Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ФГБУ ИБХ РАН) ________________________________________________________________ На правах рукописи Бойко Анна Александровна ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРОДУКЦИЕЙ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ СТАРЕНИИ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Коваленко Елена Ивановна Москва, 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений……………………………………………………………..5 Введение…………………………………………………………………………..8 I. Обзор литературы……………………………………………………………10 1.1. Нейтрофилы, их характеристика…………………………………………...10 1.1.1. Нейтрофильные гранулы……………………………………………11 1.1.2. Поверхностные маркеры нейтрофилов…………………………….14 1.2. Функции нейтрофилов и их роль в системе иммунитета………………...17 1.2.1. Фагоцитоз…………………………………………………………….17 1.2.2. Дегрануляция………………………………………………………...20 1.2.3. Нейтрофильные внеклеточные ловушки…………………………..22 1.2.4. Активные формы кислорода в нейтрофилах………………............22 1.2.4.1. Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах.............23 1.2.5. Роль нейтрофилов в патологических процессах…………………..26 1.3. Регуляция активности нейтрофилов……………………………………….28 1.4. Белки теплового шока………………………………………………………30 1.4.1. Семейство белков теплового шока 70 кДа. ……………………......32 1.4.2. Внутриклеточные функции HSP70…………………………………35 1.4.3. Внеклеточные функции HSP70…………………………………......40 1.4.4. HSP70 в нейтрофилах………………………………………………..46 1.5. HSP70 и окислительный стресс…………………………………………….47 1.6. Механизмы секреции HSP70…………………………………………….....48 1.7. Причины и иммунологические аспекты процесса старения …………….52 1.7.1. Основные теории развития старения……………………………….52 1.7.2. Ассоциированные с возрастом изменения в нейтрофилах…….....53 1.7.3. HSP70 при старении…………………………………………………54 II. Материалы и методы……………………………………………………….56 2.1. Реагенты……………………………………………………………………..56 2 2.2. Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов…………………………………………………………………………..57 2.3. Проточная цитофлуориметрия……………………………………………..59 2.3.1. Оценка жизнеспособности нейтрофилов…………………………..59 2.3.2. Цитометрический анализ внутриклеточного уровня HSP70……...60 2.3.3. Цитометрический анализ поверхностной экспрессии HSP70 и маркеров дегрануляции………………………………………………………….60 2.3.4. Цитометрическое измерение внутриклеточной продукции АФК………………………………………………………….....61 2.4. Анализ внутриклеточного содержания HSP70 методом Вестернблоттинга…………………………………………………………………………61 2.5. Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции…………………………………………………………….62 2.6. Статистический анализ данных……………………………………………63 2.7. Измерение транскрипционной активности генов HSP70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR)…...63 2.7.1. Проведение qRT-PCR………………………………………………..64 2.7.2. Статистическая обработка данных qRT-PCR……………………...65 2.8. Оценка внеклеточного уровня HSP70 с помощью ИФА…………………65 III. Результаты……………………………………………………………….....67 3.1. Внутриклеточное содержание HSP70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах……………………………………………………………...67 3.2. Динамика изменения уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………………………..68 3.2.1. Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………68 3.2.2. Анализ динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………71 3.3. Анализ экспрессии HSP70 в мононуклеарных клетках человека………..73 3 3.4. Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока………………………………….75 3.5. Воздействие гипертермии на уровень HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах…...........................................................................................81 3.6. Высвобождение HSP70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство……………………………………………………………………..82 3.7. Анализ механизмов, регулирующих высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов…………………………………..84 3.8. Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах…………………………………………………………………………...89 3.9. Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержанием HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах…………………………………...92 IV. Обсуждение……………………………………………………………….....95 Выводы…………………………………………………………………………105 Список литературы…………………………………………………………...106 4 Список сокращений АДФ – нуклеотид аденозиндифосфат АПК – антиген-презентирующие клетки АТФ – нуклеотид аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода АФКDCF спонт – спонтанный внутриклеточный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах, измеренный с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA АФКЛЗХ спонт – спонтанный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах, измеренный с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции АФКЛЗХ инд – индуцированная опсонизированным зимозаном продукция АФК в нейтрофилах, измеренная с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции ЛЗХ – люминол-зависимая хемилюминесценция СОД – фермент супероксид дисмутаза ТШ – тепловой шок ЭПР – эндоплазматический ретикулум BiP (Binding immunoglobulin Protein) – белок, связывающий иммуноглобулины BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) – катионный белок, обладающий бактерицидной и LPS-связывающей активностью CR1 (CD35) – рецептор к фрагменту системы комплемента 1 CXCL8 (IL-8) – интерлейкин 8 DCFH-DA (2'-7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate) – проницаемый флуоресцентный зонд, уровень флуоресценции которого пропорционально зависит от концентрации H2O2 FcγRIIA (CD32) – Fc-рецептор для иммуноглобулинов fMLP (formyl-1-methionyl-1-leucyl-1-phenylalanine) – хемоаттрактант G-CSF – гранулоцитарный колонестимулирующий фактор 5 GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор GPCR – суперсемейство трансмембранных гликопротеиновых «серпентиновых» рецепторов, связанных с внутриклеточными GTPсвязанными белками Hsc70 – конститутивный белок HSP70 HSF (heat shock factor) – транскрипционный фактор, инцициирующий транскрипцию генов HSP HSP – белки теплового шока Hsp70 – индуцируемый белок HSP70 HSP70 – семейство белков теплового шока 70 кДа HSP70базальный – содержание HSP70 в интактных нейтрофилах HSP70ТШ – уровень HSP70, зарегистрированный сразу после окончания ТШ ΔHSP70ТШ – параметр, который рассчитывается в виде разницы между HSP70ТШ и HSP70базальный IFNγ – гамма-интерферон ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) – цитоплазматическая сигнальная последовательность ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs) – последовательность, деактивирующая тирозиновые рецепторы LFA-1 (CD11a/CD18) – высокоафинный рецептор адгезии LPS – липополисахарид LTВ4 – лейкотриен B4 Mac-1/ СR3 (CD11b/CD18) – рецептор адгезии MAP – митоген-активированная протеинкиназа mTOR (mammalian target of rapamycin) – сигнальный путь, ингибируемый рапамицином NET – нейтрофильные внеклеточные ловушки O2* – супероксид анион-радикал OH* – гидроксил радикал 6 PAF (platelet activating factor) - хемоаттрактант PI3К – фосфатидилинозитол-3-киназа PMA (phorbol meristat acetate) – активатор протинкиназы С SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-fusion-protein attachment protein receptor) – семейство белков, обеспечивающих в слиянии мембран гранул и везикул с плазматической мембраной во время фагоцитоза и экзоцитоза TLR (Toll-like receptors) – рецепторы врожденного иммунитета TNFα/βR – рецептор фактора некроза опухоли 7 В настоящее Введение старение рассматривается время как сложный биологический процесс, который протекает на фоне разнообразных молекулярных и функциональных изменений в организме. Самая известная из теорий, объясняющих причины старения, утверждает, что чрезмерное образование свободных радикалов, особенно активных форм кислорода (АФК), совместно с нарушением защитной системы клеток от клеточного стресса, способствует старению организма [Harman D., 1956]. С одной стороны АФК осуществляют элиминацию патогена и клиренс поврежденных тканей, а с другой стороны, интенсивная продукция АФК усугубляет воспалительные реакции, оказывая повреждающее влияние не только на мишени, но и на собственные ткани организма. Один из механизмов, обеспечивающих защиту клеток от неблагоприятных последствий действия АФК, связан с участием высоко консервативных белков теплового шока семейства 70 кДа (HSP70). Белки HSP70 обладают широким спектром шаперонных функций и способствуют нормальному протеканию многих внутриклеточных процессов. Они обеспечивают устойчивость клеток к стрессу, участвуя в процессах дезагрегации, репарации и элиминации поврежденных в условиях стресса белков. Нарушение HSP70-опосредованных механизмов, связанных с поддержанием белкового гомеостаза, может быть одним из факторов, ускоряющих старение. Нейтрофилы, клетки врожденной иммунной системы, представляют основной источник как внутриклеточных, так и внеклеточных АФК в организме и могут играть значительную роль в процессе старения. Известно, что нейтрофилы прямо или косвенно участвуют в патогенезе многих заболеваний, связанных с возрастом. В нейтрофилах, несмотря на их низкую биосинтетическую активность, как и во всех эукариотических клетках, экспрессируются белки HSP70. В то же время, работ, в которых бы изучались особенности экспрессии и роль HSP70 в функционировании нейтрофилов, 8 мало. Нет информации о возрастных изменениях, связанных с уровнем внутриклеточных HSP70 в нейтрофилах. До сих пор не ясно, участвуют ли HSP70 в регуляции процессов продукции АФК нейтрофилами. Таким образом, актуальным является изучение в рамках одной работы вопросов, связанных с возрастными изменениями экспрессии HSP70 и генерации АФК в популяции нейтрофилов, а также анализ взаимосвязи внутриклеточного уровня HSP70 с продукцией АФК. Немаловажным также представляется оценка способности нейтрофилов продуцировать внеклеточные формы HSP70, играющие важную иммунорегуляторную роль [Calderwood et al., 2005; Pockley, 2002]. Изучение этих вопросов может способствовать более глубокому пониманию процесса старения, а также позволить сформулировать стратегию коррекции патологических состояний, ассоциированных с возрастом, в которых нейтрофилы играют важную роль. Цель исследования – изучение возрастных особенностей внутриклеточного уровня HSP70 и динамики стресс-индуцированных изменений содержания HSP70, а также анализ взаимосвязи этих изменений с продукцией АФК в нейтрофилах человека. Исходя из цели исследования поставлены следующие задачи: Проанализировать содержание HSP70 в нейтрофилах человека в трех возрастных группах: молодые, пожилые и долгожители. Исследовать динамику изменения внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в ответ на тепловой шок и выявить факторы, влияющие на эту динамику. Сравнить динамику изменения внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах в ответ на тепловой шок в разных возрастных группах. Оценить спонтанную и индуцированную продукцию активных форм кислорода в нейтрофилах в разных возрастных группах. Изучить взаимосвязь содержания HSP70 и продукции АФК, а также ее возрастные особенности. 