба человека подтвердили, что калибровка сигнала ОКТ, существенная для оценки коэффициента ослабления по его наклону, мало сказывается на 10 характерном времени изменения указанного наклона и, следовательно, на оценке коэффициента проницаемости, которая является достаточно универсальной. Исследования тканей ногтя человека показывают, что с помощью ОКТ можно проводить не только визуализацию подобных биотканей in vivo, но и количественно определять относительные изменения оптических характеристик (коэффициента ослабления) под действием просветляющего агента или механического сжатия, что расширяет сферу практического (и в отдаленной перспективе, клинического) применения ОКТ. Выполненные автором диссертации ОКТ исследования образцов жировой ткани человека были использованы для получения дополнительной информации о механизмах фотодинамического воздействия на жировую ткань, что важно для медицинских исследований, направленных на борьбу с ожирением. Реализованная в виде численного алгоритма и программы модель формирования сигнала ОКТ в среде, испытывающей оптическое просветление в результате диффузии иммерсионного агента, применима к неоднородным средам и может быть полезна как для интерпретации будущих экспериментов, так и для использования в алгоритмах решения обратной задачи извлечения исходных оптических и диффузионных параметров среды из данных ОКТ-измерений. Помимо демонстрации возможностей оптического мониторинга проникновения наночастиц в образцы дентина и эмали зуба человека, практическая важность полученных в этом направлении результатов состоит в том, что они указывают на низкую эффективность «спонтанного» внедрения наночастиц в дентин и, тем более, эмаль зуба при погружении во взвесь наночастиц или при нанесении таковой на поверхность зуба и убеждают в необходимости поиска дополнительных мер интенсификации этого процесса. На защиту выносятся следующие положения: 11 1. При исследовании плотных сильно рассеивающих биотканей (ткани зуба и ногтя человека) методика обработки цифровых ОКТ изображений, основанная на усреднении сигнала по группе А-сканов, позволяет лучше выявить как структурные элементы биоткани, так и сравнительно небольшие изменения сигнала ОКТ, вызванные внешними воздействиями (аппликация иммерсионного агента, механическое давление) и слабо различимые визуально на исходном ОКТ изображении. 2. Методика обработки цифровых ОКТ-изображений с расчетом усредненного А-скана позволяет проводить мониторинг проникновения химических агентов в образцы тканей зуба человека по изменению среднего наклона сигнала ОКТ в реальном времени. Получаемые в результате постоянная времени насыщения и коэффициент проницаемости значительно менее чувствительны к калибровке сигнала, вкладу многократного рассеяния, а также наличию и характеру макроскопической неоднородности биоткани, чем сам наклон сигнала ОКТ и определяемый по нему коэффициент ослабления света биотканью. 3. Как показывает численное моделирование пространственно-временного поведения сигнала ОКТ в среде, где происходит диффузия иммерсионного агента, учет зависимости сечения рассеяния назад от концентрации агента существенно сказывается на пространственном поведении сигнала ОКТ и может приводить появлению на А-скане максимума, который является индикатором указанного влияния. 4. Длительное (несколько суток) содержание срезов дентина и эмали зуба человека во взвеси наночастиц TiO2 с периодическим (несколько раз в сутки) включением ультразвука приводит к заметным (до 5 дБ) изменениям формы усредненного А-скана ОКТ на глубинах, достигающих сотен микрометров. Эти данные свидетельствуют о проникновении наночастиц в образцы, но их недостаточно для оценки глубины проникновения, которая может быть завышена за счет многократного рассеяния. Прямая визуализация внедренных наночастиц методами нелинейной микроскопии показывает, что при 12 небольших (до 30 минут) длительностях УЗ обработки срезов зуба человека, погруженных в суспензию наночастиц, глубина проникновения наночастиц ZnO в срезы дентина достигает десятков микрометров, а для наночастиц TiO2 на порядок меньше, что можно объяснить большей степенью агрегации последних. Достоверность результатов вытекает, прежде всего, из корректного использования современных и предварительно апробированных приборов и методик исследования (спектральный оптический когерентный томограф THORLABS Spectral Radar OCT (США); двухфотонный томограф JenLab GmbH (Германия) с титан-сапфировым фемтосекундным лазером Mai Tai XF, Spectra Physics (США), оптические и электронные микроскопы и др.). При обработке результатов использовались пакеты прикладных программ, математические модели, и приближения, апробированные ранее другими авторами на родственных объектах. Там, где позволяли условия эксперимента, измерения проводились многократно с последующим статистическим усреднением. Результаты и выводы согласуются с современными представлениями о механизмах изученных процессов и опубликованными результатами других авторов, полученными с помощью альтернативных методов. Личный вклад автора диссертации состоит в участии в постановке задач и планировании исследований совместно с научным руководителем проф. Тучиным В.В., в проведении экспериментов и обработке их данных, в проведении расчетов при математическом моделировании процессов, в написании и подготовке текстов статей к публикации. Исследования по двухфотонной микроскопии проникновения наночастиц в ткани зуба проводились совместно с М.Е. Дарвиным в Центре экспериментальной и прикладной кожной физиологии Медицинского университета «Шарите», Берлин, Германия под руководством профессора Ю. Ладеманна. Изучение жировой ткани проводилось совместно с И.Ю. 13 Яниной, которая использовала результаты ОКТ-исследований автора диссертации для дальнейшей статистической обработки и интерпретации. Публикации по теме диссертации и апробация результатов. Основные результаты диссертации опубликованы в 16 статьях, из них 13 - в рецензируемых изданиях, удовлетворяющих требованиям пунктов 12 и 13 «Положения о присуждении ученых степеней», а именно: 11 статей в изданиях, включенных в систему цитирования SCOPUS, 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК и включенном в SCOPUS, 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК. SCOPUS 1. Trunina N.A., Derbov V.L., Tuchin V.V., Altshuler G.B. Dentinal permeation modeling // Proc. SPIE. 2008. V. 6791. P. 67910T-1-7. 2. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. OCT monitoring of clearing agents within tooth dentin // Proc. SPIE. 2009. V. 7443. P. 74432D-1-8. 3. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. OCT monitoring of diffusion of water and glycerol through tooth dentin in different geometry of wetting // Proc. SPIE. 2010. V. 7563. P. 7563OU-1-5. 4. Tuchin V.V., Bashkatov A.N., Genina E.A., Kochubey V.I., Lychagov V.V., Portnov S.A., Trunina N.A., Miller D.R., Cho S., Oh H., Shim B., Kim M., Oh J., Eum H., Ku Y., Kim D., Yang Y. Finger tissue model and blood perfused skin tissue phantom // Proc. SPIE. 2011. V. 7898. P. 78980Z-1-11. 5. Larin K.V., Ghosn M.G., Bashkatov A.N., Genina E.A., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical clearing for OCT image enhancement and in-depth monitoring of molecular diffusion // IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 2011. V. 18. No. 3. P. 1244 - 1259. 6. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Temporal change of adipose tissue refractive index at photodynamic treatment: in vitro study using OCT // Proc. SPIE. 2012. V. 8222. P. 82221G-1-6. 7. Trunina N.A., Popov A.P., Lademann J., Tuchin V.V., Myllylä R., Darvin M.E. Two-photon-excited autofluorescence and second-harmonic generation microscopy 14 for the visualization of penetration of TiO2 and ZnO nanoparticles into human tooth tissue ex vivo // Proc. SPIE. 2012. V. 8427. P. 8427OY-1-6. 8. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical coherence tomography of adipose tissue at photodynamic/phototermal treatment in vitro // J. Innovat. Opt. Health Sci. 2013. V. 6. No. 2. P. 1350010-1-7. 9. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Photo-induced cell morphology alterations quantified within adipose tissues by spectral OCT // J. Biomed. Opt. 2013. V. 18. No. 11. P. 111407-1-10. 10. Trunina N.A., Darvin M.E., Kordás K., Sarkar A., Mikkola J.-P., J. Lademann, Meinke M.C., Myllylä R., Tuchin V.V., Popov A.P. Monitoring of TiO2 and ZnO nanoparticle penetration into enamel and dentine of human tooth in vitro and assessment of their photocatalytic ability // IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 2014. V. 20. No. 3. P. 7300108-1-8. 11. Trunina N.A., Derbov V.L., Tuchin V.V. Simple numerical model of OCT signal evolution due to the diffusion of an optical clearing agent // Proc. SPIE. 2014. V. 9031. P. 90310B-1-9. Перечень ВАК и SCOPUS 12. Трунина Н.А., Лычагов В.В., Тучин В.В. Исследование диффузии воды через дентин зуба человека методом оптической когерентной томографии // Опт. и спектр. 2010. Т. 109. № 2. С. 190 - 196. Перечень ВАК 2011 года 13. Трунина Н.А. Тучин В.В. Визуализация проникновения наночастиц TiO2 в ткани зуба человека методом оптической когерентной томографии // Изв. Саратовского ун-та. Новая серия. Сер. Физика. 2011. Т. 11. №. 2. С. 5-9. Прочие статьи 14. Кальянов А.Л., Лычагов В.В., Трунина Н.А., Федосов И.В., Лакоди-на Н.А., Тучин В.В., Беликов А.В., Альтшулер Г.Б. Исследование возможности химического отбеливания зубов, используя отверстия в эмали // Проблемы оптической физики (Материалы 11-ой Международной молодежной научной 15 школы по оптике, лазерной физике и биофотонике, 25– 28 сентября 2007) Саратов: Новый ветер, 2008. С.44 - 47. 15. Трунина Н.А., Дербов В.Л., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Модель проницаемости дентина // Проблемы оптической физики и биофотоники (Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике, 23 – 26 сентября 2008). Саратов: Новый ветер, 2009. С. 42 - 47. 16. Герасимова Н.С., Трунина Н.А., Генина Э.А., Башкатов А.Н., Кочубей В.И., Тучин В.В. Исследование оптического просветления дентина // Проблемы оптической физики и биофотоники (Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике 23 – 26 сентября 2008). Саратов: Новый ветер, 2009. С. 47 - 54. Основные результаты диссертационной работы доложены на конференциях: Saratov Fall Meeting 2007 (SFM 2007), September, 25-28, 2007, Saratov, Russia; The International Topical Meeting on Optical Sensing and Artificial Vision 2008 (OSAV 2008), May, 12-15, 2008, St.-Petersburg, Russia; BIGSS’08 Biophotonics and Imaging Graduate Summer School, University of Limerick, August,29-September,2, 2008, Ireland; Scientific Meeting of EC-project “Photonics4Life”, November, 18-19, 2008, Brussels, Belgium; SPIE Optics+Photonics 2009, August 1-6, 2009, San Diego, USA; Saratov Fall Meeting 2009 (SFM 2009), September, 21-24, 2009, Saratov, Russia; Scientific Meeting of EC-project “Photonics4Life”, November, 6-18, 2009, Barcelona, Spain; SPIE Photonics West 2010, January, 23-28, 2010, San Francisco, USA; 16 Научно-практическая конференция Presenting Academic Achievements to the World: 29-30 марта, 2010, Саратов, Россия; SPIE Photonics Europe 2010, April, 12-16, 2010, Brussels, Belgium; 71-я научно-практическая конференция студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые – здравоохранению региона» МУ-ЗР’10: 22-24 апреля, 2010, Саратов, Россия; Saratov Fall Meeting 2010 (SFM 2010), October, 5-8, 2010, Saratov, Russia; SPIE Photonics West 2011, January, 22-27, 2011, San Francisco, USA; Saratov Fall Meeting 2011 (SFM 2011), September, 27-30, 2011, Saratov, Russia; SPIE Photonics West 2012, January, 21-26, 2012, San Francisco, USA; SPIE Photonics Europe 2012, April, 16-19, 2012, Brussels, Belgium; Russian-Chinese Workshop: Biophotonics and Biomedical Optics, SFM 2012, 26-28 September, 2012, Saratov, Russia; D:\report\621SFM 2012, 25-28 September, 2012, Saratov, Russia; 1st International Biophotonics Meeting in Israel, Conference BPI12, Tel Aviv, Israel, 9-11 December, 2012; SPIE Photonics West 2013, San Francisco, USA; February, 2-7, 2013. Повышение квалификации, проведение совместных исследований по теме диссертации и обсуждение их результатов осуществлялись соискателем в ходе стажировок A two-week course of professional training in Imaging of living tissues by means of dynamical light scattering, Weizmann Institute, Rehovot, Israel, October 1730, 2010; A two-week course of professional training in Optical Coherence Tomography as a method for monitoring the diffusion of chemical agents and penetration of nanoparticles into biological tissues, Department of Dermatology, Venerology 17 and Allergology, Centre of Experimental and Applied Cutanious Physiology, Charite University Medicine, Berlin, August 15-28, 2011; и международных школ BIGSS’08 Biophotonics and Imaging Graduate Summer School, University of Limerick, August,29-September,2, 2008, Ireland; 16th CIMO WINTER SCHOOL “Building blocks of life: from biomaterials to living organisms” March 12-17, 2012, Finland. Работа соискателя и участие в мероприятиях по теме диссертации были поддержаны персональными грантами SPIE Travel Grant on participation on Optics + Photonics 2009, August 1-6, 2009, San Diego, USA; Travel Gant on participation on BIGSS’08 Biophotonics and Imaging Graduate Summer School, University of Limerick, August, 29-September, 2, 2008, Ireland; Н.А.Трунина, «Разработка методов оптического контроля свойств твердых тканей зуба человека под действием химических агентов и наночастиц для косметической и терапевтической стоматологии», Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, программа «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» (УМНИК). Контракт на выполнение НИОКР № 8761 p /14002 от 14 января 2011 г. Travel Grant on participation on 16th CIMO WINTER SCHOOL Building blocks of life: from biomaterials to living organisms March 12-17, 2012, Finland Grant on visiting Oulu University, Finland, February,13-March,1, 2013 Исследования по теме диссертации проводились соискателем в качестве исполнителя ряда проектов, поддержанных грантами: Photonics4Life , Network of Excellence for Biophotonics, Seventh Framework 18 Programme (FP7-ICT-2007-2, грантовое соглашение № 224014) Грант Американского Фонда Гражданских Исследований и Развития (CRDF), RUB1-2932-SR-08. Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», гос. контракт 02.740.11 0770. Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», гос. контракт 02.740.11 0879. Грант РФФИ, 10-02-90039_Бел_а. Достижения соискателя в исследовательской работе по теме диссертации отмечены премиями и наградами Премия за 2010год Международной академической издательской компании «Наука» за лучшую публикацию в издаваемых ею журналах (диплом №142, решение комиссии от 22 ноября 2011г., протокол №2). SPIE Best Student Paper Award, SPIE Photonics Europe 2012 Стипендия Президента РФ для аспирантов (приказ Минобрнауки http://www.sgu.ru/node/89120) Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения (раздел 1), основной части, содержащей 6 разделов (разделы 2 - 7), заключения (раздел 8) и списка цитируемой литературы, включающего 317 наименований, содержит 45 рисунков и 3 таблицы. Объем диссертации составляет 157 страниц. Во введении (раздел 1) дается общая характеристика диссертации как квалификационной работы, включающая актуальность темы, цель и задачи работы, новые результаты, их теоретическое и практическое значение, личный вклад соискателя, публикацию и апробацию результатов диссертации, ее структуру и объем. В разделе 2 приводятся необходимые сведения о методах исследования, а в разделе 3 – об объектах исследования. Эти разделы являются обзорными и нужны для характеристики современного состояния 19 исследований, близких к теме диссертации, а также для определения основных понятий, необходимых для понимания последующего изложения. С раздела 3 начинается описание самостоятельных исследований автора. Здесь приводится описание экспериментов по ОКТ-мониторингу проникновения химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы зубной ткани in vitro. Четвертый раздел посвящен ОКТ-исследованию изменений, вызванных внешними воздействиями, в других плотных тканях. Сначала описаны ОКТисследования in vivo тканей пальца человека, позволившие оценить коэффициент ослабления отдельных слоев и его изменения под действием иммерсии и механического сдавливания. Затем излагаются результаты экспериментов по ОКТ визуализации клеток жировой ткани человека в процессе долговременных изменений, вызванных комбинированным воздействием света и красителей, на основании которых был выполнен статистический анализ распределения клеток по размерам и сделаны выводы о механизмах их разрушения. Теоретический раздел 5 содержит описание двух разных моделей. Вначале рассматривается простая модель тубулярной структуры дентина, на основе которой проведен расчет коэффициента проницаемости дентина в зависимости от диаметра и плотности числа тубул. Далее описана математическая модель, основанная на численном решении уравнения диффузии с последующим использованием известной теории формирования сигнала ОКТ в рассеивающей среде с заданными свойствами. В качестве нетривиального примера описан механизм формирования немонотонного А-скана в условиях, когда оптическое просветление влияет не только на коэффициент ослабления, но и на сечения рассеяния назад, определяющее полезный сигнал. Наконец, в седьмом разделе описываются эксперименты по оптическому мониторингу проникновения наночастиц в образцы зубной эмали и дентина. Вначале рассмотрены измерения методом ОКТ-визуализации, а затем – с помощью нелинейной микроскопии с использованием флуоресценции с двухфотонным В заключении (раздел 8) обсуждаются итоги проделанной работы и перспективы ее продолжения. 20 21 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Оптическая когерентная томография (ОКТ) Оптическая визуализация биологических тканей – сложная задача, так как даже в ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне, где поглощение минимально (так называемое физиологическое окно прозрачности) распространение света затруднено интенсивным рассеянием на неоднородностях показателя преломления, присущих природе биологических тканей [1]. Классическим примером является склера глаза, компоненты которой слабо поглощают видимый свет, но имеют различный показатель преломления, так что из-за рассеяния склера почти непрозрачна. Восстановление трехмерной структуры объектов осуществляется при использовании рентгеновской [2–4], магнитно-резонансной [5, 6], ультразвуковой и других методов томографии [7]. В настоящее время главным образом развиваются четыре направления оптической томографии: первое основано на регистрации группы выделенных (прямо прошедших или диффузно рассеянных) фотонов при облучении объекта импульсами света сверхкороткой длительности; второе использует регистрацию волн фотонной плотности; третье – когерентные свойства оптического излучения; четвертое основано на принципах конфокальной микроскопии [8–12]. В когерентной томографии на сегодняшний день наиболее широко обсуждаются два подхода. Первый по своей сути очень близок к импульсной томографии, так как основан на регистрации прямо прошедших фотонов, селекция которых осуществляется за счет сохранения ими когерентности по отношению к падающему пучку путем оптического гетеродинирования (интерференции), поэтому он может регистрировать томограммы в непрерывном режиме [13–16]. Второй подход основан на селекции рассеянных (отраженных) фотонов локальными неоднородностями биоткани за счет использования интерферометров с низкокогерентными источниками 22 света (суперлюминесцентные светодиоды, фемтосекундные лазерные системы) [12, 17–20]. Визуализация биологических тканей путем простого просвечивания, как это делается в рентгеновской радиологии или когерентной томографии, непригодна в видимой или ИК-области. Это связано с тем, что фотоны, проходящие через толстый образец ткани, многократно рассеиваются, теряя свою пространственную когерентность и уничтожая контраст изображения. Было предложено множество методов для снижения влияния рассеянного света на формирование освещающего излучения, изображения путем которая рассеивается не выделения той или части минимально рассеивается в ткани. Например, пространственный фильтр в виде точечной диафрагмы в конфокальной микроскопии позволил получить высококачественные изображения деталей строения тканей на клеточном и субклеточном уровне, в том числе in vivo. Однако чисто пространственный фильтр неэффективен против многократно рассеянного света в сильно рассеивающих средах, поэтому конфокальная микроскопия ограничена первыми несколькими сотнями микрометров по глубине [21]. Для получения изображений более глубоких слоев сильно рассеивающих тканей ранние исследования были сосредоточены на временной селекции нерассеянной («баллистической») составляющей света, прошедшего [22] или отраженного назад [23] образцом биологической ткани. Была также предложена и продемонстрирована нелинейно-оптическая селекция неотклоненного света [24]. Однако потребность в дорогостоящих фемтосекундных лазерах для реализации этих методов ограничивает их использование в рутинных медицинских приложениях. В последнее время получил известность другой, более экономичный подход, который использует в качестве пространственного фильтра малую длину когерентности широкополосного источника света, а не длину ультракороткого лазерного импульса. Методы, 23 основанные на когерентной селекции, включают одномерный дальнометрический метод оптической когерентной рефлектометрии [25], двумерные комбинированные методы сканирования и измерения дальности, такие как ОКТ [19, 26], оптическая когерентная микроскопия [27] и методика, основанная на низкокогерентной голографии [28]. Из всех этих методов метод ОКТ показал себя наиболее перспективным для клинических приложений, благодаря его относительной простоте и низкой стоимости. На протяжении последних десятилетий значительное развитие получила неинвазивная ОКТ диагностика биотканей [29–31]. Этот метод позволяет получать трехмерные изображения приповерхностных слоев ткани с хорошим пространственным разрешением, достигающим ~ 6-10 мкм, и с высокой чувствительностью (> 100 дБ) [29, 32]. Неинвазивность, имеющая принципиальное значение при исследованиях in vivo, высокое разрешение, сравнительная простота и невысокая стоимость являются несомненными преимуществами ОКТ перед другими методами визуализации. Некоторые последние достижения ОКТ-технологии, в том числе, в сочетании с другими подходами в рамках одного устройства описаны в обзоре [33]. К недостаткам ОКТ можно отнести небольшую глубину зондирования, а также ухудшение качества изображения за счет формирования спеклов [34]. После первой демонстрации в 1991 г. для послойной визуализации глаза человека [35] ОКТ активно развивается для разнообразных диагностических приложений. Около половины академических исследований и промышленных разработок по ОКТ приходится на офтальмологические применения [36-45], на втором месте идет визуализация сердечно-сосудистой системы [46-53]. ОКТ применяется также в дерматологии [54-58], стоматологии [59-70], и эндоскопических исследованиях [71-76]. Существуют две основные схемы ОКТ - временная и спектральная [29]. При временной ОКТ образец помещается в предметное плечо интерферометра Майкельсона, а сканирующая оптическая линия задержки - в опорное плечо 24 (рисунок 2.1). Сканирование по глубине осуществляется путем перемещения опорного зеркала и синхронной записи интерферометрического сигнала, продольное разрешение определяется длиной когерентности излучения. За счет использования низкокогерентного (широкополосного) источника [37] типичное продольное разрешение достигает 6-10 мкм. Зависимость ОКТ сигнала от глубины называется А-сканом. Латеральное (поперечное) сканирование осуществляется перемещением образца либо отклонением предметного пучка (рисунок 2.1). Двумерные томографические изображения (В-сканы) получаются из последовательности А-сканов путем латерального сканирования зондирующего пучка вдоль некоторого направления. В свою очередь, из последовательности В-сканов формируется трехмерное изображение приповерхностного слоя ткани. Латеральное разрешение определяется размером пятна предметного светового пучка, фокусируемого на зондируемую область образца. Рис. 2.1. Схема волоконно-оптического ОКТ сканера, работающего по временной схеме В частотно-модуляционной ОКТ (Фурье-ОКТ, спектральной ОКТ), основанной на спектральной интерферометрии рассеянного назад излучения 25 [9], сканирование по глубине образца (измерение времени задержки отраженного сигнала с данной глубины) заменяется регистрацией спектра с Фурье-преобразованием. В результате отпадает необходимость в движении опорного зеркала и весь А-скан получается в результате одного измерения. В настоящее время ясно, что этот метод обладает большим преимуществом по скорости и чувствительности [76] по сравнению с его временными аналогами. В экспериментальной части диссертации использована именно спектральная ОКТ, поэтому на этом методе мы остановимся несколько подробнее. На рисунке 2.2 показана схема частотно-модуляционной ОКТ на основе интерферометра Майкельсона и спектрометра с высоким разрешением (спектрального радара). Поскольку спектральный радар измеряет амплитуду рассеяния E(z) вдоль оси, идущей от поверхности вглубь объекта, за одну экспозицию приемника без продольного сканирования, время записи томограммы может быть очень мало. Рис. 2.2. Схема спектральной ОКТ с источником света, имеющим малую длину когерентности 26 В результате суперпозиции предметного и опорного полей формируется спектральное распределение интенсивности регистрируемого света I (k ) S (k ) 2 E ( z )cos(2kz ) dz , (2.1) 0 где k – волновое число, S(k) – спектральное распределение амплитуды источника света. С помощью обратного преобразования Фурье определяется зависимость амплитуды рассеяния от глубины. Вместо низкокогерентного источника в схеме спектральной ОКТ может быть использована лазерная развертка, то есть быстрая перестройка лазера в широкой полосе оптических частот [78]. В работах [79, 80] показано, что Фурье-ОКТ и ОКТ со сканированием частоты источника имеют преимущества по чувствительности по сравнению с временной ОКТ. Дополнительную информацию о функциональном состоянии биоткани можно получить с помощью доплеровской и поляризационно-чувствительной ОКТ. Доплеровская ОКТ позволяет выделить изображение движущихся компонентов на фоне неподвижного окружения [81]. В частности, волоконно-оптическая доплеровская ОКТ может использоваться для измерений скорости потока крови в сосуде, расположенном за сильно рассеивающим слоем в живом объекте [82]. В поляризационно-чувствительной ОКТ [79, 80, 83, 84] используется не только интенсивность, но и поляризация отраженного назад света, изменение которой определяется анизотропией среды. В большинстве исследований с применением поляризационно-чувствительной ОКТ критерием патологических изменений является измеряемое уменьшение макроскопического двулучепреломления биоткани. Поскольку на глубинах более 300500 мкм трудно обеспечить корректные измерения двулучепреломления, для более глубоких слоев (до 1,5 мм) используется более простая кросс-поляризационная ОКТ [85], в которой измеряется кросс-поляризованная компонента света, рассеянного назад. Патологические процессы характеризуются изменениями в количестве коллагеновых волокон и их пространственной организа- 27 ции. Поэтому сравнительный анализ кросс-поляризационных свойств обратного рассеяния для нормальной и патологической биоткани можно использовать для ранней диагностики неопластических процессов. 