Положительная динамика основных субпопуляций лимфоидных

— Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №10, c.17-23.
Положительная динамика основных субпопуляций
лимфоидных клеток крови при лечении больных
ВИЧ-инфекцией иммуномодулятором «Гепон»
Холмс Р.Д., Катлинский А.В., Пичугин А.В., Папуашвили М.Н., Атауллаханов Р.И.
ГНЦ РФ Институт иммунологии МЗ РФ, Immutic Group, OOO Иммафарма, Московская
медицинская академия им. Сеченова
Новые методы лечения ВИЧ-инфекции необходимы, чтобы эффективно решать глобальную проблему
ВИЧ/СПИД. Тридцать три миллиона человек на Земле инфицированы ВИЧ, 22 млн. - уже погибли от ВИЧинфекции, каждый день происходит заражение новых 15 тысяч человек [6,7]. В настоящее время лучшим лечением
ВИЧ-инфекции является активная противовирусная химиотерапия (highly active antiretrovirai therapy, HAART),
при которой используется комбинация 3 или 4 противовирусных препаратов, но и она все еще мало эффективна.
Применение различных вариантов НА ART подавляет репликацию ВИЧ только у половины пациентов. Даже у
тех, у кого HAART ингибирует размножение вируса, полного излечения не происходит. Наконец, HAART
вызывает значительные побочные эффекты. Анализ результатов 23 клинических исследований с участием 3275
пациентов [3] показал, что даже после 48-недельного применения различных вариантов HAART уровень вируса в
периферической крови остается достоверным (более 400 копий РНК ВИЧ в 1 мл плазмы), а количество CD4+Тклеток повышается в среднем на 160 клеток в 1 мкл по отношению к исходному среднему уровню 375 клеток в 1
мкл.
В поисках препаратов, дополняющих HAART, все чаще обращается внимание на иммуномодуляторы,
способные повысить иммунную защиту от оппортунистических инфекций, а также способствующие
восстановлению показателей иммунного статуса, нарушенных ВИЧ-инфекцией. Ранее нами сообщалось, что
применение иммуномодулятора «Гепон» у ВИЧ-инфицированных позволяет повысить эффективность иммунного
контроля оппортунистических инфекций [1], а также усиливает продукцию антител к антигенам ВИЧ [2]. В
данной работе показано, что продолжительное применение Гепона приводит к улучшению показателей иммунного
статуса у взрослых пациентов, инфицированных ВИЧ.
Материалы и методы
Всего в исследовании участвовали 18 ВИЧ-инфицированных пациентов. Препарат Гепон принимали
однократно, ежедневно по 10 мг per os в виде водного раствора. Первая группа из 9 (6 мужчин и 3 женщин)
пациентов принимала препарат в течение 4 недель. Возраст варьировал от 25 до 51 (средний возраст 35 лет).
Давность установления диагноза «ВИЧ-инфекция» составляла от 1 до 10 лет, в среднем 3 года. Вторая группа из 9
(5 мужчин и 4 женщин) пациентов принимала препарат в течение 12 недель. Возраст участников второй группы
варьировал от 16 до 45 (средний возраст 33 года). Давность установления диагноза «ВИЧ-инфекция» составляла от
2 до 10 лет, в среднем 5 лет.
Кровь для иммунологических исследований пациенты сдавали еженедельно в течение месяца до начала
терапии, во время всего курса терапии и в течение 1 месяца после окончания курса. Кровь из локтевой вены
получали утром натощак в вакуумные пробирки системы "Vacutaner" фирмы "Becton Dickinson" с
антикоагулянтом K3EDTA. Количественное определение основных популяций лимфоцитов проводили с помощью
трехцветных наборов моноклональных антител CD3/CD4/CD45, CD3/CD8/CD45, CD3/CD19/CD45,
CD3/CD16/56/CD45 (Becton Dickinson) и специальных пробирок с калиброванным содержанием микрошариков
(TruCOUNT tubes, Becton Dickinson) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. 100 мкл цельной крови
помещали в пробирку с калибровочными шариками, тщательно встряхивали и добавляли 10 мкл соответствующих
антител. Кровь с антителами инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, добавляли в
каждую пробирку по 1 мл лизирующего-фиксирующего раствора и выдерживали в течение 15 минут при
комнатной температуре. Анализ образцов осуществляли на проточном цитофлуориметре FASC Calibur (Becton
Dickinson) с использованием программного обеспечения CellQuest. Перед началом измерений прибор калибровали с
помощью калибровочных микрошариков.