9 I. Обзор литературы 1.1. Нейтрофилы, их характеристика Полиморфноядерные (сегментоядерные) гранулоциты, или нейтрофилы, составляют преобладающую популяцию лейкоцитов в крови млекопитащих и реализуют первую линию защиты в системе врожденного иммунитета, обеспечивая ответ организма на бактериальные и грибковые инфекции. Нейтрофилы образуются в костном мозге из стволовых мультипотентных гемопоэтических клеток в миелопоэзе. Последовательные этапы дифференцировки миелоидных предшественников нейтрофилов (миелобласт, промиелоцит и миелоцит) завершаются фазой созревания нейтрофилов в метамиелоцит, палочкоядерную и зрелую сегментоядерную формы, которые характеризуются ультраструктурными изменениями ядра и гранул. После цикла дифференцировки, который составляет в зависимости от степени активности процесса от 7 до 10 дней, около 10% созревших нейтрофилов попадают из костного мозга в кровоток, большая часть зрелых нейтрофилов депонируется в синусах костного мозга. Пополнение зрелых клеток в кровяном русле ежедневно составляет порядка 1011 клеток, а концентрация нейтрофилов в крови варьирует в диапазоне 3-5×106/мл. Доля циркулирующих в крови зрелых сегментоядерных нейтрофилов составляет от 45% до 75% от общего количества лейкоцитов человека. Эти клетки также представлены в виде регионального пула, выстилающего внутреннюю поверхность капилляров в ткани легких, печени и селезенки [Peters, 1998]. Средняя продолжительность циркуляции нейтрофилов в кровотоке составляет 8-20 ч, после чего, если их не активируют факторы воспаления, нейтрофилы мигрируют в ткани. После миграции в ткани продолжительность жизни нейтрофилов составляет, как правило, 1-2 дня, затем они подвергаются спонтанному апоптозу и уничтожаются макрофагами, тем самым минимизируя повреждения ткани цитотоксическим содержимым своих гранул [Fox et al., 2010]. Пролонгация времени жизни нейтрофилов 10 связана с их реакцией на цитокины воспаления и ассоциирована с персистенцией воспаления [Galligan and Yoshimura, 2003]. Развитие апоптоза в нейтрофилах может ингибироваться при добавлении интерлейкинов IL-1β, IL-6, фактора некроза опухоли альфа (TNFα), гамма-интерферона (IFNγ), гранулоцитарно-макрофагального колонестимулирующего фактора (GMCSF), гранулоцитарного колонестимулирующего фактора (G-CSF), липополисахарида (LPS) [Colotta et al., 1992]. Апоптоз может запускаться различными механизмами: внутренним (митохондриальным), внешним (рецептор-опосредованным) и механизмом, опосредованным развитием стресса эндоплазматического ретикулума (ERстресса). В нейтрофилах реализуются все три описанных механизма апоптоза [Binet et al., 2010]. Средний размер зрелых нейтрофилов составляет 12-15 мкм. Эти клетки имеют сложную систему актинового цитоскелета, которая ответственна за процессы хемотаксиса, фагоцитоза и экзоцитоза. Клеточное ядро зрелых нейтрофилов имеет характерный внешний вид, оно состоит из 2-5 сегментов, связанных хроматином. 1.1.1. Нейтрофильные гранулы С помощью биохимических методов, метода электронной микроскопии, фракционирования в зрелых нейтрофилах было охарактеризовано несколько типов гранул с содержащимися в них маркерными белками [Bainton, 1993]. Выделяют первичные, или азурофильные; вторичные, или специфические; третичные, или желатиназные, истинные лизосомы и секреторные везикулы [Borregaard and Cowland, 1997; Gullberg et al., 1999]. Азурофильные гранулы являются самыми крупными в цитоплазме нейтрофилов и образуются раньше других гранул, еще на этапе промиелоцита, что позволяет считать их первичными. Несмотря на высокое содержание в азурофильных гранулах кислых гидролаз, характерных для 11 лизосом, на мембране этих гранул отсутствуют лизосомальные мембраноассоциированые белки LAMP-1 и LAMP-2, что отличает эти гранулы от истинных лизосом [Dahlgren et al., 1995; Cieutat et al., 1998]. Азурофильные гранулы относятся к секретируемым гранулам, их компоненты высвобождаются не только в фагосому в процессе фагоцитоза, но и на поверхность нейтрофилов, а также во внеклеточное пространство при дегрануляции. Азурофильные гранулы содержат белки и пептиды, обладающие микробицидными свойствами, такие как миелопероксидаза, гемосодержащий фермент, который образует одну из систем генерации активных форм кислорода (АФК). Компонентами азурофильных гранул являются также нейтральные (сериновые) протеиназы: катепсин G, эластаза, протеиназа 3, азуроцидин [Pederzoli et al., 2004; Durant et.al., 2010], а также дефенсины, фактор BPI (bactericidal/permeability-increasing protein), обладающий LPS-связывающей и нейтрализующей активностью, лизоцим и др. [Levy, 2000]. Основное содержимое этого типа гранул составляют высококатионные белки, которые находятся в связанном состоянии с негативно заряженными сульфатными протеингликанами на внутренней поверхности азурофильных гранул. Такая модификация белков внутри гранул позволяет находиться протеолитическим ферментам в инактивированном состоянии до момента их высвобождения [Owen et al., 1995]. Вторичные, или специфические, гранулы являются секретируемыми гранулами. Этот тип гранул содержит маркерный белок лактоферрин, который является хелатором ионов железа и меди, необходимых для роста бактерий, и катализирует образование гидроксил-радикала [Bullen and Armstrong, 1979; Winterbourn, 1983]. Специфические гранулы заключают в себе бактериостатические и бактерицидные вещества: щелочную фосфатазу, белок связывающий витамин В-12 (кобалофилин), активатор плазминогена, коллагеназу, две трети от общего количества лизоцима, липокалин 12 [Bundgaard et al., 1994], желатиназу [Hibbs and Bainton, 1989]. Коллагеназа расщепляет коллаген, что позволяет нейтрофилам свободно двигаться к очагу воспаления и повреждения. При дефиците специфических гранул нейтрофилы обладают слабой активностью, что, по-видимому, связано с нарушением их миграции [Witko-Sarsat et al., 2000]. Основным содержимым третичных гранул, как следует из названия, является желатиназа. Этот фермент облегчает миграцию нейтрофилов в окружающие их ткани. Помимо этого, в третичных гранулах обнаружены небольшие количества дегрануляцией ацетилтрансферазы специфических гранул, и при лизоцима. стимуляции Наряду с нейтрофилов происходит дегрануляция содержимого этих типов гранул. Одним из основных мембранных компонентов как специфических, так и желатиназных гранул являются рецепторы адгезии Mac-1 (CD11b/CD18) [Borregaard and Cowland, 1997]. Четвертый тип гранул, называемый секреторными везикулами, появляется на стадии созревания нейтрофилов. Известно, что основым содержимым секреторных везикул является белок плазмы – альбумин, что указывает на их эндоцитозное происхождение [Borregaard et al., 1992]. Эти органеллы в внутриклеточными нейтрофилах структурами, являются способными наиболее к мобильными быстрому процессу экзоцитоза. Одной из функций этих гранул является сохранение запаса мембранных компонентов. Мембрана этого типа гранул богата рецеторами, которые в процессе экзоцитоза интегрируются в состав плазматической мембраны. Компонент NADPH-оксидазы, основного продуцента АФК, в виде комплекса gp91phox-p22phox (цитохром b558) локализован на мембране секреторных везикул [Segal, 2005]. Также в своем составе они имеют щелочную фосфатазу, рецептор к пептидному продукту бактерий fMLP (formyl-1-methionyl-1-leucyl-1-phenylalanine), рецептор к компоненту системы комплемента CR1 [Sengelov et al., 1994]. Секреторные везикулы способны 13 высвобождаться на поверхности нейтрофилов даже при отсутствии внеклеточного Ca2+ [Sengelov et al., 1993]. Лизосомы выделяют в качестве отдельного гранулярного компартмента. Они содержат кислые гидролазы, высвобождение содержимого лизосом в фагосому происходит позднее, чем высвобождение содержимого азурофильных гранул. [Segal et al., 1980]. 1.1.2. Поверхностные маркеры нейтрофилов Для нейтрофилов характерна экспрессия ряда молекул на цитоплазматической мембране. Эти поверхностные молекулы не только являются маркерами нейтрофилов, но и определяют особенности активации и эффекторной функции этих клеток. Экспрессируемые на нейтрофилах рецепторы проводят сигналы, запускающие внутриклеточные каскадные реакции, в ходе которых могут активироваться процессы адгезии, миграции, фагоцитоза, дегрануляции, продукции АФК, образования внеклеточных ловушек, а также продукции нейтрофилами хемокинов и цитокинов. Некоторые рецепторы распознают патоген-ассоциированные молекулы (к аминопептидазе N – СD13, к компоненту бактериальной стенки LPS – CD14, TLR (Toll-like receptors); другие рецепторы распознают факторы, которые выделяются в тканях в процессе воспаления (TNFα/βR). Также на поверхности нейтрофилов охарактеризованы рецепторы для взаимодействия с Fc-фрагментами антител, рецепторы для белковых фрагментов системы комплемента С3b/С4b и iC3b/C4b – СR1 (CD35) и СR3 (CD11b/CD18), соответственно. При появлении в организме патогена, нейтрофилы первыми реагируют на медиаторы воспаления – хемоаттрактанты, которые высвобождаются из бактерий, мертвых эндотелиальными хемоаттрактантами клеток клетками для или в продуцируются воспаленных нейтрофилов 14 стромальными участках. принято считать и Классическими fMLP, LTВ4 (лейкотриен B4), PAF (platelet activating factor), компонент системы комплемента С5а, цитокин CXCL8 (IL-8), что определяются присутствием на поверхности нейтрофилов соответствующих рецепторов. Эти рецепторы принадлежат к суперсемейству трансмембранных гликопротеиновых «серпентиновых» рецепторов GPCR, связанных с внутриклеточными GTPсвязанными белками, которые инициируют активацию двух параллельных путей сигналинга. Один из них опосредован активирующим действием через вторичные посредники фосфолипаз С на протеинкиназу С и регуляцию потока Ca2+. Другой путь запускается при активации фосфатидилинозитол-3киназы (PI3К) с последующим образованием фосфатидилинозитол-3,4,5 трифосфатов в качестве вторичных посредников. Эти посредники вовлечены в процессы дегрануляции и активации NADPH-оксидазы [Li et al., 2000]. Также описано, что в дегрануляции и респираторном взрыве участвуют активированные с помощью GPCR тирозиновые киназы (Srс-семейства) и митоген-активированные протеинкиназы (MAP) [Mócsai et al., 1997]. Важным этапом миграции нейтрофилов к месту воспаления является прикрепление нейтрофилов к эндотелию сосудов и трансэпителиальная миграция с участием молекул адгезии, таких как β2-интегринов, эндотелиальных Р- и Е-селектинов, и L-селектина, экспрессируемого нейтрофилами. Охарактеризованы основные рецепторы адгезии нейтрофилов: αмβ2-интегрины Mac-1 и высокоафинный LFA-1 (CD11a/CD18), а также лиганды к P-селектину и к E-селектину – PSGL-1 и ESL-1, соотвественно [Witko-Sarsat et al., 2000]. Агонистами, запускающими активацию интегринов в нейтрофилах, являются упомянутые выше хемоаттрактанты (fMLP, IL-8, C5a), LPS, TNFα и GM-CSF. Нейтрофилы интегрируют сигналы от рецепторов при кластеризации интегринов и взаимодействии с субстратом адгезии с поступающими в это же время сигналами от воспалительных цитокинов и/или хемоаттрактантов. Это приводит к активации различных тирозиновых киназ [Fuortes et al.,1999; 15 Abram and Lowel, 2009], малых G-белков, активации актин-зависимых процессов, приводящих к дегрануляции и избыточной продукции АФК [Lowell and Berton, 1999]. Показано, что наличие в составе адгезивных белков специфической аминокислотной последовательности Arg–Gly–Asp (RGD – последовательность) влияет на характер их взаимодействия с интегринами, угнетая активацию нейтрофилов, возможно, защищая от спонтанной активации в кровяном русле [Gresham et al., 1989]. Наиболее важные рецепторы, экспрессируемые на поверхности нейтрофилов, представлены в таблице 1. Таблица 1. Основные рецепторы, экспрессирующиеся на поверхности нейтрофилов. Серпентиновые Fc-рецепторы Рецепторы адгезии Цитокиновые рецепторы рецепторы Рецепторы врожденного иммунитета 1.Рецепторы fMLP FPR1,2,3 2.Рецепторы хемоаттрактантов BLT1,2 (LTB4-rec) PAFR C5aR 3.Хемокиновые рецепторы CXCR1 Fc-рецепторы cγRI cγRIIA cγRIIIB cαRI 1.Интегрины LFA-1 (αLβ2) Mac-1 (αMβ2) 2.Селектины и лиганды к селектинам L-селектин ESL-1 PSGL-1 FcεRI FcεRII 1.Тип 1 1.TLR- IL-4R IL-6R IL-12R IL-15R G-CSFR GM-CSFR 2.Тип 2 рецепторы IFNα/β-rec IFNGR IL-10R IL-1R family IL-1RI IL1RII (decoy) IL-18R 3.Семейство IL-1R 4.Семейство TNFR TNFR1,2 FAS TRAIL-R2,3 TLR1 TLR2 TLR4 TLR5 TLR6 TLR8 TLR9 2.Лектины 3.NODподобные рецепторы 4.RIGподобные рецепторы С изменениями из [Futosi et al., 2013] 16 1.2. Функции нейтрофилов и их роль в системе иммунитета Нейтрофилы способности выполняют распознавать свои эффекторные чужеродные функции благодаря субстанции. В ходе последовательных реакций осуществляется комплекс следующих событий: фагоцитоз и бактерицидных внутриклеточное цитотоксических переваривание, факторов при высвобождение дегрануляции во внеклеточное пространство, продукция АФК и ряда хемокинов, образование внеклеточных ловушек. Собственная продукция нейтрофилами цитокинов влияет на активацию клеточного ответа Th1 или Th2, обеспечивая взаимодействие звеньев гуморального и клеточного иммунитета [Di Carlo et al., 2001]. 