1.2 Применения ОКТ для количественного определения оптических параметров среды и их мониторинга Параллельно с совершенствованием ОКТ как средства получения трехмерных изображений продолжают развиваться применения ОКТ для количественного определения тех или иных оптических параметров биоткани и их пространственного распределения. Поскольку в ОКТ используются широкополосные источники света, из ОКТ сигнала можно извлекать спектроскопическую информацию, то есть осуществлять спектроскопическое исследование биоткани с пространственным разрешением [86–89]. Такая методика называется спектроскопической ОКТ (СОКТ). Morgner и др. (2000) впервые предложили вариант временной широкополосной СОКТ с использованием сдвига центра тяжести спектра в качестве количественного индикатора спектральных изменений [86]. В работах [87, 90] на основе измеренных с разрешением по глубине спектров рассеяния назад и передаточных функций ткани была произведена количественная оценка распределения концентрации поглощающих центров. Модификация спектра рассеянного назад излучения обусловлена двумя механизмами: поглощением и рассеянием. Измерение поглощения в сочетании с использованием закона Бугера-Ламберта-Бера открывает возможность измерения концентраций таких сильно поглощающих биологических веществ, как гемоглобин, цитохромы и меланин с разрешением по глубине [91]. Аналогично можно получать распределение концентраций экзогенных контрастных агентов, таких как органические красители [92]. По данным измерений рассеяния с помощью теории рассеяния можно идентифицировать клеточные и субклеточные морфологические и биохимические изменения, такие как изменение отношения «ядро/цитоплазма» на ранней стадии развития опухолей [93]. Однако, стандартная ОКТ в мутных средах не позволяет дифференцировать 28 вклады рассеяния и поглощения. Поэтому в большинстве первых работ по СОКТ спектральные изменения относились на счет поглощения, а вклад рассеяния считался пренебрежимо малым. Это предположение далеко от реальности, так как большинство биотканей рассеивают свет сильнее, чем поглощают. Даже при использовании специально подобранных поглощающих красителей в качестве контрастных агентов вклад рассеяния не может быть сделан пренебрежимо малым, так как концентрация красителя в биоткани не может быть как угодно высокой. Сложность разделения вкладов поглощения и рассеяния возникает от слишком большого числа переменных, подлежащих определению при решении обратной задачи. Иногда, например, при использовании красителей, сильно поглощающих в ближней ИК области, спектр красителя известен априори и сильно отличается от спектра рассеяния биоткани. В таких случаях разделение вкладов рассеяния и поглощения становится возможным (см., например, [94–96]). Ряд авторов обратились к проблеме получения количественной информации об оптических свойствах рассеивающих образцов с помощью низкокогерентной интерферометрии (НКИ) и ОКТ. Для обеспечения высокой точности таких оценок требуется знание связи между оптическими свойствами рассеивающего образца и сигналом НКИ [97-101], а также роли спекл-шума в отображении оптических свойств [89,102,103]. В работе [104] продемонстрировано применение НКИ для измерений диффузии красителя в рассеивающих фантомах биоткани. Коэффициент диффузии фталоцианинового красителя был измерен в 1.5% агаровом геле, содержащем интралипид в качестве рассеивающего компонента, c использованием интерферометрии на двух длинах волн. Коэффициент диффузии красителя оценивался путем подгонки математической модели интерферометрического сигнала к экспериментально измеренной огибающей НКИ. Результаты показывают, что метод пригоден для образцов с непрерывными пространственными вариациями коэффициента рас- 29 сеяния на расстояниях, ограниченных снизу длиной когерентности зондирующего излучения, и позволяет характеризовать процесс диффузии в рассеивающих средах in situ. Методика неинвазивной оценки молекулярной диффузии в биотканях с помощью ОКТ была предложена Лариным и соавторами [105-109]. Они показали, что, используя ОКТ с одним источником света, можно осуществить мониторинг диффузии глюкозы в биотканях на основе анализа рассеивающих свойств биоткани с разрешением по времени и глубине, наблюдая за временной эволюцией А-скана [110]. Полученные результаты говорят о том, что метод ОКТ можно успешно применять для функционального имиджинга и количественной характеристики процессов диффузии как в фантомах, имитирующих биоткани, так и в самих биотканях. В работе [105] были представлены результаты пилотных исследований по применению ОКТ для мониторинга и количественной характеристики диффузии различных агентов в склере и роговице цельного глаза кролика ex vivo. Исследования по ОКТ-мониторингу диффузии глюкозы и других агентов, проведенные в рассеивающих средах со стабильными оптическими свойствами, на животных и человеке, продемонстрировали: способность метода ОКТ обнаруживать изменения коэффициента рассеяния с точностью около 1,5% в средах со стабильными оптическими свойствами; хорошую корреляцию изменений наклона сигнала ОКТ на глубине 150-900 мкм в коже с изменениями концентрации глюкозы в крови у животных; хорошую корреляцию изменений наклона сигнала ОКТ на глубине 200 1000 мкм в коже с изменениями концентрации глюкозы в крови у человека; возможность повысить точность, чувствительность и специфичность неинвазивного мониторинга концентрации глюкозы в крови с помощью метода ОКТ за счет использования оптимизированных систем ОКТ. 30 Эти выводы стимулируют интерес к дальнейшему развитию техники ОКТ-мониторинга диффузии химических агентов, совершенствованию предложенной методики и ее распространению на различные проникающие агенты и новые типы биотканей, в частности, на ткани человеческого зуба, что составляет одну из основных задач настоящей работы. 2.2. Нелинейная микроскопия Большая часть экспериментальных исследований, описанных в настоящей работе, была выполнена автором с использованием метода ОКТ. Однако, при исследовании проникновения наночастиц в биоткани применялись и другие методы, известные как нелинейная (двухфотонная) микроскопия (двухфотонная томография). Такое название объединяет два метода, основанных на разных нелинейно-оптических эффектах: генерации второй гармоники и двухфотонном возбуждении флуоресценции. Генерация второй гармоники представляет собой параметрическое взаимодействие волн в нелинейной среде, при котором среда не возбуждается, а два фотона накачки преобразуются в один фотон удвоенной частоты (второй гармоники). При двухфотонном возбуждении флуоресценции два фотона накачки поглощаются средой в результате одного квантового перехода, после чего флуоресценция происходит так же, как если бы указанное возбуждение было произведено любым другим способом (например, путем поглощения одного кванта удвоенной частоты). Общей чертой этих эффектов является то, что они возникают только в области достаточно высокой интенсивности возбуждающего поля – в области острой фокусировки пучка накачки, что обеспечивает пространственное разрешение при формировании изображений. Вторая общая черта, важная для биотканей, состоит в том, что накачка производится ИК излучением, рассеяние которого в биотканях гораздо слабее, чем для видимого излучения. 31 2.2.1. Микроскопия с использованием генерации второй гармоники Эффект генерации второй гармоники (ГВГ) света – первый нелинейнооптический эффект, экспериментально обнаруженный в кристалле кварца почти сразу после создания лазера [111]. Первое наблюдение ГВГ в биологических тканях относится к 1971 году [112]. Использование конфокального сканирующего микроскопа в сочетании с фемтосекундным титан-сапфировым лазером в качестве источника света привело к появлению ГВГ микроскопии, которая впервые была применена к биологическому объекту в работе [113]. Это вызвало бурный рост числа публикаций по различным применениям ГВГ, в том числе, в микроскопии и визуализации структуры биологических объектов [114-117]. В 2010 году ГВГ-микроскопия была успешно применена для исследований, проводимых на лабораторных животных in vivo [118,119]. Особенностью формирования сигнала второй гармоники в условиях возбуждения ультракоротким импульсом является то, что такой импульс имеет незначительную энергию, что обеспечивает неинвазивность воздействия, и при этом гигантскую пиковую мощность (и, соответственно, амплитуду электрического поля), что дает возможность получать доступные для регистрации величины интенсивности света на удвоенной частоте даже при малых коэффициентах преобразования. В стационарном режиме для обеспечения заметной перекачки энергии из первой гармоники во вторую требуется выполнение хорошо известных условий синхронизма (см., например, [120, 121]), а также прохождение синхронизированными волнами достаточного для перекачки расстояния в среде. В режиме ультракороткого импульса и высокочувствительной регистрации слабого сигнала на удвоенной частоте условия синхронизма не являются обязательными. Фактически в этом случае можно регистрировать излучение (некогерентное) отдельных молекул, обладающих нелинейной поляризуемостью. В результате можно регистрировать излучение на частоте второй гармоники в различных направлениях, в частности, назад. По существу, в этом случае имеет место нелинейное молекулярное рассеяние. Основным тре- 32 бованием для его существования является наличие нелинейной поляризуемости молекул. Одной из биологических сред с большой нелинейной восприимчивостью и сильным сигналом ГВГ является коллаген, входящий в состав соединительных тканей [122], что обусловило значительный интерес к его исследованиям с помощью ГВГ [113, 123, 124]. Описаны спектральные различия сигнала второй гармоники нормальной и раковой ткани, что делает ГВГ-микроскопию полезной в онкологии [125]. ГВГ может служить не только для обнаружения и визуализации коллагена [126], но и для различения его типов, например, кристаллический коллаген I типа генерирует более мощный сигнал, чем коллаген III типа на одной и той же длине волны [124]. Авторы [127] проводили исследования ГВГ в твердых тканях зуба и пришли к заключению, что ГВГ вызвано скорее коллагеном, чем кристаллами гидроксиапатита ( Ca 10 PO 4 6 OH2 ). Более того сообщалось, что ГВГ не наблюдается в поражен- ных кариесом тканях, что дает дополнительный способ их обнаружения. Возможность регистрации ГВГ в направлении назад позволяет реализовать на базе одной оптической схемы сканирующего микроскопа два физических принципа, а именно, ГВГ и флуоресценцию с двухфотонным возбуждением. Оба эти принципа позволяют получать объемное изображение на глубину порядка миллиметров. Такие приборы часто называют многофотонными оптическим томографами. 2.2.2. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением В основе лазерной сканирующей микроскопии с двухфотонным возбуждением, впервые практически реализованной в работе [128], лежит явление двухфотонного поглощения. Теоретически оно было предсказанное в 1931 году [129], а экспериментальное его наблюдение стало возможным лишь в 1961 году с появлением лазеров [130]. Малая вероятность двухфотонного перехода требует высоких интенсивностей возбуждающего излучения, источником которого в настоящее время чаще всего является фемтосекундный титан-сапфировый лазер (длительность импульса ~100 фc, частота следования импульсов 33 ~80 МГц). Именно с внедрением этого лазера в практику двухфотонное возбуждение стало реальным неинвазивным инструментом исследования биологических объектов (см., например, [131] и ссылки в этой работе, а также более новые публикации, например, [132]). Вероятность двухфотонного возбуждения растет пропорционально квадрату интенсивности возбуждения, а не первой степени, как при однофотонном возбуждении. Поэтому при двухфотонном возбуждении достигается большее аксиальное разрешение, чем это можно достичь в конфокальной микроскопии, так как флуоресценция возбуждается в объеме порядка 1012 см3, а отсутствие необходимости в точечной диафрагме (см. рисунок 2.3) увеличивает число фотонов флуоресценции, собираемых приемником. Дополнительный эффект достигается за счет подбора формы и размеров фокального пятна [133]. Рисунок 2.3. Схематическое сравнение однофотонного конфокального (слева) и двухфотонного (справа) возбуждения флуоресценции [131]. Двухфотонное возбуждение в образце SS происходит в меньшем объеме, чем однофотонное (с участием только лучей 2 и 3, но не 1). Без точечной диафрагмы PH увеличивается число фотонов, приходящих на фотоумножитель PMT (лучи 4 и 5, а не только 4). Двухфотонный микроскоп меньше повреждает исследуемый образец, чем однофотонный конфокальный микроскоп (см. рис. 2.3), так как, во-пер- 34 вых, энергия ИК фотонов недостаточна, чтобы вызвать нежелательные фотоиндуцированные изменения, а во-вторых, суммарная энергия фемтосекундных импульсов мала, а высокая мощность достигается за счет их малой длительности. Каждое положение фокуса дает один пиксель, а для получения трехмерного изображения необходимо сканирование. Сканирующая головка обычно образуется двумя зеркалами, угол наклона которых можно быстро менять с помощью гальванометра. К недостаткам двухфотонного возбуждения флуоресценции относится сравнительно высокая стоимость фемтосекундных лазеров. Спектр двухфотонного поглощения молекул может сильно отличаться от спектра однофотонного поглощения. Для малых объектов (изолированные клетки) разрешение однофотонной конфокальной микроскопии может быть выше из-за меньшей длины волны возбуждения. Однако, в рассеивающих тканях, высокое разрешение по глубине и более высокий процент регистрации испущенных фотонов обеспечивают преимущество флуоресцентной микроскопии с двухфотонным возбуждением, что способствовало ее применению в физиологии, нейробиологии, эмбриологии, биоинженерии тканей. Уже в течение первого десятилетия c момента появления с ее помощью удалось детально визуализировать клетки кожи человека in vivo [134]. Благодаря высокой скорости формирования изображения двухфотонная микроскопия флуоресценции может использоваться для неинвазивной оптической биопсии [135]. 35 3. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Настоящий раздел начинается с описания диффузии химических веществ в биотканях и вызванного ею изменения оптических параметров (оптического просветления). Приводятся известные из литературы сведения о строении и свойствах биотканей, исследованных автором. Большая часть работы посвящена экспериментам с образцами дентина и эмали зуба человека, поэтому наиболее подробно рассмотрено строение зуба и свойства образующих его тканей. Дается обзор литературы, дающий представление о масштабах и разнообразии исследований, направленных на применение ОКТ в стоматологии. Наконец, наряду с тканями зуба, автор использовал ОКТ в отдельных исследованиях других тканей, сведения о которых завершают раздел. 3.1Диффузия химических агентов в биотканях Изучение проницаемости биотканей, т.е. способности пропускать различные вещества, имеет большое значение для медицины, особенно для фармакологии и токсикологии, так как вся жизнедеятельность организма связана с проницаемостью клеток. Для эффективного использования фармакологических средств необходимо знать их проникающую способность через ткани организма в норме и при патологии. Одним из основных механизмов проницаемости биотканей является диффузия. В настоящее время процесс диффузии веществ в биотканях все еще недостаточно изучен, несмотря на большое количество работ, посвященных его исследованию (см., например, [29, 136–140] и другие). Для приближенного описания диффузии веществ в биотканях часто пользуются феноменологическим законом Фика, который определяет связь между плотностью потока числа частиц J и градиентом концентрации (плотности числа частиц) C (см., например, [141]) J C , (3.1) где D – локальный коэффициент диффузии. Знак минус в правой части уравнения означает, что диффузионный поток направлен в сторону убывания 36 концентрации. Сохранение числа частиц при диффузии выражается уравнением непрерывности J C . t (3.2) Подстановка (3.1) в (3.2) приводит к дифференциальному уравнению для концентрации C D 2C , t (3.3) (второй закон Фика), где 2 - оператор Лапласа. Коэффициент диффузии зависит от температуры и является собственной характеристикой вещества в экспериментах по самодиффузии, где суммарная концентрация частиц не изменяется, а диффузия регистрируется с помощью меченых атомов. Для низкомолекулярных соединений коэффициенты самодиффузии имеют величину порядка 10 5 см2∙с-1. Так, коэффициент самодиффузии воды равен 1,07∙ 10 5 см2 ∙с-1 [142]. В растворах суммарный перенос вещества всегда сопровождается течением жидкости. Поскольку собственные коэффициенты диффузии смешивающихся веществ (растворителя и растворенных молекул) различаются, то в процессе переноса вещества может возникнуть разность гидростатического давления, а значит и течение раствора, которое снижает эту разность давлений, которая в свою очередь вызывает увеличение потока менее подвижных молекул растворенного вещества и уменьшение потока более подвижных молекул растворителя. Скорость взаимной диффузии в этом случае определяется одним общим коэффициентом диффузии, зависящим от условий эксперимента и включающим свойства как растворенного вещества, так и растворителя. Если растворенное вещество присутствует в малой концентрации, влияние диффузии растворителя снижается [140]. Согласно [142], в водном растворе при малой концентрации коэффициент диффузии составляет 0,52∙ 10 5 см2∙с-1 для глюкозы, 0,36∙ 10 5 см2∙с-1 для сахарозы и 0,63∙ 10 5 см2∙с-1 для глицерина. 37 Решение уравнения (3.3) определяется граничными условиями и может быть достаточно просто найдено для препаратов тканей с простыми геометрическими формами при условии, что скорость процесса не лимитируется мембранами, а коэффициент диффузии можно считать не зависящим от координат. Модели такого рода используются при исследовании диффузии веществ в межклеточном пространстве или в тех случаях, когда мембраны есть, но растворенное вещество чрезвычайно быстро проникает сквозь них. Рассмотрим решение уравнения (3.3) для плоской пластинки толщиной l , которая в начальный момент времени с одной стороны приводится в контакт с раствором, имеющим концентрацию C0 , с другой же стороны пластина изолирована от проникновения агента. Начальная концентрация вещества внутри пластинки равна 0. Этой ситуации соответствуют начальные условия C z, 0 0 и граничные условия C 0, t C0 , C l , t / z 0 [140]: 4 1 2n 1 z 2 C z, t C0 1 exp 2n 1 D 2t / 4l 2 sin 2l n 0 2n 1 (3.4) Выражение (3.4) представляет собой быстро сходящийся ряд, и его сумма равна концентрации вещества C внутри пластины на расстоянии z от одной из ее сторон в некоторый момент времени t. Соотношение между количеством растворенного вещества mt внутри тела в момент времени t и его равновесным значением m∞ т.е. количеством вещества в окружающем растворе [140]: mt 0 Cdz 8 1 2 m C0 l l n0 1 2n 1 2 n 1 D 2t / l 2 2 e 2 (3.5) . Средняя по толщине образца биоткани концентрация диффундирующего вещества в каждый момент времени определяется как: 8 C t C0 1 2 2 n12 t / e 2 n 0 2 n 1 1 (3.6) 38 где τ - постоянная времени диффузии. В данном случае. l2 2D В первом приближении выражение (3.6) может быть заменено выражением: C (t ) C0 (1 e t / ) (3.7) В то же время, для описания процессов диффузии осмотически активных веществ через мембрану (подобным образом можно, например, моделировать проникновение веществ через поверхностные слои кожи), используется уравнение (3.1). Его решение может быть получено в форме [140]: C (t ) C0 (1 e P t d (3.8) ) где Р – коэффициент проницаемости мембраны, d - толщина мембраны (слоя биоткани) и t - время воздействия осмотически активного вещества на биоткань. Из сравнения уравнений (3.7) и (3.8) видно, что коэффициент проницаемости связан с постоянной времени диффузии и коэффициентом диффузии как: P l 2D l (3.9) или, в случае односторонней диффузии P D/l (3.10) Согласно [143], в пористых средах, каковыми являются фиброзные ткани, полный коэффициент диффузии определяется как отношение коэффициента диффузии проникающего агента во внутритканевой жидкости к коэффициенту пористости биоткани. Под коэффициентом пористости понимают отношение суммарного объема пор к объему всего образца. Таким образом, в этом случае для вычисления количества осмотически активного вещества, проникшего в биологическую ткань, необходимо знать коэффициент диффузии и коэффициент пористости биоткани. Уточненная связь коэффициента проницаемости и коэффициента диффузии для эпидермального слоя кожи рассмотрена в [138] В результате диффузии химических агентов биоткань может менять свои оптические свойства. Одним из важнейших эффектов такого рода 39 является оптическое просветление биотканей при диффузии иммерсионных агентов. Именно на использовании эффекта просветления основана методика ОКТ-мониторинга химических агентов в образцах биотканей, лежащая в основе настоящей работы. 3.2Просветление биотканей при диффузии иммерсионных агентов Возможности оптических методов диагностики ограничиваются сильным рассеянием света в биотканях, которое уменьшает глубину зондирования, ухудшает пространственное разрешение и контраст изображений [144–146]. Коэффициент (μs) и фактор анизотропии (g) рассеяния главным образом зависят от разности показателей преломления между компонентами, составляющих ткань. Одним из простых и эффективных методов увеличения глубины зондирования и качества изображений внутритканевых структур, является временное снижение светорассеяния в биотканях – оптическое просветление [147, 148]. Исчерпывающий обзор современного состояния проблемы оптического просветления содержится в статье [149]. В этой работе приведены многочисленные примеры воздействий, влияющих на рассеивающие свойства биотканей: компрессия [150, 151], растяжение [152], дегидратация [153, 154], коагуляция [155], а также фотохимическое [156, 157] и фототермическое [157] просветление. Для целей настоящей работы важным является просветление за счет пропитывания тканей биосовместимыми химическими веществами (иммерсии) [109, 147, 148, 158–164]. Эти вещества имеют больший показатель преломления, чем у исходной внутритканевой жидкости, но меньший, чем у рассеивающих структурных элементов. Рассмотрим простейший механизм этого явления [149]. По мере диффузии иммерсионной жидкости в биоткань увеличивается показатель преломления внутритканевой жидкости. Для его оценки можно использовать закон Гладстона-Даля [165] n niCi , где i i Ci 1 . (3.11) 40 Здесь n – показатель преломления смеси невзаимодействующих жидкостей, а ni и Ci – показатели преломления и объемные доли каждой компоненты, соответственно. В случае двух компонент (внутритканевая жидкость и иммерсионный агент, концентрация которого C t зависит от времени за счет диффузии) формула (3.11) дает зависящий от времени показатель преломления смеси nI t : nI t 1 C t nbase C t nosm , (3.12) где nbase – показатель преломления внутритканевой жидкости до начала диффузии, а nosm – показатель преломления гиперосмотической иммерсионной жидкости (например, раствора глюкозы или глицерина). В разделе 6 мы продолжим обсуждение данного вопроса при построении модели формирования сигнала ОКТ в процессе оптического просветления среды. 3.3. Строение тканей зуба и использование ОКТ для их исследования 3.3.1. Основные сведения о строении зуба В данном разделе с целью сделать более понятным последующее изложение кратко приведем известные из литературы сведения о строении зуба, уделяя основное внимание тем его особенностям, которые существенны для распространения света (см. книгу [29], обзор более ранних работ содержится в [166]). Общий план строения зуба представлен на рис. 3.1. В зубе выделяют коронку, шейку, окруженную десной, и корень, находящийся в лунке альвеолярного отростка челюсти. Коронка покрыта эмалью – самой твердой частью зуба. В коронке находиться полость зуба, переходящая в зубной канал и заполненная рыхлой тканью – пульпой, в которой проходят сосуды и нервы. С точки зрения гистологии зуб состоит из нескольких видов тканей (рис. 3.2). Из них эмаль, дентин и цемент являются минерализованными тканями, в составе которых преобладают неорганические компоненты, а также присутствуют органические соединения и вода (см. Таблицу 1). 41 Рис. 3.1. Общий план строения зуба [167]. Рис. 3.2. Строение зуба с гистологической точки зрения (1 – эмаль, 2 – дентин, 3 – пульпа, 4 – цемент) [168]. Таблица 1 Химический состав эмали, дентина и цемента (в % от массы) [169]. Кальций Фосфор Магний Карбонаты Вода Органическ ие вещества Эмаль 36-36,7 17 0,45 2,5 3,8 0,3-1,3 Дентин 27 13 0,40 3,3 10 20 Цемент 30 15-17 0,45 3-4 12 20-26 42 В настоящей работе исследованы образцы дентина и эмали. Эмаль – бессосудистая и самая твердая ткань организма. Она располагается поверх дентина, с которым тесно связана структурно и функционально, защищает дентин и пульпу зуба от воздействия внешних раздражителей. Толщина слоя эмали максимальна в области жевательных бугорков постоянных зубов, где она достигает 2,3-3,5 мм; на латеральных поверхностях постоянных зубов она обычно равна 1-1,3 мм. Твердость эмали объясняется высокой концентрацией в ней неорганических веществ (до 97%), главным образом, кристаллов апатитов: гидроксиапатита (до 75%), карбонатапатита, фторапатита, хлорапатита и др. Здоровая эмаль содержит 0,8-1,0% свободной воды и 1,2% органических соединений, представленных белками, липидами и углеводами. Углеводы эмали в основном представлены глюкозой, маннозой и галактозой [169]. Мельчайшими структурными единицами эмали являются кристаллы апатитоподобного вещества, формирующие эмалевые призмы. Минеральную основу составляют кристаллы апатитов и восьмикальциевый фосфат. Большая часть кристаллов гидроксиапатита в эмали ориентирована и упорядочена в виде сложных образований – эмалевых призм. Элементарная ячейка гидроксиапатита (структура 1 порядка) имеет молекулярную массу около 1000, в составе кристалла гидроксиапатита (структура 2 порядка) находится около 2500 таких ячеек (М=2 500 000). Эмалевая призма (структура 3 порядка) в свою очередь составлена из тысяч и миллионов кристаллов [169]. Эмалевые призмы – главные структурно-функциональные единицы эмали, проходящие пучками через всю ее толщину радиально (преимущественно перпендикулярно дентино-эмалевой границе). Форма призм на поперечном сечении – овальная, полигональная или – наиболее часто у человека – арочная (в виде замочной скважины); их диаметр составляет 3-5 мкм и увеличивается от дентино-эмалевой границы к поверхности эмали примерно в два раза. Между упорядочено расположеннными кристаллами гидроксиапатита имеются микропространства, заполненные эмалевой жидкостью с большим 43 содержанием воды, которая служит переносчиком молекул ряда веществ и ионов кристаллов в эмалевых призмах. В центральной части каждой призмы кристаллы лежат почти параллельно ее длинной оси; чем больше они удалены от этой оси, тем значительнее отклоняются от ее направления, образуя с ней все большой угол. Эмаль является сравнительно прозрачной тканью, поэтому оптические свойства зуба (поглощение, рассеяние, цвет) определяются, в основном, дентином [29]. Дентин составляет основную массу зуба и определяет его форму (рис. 3.3), имеет светло-желтую окраску, обладает некоторой эластичностью; он прочнее кости и цемента, но в 4-5 раз мягче эмали. Он состоит из межклеточного вещества, пронизанного дентинными трубочками (тубулами), содержащими отростки одонтобластов, тела которых лежат на периферии пульпы. Между трубочками располагается интертубулярный дентин. Межклеточное вещество дентина представлено коллагеновыми волокнами и основным веществом (содержащим преимущественно протеогликаны), которые связаны с кристаллами гидроксиапатита. Последние имеют вид шестигранных призм или пластинок размерами 3-3,5 нм × 20-60 нм и значительно мельче, чем кристаллы гидроксиапатита в эмали. Рис. 3.3. Топография дентина и ход дентинных трубочек: ДТ – дентинные трубочки; ИГД – интерглобулярный дентин; ЗСТ – зернистый слой Томса; Э – эмаль; Ц – цемент; ПК – пульпарная камера; РП – рога пульпы; КК – канал корня; АО – апикальное отверстие; ДК – добавочный канал [85]. 44 Дентинные трубочки (тубулы) – тонкие, сужающиеся снаружи канальцы, радиально пронизывающие дентин от пульпы до его периферии и обуславливающие его трофику. Они имеют внутренний диаметр от 0.5 до 4 мкм в зависимости от области зуба [170] Плотность числа дентинных тубул также в значительной степени зависит от определенной области зуба. Левая часть схемы зуба на рис.3.4 иллюстрирует распределение плотности тубул, выраженное в числе тубул на 0.1 мм [171]. Среднее значение плотности числа тубул изменяется от 9 до 24 тубул на 0.1 мм, т.е. от 8100 до 57600 тубул на 1 мм2. Оценка предельных изменений плотности числа тубул приводит к значениям от 7 до 30 тубул на 0.1 мм, т.