Правила работы в бактериологической лаборатории. Морфология

«ПРАВИЛА РАБОТЫ В БАКТЕРИООГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ.
МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ. СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММЕРСИОННОГО ОБЪЕКТИВА. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ
ОКРАСКИ ПРЕПАРАТОВ »
Актуальность темы: готовить препараты из любого патологического материала
больного или культуры бактерий на предметном стекле, красить и микроскопировать их
для определения морфологии возбудителя с целью ориентировочной диагностики
инфекционного заболевания или осложнения должен уметь каждый врач.
Правила работы в учебной бактериологической лаборатории
на кафедре микробиологии
Работа на кафедре микробиологии и в бактериологической лаборатории требует
строгого соблюдения специальных правил, поскольку исследования проводятся с
использованием живых культур микроорганизмов и заразного материала от больных и
экспериментальных животных.
Соблюдение этих правил необходимо не только для личной безопасности, но и для
безопасности окружающих нас людей.
1 Все студенты должны работать в медицинских халатах, шапочках, резиновых перчатках
и сменной обуви.
2 Каждый студент должен работать только на закрепленном за ним рабочем месте.
3 Запрещается заходить в учебные лаборатории в головных уборах и верхней одежде,
ложить на столы портфели и сумки.
4 В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить,
принимать пищу, хранить продукты питания.
5 На рабочем столе должны находиться только предметы, необходимые для проведения
бактериологических исследований: спиртовка, пастеровские и градуированные пипетки,
пинцеты, бактериологические петли, шпатели, предметные и накрывные стекла,
пробирки, штативы, чашки Петри, микроскоп.
6 Переливать жидкости, содержащие патогенные микроорганизмы категорически
запрещено. При наборе таких жидкостей в пипетки необходимо пользоваться резиновыми
баллонами или грушами.
7 При попадании инфекционного материала на руки, стол, пол и другие поверхности надо
немедленно сообщить об этом преподавателю и в его присутствии провести дезинфекцию
зараженных участков, затем обработать руки дезинфицирующим и тщательно их вымыть
с мылом.
8 Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами,
не допускается их распыление, поэтому нельзя оставлять открытыми чашки Петри,
пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.
9 В учебной лаборатории не разрешаются лишние хождения, резкие движения, ненужные
разговоры. Выполнение этих требований предотвращает проникание посторонних
микроорганизмов из воздуха и ротовой полости в изучаемый материал.
10 После окончания работы протерають иммерсионный объектив микроскопа, столы
дезинфицируют, предметы, материалы, инструменты, инфицированные во время
выполнения практической работы, собирают в биксы для обеззараживания и
дезинфицирую руки.
1
Каплін М.М. Практикум для практичних занять з мікробіології, вірусології, імунології. Розділ
«Морфологія, фізіологія та генетика мікроорганізмів» / М.М. Каплін, В.М. Голубнича, Т.В. Івахнюк. – Видво СумДУ. - 2012. – С.
Правила дезинфекции рабочего места:
• сделайте из ваты шарик диаметром около 2 см;
• возьмите шарик пинцетом, смочите его в дезинфекционном растворе;
• протрите этим шариком поверхность стола;
• опустите шарик в посуду с дезинфицирующим раствором;
• вытрите стол влажной салфеткой.
Правила дезинфекции рук:
• сделайте из ваты 2 шарика диаметром около 2 см;
• возьмите шарик пинцетом, смочите его в дезинфекционном растворе;
• протрите им руки в такой последовательности: левая рука - тыльная сторона, ладонная
сторона, между пальцами, ногтевая пластинка, под ногтями; правая рука - в такой же
последовательности;
• опустите шарик в посуду с дезинфицирующим раствором;
• возьмите пинцетом второй шарик и все повторите;
• вымыйте руки водой с мылом.
Внимание! Помните о том, что студенты несут ответственность за микроскопы, которыми
пользуются, другое лабораторное оборудование, чистоту рабочего места, соблюдение
правил техники безопасности.