1.2.1. Фагоцитоз Нейтрофилы интернализуют как опсонизированные, так и неопсонизированные частицы. Фагоцитоз опсонизированных частиц является рецепторно-опосредованным. Наиболее важными для этого процесса считаются экспрессируемые на поверхности нейтрофилов рецепторы для иммуноглобулинов Fc-рецепторы (FcγRIIA, или CD32) и для фрагмента компонента системы комплемента CR3, а также корецепторы к ним FcγRIIIB (CD16) и CR1, взаимодействуют соответственно. с Низкоафинные опсонизированными FcγR не только иммуноглобулинами микроорганизмами, но и играют важную роль в активации нейтрофилов иммунными комплексами [Coxon et al., 2001]. Помимо рецепторов к IgG на поверхности нейтрофилов выявлены рецепторы к другому классу иммуноглобулинов – IgA, которые, как полагают исследователи, самостоятельно или в качестве корецепторов к FcγRIIA участвуют в усилении фагоцитоза и процессов дегрануляции и индукции окислительного взрыва, а также рецепторы к IgЕ, что может 17 объяснить участие нейтрофилов в аллергическом ответе [Mazengera and Kerr, 1990; van der Steen et al., 2012; Monteseirin et al., 2001]. Сигнальные пути, запускаемые в процессе фагоцитоза Fc-рецепторами и рецепторами к компонентам комплемента, имеют ряд различий. Поглощение опсонизированного антителами микроорганизма происходит при их контакте с FcγRIIA на поверхности цитоплазматических нейтрофилов, сигнальных фосфорилировании последовательностей ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) при участии тирозиновых киназ, которые состаляют ключевой путь: Src-киназы /ITAMs/Syk-киназа. Syk-киназа фосфорилирует ряд белков, участвующих в запуске фагоцитоза, процессe слияния мембран и формирования фагосомы [Kobayashi et al., 1995; García-García and Rosales, 2002]. Внутри фагосомы выделяются АФК, сопутствующие развитию окислительного стресса, и протеолитические ферменты. Респираторный взрыв, сопровождающий Fc-опосредованный фагоцитоз, имеет немитохондриальную природу, он происходит при усиленной продукции АФК ферментным комплексом NADPH-оксидазы в процессе потребления кислорода, не связанного с дыханием и потреблением энергии для метаболизма [Suh et al., 2006]. Во втором случае, при фагоцитозе частиц, опсонизированных фрагментом комплемента iС3b с участием рецептора СR3, задействован механизм активации нейтрофилов, независимый от содержания ионов свободного Ca2+ в цитоплазме [Lew et al., 1985]. Сам по себе комплементопосредованный фагоцитоз не приводит к развитию респираторного взрыва. Этот путь фагоцитоза возможен лишь при наличии дополнительных факторов активации, которые фосфорилируют корецептор CR1, после чего увеличивается активность рецептора СR3 [Zhou and Brown, 1994]. Вероятно, два вышеописанных механизма активации фагоцитоза являются взаимосвязанными, например, через активацию Syk-киназы [Tohyama and Yamamura, 2006]. Описаны эффекты усиления окислительного стресса и 18 развития апоптоза в нейтрофилах при одновременной активации двух механизмов фагоцитоза. При этом в роли агониста выступает комплементопосредованный механизм [Zhou and Brown, 1994]. Существует несколько точек зрения на то, какой механизм активации фагоцитоза превалирует при уничтожении микроорганизма: окислительный или неокислительный. Ранее считалось, что действие свободных радикалов и других АФК, продуцируемых NADPH-оксидазой, а также продуктов миелопероксидазы, обеспечивает достаточную токсичность, чтобы разрушить бактерию. В настоящее время полагают, что процесс разрушения бактерий происходит благодаря первичной роли высвобождаемых из гранул ферментов в фагосому и переваривания патогена. Например, нарушение сборки ферментного комплекса NADPH-оксидазы и уменьшение продукции АФК при хроническом грануломатозе в ряде случаев не отменяет сохранение резистентности к некоторым микроорганизмам [Reeves et al., 2002]. Техника направленного мутагенеза позволила также оценить влияние таких белков, как эластаза, катепсин G, содержащихся в гранулах, на эффективность микробицидной активности в мышиных моделях [Tkalcevic et al., 2000]. Нарушение продукции этих белков приводят к невозможности разрушения микроорганизма даже при нормальных значениях продукции АФК. Однако продукция АФК влияет на физико-химические параметры в гранулах нейтрофилов [DeCoursey et al., 2003]. Обобщая, можно заключить, что внутрифагосомное разрушение микроорганизмов происходит по кислородзависимому ферментативному механизму. При «состоявшемся» фагоцитозе бактерия захватывается мембраной нейтрофила со всех сторон, попадает в цитоплазму, где происходит ее разрушение, посредством активации сигнальных путей, запускающих процессы накопления АФК и высвобождения содержимого нейтрофильных гранул в образовавшуюся фагосому. Процесс захвата и активации киллинга происходит в результате образования комплекса, состоящего из фагосомы и 19 специфической гранулы, затем, в течение десятков секунд, происходит слияние с азурофильными гранулами и высвобождение содержащихся в них микробицидных ферментов. При достижении оптимальных значений рН, при которых гидролитические ферменты могут переваривать микроорганизмы, с этим комплексом сливается лизосома и образуется фаголизосома [Segal et al., 1980]. 1.2.2. Дегрануляция Дегрануляция микробицидных факторов происходит также и во внеклеточное пространство. Такой тип секреции характерен для «несостоявшегося» фагоцитоза, который может происходить, например, в силу особенностей патогена, но преимущественно вызвается растворимыми молекулами, включая большинство хемоаттарктантов. Такой механизм дегрануляции в основном реализуется при воспалении, он приводит к деструкции тканей высвождаемыми из гранул ферментами. По мере увеличения концентрации стимулирующих молекул первыми секретируются специфические гранулы, затем компоненты азурофильных гранул, возможно, из-за разной чувствительности к концентрации ионов Са2+ в цитозоле [Lew et al., 1986]. Очевидно, что высвобождение антимикробных компонентов может происходить при разрушении нейтрофилов в результате некроза и выброса клеточных компонентов, в том числе цитоплазматических гранул. Достоверно не установлено, могут ли такие компоненты эффективно функционировать за пределами фаголизосомы. Показано, что гистоны и цитозольный белок бактериостатической калпротектин активностью вне обладают клеток, антимикробной они секретируется и в результате разрушения клетки при некрозе [Voganatsi et al., 2001]. Механизмы, контролирующие дегрануляцию нейтрофилов, до сих пор активно изучаются. Известно, что слияние мембран гранул и везикул с плазматической мембраной во время фагоцитоза и экзоцитоза обеспечивает 20 семейство белков SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-fusion-protein attachment protein receptor). При активации нейтрофилов форболовым эфиром PMA (phorbol meristat acetate) представитель семейства SNARE– белок SNAP-23 транслоцируется на клеточную мембрану. На мембране SNAP-23 взаимодействует с другим белком синтаксином-6, блокирование антителами этих белков предотвращает дегрануляцию желатиназных гранул [Martin-Martin et al., 2000]. Также рецептор-опосредованное высвобождение гранул зависит от активации сигнальных молекул, включающих srcсемейство тирозин-киназ, тирозин-фосфатазу MEG2, киназы MARCK, Rab, а также молекулы Rho GTPase, Rac2 [Lacy and Eitzen, 2008]. Механизмы, лежащие в основе секреции морфологически различных популяций гранул, запускаются в определенной последовательности, которая, скорее всего, связана с их количественным присутствием в цитозоле. При стимуляции нейтрофилов в первую очередь происходит мобилизация секреторных везикул, затем высвобождение содержимого желатиновых гранул, специфических гранул и, наконец, азурофильных гранул [Cassatella M., 2010] (Рис. 1). С изменениями из [Cassatella M., 2010]. Рис.1. Характеристика нейтрофильных гранул. 21 1.2.3. Нейтрофильные внеклеточные ловушки Еще одним механизмом уничтожения бактерий нейтрофилами является образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET, от Neutrophil Extracellular Traps) [Brinkmann and Zychlinsky, 2007]. При наблюдении за нейтрофилами был описан эффект, при котором активация клеток приводила к высвобождению разветвленных структур волокон, состоящих из деконденсированных ДНК в комплексе с цитозольными белками, белками из гранул и гистонами. По данным масспектрометрии определено не менее 24 различных белков в составе NET [Urban et al., 2009]. Такой комплекс локально обеспечивает достаточно высокую концентрацию антимикробных компонентов, чтобы уничтожить патоген независимо от поглощения. Хотя механизм образования ловушек до конца не изучен, известно, что их образование зависит от активности NADPH-оксидазы [Palmer et al., 2012]. В то же время супероксид анион-радикал, продуцируемый экзогенно с помощью NADPH-оксидазы, обладает ограниченной пермеабилизирующей способностью и не может убивать бактерию непосредственно [Klebanoff, 1974]. В дополнение внеклеточные к ловушки антимикробным могут создавать свойствам, барьер, нейтрофильные предотвращающий распространение патогена. 1.2.4. Активные формы кислорода в нейтрофилах Понятие АФК включает в себя соединения, так или иначе связанные с первичным образованием супероксид анион-радикал O2* из кислорода. Как фагоцитирующие лейкоциты, нейтрофилы, помимо потребления кислорода для дыхания, в ответ на соответствующие стимулы генерируют АФК. Основное количество молекул кислорода потребляется при дыхании в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях для энергетических и катаболических целей, и до 15% кислорода расходуется на 22 образование АФК в процессе нормальной жизнедеятельности клеток [Vladimirov and Proskurnina, 2009]. Несмотря на то, что АФК играют важную биологическую роль в повышении устойчивости организма к патогенам, широкий спектр патологических состояний обусловлен нарушениями регуляции продукции АФК: как в сторону избыточной генерации АФК и развития окислительного стресса, так и при их дефиците. АФК регулируют внутриклеточные сигнальные пути, клеточный цикл, развитие апоптоза [Suzuki et al., 1997]. Высокие концентрации АФК (в особенности перекись водорода H2O2) обладают способностью ингибировать синтез ДНК и деление клеток, а также могут активировать апоптоз [Halliwell, 2007]. Также АФК влияют на накопление ионов Са2+ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации, главным образом, протеинкиназы С и тирозинкиназ, а также ингибирования протеинфосфатаз [Dubinina, 2001]. Показано, что АФК и липидные радикалы в низких концентрациях индуцируют экспрессию генов (в том числе протоонкогенов) и деление клеток. АФК активируют белки Ras, играющие важную роль в передаче сигналов в ядро клетки [Hole et al., 2010]. Показано, что накопление АФК приводит к активации транскрипционного фактора NF-кВ, индуцирующего синтез ряда цитокинов и рецепторов, участвующих в развитии иммунного и воспалительного ответа [Morgan and Liu, 2011]. Известно об участии АФК в промежуточных реакциях синтеза гормонов, в том числе эйкозаноидов и иодтиронинов [Кулинский, 1999]. 1.2.4.1. Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах Продукция АФК в нейтрофилах, как внутриклеточных, так и внеклеточных, находится под упорядоченным контролем инициирующих и ингибирующих компонентов различных 23 рецепторно-опосредованных сигнальных путей. Разнообразные внутриклеточные компоненты координируют работу продуцирующих АФК систем и участвуют в поддержании оптимальных значений АФК. Главным источником АФК служит реакция одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. В ходе такой реакции образуется первичный радикал – супероксид анион-радикал O2*. В нейтрофилах он образуется преимущественно NADPH-оксидазным комплексом внешней цитоплазматической мембраны, мембран фагосом, в небольшой степени дыхательной цепью внутренней мембраны митохондрий и эндоплазматической системой цитохрома Р-450. Еще одним первичным радикалом является монооксид азота NO, однако его образование контролируют другие ферментные системы – NO-синтетазы. Из-за высокой реактивности O2* быстро переходит в молекулярные продукты. Так, большая часть O2*спонтанно или под действием фермента супероксид дисмутазы (СОД) превращается в H2O2, малоустойчивую молекулу, которая токсична в больших концентрациях [Babior et al., 1973]: 2O2*+ 2O2* + 2H+ O2 + H2O2 Цитотоксический эффект O2* и H2O2 связан с их способностью реагировать с продуктами других антимикробных систем и образовывать более агрессивные АФК, таких как гипохлорид HOCl, гидроксил радикал OH*, синглетный кислород 1O2, озон О3, и др. Оксидант нерадикальной природы HOCl, который образуется из H2O2 под действием фермента миелопероксидазы, обладает самым сильным антибактериальным и фунгицидным эффектом, однако способность этого соединения самостоятельно разрушать фагоцитированные вещества однозначно не доказана [Arnhold, 2004]. В неблагоприятных для клетки условиях при участии O2* происходит восстановление трехвалентного иона железа до двухвалентного. В качестве 24 донора электорона Fe2+ может вступать в реакцию с H2O2 (реакция Фентона) или с HOCl с образованием активного окислителя – OH*, обладающего мутагенным и канцерогенным свойствами за счет способности повреждать ДНК [Halliwell, 2007]. В то же время OH* запускает перекисное окисление липидов биологических мембран с образованием липидных радикалов, которые является источников хотя и не единственным, но одним из основных спонтанной хемилюминесценции клеток [Vladimirov and Proskurnina, 2009]. Вышеописанные представители группы АФК обладают разнообразными свойствами, функциями, и в зависимости от факторов, воздействующих на клетку, их соотношение может меняться. В нефагоцитирующих клетках АФК являются в основном продуктами работы митохондриальных белков в составе дыхательной цепи мембраны митохондрий, которая является основным поставщиком энергии клетки в форме АТФ. В ходе транспорта электронов по дыхательной цепи 1-2% электронов «теряются» и участвуют в продукции O2*. Факторы, приводящие к нарушению окислительного потенциала мембраны митохондрий, в частности, в результате нарушения синтеза белков-переносчиков электронов в дыхательной цепи или блокировании электронно-транспортных путей, усиливают продукцию O2* [Boveris, 1984]. Поскольку нейтрофилы бедны митохондриями, этот путь генерации АФК вносит значительно мешьший вклад в общую продукцию АФК в этих клетках, по сравнению с другими источниками. В нейтрофилах основным продуцентом АФК является мембраносвязанный мультимолекулярный ферментный комплекс NADPHоксидаза, в меньшей степени ферментные системы СОД и миелопероксидазы. Типичная структура NADPH-оксидазы в нейтрофилах включает в себя несколько субъединиц: две мембранные p22phox и gp91phox 25 (NOX2), три цитозольные p67phox, p47phox, p40phox и низкомолекулярные Gбелки Rac2, Rap1A и Rho [Sheppard et al., 2005]. Существует несколько механизмов регуляции активности NADPHоксидазы, и эта регуляция опосредована взаимодействием различных компонентов этого фермента. В покоящихся клетках NADPH-оксидаза существует в диссоциированном состоянии, тогда как при стимуляции нейтрофилов ее компоненты образуют функционально активный комплекс, и происходит образование O2* [Sheppard et al., 2005]. Активация NADPH-оксидазы происходит при фосфорилировании составляющих фермент белков и транслокации цитозольных компонентов к мембране для полной сборки ферментного комплекса. Считается, что активированная NADPH-оксидаза находится в связанном состоянии с внешней плазматической мембраной или образованной фагосомой, однако описано существование отдельного пула NADPH-оксидазы в везикулярных структурах. Достоверно не установлено, каково происхождение этих образований: внутриклеточное или из внешней мембраны. Образование таких везикул пиноцитозом не объясняет механизм полной сборки в них цитозольных и мембранных компонентов NADPH-оксидазы [Robinson, 2008]. 1.2.5. Роль нейтрофилов в патологических процессах Изменение активности нейтрофилов может быть одним из факторов, определяющих развитие и прогрессирование патологических процессов. Ответ нейтрофилов предшествует более при острых воспалениях специфическому и инфекциях лимфоцитарному всегда ответу, преобладающему при хронических воспалениях и инфекциях. Однако нейтрофилы нельзя рассматривать лишь как маркеры острого воспаления: описано их участие в развитии заболеваний с хроническим течением воспалительного процесса. Установлены роль и вклад нейтрофилов в патогенезе таких заболеваний, как хронический грануломатоз, различные 26 болезни легких, системные васкулиты, ревматоидный артрит и сердечнососудистые заболевания [Iking-Konert et al., 2008]. Избыточная активация нейтрофилов и накопление АФК описано в патогенезе ряда иммунных заболеваний, онкогенезе [Valko et al., 2006], при нарушениях метаболизма, после ишемии миокарда и головного мозга [Neuzil et al., 2005], при атеросклерозе [Zalba et al., 2005]. Появление антинейтрофильных антител к ферментам (протеиназа-3, миелопероксидаза) нейтрофилов приводит к усилению и пролонгации их активации, избыточной продукции АФК и лизосомальных ферментов, индуцирующих лизис клеток эндотелия, что имеет большое патогенетическое значение при развитии системных васкулитов [Kallenberg, 2011]. Роль нейтрофилов в противоопухолевом иммунитете неоднозначна. С одной стороны, на начальных этапах развития опухоли нейтрофилы одними из первых мигрируют в область ее формирования, где меняют морфологию и свою функциональную активность [Мальцева, 2007]. В очаге развития опухоли нейтрофилы оказывают цитостатический и цитотоксический эффекты на опухолевые клетки-мишени посредством избыточной продукции АФК [Nathan, 2006], а также независимо от АФК, вероятно, с помощью цитокин-опосредованного механизма [Brú et al., 2009]. С другой стороны, данные свидетельствует о том, что на поздних этапах опухолевого развития, нейтрофилы способствуют прогрессии опухолей при участии селектинов и нескольких нейтрофильных ферментов, в частности, металлопротеиназ, а также цитокинов, стимулирующих ангиогенез и провоцирующих рост и метастазирование опухоли [Tazzyman et al., 2009]. По мере миграции нейтрофилов в ткани в них активируется транскрипция ряда хемокинов, включая IL-8, которые дополнительно привлекают клетки в очаг воспаления [Cassatella et al., 1993; Scapini et al., 2000; Scapini еt al., 2008]. 27 Таким образом, нейтрофилы, участвуя в иммунных реакциях организма, выполняют двойную роль: с одной стороны, они обеспечивают, антимикробную защиту и клиренс поврежденных тканей, а с другой стороны, усугубляют воспалительные реакции с повреждающим эффектом, связанным, в том числе, с продукцией АФК. 1.3. Регуляция активности нейтрофилов В организме осуществляется негативная регуляция функционирования нейтрофилов, ограничивающая их активность и предотвращающая повреждение тканей при дегрануляции и избыточной продукции АФК нейтрофилами. Способы защиты от АФК включают в себя химические и ферментативные механизмы. Первый защитный механизм реализуется с участием веществ-антиоксидантов, которые прерывают цепную реакцию окисления. Вступая в реакции со свободными радикалами, они сами превращаются в радикалы, но с меньшей реакционной способностью. К таким природным антиоксидантам относятся низкомолекулярные белки плазмы: аскорбиновая кислота (витамин С), α-токоферол (витамин Е), βкаротин (витамин А), а также мочевая кислота, билирубин и др. [Arai, 2001]. Ферментный механизм защиты от АФК опосредован действием таких основных антиоксидантных ферментов, как супероксиддисмутаза и каталаза, инициирующая разложение H2O2 до O2 и H2O. Молекула глутатиона (GSH) играет ключевую роль в поддержании баланса между прооксидантами и антиокидантами. Антиоксидантный фермент глутатионпероксидаза катализирует реакцию восстановления перекиси водорода до воды с помощью молекулы глутатиона: H2O2 + 2 GSH 2GSSG+ H2O Затем окисленный глутатион (GSSG) восстанавливается с помощью NADPH и глутатионредуктазы в ходе реакции: GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+ 28 Помимо универсальных механизмов негативной регуляции нейтрофилов, описаны и другие, еще малоизученные пути. Один из них осуществляется за счет последовательностей ITIM (immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif), которые, деактивируют тирозиновые рецепторы, участвующие в сигнальных путях активации нейтрофилов [Daëron et al., 2008]. Изучены механизмы, транскрипционный по фактор, которым АФК стимулирующий активируют работу NFR2- антиоксидантных систем, или увеличивают трансляцию NFR2-транскрипционного фактора через PI3К [Kensler et al., 2007; Purdom-Dickinson et al., 2007]. Показано, что mTOR сигнальный путь (от Target of Rapamycin) негативно регулирует активность формирования NET и координирует работу внутриклеточных сигнальных путей, ингибирующих активацию нейтрофилов [Itakura and McCarty 2013]. Еще один эффективный механизм регуляции активности нейтрофилов осуществляется через рецептор к хемерину ChemR23, преимущественно синтезируемому в печени. Этот рецептор экспрессируется на макрофагах, дендритных клетках и активированных эндотелиальных клетках и индуцирует активацию макрофагов, усиливая их фагоцитарную активность и поглощение апоптозных нейтрофилов [Cash et al., 2010]. Данный механизм уменьшает риск развития некроза нейтрофилов и высвобождения их содержимого наружу. В экссудате в очаге воспаления охарактеризованы противовоспалительные липидные медиаторы: резолвины и протектины. Действие резолвина E1 основано на активации ChemR23, а также блокировании рецептора лейкотриена 4, что ингибирует активацию нейтрофилов [Arita et al., 2007], тогда как протектин D1 активирует полимеризацию актина и β2-интегринов [Schwab et al., 2007]. 29 Временная негативная регуляция может осуществляться в момент адгезии нейтрофилов опосредованно через сигналы от интегриновых рецепторов. Активация интегриновых рецепторов может регулировать активность NADPH –оксидазы через белок Rac2 за счет ингибирования процесса полной сборки NADPH-оксидазного комплекса [Zhao et al., 2003]. Недавно активности был описан путь нейтрофилов с аутокринной участием негативной молекулы регуляции пентраксина, высвобождаемого из специфических гранул нейтрофилов. Было показано, что пентраксин связывается с Р-селектином на эндотелиальных клетках и блокирует последний, тем самым препятствуя захвату нейтрофилов эндотелильными клеткамим и дальнейшей их миграции в ткани [Deban et al., 2010]. Таким образом, в организме реализуется несколько уровней защиты от гиперфункции нейтрофилов, основанных на разнообразных механизмах, препятствующих активации нейтрофилов либо влияющих на метаболизм АФК. 1.4. Белки теплового шока Белки теплового шока (HSP, от heat shock proteins) составляют одну из молекулярных систем, направленных на защиту клетки от различных цитотоксических факторов. Свое название эти белки получили из-за того, что тепловое воздействие индуцировало в клетках их массированный синтез. Позднее было установлено, что экспрессия белков теплового шока является реакцией на целый спектр неблагоприятных факторов, таких как гипоксия, соли тяжелых металлов, окислительный стресс, излучение, алкоголь, магнитное поле, воспаление, инфекции и др. Белки HSP обнаружены во всех исследованных организмах и клетках, что позволяет относить их к наиболее консервативной и универсальной системе стресс-индуцируемого клеточного ответа. В то же 30 время большинство представителей семейств HSP представлены в клетках и в нормальных условиях. Белки теплового шока млекопитающих берут свое происхождение от прокариотических форм, где они участвуют в процессе фолдинга и поддержания правильной структуры внутриклеточных белков, препятствуют образованию белковых агрегатов. В эукариотических организмах эти белки также выполняют шаперонные функции и способны связывать новосинтезированные или поврежденные гидрофобные участки пептидов и восстанавливать их структуру. Белки HSP участвуют в элиминации неправильно свернутых или денатурированных белков, а также влияют на развитие апоптоза, пролиферации, дифференцировки. После того, как было доказано существование исследований была внеклеточного продемонстрирована пула HSP70, способность во множестве этих белков участвовать в разнообразных иммунорегуляторных механизмах. Выделяют следующие семейства белков HSP в соответствии с их средними молекулярными массами: высокомолекулярные HSP100 (100 кДа), HSP90 (90 кДа), HSP70 (70 кДа), HSP60 (60 кДа), HSP40 (40 кДа), и малые HSP27(27 кДа), HSP10 (10 кДа). Каждое семейство включает один или несколько белков. Поскольку каждое семейство HSP является продуктами родственных генов, то внутри каждой группы прослеживается высокая (до 99%) степень гомологии между белками. Несмотря на консервативность многих HSP, профиль экспрессии этих белков зависит от организма, где они синтезируются, и от индуцирующего фактора. Например, в ответ на тепловой шок (далее ТШ) значительно увеличивается экспрессия белков семейств HSP70, HSP90, HSP100, HSP27, однако тяжелыми металлами индукция экспрессии наблюдается только для HSP70. Как правило после ТШ сначала запускается синтез белков семейств HSP70, затем HSP90, и лишь позднее HSP27 [Маргулис и Гужова, 2000]. 