е. от 4900 до 90000 тубул на 1 мм2. Рис. 3.4. Плотность дентинных трубочек (число трубочек на 0.1 мм, левая часть) и распределение тонких тубулярных ответвлений (правая часть). Шесть штриховых линий в левой части схемы показывают места подсчета трубочек, а цифры вдоль этих линий – среднее значение числа трубочек на трех уровнях по глубине: внутреннем (50 мкм от предентина), среднем и внешнем (250 мкм от границ раздела «дентин-эмаль» и «цемент- эмаль»). [170]. Благодаря тому, что дентин пронизан огромным числом трубочек, несмотря на свою плотность, он обладает высокой проницаемостью. Это обстоятельство имеет существенное клиническое значение, обуславливая быструю реакцию пульпы на повреждение дентина. При кариесе дентинные 45 трубочки служат путями распространения микроорганизмов. В дентинных трубочках располагаются отростки одонтобластов, в части их – также и нервные волокна, окруженные тканевой (дентинной) жидкостью (рис. 3.5). Дентинная жидкость представляет собой транссудат периферических капилляров пульпы и по белковому составу сходна с плазмой крови; в ней содержатся также гликопротеины и фибронектин. Изнутри стенка дентинной трубочки покрыта тонкой пленкой органического вещества – пограничной пластинкой (мембраной Неймана), которая проходит по всей длине дентинной трубочки, содержит высокие концентрации гликозаминогликанов и имеет вид тонкого плотного мелкозернистого слоя. Рис. 3.5. Содержимое дентинной трубочки: ООБЛ – отросток одонтобласта; КФ – коллагеновые фибриллы; НВ – нервное волокно; ПОП – периодонтобластическое пространство, заполненное дентинной жидкостью; ПП – пограничная пластинка (мембрана Неймана) [169]. Тубулы окружает перитубулярный дентин с диаметром 3.0±1.8 мкм и высоким объемным содержанием минералов 90±6% (рис. 3.6). Между тубулами с окружающим их перитубулярным дентином находится интертубулярный дентин, с меньшим, порядка 40±6% по объему, содержанием минерального компонента. Интертубулярный дентин на 90% по объему состоит из коллагеновых фибрилл со встроенными кристаллами минералов и на 10% по объему из межфибриллярного дентина. Фибриллы с диаметром 50-150 нм распределены в дентине с более или менее случайной ориентацией. Все составляющие, кроме тубул, содержат минеральные иглообразные кристаллы 46 гидроксиапатита диаметром 2.0—2.5 нм и выше, до ~5 нм, и длиной ~20 нм и выше, вплоть до 100 нм. [29] Рис. 3.6. Электронная микрофотография дентина зуба человека: ТД – тубулярный дентин; ПТД – перитубулярный дентин (более плотный и однородный); ИТД – интертубулярный дентин (более рыхлый и неоднородный) [29], cтр. 18, см. также [172]. Строение зуба характеризуется наличием структур, которые могут играть роль природных световодов, обеспечивающих достаточно высокую эффективность освещения пульпы почти независимо от того, как именно свет падает на поверхность зуба. В эмали функцию световодов могут выполнять эмалевые призмы, а в дентине – область между тубулами, причем в дентине волноводный эффект выражен сильнее. Указанные эффекты удовлетворительно описываются моделью волноводно-рассеивающей среды [173, 174]. 3.3.2. Использование ОКТ для исследования тканей зуба Основным ограничением проникновения видимого света с длиной волны 400– 700 нм в ткани зуба является рассеяние света [175]. В ИК диапазоне на длинах волн более 1500 нм основным фактором, ограничивающим глубину проникновения в ткань, становится поглощение излучения водой [176, 177]. Поэтому для ОКТ тканей зуба наиболее подходит диапазон длин волн от 700 до 1500 нм. В 2000, Otis и др. достигли высоких результатов, как по качеству ОКТ- 47 изображения, так и глубине зондирования тканей зуба, с использованием источников света с длиной волны 1310 нм и 850 нм [61]. В последние годы метод ОКТ получил достаточно широкое распространение в стоматологии [176]. Первые изображения тканей зуба in vitro были опубликованы в 1998 году [178]. Они были получены с использованием временной ОКТ на длине волны 1310 нм и сравнивались с микрофотографией при разрешении 17 мкм. Были продемонстрированы полученные in vitro методом ОКТ изображения переходных слоев «эмаль-цемент» и «десна-зуб» на образцах тканей зуба свиньи. Позднее была осуществлена ОКТ визуализация тканей зуба человека in vivo [179, 180]. На длине волны 1310 нм было достигнуто разрешение 12 мкм при значительной глубине зондирования 3 мм. На ОКТ изображениях уверенно определялись переход между эмалью и дентином и периодонтальные структуры. Метод ОКТ успешно применялся для визуализации изменений зубной ткани, вызванных кариесом в начальной стадии [181, 182] и в стадии развитого поражения [83, 181–183], для оценки тяжести поражения [83,183], степени реминерализации [184, 185], определения эффективности ингибирования деминерализации химическими агентами [184, 186]. Метод ОКТ использовали для проверки того, как различные агенты, содержащие фтор, ингибируют деминерализацию на модели кариеса in vitro [185], для оценки областей деминерализации вокруг ортодонтических скоб (брекетов) [186], для определения подвижности зубов при ортодонтических нагрузках [187]. Метод ОКТ применялся также для оценки состояния слизистой оболочки полости рта [182], состояния зубных имплантатов [188], целостности зубных протезов [183], их качества и подгонки [181, 182, 184, 188]. Warren и др. выполнили детальное исследование структуры зуба в направлении его вертикальной оси [189] и визуализировали переходные слои между эмалью и дентином, а также между дентином и цементом. Наряду со структурной визуализацией самих тканей зуба, метод ОКТ использовался также для обнаружения трещин [190–192]. В частности, Imai и др. 48 [190] использовали ОКТ для демонстрации того, как трещины эмали распространяются за границу раздела между эмалью и дентином. Другим важным применением ОКТ явилась визуализация приграничного микропросачивания между тканями зуба и пломбировочным материалом и/или эндодонтическим заполнителем [193–196], например, композитной смолы [196]. Применение ОКТ к комплексу «дентин-пульпа» [197] продемонстрировало возможность отличить пульпу от дентина на ОКТ-изображении и, следовательно, контролировать остаточный слой дентина поверх пульпы, обеспечивая более точный прогноз и тактику лечения зуба. В недавней статье [198] авторы приводят обзор своих ОКТ ex vivo исследований абфракции (микроструктурной потери зубного вещества в областях концентрации напряжения) и аттриции (потери твердых тканей зубов вследствие контакта зубов-антагонистов), дефектов материала и микропротечки на границе зубной ткани и заполнения, качества соединения между твердой тканью зуба и ортодонтическими скобами, результатов протезирования и микропротечки на границе протеза и др. Во всех случаях ОКТ демонстрирует более высокую чувствительность к структурным изменениям материала, чем обычные диагностические методы. Выше уже кратко упоминалось о применении ОКТ к диагностике кариеса, которым по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2009 году страдало 60%–90% детей школьного возраста и подавляющее большинство взрослого населения Земли [199]. Механический износ за счет трения также может приводить к потере зубов. ОКТ обеспечивает возможность раннего обнаружения кариеса [183, 200–202]. Обнаружение сильного двулучепреломления в эмали и анизотропного распространения света в тубулярной структуре дентина привело к тому, что многие исследования сосредоточились на применении поляризационно-чувствительной ОКТ к обнаружению кариеса [63, 65, 67, 203–210]. Первые ОКТ изображения кариеса с разрешением по поляризации были получены Baumgartner и др. [67, 203, 204]. Wang и др. измерили двулучепреломление в дентине и эмали и предположили, что призмы эмали ведут себя как волноводы [211] (о модели волноводно-рассеивающей 49 среды [173, 174] для тканей зуба уже говорилось выше). Поляризационно-чувствительная ОКТ пригодна для обнаружения вторичного кариеса, так как рассеивающие свойства восстановительных материалов и твердых тканей зуба существенно различаются [206, 207]. 3.4. Строение ногтя пальца человека и применение ОКТ для его иссле- дования Ноготь представляет собой особого рода роговое, твердое, пластинчатое и обыкновенно дорсальное выпуклое образование на коже кончиков пальцев рук и ног [212], рост которого происходит из сумкообразного вдавления верхнего слоя кожи (эпидермиса) на тыльной поверхности пальцев. Образование ногтя происходит в корне ногтя (матрице) - специализированной ткани, которая занимает нижнюю часть сумки ногтя от проксимального конца до «лунки» (рис. 3.7). Рис. 3.7. Анатомия кончика пальца человека и схематическое строение ногтя [213]. Участок матрицы ногтя примыкает к ногтевому ложу – преобразованному слою дермы, с которым прочно срастается нижняя поверхность ногтевой пластины с продольными валиками до гипонихия. Гипонихием называют 50 дорсальный участок эпидермиса между ногтевым ложем и кончиком пальца. Участки кожной складки, охватывающие ноготь проксимально и латерально, называют ногтевым валиком (перионихием). Серповидная задняя часть ногтя с расположенным снизу участком корня (участком матрицы), покрывающим дорсальный перионихий, образует эпителиальную кожицу, которая свободно примыкает к поверхности ногтя и называется ногтевой кожицей (кутикулой). Размеры поверхности и толщина ногтей значительно различаются в зависимости от возраста, индивидуальных особенностей человека и нахождения на различных пальцах ног и рук. Во внутреннем строении ногтя [214] гистологически различаются продукты дифференцировки матрицы ногтя, собственно ногтевой пластины, верхний слой из более плоских, плотных слоистых и сильно вытянутых вдоль клеток (верхняя часть ногтевой пластины или «дорсальный ноготь») и более толстый внутренний слой с большим количеством кубических клеток (нижняя часть ногтевой пластины или «промежуточный ноготь»), которые отчетливо различаются также по гистохимическим и электронно-оптическим свойствам (см. рис. 3.7). Слоистое строение ногтя с более жестким верхним и более эластичным нижним участком обеспечивает благоприятные механические свойства. К свободной части ногтя с нижней стороны прочно примыкает третий слой, который представляет продукт дифференцировки гипонихия и который при наличии патологических процессов может сильно разрастаться (гипертрофироваться) (гипонихиальный кератин или «вентральный ноготь»). Гипонихиальный кератин состоит из полиэдрических безъядерных клеток, расположенных более свободно и беспорядочно, чем в ногтевой пластине. В области ногтевого ложа происходит присоединение образованного этой зоной кератина к собственно ногтевой пластине [215]. Доступное расположение, благоприятные оптические свойства [216, 217] и структура ногтя, состоящая из относительно тонких слоев, делают его удобным объектом для ОКТ-визуализации in vivo. Поэтому в ряде публикаций, 51 посвященных разработке новых модификаций ОКТ и продвижению ОКТ на рынок медицинских услуг, ноготь используется как объект для иллюстрации возможностей метода. Так, например, в [218] примеры визуализации пальца человека, в частности, ногтевого валика, использованы для иллюстрации возможностей метода высокоскоростной ОКТ. В работе [219] с помощью ОКТ высокого разрешения на двух длинах волн 8400 и 1230 нм получены ОКТ изображения области ногтевого валика, на которых с высоким контрастом различаются роговой слой, эпидермис и базальная мембрана, слои ногтевой пластинки и кровеносные сосуды внутри дермы. Как иллюстрация возможностей различных модификаций метода ОКТ изображения ногтя человека использованы в [220–222]. Ноготь – удобный объект, для которого ОКТ открывает новые возможности неинвазивного получения функциональной и морфологической информации in vivo. Так, в работе [223] представлены результаты in vivo ОКТ микроангиографии (OMAG) изменений перфузии ногтевого валика пальца человека под действием внешнего механического давления. При ступенчатом изменении приложенной силы использование OMAG позволило визуализировать и количественно оценить изменяющуюся капиллярную перфузию тканей ногтевого валика. В работе [224] на 30 добровольцах успешно выполнено исследование типичной морфологии здоровых ногтей in vivo с помощью ОКТ и лазерной конфокальной сканирующей микроскопии (ЛКСМ) и исследовано влияние длительного смачивания водой на характер ОКТ изображения (увеличение толщины ногтя) и чрезногтевую потерю воды. Улучшенные по сравнению с УЗИ измерения толщины ногтей in vivo неинвазивно выполнены с помощью ОКТ в работе [225]. В клинической практике ОКТ позволяет идентифицировать поражения ногтя при онихомикозе [226] и псориазе [227]. В работе [228] показано, что в диагностике псориаза ОКТ превосходит ультразвуковую (УЗ) визуализацию высокого разрешения. В отличие от последней, ОКТ позволяет разрешать отдельные слои ногтевой пластинки с выраженным утолщением вентральной 52 пластины, которая становится сильно неоднородной с признаками эрозии и беспорядочного слияния с подстилающим эпидермисом, что коррелирует с клинической картиной подногтевого гиперкератоза. Подробное исследование возможностей ОКТ в прижизненном исследовании морфологии ногтевого аппарата в норме и при патологических состояниях в течение ряда лет ведется группой ученых Нижегородской государственной медицинской академии (см. [229–231] и ссылки в последней работе). Одним из результатов этих исследований явился запатентованный способ дифференциальной диагностики грибковых и псориатических поражений ногтевой пластинки на основе четко определенного перечня ОКТ признаков [232]. В разделе 5.1 мы используем in vivo ОКТ ногтя человека для решения новой экспериментальной задачи - оценки изменения оптических параметров отдельных слоев ногтя под действием оптического просветления глицерином и механического сжатия. 3.5. Строение жировой ткани и проблема разрушения адипоцитов Жировая ткань образуется из зародышевой соединительной ткани (мезенхимы) и состоит из жировых клеток — адипоцитов, основной объем которой занимает внутриклеточная жировая капля [233]. У позвоночных жировая ткань располагается главным образом под кожей (подкожно-жировая клетчатка) и в сальнике, между внутренними органами. Физиологическая роль жировой ткани состоит в защите организма от потери тепла и создании запаса энергии. Адипоциты имеют значительные размеры, достигающие миллиметра. Ядро находится на периферии клетки, а цитоплазма содержит много митохондрий (рис. 3.8). Цитоплазма жировой клетки, окружающая внутриклеточную каплю жира, содержит значительное количество органелл, определяющих метаболическую активность клетки. Жировую клетку окружает клеточная мембрана, которая снаружи соединяется с сеткообразной структурой рыхлой межклеточной субстанции, содержащей аргирофильные (способные связывать соли серебра) волокна, фиброциты, лимфоидные элементы и тучные клетки. Жировая ткань разделена соединительнотканными 53 перегородками и обеспечивается кровью через сетку мелких кровеносных сосудов с густой сетью капилляров. Рис. 3.8. Строение белой жировой ткани: (а) - адипоциты с удаленным жиром в световом оптическом микроскопе; (б) - ультрамикроскопическое строение адипоцитов: 1 - ядро адипоцита; 2 - крупные капли липидов; 3 - нервные волокна; 4 - гемокапилляры; 5 - митохондрии адипоцита; (в) – микрофотография жировой ткани (окраска суданом III): 1 - адипоциты; 2 кровеносный сосуд [234]. Иннервация жировой ткани осуществляется адренергическими волокнами, которые проходят вдоль кровеносных сосудов. Разветвленные окончания нервных волокон оплетают отдельные жировые клетки и кончаются на их клеточной мембране. Состав жировой ткани зависит от области тела, глубины слоя; он может также несколько отличаться у отдельных индивидуумов. Жировая ткань кроме жира содержит 22% воды, 5,8% белка, 15 ммоль/кг калия. Жирные кислоты представлены 42—51% олеиновой, 22—31% пальмитиновой, 5—14% пальмито-олеиновой, 3—5 % миристиновой, 1—5 % линолевой кислот [233]. Жировая ткань играет большую роль в метаболической регуляции как энергетического равновесия в организме, так и сосудистого гомеостаза [235, 236]. 54 Хорошо известно, что избыток жира в организме (ожирение) приводит к ряду заболеваний (см., например, [237, 238]). Имеются свидетельства того, что число жировых клеток человека меняется только в детстве и подростковом возрасте, а у взрослых остается постоянным даже при значительных колебаниях массы тела [239]. Меняется только содержание жира в адипоцитах. Ожирение за счет чрезмерного содержания в адипоцитах называется гипертрофическим. Однако при гиперпластическом ожирении [237] происходит необратимый рост числа адипоцитов. У взрослых это происходит при значительном превышении нормальной массы тела. Поэтому поиски наиболее безопасных методов снижения числа адипоцитов продолжаются (см., например, [240] и ссылки в этой работе). Одним из современных способов удаления жировых отложений является лазерный липолиз (селективный фототермолиз), позволяющий локально разрушать жировые клетки за счет нагрева интенсивным лазерным излучением [241–244]. Эта процедура менее травматична и сопровождается меньшими кровопотерями по сравнению с традиционной липосакцией. Существует два сценария гибели жировой клетки: некроз и апоптоз [245–249]. Основным результатом лазерного липолиза является некроз, который характеризуется разрывом клеточных мембран, разрушением органелл, высвобождением лизосомальных ферментов и выходом цитоплазмы в межклеточное пространство. Вокруг омертвевших тканей возникает реактивное воспаление, которое, в конечном счете, приводит к образованию рубца. В отличие от некроза, апоптоз не сопровождается воспалением окружающих тканей. Гибель клетки по сценарию апоптоза проявляется в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец, которые тут же фагоцитируются окружающими клетками [245–249]. Такой менее инвазивный 55 сценарий снижения числа адипоцитов через апоптоз или контролируемой некроз небольшого количества жировой ткани может быть обеспечен фотодинамическим/тепловым методом (ФД/ТМ) (см. [240] и ссылки в этой работе). ФД/ТМ вызывает необратимое повреждение светом биологических структур (или нарушение их функций) в присутствии кислорода, сенсибилизированное введенными в клетки или организмы хромофорами (например, красителями). В разделе 5.2 с помощью ОКТ на клеточном уровне будут исследованы процессы, возникающие в образцах жировой ткани in vitro после воздействия ФД/ТМ. 56 4 ОКТ-МОНИТОРИНГ ДИФФУЗИИ ИММЕРСИОННЫХ АГЕНТОВ В ОБРАЗЦАХ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO В настоящем разделе излагаются оригинальные результаты экспериментальных исследований, выполненных автором диссертации и опубликованных в статьях [109, 250–254]. 4.1. Подготовка образцов Исследовались образцы дентина и эмали зуба человека. Зубы удалялись в стоматологической клинике в результате плановой операции. После удаления для поддержания естественных свойств они хранились в физиологическом растворе при температуре ~ 4°C в защищенном от света месте. Смоченные водой образцы зубов распиливались с помощью алмазного диска вдоль и поперек дентинных канальцев. Полученные поперечные и продольные срезы дентина зуба человека затем шлифовались. В поперечном срезе дентинные канальца располагались перпендикулярно поверхности среза зуба. Для очистки от продуктов распиливания и шлифовки образцы обрабатывались ортофосфорной кислотой (37%) и помещались в ультразвуковую ванну на 10 минут. Затем измерялись толщины полученных образцов, которые в среднем составляли около 1 мм. Предварительно изображения готовых образцов регистрировались с использованием оптического микроскопа (Axio Imager, Carl Zeiss, увеличение 32). Пример микрофотографий среда дентина представлен на рис. 4.1. По полученным изображениям мы могли хотя бы приблизительно убедиться в эффективности очистки входов в дентинные канальцы, оценить размеры и плотность распределения тубул по поверхности спила и выбрать области для последующего исследования проникновения химических агентов с помощью ОКТ. 57 (а) (б) Рис. 4.1. Микрофотографии дентина среза зуба человека (Axio Imager, Carl Zeiss) (а) - увеличение 20×, (б) – увеличение 100×). Средний диаметр тубул – (5.423±1.097) мкм, плотность числа тубул – 12500 1/мм2. Далее выделялась подлежащая исследованию область поверхности образца. Остальная его поверхность покрывалась прозрачным быстросохнущим лаком с последующей просушкой в воздушном потоке. Таким образом мы стремились локализовать участок поверхности среза и исключить проникновение агента через боковые и нижние грани образца в исследуемую область. Размер окна, на которое не наносился прозрачный быстросохнущий лак, составляла 2 мм ×2 мм, что примерно вдвое больше толщины образца. Для экспериментов, в которых смачивание образца производилось с тыльной стороны по отношению к ОКТ-зондированию (см. рис. 4.6), оставлялись два окна на противоположных гранях образца. 4.2. Схема экспериментальной установки и методика обработки результатов 4.2.1. Описание экспериментальной установки. Эксперименты проводились с помощью системы THORLABS Spectral Radar OCT. Эта система представляет собой промышленный прибор, реализующий принцип спектральной ОКТ (см. раздел 2.2), предназначена для практических медико-биологических исследований, в том числе in vivo, имеет компактное настольное исполнение и снабжена подвижной зондирующей головкой. В 58 случае in vivo визуализации подвижный зонд может перемещаться вручную, а при проведении количественных измерений in vitro закрепляется на штативе. Внешний вид системы показан на рис. 4.2, а схема – на рис. 4.3. Конструкция прибора практически исключает доступ пользователя к его оптической схеме. Приведенные ниже сведения заимствованы из технического описания и руководства пользователя. Рис. 4.2. Фотография установки THORLABS Spectral Radar OCT. Рис. 4.3. Схема установки THORLABS Spectral Radar OCT. Широкополосное излучение от суперлюминесцентного диода (СЛД) с центральной длиной волны 930±5 нм, выходной мощностью 2 мВт и шириной спектральной полосы 100±5нм направляется в портативный зонд с 59 интерферометром Майкельсона, который делит свет на два отдельных пучка. Опорное плечо заканчивается зеркалом, а другое плечо содержит линзу, которая фокусирует свет на образец. Эта же линза используется для того, чтобы собрать рассеянный в направлении назад или отраженный от образца свет. Пучки из обоих плеч интерферометра совмещаются и направляются в спектрометр с разрешением по длине волны 0,14 нм, который пространственно разделяет свет различных частот для формирования интерференционной картины (в данном случае - зависимости интенсивности от длины волны), которая затем анализируется для получения спектрального ОКТ изображения. Если бы длина предметного плеча была фиксирована, то есть в предметном плече также стояло бы зеркало, то интерференционная картина имела бы вид синусоидальной функции длины волны. Фурье-образ такой картины представляет собой один узкий пик. Однако, в связи с тем, что свет, идущий назад от образца, берет начало на разной глубине, возникает амплитудная модуляция синусоидальных колебаний интенсивности в зависимости от длины волны. Фурье-образ этой зависимости дает интенсивность рассеянного в обратном направлении или отраженного света как функцию глубины (аксиальное или А-сканирование). Аксиальное разрешение системы в свободном пространстве составляет при этом 6,2 мкм. Весь необходимый сбор информации, а также ее обработка осуществляется с помощью пакета программного обеспечения, который содержит полный набор функций для управления процессом измерения, сбором, хранением и обработкой данных измерения, а также для показа на экране ОКТ изображений. Съемка может производиться со скоростью 8 кадров в секунду, что позволяет наблюдать нестационарные процессы. Максимальные размеры изображаемой области составляют 1,6 мм по глубине и 6 мм по ширине. Это изображение записывается и хранится в виде двумерного массива, имеющего 512 строк (по глубине) и около 2000 столбцов (по ширине) и отображается на экране монитора ПК, как поясняется ниже. На рис. 4.4 показан интерфейс программного обеспечения. 60 Рис. 4.4. Интерфейс программного обеспечения. В окне интерфейса программного обеспечения можно выделить 5 основных панелей: панель управления параметрами изображения, панель Ацикла и панель В-цикла сканирования, панель изображения, полученного с помощью ПЗС-камеры, и панель записи и сохранения данных. С помощью панели управления параметрами изображения можно регулировать число столбцов, то есть поперечный размер изображаемой области, а также режим графического представления записанного изображения на экране монитора (контраст, яркость, фильтрация, имитирующая освещение источником света с различным спектральным составом). Экран А-цикла сканирования показывает продольный цикл сканирования в одной точке поверхности. Экран В-цикла сканирования показывает серию А-циклов сканирования, давая изображение образца в поперечном сечении. Линейка визуализации используется для установки границ показа изображения. С помощью панели изображения, полученного ПЗС-камерой, регулируется количество временно сохраняемых изображений и палитра полученных изображений (серая или цветная шкала). 61 С помощью панели записи и сохранения данных можно наблюдать профиль отдельного А-скана вдоль линии одного курсора. 4.2.2. Обработка полученных данных. Модель формирования сигнала ОКТ Обработка ОКТ-изображений, полученных в ходе экспериментов, осуществлялись следующим образом [252–254]. Выбиралась некоторая область ОКТ-изображения (рис. 4.5(а)), внутри которой с целью подавления шумовой составляющей сигнала проводилось усреднение по группе соседних столбцов исходной матрицы изображения (по группе А-сканов, пример одного из которых приведен на рис. 4.5(б)). (а) (б) (в) Рис. 4.5. Пример ОКТ-изображения среза дентина зуба человека. Прямоугольником выделена область усреднения (а). Пример единичного Аскана, местоположение которого на рис. (а) указано линией (б). Пример Аскана после усреднения по указанной на рис. (а) области (в). 62 При выборе области усреднения мы визуально оценивали ОКТ изображение и стремились, с одной стороны, охватить большее число Асканов, а с другой стороны остаться в пределах макроскопически однородной области, избегая включения разнородных структур ткани. Для каждой выбранной области получалась усредненная зависимость интенсивности сигнала ОКТ от глубины (рис. 4.5(в)). Возможность ОКТ мониторинга проникновения химических веществ в биоткань основана на изменении ее оптических свойств, которое приводит к изменению формы А-скана [105–108]. Рассмотрим модель формирования ОКТ сигнала в среде с заданными оптическими свойствами [255], учитывающую как рассеивающие свойства среды, так и геометрию пучков света, согласно которой средний квадрат тока гетеродинного сигнала, измеряемого ОКТсистемой, можно представить как произведение i2 z i2 2 где i 0 0 z, (4.1) - сигнал в отсутствие рассеяния, а z - фактор, описывающий де- градацию сигнала за счет рассеяния. Сигнал в отсутствие рассеяния определяется как i2 0 2 Pr Ps b / wH 2 (4.2) где - коэффициент преобразования мощности в ток гетеродина; Pr и Ps мощность опорного и предметного пучков, b - эффективное сечение рассеяния назад, wH - радиус пробного пучка на уровне 1/ e от максимума на глубине зондирования. Для гауссова зондирующего пучка [255] 2 wH 2 2 B B w0 A , f kw0 2 (4.3) где A , B - элементы матрицы ABCD , описывающей распространение пучка от плоскости линзы до зондируемой глубины внутри образца. В случае, когда фокальная плоскость предметного пучка зафиксирована на поверхности образца, 63 A 1 и B f z / n . Величина w0 представляет собой радиус предметного пучка на уровне 1/ e от максимального значения интенсивности в плоскости линзы, а n - средний показатель преломления образца. Согласно [255], фактор, учитывающий рассеяние в образце, определяется выражением z exp 2s z 2 exp s z 1 exp s z 1 ws / wH 2 1 exp s z wH / ws 2 2 (4.4) Первый член в (4.4) описывает вклад однократного рассеяния, третий – вклад многократного рассеяния, а второй – перекрестное воздействие того и другого. Величина ws представляет собой 1/ e -радиус предметного пучка на глубине зондирования при наличии рассеяния, то есть [255] B B 2B ws2 w02 A f kw0 k 0 z 2 2 2 (4.5) где z - поперечная длина когерентности. Вывод этой величины [255, 256] показывает, что 0 z 3 nB s z rms z , (4.6) где rms - среднеквадратичный угол рассеяния, определенный как полуширина гауссовой кривой, аппроксимирующей фронтальный лепесток фазовой функции рассеяния [257] Уравнения (4.1) - (4.6) использованы в [258] в качестве основной математической модели для решения обратной задачи – извлечения оптических параметров среды из экспериментального сигнала ОКТ. В широко используемом приближении однократного рассеяния [259, 260] из формул (4.1), (4.2) и (4.4) получается выражение для наблюдаемого сигнала ОКТ, пропорционального среднеквадратичному току фотоприемника: 64 I z i 2 z 2 Pr Ps b / wH 2 exp s z (4.7) С учетом поглощения коэффициент рассеяния в (4.7) заменяется на коэффициент полного ослабления t s a , где a - коэффициент поглощения [259, 260]. В большинстве биологических тканей s a , и ослабление сигнала обусловлено, в основном, рассеянием. Приближение однократного рассеяния на практике успешно использовалось, при ОКТ исследованиях таких сильно рассеивающих объектов, как кровь [261]. Подробное обсуждение рассматриваемой модели и ее приложений см. в книгах [259, 260]. Из формул (4.1) – (4.7) следует, что даже в приближении однократного рассеяния зависимость сигнала ОКТ от координаты z (форма А-скана) может быть сложной и определяется несколькими факторами: ослабление предметной волны при прохождении до зондируемого слоя и обратно, описываемое экспонентой в (4.7); зависимость радиуса зондирующего пучка от глубины wH z согласно формуле (4.3); структурная неоднородность среды, приводящая к зависимостям b z и t z . Если z f и в пределах глубины зондирования предметная волна почти плоская, то можно пренебречь зависимостью радиуса зондирующего пучка от глубины wH z и считать wH const . Неоднородность среды можно явно учесть, переписав (4.7) с заменой s на t s a в виде I z z i 2 z 2 Pr Ps b z / wH 2 exp t z ' dz ' 0 (4.8) В наших экспериментах сигнал ОКТ записывался и сохранялся в логарифмическом масштабе, поэтому для анализа зависимости (4.8) удобно 65 ввести функцию R(z)=ln[I(z)] и определить ее наклон по двум значениям оптической глубины z1 и z2: R z2 R z1 b z2 1 z 2 z 1 1 ln t z ' dz ' ln b 2 t , z 2z b z1 z z1 2z b z1 (4.9) z 1 2 где ∆z = z2 - z1, а t t z ' dz ' - средний коэффициент ослабления в слое z z1 ∆z. Величина (4.9) известна как средний наклон сигнала ОКТ (SSOCT) и используется как диагностический параметр состояния рассеивающих сред [105–108, 259, 260]. Из-за неоднородности биоткани правая часть (4.9) может зависеть от выбора точек z1 и z2. Эта зависимость становится пренебрежимо малой, если зондируемый слой среды почти однороден. Если сечение b z одинаково на глубинах z1 и z2, то наклон сигнала ОКТ однозначно связан со средним коэффициентом ослабления. Если коэффициент отражения α(z) случайным образом флуктуирует вблизи некоторого среднего значения (случайный ансамбль отражателей), то соотношение (4.9) позволяет приближенно определить средний коэффициент ослабления, причем точность этого приближения растет с увеличением ∆z, поскольку первое слагаемое в правой части (4.9) есть отношение флуктуирующей, но ограниченной величины ln b z2 к растущей величине ∆z. b z1 При диффузии иммерсионного агента оптические параметры случайнонеоднородной среды могут существенно меняться из-за оптического просветления [148, 149]. Это приводит к временной зависимости среднего наклона сигнала ОКТ, по которой можно рассчитать коэффициент проницаемости биоткани [109] P zreg treg . (4.10) где zreg – толщина слоя, treg - время от начала диффузии до ее насыщения. В нашем случае zreg z , а в качестве treg бралась постоянная времени, 66 вычисляемая из экспоненциальной аппроксимации временной зависимости наклона сигнала ОКТ, вид которой, как правило, не позволял определить время насыщения слоя непосредственно из графика. В заключение заметим, что экспоненциально убывающая величина I z - не интенсивность отраженного сигнала, как иногда утверждается в литературе, в том числе некоторых наших ранних работах [251–253, 262]. Это хорошо видно из формулы (4.7), содержащей мощность предметной волны под знаком квадратного корня. Ошибочное отождествление I z с отраженной интенсивностью приводит к появлению лишнего множителя 2 в показателе экспоненты и, соответственно к двукратному занижению t , определяемого из (4.9). Разъяснение вопроса содержится в книге [259], стр. 477. В наших последующих работах (см. [109] и более поздние статьи) данная ошибка устранена. Важно заметить, что это не влияет на величину коэффициента проницаемости P (формула (4.10)), так как для его вычисления важен не сам наклон сигнала ОКТ, а скорость его изменения со временем. 