Классификация и морфология микроорганизмов.
Основателем научной биологической систематики являются шведский ученый
Карл Линней (1707 - 1778). Сейчас количество открытых микроорганизмов огромная только бактерий известно более 5 тысяч видов, и это число постоянно увеличивается.
Составление известных науке микроорганизмов по степени их родства между собой
занимается отдельная наука - систематика микроорганизмов. Используя принципы
таксономии, все живые существа делятся на группы - таксоны. Включение в
определенного таксона таксоны обусловлены сходством признаков или эволюционным
родством организмов.
Таксоны располагаются по иерархическому принципу - высшие таксоны включают
в себя низшие .
Основными таксономическими категориями микробов являются в нисходящем
порядке:
• Домен (Domain).
• Царство (Kigdom).
• Тип (Phylum).
• Класс (Class).
• Порядок (Order).
• Семья (Family).
• Род (Genus).
• Вид (Species).
Основным таксоном, которым начинается любая систематика, является вид. Вид
микробов - группа близких между собой микроорганизмов, которые имеют общий корень
происхождения и на данном этапе эволюции характеризуются определенными
морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, которые
сформировались в результате отбора, эволюции микроорганизмов2.
В некоторых случаях внутри вида выделяют мелкие единицы - так называемые
инфраподвидовые таксоны, такие как подвид и вид.
1
Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія: підручник для студ. вищ. навч. закл. / За редакцією В.П.
Широбокова / Видання 2-е. Вінниця: Нова книга, 2011. – С. 61 – 63.
Разновидности, в свою очередь, делятся на морфовары - группы, отличающихся внешним
видом, хемовары - за биохимической активностью, биовары - за лизабельностью
определенными фагами, сыровары - за антигенным строением, культывары - за
культуральным свойствам, резистовары - за устойчивостью к внешним воздействиям, в
частности - к действию антибиотиков 2.
Номерологическая таксономия обеспечивает объективные и информационные
подходы
для
классификации
микроорганизмов.
Именно
номерологическая
классификация лежит в основе определителя бактерий, созданного еще в 1923 году
американским микробиологом Д. Берджи2.
Сейчас мир микробов делят на две основные группы: формы, не имеющие
клеточного строения (к ним относят вирусы, вироины и прионы), и имеющие клеточное
строение.
Последние делятся на два больших царства - прокариоты (доядерные клетки) и
эукариоты - клетки, имеющие ядро.
Эукариоты, патогенные для человека, в свою очередь делят на простейшие
(царство Animalia, подцарство Protozoa) и грибы (царство Fungi).
Прокариоты разделяют на архебактерии и эубактерии.
Видовые названия микроорганизмов формируются по принципам введенной в
биологию бинарной номенклатуры. Бинарная номенклатура (от лат. Binarus - двойной) это обозначение видов живых существ двойным названием - по роду и виду.
В микробиологии роды, как правило, называют по фамилии автора (Escherichia,
Salmonella, Shigella) или морфологии микроорганизма (Vibrio, Staphylococcus,
Streptococcus) / Видовое название отражает характер заболевания (Vibrio cholerae,
Salmonella enteritidis), пигментообразование (Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa) , место проживания микроба (Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis) или
фамилия открывателя данного микроба (Shigella sonnei, Borrelia burdorferi).
Таксономические критерии определения вида чрезвычайно важны для
медицинской микробиологии. Практически процесс определения вида и процесс
диагностики инфекционной болезни являются синонимами2.