31 1.4.1. Семейство белков теплового шока 70 кДа Одним из наиболее полно исследованных семейств HSP является семейство белков теплового шока 70 кДа – HSP70 (HSPA). У человека, согласно номенклатуре HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC), в состав этого семейства входят несколько белков с молекулярной массой 6678 кДа, весьма гомологичных между собой, но кодируемых разными генами (Таблица 2). (http://www.genenames.org). Таблица 2. Белки семейства HSP70. Название гена HSPA1A HSPA1B HSPA1L HSPA2 HSPA4 HSPA4L HSPA5 HSPA6 HSPA7 HSPA8 HSPA9 (mortalin) HSPA12A HSPA12B HSPA13 HSPA14 HSPH1 HYOU1 Название белков, синонимы HSPA1; HSP72;HSP70-1 HSPA1B; HSP70-2 hum70t; Hsp70-HOM Heat-shock70kDa protein-2; Hsp70.2 HS24/P52; HSPH2 APG-1, Osp94, HSPH3 BIP; GRP78;MIF2 Heat shock70kDa protein 6 (HSP70B’) Heat shock70kDa protein 7 (HSP70B) HSC70; HSC71;HSP73 HSPA9B; GRP75;PBP74; mtHsp70 FLJ13874;KIAA0417 C20orf60; dJ1009E24.2 Stch HSP70-4;HSP70L1 HSP105A; HSP105B;KIAA0201; Hypoxia up-regulated 1; Grp170; ORP150 Хромосома 6p21.3 6p21.3 6p21.3 14q23 5q31.1 4q28 9q33.3 1q23.3 1q23.3 11q.24.1 5q31.1 10q25.3 20p13 21q11.1 10p13 13q12.2-q13.3 11q23.1-q23.3 Индукция стрессом Да Да Нет Нет Нет Нет Нет Да Нет Нет Да Адаптированно из: http://www.genenames.org/genefamilies/HSP#HSP70. Основными, наиболее изученными, стресс-индуцируемыми продуктами генов семейства HSP70 являются белки HSPA1A/B, вероятно, взаимозаменяемые, отличающиеся друг от друга двумя аминокислотами, а также белок HSPA6 – преобладающий продукт синтеза, индуцированного ТШ. В литературе чаще всего эти белки с молекулярной массой 72 кДа обозначаются как Hsp70 (иногда в литературе встречается их обозначение 32 как Hsp72). Белок HSPA7 высокогомологичен белку HSPA6, но является продуктом отдельного гена. Для белков HSPA1L и HSPA2 выявлена высокая специфичность к тестикулярной ткани. К конститутивно экспрессируемым в клетке белкам относится HSPA8 с молекулярной массой 73 кДа, чаще встречаемый в литературе органеллоспецифические с аббревиатурой белковые изоформы. К Hsc70, а последним также относят глюкозо-регулируемый белок HSPA5, или Grp 78, с молекулярной массой 78 кДа, сосредоточенный в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), митохондриальный HSPA9, или mtHsp70, с молекулярной массой 75 кДа, а также белок HSPA13, или Stch, обнаруженный в микросомах. Продукты генов HSPA12A, HSPA12B и HSPA14 наиболее отличаются от других членов семейства и являются наименее изученными [Kampinga et al., 2009]. Белок гена HSP105A в условиях гипоксии накапливается в ЭПР [Behnke and Hendershot, 2014]. Конститутивный и индуцируемый белки HSP70 отличаются по характеру синтеза, который зависит от специализации и функциональной нагрузки клетки. Большинство представителей семейства HSP70 синтезируются постоянно. Однако базовый уровень экспрессии белков различен. Уровень экспрессии белков зависит от того, в каком организме и в каких типах клеток они синтезируются [Mayer and Bukau, 2005]. Индуцируемый Hsp70 – это белок, активация экспрессии которого происходит под воздействием клеточного стресса, в то время как для большинства других внутриклеточных белков характерно ингибирование их синтеза во время стресса. Для индукции транскрипции гена Hsp70 обязательным условием транскрипционных является элементов HSE взаимодействие (heat shock регуляторных element) в составе промоторного участка гена с факторами HSF (heat shock factor), в первую очередь HSF1 [Pirkkala et al., 2001]. Более того, при изучении структуры гена, кодирующего Hsp70, была выявлена особенность в виде отсутствия 33 интронов, а следовательно, синтез этого белка во время стресса защищен от ошибок при сплайсинге [Günther and Walter, 1994]. Для молекул семейства HSP70 характерна трехдоменная организация (Рис. 2). Консервативный NH2-домен с молекулярной массой 44 кДа, составляет около 450 а.о. Этот домен прочно связывается с АТФ или АДФ и обладает АТФ-азной активностью. Вариабельный СOOH-терминальный, или субстратсвязывающий, домен с молекулярной массой 27 кДа составляет около 200 а.о. В этот домен входит участок размером 18 кДа состоящий из двукратно повторяющихся четырех антипараллельных аминокислотных последовательностей и четырех петель между ними. Этот участок, как и концевой спиральный участок, размером 10 кДа, непосредственно контактирует с субстратом, где он связывается с несвернутыми или частично свернутыми полипептидными последовательностями. Два описанных домена разделены короткой последовательностью– линкерным участком, в котором находится сайт узнавания белка протеолитическими ферментами. Линкерный участок регулирует АТФ-зависимую диссоциацию комплекса HSP70-пептид, координируя работу двух основных доменов [Jiang et al., 2005]. Недавно было показано, что при связывании АТФ с NH2-концевым спиральным участком меняется конформация СOOH-терминального домена и становится возможным доступ фрагмента HSP70 к субстрату [Kityk et al., 2012]. Скорость связывания и высвобождения пептидов определяется гидролизом и восстановлением молекулы АТФ. При гидролизе молекулы АТФ с образованием АДФ аффинность связывания пептида с HSP70 резко возрастает и скорость отсоединения пептида уменьшается. На этом механизме основан метод получения комплексов HSP70 с антигенными пептидами при использовании аффинной хроматографии на АДФ-носителях [Peng et al., 1997]. АТФ-зависимое изменение конформации молекулы HSP70, позволяющее захватывать и высвобождать молекулы субстрата, невозможно без участия регуляторных белков-помощников – кошаперонов и кофакторов. 34 Помимо вышеупомянутого белка HSP40, к таким молекулам относятся белки Bag-l, Hsc70-interacting protein (Hip) and Hsc70-Hsp90-organizing protein (Hop) [Höhfeld, 1998]. Белок Bag-l совместно с другим белком CHIP (от Сarboxyl terminus of the Hsc70-interacting protein) участвуют в процессе утилизации необратимо денатурированных белков-субстратов, транспортируя их в протеасомы [Tsukahara and Maru, 2010]. С изменениями http://www.biochem.iisc.ernet.in/patric.htm Рис.2. Структура HSP70. 1.4.2. Внутриклеточные функции HSP70 Молекулы HSP70 принимают участие в правильной укладке новосинтезированных или денатурированных полипептидных цепей, их стабилизации, деградации неправильно свернутых белков, предотвращении белковой агрегации, формировании нативной конформации белков для их дальнейшего импорта в различные органеллы, такие как митохондрии и эндоплазматический ретикулум. 35 Появление и накопление в клетке поврежденных белков увеличивает экспрессию Hsp70. После термического воздействия, вызывающего денатурацию клеточных белков, концентрация Hsp70 может составлять до 20% от всех цитоплазматических белков. Действие Hsp70 лежит в основе термотолерантности – феномена адаптации к повышению температуры и увеличения температурного порога чувствительности путем стабилизации белковых молекул с помощью Hsp70 при первичном, менее сильном нагреве [Lindquist, 1986]. Введение нейтрализующих антител к Hsp70 в нейроны приводит к повышению чувствительности клеток к ТШ [Khan and Sotelo, 1989]. В ранний постстрессорный период накопленный Hsp70 может распределяться в разных компартментах. Различная внутриклеточная локализация HSP70 белков определяет их функциональную роль [Jaattela, 1999]. Кратковременное накопление этих белков происходит в первую очередь в клеточном ядре. Считается, что Hsp70 участвует в защите генетического материала [Kotoglou et al., 2009]. В разных типах клеток транскрипцию генов и трансляцию Hsp70 могут запускать различные факторы. К индукции Hsp70 могут приводить не только патологические для клетки воздействия, такие как, например, гипертермия или оксислительный взрыв, но и разнообразные физиологические сигналы, среди которых адренокортикотропные и глюкокортикоидные, тиреоидные гормоны, истощение гликогена и др. [Blake et al., 1991; Valen et al., 2000; Febbraio et al., 2002; Maloyan et al., 2002]. Белки HSP70 необходимы для клеточного восстановления и выживания в стрессовых условиях: их количество коррелирует с тяжестью протекания разных патологических состояний, таких как ишемия, воспаление, аутоиммунные процессы, злокачественные опухоли, бактериальные и вирусные инфекции, патологическая беременность, травма, гипертония, нейродегенеративные заболевания [Tan et al., 2007; Pockley et al., 2002, 2003]. В патогенезе некоторых нейродегенеративных заболеваний, в том числе 36 болезней Альцгеймера и Хантингтона, лежит агрегация определенных внутриклеточных белков. Поэтому при этих расстройствах важную роль играют HSP70 и их шаперонная активность [Westerheide and Morimoto, 2005]. Увеличение продукции Hsp70 при гипоксии связано с развитием толерантности миокарда к более длительным эпизодам ишемии. Одним из доказательств этого является тот факт, что при повышенной экспресии Hsp70 увеличение размера миокарда и выход креатинкиназы, которые являются маркерами инфаркта, ингибируются [Marber et al., 1995]. HSP70 облегчают транспортировку ряда белков через клеточные мембраны [Young, 2003]. Как шапероны, HSP70 образуют комплексы с внутриклеточными антигенными пептидами, которые затем могут высвобождаться наружу или экспонироваться на клеточной мембране. Доказано, что Hsp70 участвует в процессинге антигенов. Белок Hsp70 в комплексе с антигенным пептидом усиливает связывание пептида-антигена с рецепторами антиген-презентирующих клеток (АПК), способствует интернализации антигена и последующей его презентации на поверхности АПК в составе комплекса с молекулыми MHC класса I [Theriault et al., 2005]. С другой стороны HSP70 защищает антигенные пептиды в процессе их транспортировки в ЭПР для связывания с белками МНС класса I [Srivastava, 2002]. Таким образом, HSP70 обладают иммуностимулирующим и адъювантным эффектом для АПК. Белки HSP70 играют роль в процессах клеточной дифференцировки и пролиферации. Эти белки образуют комплексы с регуляторными белками, такими как р53, MAPKs, Src-киназа, с рецепторами тирозиновых киназ, NFkB [Helmbrecht et al., 2000; Guzhova et al., 1997]. Изменение экспрессии внутриклеточных HSP70 оказывает модулирующее влияние клеточный цикл. Во-первых, Hsp70 непосредственно участвует в процессах восстановления митотической центросомы [Hut et al., 37 2005]. Во-вторых, индукция синтеза этого белка может приводить к смещению баланса в сторону S-фазы [Liu et al., 2011]. Гиперпродукция в клетках HSP70 ингибирует развитие аутофагии, как альтернативный, более «радикальный» механизм клеточного ответа на стресс [Dokladny et al., 2013]. В опухолевых клетках, по сравнению с нормальными клетками, регистрируется повышенный базальный уровень Hsp70, что может объяснять более выраженную устойчивость к стрессу, например, при дефиците питательных веществ, гипоксии, облучении и/или химиотерапии. На линиях опухолевых клеток показано, что молекула Hsp70 является ингибитором индукции апоптоза. Введение в культуру раковых клеток лимфомы Molt4 антисмысловых мРНК к Hsp70 вызывало развитие апоптоза [Wei et al., 1995], такой же эффект регистрировался и на линиях опухолевых клеток легких [Nylandsted et al., 2000]. Aнтиапоптозный эффект HSP70 опосредован их взаимодействием со многими ключевыми белками, участвующими в развитии апоптоза. Описано, что Hsp70 вызывает супрессию сигнальных путей с участием MAP-киназы, модулирующей высвобождение цитохрома с – необходимого компонета запуска каспазного каскада. Также Hsp70 препятствует образованию апоптосомы путем блокирования фактора Apaf-1, участвующего в активации про-каспазы-9 [Beere, 2004 и 2005]. По другим данным, при блокировании синтеза Hsp70 развитие апоптоза происходит независимо от активации каспаз и супрессии противоапоптогенного белка Bcl-2 [Nylandsted et al., 2000]. Член семейства HSP70, белок Grp78, является одним из ключевых белков, негативно регулирующий развитие ER-стресса, который развивается вследствие нарушения активации адаптивных механизмов фолдинга и деградации белков и, в конечном итоге, приводит к активации апоптоза [Xu et al., 2005]. 