4.3Результаты измерений и их обсуждение 4.3.1 Мониторинг проникновения воды и глицерина в ткани зуба методом ОКТ Образцы дентина зуба человека, приготовленные как описано в разделе 4.1, смачивались химическими агентами по двум схемам. В первом случае (рис. 4.6 схема А) образец погружался в кювету, соединенную посредством трубки со шприцом, с помощью которого регулировалось заполнение кюветы агентом. ОКТ-сканирование образца производилось через слой жидкости покрывающей образец. Во втором случае (рис. 4.6 схема Б) образец приклеивался к окошку кюветы. Смачивание образца химическим агентом производилось с тыльной стороны образца по отношению к зондированию. Смысл использования двух схем смачивания состоял в следующем. В исследуемых образцах рассеяние вносит вклад как в формирование диффузно отраженного назад светового потока, так и в ослабление сигнала при 67 прохождении слоя среды. Это означает, что под влиянием диффузии следует ожидать изменений как µt, так и b z . Относительный вклад того и другого зависит от схемы аппликации агента (то есть от того, где раньше происходит просветление: в зондируемом слое или на пути к нему), что подтверждается результатами, приведенными ниже. Схема А Схема Б Рис. 4.6. Схемы аппликации химического агента и регистрации ОКТ-сигнала. 1 – кювета с агентом, 2 – исследуемый образец, 3 (жирная черная линия) – слой быстросохнущего прозрачного лака. В обоих случаях ОКТ-сканирование образца, находящегося в контакте с проникающим агентом, производилось многократно в течение нескольких часов через одинаковые промежутки времени (8 и 11 сек). Для сравнения предварительно осуществлялось сканирование каждого образца до его контакта с агентом. В качестве агентов использовались вода и 44% водный раствор глицерина. Глицерин был выбран как широко применяемый просветляющий агент для различных биологических тканей. Проникновение воды в зубную ткань представляет интерес в связи с ее ролью в функционировании живого зуба, а также с имеющимися данными о влиянии воды на механическую прочность этой ткани [172]. Пластинки дентина перед проведением эксперимента подвергались подсушиванию в потоке теплого воздуха, и процесс проникновения воды в ткань можно рассматривать как частичное замещение воздуха водой в пористой среде. На эффективность такого процесса указывают ранние эксперименты по взвешиванию зубной ткани до и 68 после ее пропитки водой [139]. Механизм проникновения воды сложный. Как показывают наши наблюдения, он не похож на чистое капиллярное впитывание, при котором в среде распространяется резкая граница между смоченной и сухой областями. Хотя замещение воздуха водой в порах нельзя назвать диффузией, наблюдаемый по оптическому просветлению дентина процесс проникновения воды имеет определенное сходство с диффузией в том, как ведет себя локальная концентрация воды в пространстве и времени. Каков бы ни был детальный механизм проникновения воды, ее показатель преломления 1.333 ближе к показателю преломления дентина 1.6 [29], чем показатель преломления воздуха, что обеспечивает условия для оптического просветления (смоченный образец прозрачнее сухого). В пользу применимости приближения однократного рассеяния к обработке результатов нашего эксперимента свидетельствует то, что фактор анизотропии g для дентина значительно меньше единицы и составляет 0,44 [29]. Результаты обработки экспериментальных данных, приведенные на рис. 4.7, демонстрируют выраженную зависимость скорости проникновения воды от структуры образца, главным образом от диаметра и плотности числа тубул. Чем больше средний диаметр тубул, тем меньше время насыщения (см. табл. 2). Уменьшение времени насыщения происходит и с ростом плотности числа тубул. При аппликации воды со стороны оптического зондирования (рис. 20 схема А) процесс проникновения воды в образец отчетливо проявляется в уменьшении среднего наклона функции R(z), основной вклад в который в этом случае дает средний коэффициент ослабления [рис. 4.7(а)]. Действительно, при такой схеме аппликации вода в первую очередь смачивает и просветляет поверхностные слои образца, ответственные за ослабление сигнала. При аппликации агента с тыльной стороны образца (рис. 20 схема Б) уменьшение среднего наклона зависимости R(z) менее очевидно [рис. 4.7(б)]. Более того, по обращенному порядку следования кривых на рис. 4.7 (а) и (б) может показаться, что на рис. 4.7 (б) наклон вообще растет. Это не так, если помнить, что наклон вычислялся по средней части А-сканов, и если на рис. 4.7 (а) он снижается за счет подъема «хвоста», то на рис. 4.7 (б) - за счет более быстрого спада начальной части кривых, тогда как «хвосты» совпадают. Различие в изменениях формы А-сканов можно объяснить тем, что в случае смачивания с тыльной стороны (рис. 4.7 (б)) распространяющийся агент в первую очередь 69 достигает тонкого зондируемого слоя и уменьшает b z еще до насыщения агентом слоев, лежащих ближе к фронтальной грани. Важно, однако, что характерное время насыщения среднего наклона функции R(z) для схем аппликации А и Б [рис. 4.7 (а) и (б)] получается практически одинаковым. При этом схема Б выгодно отличается тем, что в ней отсутствуют артефакты, вызванные наличием прозрачного слоя жидкости переменной толщины перед образцом. (а) (б) (в) (г) Рис. 4.7. Усредненные А-сканы, полученные в различные моменты времени при смачивании образца по схемам А и Б соответственно (а, б). Временные зависимости среднего наклона функции R(z) и их экспоненциальная аппроксимация при смачивании образца водой по схемам А и Б соответственно (в, г). Образец № 1. Интервал глубин 150-300 мкм. Для оценки коэффициента проницаемости дентина P использовалось выражение (4.10), причем постоянная времени определялась на основе экспоненциальной аппроксимации зависимости наклона ОКТ сигнала от времени [сплошные линии на рис. 4.7 (в) и (г)]. Значения коэффициента 70 проницаемости приведены в таблице 4.1. Бросается в глаза значительный разброс значений коэффициента проницаемости дентина по отношению к воде от образца к образцу, причем решающее значение имеет средний диаметр тубул, который сильно меняется от зуба к зубу и от одной части зуба к другой. Таблица 4.1. Структурные параметры дентина, полученные на основе микрофотографий дентина, и характеристики диффузии, полученные на основе ОКТ измерений № образ ца Толщина образца, dоб, мм Средний диаметр тубул, мкм Агент Время насыщения , мин Коэффициент проницаемости, см/с 1 0.9 0.6±0.1 вода 78 (3.0±0.1)×10–6 2 1.3 2.3±0.1 вода 9 (4.0±0.2)×10–5 3 1.2 1.6±0.1 вода 154 (2.1±0.6)×10–6 4 0.8 2.4±0.5 44% водный раствор глицер ина 54 (1.5±2.2)× 10–5 4.3.2 Исследование изменений дентина под действием глюкозы методом ОКТ Содержание глюкозы в дентине зуба существенно как для функционирования зуба, так и для диагностики проявлений сахарного диабета. С помощью ОКТ нами были проведены экспериментальные исследования воздействия водного раствора глюкозы на образцы дентина зуба человека [109, 263]. Первой задачей было сравнение проницаемости образца для водного раствора глюкозы и чистой воды. Вторая задача заключалась в выяснении последствий длительного вымачивания образца в водном растворе глюкозы. Такое воздействие можно рассматривать как попытку имитации in vivo условий, возникающих для зубной ткани при наличии нарушений сахарного обмена, в частности, сахарного диабета. На настоящей начальной стадии экспериментов последствия длительного воздействия глюкозы на ткань зуба оценивались по проницаемости образца по отношению к воде до и после длительного содержания в водном растворе глюкозы. Процедура предварительной 71 подготовки образца к ОКТ- исследованию была одинаковой в обоих случаях (см. раздел 4.1). В первой серии экспериментов наблюдалось изменение среднего наклона сигнала ОКТ по описанной выше методике для одного и того же образца дентина с целью сравнения проницаемости дентина по отношению к дистиллированной воде и 35% водному раствору глюкозы. Результаты представлены на рис. 4.8. Рис. 4.8. Временные зависимости среднего наклона ОКТ сигнала при смачивании образца дистиллированной водой и 35% водным раствором глюкозы. Интервал глубин 60-240 мкм. Рис. 4.9. Временные зависимости среднего наклона ОКТ сигнала при смачивании образца дистиллированной водой до (1) и после (2) пяти суток 72 его инкубирования в 35% водном растворе глюкозы. Интервал глубин 60-240 мкм. Во второй серии экспериментов проницаемость образца дентина по отношению к воде исследовалась до и после его длительного (5 суток) нахождения в 35% водном растворе глюкозы. Сначала проводилось исследования проникновения воды в образец, подготовленный по стандартной методике (раздел 4.1). Затем образец помещался на 5 суток в 35% раствор глюкозы, после чего был промыт и высушен в соответствии со стандартной процедурой обработки. После этого повторялось ОКТ исследование проникновения воды и сравнивались результаты, полученные до и после выдерживания в растворе глюкозы. Результаты представлены на рис. 4.9. Проведенные измерения позволяют сделать ряд выводов. Как и следовало ожидать, раствор глюкозы проникает в дентин зуба человека намного медленнее, чем вода (см. рис. 4.8). Длительное нахождение образца дентина в растворе глюкозы привело к необратимым изменениям его свойств, что видно по значительной разнице графиков на рис. 4.9. После выдерживания в растворе глюкозы вода значительно быстрее проникает в дентин. На рис 4.9 это наиболее очевидно выражается в том, что спад наклона сигнала ОКТ начинается раньше, поскольку вода раньше достигает сканируемых слоев биоткани. При более внимательном анализе видно, что и сам спад происходит круче, то есть после пребывания в растворе глюкозы образец быстрее пропитывается водой. Для оценки постоянной времени установления наклона ОКТ сигнала, которую можно приближенно принять за оценку экспоненциальная аппроксимация времени y t y0 Ae диффузии, t t0 / использовалась . Параметр t0 учитывал различное время начала спада зависимостей на рис. 4.9, причем сам спад аппроксимировался экспонентой. В результате аппроксимации оказалось, что постоянная времени τ, первоначально равная (0.72±0.45) мин, после длительного пребывания образца в растворе глюкозы стала равной (0.48±0.04) мин., то есть уменьшилась в 1.5 раза. Времена задержки (начала спада кривых) на рис. 4.9 73 различаются примерно в 1.9 раза, что согласуется по порядку величины, особенно с учетом значительной ошибки аппроксимации для первоначального значения τ. Соответствующие коэффициенты проницаемости дентина по отношению к воде до и после пребывания образца в 35% водном растворе глюкозы составляют (2,6±1,6)×10-4 см/с и (3,9±0,4)×10-4 см/с. Механизм обнаруженного изменения требует дальнейшего исследования, однако, можно предположить, что увеличение проницаемости образцов по отношению к воде связано с влиянием раствора глюкозы на интертубулярный дентин, который становится более плотным, оставляя больше свободного пространства для проникновения воды внутри тубул. Сделанные выводы носят предварительный характер. Для их проверки необходимы повторные измерения на различных образцах с набором необходимой статистики, а также дополнительные исследования, в том числе с применением усовершенствованных математических моделей, с целью интерпретации механизма изменений, сопровождающих накопление глюкозы в дентине зуба человека. Однако эти результаты вполне достоверно показывают различия в проницаемости дентина зуба по отношению к агентам в норме и после длительного воздействия глюкозы. 74 5 ОКТ ИЗМЕРЕНИЯ В ТКАНЯХ НОГТЯ IN VIVO И ОБРАЗЦАХ ЖИРОВОЙ ТКАНИ 5.1. ОКТ визуализация тканей пальца человека Как отмечалось выше, ноготь пальца человека – удобный объект для ОКТ исследований in vivo, отраженных в ряде публикаций (см. ссылки в разделе 3.4). Одним из малоисследованных вопросов остается воздействие химического агента в сочетании с механическим давлением на систему эпителиальных и фиброзных тканей ногтя пальца человека. Результаты ОКТ исследований данного вопроса, излагаемые ниже, подробно описаны в нашей работе [262] и более кратко – в нашем обзоре [109]. Исследовались эпителиальные и фиброзные ткани под ногтем мизинца мужчины-добровольца в возрасте 66 лет. Верхний слой ногтя был частично удален с помощью маникюрной алмазной пилочки. На рис. 5.1 показан схематический разрез пальца с частично удаленным ногтем. Рис. 5.1. Схематическое представление пальца руки с удаленным верхним слоем ногтевой пластинки. Производилось ОКТ-сканирование в нескольких участках ногтя при касании пластикового ограничителя оптического зонда, ОКТ-сканирование при надавливании ограничителя на ноготь и ОКТ-сканирование после 20 минутного воздействия глицерина на поверхность ногтевой пластинки с частично удаленным верхним слоем. Надавливание осуществлялось с целью уплотнения ткани ногтя и выдавливания части объема крови из области измерений, что должно способствовать увеличению прозрачности и, соответственно, глубины зондирования структур ткани. Как известно из ряда работ, подробный обзор которых недавно выполнен Гениной и соавторами 75 [149], механическое сдавливание, как и иммерсия, является одним из механизмов оптического просветления биотканей. Глицерин также применялся как просветляющий химический агент. При этом сдавливание сильно влияет на перфузию биотканей, тогда как иммерсия главным образом снижает разность показателей преломления. Обработка полученных данных осуществлялась по методу, описанному в разделе 4.2. При пересчете оптической глубины в геометрическую (zгеом=zопт/n, где n –показатель преломления биоткани) использовались следующие значения показателей преломления nногтя=1,51; nэпидермиса=1,43; nдермы=1,38. Учитывалось также, что для всех биологических тканей коэффициент поглощения в рассматриваемой области длин волн 930100 нм мал, и основной вклад в ослабление сигнала ОКТ вносит рассеяние [29, 144, 259, 260]. Для трех различных участков ногтя мизинца, отличающихся расстоянием от края ногтя, получены ОКТ изображения, в результате обработки которых построены усредненные А-сканы, по наклону которых затем определены значения среднего коэффициента ослабления для каждого слоя (ноготь, эпидермис, дерма). Основной вклад в ослабление дает рассеяние, поэтому фактически определяется коэффициент рассеяния указанных тканей. На рис. 5.2а-в показано положение участков 1, 2, 3 и направлений латерального сканирования, а на рис. 5.3 и 5.4 приведены соответствующие ОКТ-изображения и обработанные зависимости сигнала ОКТ от глубины (усредненные А-сканы). Сравнение рис. 5.3 и 5.4 показывает, что усредненный А-скан дает больше информации о структуре слоев ткани, чем простая ОКТ визуализация. В частности, по рис. 5.3а трудно судить о скорости ослабления сигнала в тонком слое ногтя, который выглядит как полоса примерно одинаковой яркости, тогда как обработанный А-скан (рис. 5.4а) такую информацию содержит. Положение границы между эпидермисом и дермой также лучше видно на усредненном А скане, чем на ОКТ-изображении, выводимом на экран монитора. Сказанное относится и к другим участкам ногтя, исследованным в данном эксперименте. 76 (а) (б) (в) Рис. 5.2 - Фотографии пальца с указанием исследуемых участков 1 (а), 2 (в) и 3 (в), а также направления латерального сканирования. (а) (б) (в) Рис. 5.3. ОКТ-изображение тканей под ногтем мизинца для исследуемых участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) 77 (а) (б) (в) Рис. 5.4 - Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования (усредненный А-скан) для тканей под ногтем мизинца для участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) и рассчитанные значения коэффициента ослабления (рассеяния) для разных слоев ткани. 78 Участок 2 выбирался ближе к краю ногтя (рис. 5.2б), причем направление В-сканирования не отличалось от такового для участка 1. Рис. 5.3б и 5.4б наглядно показывают, что ближе к краю ногтя толщина и структура лежащего под ним эпидермиса меняются по сравнению с участком 1. Участок 3 был выбран на самом краю ногтя (рис. 5.2в). На рис. 5.3в и 5.4в видно, что с переходом в эту область ногтевая пластинка становится толще, меняются также толщина и структура лежащих под ней слоев. Это, конечно, связано с тем, что часть ногтя была спилена, так как у интактного ногтя середина толще. На рис. 5.4 цветом выделены слои ногтя, эпидермиса и дермы, засечками отмечены границы наблюдаемых слоев и численно указаны глубины их расположения. Матрикс ногтевого ложа не попадает в область наблюдения, которая находится ближе к концу пальца. По наклону спадающих участков Асканов оценены и указаны на рисунках «локальные коэффициенты ослабления» слоев. Эта оценка является весьма условной и требует комментария, так как наклон сигнала ОКТ равен среднему коэффициенту ослабления только в макроскопически однородном слое. Для фантома из чередующихся макроскопически однородных резко разграниченных слоев с большими и малыми сечениями рассеяния назад А-скан имел бы зубчатую форму (рис. 5.5а), причем наклон вершин зубьев и дна впадин между ними был бы связан с ослаблением сигнала каждым однородным слоем. Рис. 5.5. Схематический вид идеализированного А-скана (толстая линия) для фантома, состоящего из однородных резко разграниченных слоев, в которых b z (тонкая линия) меняется периодически (а) и монотонно увеличивается ступенями (б). Если фантом состоит из слоев, у которых сечение рассеяния назад растет с увеличением глубины, то на границах слоев сигнал ОКТ делает скачок вверх, 79 а затем плавно спадает за счет ослабления. В любом случае должен наблюдаться в целом спадающий ход А-скана, поскольку и формирование полезного сигнала (рассеяние назад), и его ослабление (рассеяние во всех других направлениях плюс поглощение) уменьшают мощность предметной волны по мере углубления в среду. Реальные А-сканы на рис. 5.4. имеют участки плавного возрастания и убывания. Если причиной возрастания может быть только рост отражающей способности среды, то убывание может быть связано как с уменьшением отражения, так и с ослаблением сигнала по пути до зондируемого слоя и обратно. Оценки на рис. 5.4 далее на рис. 5. 7 и 5.9 проведены в приближении, что участки убывания на А-скане обусловлены именно ослаблением (аналогично фантому, показанному на рис. 5.5 (б)), а отражение от слоя к слою только растет. Это предположение нуждается в дополнительной проверке, поэтому приведенные оценки локального коэффициента ослабления слоев являются условными. В частности, плавный рост отражения назад внутри слоя может уменьшать наклон сигнала ОКТ на соответствующем участке А-скана, что даст заниженное значение t . Возможно, что именно в этом заключается причина отличия полученных здесь значений t от известных данных для кожи [317]. Следующее ОКТ-зондирование проводилось на участке 1 с надавливанием на поверхность ногтя ОКТ-зондом. Результаты представлены на рис. 5.6 и 5.7. Рис. 5.6 - ОКТ-изображение тканей под ногтем мизинца при надавливании. 80 Рис. 5.7. Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования для тканей под ногтем мизинца при надавливании и рассчитанные значения коэффициента ослабления (рассеяния) для разных слоев ткани. На следующем этапе исследования на участках, приблизительно совпадающих с участками 1, 2 и 3 на рис. 5.2, проводились измерения с предварительным нанесением на поверхность ногтя глицерина в качестве просветляющего агента. Соответствующие ОКТ-изображения приведены на рис. 5.8, а сигналы ОКТ в зависимости от глубины сканирования - на рис. 5.9. Оценки среднего коэффициента ослабления в ногтевой пластинке, эпидермисе и дерме по среднему наклону сигнала ОКТ в соответствующих слоях приведены в таблице 5.1. Эти оценки, как и приведенные на рисунках 5.4, 5.7 и 5.9, сделаны в предположении, что средний наклон сигнала ОКТ обусловлен только ослаблением сигнала, то есть без учета возможных изменений сечения рассеяния назад. Из ОКТ изображений и усредненных А-сканов видно, что толщина эпидермиса и дермы под ногтевой пластинкой сильно зависит от расстояния до ее края. Видно, что и аппликация глицерина, и компрессия существенно влияют на форму А-сканов и коэффициенты ослабления слоев. Более детальное рассмотрение позволяет предположить, что ноготь в глицерине утолщается и набухает, а далее отдает его в кожу, где эпидермис с дермой хорошо просветляются. При компрессии ситуация иная. Ноготь размягчен (так 81 как счищен верхний твердый слой) и хорошо подвержен компрессии, так же реагирует эпидермис, но реакции дермы не видно. Значит, выдавливания крови нет или его просто не видно на длине волны 930 нм. Надо заметить также, что видимая на А сканах толщина слоев оптическая, то есть может меняться, если в результате надавливания или проникновения глицерина изменился показатель преломления. (а) (б) (в) Рис. 5.8 - ОКТ-изображение тканей под ногтем мизинца для исследуемых участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) после 20-минутного нанесения глицерина. 82 (а) (б) (в) Рис. 5.9 - Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования для тканей под ногтем мизинца для исследуемых участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) после двадцатиминутного нанесения глицерина. 83 Таблица 5.1. Оценки коэффициента ослабления для ногтя, эпидермиса и дермы на различных участках интактного ногтя, а также в условиях просветления глицерином и при механическом надавливании. Участок μt,см-1 μt после 20 минутного μt при надавливании, см-1 применения глицерина, см-1 ноготь эпидермис дерма ноготь эпидермис дерма ноготь эпидермис дерма 1 431,2 64,8 19,6 613,4 34,6 16,2 343,6 16,4 19,6 2 556,2 36 - 513,6 46 - - - - 3 424 40 9 528,2 32 - - - - Несмотря на предварительность полученных результатов и отмеченную выше условность оценок коэффициентов ослабления слоев, они могут быть полезны в дальнейших исследованиях, направленных на создание новых типов оптических датчиков для мониторинга содержания глюкозы, гемоглобина и других аналитов в тканях, когда палец является информационным объектом. 5.2ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой ткани В настоящем разделе показано, что с помощью ОКТ успешно обнаруживаются фотоиндуцированные морфологические изменения жировой ткани in vitro, обусловленные фотовоздействием. В работах [264–266] автором диссертации были получены и исследованы ОКТ-изображения слоев жировой ткани, на основании которых был сделан вывод о том, что наблюдаемые изменения связаны с липолизом жировых клеток и их разрушением за счет фотодинамического эффекта. Методы неинвазивного или малоинвазивного удаления лишних жировых клеток необходимы для решения важной медицинской проблемы борьбы с ожирением (см. раздел 3.5). Недавно было показано, что фотодинамические/фототермические эффекты в жировой ткани, окрашенной бриллиантовым зеленым (БЗ) или индоцианиновым зеленым (ИЗ) красителями, при облучении светодиодом или полупроводниковым лазером ближнего ИК диапазона приводят к липолизу жировых клеток и их гибели по сценарию апоптоза [267, 268]. Установлено, что в результате 84 светоиндуцированной перколяции внутриклеточное вещество вытекает в интерстициальное пространство [269], что приближает показатель преломления интерстициальной жидкости, исходно равный ni 1.36, к показателю преломления внутриклеточного вещества жировых клеток na 1.44 и повышает однородность и прозрачность образца [270, 271]. Применение ОКТ для исследования изменений морфологии жира в ходе фотодинамического воздействия в наших работах [264–266] впервые позволило проследить за указанными процессами во времени на клеточном уровне. Рассмотрим эти эксперименты более подробно. Постановка эксперимента. Экспериментальная установка включала подробно описанную в разделе 4.2 портативную ОКТ систему THORLABS Spectral Radar OCT System. Образцы представляли собой срезы жировой ткани человека, удаленной в ходе плановых хирургических операций, толщиной 200—600 мкм и площадью 0.5×0.5 см2. Процедура подготовки образцов подробно описана в [266]. Образцы помещались в термостабилизирующий держатель, соединенный с термостатом TJ-TC-01, что позволяло контролировать температуру образца в пределах от +30 до +60°С с точностью of ±0.1°С. После установления температуры начиналось ОКТ исследование, причем первое изображение получалось от интактного образца. Затем каждый срез жировой ткани делился прокладками на 4 зоны. Первая зона была контрольной, где жир не подвергался воздействию ни света, ни красителей. Вторая зона окрашивалась водно-спиртовыми растворами ИЗ и БЗ с концентрацией 1 мг/мл и 6 мг/мл, соответственно. Третья зона подвергалась воздействию света, источниками которого служили либо диодный лазер (LS2-N-808-10000, длина волны 808 нм, экспозиция 5 мин.), либо стоматологическая диодная лампа (Ultra Lume Led 5, длина волны 442 и 597 нм, экспозиция 15 мин.). Наконец, четвертая зона сначала окрашивалась, а затем подвергалась фотовоздействию. ОКТ-изображение всех четырех зон образца получалось одновременно сразу после фотовоздействия, а затем повторно через каждые 15 минут в течение достаточно длительного времени 85 (до 300 минут). Во время всей процедуры температура поддерживалась постоянной. Измерения проводились при дневном освещении. Для статистической обработки идентичные измерения повторялись для 10 различных образцов. При другой температуре или при окрашивании другим красителем вся процедура снова повторялась по 10 раз с новыми срезами жировой ткани. Результаты и их обсуждение. Контрольные части образцов (зона 1), которые не подвергались действию света и красителей, демонстрировали стабильность в отношении окружающих условий в течение длительного времени. На рис. 5.10 приведена серия ОКТ изображений срезов жировой ткани, окрашенных БЗ, до (а) и после (б –г) облучения светом лампы в течение 15 мин. (температура образца комнатная, 25 ºC). На рис. 5.10 (б) ткань показана сразу после облучения, а на рис. 5.9 (в) и (г) – через большие промежутки времени 120 и 300 мин., соответственно. Диодная лампа Ultra Lume Led 5 давала излучение на длинах волн 442 и 597 нм с плотностью мощности 75,5 мВт/см2. Спектр излучения лампы перекрывался со спектром поглощения красителя БЗ. Концентрация водно-спиртового (2:3) раствора БЗ составляла 6 мг/мл. Начальная толщина образца, измеренная микрометром несколько раз с последующим усреднением, оказалась равной 533±41 мкм. Рис. 5.11 отличается от рис. 5.10 тем, что измерения проводились не при комнатной, а при физиологической температуре 37 ºC. Второе отличие состоит в том, что ОКТ изображения на рис. 5.11 (в) и (г) получены через меньшее время, а именно, 60 и 120 мин., соответственно. Начальная толщина среза 237±10 мкм. Диодный лазер непрерывного действия LS-2-N-808-10000 генерировал излучение с длиной волны 808 нм и плотностью мощности 250 мВт/см2. Концентрация ИЗ составляла 1 мг/мл, начальная толщина образца 520±13 мкм. 15 15 12 12 12 9 6 6 0 3000 6000 9000 12000 Cell area, m 2 3000 Cell б) 9 6 3 0 15000 6 0 0 0 9 3 3 3 a) 9 Cell number 15 12 Cell number 15 Cell number Cell number 86 6000 9000 12000 0 15000 3000 6000 Cell 2 area, m 9000 12000 15000 0 2 0 area, m 3000 6000 Cell в) 9000 12000 15000 2 area, m г) Рис. 5.10. ОКТ-изображения срезов жировой ткани, окрашенных БЗ до облучения диодной лампой (a); через 15 минут после облучения (б); через 120 (в); через 300 минут (г). Температура образца 25ºC. Гистограммы наверху показывают распределение жировых клеток по площади изображений (алгоритм изложен в работе [266]). В нижней части показаны А-сканы, усредненные по всей области В-сканирования. 