На рисунке 1 представлен типичный пример анализа образца с антителами TriTEST CD3/CD4/CD45.
Все лимфоциты идентифицировали по наличию CD45 и соответствующего показателя рассеяния света (SSC) - зона
1 на рисунке 1А. Затем T-хелперы определяли как лимфоциты, несущие одновременно CD3 и CD4 молекулы (зона
3 на рис.1Б). Абсолютное число CD4+ клеток получали после нормировки на концентрацию калибровочных
шариков (зона 2 на рис. 1A). Аналогичным образом определяли другие субпопуляции лимфоцитов: CD8+Т-клетки по наличию CD3 и CD8, B-клетки - по отсутствию CD3 и наличию CD19, NK-клетки - по отсутствию CD3 и
наличию CD 16 и CD56.
Рис. 1. Подсчет абсолютного содержания CD4+Тлимфоцитов у ВИЧ-инфицированного пациента с помощью
реагента TriTEST CD3/CD4/CD45 и пробирок с
микросферами TruCOUNT фирмы "Becton Dickinson ".
Лимфоциты (А, зона 1) определяют по параметрам
рассеяния (SSC-H ось ординат) и окраски антителами
к CD45 (ось абсцисс). Среди лимфоцитов выделяют
клетки, позитивные по CD3 и CD4 (Б, зона 3).
Абсолютное количество CD45+CD3+CD4+ лимфоцитов
подсчитывают после нормировки на известную
концентрацию калибровочных микросфер (В, зона 2).
Результаты и обсуждение
Повышение точности измерений абсолютного числа
клеток в субпопуляциях
При мониторинге количества лимфоцитов в основных
субпопуляциях у пациентов, инфицированных ВИЧ,
необходима высокая точность измерения. Для ВИЧинфекции характерно снижение содержания CD4+Tлимфоцитов. Мониторинг этого показателя является одним
из ведущих критериев эффективности терапии ВИЧинфекции, наряду с исследованием вирусной нагрузки и
контроля оппортунистических инфекций. По результатам
23 клинических испытаний установлено, что даже при
наиболее эффективной противовирусной терапии среднее
увеличение количества CD4+Т-клеток не превышало 43%
от исходного количества клеток [3].
В связи с относительно небольшим эффектом
современной терапии на содержание CD4+Т-клеток при
ВИЧ-инфекции возникла актуальная задача повышения
точности измерения. При обычном способе определения
содержания субпопуляций лимфоцитов периферической
крови подсчитывают количество лейкоцитов с помощью
автоматического счетчика клеток (ошибка до 10%),
определяют процентное содержание лимфоцитов по мазку
крови под микроскопом (ошибка около 20%) и, наконец,
определяют
процентное
содержание
исследуемой
субпопуляции с помощью моноклональных антител и
проточного цитометра (ошибка около 5% при правильной
настройке прибора и использовании надежных реагентов).
Таким образом, абсолютное содержание искомой
популяции
получают,
как
произведение
трех
вышеперечисленных величин. Ясно, что ошибка такого
подсчета не позволяет с достаточной надежностью
оценивать небольшие эффекты, ожидаемые при
проведении современной терапии ВИЧ-инфекции.
В данной работе мы использовали методику фирмы Becton Dickinson, специально разработанную для более
точного подсчета абсолютного количества лимфоцитов в субпопуляциях. Для этого исследуемый образец крови
помещают в специальные пробирки с калибровочными микросферами. Точность такой методики составляет
около 5%. Данный протокол рекомендован в настоящее время Центром по контролю заболеваемости (CDC) для
оценки иммунного статуса лиц, инфицированных ВИЧ [4].
Применение указанного метода в наших исследованиях позволило измерять абсолютное количество CD4+Тлимфоцитов, CD8+Т-лимфоцитов, В-клеток и NK-клеток с ошибкой не более 5%, что вполне соответствовало
данным работы [5].