38 Также было продемонстрировано, что Hsp70 защищает от развития апоптоза немитохондриального происхождения. Белок Hsp70 ингибирует TNFα-индуцированный апоптоз [Guzhova and Margulis, 2006], а также эффективно супрессирует развитие Fas- и TRAIL- (от TNF-related apoptosisinducing ligand) опосредованного апоптоза в разных типах клеток. Накопление в клетке HSP70 увеличивает устойчивость клеток к стауроспорину, доксорубицину – известных индукторов апоптоза [Mayer and Bukau, 2005]. С другой стороны белки HSP70 могут иницициировать развитие апоптоза. Один из таких механизмов опосредуется связываением локализованного на поверхности опухолевых клеток Hsp70 с молекулой гранзима В и активацией NK-клеток [Gross et al., 2003]. Второй механизм является каспазо-зависимым и заключается в том, что Hsc70 усиливает развитие апоптоза путем связывания с каспазо-активированными ДНК-азами через Т-клеточный рецептор [Liu et al., 2003]. Grp78 участвуют в процессе синтеза иммуноглобулинов. В литературе Grp78 часто обозначается как BiP (от Binding immunoglobulin Protein). Эти белки связываются с тяжелыми цепями, что препятствует образованию агрегатов из тяжелых цепей. Впоследствии легкая цепь вытесняет молекулу BiP и формируется полная иммуноглобулиновая молекула. [Satoh et al., 1993]. Таким образом, внутриклеточные HSP70 обладают широким спектром цитопротекторных и регуляторных свойств, принимают участие во многих внутриклеточных событиях, включая представление антигена при кросспрезентации. 39 1.4.3. Внеклеточные функции HSP70 Разные виды клеточного стресса приводят не только к увеличению внутриклеточного содержания HSP70. В ряде случаев стресс индуцирует процессы транслокации HSP70 на плазматическую мембрану и/или высвобождение этих белков во внеклеточное пространство, что приводит к формированию внеклеточного пула этих белков, циркулирующих в организме. Впервые факт высвобождения HSP во внеклеточное пространство был зафиксирован при исследовании нервных клеток. Было доказано, что HSP могут высвобождаться из клеток глии [Tytell et al., 1986; Hightower and Guidon, 1989]. Установлено, что помимо нервных клеток другие клетки тоже способны высвобождать Hsp70 во внеклеточное пространство [Hunter-Lavin et al., 2004; Mambula and Calderwood, 2006]. Как и внутриклеточные, циркулирующие Hsp70 способствуют выживанию клеток в условиях стресса [Robinson et al., 2005]. Установлено, что их уровень в крови коррелирует с выживанием больных, перенесших тяжелые травмы [Pittet et al., 2002]. В то же время показано, что при гипертонической болезни, атеросклерозе, заболеваниях почек, уровень циркулирующего Hsp70 достоверно увеличивается [Pockley et.al., 2002]. Вместе с тем, и у здоровых доноров в ответ на физические нагрузки происходит увеличение концентрации циркулирующего Hsp70 [Pockley, 2002; Campisi and Fleshner, 2003]. Таким образом, высвобождение этого белка может рассматриваться не только в контексте патологического процесса, но может служить нормальным адаптивным ответом на стресс, вызванным физиологическими или физическими факторами, эндогенными сигналами. Внеклеточные HSP70 играют роль медиаторов в процессах клеточных взаимодействий и транспорта белков. После высвобождения этих белков во внеклеточное поверхностью пространство по они могут аутокринному или связываться паракринному с клеточной механизму. Альтернативный механизм клеточного взаимодействия с участием Hsp70 40 может быть связан с мембранными везикулами, содержащими Hsp70. Эти везикулы могут высвобождаться из клеток и затем поглощаться другими клетками за счет слияния мембран или посредством рецепторного взаимодействия [De Maio, 2011]. В одной из первых публикаций на эту тему описано, что после высвобождения Hsp70 из глии во внеклеточное пространство этот белок затем может интернализовываться в окружающие нейроны в аксональной области синапсов, где концентрация внутриклеточного белка меньше, чем в теле нейрона [Tytell et al., 1986]. Разнообразие рецепторов, взаимодействующих с Hsp70 или опосредованно активированных с участием Hsp70, указывает на то, что эти белки взаимодействуют со множеством типов клеток и выполняют целый комплекс функций вне клетки. В нескольких исследованиях продемонстрировано, что HSP70 оказывают различные эффекты на клетки иммунной системы [Srivastava, 2002; Calderwood et al., 2005]. HSP70 обладают иммунорегуляторными свойствами, воздействуя на клетки врожденной иммунной системы через рецепторы клеточной мембраны, такие как CD91 [Basu et al., 2001], TLR2 и TLR4 [Asea et al., 2002], СD40 [Becker et al., 2002]. Как известно, активация CD40 на АПК имеет важную костимулирующую роль для развития Тклеточного ответа и взаимодействия компонентов врожденного и приобретенного иммунитета. Следует учесть, что данные о способности Hsp70 активировать CD40 противоречивы [Becker et al., 2002; Binde, 2009]. Ряд рецепторов к модифицированным липопротеинам из семейства скавенджер-рецепторов, LOX-1 и SREC-1, FEEL-1/CLEVER-1 могут не только связываться с HSP70, но и способствовать интернализации HSP70 [Thériault et al., 2006]. 41 Показано, что Hsp70 может активировать фрагмент С1q системы комплемента и запускать каскад системы комплемента по классическому пути [Prohaszka et al., 2002]. Hsp70 обладает способностью к индукции продукции и высвобождения провоспалительных маркеров. Через связывание с рецепторами TLR2 и TLR4 запускаются воспалительные сигналы в макрофагах, дендритных клетках (ДК), нейтрофилах. Показано, что связывание внеклеточного Hsp70 с TLR2 или TLR4 на плазматической мембране моноцитов и макрофагов вызывает активацию потока ионов Ca2+, чего не происходит при активации этих рецепторов с помошью LPS. В дальнейшем в этих клетках происходит активация транскрипционного фактора NF-kappaβ и усиление экспрессии провоспалительных цитокинов TNFα, IL-1β, IL-6 и IL-12 совместно с активацией CD14 в качестве корецептора [Asea et al., 2000]. При совместной инкубации АПК с внеклеточным Hsp70 возрастает продукция NO, потенциально апоптогенного медиатора [Panjwani et al., 2002]. Таким образом, экзогенный Hsp70 может выступать в качестве сигнала опасности для системы врожденного иммунитета и стимулировать иммунный ответ. Было показано, что за иммунологические эффекты отвечают специфические фрагменты молекулы Hsp70. Пептид, локализованный в Стерминальном домене (359-610 а.о.) индуцирует продукцию хемокинов, созревание ДК, продукцию цитокинов, таких как IL-12, стимулирующих иммунный ответ по типу Th1, тогда как N-терминальный домен такими свойствами не обладает [Wang et al., 2002]. Многие исследователи акцентируют внимание на том, что используемый в экспериментах in vitro рекомбинатный Hsp70 может давать стимулирующий иммунный ответ за счет контаминации LPS. В моделях in vitro на мышиных и крысиных макрофагах было показано, что очищенный от LPS Hsp70 не стимулировал высвобождение воспалительных цитокинов [Gao 42 and Tsan, 2003; Johnson and Fleshner, 2006]. Однако последующие эксперименты с использованием рекомбинантного Hsp70 небактериального происхождения подтвердили способность этого белка проявлять иммунорегуляторные свойства [Zheng et al., 2010]. Было доказано in vivo, что стресс-индуцируемый внеклеточный Hsp70 эндогенного происхождения обладает активирующим действием на клетки иммунной системы [Vega et al., 2008; Kovalchin et al., 2006; Gastpar et al., 2004]. Показано, что Hsp70 может проникать через сосудистую стенку локально в очаг воспаления, обусловленного бактериальным заражением. Локальное увеличение концентрации внеклеточного Hsp70 после стресса коррелировало с усилением иммунного ответа в месте введения патогена, ограничиением распространения очага заражения и более быстрым течением восстановления после заражения. Введение ингибитора проницаемости сосудов (антагониста гистаминовых рецепторов H1 кетотифена) не увеличивало локальную концентрацию внеклеточного Hsp70. Описанные эффекты отменялись при нейтрализации антителами против Hsp70 в очаге воспаления [Johnson and Fleshner, 2006]. Аутоиммунные заболевания, такие как артриты, рассеянный склероз, инсулинзависимый диабет, сопровождаются хроническим воспалением и деструкцией тканей. В крови больных этими заболеваниями повышен уровень циркулирующих HSP в виде потенциальных аутоантигенов, и антител к ним. Описан эффект ингибирования развития процесса хронического воспаления в моделях некоторых аутоиммунных заболеваний при иммунизации экзогенными HSP, в частности, Hsp70 бактериального происхождения. Считают, что этот эффект опосредован активацией популяции низкоаффинных аутореактивных CD4+ регуляторных T-клеток, синтезирующих противовоспалительный иммуносупрессивная Т-клеточная активация цитокин возможна IL-10. в Такая результате узнавания на поверхности АПК эпитопов собственных Hsp70 в комплексе с 43 МНС класса II, высокогомологичных бактериальным эпитопам [Hauet-Broere et al., 2006]. В то же время, известно, что при аутоиммунных заболеваниях стрессиндуцируемая экспрессия Hsp70 на клеточной поверхности усугубляет развитие хронического воспаления. Считается, что происходит активация АПК и Тh1-клеточного ответа при возрастании концентрации аутоантигена Hsp70 за счет высвобождения из поврежденных тканей, а также в результате кросс-реактивности T-клеток на эпитопы собственных Hsp70, гомологичных чужеродным эпитопам Hsp70 патогена. Активации АПК со стороны Hsp70 сопровождается усиленной продукцией иммуностимуллирующего цитокина IFNγ, что обуславливает усиление воспалительного иммунного ответа [Pockley et al., 2008]. Как было доказано в моделях на крысах, HSP70 может оказывать антисептическое действие и эффективно защищать от эндотоксинового шока, а также модулировать ответ миелоидных клеток при стимуляции LPS, увеличивая выживаемость и стабилизируя гемостаз и ряд других гемодинамических характеристик [Rozhkova et al., 2010]. Hsp70 был обнаружен на поверхности многих опухолевых клеток, в том числе в комплексе с опухолевыми антигенами [Multhoff et al., 1997; Sapozhnikov et al., 2002]. Поверхностная экспрессия Hsp70 на опухолевых клетках играет важную роль в клеточных взаимодействиях, усиливая распознавание опухоли клетками иммунной системы [Bausero et. al., 2005]. Все эти особенности HSP легли в основу изучения противоопухолевой активности HSP70 в составе вакцин. Иммунизация комплексом HSP70опухолевый пептид усиливает синтез антител к пептидам, снижает уровень метастазирования опухолевых клеток в мышиных моделях, благодаря активации специфического СD8+ T-клеточного ответа, тогда как введение чистого HSP70 такого эффекта не вызывает [Udono H. and Srivastava P.K. 1993]. Противоопухолевые вакцины на основе HSP70 потенциально 44 стимулируют не только адаптивный, но и врожденный противоопухолевый иммунитет. Это возможно благодаря взаимодействию молекул NKG2A на поверхности NK-клеток с молекулой Hsp70, экспрессируемой опухолевым клетками [Srivastava, 2002]. В то же время, описаны механизмы с участием Hsp70, которые обеспечивают активацию роста опухоли. В основном это связано с уже описанным ранее противоапоптозным действием HSP70, а также за счет взаимодействия Hsp70 с незрелыми формами клеток миелоидного происхождения MDCS с фенотипом CD11b+CD33+HLA-DR– (у человека) или Ly-6C/G CD11b (у мышей), количество которых в организме, где развивается опухоль, возрастает. При воздействии на MDCS опухолевыми экзосомами, содержащими Hsp70, индуцируется антиген-специфическая толерантность CD8+ T-клеток. Молекула Hsp70 может запускать активацию в MDCS транскрипционного фактора Stat3 через TLR2 и аутокринную продукцию IL6 [Chalmin et al., 2010]. Внеклеточные HSP70 рассматриваются как шаперокины, то есть проявляют свою активность не только в качестве шаперонов, но и цитокинов [Asea et al., 2000]. Преобладающее большинство литературных данных, освещающих внеклеточные функции HSP70, относятся к индуцируемой форме этого белка Hsp70, но среди них встречаются публикации, в которых описывается роль конститутивной формы Hsc70 вне клетки. Так, на тепловой ответ в нервных клетках активируется синтез не только Hsp70, но также процесс транслокации эксперссируемого Hsc70 в области синапсов, где эта молекула осуществляет нейропротективные функции во время стресса [Chen and Brown, 2007]. Таким образом, можно сделать вывод, что влияние, оказываемое in vitro и in vivo внеклеточным Hsp70, может быть активирующим или ингибирующим. Эти эффекты зависят от множества факторов. К таким 45 факторам относятся происхождение Hsp70 (из нормальной клетки, из клетки, инфицированной вирусом, из опухолевой клетки, из бактерии); локализация белка (циркуляция или транслокация на внешней клеточной поверхности); вид стресса (окислительный стресс, бактериальная или вирусная инфекция, физическая нагрузка). 