15 15 12 12 12 9 6 6 9 6 3 3 3 0 0 0 0 3000 6000 Cell a) 9 9000 area, m 12000 0 15000 2 3000 6000 Cell б) 9000 12000 area, m Cell number 15 12 Cell number 15 Cell number Cell number 87 3000 6000 Cell в) 6 3 0 15000 2 9 9000 area, m 12000 0 15000 0 2 3 000 6000 C ell 9000 area, m 12 000 1 5000 2 г) Рис. 5.11. То же, что на рис. 5.10, но при физиологической температуре 37 ºС. Изменены также времена получения изображений (в) и (г), теперь они составляют 60 и 120 минут после освещения лампой, соответственно. Остальные условия идентичны случаю, показанному на рис. 5.10 Такие же особенности наблюдались при окрашивании ткани с помощью ИЗ и освещением диодным лазером ближнего ИК диапазона. Для комнатной температуры 25 ºC результаты показаны на рис. 5.12. Лазерное освещение продолжалось 5 минут, а ОКТ-наблюдения, как и на рис. 5.10, проводились до воздействия, сразу после его окончания, а затем через 60 и 120 минут. Аналогичный эксперимент, но при температуре 37 ºC и временах ОКТзондирования 60 и 120 минут после воздействия, иллюстрируется рис. 5.13. Начальная толщина образца в этом случае составляла 281±18 мкм. 15 15 12 12 12 9 6 6 9 6 3 3 3 0 0 0 0 3000 6000 Cell а) 9 9000 12000 15000 0 2 area, m 3000 6000 Cell б) 9000 12000 area, m Cell number 15 12 Cell number 15 Cell number Cell number 88 0 3000 6000 Cell в) 6 3 0 15000 2 9 9000 area, m 12000 0 15000 3000 6000 Cell 2 9000 12000 area, m 15000 2 г) Рис. 5.12. Эксперимент при комнатной температуре 25ºC, аналогичный показанному на рис. 5.10, но с заменой красителя БЗ на ИЗ и лампы на диодный лазер (экспозиция в течение 5 минут). А-сканы, показанные внизу, усреднены по области, ограниченной на ОКТ-изображениях тонкими вертикальными линиями. 15 15 12 12 12 9 6 3 0 0 3000 6000 Cell a) 9000 area, m 12000 9 6 6 3 0 0 3000 6000 Cell б) 9 3 0 15000 2 9000 12000 15000 Cell number 15 12 Cell number 15 Cell number Cell number 89 0 3000 6000 Cell в) 6 3 0 2 area, m 9 9000 12000 area, m 0 15000 3000 6000 Cell 2 9000 12000 area, m 15000 2 г) Рис. 5.13. Эксперимент при физиологической температуре 37 ºC, аналогичный показанному на рис. 5.11, с заменой красителя БЗ на ИЗ и лампы на диодный лазер (экспозиция в течение 5 минут). А-сканы, показанные внизу, усреднены по области, ограниченной на ОКТизображениях тонкими вертикальными линиями. Как видно из приведенных рисунков, разрешения ОКТ достаточно для визуализации отдельных адипоцитов, что позволило исследовать влияние облучения на распределение клеток по размерам. На основании проведенных автором диссертации ОКТ исследований соавтор работ [17, 264 - 266] по теме диссертации И.Ю. Янина провела дальнейший статистический анализ распределения клеток по площади их изображений, результаты которого показаны в виде гистограмм в верхней части рис. 5.10 - 5.13. Алгоритм этого статистического анализа подробно описан в статье [266]. Гистограммы показывают, что со временем распределение становится более однородным, так как число мелких клеток увеличивается в результате липолиза, а число крупных клеток - в результате набухания и слияния жировых капель. 90 Характерное время наступления изменений в структуре клеток после обработки красителем и освещения составило 60—300 мин, что согласуется с ожидаемым биологическим откликом на фотодинамическое воздействие [272]. По прошествии этого времени наиболее значительные изменения видны в приповерхностном слое. После обработки БЗ и освещения лампой толщина этого слоя составила 20–60 мкм при комнатной температуре (25C, рис. 5.10 б-г) и 80–90 мкм при физиологической температуре (37C, рис. 5.11 б-г). После обработки ИЗ и освещения лазером при комнатной температуре (25C) толщина этого слоя была 30—70 мкм (рис. 5.12 б-г), а при физиологической температуре (37C) достигала 230 мкм (рис. 5.13 б-г). Из полученных ОКТизображений средний размер жировых клеток оценивается как 60—70 мкм. Наблюдаемые изменения ОКТ изображений можно интерпретировать как результат липолиза и разрушения клеток, вызванные фотодинамическим воздействием. Конечными продуктами липолиза клеток являются глицерин и вода [273], которые вызывают оптическое просветление. Вместе с разрушением верхнего слоя клеток это облегчает проникновение света внутрь биоткани для взаимодействия со следующими слоями клеток. Оптическое просветление видно по увеличению отраженного сигнала от нижней границы между жировой тканью и стеклом (рис. 5.10 - 5.13) [261, 274]. Видно также, что при физиологической температуре фотодинамическое воздействие приводит к более быстрым и глубоким морфологическим изменениям жировой ткани, чем при комнатной. В описанных здесь экспериментах впервые показано, что с помощью портативного серийного оптического когерентного томографа, разработанного для биомедицинских применений in vivo и обладающего умеренным пространственным разрешением, можно количественно оценивать последствия фотодинамического воздействия на образцы жировой ткани на клеточном уровне. В силу сравнительно большого размера жировых клеток, метод ОКТ пригоден для непосредственного контроля процессов липолиза и разрушения 91 клеток в результате не только фотодинамического эффекта, но и других воздействии, включая химические препараты [273] и ультразвук [275]. 92 6 МОДЕЛЬНЫЕ РАСЧЕТЫ ПРОНИЦАЕМОСТИ ДЕНТИНА И ФОРМИРОВАНИЯ СИГНАЛА ОКТ В ПРОЦЕССЕ ОПТИЧЕСКОГО ПРОСВЕТЛЕНИЯ В отличие от остальных экспериментальных разделов диссертации, данный раздел посвящен двум разным математическим моделям. Первая из них – стационарная, она связывает коэффициент проницаемости дентина с его тубулярной структурой. Вторая – нестационарная - описывает формирование сигнала ОКТ в рассеивающей среде в процессе оптического просветления, вызванного диффузией химического агента. 6.1. Модельный расчет проницаемости дентина для химических агентов Имеются данные о связи тубулярной структуры дентина с различными патологиями как общего характера (остеопороз), так и касающимися непосредственно зуба (кариес, гиперчувствительность), например, в [278] отмечена связь между увеличенным диаметром тубул дентина и кариесом. В работе [279] приводятся данные о том, что при гиперчувствительности средний диаметр тубул дентина примерно вдвое больше, чем в здоровом зубе. Пространственного разрешения ОКТ недостаточно для визуализации тубул, однако, как показано в предыдущих разделах, по скорости изменения наклона сигнала ОКТ можно неинвазивно определять коэффициент проницаемости образцов дентина. Очевидно, что проницаемость дентина по отношению к химическим агентам зависит как от диаметра тубул, так и от плотности их распределения. При наличии модели, связывающей тубулярное строение с дентина с его проницаемостью относительно различных химических агентов, проницаемость становится косвенным диагностическим признаком структурных изменений дентина, связанных с тем или иным типом патологии. В нашей упрощенной модели [276, 277] были учтены основные особенности тубулярной структуры дентина, описанные в разделе 3.3.1. и хорошо видимые на электронной микрофотографии (рис. 3.6). Модель 93 представляет собой плоский слой, вырезанный перпендикулярно направлению тубул, с тремя различными коэффициентами диффузии: внутри тубул, вдоль перитубулярных структур (полых цилиндров из более плотного и менее проницаемого вещества, окружающего тубулы) и в интертубулярном пространстве (рис. 6.1). Рис. 6.1. Трехкомпонентная модель дентина. Среднее расстояние L0 между тубулами связано с их числом N, приходящимся на единицу поверхности, выражением L0 1 N. (6.1) 94 Коэффициент проницаемости образца по отношению к химическому агенту может быть проницаемости представлен Pi как различных взвешенная областей сумма (тубул, коэффициентов перитубулярного и интертубулярного дентинов) PD f tub Ptub f itub Pitub f ptub Pptub , (6.2) где весовые коэффициенты пропорциональны площади поперечного сечения каждой из указанных выше областей, а в сумме равны единице. Такую модель описывает ряд очевидных соотношений: f tub f itub f ptub 1 , Pj f tub f ptub Dj hD , (6.4) 2 dtub N tub , 4S 2 2 (d ptub d tub ) 4S (6.3) (6.5) N tub , f itub 1 ( f tub f ptub ) , (6.6) (6.7) где индекс j принимает значения tub, itub, и ptub, D j - коэффициенты диффузии в различных компонентах дентина; hD – толщина дентинного слоя, вырезанного перпендикулярно направлению тубул; dtub – среднее значение диаметра тубул; dptub – среднее значение внешнего диаметра перитубулярной области, представляющей собой полый цилиндр с внутренним диаметром dtub; Ntub – число тубул в пределах площади поверхности образца дентина S, то есть Ntub/S – среднее значение плотности числа тубул. Проницаемость всего зуба можно определить, используя описанную выше трехкомпонентную модель для дентина и границы раздела «дентин – эмаль», а также одно- или двухкомпонентную (с учетом призматической структуры эмали) модель диффузии через эмаль. В этом случае полный 95 коэффициент проницаемости PT системы «дентин+пограничный слой+эмаль» будет определяется как 1 1 1 1 PT PD PDE PE , (6.8) где PD, PDE и PE – коэффициенты проницаемости дентина, пограничного слоя и эмали, соответственно; PD определяется непосредственно из соотношения (6.2), PDE и PE из аналогичных соотношений с соответствующими структурными элементами и значениями параметров. В прямой постановке задачи с помощью данной модели можно рассчитать распределение проницаемости по поверхности зуба, учитывая вариации диаметров тубул и плотности их числа. Последние могут быть взяты из данных электронной микроскопии, а коэффициенты диффузии трех различных типов дентина – из независимых измерений in vitro. Искомой величиной является коэффициент проницаемости. Если же общий коэффициент проницаемости получен экспериментально, например, с помощью ОКТ, то можно поставить две обратные задачи. 1. Коэффициент проницаемости измерен достаточное количество раз на разных образцах, тубулярная структура которых известна из микроскопии. Требуется определить коэффициенты диффузии трех типов дентина. 2. Коэффициент проницаемости измерен достаточное количество раз на одном образце, коэффициенты диффузии трех типов дентина известны, требуется определить структурные параметры дентина. В качестве примера решения прямой задачи была рассчитана проницаемость модели дентина по отношению к воде и перекиси водорода. Вода играет основную роль в естественном обмене веществ в зубной ткани, 96 ОКТ мониторинг проникновения воды в образцы дентина описан в предыдущих разделах диссертации. Перекись водорода – распространенный отбеливатель. По техническим причинам для нее нам не удалось провести ОКТ измерений, расчет носит прогнозирующий характер. Использовались следующие значения параметров: Ditub 3,6×10-7 см2/с, Dtub 3,6×10-6 см2/с, D ptub 3,6×10-8 см2/с для перекиси водорода; Ditub 1,74×10-6 см2/с [280]; Dtub 1,74×10-5 см2/с; D ptub 1,74×10-7 см2/с для воды. Толщина слоя полагалась равной 1 мм. Диаметр тубул варьировался от 0,5 до 4 мкм, а плотность числа тубул – от 10000 до 90000 мм-2. Как видно из приведенных данных, наиболее важную роль в формировании полного коэффициента проницаемости играет толщина перитубулярного слоя. На рис. 3.6 толщина перитубулярного слоя приблизительно равна диаметру тубулы. Однако, в литературе имеются свидетельства вариабельности этой толщины, например, при воздействии кислот [281, 282]. В наших расчетах мы рассматривали два случая. В первом из них мы предполагали, что толщина слоя перитубулярного дентина постоянна и равна наименьшему диаметру тубулы. Для этого случая на рисунках 6.2 (а) и (б) показана рассчитанная зависимость проницаемости дентина от диаметра тубул и плотности их числа для перекиси водорода и воды, соответственно. В допустимых пределах изменения диаметра и числа тубул значение проницаемости меняется почти на порядок величины, причем, естественно, зависимость от диаметра квадратичная, а от числа тубул линейная. Во втором случае мы предположили, что отношение толщины перитубулярного слоя к диаметру тубулы является постоянной величиной, то есть геометрия тубулы меняется подобным образом. В этом случае изменения проницаемости малы и поэтому здесь не показаны. Очевидно, что в этом случае увеличение проницаемости за счет сечения тубул компенсируется уменьшением проницаемости за счет пропорционального увеличения толщины стенок, для вещества которых коэффициент диффузии наименьший. Наши экспериментальные оценки коэффициента проницаемости P для воды 97 (таблица 4.1) попадают в интервал рассчитанных значений этой величины (рис. 6.2 (а)). Проведенные расчеты подтверждают естественное предположение о том, что значительный разброс (на порядок величины) экспериментальных значений P для разных образцов (таблица 4.1) связан с различиями в тубулярной структуре, так как образцы вырезались из разных частей зубов, удаленных у разных пациентов. Таким образом, измеряя полную проницаемость слоя дентина и сравнивая результат с теоретическими оценками, можно судить об отношении толщины стенок тубулы к ее диаметру. а б Рис. 6.2 Проницаемость слоя дентина в зависимости от диаметра тубул и плотности их числа (а) - для перекиси водорода, (б) – для воды Дальнейшее использование модели может быть связано с решением обратных задач на основе экспериментально измеренной проницаемости дентина в целом. Например, пусть из данных микроскопии известна тубулярная структура (диаметры и плотность числа тубул, толщина перитубулярной стенки) для трех образцов. Тогда из (6.2) и (6.4) получаем три уравнения для определения трех коэффициентов диффузии различных типов дентина 98 3 PDi f j i j 1 Dj hD , i 1,2,3 Здесь i=1,2,3 нумерует образцы с различной тубулярной структурой, учитываемой весовыми коэффициентами f j , а j=1,2,3 - номер образца. Для i уточнения процедуры можно взять большее, чем 3, число образцов, а параметры D j находить по методу наименьших квадратов. Альтернативная коэффициентов постановка диффузии обратной различных задачи предполагает типов экспериментальное определение проницаемости PD дентина. знание Тогда для данного участка исследуемого зуба даст линию равной высоты на рисунке типа 6.2 (а) и (б). Можно воспользоваться тем, что, как известно из литературы [170], плотность числа тубул не сильно зависит от состояния зуба, а определяется в основном выбором его участка. Зная, на каком участке произведено зондирование, можно оценить плотность числа тубул, тогда их средний диаметр можно найти из градуировочных графиков типа 6.2 (а) и (б). Для практической реализации такого подхода, конечно, потребуется выяснение наличия и характера связи между диаметром тубул и толщиной перитубулярной стенки, без которого число неизвестных становится равным трем, и для определения диаметра тубул требуется дополнительная информация. 6.2 Численное моделирование формирующегося в нестационарного процессе оптического сигнала ОКТ, просветления рассеивающей среды Формирование сигнала ОКТ в условиях проникновения просветляющего агента в рассеивающую биоткань включает ряд механизмов, которые сложно отделить друг от друга в натурном эксперименте. Так, например, в разделе 5.1 отмечалось, что в слоистой среде локальный наклон сигнала ОКТ может быть связан как с ослаблением при прохождении однородного слоя, так и с плавным уменьшением сечения рассеяния назад, если слой неоднородный. В разделе 99 4.3.1) отмечалось, при оптическом просветлении рассеивающей среды иммерсионным агентом наряду с коэффициентом ослабления t может уменьшаться и сечение рассеяния назад b , то есть условия распространения сигнала улучшаются, но сам формируемый сигнал что сказывается на форме А-скана. Для более полного анализа механизмов формирования сигнала ОКТ нами была построена модель [283] на основе численного решения уравнения диффузии с последующим расчетом формы А-скана по найденному распределению концентрации диффундирующего агента. Рассмотрим плоский слой рассеивающей среды, на обеих поверхностях которого концентрация диффундирующего агента поддерживается постоянной. Это соответствует образцу, погруженному в раствор, постоянство концентрации которого поддерживается перемешиванием. Модель применима к плоской пластине конечных размеров, если толщина пластины много меньше ее длины и ширины. Запишем уравнение диффузии (3.3) в одномерном случае С z , t 2C z , t , D( z, t ) t z 2 (6.9) где C z, t - концентрация химического агента, зависящая от поперечной по отношению к пластине координаты x и времени t , D( z , t ) - коэффициент диффузии, заданный как функция координаты и времени. Для однородного слоя уравнение диффузии имеет известное решение (3.4). Предлагаемая программа численного решения не требует однородности или стационарности диффузионных свойств среды. Граничные и начальные условия имеют вид: 0 z l; 0, С z, 0 C0 , z 0, z l ; C 0, t C l , t C0 где l - толщина образца, С0 (6.10) - постоянная концентрация агента, поддерживаемая на границах образца. Численное решение задачи (6.9), (6.10), производилось с помощью пакета Mathematica. Программа численного решения дифференциальных 100 уравнений, входящая в состав этого пакета, требует непрерывности решения во все моменты времени, включая начальный, поэтому разрывная функция в (6.10) заменялась на непрерывную, но быстро спадающую от границ вглубь образца. l z С z , 0 С0 e z e (6.11) Эмпирически было установлено, что оптимальным является 102 при l 1 , а дальнейшее увеличение приводит появлению артефактов (ложных осцилляций). Для расчета изменения рассеивающих свойств биоткани в результате диффузии мы использовали широко распространенную модель [149, 284], в которой рассеивающими элементами являются тонкие длинные прозрачные диэлектрические цилиндры, описываемые теорией рассеяния Ми в приближении Ганса-Рэлея. В рамках этой модели коэффициент рассеяния зависит от отношения m nC / nI показателей преломления рассеивающих частиц nC и окружающей среды nI как 2 2 , s N s N s0 m 2 1 1 2 m 1 (6.12) где s - сечение рассеяния, N - плотность числа рассеивающих частиц, коэффициент s0 определяется длиной волны света и размерами частиц [285, 286]. Из (6.12) видно, что при полном выравнивании показателей преломления m 1 и коэффициент рассеяния обращается в нуль. Воспользуемся формулой (3.12) раздела 3.2, чтобы связать коэффициент рассеяния с концентрацией диффундирующего агента, определяемой путем численного решения уравнения диффузии, nI z , t 1 C z , t nbase C z , t nosm , (6.13) где nbase , nosm - показатели преломления основного вещества и диффундирующего агента, соответственно. Модель формирования сигнала ОКТ в среде с известным распределением коэффициента рассеяния сформулирована выше в 101 разделе 4.2 (формулы (4.1) – (4.7)). Таким образом, реализованный нами алгоритм включает следующие шаги: численное решение уравнения диффузии (6.9) с граничными и начальными условиями (6.10), аппроксимированными с помощью функции (6.11); вычисление nI по формуле (6.13) и s по формуле (6.12); вычисление сигнала ОКТ по формулам (4.1) – (4.7) раздела 4.2. Рассмотрим вначале модель среды, в которой эффективное сечение отражения назад b не зависит от концентрации иммерсионного агента. На рисунке 6.3 приведены примеры тестового расчета с помощью разработанного алгоритма для модельной среды с показателем преломления рассеивающих частиц 1.6, базового вещества 1.3 и иммерсионного агента 1.5. Для простоты рассмотрен случай пренебрежимо малой зависимости радиуса предметного пучка от глубины зондирования wH / ws 1 . Такое приближение справедливо, когда глубина зондирования много меньше фокусного расстояния оптической системы, направляющей предметный пучков в образец. Заметим при этом, что предложенный алгоритм позволяет проводить моделирование для различных конструкций томографов, в которых указанные параметры меняются в широких пределах. По вертикальной оси отложена величина i 2 при i 2 0 1 (см. формулу (4.1)). В формуле (6.12) полагали N s0 1 . На рисунке видно, что по мере диффузии иммерсионного агента за счет оптического просветления уменьшается наклон сигнала ОКТ и увеличивается глубина проникновения зондирующего излучения в образец. Этот вывод качественно согласуется с экспериментальными результатами раздела 4. Случай, показанный на рис. 6.3(а), соответствует началу процесса диффузии вблизи зондируемой границы, когда диффузия агента с противоположной стороны образца практически не влияет на сигнал ОКТ. На рис. 6.3(б) то же самое показано при насыщении более тонкого образца 102 с обеих сторон. Эффект увеличения глубины проникновения и уменьшения наклона А-скана выражен значительно сильнее. Рис. 6.3. Изменение со временем формы сигнала ОКТ в процессе диффузии иммерсионного агента. Эффективное сечение рассеяния назад не зависит от концентрации иммерсионного агента. (а) – начало процесса диффузии в толстый образец, l 5 ; (б) – то же самое при полном насыщении более тонкого образца с l 1 за более длительное время. Все величины приведены в относительных единицах. Теперь поставим задачу выяснить, как сказывается на форме сигнала ОКТ возможное влияние просветляющего агента на сечение рассеяния назад b , входящее в (4.2) и являющееся источником сигнала ОКТ. Как правило (см., например, [149, 284]) считается, что при просветлении уменьшается только коэффициент ослабления t . Это приближение использовано нами в обработке экспериментов, описанных в разделе 4. Такой подход оправдан, когда с помощью ОКТ производится визуализация диффузно отражающей структурной неоднородности, которая обнаруживается сквозь слой ослабляющей свет 103 среды. Диффузия агента просветляет этот слой, но пренебрежимо мало влияет на объект визуализации. Если же сам объект в основном состоит из непоглощающих рассеивателей в прозрачном окружении, то по крайней мере часть сигнала ОКТ порождается той же причиной, что и его ослабление – рассеянием, которое обусловлено перепадом показателя преломления между прозрачной средой и рассеивателями, поэтому интересно промоделировать просветление b вместе с s . Для образцов твердых биотканей со сложным составом и структурой, например, для образцов дентина зуба человека, разумно допустить, что часть отраженного назад излучения порождается структурными элементами, не подверженными просветлению. Это приводит к феноменологической формуле b C z , t b 0 k s C z , t . (6.14) Здесь - постоянная, а b0 - часть сечения диффузного отражения, связанная с другими механизмами и не зависящая от концентрации агента. На рис. 6.4 показана эволюция формы сигнала ОКТ в процессе диффузии при тех же параметрах, что и на рис. 6.3а, но в предположении, что сечение обратного рассеяния частично испытывает влияние оптического просветления b 0 1, k 0, 25 . Видно, что в этом случае в начальной части А-скана появляется максимум, который в дальнейшем сглаживается. По мере того, как агент диффундирует вглубь среды, максимум исчезает, наклон сигнала ОКТ уменьшается, а глубина проникновения растет, что типично для упрощенной модели, использованной в разделе 4 для обработки экспериментальных данных. На врезке к рис. 6.4 воспроизведен рисунок из нашей экспериментальной работы [253], на котором просматривается небольшой максимум на А-скане вблизи входа в образец. Немонотонное поведение А-сканов наблюдалось нами и в некоторых других случаях, однако, для определения наклона сигнала ОКТ и его временной зависимости брались монотонно спадающие части А-сканов. Результаты проведенного здесь моделирования качественно описывают лишь 104 один из возможных механизмов появления немонотонности А-сканов, не связанный с макроскопической неоднородностью исходного образца. Рис. 6.4. Форма А-скана при тех же параметрах, что и на рис. 4а, но с учетом соотношения (6.14) при b 0 1, k 0, 25 . Справа в рамке форма экспериментального Аскана из [253]. В заключение данного раздела сделаем ряд замечаний. Во-первых, полученные результаты следует рассматривать как качественные. Для того, чтобы предпринять попытку их количественного сопоставления с экспериментом требуется значительное число неизвестных параметров. Во-вторых, нужно отметить, что реальный процесс проникновения химических агентов в пористую твердую биоткань (дентин, эмаль зуба) достаточно сложен и может представлять собой сочетание диффузии, просачивания и капиллярного смачивания. Дентин имеет тубулярную структуру, в нормальном состоянии зуба in vivo тубулы заполнены жидкостью – зубным ликвором [170]. В наших экспериментах in vitro [252 – 254] вырезанные пластинки зубного дентина хранились в физиологическом растворе, перед проведением измерений высушивались, после чего помещались в кювету с раствором и периодически подвергались ОКТсканированию. При помещении образцов дентина в растворы таких химических агентов, как глюкоза и глицерин, наблюдались длительные (несколько часов) процессы изменения рассеивающих свойств ткани, отражающиеся на 105 форме сигнала ОКТ и интерпретированные как проявления диффузии указанных агентов, приводящей к оптическому просветлению образца. В этих случаях предложенная в данном разделе модель может быть применима, когда смачивание образца дентина водой, имитирующей зубной ликвор, уже произошло, после чего в воде, заполнившей тубулы и их боковые ответвления, медленно происходит диффузия химического агента с достаточно большим молекулярным весом (глюкоза, глицерин). Наконец, отметим, что разработанный алгоритм применим к более сложным задачам, когда среда макроскопически неоднородна и нестационарна как по отношению к диффузии (коэффициент диффузии зависит от координаты и времени), так и по своим оптическим свойствам (заданными функциями координаты и времени являются сечение рассеяния назад, плотность числа рассеивающих частиц и показатели преломления компонентов среды, в которой происходит диффузия). Решение таких задач, как и количественное сравнение результатов с экспериментами на фантомах и биотканях, является предметом будущих исследований. 106 7 ОПТИЧЕСКИЙ МОНТОРИНГ ПРОНИКНОВЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ В ОБРАЗЦЫ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO Проникновение наночастиц в эмаль и дентин зуба представляет значительный интерес в связи с решением проблем чувствительности зуба, укрепления эмали, дезинфекции, восстановления, а также косметического отбеливания. Проблемам и перспективам применения наночастиц и нанотехнологий в медицине и, в частности, в стоматологии посвящено несколько обзорных статей [287 – 289]. Потенциальные применения нанотехнологий в медицине очень широки [289]. Это визуализация и диагностика, целевая доставка лекарственных препаратов, терапия и инженерия тканей. Наиболее разработанным и уже широко используемым направлением использования наночастиц в стоматологии на сегодняшний день является их добавление в составы, применяемые для восстановления поврежденной зубной ткани [289]. Другие направления находятся еще в стадии экспериментального исследования. Одна из актуальных задач стоматологии – снижение гиперчувствительности зубов, механизм которой связан с тубулярной структурой дентина [290]. Чувствительные зубы имеют большее число открытых тубул увеличенного диаметра, для закрытия которых использовались наночастицы золота с последующим лазерным воздействием [291]. В перспективе ожидается создание нано-роботов на базе природных биоматериалов, которые могли бы избирательно и точно осуществлять окклюзию специфических тубул, обеспечивая больному быстрое и постоянное лечение [291, 292]. Наночастицы можно использовать для управления формированием биопленок в полости рта. Биоцидные, антиадгезивные и транспортные свойства позволяют использовать их в составе покрытий при протезировании, для местного применения, а также в составе стоматологических материалов [293]. Бактерии являются причиной большинства эндодонтических инфекций. Их присутствие в тубулах дентина связано с постоянной инфекцией корневого канала [294]. Исследования показали возможность проникновения бактерий в 107 тубулы на глубину до 150 мкм [295]. Внедрение антибактериальных наночастиц в тубулы может использоваться как способ их доставки для улучшения дезинфекции корневого канала. Авторы [296] показали, что эффективность такого внедрения можно повысить с помощью высокоинтенсивного ультразвукового воздействия, приводящего к коллапсу кавитационных пузырьков. На поверхности зуба бактерии образуют биопленки, стратегия борьбы с которыми включает создание антиадгезивных поверхностей, включение антимикробных агентов в полимеры медицинских устройств и доставку антибиотиков [297]. В этой связи наночастицы оксида цинка (ZnO) прошли тестирование in vitro на специальных культурах биопленок и продемонстрировали способность существенно замедлять рост биопленки S. sobrinus в течение трехдневного периода [293]. Kishen и др. [298] продемонстрировали снижение числа E. faecalis , прилипших к поверхности дентина на поверхности корневого канала после обработки катионными антибактериальными наночастицами, такими как ZnO в чистом виде или в комбинации с хитозаном. Есть основания полагать, что такая обработка поверхности способна предотвращать формирование бактериальных биопленок in vivo. Наночастицы диоксида титана (TiO2) обладают фотохимической активностью и могут служить ингибиторами бактерий [299]. Их фототоксичность может быть модифицирована с помощью примесей или покрытия, и в таком виде они широко применяются в потребительских товарах (краски, солнцезащитные кремы, зубные пасты) для отбеливания или защиты от ультрафиолетового излучения [300, 301]. Показано, что бактерицидная эффективность наночастиц ZnO и фотохимическая активность наночастиц TiO2 усиливаются с уменьшением размера частиц [302, 303]. С целью отбеливания дентина в работе [304] использовался раствор 3.5% перекиси водорода с взвесью наночастиц диоксида титана. Отбеливающий агент применялся на срезах дентина с последующим воздействием 405 нм диодным лазером или галогеновой лампой. С помощью спектрофотометрических измерений был продемонстрирован 108 значительный эффект отбеливания в результате указанного комбинированного воздействия. Наконец, в работе [305] исследовалось восстановление эмали зуба с помощью наночастиц гидроксиапатита и было обнаружено принципиальное значение их размера. Частицы с размером 20-40 нм, типичным для собственных структурных элементов эмали, обеспечивали создание прочного покрытия на ее поверхности, устойчивого к кислотным агентам, в то время как частицы большего размера таким эффектом не обладали. В данном разделе излагаются результаты наших работ по изучению проникновения наночастиц в образцы эмали и дентина с помощью ОКТ и нелинейной оптической микроскопии. 