Количество CD4+Т-клеток
В таблицах I и 2 представлены данные о процентном содержании и абсолютном количестве лимфоцитов
основных субпопуляций у ВИЧ-инфицированных пациентов до начала терапии Гепоном. Очевидно, что у
пациентов обеих групп имело место значительное истощение популяции CD4+Т-клеток. Относительное
содержание CD4+Т-клеток составляло 24% в первой и 13% во второй группе, средние значения абсолютного
количества клеток данного типа в группах составляли 389 и 250 клеток на 1 мкл, соответственно.
Таблица 1. Относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ инфицированных
пациентов до начала терапии Гепоном
Таблица 2. Абсолютное содержание основных субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных
пациентов до начала терапии Гепоном
Интересно отметить, что количество CD4+Т-клеток не всегда отражало тяжесть клинических проявлений ВИЧинфекции. Так, например, в крови пациента №9 детектировалось всего 19 CD4+Т-клеток в 1 мкл, однако,
клинический статус пациента был вполне удовлетворительным в течение продолжительного времени наблюдения
(не менее полугода). Это означает, что в отсутствии CD4+Т-клеток другие звенья (механизмы) иммунной системы
вполне успешно справляются с задачами иммунной защиты.
Курсовое лечение Гепоном способствовало постепенному увеличению содержания CD4+Т-клеток в крови
ВИЧ-инфицированных пациентов. Так, у 8 (45%) из 18 исследованных в процессе или после лечения Гепоном
произошло увеличение количества CD4+Т-клеток (табл. 3, рис. 2А). В процессе и после 4-недельного лечения
Гепоном явно проявлялась тенденция к нарастанию содержания CD4+Т-клеток, но прирост был небольшим и
статистически недостоверным. Напротив, в группе пациентов, получавших Гепон в течение 12 недель, среднее
значение содержания CD4+Т-клеток достоверно возросло в процессе лечения до 113% от исходного уровня
(р=0,039). По-видимому, для заметного восстановления истощенной субпопуляции Т-клеток необходимо время
порядка 3 или более месяцев.
Таблица 3. Относительные изменения основных субпопуляций лимфоцитов у ВИЧинфицированных пациентов при терапии Гепоном.
Примечание.
1. Данные для каждого пациента выражены в процентах от значений до начала лечения.
2. Приведены средние значения и стандартные отклонения по группе.
3. Значком (*) отмечены достоверные отличия с p<0,05
Количество CD8+ Т-клеток
Для хронических вирусных инфекций и, в частности, для ВИЧ-инфекции характерно увеличение содержания
CD8+Т-клеток. Оно связано с повышенной потребностью организма в цитолитических CD8+Т-клетках, несущих
основную нагрузку в защите от вирусной инфекции.
У всех исследованных нами ВИЧ-инфицированных пациентов было значительно повышено содержание
CD8+Т-лимфоцитов. В первой группе средние значения составили 53% или 782 клетки на 1 мкл, во второй группе 57% или 1171 клетку на 1 мкл (табл. 1 и 2). После 4-недельного лечения Гепоном явно наметилась тенденция к
снижению содержания CD8+Т-клеток, но более отчетливо она проявилась в процессе и после 12-недельного курса
лечения Гепоном. Так, после окончания 12-недельного курса лечения Гепоном содержание CD8+Т-клеток
уменьшилось до 80% (р=0,002) от исходного количества этих клеток до лечения (табл. 3, рис. 2Б).
Полученные данные об уменьшении патологически повышенного количества CD8+Т-клеток в результате
курсового лечения Гепоном свидетельствует об уменьшении потребности в цитолитических CD8+Т-клетках, что
может косвенно отражать уменьшение вирусной нагрузки в процессе лечения Гепоном.
Рис.
2.
Относительные
изменения
содержания CD4+Т-клеток(А), CD8+Т-клеток (Б)
и иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 (В) у
ВИЧ-инфицированных пациентов при терапии
Гепоном.
Данные
каждого
пациента
нормированы на значения до начала терапии.
Приведены средние значения (точки), ошибка
среднего (прямоугольники) и стандартное
отклонение (линии).