1.4.4. HSP70 в нейтрофилах На основании морфологических данных об особенностях хроматиновой структуры ядра ретикулума и и незначительном количестве рибосом некоторое время препрограммированы на эндоплазматического считали, что функционирование без нейтрофилы значительной биосинтетической активности [Сline, 1966; Murphy, 1976]. Позднее было обнаружено, что в этих клетках происходит активация генов и синтез белков, в частности ряда хемокинов, и что это играет значительную роль в клеточных взаимодействиях при воспалении [Jack and Fearon, 1988; Shaun et al., 1992; Beaulieu et al., 1992]. С помощью метода включения меченого метионина [35S] и разделения клеточного лизата в градиентном геле была продемонстрирована способность нейтрофилов синтезировать Hsp70 [Eid et al., 1987]. Несмотря на то, что ранее считалось, что Hsp70 экспрессируется на поверхности лишь опухолевых клеток [Multhoff et al., 1995], была определена локализация Hsp70 на поверхности нейтрофилов [Giraldo et al., 2010]. Внеклеточные Hsp70 стимулируют хемотаксис нейтрофилов, и этот эффект является дозозависимым [Ortega et al., 2009]. Индукция HSP70 в апоптозных нейтрофилах способствует усилению продукции TNFα макрофагами [Zheng et al., 2004]. 46 1.5. HSP70 и окислительный стресс В модели эндотелиальных клеток была исследована возможность окислительного стресса индуцировать экспрессию HSP. Нагревание, добавление H2O2 и последующий анализ с помощью Вестерн-блоттинга показал, что ТШ индуцирует быстрое и значительное увеличение уровня мРНК Hsp70. Добавление H2O2 тоже приводит к такому эффекту, но количество накопленных мРНК на порядок меньше. Кинетика синтеза Hsp70 коррелирует с накоплением мРНК [Jornot et al., 1991]. Продемонстрировано, что шаперонная активность очищенных Hsp70 и Hsc70 возрастает в условиях окислительного стресса [Callahan et al., 2002]. У трансгенных по Hsp70 дрозофил экспрессия Hsp70 увеличивается при усилении продукции АФК, что дает авторам основание предположить наличие совместной работы HSP и антиоксидантных компонентов [Gupta et al., 2007]. Экзогенный HSP70 значительно ингибирует LPS-индуцированную продукцию АФК в различных миелоидных клетках [Rozhkova et al., 2010]. Показано, что ТШ или обработка клеток ионами металла кадмия, которые индуцируют синтез HSP, в том числе Hsp70, в нейтрофилах вызывают временное ингибирование NADPH-оксидазы, без изменения их фагоцитозной активности. [Maridonneau-Parini et al., 1988]. Однако в безъядерных цитопластах после воздействия ТШ продукция O2* также временно ингибируется, вероятно, потому, что ТШ изменяет механизм транслокации и сборки компонентов NADPH-оксидазы. С другой стороны, первичное нагревание нейтрофилов, предотвращало ингибирование продукции O2* при вторичном нагревании, что, могло быть связано с термотолерантностью. При блокировании синтеза HSP во время первичного нагревания, эффект ингибирования NADPH- оксидазы выявлялся вновь во время повторного ТШ. Таким образом, была продемонстрирована взаимосвязь между защитным механизмом от продукции O2* и синтезом HSP, 47 однако не исключено, что активность NADPH-оксидазы и синтез HSP являются хотя и сопутствующими, но не прямо связанными явлениями [Maridonneau-Parini et al., 1993]. В то же время продемонстрировано взаимодействие HSP70 и NOX4 (конститутивно активный фермент NADPH- оксидазы, преимущественно экспрессируемый в гладкомышечных клетках) в клетках проксимальных почечных канальцев. После транслокации HSP70 на мембрану активность NADPH-оксидазы уменьшается, чего не наблюдается при инкубации с антителами против HSP70. Таким образом, транслокация HSP70, снижая активность NOX4, оказывает цитопротективный эффект [Bocanegra et al., 2010]. 1.6. Механизмы секреции HSP70 В настоящее время известно, что высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство может происходить как пассивным путем при клеточной гибели путем некроза, так и посредством активной секреции [De Maio, 2011]. Продемонстрировано, что апоптоз, индуцированный облучением, не приводит к высвобождению HSP70, тогда как некроз, вызванный многократным замораживанием и оттаиванием, приводит к выбросу клеточного содержимого, в том числе и HSP70 [Basu et al., 2000]. Механизмы активного высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство до сих пор обсуждаются. Считается, что HSP70 не секретируются по механизму классического экзоцитоза, так как аминокислотная последовательность молекул внутриклеточных HSP70 не содержит лидирующего пептида, который необходим для экзоцитоза по классическому механизму через систему транспорта ЭПР-Гольджи [Mambula et al., 2007]. Однако полученные иммуногистохимическими методами данные указывают на то, что в клетках HeLa новосинтезированная молекула Hsp70 48 локализуется в комплексе Гольджи [Schneider et al., 2002]. Несмотря на то, что в большинстве исследований ингибитор классического экзоцитоза брефелдин А не оказывал влияния на уровень секреции белка, есть данные, что в клетках карциномы А431 брефелдин А все же ингибировал процесс высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство [Evdonin et al., 2006]. Подобно молекулам без лидирующей последовательности IL-1α и -1β, для которых известны несколько механизмов высвобождения, в литературе также описаны разнообразные альтернативные пути высвобождения Hsp70 в отсутствие некроза, реализованные по неклассическому механизму секреции или нетрадиционными путями. Для IL-1β описан путь секреции в составе секреторных лизосомных эндосом, или эндолизосом, которые сливаются с плазматической мембраной и высвобождают свое содержимое во внеклеточное пространство[Andrei et al., 1999]. Hsp70 был обнаружен внутри лизосом [Nylandsted et al., 2004]. Впоследствии возможность высвобождения HSP70 в составе секреторных эндосомальных лизосом была показана для некоторых опухолевых клеток и макрофагов. Предполагается, что в процессе транслокации Hsp70 в лизосому может участвовать транспортная система ABC-транспортеров (АTP-binding cassette) [Mambula and Calderwood, 2006]. В то же время представлены данные, что в клетках производных кератиноцитов в высвобождение Hsp70 вовлечен везикулярный транспорт, при котором секреторные гранулы, содержащие Hsp70, не несут специфических маркеров эндосом, лизосом и липидов, но несут маркер секреторных гранул – хромогранин А [Evdonin et al., 2006]. Одним из альтернативных механизмов рассматривается выход во внеклеточное пространство в составе секреторных внеклеточных везикул, к которым относят экзосомы, микрочастицы и эктосомы. Экзосомы представляют собой везикулы, образованные из плазматической мембраны в результате эндоцитоза и упакованные в мультивезикулярные тельца в 49 результате инвагинации эндосомной мембраны. Эти тельца могут сливаться с клеточной поверхностью и экзосомы высвобождаются наружу. Этот механизм отличается от механизма образования микрочастиц и эктосом непосредственно из плазматической мембраны в результате ее выпячивания. Высвобождение Hsp70 в составе экзосом наблюдали в макрофагах [Bhatnagar et al., 2007], в В-клетках, подвергнутых ТШ, и в мононуклеарных клетках, нативных и стрессированных нагреванием [Clayton et al., 2005; Hunter-Lavin et al., 2004; Lancaster and Febbraio,2005]. Экзосомный механизм высвобождения Hsp70 описан при стимуляции провоспалительными цитокинами IFNγ и IL-10 опухолевых клеток [Bausero et al., 2005]. Следует уточнить, что при такой стимуляции высвобождение в экзосомах было частичным, так как Hsp70 высвобождался и в свободной форме. Одним из факторов, способствующих высвобождению Hsp70 в составе экзосом, может являться активация симпатической нервной системы. Высвобождение норадреналина и последующая активация α1-адренорецепторов увеличивает запас внутриклеточного Ca++, что, как считают авторы, может стимулировать секрецию экзосом с содержащимся в них Hsp70 [Johnson and Fleshner, 2006]. Более того, по всей видимости, существует два пути высвобождения Hsp70 в составе экзосом. В ответ на ТШ на В-лимфоцитах увеличивается количество высвобождаемых экзосом, содержащих внутри Hsp70 [Clayton et al., 2005], в то время как в моноцитах человека в ответ на стресс увеличивается концентрация Hsp70 внутри и на поверхности экзосом без увеличения их количества [Lancaster and Febbraio, 2005]. Также было показано, что после стресса Hsp70 интегрируется в липидный бислой мембраны и высвобождается во внеклеточное пространство в мембрано-ассоциированном состоянии в виде везикул. Внеклеточные мембраны, заключающие в себе Hsp70, многократно эффективнее, чем очищенный рекомбинантный белок, индуцировали продукцию ТNFα на макрофагах в качестве индикатора их активации, 50 возможно, за счет многократно увеличенной локальной концентрации Hsp70 [Vega et al., 2008]. В настоящее время известно, что Hsc70 тоже детектируется вне клетки. Легкая стимуляция IFN-γ и IL-10, не приводящая к развитию клеточной смерти, индуцировала активный процесс высвобождения Hsc70 из опухолевых клеток в составе экзосом [Barreto et al., 2003]. На клетках почки хомячка BHK-21 было показано, что в секрецию Hsp70 и Hsc70 не вовлечены экзосомы, и эта секреция не зависит от синтеза белка de novo. Зато метил-β-циклодекстрим, вещество, которое разрушает детергент-устойчивые микродомены – липидные рафты, уменьшает секрецию обоих белков HSP70. [Evdokimovskaya et al., 2010]. Хотя в уже упомянутой работе [Lancaster and Febbraio, 2005] в мононуклеарных клетках человеческой периферической крови метил-β-циклодекстрим не влияет на процесс высвобождения белка, а значит, этот процесс не затрагивает липидные рафты. Целый пласт исследований посвящен изучению взаимодействия Hsp70 с мембраной, что могло бы обяснить механизм появления Hsp70 на клеточной поверхности. Белки Hsp70 и Hsc70 способны интегрироваться в липидный бислой липосом, где участвуют в формировании АТФ/ АДФ-зависимых катионных каналов, а также индуцируют агрегацию липосом [Arispe et al., 2002]. Кинетика агрегации и проводимость каналов отличается для Hsp70 и Hsc70. Позже было продемонстрировано, что специфичность этих белков к липидной мембране коррелирует с экспрессией фосфатидилсерина на мембране [Arispe et al., 2004]. Таким образом, до сих пор не известен универсальный или преимущественный механизм секреции HSP70 для клеток иммунной системы вообще и для нейтрофилов в частности. 