7.1 Изменения формы ОКТ сигнала после ультразвукового воздействия на образцы дентина, погруженные во взвесь наночастиц Во всех указанных выше задачах в большей или меньшей степени возникает необходимость неразрушающего мониторинга проникновения наночастиц вглубь ткани зуба. Одним из перспективных средств такого мониторинга является ОКТ. В разделе 4 нами продемонстрирована эффективность метода ОКТ при мониторинге проникновения химических агентов в образцы дентина зуба человека. В настоящем разделе описана впервые предпринятая нами попытка распространения указанной методики на исследование проникновения наночастиц диоксида титана в эмаль и дентин образцов зуба человека in vitro [109, 306]. Исследовались образцы дентина и эмали зуба человека, подготовленные по технологии, описанной выше в разделе 4.1. Для обработки образцов использовалась суспензия наночастиц двуокиси титана TiO2 (размер частиц <100нм, Aldrich, USA) в Poly(Sodium4-Styrene-Sulfonate) с концентрацией наночастиц 10 мг/мл. В начале эксперимента проводилось контрольное ОКТ-сканирование образцов, еще не обработанных наночастицами. Суспензия наночастиц TiO2 предварительно помещалась в УЗ ванну на 15 минут. Ультразвук с частотой 43–45 кГц предназначался для предотвращения седиментации наночастиц. 109 Затем образцы погружались в кювету с суспензией наночастиц TiO2, а кювета помещалась в УЗ ванну на 15 минут для стимуляции проникновения наночастиц в толщу зубной ткани. Затем поверхность образца промывалась водой и просушивалась в воздушном потоке в течение 30 минут для удаления остатков взвеси с поверхности образца. После этого производилось его ОКТсканирование. Подобная процедура повторялась несколько раз, после чего образцы снова помещались в кювету с суспензией TiO2 и оставлялись в ней до следующего дня. Полная продолжительность эксперимента с одним образцом составляла 10 дней. (а) (б) Рис. 7.1. ОКТ-изображение среза зуба человека до обработки (а) и после обработки наночастицами TiO2 в течение 5 суток (б). На рис. 7.1(а) показано ОКТ-изображение среза зуба человека до обработки частицами диоксида титана, а на рис. 7.1(б) – после обработки. Левая часть образца – эмаль (светлая горизонтальная полоса – структурный дефект, возможно, трещина), правая - дентин. На первый взгляд изображения одинаковы, однако при очень внимательном сравнении можно заметить некоторое увеличение яркости изображения на глубине порядка сотен 110 микрометров после длительной обработки взвесью наночастиц диоксида титана. (а) (б) Рис. 7.2. Усредненные А-сканы, полученные в различные моменты времени в процессе обработки дентина (а) и эмали (б) взвесью наночастиц TiO2 Для более четкого выявления отмеченных изменений были построены усредненные А-сканы, полученные в различные моменты времени в процессе обработки образца наночастицами диоксида титана (рис. 7.2). Видно, что с течением времени вид А-скана постепенно меняется, причем наибольшее увеличение сигнала ОКТ (до 5 дБ) наблюдается непосредственно вблизи поверхности и на глубинах 300–600 мкм от поверхности образца. Пики на Асканах соответствуют светлым полосам на ОКТ изображениях рис. 7.1 и отображают структурные особенности (дефекты) образца, по мере обработки взвесью наночастиц они меняются вместе со всем А-сканом. Изменения, происходящие в образцах, можно связать с проникновением наночастиц диоксида титана в эмаль и дентин среза зуба человека. Однако, на основании полученных результатов о глубине проникновения наночастиц судить сложно, так как наночастицы, внедренные в приповерхностные слои, могут значительно увеличить кратность рассеяния фотонов и, соответственно, время их задержки. В терминах однократного рассеяния это выглядит как проникновение наночастиц на большую глубину. Проникновение в образец 111 агента, в котором взвешены наночастицы, также может влиять на вид ОКТизображения (см. раздел 4). Таким образом, результаты ОКТ-сканирования и обработки полученных изображений показали, что в результате многодневной обработки образца зубной ткани суспензией наночастиц двуокиси титана наблюдается достигающее 5 дБ увеличение сигнала ОКТ вблизи поверхности образцов и с глубин 300–600 мкм, которое можно связать с проникновением наночастиц в образец. Однако, количественная интерпретация этих результатов затруднительна, что является стимулом для использования методов оптической томографии высокого пространственного разрешения, позволяющих визуализировать наночастицы непосредственно. 7.2Нелинейная микроскопия проникновения наночастиц Поскольку разрешающая непосредственной способность визуализации ОКТ отдельных недостаточна наночастиц, для возникает потребность в оптическом мониторинге их проникновения с помощью методов многофотонной микроскопии (см. раздел 2.2), сочетающей большее, чем у ОКТ, разрешение с возможностью получения послойных томографических изображений на разной глубине. В настоящем разделе представлены результаты наших экспериментов [307, 308], показывающих, что нелинейная оптическая микроскопия на основе флуоресценции с двухфотонным возбуждением, генерации второй гармоники и гиперрэлеевского рассеяния может быть использована для мониторинга проникновения наночастиц TiO2 и ZnO в образцы тканей зуба. Эксперименты проводились в Центре экспериментальной и прикладной кожной физиологии Медицинского университета «Шарите», Берлин, Германия под руководством профессора Ю. Ладеманна. Для измерений использовался двухфотонный томограф (JenLab GmbH, Германия) с компактным перестраиваемым титансапфировым фемтосекундным лазером ближнего ИК диапазона (Mai Tai XF, Spectra Physics, США), модулем сканирования пучка с гальваносканерами и пьезоприводной оптикой, приемным модулем с быстродействующим 112 фотоумножителем (ФЭУ), а также управляющим блоком, включающим программный пакет JenLab и служащим для построения изображений. Лазер имел длительность импульса 100 фс, частоту следования импульсов 80 МГц, максимальную выходную мощность вблизи образца 50 мВт, диапазон доступных длин волн 710–920 нм. Высокая числовая апертура (NA=1,3) объектива с пьезоприводом (Ζeiss EC Plan-Neofluar 40x/1.3 oil) обеспечивала высокое пространственное разрешение, достигающее 0,5 мкм в латеральном и 2 мкм в аксиальном направлении [309]. Типичный размер поля сканирования 200 мкм 200 мкм, время сканирования составляло 13,4 с. Нелинейная оптическая микроскопия дает возможность визуализировать биоткани через посредство множества флуоресцирующих биомолекул, таких как NAD(P)H, флавины, порфирины, эластин и меланин [310]. Коллаген внеклеточного матрикса можно идентифицировать по генерации второй гармоники (ГВГ). Наночастицы ZnO генерируют когерентное (ГВГ) и некогерентное (гиперрэлеевское рассеяние (ГРР)) излучение на удвоенной частоте возбуждающего света [311] в дополнение к флуоресценции, возбуждаемой двухфотонным поглощением (ФВДП), в то время как наночастицы TiO2 генерируют только ФВДП. Сигналы ФВДП и ГВГ/ГРР одновременно регистрировались в двух каналах быстродействующими ФЭУ приемниками с чувствительностью на уровне единичных фотонов, в режиме, при котором регистрируемое излучение ФВДП/ГВГ/ГРР не проходило через сканирующую оптику. Сигналы ФВДП и ГВГ/ГРР отделялись друг от друга посредством оптических фильтров, расположенных перед ФЭУ приемниками. Для измерения сигнала ФВДП использовался широкополосный фильтр (400–700 нм), а для детектирования сигнала ГВГ/ГРР – узкополосный фильтр на 380±5 нм. Применяемая методика нелинейной оптической микроскопии была ранее подробно описана в работе [312]. Образцы тканей зуба и наночастицы. Процедура приготовления об- разцов тканей зуба была аналогична описанной в разделе 4.1. В зависимости 113 от расстояния от оси зуба, пластинки образовывали различные углы с направлением тубул дентина. На основании результатов микроскопии было получено распределение по размерам для тубул, расположенных почти перпендикулярно к поверхности среза (рис. 7.3). Рис. 7.3. Распределение тубул по размерам в исследованных образцах дентина Исходными были беспримесные наночастицы TiO2 (анатаз) и ZnO (SigmaAldrich, Германия). Модифицированные анатазные наночастицы TiO2 получались из исходных путем отжига либо в 2% NH3 в атмосфере N2 при 600 °C в течение 4 часов (TiO2/NH3), либо в атмосфере чистого N2 при 600 °C в течение 4 часов (TiO2/N2). Легированные азотом наночастицы представляют интерес для изучения фототоксичности [313]. В результате обработки изображений (рис. 7.4), полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), было построено распределение наночастиц по размерам (рис. 7.5). Как видно из гистограмм, размеры исходных частиц в порошке для TiO2 намного меньше, чем для ZnO (30 нм и 310 нм, соответственно). Однако, в суспензии (см. ниже) частицы образуют агрегаты и агломераты, размеры и устойчивость которых к внешним воздействиям фактически определяют проникающую способность частиц. Поэтому делать выводы о скорости и глубине проникновения 114 частиц в образцы на основании приведенных данных преждевременно, что подтверждают описанные ниже эксперименты. Рис. 7.4. Наночастицы TiO2, легированные азотом (а), и беспримесные наночастицы ZnO (б). Сканирующий электронный микроскоп Zeiss Sigma, Германия (а) и JCM-5000, JEOL, Япония (б) Рис. 7.5. Распределение по размерам для исходных наночастиц TiO2 (а) и ZnO (б), построенное по данным электронной сканирующей микроскопии. Перед нанесением наночастиц была выполнена нелинейная оптическая микроскопия интактных образцов. Оптимальная для этого длина волны оказалась равной 760 нм [311]. Для обработки образцов ткани зуба использовались суспензии наночастиц TiO2 и ZnO, для приготовления которых 24 мг наночастиц смешивались с 1 мл 0.8% 3-карбокси-2,2,5,5-тетраметилпирролидин -1-оксила (SigmaAldrich, Германия). Затем образцы помещались в кюветы с суспензией наночастиц. В течение 15 минут образцы, погруженные в суспензию наночастиц, 115 обрабатывались в ультразвуковой ванне Bandelin SONOREX SUPER RK 102 H, 35 кГц, 240 Вт с целью разрушения агрегатов и стимуляции проникновения частиц. Несмотря на частичное разрушение агрегатов, реальный средний размер частиц в суспензии мог быть больше, чем обнаруженный с помощью СЭМ в порошке. Тубулы дентина в суспензии располагались горизонтально. После УЗ обработки образцы споласкивались водой и записывались сканы нелинейной оптической микроскопии. После окончания записи образы снова помещались в кювету с суспензией наночастиц и обрабатывались ультразвуком в течение 15 минут. Такая процедура повторялась 3 раза. Результаты и их обсуждение. Проникновение частиц в образцы регистрировалось путем получения послойных изображений на различной глубине. На рис. 7.6 показаны изображения, полученные с помощью флуоресценции, возбуждаемой двухфотонным поглощением и генерации второй гармоники для дентина после 30 минут ультразвуковой обработки в суспензии TiO2 на глубине z = 0 мкм (а, б) и z = 5 мкм (в, г). В отличие от ОКТ-изображений, хорошо видна тубулярная структура дентина, видно даже расположение разных типов дентина: перитубулярный дентин окружает тубулы, образуя кольца (рис. 7.6 (а, в)), а интертубулярный дентин заполняет значительное более обширное пространство между тубулами. Рис. 7.6. Изображения дентина, полученные с помощью ФВДП (а, в) и ГВГ/ГРР (б, д) после 30 минут ультразвуковой обработки в суспензии TiO2 на глубине z = 0 мкм (а, б) и z = 5 мкм (в, г). Яркие белые пятна - наночастицы TiO2. 116 Коллаген, заполняющий тубулы дентина (интертубулярный дентин) дает сильный сигнал ГВГ, о чем ранее сообщалось в [314]. Более плотный, однородный и минерализованный перитубулярный дентин производит и ГВГ, и ФДФВ-сигналы, причем последний обусловлен входящими в состав дентина протеинами [315]. Светлые пятна - агрегаты наночастиц, проникших в структуру дентина. На рис. 7.7 показаны ГВГ/ГРР-изображения дентина зуба на различных глубинах после 30-минутной обработки ультразвуком в суспензии ZnO. На ФВДП-изображениях дентина после такой обработки не было обнаружено признаков проникновения наночастиц ZnO. Приведенные на рис. 7.6. и 7.7 изображения показывают, что максимальная наблюдаемая глубина проникновения составляет 45 мкм для наночастиц ZnO и 5 мкм для TiO2. Такую разницу можно объяснить различием размера агрегатов, который у ZnO значительно меньше, а также возможным различием чувствительности обнаружения для различных наночастиц. Хотя для уменьшения агломерации наночастиц и усиления их проникновения в структуру образца зубной ткани и проводилась ультразвуковая обработка, полностью исключить агломерацию наночастиц невозможно, а ведь именно форма, размеры и способность к агрегации частиц играют решающую роль в их проникновении в образец. Рис. 7.7. ГВГ/ГРР-изображения дентина после 30 минут ультразвуковой обработки в суспензии наночастиц ZnO, z = 0 мкм (а), z = 5 мкм (б), z = 10 мкм (в), z = 45 мкм (г). Белые пятна – изображения наночастиц ZnO. Более слабый, чем при ФВДП, сигнал от самого дентина, вообще говоря, тоже присут- 117 ствующий на изображениях, был специально исключен путем снижения интенсивности лазерного излучения, что позволило повысить контраст изображения наночастиц. На рис. 7.8 показаны ГВГ/ГРР-изображения зубной эмали до и после 45-минутной обработки ультразвуком в суспензии наночастиц ZnO на различной глубине. Эмаль производит сильный сигнал ФВДП (не показанный на рисунке), ясно выявляющий структуру эмалевых призм, и не дает сигнала ГВГ/ГРР. В отличие от TiO2, наночастицы ZnO создают сильный сигнал ГВГ/ГРР [311], так как они обладают необходимой для этого значительной оптической нелинейностью второго порядка. Компонента амплитуды электрического поля второй гармоники Ei2 связана с компонентами амплитуды электрического поля первой гармоники E j соотношением Ei2 dijk E j Ek . j ,k По симметрии для наночастиц ZnO отличны от нуля коэффициенты d333 и d311 [311, 314]. Для наностержней ZnO с отношением толщины к длине от 5,7 до 10,8 оценка этих коэффициентов [316] дала от 7,8 до 18,0 пм/В для d333 и от 0,14 до 2,88 пм/В для d311. Что касается наночастиц TiO2, то они обнаруживаются только по сигналу ФВДП, так что ZnO можно считать более подходящим материалом для нелинейной микроскопии. Рис. 7.8. ГВГ/ГРР-изображения эмали до (а) и после (б–г ) 45-минутной ультразвуковой обработки в суспензии наночастиц ZnO: z = 0 мкм (б), z = 2 мкм (в), z = 12 мкм (г). Белые пятна – сигнал от наночастиц ZnO. 118 На рис. 7.7 и 7.8 также видны преобладающие направления структур, формирующих исследуемую зубную ткань: тубулы дентина направлены от нижнего левого угла к правому верхнему (рис. 7.7), а призмы эмали вытянуты от правого нижнего угла к левому верхнему (рис. 7.8.). Смещение положения наночастиц в горизонтальной плоскости (перпендикулярно направлению Z-сканирования) от одного изображения к другому мы считаем артефактом, причина которого – либо неодинаковое расположение образца по отношению к фокальной плоскости падающего света, либо шероховатость поверхности образца (перепад высоты). Измерения профиля поверхности образцов дентина и эмали с помощью оптического профилометра Contour GT-K0 (Bruker, США), выполненные для выяснения этого вопроса (рис.7.9), выявили изменения высоты поверхности в пределах нескольких мкм, что сравнимо с шагом сканирования по глубине (1, 2 или 5 мкм в зависимости от ситуации). 119 Рис. 7.9. Изображения поверхности одного из образцов дентина (а) и эмали (б), полученные с помощью оптической профилометрии. Рассматривая сложный процесс проникновения наночастиц в пористую ткань зуба по аналогии с диффузией, можно грубо оценить нижнюю границу соотвествующего «коэффициента диффузии» D по глубине d и времени проникновения как D d2/. Для наночастиц ZnO глубина проникновения в дентин составила 45 мкм после 30 минут ультразвуковой обработки, тогда как для эмали глубина 10 мкм была достигнута после 15 минут обработки (соответствующие изображения не показаны). Отсюда получаем D2.5108 см2/с и D109 см2/с для эмали. Для наночастиц TiO2 глубина 5 мкм была достигнута после ультразвуковой обработки в течение 30 минут, что дает D 2.81010 см2/с. В этих вычислениях не учитывалась кривизна тубул и промежутков 120 между призмами эмали, поскольку образцы полностью покрывались взвесью наночастиц. Видно, что: а) дентин более проницаем для частиц ZnO, чем эмаль; б) «коэффициент диффузии» наночастиц ZnO примерно в 2 раза выше, чем TiO2. Можно предположить, что это вызвано различными размерами их агрегатов (рис. 7.4), которые могут не полностью разрушаться при ультразвуковой обработке. При исследовании проницаемости для каждого типа наночастиц бралось по четыре образца, все полученные данные находились в согласии друг с другом. В принципе, многофотонная микроскопия способна визуализировать агрегаты наночастиц в тубулах до глубины около 200 мкм, которая, однако, в описанных выше экспериментах частицами не достигалась. В заключение суммируем результаты данного раздела. С помощью нелинейной оптической микроскопии наблюдалось проникновение наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека. Наночастицы TiO2 обнаруживались только по флуоресценции, возбуждаемой двухфотонным поглощением, тогда как ZnO – только по сигналу генерации второй гармоники и гиперрэлеевского рассеяния. Оба типа сигналов – ГВГ/ГРР для наночастиц ZnO и ФВДП для TiO2 nanoparticles – превышают слабый ГВГ и ФВДП фоновый сигнал от самих тканей зуба, что и делает возможным обнаружение наночастиц. В условиях данного эксперимента для использованных в нем образцов наночастицы ZnO наблюдались на глубине до 12 мкм и 45 мкм в образцах эмали и дентина зуба человека, соответственно, а наночастицы TiO2 на глубине 5 мкм в дентине. Проникновение наночастиц TiO2 в эмаль не удалось визуализировать, так как сигнал от них был слабым по сравнению с фоновым сигналом от самой эмали. Размер и форма наночастиц, а также их способность к агрегации играют важную роль в процессе проникновения. Для частиц ZnO проницаемость дентина оказалась примерно на порядок величины больше, чем у эмали. За одно и то же время глубина проникновения оказалась выше у частиц ZnO, 121 чем у исходно более мелких частиц TiO2, что можно объяснить большей степенью агрегации последних. Проверка данной гипотезы требует дополнительного исследования независимыми методами. 122 8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе, насколько показал проведенный нами анализ литературы, впервые предпринята попытка применить метод оптической когерентной томографии к исследованию изменений тканей зуба человека в процессе проникновения в них химических агентов и взвесей наночастиц. Эта попытка оказалась успешной. Несмотря на трудности, связанные с характерными особенностями дентина и эмали и, прежде всего, с сильным рассеянием, удалось получить ОКТ-изображения образцов дентина и эмали толщиной порядка 1 мм и провести в реальном времени мониторинг изменений, происходящих в ткани в процессе проникновения агента. Как следует из наших экспериментов, основной причиной видимых на ОКТ изменений в случае проникновения химических агентов является эффект оптического просветления, а в случае проникновения наночастиц – рассеяние света частицами. Эксперименты проводились на срезах ткани зуба в течение длительного времени, так как заметное проникновение большинства исследованных агентов в образцы занимало до нескольких часов. В качестве просветляющих агентов использовались вода, глицерин и растворы глюкозы в воде. Для этих веществ по временной динамике среднего наклона сигнала ОКТ были определены постоянные времени, характеризующие процесс стабилизации оптических свойств образца, а по ним найдены значения коэффициента проницаемости. Продемонстрирована значительная зависимость найденных параметров от структурных особенностей образца, прежде всего связанных с различием в плотности и среднем диаметре тубул дентина. Использовать средний наклон сигнала ОКТ как диагностический параметр было предложено ранее [105–109] для таких тканей, как роговица, склера, кожа. Для тканей зуба данный подход применен нами впервые. Если отражение происходит от непросветляемого объекта (неоднородности), находящегося в рассеивающей просветляемой среде, то использованный нами метод позволяет определить непосредственно коэффициент ослабления 123 среды. Но при оптическом просветлении может меняться не только коэффициент ослабления, но и сечение рассеяние назад, создающее полезный сигнал. Простое соотношение между средним наклоном сигнала ОКТ и коэффициентом ослабления среды может нарушаться и в силу ее макроскопической неоднородности, так что для извлечения количественных значений коэффициента ослабления (рассеяния) из наклона сигнала ОКТ требуется тщательная калибровка установки с использованием фантомов. Однако, это не обязательно при определении времени стабилизации наклона сигнала ОКТ, значения которого затем были использованы нами для вычисления коэффициента проницаемости. В экспериментах с глюкозой было обнаружено, что проникновение раствора глюкозы в образец зубной ткани происходит намного медленнее, чем для воды и глицерина. Этот результат очевиден, если учесть размеры и массу молекул глюкозы, которые намного больше молекул воды и глицерина. Однако, в этой части работы более важная задача состояла в том, чтобы выяснить возможность необратимых последствий длительного воздействия раствора глюкозы на ткани зуба. Такая задача связана с глобальной проблемой профилактики и лечения сахарного диабета и его последствий в организме человека. Длительное вымачивание образцов ткани зуба в растворе глюкозы в какой-то степени имитировало процессы, происходящие в организме больного диабетом. Обнаружено, что после такого вымачивания в образцах происходили необратимые изменения, проявлением которых было значительное изменение скорости проникновения воды. Проникновение исследовалось с наночастиц целью в дентин последующего и эмаль использования зуба человека эффекта при восстановлении зубной ткани (гидроксиапатит) и косметическом отбеливании (двуокись титана). Внедрение части производилось из взвеси и стимулировалось ультразвуком, а его мониторирование осуществлялось по ОКТ изображениям. В этом эксперименте было наглядно продемонстрировано преимущество использования обработанного путем усреднения сигнала ОКТ 124 перед непосредственно ОКТ–изображением, как таковым. На полученных кривых ОКТ-сигнала отчетливо видны изменения, достигающие 5 дБ и усиливающиеся в процессе внедрения наночастиц. Однако, оценка глубины проникновения частиц оказалась затруднительной из-за возможного влияния многократного рассеяния и растворителя на образцы, что требует дополнительных исследований. В дополнение к ОКТ-исследованиям, не позволяющим разрешить отдельные наночастицы и фактически дающим лишь косвенное подтверждение их проникновения в образцы тканей зуба, были проведены эксперименты по мониторингу проникновения наночастиц в образцы дентина и эмали зуба человека с использованием многофотонной микроскопии. Наночастицы ZnO проникали в эмаль и дентин зуба человека на глубину 12 мкм и 45 мкм, соответственно, а наночастицы TiO2 на глубину 5 мкм. Проникновение преимущественно происходит вдоль направления призм эмали или тубул дентина. Обнаружено, что проницаемость дентина для наночастиц ZnO на порядок выше проницаемости эмали и что скорость проникновения существенно зависит от размера частиц: она выше для субмикронных частиц ZnO, чем для агрегатов микронного размера из исходно более мелких частиц TiO2. Основное внимание в работе было сосредоточено на тканях зуба человека, однако, возможности мониторинга процессов, протекающих в твердых и плотных тканях гораздо шире. Иллюстрацией данного утверждения могут служить выполненные нами исследования процессов, происходящих в тканях ногтя пальца человека и образцах жировой ткани. В тканях ногтя наблюдались хорошо заметные изменения ОКТ изображений и усредненных А-сканов при совместном воздействии глицерина (иммерсионное просветление) и механического сжатия. В данном случае мониторинг происходящих изменений был выполнен в условиях визуализации структурных элементов ногтя и подстилающих тканей, вплоть до дермы. Высокое разрешение ОКТ позволило исследовать долговременные процессы 125 разрушения образцов жировой ткани после комбинированного воздействия красителей и источников света на клеточном уровне. Эти результаты являются еще одним свидетельством информативности и перспективности применения ОКТ как неинвазивного средства мониторинга процессов, протекающих в биологических тканях, в реальном времени. 126 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Cheong W.F., Prahl S.A., Welch A.J. A review of the optical properties of biological tissues // IEEE J. Quant. Elect. 1990. V. QE-26. P. 2166—2185 2. Троицкий И.Н. Статистическая теория томографии. М.: Радио и связь, 1989. 240 с. 3. Наттерер Ф. Математические аспекты компьютерной томографии. Пер. С англ. - М.: Мир, 1990. 280 с. 4. Медофф Б.П. Реконструкция изображений по ограниченным данным: теория и применения в компьютерной томографии, в кн.: Реконструкция изображений/ Под ред. Г. Старка. М.: Мир, 1992. Гл. 9. С. 385–436. 5. Галайдин П.А., Замятин А.И., Иванов В.А. Основы магниторезонансной томографии. СПб: Изд-во ИТМО, 1998. 24 c. 6. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях. М.: Мир, 1990. - 709с. 7. Марусина М.Я. Казначеева А.О. Современные виды томографии. Учебное пособие - СПб.: СПбГУ ИТМО, 2006. - 152 с 8. Medical optical tomography: functional imaging and monitoring / Eds G. Müller, B. Chance, R. Alfano et.al. Bellingham: SPIE, 1993. V. IS11. 9. Selected papers on tissues optics: applications in medical diagnostics and therapy/ Ed. V.V. Tuchin. Bellingham: SPIE, 1994. V. MS102 10. Rinneberg H. Scattering of laser light in turbid media, optical tomography for medical diagnostics. // The inverse problem / Ed. H. Lübbig. Berlin, Academia Verlag, 1995. P. 107–141. 11. Coherence-domain method in biomedical optics / Ed. V.V. Tuchin. Bellingham, SPIE, 1996. Vol. 2732. 12. Fercher A.F. Optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 1996. V. 1. P. 157–173. 127 13. Inaba H. Coherent detection imaging for medical laser tomography // Medical optical tomography: functional imaging and monitoring / Eds G. Müller, B. Chance, R. Alfano et.al. Bellingham WA, SPIE Institute Series. 1993. V. IS11. P. 317–347. 14. Dörschel K., Messer B., Minet O., Müller G. High resolution coherent tomography // Medical optical tomography: functional imaging and monitoring / Eds G. Müller, B. Chance, R. Alfano et.al. Bellingham WA, SPIE Institute Series. 1993. V. IS11. P. 348–354. 15. Poupinet L., Jarry G. Heterodyne detection for measuring extinction coefficient in mammalian tissue // J. Optics (Paris). 1993. V. 24. P. 279–285. 16. Jones R., Hyde S.W.C., Lynn M.J. et.al. Holographic storage and high background imaging using photorefractive multiple quantum wells // Appl. Phys. Lett. 1996. V. 69. P. 1837–1839. 