ПРИМЕРЫ ПОСТРОЕНИЯ БИНОМИНАЛЬНОГО
НАЗВАНИЯ БАКТЕРИЙ
вид бактерий
Bacillus anthracis
Clostridium tetanus
Staphylococcus aureus
Shigella dysenteriae
Esherichia coli
Salmonella typhi
Условные обозначения принадлежности к:
РОДА
ВИДА
Bacillus (палочка)
аnthracis (уголь –
«антрацид»)
Clostridium (веретено)
tetanus (судороги)
Staphylococcus (гроздья
aureus (золотистый цвет
винограда, мешок)
колонии)
Shigella (Шига – автор)
dysenteriae (растройство
кишечника
Esсherichia (Ешерих – автор) coli (кишка)
Salmonella (Сальмон - автор) typhus («туман» - бреденье)
СХЕМА ФОРМИРОВАНИЯ БИНОМИНАЛЬНО НАЗВАНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Фамилия автора
Клинические признаки
Морфология колоний
РОД
ВИД
Место локализации
Морфология бактерий
Географическое место
выявления
Бактерии - это преимущественно одноклеточные организмы, не имеющие четко
сформированного ядра и хлорофилла. Прокариоты отличаются от эукариот по ряду
основных признаков.
1.Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной мембраны).
2.Отсутствие развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.
3.Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.
4.Не способности к эндоцитозу (захват частиц пищи).
5.Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.
6. Значительно меньшие размеры (как правило). Большая часть бактерии имеет
размеры 0,5 - 0,8 микрометров (мкм) х 2 - 3 мкм.
По форме выделяют следующие основные группы микроорганизмов.
1.Шаровидные или коки (с греч. - Зерно).
2.Палочковидные.
3.Извилистые.
4.Нитьевидные.
Коковидные бактерии (кокки), по характеру взаиморасположения после
деления делятся на ряд вариантов.
1.Микрококки. Клетки расположены одиночно. Входят в состав нормальной
микрофлоры, находятся во внешней среде. Заболеваний у людей не вызывают.
2.Диплококки. Деление этих микроорганизмов происходит в одной плоскости,
образуются пары клеток. Среди диплококков много патогенных микроорганизмов гонококки, менингококк, пневмококк.
3.Стрептококки. Деление осуществляется в одной плоскости, после деления клетки
сохраняют связь (не расходятся), образуя цепочки. Много патогенных микроорганизмов возбудители ангин, скарлатины, гнойных воспалительных процессов.
4.Тетракокки. Деление происходит в двух взаимоперпендикулярных плоскостях с
тетрад (то есть по четыре клетки). Медицинского значения не имеют.
5.Сарцины. Деление происходит в трех взаимоперпендикулярных плоскостях,
образуя тюки (пакеты) с 8, 16 и большего числа клеток. Часто обнаруживают в воздухе.
6.Стафилококки (от лат. - гроздь винограда). Делятся беспорядочно в разных
плоскостях, образуя скопления, напоминающие гроздья винограда. Вызывают
многочисленные болезни, прежде всего гнойно-воспалительные.
Палочковидные формы микроорганизмов.
1. Бактерии - палочки, которые не образуют спор.
2. Бациллы - аэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры обычно не
превышает размера ("ширины") клетки (эндоспоры).
3. Клостридии - анаэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры больше
поперечника (диаметра) вегетативной клетки, в связи с чем клетка напоминает веретено
или теннисную ракетку.
Необходимо иметь в виду, что термин «бактерия» часто используют для
обозначения всех микробов-прокариот. В более узком (морфологическом) значении
бактерии - палочковидные формы прокариот, не имеющих спор.
Извитые формы микроорганизмов.
1.Вибрионы и кампилобактерии, имеют один изгиб, могут быть в форме запятой,
короткого завитка.
2.Спириллы, имеют 2 - 3 завитка.
3.Спирохеты, имеют разное число завитков, аксостиль - совокупность фибрилл,
специфический для различных представителей характер движения и особенности
строения (особенно концевых участков). Из большого числа спирохет наибольшее
медицинское значение имеют представители трех родов-Borrelia, Treponema, Leptospira.
Более подробная характеристика морфологии риккетсий, хламидий, микоплазм,
спирохет будет дана в соответствующих темах практических занятий. .
Световая микроскопия
Световая микроскопия относится к наиболее распространенным и доступным
методам наблюдения. Ею чаще всего пользуются при исследовании окрашеных
препаратов.