Обозначения по оси абсцисс:
I - первая группа пациентов (4недели
терапии Гепоном),
II - вторая группа пациентов(12 недель
терапии Гепоном);
0 - до начала терапии, 1- во время
терапии, 2 - через 1 месяц после окончания
лечения Гепоном.
Иммунорегуляторный коэффициент
У больных ВИЧ-инфекцией вследствие
истощения
популяции
CD4+Т-клеток
и
увеличения
содержания
CD8+Т-клеток
значительно
снижен
иммунорегуляторный
коэффициент (отношение CD4/CD8). Среднее
значение иммунорегуляторного коэффициента в
исследованных нами группах больных составило
0,49 в первой группе и 0,24 - во второй, что было
значительно
ниже допустимых значений
здоровой нормы (от 1 до 2). В процессе лечения
Гепоном и после его окончания происходило
достоверное повышение иммунорегуляторного
коэффициента (табл. 3, рис. 2В). Наиболее
значительный рост наблюдался у больных,
получавших Гепон в течение 12 недель, значение
иммунорегуляторного
коэффициента
у
пациентов второй группы выросло до 126% от
исходных
значений
(р=0,003).
Это
свидетельствовало о существенном улучшении
одного из самых важных показателей иммунного
статуса в результате лечения Гепоном.
NK-клетки и B-клетки
У большинства исследованных в данной работе пациентов абсолютное количество NK- и В-клеток до
лечения было близким к значениям здоровой нормы. В процессе и после лечения Гепоном количество NK- и Вклеток не претерпевало достоверных изменений.
В целом, по результатам проведенного исследования можно заключить, что применение Гепона в течение 4-12
недель приводит к положительным изменениям показателей иммунограммы у больных ВИЧ-инфекцией. Среди
наиболее значимых следует отметить: умеренное нарастание количества CD4+Т-клеток, значительное снижение
числа CD8+Т-клеток, значительное нарастание иммунорегуляторного коэффициента. Эти положительные
изменения иммунограммы проявляются не сразу, а через 1 месяц после окончания 4-12-недельного курса
терапии Гепоном. Вероятно, в процессе и после терапии Гепоном в состоянии иммунной системы пациентов
наступают позитивные изменения, которые и приводят к положительной динамике популяций лимфоидных клеток
в отдаленный период.
Список литературы
1. Р.И.Атауллаханов, Р.Д.Холмс, А.В.Катлинский, А.В.Пичугин, М.Н.Папуашвили, Н.М.Шишкова.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Повышение эффективности иммунного контроля оппортунистических инфекций при лечении
больных ВИЧ-инфекцией иммуномодулятором «Гепон». // Иммунология, - 2002.
Р.Д.Холмс, Р.И.Атауллаханов, А.В.Катлинский, М.Н.Папуашвили, А.В.Пичугин. Активация
образования
антител
к
антигенам
ВИЧ
при
лечении
больных
ВИЧ-инфекцией
иммуномодулятором«Гепон». // Иммунология. - 2002.
Bartlett J.A., R. DeMasi, J.Quinn, CMoxharn, F.Rousseau. Overview of the effectiveness of
triplecombination therapy in antiretroviral-naive HIV-1 infected adults. //AIDS. -2001. - V. 15. - P . 13691377.
Nicholson J., P.Kidd, F.Mandy, D.Livnat, J.Kagan. Three-color supplement to the NIAID DAIDS
guidelinefor flow cytometric immunophenotyping. //Cytometry. - 1996. - V. 26. - P. 227-230.
Schnizlein-Bick C.T., J.Spritzler, C.L.Wilkening, J.K.Nicholson, M.R.O'Gorman. - Evaluation of
TruCountabsolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency
virus-positiveadults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation. // Clin.
Diagn. Lab. Immunol. - 2000, May. - V. 7. - № 3. - P. 336-343.
Schwartlander B. et al. Resource Needs for HIV/AIDS. // Science. - 2001. - V. 292. - P. 2434.
Schwartlander В., G.Garnett, N.Walker, R.Anderson. AIDS in a New Millennium. // Science, - 2000. V. 289. - P. 64-67.