17. Fercher A.F., Drexler W., Hitzenberger C.K. Ocular partial-coherence interferometry // Proc. SPIE, 1996. V. 2732. P. 210–228. 18. Fercher A.F., Drexler W., Hitzenberger C.K. Ocular partial-coherence tomography // Proc. SPIE, 1996. V. 2732. P. 229–241. 19. Izatt J. A., Kulkarni M. D., Kobayashi K., Sivak M.V., Barton J.K., Welsh A.J. Optical coherence tomography for biodiagnostics // Opt. Photon. News. 1997. V. 8. P. 41–47. 20. Schmitt J.M. Array detection for speckle reduction in optical coherence microscopy // Phys. Med. Biol. 1997. Vol. 42. P. 1427–1439. 21. Rajadhyashka M., Anderson R.R., Webb R.H. Video-rate confocal scanning laser microscope for imaging human tissues in vivo // Appl. Opt. 1999. V. 38. P. 2105–2115. 22. Hee M.R., Izatt J.A., Jacobson J.M., Swanson E.A., Fujimoto J.G. Femtosecond transillumination optical coherence tomography // Opt. Lett. 1993. V. 18. P. 950– 952. 23. Fujimoto J.G., De Silvestri S., Ippen E.P., Margolis R., Oseroff A. Femtosecond optical ranging in biological systems // Opt. Lett. 1986. V. 11. P. 150–152. 128 24. Rudolph W., Kempe M. Trends in optical biomedical imaging // J. Mod. Opt. 1997. V. 44. P. 1617–1642. 25. Fercher A.F., Mengedoht K., Werner W. Eye-length measurement by interferometry with partially coherent light // Opt. Lett. 1988. V. 13. P. 186–188. 26. Гуров И.П. Оптическая когерентная томография: принципы, проблемы и перспективы. В кн.: Проблемы когерентной и нелинейной оптики / Под ред. И.П. Гурова и С.А. Козлова. СПб: СПбГУ ИТМО, 2004. С. 6–30. 27. Izatt J.A., Hee M.R., Owen G.A., Swanson E.A., Fujimoto J.G. Optical coherence microscopy in scattering media // Opt. Lett. 1994. V. 19. P. 590–592. 28. Leith E.N., Chen C., Chen H., Chen Y., Dilworth D., Lopez J., Rudd J., Sun P.C., Valdmanis J., Vossler G. Imaging through scattering media with holography // J. Opt. Soc. Am. 1992. V. 9. P. 1148–1153. 29. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. М.: Физматлит, 2010. 30. Fercher A.F., Drexler W., Hitzenberger C.K., Lasser T. Optical coherence tomography - principles and applications // Rep. Prog. Phys. 2003. V. 66. No. 2. P. 239–303. 31. Зимняков Д.А., Тучин В.В. Оптическая томография тканей // Квант. электрон. 2002. Т. 32. № 10. С. 849–867. 32. Vo-Dinh T. Biomedical Photonics Handbook, capitolul 13: Optical Coherence Tomography Imaging, CRC PRESS Boca Raton, London, New York Washington, D.C. 2003. P. 22–24. 33. Drexler W., Liu M., Kumar A., Kamali T., Unterhuber A., Leitgeb R.A. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality // J. Biomed. Opt. 2014. V. 19. No. 7. P. 071412. 34. Schimitt J.M., Xiang S.H., Yung K.M. Speckle in optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 1999. V. 4. P. 95–105. 35. Huang D., Swanson E.A., Lin C.P., Schuman J.S., Stinson W.G., Chang W., Hee M.R., Flotte T., Gregory K., Puliafito C.A., Fujimoto J.G. Optical coherence tomography // Science. 1991. V. 254. P. 1178–1181. 129 36. Puliafito C.A., Hee M.R., Lin C.P., Reichel E., Schuman J.S., Duker J.S., Izatt J.A., Swanson E.A., Fujimoto J.G. Imaging of macular diseases with optical coherence tomography // Ophthalmology. 1995. V. 102. No. 2. P. 217–229. 37. Drexler W., Morgner U., Ghanta R.K., Kartner F.X., Schuman J.S., Fujimoto J.G. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography // Nat. Med. 2001. V. 7. No. 4. P. 502–507. 38. Schuman S.G., Hertzmark E., Fujimoto J.G., Schuman J.S. Wavelength independence and interdevice variability of optical coherence tomography // Ophthal Surg. Las. Im. 2004. V. 35. No. 4. P. 316–320. 39. Srinivasan V.J., Monson B.K., Wojtkowski M., Bilonick R.A., Gorczynska I., Chen R., Duker J.S., Schuman J.S., Fujimoto J.G. Characterization of outer retinal morphology with high-speed, ultrahigh-resolution optical coherence tomography // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008. V. 49. No. 4. P. 1571–1579. 40. Pircher M., Baumann B., Gotzinger E., Hitzenberger C.K. Retinal cone mosaicimaged with transverse scanning optical coherence tomography // Opt. Lett. 2006. V. 31. No. 12. P. 1821–1823. 41. Gotzinger E., Pircher M., Geitzenauer W., Ahlers C., Baumann B., Michels S., Schmidt-Erfurth U., Hitzenberger C.K. Retinal pigment epithelium segmentation by polarization sensitive optical coherence tomography // Opt. Express. 2008. V. 16. No. 21. P. 16410–16422. 42. Chen Y., de Bruin D.M., Kerbage C., de Boer J.F. Spectrally balanced detection for optical frequency domain imaging // Opt. Express 2007. V. 15. No. 25. P. 16390– 16399. 43. Ho J., Witkin A.J., Liu J., Chen Y., Fujimoto J.G., Schuman J.S., Duker J.S. Documentation of intraretinal retinal pigment epithelium migration via highspeed ultrahigh-resolution optical coherence tomography // Ophthalmology 2011. V. 118. No. 4. P. 687–693. 44. Chen Y., Vuong L.N., Liu J., Ho J., Srinivasan V.J., Gorczynska I., Witkin A.J., Duker J.S., Schuman J., Fujimoto J.G. Three-dimensional ultrahigh resolution 130 optical coherence tomography imaging of age-related macular degeneration // Opt. Express 2009. V. 17. No. 5. P. 4046–4060. 45. Srinivasan V.J., Chen Y., Duker J.S., Fujimoto J.G. In vivo functional imaging of intrinsic scattering changes in the human retina with high-speed ultrahigh resolution OCT // Opt. Express. 2009. V. 17. No. 5. P. 3861–3877. 46. Chia S., Raffel O.C., Takano M., Tearney G.J., Bouma B.E., Jang I.K. In-vivo comparison of coronary plaque characteristics using optical coherence tomography in women vs. men with acute coronary syndrome // Coron. Artery Dis. 2007. V. 18. No. 6. P. 423–427. 47. Kawasaki M., Bouma B.E., Bressner J., Houser S.L., Nadkarni S.K., MacNeill B.D., Jang I.K., Fujiwara H., Tearney G.J. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography and integrated backscatter intravascular ultrasound images for tissue characterization of human coronary plaques // J. Am. Coll. Cardiol. 2006. V. 48. No. 1. P. 81–88. 48. Bouma B.E., Tearney G.J., Yabushita H., Shishkov M., Kauffman C.R., Gauthier D.D., MacNeill B.D., Houser S.L., Aretz H.T., Halpern E.F., Jang I.K. Evaluation of intracoronary stenting by intravascular optical coherence tomography // Heart 2003. V. 89. No. 3. P. 317–320. 49. Kubo T., Imanishi T., Takarada S., Kuroi A., Ueno S., Yamano T., Tanimoto T., Matsuo Y., Masho T., Kitabata H., Tsuda K., Tomobuchi Y., Akasaka T. Assessment of culprit lesion morphology in acute myocardial infarction - Abilityof optical coherence tomography compared with intravascular ultrasound and coronary angioscopy // J. Am. Coll. Cardiol. 2007. V. 50. No. 10. P. 933–939. 50. Sawada T., Shite J., Shinke T., Watanabe S., Otake H., Matsumoto D., Imuro Y., Ogasawara D., Paredes O.L., Yokoyama M. Persistent malapposition after implantation of sirolimus-eluting stent into intramural coronary hematoma Optical coherence tomography observations // Circulation J. 2006. V. 70. No. 11. P. 1515–1519. 131 51. Kume T., Akasaka T., Kawamoto T., Watanabe N., Toyota E., Neishi Y., Sukmawan R., Sadahira Y., Yoshida K. Assessment of coronary arterial plaque by optical coherence tomography // Am. J. Cardiol. 2006. V. 97. No. 8. P. 1172–1175. 52. Brezinski M.E. Optical coherence tomography for identifying unstable coronary plaque // Int. J. Cardiol. 2006. V. 107. No. 2. P. 154–165. 53. Tearney G.J., Jang I.K., Kang D.H., Aretz H.T., Houser S.L., Brady T.J., Schlendorf K., Shishkov M., Bouma B.E. Porcine coronary imaging in vivo by optical coherence tomography // Acta cardiologica 2000. V. 55. No. 4. P. 233–237. 54. Yasuno Y., Endo T., Makita S., Aoki G., Itoh M., Yatagai T. Three-dimensional line-field Fourier domain optical coherence tomography for in vivo dermatological investigation // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. P. 014014–014020. 55. Weissman J., Hancewicz T., Kaplan P. Optical coherence tomography of skin for measurement of epidermal thickness by shapelet-based image analysis // Opt. Express. 2004. V. 12. No. 23. P. 5760–5769. 56. Pierce M.C., Strasswimmer J., Park B.H., Cense B., de Boer J.F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2004. V. 9. No. 2. P. 287–291. 57. Zhao Y.H., Chen Z.P., Saxer C., Xiang S.H., de Boer J.F., Nelson J.S. Phaseresolved optical coherence tomography and optical Doppler tomography for imaging blood flow in human skin with fast scanning speed and high velocity sensitivity // Opt. Lett. 2000. V. 25. No. 2. P. 114–116. 58. Welzel J., Lankenau E., Birngruber R., Engelhardt R. Optical coherence tomography of the skin // Curr. Probl. Dermatol. 1998. V. 26. P. 27–37. 59. Baumgartner A., Dichtl S., Hitzenberger C.K., Sattmann H., Robl B., Moritz A., Fercher A.F., Sperr W. Polarization-sensitive optical coherence tomography of dental structures // Caries Res. 2000. V. 34. No. 1. P. 59–69. 60. Colston B.W., Jr., Everett M.J., Sathyam U.S., DaSilva L.B., Otis L.L. Imaging of the oral cavity using optical coherence tomography // Monogr. Oral Sci. 2000. V. 17. P. 32–55. 132 61. Otis L.L., Colston B.W., Jr., Everett M.J., Nathel H. Dental optical coherence tomography: a comparison of two in vitro systems // Dentomaxillofac. Radiol. 2000. V. 29. No. 2. P. 85–89. 62. Otis L.L., Everett M.J., Sathyam U.S., Colston B.W., Jr. Optical coherence tomography: a new imaging technology for dentistry // J. Am. Dental Assoc. 2000. V. 131. No. 4. P. 511–514. 63. Fried D., Xie J., Shafi S., Featherstone J.D.B., Breunig T.M., Charles L. Imaging caries lesions and lesion progression with polarization sensitive optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2002. V. 7. No. 4. P. 618–627. 64. Otis L.L., al-Sadhan R.I., Meiers J., Redford-Badwal D. Identification of occlusal sealants using optical coherence tomography // J. Clin. Dent. 2003. V. 14. No. 1. P. 7– 10. 65. Ko A.C.-T., Choo-Smith L.-P., Hewko M., Leonardi L., Sowa M.G., Dong C.C.S., Williams P., Cleghorn B. Ex vivo detection and characterization of early dental caries by optical coherence tomography and Raman spectroscopy // J. Biomed. Opt. 2005. V. 10. No. 3. P. 031118. 66. Jones R.S., Darling C.L., Featherstone J.D.B., Fried D. Remineralization of in vitro dental caries assessed with polarization-sensitive optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. No. 1. P. 014016. 67. Jones R.S., Darling C.L., Featherstone J.D.B., Fried D. Imaging artificial caries on the occlusal surfaces with polarization-sensitive optical coherence tomography // Caries Res. 2006. V. 40. No. 2. P. 81–89. 68. Chen Y.L., Otis L., Zhu Q. Polarization memory effect in optical coherence tomography and dental imaging application // J. Biomed. Opt. 2011. V. 16. No. 8. P. 086005. 69. Chen Y., Otis L., Zhu Q. Polarization memory effect in the polarization-sensitive optical coherence tomography system // Proc. SPIE. 2007. V. 6429. P. 6429K. 70. Chen Y., Otis L., Piao D., Zhu Q. Characterization of dentin, enamel, and carious lesions by a polarization-sensitive optical coherence tomography system // Appl. Opt. 2005. V. 44. No. 11. P. 2041–2048. 133 71. Su J.P., Zhang J., Yu L.F., Chen Z.P. In vivo three-dimensional microelectromechanical endoscopic swept source optical coherence tomography // Opt. Express. 2007. V. 15. No. 16. P. 10390–10396. 72. Yaqoob Z., Wu J.G., McDowell E.J., Heng X., Yang C.H. Methods and application areas of endoscopic optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. No. 6. P. 063001. 73. Данильченко Д., Закс М., Ланкенау Е., Кениг Ф., Хютман Г., Шнор Д., АлъШукри С., Ленинг Ш. Оптическая когерентная томография мочевого пузыря: потенциал высокоразрешающего визуального исследования для эндоскопической диагностики // Опт. и спектр. 2006. Т. 101. №1. С. 44–49. 74. Mashimo H., Desai S., Pedrosa M., Wagh M., Chen Y., Herz P., Hsiung P.L., Aguirre A., Koski A., Schmitt J., Fujimoto J.G. Ultrahigh resolution endoscopic optical coherence tomography: a novel technology for gastrointestinal imaging // Gastroenterology 2005. V. 128. No. 4. P. A251–A251. 75. Chen Y., Herz P.R., Hsiung P.-L., Aguirre A.D., Schneider K., Fujimoto J.G., Mashimo H., Desai S., Pedrosa M., Schmitt J.M., Koski A. Ultrahigh resolution endoscopic optical coherence tomography for gastrointestinal imaging // Proc. SPIE. 2005. V. 5690. doi:10.1117/12.592609. 76. Tearney G.J., Brezinski M.E., Bouma B.E., Boppart S.A., Pitvis C., Southern J.F., Fujimoto J.G. In vivo endoscopic optical biopsy with optical coherence tomography // Science. 1997. V. 276. No. 5321. P. 2037–2039. 77. Handbook of Optical Coherence Tomography / Eds. B.E. Bouma, G.J. Tearney. New York: Marcel-Dekker, 2002. 78. Maheshwari A., Choma M.A., Izatt J.A. Heterodyne swept-source optical coherence tomography for complete complex conjugate ambiguity removal // Proc. SPIE. 2005. V. 5690. P. 91–95. 79. Jung E.J., Park J.-S., Jeong M.Y. et al. Spectrally sampled OCT for sensitivity improvement from limited optical power // Opt. Express. 2008. V. 16. No. 22. P. 17457–17467. 134 80. Choma M.A., Sarunic M.V., Yang C. et al. Sensitivity advantage of swept source and Fourier domain optical coherence tomography, Opt. Express. 2003. V.11. No. 18. P. 2183–2189. 81. Chen Z. Optical Doppler tomography. In: Coherent-Domain Optical Methods: Biomedical Diagnostics, Environmental and Material Science / ed. V.V. Tuchin. Boston: Kluwer Academic Publishers, 2004. V. 2. P. 315–342. 82. Chen Z., Milner T., Srinivas S., et al. Noninvasive imaging of in-vivo blood flow velocity using optical Doppler tomography // Opt. Lett. 1997. V. 22. P. 1119–1121. 83. Sinescu C., Negrutiu M.L., Todea C. et al. Quality assessment of dental treatments using en-face optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2008. V. 13. No. 5. P. 054065. 84. De Boer J., Milner T., van Gemert M., Nelson J. Two dimensional birefringence imaging in biological tissue by polarisation sensitive optical coherence tomography // Opt. Lett. 1997. V. 22. P. 934–936. 85. Schmitt J.M., Xiang S.H. Cross-polarized backscatter in optical coherence tomography of biological tissue // Opt. Lett. 1998. V. 23. No. 13. P. 1060–1062. 86. Morgner U., Drexler W., Kartner F.C., Li X.D., Pitris C., Ippen E.P., Fujimoto J.G. Spectroscopic optical coherence tomography // Opt. Lett. 2000. V. 25. P. 111– 113. 87. Hermann B., Bizheva K., Unterhuber A., Povazay B., Sattmann H., Schmetterer L., Fercher A.F., Drexler W. Precision of extracting absorption profiles from weakly scattering media with spectroscopic time-domain optical coherence tomography // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 1677–1688. 88. Schmitt J., Xiang S., Yung K. Differential absorption imaging with optical coherence tomography // J. Opt. Soc. Am. A. 1998. V. 15. P. 2288–2296. 89. Støren T., Røyset A., Svaasand L.O., Lindmo T. Functional imaging of dye concentration in tissue phantoms by spectroscopic optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2005. V. 10. P. 024037. 135 90. Faber D.J., Mik E.G., Aalders M.C.G., van Leuven T.G. Light absorption of (oxy-)hemoglobin assessed by spectroscopic optical coherence tomography // Opt. Lett. 2003. V. 28. P. 1436–1438. 91. Jobsis F.F. Non-invasive, infrared monitoring of cerebral and myocardial oxygen sufficiency and circulatory parameters // Science. 1977. V. 198. P. 1264–1267. 92. Xu C., Ye J., Marks D.L., Boppart S.A. Near-infrared dyes as contrast-enhancing agents for spectroscopic optical coherence tomography // Opt. Lett. 2004. 29. P. 1647–1649. 93. Backman V., Wallace M.B., Perelman L.T., Arendt J.T., Gurjar R., Muller M.G., Zhang Q., Zonios G., Kline E., Mcgillican T., Shapshay S., Valdez T., Badizadegan K., Crawford J.M., Fitzmaurice M., Kabani S., Levin H.S., Seiler M., Dasari R.R., Itzkan I., Van Dam J., Feld M.S. Detection of preinvasive cancer cells // Nature. 2000. 406. P. 35–36. 94. Yang C., McGuckin L.E., Simon J.D., Choma M.A., Applegate B.E., Izatt J.A. Spectral triangulation molecular contrast optical coherence tomography with indocyanine green as the contrast agent // Opt. Lett. 2004. V. 29. P. 2016–2018. 95. Xu C., Boppart S.A. Comparative performance analysis of time-frequency distributions for spectroscopic optical coherence tomography // Appl. Opt. 2005. V. 44. No. 10. P. 1813–1822. 96. Xu C., Marks D.L., Do M.N. Boppart S.A. A least-squares fitting algorithm for separating absorption and scattering profiles in spectroscopic optical coherence tomography // Proc. SPIE. 2005. V. 5690. P. 201–208. 97. Schmitt J.M., Knüttel A., Bonner R.F. Measurement of optical properties of biological tissues by low-coherence interferometry // Appl. Opt. 1993. V. 32. P. 6032– 6042. 98. Pan Y., Birngruber R., Rosperich J., Engelhardt R. Low coherence optical tomography in turbid tissue: theoretical analysis // Appl. Opt. 1995. V. 34. P. 6564– 6574. 99. Thurber S.R., Brodsky A.M., Burgess L.W. Characterization of random media by low-coherence interferometry // Appl. Spectrosc. 2000. V. 54. P. 1506–1514. 136 100. Faber D.J., van der Meer F.J., Aalders M.C.G., van Leeuwen T.G. Quantitative measurement of attenuation coefficients of weakly scattering media using optical coherence tomography // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 4353–4365. 101. Xu C., Marks D.L., Do M.N., Boppart S.A. Separation of absorption and scattering profiles in spectroscopic optical coherence tomography using a leastsquares algorithm // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 4790–4803. 102. Kholodnykh A.I., Petrova I.Y., Larin K.V., Motamedi M., Esenaliev R.O. Precision of measurement of tissue optical properties with optical coherence tomography // Appl. Opt. 2003. V. 42. P. 3027–3037. 103. Pircher M., Götzinger E., Leitgeb R., Fercher A.F., Hitzenberger C.K. Speckle reduction in optical coherence tomography by frequency compounding // J. Biomed. Opt. 2003. V. 8. P. 565–569. 104. Støren T., Røyset A., Svaasand L.O., Lindmo T. Measurement of dye diffusion in scattering tissue phantoms using dual-wavelength low-coherence interferometry // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. No. 1. P. 014017. 105. Ghosn M.G., Tuchin V.V., Larin K.V. Nondestructive quantification of analyte diffusion in cornea and sclera using optical coherence tomography // Invest. Ophthalmol .Vis. Sci. 2007. V. 48. No. 6. P. 2726–2733. 106. Ларин К.В., Тучин В.В. Функциональная визуализация и оценка скорости диффузии глюкозы в эпителиальных тканях с помощью оптической когерентной томографии // Квант. электрон. 2008. T. 38, № 6. С. 551–556. 107. Ghosn M.G., Carbajal E.F., Befrui N.A., Tuchin V.V., Larin K.V. Differential permeability rate and percent clearing of glucose in different regions in rabbit sclera // J. Biomed. Opt. 2008. V. 13. No. 2. P. 021110. 108. Ghosn M.G., Sudheendran N., Wendt M., Glasser A., Tuchin V.V., Larin K.V. Monitoring of glucose permeability in monkey skin in vivo using Optical Coherence Tomography // J. Biophoton. 2010. V. 3. No. 1–2. P. 25–33. 109. Larin K.V., Ghosn M.G., Bashkatov A.N., Genina E.A., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical clearing for OCT image enhancement and in-depth monitoring of 137 molecular diffusion // IEEE J. Select. Topics in Quantum Electron. 2011. V. 18. No. 3, P. 1244–1259. 110. Ghosn M., Tuchin V.V., Larin K.V. Depth-resolved monitoring of glucose diffusion in tissues by using optical coherence tomography // Opt. Lett. 2006. V. 31. P. 2314–2316. 111. Franken P.A., Hill A.E., Peters C.W., Weinreich G. Generation of optical harmonics // Phys. Rev. Lett, 1961, V. 7, P. 118–119. 112. Fine S., Hansen W.P. Optical second harmonic generation in biological systems // Appl. Opt. 1971. V. 10. P. 2350–2353. 113. Freund I., Deutsch M., Sprecher A. Connective tissue polarity, optical secondharmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rattail tendon // Biophys. J. 1986. V. 50. P. 693–712. 114. Campagnola P.J., Clark H.A., Mohler W.A., Lewis A., Loew L.M. Second harmonic imaging microscopy of living cells // J. Biomed. Opt. (SPIE). 2001. V. 6. No. 3. P. 277–286. 115. Campagnola P.J., Loew L.M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 1356–1360. 116. Stoller P., Reiser K.M., Celliers P.M., Rubenchik A.M. Polarization-modulated second harmonic generation in collagen // Biophys. J. 2002. V. 82. P. 3330–3342. 117. Han M., Giese G., Bille J.F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera // Opt. Express. 2005. V. 13. P. 579–5797. 118. Cohen B.E. Biological imaging: beyond fluorescence // Nature. 2010. V. 467. No. 7314. P. 407–408. 119. Pantazis P., Maloney J., Wu D., Fraser S. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. V. 107. No. 33. P. 14535–14540. 120. Boyd R.W. Nonlinear Optics. San Diego, CA: Academic Press, 1992. 121. Ярив А. Квантовая электроника и нелинейная оптика. М.: Советское радио, 1973. 456 C. 138 122. Roth S., Freund I. Optical second-harmonic scattering in rat-tail tendon // Biopolymers. 1981. V. 20. P. 1271–1290. 123. Kim B.M., Eichler J., Reiser K.M., Rubenchik A.M., Da Silva L.B. Collagen structure and nonlinear susceptibility: effects of heat, glycation, and enzymatic cleavage on second harmonic signal intensity // Lasers Surg. Med. 2000. V. 27. P. 329–335. 124. Cox G., Kable E., Jones A., Fraser I., Manconi F., Gorrell M. 3-dimensional imaging of collagen using second harmonic generation // J. Struct. Biol. 2002. V. 141. P. 53–62. 125. Deng X., Williams E.D., Thompson E.W., Gan X., Gu M. Second harmonic generation from biological tissues: effect of excitation wavelength // Scanning, 2002. V. 24. P. 175–178. 126. Cox G.C., Manconi F., Kable E. Second harmonic imaging of collagen in mammalian tissue // Proc. SPIE. 2002. V. 4620. P. 148–156. 127. Altshuler G.B., Belashenkov N.R., Martsinovski G.A., Solounin A.A., Nonlinear transmission and second harmonic generation in dentin in the field of ultrashort Nd-laser pulses // Proc. SPIE. 1995. V. 1984. P. 6–10. 128. Denk W., Strickler J., Webb W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy // Science. 1990. V. 248. P. 73–76. 129. Goeppert-Mayer M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen // Ann. Phys. 1931. V. 9. P. 273–295. 130. Kaiser W., Garrett C. Two-photon excitation in CaF2:Eu2+ // Phys. Rev. Lett. 1961. V. 7. No. 6. P. 229–231. 131. Denk W., Svoboda K. Why multiphoton imaging is more than a gimmick // Neuron. 1997. V. 18. P. 351–357. 132. Helmchen F., Denk W. Deep tissue two-photon microscopy // Nat. Methods. 2005. V. 2. P. 932–940. 133. Kaminer I., Nemirovsky J., Segev M. Optimizing 3D multiphoton fluorescence microscopy // Opt. Lett. 2013. V. 38. No. 19. P. 3945–3948. 139 134. Masters B.R., So P.T.C., Gratton E. Multiphoton excitation fluorescence microscopy and spectroscopy of in vivo human skin // Biophys. J. 1997. V. 72. No. 6. P. 2405–2412. 135. Bewersdorf J., Rainer P., Hell S.W. Multifocal multiphoton microscopy // Opt. Lett. 1998. V. 23. P. 665–667. 136. Tuchin V.V., Bashkatov A.N., Genina E.A., Kochubey V.I., Lakodina N.A., Simonenko G.V., Sinichkin Yu.P., Proshina Yu.M., Razumikina N.A. Optics of living tissues with controlled scattering properties // Proc. SPIE. 1999. V. 3683. P. 10–21. 137. Deen W.M. Hindered transport of large molecules size and configuration on diffusion in microporous membranes // AIChE J. 1981. V. 27. P. 952–959. 138. Peck K.D., Ghanem Asbdel-Halim, Higuchi W.I. Hindered diffusion of polar molecules through and effective pore radii estimates of intact and ethanol treated human epidermal membrane // Pharmacol. Res. 1994. V. 11. P. 1306–1314. 139. Губанов Н.И., Утенбергенов А.А. Медицинская физика. M.: Медицина, 1978. 336 C. 140. Handbook of optical sensing of glucose in biological fluids and tissues / Ed. V. Tuchin, Taylor & Francis Group LLC, CRC Press, 2009, P. 587–621. 141. Сивухин Д.В. Общий курс физики. Термодинамика и молекулярная физика. М.: Физматлит, 2005. 544 C. 142. Таблицы физических величин / Под ред. акад. И.К. Кикоина. М.: Атомиздат, 1976. 1008 с. 143. Лыков А.В. Явление переноса в капиллярно-пористых телах. М.: Госуд. изд-во технико-теоретической литературы, 1954. 296с. 144. Tuchin V.V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnosis, second edition, Bellingham, WA: SPIE Press, 2007. 145. Boas D.A. A fundamental limitation of linearized algorithms for diffuse optical tomography // Opt. Express. 1997. V. 1. P. 404–413. 140 146. Smithpeter C.L., Dunn A.K., Welch A.J., Richards-Kortum R. Penetration depth limits of in vivo confocal reflectance imaging // Appl. Opt. 1998. V. 37. P. 2749–2754. 147. Tuchin V.V. A clear vision for laser diagnostics (review) // IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 2007. V. 13. P. 1621–1628. 148. Tuchin V.V. Optical clearing of tissues and blood. Bellingham, WA: SPIE Press, 2006. 149. Genina E.A., Bashkatov A.N., Sinichkin Yu.P., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Optical clearing of biological tissues: prospects of application in medical diagnostics and phototherapy // J. Biomed. Photon. Eng. 2015. V. 1. No. 1, P. 22–58. 150. Agrba P.D., Kirillin M.Yu., Abelevich A.I., Zagaynova E.V., Kamensky V.A. Compression as a method for increasing the informativity of optical coherence tomography of biotissue // Opt. Spectr. 2009. V. 107. No. 6. P. 853–858. 151. Drew C., Milner T.E., Rylander C.G. Mechanical tissue optical clearing devices: evaluation of enhanced light penetration in skin using optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2009. V. 14. No. 6. P. 064019. 152. Guzelsu N., Federici J.F., Lim H.C., Chauhdry H.R., Ritter A.B., Findley T. Measurement of skin stretch via light reflection // J. Biomed. Opt. 2003. V. 8. P. 80– 86. 153. Rylander C.G., Stumpp O.F., Milner T.E., Kemp N.J., Mendenhall J.M., Diller K.R., Welch A.J. Dehydration mechanism of optical clearing in tissue // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. P. 041117. 154. Yu T., Wen X., Tuchin V.V., Luo Q., Zhu D. Quantitative analysis of dehydration in porcine skin for assessing mechanism of optical clearing. // J. Biomed. Opt. 2011. V. 16. P. 095002. 155. Lin W.-C., Motamedi M., Welch A.J. Dynamics of tissue optics during laser heating of turbid media // Appl. Opt. 1996. V. 35. No. 19. P. 3413–3420. 156. Doubrovskii V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Kinetics of changes in the coefficient of transmission of the adipose tissue in vitro as a result of photodynamic action // Biophysics 2012. V. 57. No. 1. P. 94–98. 141 157. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical coherence tomography of adipose tissue at photodynamic/photothermal treatment in vitro // J. Innovat. Opt. Health Sci. 2013. V. 6. No. 2. P. 1350010. 158. Cicchi R., Pavone F.S., Massi D., Sampson D.D. Contrast and depth enhancement in two-photon microscopy of human skin ex vivo by use of optical clearing agents // Opt. Express. 2005. V. 13. P. 2337–2344. 159. Plotnikov S., Juneja V., Isaacson A.B., Mohler W.A., Campagnola P.J. Optical clearing for improved contrast in second harmonic generation imaging of skeletal muscle // Biophys. J. 2006. V. 90. P. 328–339. 160. Genina E.A., Bashkatov A.N., Sinichkin Yu.P., Tuchin V.V. Optical clearing of the eye sclera in vivo caused by glucose // Quantum Electron. 2006. V. 36. No. 12. P. 1119–1124. 161. Vargas G., Barton J.K., Welch A.J. Use of hyperosmotic chemical agent to improve the laser treatment of cutaneous vascular lesions // J. Biomed. Opt. 2008. V. 13. No. 2. P. 021114. 162. Khan M.H., Chess S., Choi B., Kelly K.M., Nelson J.S. Can topically applied optical clearing agents increase the epidermal damage threshold and enhance therapeutic efficacy // Lasers Surg. Med. 2004. V. 35. P. 93–95. 163. Zhu D., Wang J., Zhi Z., Wen X., Luo Q. Imaging dermal blood flow through the intact rat skin with an optical clearing method // J. Biomed. Opt. 2010. V. 15. P. 026008. 164. Zhu D., Larin K., Luo Q., Tuchin V.V. Recent progress in tissue optical clearing // Las. Photon. Rev. 2013. V. 7. No. 5. P. 732–757. 165. Heller W. Remarks on refractive index mixture rules // J. Phys. Chem. 1965. V. 69. No. 4. P. 1123–1129. 166. Tichin V.V., Altshuller G.B. Dental and oral tissue optics // Photonics in Dentistry. Series of Biomaterials and Bioengineering / Ed. Kishen A., Asundi A. London: Imperial College Press, 2006. P. 245–300. 142 167. Липченко В.Я, Самусев Р.П. Атлас нормальной анатомии человека: Учебное пособие. - 2-е изд., перераб. и доп. /В.Я. Липченко, Р.П. Самусев – М.: Медицина,1988.-320с. 168. Zijp J.R., Ten Bosch J.J. Theoretical model for the scattering of light by dentin and compаration with measurements // Appl. Opt. 1993. V. 32. No. 4. P. 411–415. 169. Луцкая И. К., Артюшкевич А.С. Руководство по стоматологии. Практическое пособие. Ростов н/Д: Феникс, 2000. 512 C. 170. Mjor I.A., Nordahl I. The density and branching of dentinal tubules in human teeth // Archs. Oral Biol. 1996. V. 41. P. 401–412. 171. Kinney J.H., Oliveira J., Haupt D.L., Marshall G.W., Marshall S.J. The spatial arrangement of tubules in human dentin // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2001. V. 12. 