М

На правах рукописи
МИЛЛЕР АННА ВИКТОРОВНА
МЕХАНИЗМЫ ПРАЙМИРОВАНИЯ
РЕСПИРАТОРНОГО ВЗРЫВА НЕЙТРОФИЛОВ
03.00.02 - Биофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пущино – 2004
1
Работа выполнена в Пущинском государственном университете на базе
Института биофизики клетки РАН.
Научный руководитель: кандидат биологических наук В.Г. Сафронова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
профессор В.П. Зинченко
кандидат биологических наук
Т.В. Сирота
Ведущая организация:
Институт биологии развития
им. Н.К. Кольцова РАН
Защита состоится «__»_______________2004г. в ___часов на
заседании диссертационного совета Д 002.38.01 при Институте
биофизики клетки РАН
по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино
Автореферат разослан «__»_____________2004 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
2
Т.И. Смолихина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
проблемы.
Полиморфноядерные
нейтрофильные
гранулоциты (нейтрофилы) участвуют во врожденном иммунном ответе и
обеспечивают первую линию защиты организма от вторгшихся бактерий.
Миграция нейтрофилов в очаг острого воспаления происходит в градиенте
хемотаксических факторов, одним из которых является N-формил-Мет-Лей-Фен
(ФМЛФ). Связывание хемотаксического пептида ФМЛФ со своим рецептором,
сопряженным с гетеротримерным G-белком, запускает каскад внутриклеточных
процессов c последующим развитием респираторного взрыва. Респираторный,
или дыхательный, взрыв нейтрофилов представляет собой массированный
выброс активных форм кислорода при усиленном потреблении кислорода и
глюкозы. За его развитие ответственен мембранный фермент NADPH оксидаза,
осуществляющий перенос электронов от внутриклеточного NADPH на молекулу
экзогенного кислорода [McPhail et al., 1984]. Активация фермента вызывает
уменьшение концентрации NADPH в клетке, что активирует окисление глюкозы
через гексозо-монофосфатный шунт (ГМШ) - основной поставщик NADPH в
нейтрофилах [Nessel et al., 1998]. При этом может утилизироваться глюкоза из
внеклеточной среды и/или глюкоза, запасенная в клетке [Tan et al., 1998].
Известно, что передача сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу идет по
фосфоинозитидному пути с участием фосфолипазы C (ФЛС), инозитол-1,4,5трисфосфата, Са2+ и протеинкиназы С [по Thelen et al., 1993]. Кроме того, было
показано участие каскада митоген-активируемых протеинкиназ (МАРКs) [Rane et
al., 1997] и фосфотидилинозитол-3-киназы (ФИ3К) [Ward et al., 2000].
Многими авторами разрабатывается концепция активации нейтрофилов
как двухступенчатого процесса [Thelen et al., 1993; Doerfler et al., 1994; Coffer et
al., 1998]. Сначала нейтрофилы взаимодействуют с агентами, которые не
активируют клетку, а переводят ее в состояние готовности к ответу [Hallett &
Lloyds, 1997]. Затем уже подготовленный нейтрофил получает соответствующий
стимул, что приводит его к полностью активированному состоянию. Процесс,
при
котором
предварительная
обработка
клетки
агентом
приводит
к
последующему усилению ответа на активацию, называют праймированием (от
англ. “priming” - подготовка). В настоящее время интенсивно изучается
праймирование
функций
нейтрофилов
цитокинами,
хемотаксическими
факторами, метаболическими регуляторами, действующими через рецепторы,
3
принадлежащие к разным семействам [Kurt-Jones et al., 2002; Seely et al., 2003;
Dewas et al., 2003]. Сами праймирующие агенты не вызывают изменений
функций
нейтрофилов,
в
том
числе
респираторного
взрыва,
но
их
предварительное воздействие приводит к усилению ответа на активацию. В
зависимости от рецептора, через который действует праймирующий агент, могут
реализоваться разные механизмы праймирования нейтрофилов: изменения в
уровне экспрессии адгезивных молекул на поверхности клетки; освобождение
содержимого гранул; полимеризация актина; фосфорилирование; синтез белка de
novo; модуляция [Ca2+]цит; активация фосфолипаз; образование биоактивных
липидов [Swain et al., 2002]. Показано, что при праймировании активность
протеинкиназ, в том числе MAPKs и тирозиновых киназ, может увеличиваться в
несколько раз [McLeish et al., 1998].
Одним
из
механизмов
фосфорилирования
белков
по
фосфорилирования
осуществляется
праймирования
остаткам
тирозина.
через
является
Запуск
рецепторы,
усиление
тирозинового
обладающие
своей
собственной тирозинкиназной активностью, к ним относят рецептор инсулина.
Изменения в регуляции инсулином активности нейтрофилов видны, в основном,
по многочисленным нарушениям, возникающим при диабете и развивающимся,
скорее, вследствие отсутствия действия инсулина, чем из-за его влияния
[Ortmeyer & Mohsenin, 1996]. Данные о праймирующем действии инсулина на
респираторный взрыв нейтрофилов отсутствуют.
Известно,
что
праймирование
нейтрофилов
бактериальным
липополисахаридом (ЛПС), основным рецептором которого на нейтрофилах
считается CD14, гликозилфосфатидилинозитол-связанный гликопротеин [Wright
et al., 1990; Ulevitch & Tobias, 1995], сопровождается усилением респираторного
взрыва [Guthrie et al., 1984]. Однако последовательность внутриклеточных
событий после связывания ЛПС нейтрофилами неизвестна, как и характер
взаимодействия сигнальных систем рецепторов ЛПС и формилированных
пептидов в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов.
Изучение
праймирование,
внутриклеточных
сигнальных
систем,
поможет
механизмы,
которыми
понять
вовлеченных
в
регулируются
специфические функции нейтрофилов, и развить терапевтические стратегии
против чрезмерной цитотоксичности нейтрофилов.
Цели и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в
исследовании механизмов праймирующего действия инсулина и ЛПС и участия
глюкозы в респираторном взрыве нейтрофилов.
4
Были поставлены следующие задачи:
- исследовать вклад компонентов каскада митоген-активируемых
протеинкиназ, фосфолипаз и фосфатидилинозитол-3-киназы в механизмы
праймирования респираторного взрыва нейтрофилов инсулином;
- исследовать вклад компонентов каскада митоген-активируемых
протеинкиназ и фосфолипаз в механизмы праймирования респираторного
взрыва нейтрофилов липополисахаридом;
-
сравнить
активируемых
вклад
протеинкиназ
исследуемых
и
сигнальных
фосфолипаз
в
систем
действие
митоген-
инсулина
и
липополисахарида на респираторный взрыв, вызванный ФМЛФ в низких и
высоких концентрациях;
- оценить роль метаболизма глюкозы в усиление респираторного взрыва
при праймировании агентами разной природы (иономицина, инсулина и ЛПС).
5