Как правило, световой поток от источника света при отсутствии препарата образует
в поле зрения микроскопа равномерный фон. Если положить на предметный столик
препарат, то неоднородные составляющие микроскопического объекта, которые
отличаются друг от друга и от окружающей среды с поглощением света и показателем
преломления, образуют рассеянный свет, и формируют изображение. В результате
наложения рассеянного и равномерного света возникает интерференция, в зависимости от
соотношения фаз и амплитуд световых колебаний определяет контраст освитлености на
картинке.
Объекты, с которыми работает микробиолог, при изучении под световым
микроскопом могут иметь разный характер: прозрачные и непрозрачные, амплитудные,
фазовые, изотропные и анизотропные. Для разных объектов, отличающихся способностью
рассеивать свет, применяют различные методы микроскопического исследования, но при
применении любого из методов, как правило, учитывают две позиции: возможность
данного способа и его доступность.
Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножив увеличение
объектива на увеличение окуляра. Вместе с тем, увеличение не определяет качества
изображения. Качество изображения, его разрешение определяется разрешением
микроскопа, т.е. возможностью различать отдельно две близко расположенные точки.
В современных оптических микроскопах разрешение объективов составляет 0,0002
мм, или 0,2 мкм. При применении сильных объективов (х90) с фокусным расстоянием 31,5 мм необходимо создать однородную оптическую среду между фронтальной линзой
объектива и препаратом. Это достигается погружением объектива в каплю кедрового
масла, которую наносят на препарат. Кедровое масло имеет показатель преломления (п =
1,51), близкий к преломлению стекла (1,52). Поэтому световой пучок, который проходит
через масло, не рассеивается и не меняет своего направления, а попадает в объектив,
обеспечивая хорошее освещение поля зрения. При отсутствии кедрового масла лучи на
границе стекло-воздух рассеиваются и освещение будет недостаточным.
Вместо кедрового масла можно использовать персиковое масло (п = 1,49), смесь из
равных объемов касторового (п = 1,47) и окропного (п = 1,49) масел, а также "имерсиол", в
состав которого входят персиковое масло (50 г), канифоль (10г), нафталин (10г), салол
(1г).
Фронтальная
линза
иммерсионного
объектива
иммерсионное
масло,
n=1,515
Воздух n=1
предметное стекло,
n=1,52
Рис. Ход лучей в иммерсионной системе
Работа с микроскопом состоит из двух основных этапов:
1) правильной установки освещенности поля зрения и препарата
2) микроскопии препарата разными объективами.
Окрашенные препараты бактерий микроскопируют только с использованием
иммерсионного объектива (х90).
Правила работы с иммерсионной системой
1 Поднять конденсор Аббе до уровня предметного столика, полностью открыть ирисдиафрагму.
2 Пользуясь объективом х8 и глядя в окуляр, не вынимая его, с помощью плоского
зеркала, достичь максимального освещения поля зрения.
3 На предметном столике разместить окрашенный препарат стрептококков, нанести на
него кедровое масло и закрепить клеммами.
4 Поворачивая револьвер, установить над препаратом иммерсионный объектив х90, под
контролем зрения погрузить его в каплю иммерсионного (кедрового) масла.
5 Глядя в окуляр любым глазом (не закрывая другой), сначала макрогвинтом найти
контуры изображения, а затем микровинтом достичь максимальной четкости, изучить и
зарисовать препарат.
6 После окончания работы поднять тубус, снять предметное стекло, осторожно вытереть
салфеткой иммерсионный объектив от кедрового масла, повернуть его в сторону,
опустить тубус.
Возможные ошибки при работе с микроскопом
1. Неправильный выбор зеркальца.
2. Неправильная установка конденсора и ирис-диафрагмы, что приводит к недостаточной
освещенности объекта.
3. Неправильный выбор объектива для работы.
4. Неправильная установка револьвера и прочее.