743–751. 172. Kishen A., Vedantam S., Hydromechanics in dentine: Role of dentinal tubules and hydrostatic pressure on mechanical stress-strain distribution // Dental Materials. 2007. V. 23. P. 1296–1306. 173. Альтшуллер Г.Б., Грисимов В.Н. Эффект волноводного распространения света в зубе человека // Докл. АН СССР. 1990. Т. 310. № 5. С. 1245–1248. 174. Альтшуллер Г.Б. Оптическая модель тканей зуба человека // Оптический журнал. 1995. Т. 62. С. 516–520. 175. Wilder-Smith P., Otis L., Zhang J., Chen Z. Dental OCT // Optical coherence tomography / Ed. W. Drexler, J.G. Fujimoto. Berlin, Heidelberg: Springer 2008, P. 1151–1182 176. Todea C., Negrutiu M.L., Balabuc C., Sinescu C., Topala F.I., Marcauteanu C., Canjau S., Semez G., Podoleanu A.G. Optical coherence tomography applications in dentistry // Timisoara Med. J. 2010. V. 60. No. 1. P. 5–16. 177. Ding Z., Ren H., Zhao Y., Nelson J.S., Chen Z. High-resolution optical coherence tomography over a large depth range with an axicon lens // Opt. Lett. 2002. V. 27. No. 4. P. 243–245. 143 178. Colston, B.W., Everett, M.J., Jr.; da Silva, L.B.; Otis, L.L.; Stroeve, P.; Nathel, H. Imaging of hard- and soft-tissue structure in the oral cavity by optical coherence tomography. // Appl. Opt. 1998. V. 37. P. 3582–3585. 179. Otis L.L., Matthew J.E., Ujwal S.S., Colson B.W., Jr. Optical coherence tomography: A new imaging technology for dentistry // J. Am. Dent. Assoc. 2000. V. 131. P. 511–514. 180. Drexler W., Fujimoto J.G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. Berlin-Heidelberg-New York: Springer, 2008. 181. Colston B.W., Jr., Sathyam U.S., DaSilva L.B., et al. Dental OCT // Opt. Express. 1998. V. 3. No. 6. P. 230–238. 182. Feldchtein F.I., Gelikonov G.V., Gelikonov V.M., Iksanov R.R., Kuranov R.V., Sergeev A.M., Gladkova N.D., Ourutina M.N., Warren J.A., Reitze D.H. In vivo OCT imaging of hard and soft tissue of the oral cavity // Opt. Express. 1998. V. 3. No. 6. P. 239–250. 183. Amaechi B.T., Podoleanu A., Higham S.M., et al. Correlation of quantitative light-induced fluorescence and optical coherence tomography applied for detection and quantification of early dental caries // J. Biomed. Opt. 2003. V. 8. No. 4. P. 642– 647. 184. Sherri L. Chong, Cynthia L. Darling, Daniel Fried, Nondestructive measurement of the inhibition of demineralization on smooth surfaces using polarizationsensitive optical coherence tomography // Lasers Surg. Med. 2007. V. 39. P. 422– 427. 185. Sherri L.C. Detection of white spot lesions around orthodontic brackets using polarization-sensitive optical coherence tomography // Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 2007. V. 132. P. 711 186. Bensona P.E., Shahb A.A., Willmotc D.R., Polarized versus nonpolarized digital images for the measurement of demineralization surrounding orthodontic brackets // Angle Orthodontist. 2008. V. 78. No. 2. P. 288–293. 144 187. Na J., Lee B.H., Baek J.H. et al. Optical approach for monitoring the periodontal ligament changes induced by orthodontic forces around maxillary anterior teeth of white rats // Med. Biol. Eng. Comput. 2008. V. 46. P. 597–603. 188. Sinescu C., Huges M., Bradu A. et al. Implant bone interface investigated with a non-invasive method: optical coherence tomography // Proc. SPIE. 2008. V. 6991. P. 69911L 189. Warren J.A. Gainesville F.L., Jr., Gelikonov G.V., Gelikonov V.M., Feldchtein F.J., Beach N.M., Moores M.D., Reitze D.H. Imaging and characterization of dental structure using optical coherence tomography // Conference on Lasers and ElectroOptics. Optical Society of America, 1998. P. CTuL6. 190. Imai K., Shimada Y., Sadr A., Sumi Y., Tagami J. Noninvasive cross-sectional visualization of enamel cracks by optical coherence tomography in vitro // J. Endod. 2012. V. 38. P. 1269–1274. 191. Braz A.K.S., Aguiar C.M., Gomes A.S.L. Evaluation of crack propagation in dental composites by optical coherence tomography // Dent. Mater. 2009. V. 25. P. 74–99. 192. Nakajima Y., Shimada Y., Miyashin M., Takagi Y., Tagami J., Sumi Y. Noninvasive cross-sectional imaging of incomplete crown fractures (cracks) using swept-source optical coherence tomography // Int. Endod. J. 2012. V. 45. P. 933– 941. 193. Todea C., Balabuc C., Sinescu C., Filip L., Kerezsi C., Calniceanu M., Negrutiu M., Bradu A., Hughes M., Podoleanu A.G. En face optical coherence tomography investigation of apical microleakage after laser-assisted endodontic treatment. Lasers Med. Sci. 2010. V. 25. No. 5. P. 629–639. 194. Sadr T.A.B.A., Shimada Y., Tagami J., Sumi Y. Non-invasive quantification of resin-dentin interfacial gaps using optical coherence tomography: Validation against confocal microscopy // Dent. Mater. 2011. V. 27. P. 915–925. 195. Braz A.K.S., Aguiar C.M., Gomes A.S.L. Evaluation of the integrity of dental sealants by optical coherence tomography. // Dent. Mater. 2011. V. 27. P. e60–e64. 145 196. Ishibashi K., Ozawa N., Tagami J., Sumi Y. Swept-source optical coherence tomography as a new tool to evaluate defects of resin-based composite restorations // J. Dent. 2011. V. 39. P. 543–548. 197. Braz A.K., Kyotoku B.B., Gomes A.S. In vitro tomographic image of human pulp-dentin complex: optical coherence tomography and histology // J. Endod. 2009. V. 35. P. 1218–1221. 198. Canjau S., Todea C., Negrutiu M.L., Sinescu C., Topala F.I., Marcauteanu C., Manescu A., Duma V.-F., Bradu A., Podoleanu A.Gh. Optical coherence tomography for non-invasive ex vivo investigations in dental medicine — a joint group experience (review) // Sovremennye tehnologii v medicine. 2015. V. 7 .No. 1. P. 97–115. 199. Petersen P.E. Future Use of Materials for Dental Restoration. Geneva: World Health Organization, 2009. 200. Holtzman J.S., Osann K., Pharar J., Lee K., Ahn Y., Tucker T., Sabet S., Chen Z., Gukasyan R., Smith P.W. Ability of optical coherence tomography to detect caries beneath commonly used dental sealants // Lasers Surg. Med. 2010. V. 42. P. 752–759. 201. Amaechi B.T., Higham S.M., Podoleanu A., Rogers J.A., Jackson D.A. Use of optical coherence tomography for assessment of dental caries: Quantitative procedure // J. Oral Rehabilitation. 2001. V. 28. P. 1092–1093. 202. Shimada Y., Sadr A., Burrow M.F., Tagami J., Ozawa N., Sumi Y. Validation of swept-source optical coherence tomography (SS-OCT) for the diagnosis of occlusal caries // J. Dent. 2010. V. 38. P. 655–665. 203. Baumgartner A., Hitzenberger C.K., Dicht S., Sattmann H., Moritz A., Sperr W., Fercher A.F. Optical coherence tomography or dental structures // Proc. SPIE 1998. V. 3248. P. 130–136. 204. Baumgartner A., Dicht S., Hitzenberger C.K., Sattmann H., Robi B., Moritz A., Sperr W., Fercher A.F. Polarization-sensitive optical coherence tomography of dental structures // Proc. SPIE. 1999. V. 3593. P. 169–176. 146 205. Everett M.J., Colston B.W., Sathyam U.S., Silva L.B.D., Fried D., Featherstone J.D.B. Non-invasive diagnosis of early caries with polarization sensitive optical coherence tomography (PS-OCT) // Proc. SPIE. 1999. V. 3593. P. 177–183. 206. Le M.H., Darling C.L., Fried D. Automated analysis of lesion depth and integrated reflectivity in PS‐OCT scans of tooth demineralization // Lasers Surg. Med. 2010 V. 42. P. 62–68. 207. Lee C., Darling C.L., Fried D. Polarization-sensitive optical coherence tomographic imaging of artificial demineralization on exposed surfaces of tooth roots // Dent. Mater. 2009. V. 25. P. 721–728. 208. Wu J., Fried D. High contrast near‐infrared polarized reflectance images of demineralization on tooth buccal and occlusal surfaces at λ = 1310 nm // Lasers Surg. Med. 2009. V. 41. P. 208–213. 209. Louie T., Lee C., Hsu D., Hirasuna K., Manesh S., Staninec M., Darling C.L., Fried D. Clinical assessment of early tooth demineralization using polarization sensitive optical coherence tomography // Lasers Surg. Med. 2010. V. 42. P. 738– 745. 210. Fried D., Staninec M., Darling C., Kang H., Chan K. Monitoring tooth demineralization using a cross polarization optical coherence tomographic system with an integrated MEMS scanner // Proc. SPIE 2012. V. 8208. P. 82080I. 211. Wang X.J., Milner T.E., de Boer J.F., Zhang Y., Pashley D.H., Nelson J.S. Characterization of dentin and enamel by use of optical coherence tomography // Appl. Opt. 1999. V. 38 P. 2092–2096. 212. Биологический энциклопедический словарь / Гиляров М.С., Баев А.А., Винберг Г.Г., Заварзин Г.А. и др. М.: Советская энциклопедия, 1986. С. 267. 213. Zaun H., Dill D. Krankhafte Veränderungen des Nagels. Balingen: Spitta, 2013. 134 S. 214. Мяделец О., Адаскевич В. Морфофункциональная дерматология. М.: Медицинская литература, 2006. 752 С., глава 18. 215. Scholz N. Lehrbuch und Bildatlas für die Podologie. Munchen: Verlag Neuer Merkur GmbH, 2003. 465 S. 147 216. Mashita Y., Ueno M., Ohmi M., Arimoto H., Kakuta N., Haruna M. Measurement of the optical properties of nails // The Second Asian and Pacific Rim Symposium on Biophotonics. IEEE, 2004. P. 44–45. 217. Parker S.G., Diffey B.L. The transmission of optical radiation through human nails // British J. Dermatol. 1983. V. 108. No. 1. P. 11 – 16. 218. Wieser W., Biedermann B.R., Klein T., Eigenwillig C.M., Huber R. MultiMegahertz OCT: High quality 3D imaging at 20 million A-scans and 4.5 GVoxels per second // Opt. Express. 2010. V. 18. No. 14. P. 14685–14704. 219. Spöler F., Kray S., Grychtol P., Hermes B., Bornemann J., Först M., Kurz H. Simultaneous dual-band ultra-high resolution optical coherence tomography // Opt. Express. 2007. V. 15. P. 10832–10841. 220. Kray S., Spöler F., Hellerer T., Kurz H. Electronically controlled coherent linear optical sampling for optical coherence tomography // Opt. Express. 2010. V. 18. P. 9976–9990. 221. Wu T., Ding Z., Wang L., Chen M. Spectral phase based k-domain interpolation for uniform sampling in swept-source optical coherence tomography // Opt. Express. 2011. V. 19. P. 18430–18439. 222. Wang R. High-speed, full-range optical coherence tomography // SPIE Newsroom 2009. Available at http://spie.org/x37309.xml DOI: 10.1117/2.1200909.1812 223. Choi W.J. Wang H. Wang R.K. Optical coherence tomography microangiography for monitoring the response of vascular perfusion to external pressure on human skin tissue // J. Biomed. Opt. 2014. V. 19. No. 5. P. 056003. 224. Sattler E., Kaestle R., Rothmund G., Welzel J. Confocal laser scanning microscopy, optical coherence tomography and transonychial water loss for in vivo investigation of nails // British J. Dermatol. 2012. V. 166. No. 4. P. 740–746. 225. Mogensen M., Thomsen J.B., Skovgaard L.T., Jemec G.B. Nail thickness measurements using optical coherence tomography and 20-MHz ultrasonography // Br. J. Dermatol. 2007. V. 157. No. 5. P. 894–900. 148 226. Abuzahra F., Spöler F., Först M., Brans R., Erdmann S., Merk H.F., Obrigkeit D.H. Pilot study: optical coherence tomography as a non-invasive diagnostic perspective for real time visualisation of onychomycosis // Mycoses. 2010. V. 53. No. 4. P. 334–339. 227. Morsy H., Kamp S., Thrane L., Behrendt N., Saunder B., Zayan H., Elmagid E.A., Jemec G.B. Optical coherence tomography imaging of psoriasis vulgaris: correlation with histology and disease severity // Arch. Dermatol. Res. 2010. V. 302. No. 2. P. 105–111. 228. Aydin S.Z., Ash Z., Del Galdo F., Marzo-Ortega H., Wakefield R.J., Emery P., McGonagle D. Optical coherence tomography: a new tool to assess nail disease in psoriasis? // Dermatology 2011. V. 222. P. 311–313. 229. Петрова Г.А., Фирсова М.С., Шливко И.Л., Зорькина М.В., Петрова К.С., Чекалкина О.Е. Применение оптико-когерентной томографии в оценке ногтевого аппарата в норме и при патологических состояниях // Медицинский альманах. 2010. № 2. С. 305–308. 230. Петрова Г.А., Фирсова М.С., Шливко И.Л., Чекалкина О.Е., Зорькина М.В., Петрова К.С. Экспериментальная идентификация компонентов ОКТизображений ногтевого аппарата // Российский журнал кожных и венерических болезней. 2010. № 5. С. 45–48. 231. Незнахина М.С. Возможности оптической когерентной томографии в прижизненном исследовании морфологии ногтевого аппарата в норме и при патологических состояниях. Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук. Нижний Новгород, 2013. 232. Петрова Г.А., Незнахина М.С., Шливко И.Л., Зорькина М.В., Петрова К.С., Эллинский Д.О., Гаранина О.Е. Cпособ дифференциальной диагностики заболеваний ногтевой пластинки // Патент РФ № 2503411, заяв. 10.10.2012, публ. 10.01.2014. 233. Тонков В.Н. Учебник нормальной анатомии человека. М.: Медгиз, 1962. 764 С. 149 234. Гистология, эмбриология, цитология: учебник / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Е.Ф. Котовский и др.; под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной. - 6-е изд., перераб. и доп. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. 800 C. 235. Kershaw E.E., Flier J.S. Adipose tissue as an endocrine organ // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004. V. 89. P. 2548–2556. 236. Cinti S. The adipose organ // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2005. V. 73. P. 9–15. 237. Дедов И.И., Мельниченко Г.А. Ожирение: этиология, патогенез, клинические аспекты // М.: ООО «МИА», 2004; 456 C. 238. Yang X., Bi P., Kuang S. Fighting obesity: When muscle meets fat //Adipocyte 2014. V. 3. No. 4. P. 280–289. 239. Spalding K.L., Arner1 E., Westermark P.O., Bernard S., Buchholz B.A., Bergmann O., Blomqvist L., Hoffstedt J., Näslund E., Britton T., Concha H., Hassan M., Rydén M., Frisén J., Arner P. Dynamics of fat cell turnover in humans // Nature. 2008. V. 453. P. 783–787. 240. Янина И.Ю. сенсибилизированной Исследование жировой ткани биофизических при воздействии процессов лазерного в и светодиодного излучения. Дисс. на соиск. уч. ст. канд. физ.-мат. наук. Саратов, 2013. 241. Altshuler G.В., Anderson R.R., Manstein D., Zenzie H.H., Smirnov М.Z. Extended theory of selective photothermolysis // Las. Surg. Med. 2001. V. 29. P. 416–432. 242. Salzman M.J. Laser lipolysis using a 1064/1319-nm blended wavelength laser and internal temperature monitoring // Semin. Cutan. Med. Surg. 2009. V. 28. P. 220–225. 243. Longo L. Non-surgical laser and light in the treatment of chronic diseases: a review based on personal experiences // Laser Phys. Lett. 2010. V. 7. P. 771–786. 244. Kim К.H., Geronemus R.G. Laser lipolysis using a 1064 nm Nd:YAG laser // Dermatol. Surg. 2006. V. 32. P. 241–248. 150 245. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // . Молек. биол. 1996. Т. З0, № З. С. 487–502. 246. Манских В. Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение // Цитология. 2007. Т. 49. № 11. С. 909–915. 247. Душников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). М.: Медицина, 2001. 192 с. 248. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death // Toxicol. Pathol. 2007. V. 35. No. 4. P. 495–516. 249. Lawen A. Apoptosis: an introduction // BioEssays 2003. V. 25. P. 888–896. 250. Кальянов А.Л., Лычагов В.В., Трунина Н.А., Федосов И.В., Лакодина Н.А., Тучин В.В., Беликов А.В., Альтшулер Г.Б. Исследование возможности химического отбеливания зубов, используя отверстия в эмали // Проблемы оптической физики. Материалы 11-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике 25– 28 сентября 2007. Саратов: Новый ветер, 2008. С. 44–47. 251. Герасимова Н.С., Трунина Н.А., Генина Э.А., Башкатов А.Н., Кочубей В.И., Тучин В.В. Исследование оптического просветления дентина // Проблемы оптической физики и биофотоники. Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике 23 – 26 сентября 2008. Саратов: Новый ветер, 2009. С. 47–54. 252. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. OCT monitoring of diffusion of clearing agents within tooth dentin // Proc. SPIE. 2009. V. 7443. P. 74432D. 253. Трунина Н.А., Лычагов В.В., Тучин В.В. Исследование диффузии воды через дентин зуба человека методом оптической когерентной томографии // Опт. и спектр. 2010. Т. 109. № 2. С. 190–196. 254. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. OCT monitoring of diffusion of water and glycerol through tooth dentine in different geometry of wetting // Proc. SPIE. 2010. V. 7563. P. 75630U. 151 255. Thrane L., Yura H. T., and Andersen P. E. Analysis of optical coherence tomography systems based on the extended Huygens-Fresnel principle // J. Opt. Soc. Am. A. 2000. V. 17. P. 484–490. 256. Yura H.T., Thrane L., Andersen P.E. Closed form solution for the Wigner phase-space distribution function for diffuse reflection and small angle scattering in a random medium // J. Opt. Soc. Am. A. 2000. V. 17. P. 2464–2474. 257. Cheng C.C., Raymer M.G. Propagation of transverse optical coherence in random multiple-scattering media // Phys. Rev. A. 2000. V. 62. P. 1–12. 258. Levitz D., Thrane L., Frosz M., Andersen P., Andersen C., Andersson-Engels S., Valanciunaite J., Swartling J., Hansen P. Determination of optical scattering properties of highly-scattering media in optical coherence tomography images // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 249–259. 259. Тучин В.В. Оптика биологических тканей: Методы рассеяния света в медицинской диагностике 2-e изд. / Пер. с англ. под ред. В.В. Тучина. М.: Физматлит, 2012. 811 C. 260. Tuchin V.V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnosis, 3rd edition. Bellingham WA: SPIE Press, 2015. 936 P. 261. Tuchin V.V., Xu X., Wang R.K. Dynamic optical coherence tomography in studies of optical clearing, sedimentation, and aggregation of immersed blood // Appl. Opt. 2002. V. 41. P. 258–271. 262. Tuchin V.V., Bashkatov A.N., Genina E.A., Kochubey V.I., Lychagov V.V., Portnov S.A., Trunina N.A., Miller D.R., Cho S., Oh H., Shim B., Kim M., Oh J., Eum H., Ku Y., Kim D., Yang Y. Finger tissue model and blood perfused skin tissue phantom // Proc. SPIE. 2011. V. 7898. P. 78980Z. 263. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. Optical coherence tomography monitoring of glucose diffusion and long-term glucose impact on the water permeability of tooth dentin // SPIE Photonics West. Technical Summaries. San Francisco: The Moscone Center, 2011. P. 7884–25. http://spie.org/Documents/ConferencesExhibitions/PW11B-Abstracts.pdf. 152 264. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Time variation of adipose tissue refractive index under photodynamic treatment: In vitro study using OCT // Proc. SPIE. 2012. V. 8222. P. 82221G. 265. Yanina I.Y., Trunina N.A., Tuchin V.V Optical coherence tomography of adipose tissue at photodynamic/photothermal treatment in vitro // J. Innovat. Opt. Health Sci. 2013. V. 6. No. 2. P. 1350010. 266. Yanina I.Y., Trunina N.A., Tuchin V.V. Photoinduced cell morphology alterations quantified within adipose tissues by spectral optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2013. V. 18. No. 11. P. 111407. 267. Tuchin V.V., Yanina I.Yu., Simonenko G.V. Destructive fat tissue engineering using photodynamic and selective photothermal effects // Proc. SPIE 2009. V. 7179. P. 71790C. 268. Yanina I.Yu., Orlova T.G., Tuchin V.V., Altshuler G.B. The morphology of apoptosis and necrosis of fat cells after photodynamic treatment at a constant temperature in vitro // Proc. SPIE. 2011. V. 7887. P. 78870X. 269. Doubrovsky V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Inhomogeneity of photo-induced fat cell lipolysis // Proc. SPIE. 2011. V. 7999. P. 7999-21. 270. Doubrovsky V.A., Dvorkin B.A., Tuchin V.V., Yanina I.Yu. Photoaction on cells of human adipose tissue in vitro // Cytology. 2011. V. 53. No. 5. P. 423–432. 271. Doubrovsky V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. The kinetics of optical properties of adipose cells in vitro as a result of photodynamic action // Biophysics. 2012. V. 57. No. 1. P. 125–136. 272. Wilson B.C. Photodynamic therapy/diagnostics: Principles, practice and advances // Handbook of Photonics for Medical Science. Ed. V.V. Tuchin, London: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2010. P. 649–686. 273. Yamaguchi T., Omatsu N., Morimoto E., Nakashima H., Ueno K., Tanaka T., Satouchi K., Hirose F., Osumi T. CGI-58 facilitates lipolysis on lipid droplets but is not involved in the vesiculation of lipid droplets caused by hormonal stimulation // J. Lipid Res. 2007. V. 48. P. 1078–1089. 153 274. Sudheendran N., Mohamed M., Ghosn M.G., Tuchin V.V., Larin K.V. Assessment of tissue optical clearing as a function of glucose concentration using optical coherence tomography // J. Innovat. Opt. Health Sci. 2010. V. 3. No. 3. P. 169–176. 275. Coleman K.M., Coleman W.P., 3rd, Benchetrit A. Non-invasive, external ultrasonic lipolysis // Semin. Cutan. Med. Surg. 2009. V. 28. No. 4. P. 263–267. 276. Trunina, N., Derbov, V., Tuchin, V., Altshuler, G. Dentinal permeation modeling // Proc. SPIE. 2008. V. 6791. P. 67910T. 277. Трунина Н.А., Дербов В.Л., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Модель проницаемости дентина // Проблемы оптической физики и биофотоники (Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике 23 – 26 сентября 2008). Саратов: Новый ветер, 2009. С. 42–47. 278. Agematsu H., Abe S., Shiozaki K., Usami A., Ogata S., Suzuki K., Soejima M., Ohnishi M., Nomani K., Ide Y. Relationship between large tubules and dentin caries in human deciduous tooth // Bull. Tokyo Coll. 2005. V. 42. No. 1–2. P. 7–15. 279. Boyer D., Tamarat P., Maali A., Lounis B., Orrit M. Phototermal imaging of nanometer-sized particles among scatterers // Science. 2002. V. 297. No. 5584. P. 1160–1163. 280. Wehrli F.W., Fernandez-Seara M.A. Nuclear magnetic resonance studies of bone water // Ann. Biomed. Eng. 2005. V. 33. No. 1. P. 79–86. 281. Marshall G.W., Jr., Balooch M., Tench R.J., Kinney J.H., Marshall S.J. Atomic force microscopy of acid effects on dentin // Dent. Mater. – 1993. V. 9. P. 265–268. 282. Marshall G.W.Jr., Inai N., Wu-Magidi I.C., Balooch M., Kinney J.H, Tagami J., et al. Dentin demineralization: effects of dentin depth, pH and different acids // Dent. Mater. 1997. V. 13. P. 338–343. 283. Trunina N.A., Derbov V.L., Tuchin V.V. Simple numerical model of OCT signal evolution due to the diffusion of an optical clearing agent // Proc. SPIE. 2014. V. 9031. P. 90310B 154 284. Bashkatov A.N., Genina E.A., Tuchin V.V. Measurement of glucose diffusion coefficients in human tissues // Handbook of Optical Sensing of Glucose in Biological Fluids and Tissues / Ed. V.V. Tuchin. Taylor & Francis Group LLC, CRC Press, 2009. P. 587–621 285. Cox J.L., Farrell R.A., Hart R.W., Langham M.E. The transparency of the mammalian cornea // J. Physiol. 1970. V. 210. No. 3. P. 601–616. 286. Bohern C.F., Huffman D.R. Absorption and scattering of light by small particles. New York: Wiley-Interscience, 1983. P.503. 287. Freitas R.A. Nanodentistry // J. Am. Dent. Assoc. 2000 V. 131. P. 1559–1565. 288. Uskokovic V., Bertassoni L.E. Nanotechnology in dental sciences: Moving towards a finer way of doing dentistry // Materials. 2010. V. 3. P. 1674–1694. 289. Gupta J. Nanotechnology applications in medicine and dentistry // J. Invest. Clin. Dent. 2011. V. 2. P. 1–8. 290. Borges A.B., Barcellos D.C., Torres C.R.G., Borges A.L.S., Marsilio A.L., Carvalho C.A.T. Dentine hypersensitivity – etiology, treatment possibilities and other related factors: a literature review // World J. Dent. 2012. V. 3. No. 1. P. 60– 67 291. Liu M.-H., Chan Ch.-H., Ling J.-H., Wang Ch. Filling in dentinal tubules // Nanotechnology. 2007. V. 18. P. 475104. 292. Whitesides G.M., Love J.C. The art of building small // Sci. Am., 2001 . V. 285. P. 38–47. 293. Allaker R.P. The use of nanoparticles to control oral biofilm formation // J. Dent. Res. 2010. V. 89. No. 11. P. 1175–1186. 294. Siqueira J.F., Jr., de Uzeda M. Disinfection by calcium hydroxide pastes of dentinal tubules infected with two obligate and one facultative anaerobic bacteria // J. Endod. 1996. V. 22. No. 12. P. 674–676. 295. Sen B.H., Piskin B., Demirci T. Observation of bacteria and fungi in infected root canals and dentinal tubules by SEM // Endod. Dent. Traumatol. 1995. V. 11. No. 1. P. 6–9. 155 296. Shrestha A., Fong S.-W., Khoo B.-Ch., Kishen A. Delivery of antibacterial nanoparticles into dentinal using high-intensity focused ultrasound // J. Endod. 2009. V. 35. No. 7. P. 1028–1033. 297. Balan L., Schneider R., Lougnot D.J. A new and convenient route to polyacrylate/silver nanocomposites by light-induced cross-linking polymerization // Prog. Org. Coat. 2008. V. 62. P. 351–357. 298. Kishen A., Shi Z., Shrestha A., Neoh K.G. An investigation on the antibacterial and antibiofilm efficacy of cationic nanoparticulates for root canal disinfection // J. Endod. 2008. V. 34. No. 12. P. 1515–1520. 299. Tuchina E.S., Tuchin V.V. TiO2 nanoparticle enhanced photodynamic inhibition of pathogens // Laser Phys. Lett. 2010. V. 7. No. 8. P. 607–612. 300. Popov A.P., Priezzhev A.V., Lademann J., Myllylä R. The effect of nanometer particles of titanium oxide on the protective properties of skin in the UV region // J. Opt. Technol. 2006. V. 73. P. 208–211. 301. Popov A.P., Priezzhev A.V., Lademann J., Myllylä R. Biophysical mechanisms of modification of skin optical properties in the UV wavelength range with nanoparticles // J. Appl. Phys. 2009. V. 105. No. 10. P. 102035. 302. Popov A.P., Hag S., Meinke M., Lademann J., Priezzhev A.V., Myllylä R. Effect of size of TiO2 nanoparticles applied onto glass slide and porcine skin on generation of free radicals under ultraviolet irradiation // J. Biomed. Opt. 2009. V. 14. No. 2. P. 021011. 303. Padmavathy N., Vijayaraghavan R. Enhanced bioactivity of ZnO nanoparticles–an antimicrobial study // Sci. Technol. Adv. Mat. 2008. V. 9. P. 035004. 304. Suemori T., Kato J., Nakazawa T., Akashi G., Hirai Y. A new non-vital tooth bleaching method using titanium dioxide and 3.5% hydrogen peroxide with a 405nm diode laser or a halogen lamp // Laser Phys. Lett. 2008. V. 5. No. 6. P. 454–459. 305 Li L., Pan H., Tao J., Xu X., Mao C., Gu X., Tamg R. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks // J. Mater. Chem. 2008. V. 18. P. 4079–4084. 156 306. Трунина Н.А., Тучин В.В. Визуализация проникновения наночастиц TiO2 в ткани зуба человека методом оптической когерентной томографии // Изв. Саратовского ун-та. Новая серия. Сер. Физика. 2011. Т. 11. № 2. С. 5–9. 307. Trunina N.A., Popov A.P., Lademann J., Tuchin V.V., Myllylä R., Darvin M.E. Two-photon-excited autofluorescence and second-harmonic generation microscopy for the visualization of penetration of TiO2 and ZnO nanoparticles into human tooth tissue ex vivo // Proc. SPIE. 2012. V. 8427. P. 8427OY. 308. Trunina N.A., Darvin M.E., Kordás K., Sarkar A., Mikkola J.-P., Lademann J., Meinke M.C., Myllylä R., Tuchin V.V., Popov A.P. Monitoring of TiO2 and ZnO nanoparticle penetration into enamel and dentine of human tooth in vitro and assessment of their photocatalytic ability // IEEE J. Selected Topics Quantum Electron. 2014, V. 20. No. 3. P. 7300108. 309. König K., Breunig H.G., Buckle R., Kellner-Höfer M., Weinigel M., Buttner E., Sterry W., Lademann J. Optical skin biopsies by clinical CARS and multiphoton fluorescence/SHG tomography // Laser Phys. Lett. 2011. V. 8. No. 6. P. 465–468. 310. Breunig H.G., Weinigel M., Bückle R., Kellner-Höfer M., Lademann J., Darvin M.E., Sterry W., König K. Clinical coherent anti-Stokes Raman scattering and multiphoton tomography of human skin with a femtosecond laser and photonic crystal fiber // Laser Phys. Lett. 2013. V. 10. P. 025604. 311. Darvin M.E., Konig K., Kellner-Hoefer M., Breunig H.G., Werncke W., Meinke M.C., Patzelt A., Sterry W., Lademann J. Safety assessment by nultiphoton fluorescence/second harmonic generation/hyper-Rayleigh scattering tomography of ZnO nanoparticles used in cosmetic products // Skin Pharmacol. Physiol. 2012. V. 25. No. 4. P. 219–226. 312. König K. Clinical multiphoton tomography // J. Biophotonics 2008. V. 1. No. 1. P. 13–23. 313. Sarkar A., Shchukarev A., Leino A.R., Kordas K., Mikkola J.P., Petrov P.O., Tuchina E.S., Popov A.P., Darvin M.E., Meinke M.C., Lademann J., Tuchin V.V. Photocatalytic activity of TiO2 nanoparticles: effect of thermal annealing under various gaseous atmospheres // Nanotechnology. 2012. V. 23. No. 47. P. 475711. 157 314. Eichler J., Kim B.M. Nonlinear scattering in hard tissue studied with ultrashort laser pulses // Z. Med. Phys. 2002. V. 12, No. 3. P. 191–197. 315. Cloitre T., Panayotov I.V., Tassery H., Gergely C., Levallois B., Cuisinier F.J.G. Multiphoton imaging of the dentine-enamel junction // J. Biophotonics 2013. V. 6. No. 4. P. 330–337. 316. Chan S.W., Barille R., Nunzi J.M., Tam K.H., Leung Y.H., Chan W.K., Djurisic A.B. Second harmonic generation in zinc oxide nanorods // Appl. Phys. B Lasers O. 2006. V. 84. No. 1–2. P. 351–355. 317. Bashkatov A.N., Genina E.A., Tuchin V.V. Optical properties of skin, subcutaneous and muscle tissues: a review // J. Innovat. Opt. Health Sci. 2011. V. 4. No. 1. P. 9–38.