51 1.7. Причины и иммунологические аспекты процесса старения 1.7.1. Основные теории развития старения Изменения экспрессии специфических генов, случайные накапливающиеся множественные молекулярные повреждения, нарушение устойчивости к клеточному стрессу, клеточное старение рассматриваются как важнейшие факторы старения организма [Franceschi et al., 2000а; Kirkwood, 2005; Saunders and Verdin, 2009]. Известная теория старения Хармана основана на том, что накопление молекулярных повреждений клеток и тканей, вызванное чрезмерным образованием АФК, является одной из основных причин, определяющих развитие процесса старения, и индукция окислительного стресса вовлечена в патогенез ассоциированных с возрастом заболеваний [Harman, 1956]. Накоплено много данных, как подтверждающих такую теорию старения, так и противоречащих ей [Balaban et al., 2005]. Поэтому теория Хармана пересматривалась и дополнялась несколько раз. В настоящее время повреждающие эффекты АФК в старении рассмотриваются во взаимосвязи с нарушениями в защитной системе клеток и нарушении белкового гомеостаза [Kregel and Zhang, 2007; Höhn et al., 2013]. Некоторые авторы считают, что усиление продукции АФК, а также накопление повреждений, вызванных окислительной модификацией молекул, могут сопровождать старение, но не являются его причиной [Blagosklonny, 2012a; Edrey and Salmon, 2014]. Одна из новейших теорий старения рассматривает этот процесс как квазипрограммируемую часть жизненного цикла, связанную с работой сигнального пути mTOR. Гиперактивация TOR ускоряет процесс старения, что частично проявляется в развитии возрастных заболеваний, которые являются признаком старения. Факторы, замедляющие пути развития метаболизма mTOR, замедляют старение и «отодвигают» развитие возрастных заболеваний, увеличивая продолжительность жизни. Согласно этой теории, увеличение продукции АФК и накопление случайных 52 молекулярных повреждений способствуют преждевременному проявлению возрастных заболеваний и ограничивают продолжительность жизни гораздо медленнее, чем старение и смерть, спровоцированные активацией TOR-пути [Blagosklonny, 2008]. Изменения в иммунной системе также играют важную роль в старении человека. Было замечено, что иммунная система пожилых людей часто характеризуется состоянием хронического воспаления, так называемого "Inflamm-aging" [Franceschi et al., 2000b]. Одной из особенностей этого состояния является постоянная слабая активация макрофагов и нейтрофилов в организме. 1.7.2. Ассоциированные с возрастом изменения в нейтрофилах Известно, что патогенез ряда заболеваний, связанных с возрастом, таких как рак, ревматоидный артрит, нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания, прямо или косвенно опосредован изменениями активности нейтрофилов [Edwards and Hallett, 1997; Halliwell, 1989; Jaillon et al., 2013]. С одной стороны, недостаточная активация нейтрофилов приводит к повышению восприимчивости к бактериальным инфекциям в пожилом возрасте. С другой стороны, чрезмерная активность нейтрофилов, например, связанная с задержкой апоптоза, может быть разрушительной для самих клеток-продуцентов и тканей из-за индукции хронического воспаления. Многочисленные исследования показывают, что нейтрофилы изменяются в процессе старения. Однако существуют значительные противоречия в данных, описывающих изменения в функционировании нейтрофилов. С одной стороны известно, что при старении количество циркулирующих нейтрофилов остается неизменным [Fortin et al., 2008], в то же время есть данные, что хроническое воспаление у пожилых доноров может быть связано с нейтрофилией и повышением уровня воспалительных белков [FerrandoMartínez et al., 2013]. Многие функции нейтрофилов – хемотаксис, фагоцитоз, 53 внутриклеточное переваривание и формирование нейтрофильных ловушек – изменяются со старением [Fulop et al., 2004; Hazeldine et al., 2014]. Спонтанный апоптоз нейтрофилов остается неизменным или незначительно увеличивается, однако цитокин-опосредованная задержка апоптоза при старении нарушается [Tortorella et al., 1998; Fulop et al., 1997]. Снижение антиоксидантной защиты в нейтрофилах пожилых людей способствуют сокращению времени жизни этих клеток [Oishi et al., 1997; Tortorella et al., 2006]. В то же время недавно у пожилых доноров было продемонстрировано наличие долгоживущих нейтрофилов [Solana et al., 2012]. Индуцированный ответ нейтрофилов на раздражитель в виде продукции АФК с возрастом у людей снижается [Fortin et al., 2008]. В то же время, уровень спонтанной продукции АФК нейтрофилами с возрастом, как правило, увеличивается и вносит вклад в развитие хронических воспалительных процессов, часто регистрируемых в пожилом возрасте [Ogawa et al., 2008; Squier, 2001; Peters et al., 2009]. 1.7.3. HSP70 при старении Один из механизмов защиты клеток от неблагоприятных последствий действия АФК может обеспечиваться высоко консервативными HSPs посредством участия в правильной укладке белка и предотвращении их агрегации [Bernadett et al., 2009; Niforou et al., 2014]. При повреждении HSP70-зависимых механизмов нарушается белковый гомеостаз, что может быть одним из факторов, ускоряющих старение. Это предположение вызвало серию исследований возрастных изменений экспрессии HSP70. Анализ данных позволяет заключить, что параметры внутриклеточного и сывороточного содержания HSP70 зависят от возраста. В частности, было показано, что базальный внутриклеточный уровень HSP70 в мононуклеарных клетках крови выше у пожилых доноров, чем у молодых [Njemini et al., 2007]. Напротив, способность этих клеток индуцировать в ответ на стресс синтез 54 HSP70, как и другие типы реакции на стресс, снижается с возрастом [Njemini et al., 2002; Calderwood et al., 2009]. Как уже обнаруживаются упоминалось, в норме, но циркулирующий его уровень в сыворотке меняется с Hsp70 возрастом. Концентрация Hsp70 в сыворотке у людей старше 90 лет, т.е долгожителей, резко снижается по сравнению с молодыми донорами до 40 лет, тогда как уровень антител к этому белку наоборот, имеет тенденцию к увеличению с возрастом, что, как утверждают авторы, демонстрирует снижение с возрастом отвечать на стресс [Rea et al., 2001; Njemini et al., 2011]. Выявлена положительная взаимосвязь между сывороточным уровнем Hsp70 и маркерами воспаления (TNF-α, С-реактивный белок, фибриноген) у пожилых людей, что подтверждает вовлеченность этих белков в вопалительные заболевания при старении [Njemini et al., 2004]. В то же время было показано, что уровень сывороточного Hsp70 связан с продолжительностью жизни [Terry et al., 2006]. В нейтрофилах у пожилых доноров была выявлена взаимосвязь между определенным параметром продукции АФК и уровнем HSP70 в плазме крови [Ogawa et al., 2008]. Таким образом, нейтрофилы как источник внутриклеточных и внеклеточных форм АФК играют значительную роль в процессе старения организма. В связи с этим представляется важным разностороннее изучение возрастных изменений взаимосвязи содержания белков HSP70, на которых основан один из механизмов защиты клеток, с продукцией нейтрофилами АФК. 55 II. Материалы и методы 2.1. Реагенты Моноклональные антитела: анти-HSP70 (клон BRM-22, Sigma-Aldrich, CША), анти-Hsp70 (клон С92F3A-5, Enzo Life Sciences, США), анти-Hsc70 (клон 1B5, Enzo Life Sciences, США), анти-β-актин (клон AC-15, SigmaAldrich, США); CD63-FITC (BioLegend, США); CD66b-FITC (BioLegend, США); CD107a-PE-Cy5 (клон eBioH4A3, eBioscience, США); CD14-PE (Сорбент, РФ). Поликлональные антитела: анти-NOX2/gp91phox (Abcam, США); антиHsp70/Hsc70 (Santa-Cruz Biotechnology, США); анти-Fab-фрагмент IgG мыши (Sigma-Aldrich, США) или крысы (eBioscience, США), PE-конъюгированные; анти-Ig мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США), анти-Ig кролика, AF488-конъюгированные (Life Technologies, США) (где FITC – флуоресцеинизотиоцианат, PE – фикоэритрин, PE-Cy5 –цианофикоэритрин, AF488 – Alexa Fluor 488 нм. Реагенты для выделения нейтрофилов из периферической крови человека и подготовки образцов: градиентная среда для выделения Polymorphprep (Axis-Shield, Швеция); фосфатно-солевой буфер DPBS, pH 7.2-7.4; бесцветный раствор Хэнкса; синтетическая среда RPMI-1640 (все ПанЭко, РФ); эмбриональная телячья сыворотка HyClone (Thermo Scientific, США); L-глутамин (ПанЭко, РФ); HEPES; циклогексимид, глибенкламид (все Sigma-Aldrich, США); хлорид аммония (Химмед, РФ). Реагенты для оценки жизнеспособности, фиксации и пермеабилизации нейтрофилов: трипановый синий (ПанЭко, РФ); пропидия йодид (PI) (SigmaAldrich, США). Параформальдегид (Riedel-de Haen, Германия); тритон X-100 (Хеликон, РФ); бычий сывороточный альбумин (BSA) (ПанЭко, РФ); набор для внутриклеточного окрашивания Cytofix/Cytoperm (Beckton Dickinson, США). Реагенты для лизирования нейтрофилов и Вестерн-блоттинга: смесь ингибиторов протеаз (Thermo Scientific, США); реагент Брэдфорда (BioRad, 56 США); нитроцеллюлозная мембрана (Sigma-Aldrich, США); Tween 20 (Хеликон, РФ); обезжиренное сухое молоко (Roth, Германия); диаминобензидин (Sigma-Aldrich, США); акриламид, бис-акриламид (ПанЭко, РФ); натрия додецилсульфат (SDS) (Panreac, США); персульфат аммония (PSA) (Sigma-Aldrich, США); преокрашенный маркер малекулярных масс (Bio-Rad, США); неорганические соли (Пан-Эко, РФ). Реагенты для определения АФК: 2’-7’-дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) (Invitrogen, США); люминол (Serva, Германия); зимозан A; формил-метил-лейцил-фенилаланильный пептид (fMLP) (все Sigma Aldrich, США). Реагенты для выделения тотальной РНК, обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (PCR) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR): TRIzol реагент (MRC, Великобритания); РНК-аза А (Sigma-Aldrich, США); ДНКаза I (Thermo Scientific, США); обратная транскриптаза MINT; реакционная смесь для RTPCR qPCRmix-HS SYBR (все Евроген, РФ); набор для проведения PCR GenPak PCR MasterMix Core (Isogene Lab., РФ). 2.2. Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов Образцы периферической крови доноров получали при условии информированного добровольного согласия доноров, в соответствии с основными этическими принципами проведения медицинских исследований, изложенными в Хельсинской декларации. В корреляционный анализ были включены данные от 65 добровольцев обоих полов. Группу молодых составили 26 доноров в возрасте от 20 до 59 лет (медиана 30.5 лет, 13 мужчин, 13 женщин); группу пожилых доноров составили 24 добровольца в возрасте 60-89 лет (медиана 73.5 года, 9 мужчин, 15 женщин); в группу долгожителей вошло 15 доноров в возрасте 90 лет и старше (медиана 91 год, 7 мужчин, 8 женщин), наблюдающихся в Российском геронтологическом 57 научно-клиническом центре. Критериями включения добровольцев в исследование являлись отсутствие у них патологии в активной фазе (острые инфекции, опухоль, инсульт, инфаркт), лечения кортикостероидами или нестероидными противовоспалительными средствами, способность самообслуживания. Периферическую кровь собирали закрытым способом в стерильные пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта гепарин (Vacutube, Италия). Начало выделения клеток производили не позднее двух часов после забора крови. Процедуру выделения нейтрофилов проводили по методике градиентного разделения клеток с использованием коммерческой среды Polymorphprep. Цельную кровь наслаивали на среду в соотношении 1:1, затем проводили центрифугирование в течение 30 мин при 500 g и 23°C в режиме без торможения. Собирали нижнюю интерфазу, соответствующую популяции полиморфноядерных лейкоцитов (нейтрофилов), с последующей двукратной отмывкой при 400 g в течение 15 мин в DPBS, или, в случае измерения внутриклеточных АФК, в растворе Хэнкса. После процедуры отмывки нейтрофилы переводили в среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ Lглутамина, с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 15 mM HEPES (полная среда). В этой среде проводили все последующие манипуляции с клетками. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью окрашивания трипановым синим (она составляла, как правило, более 95%). Готовили образцы, содержащие по 500 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2×106 клеток/мл. Часть образцов подвергали нагреванию на термостатируемой водяной бане (BioSan, Латвия). Контрольные образцы, а также образцы подвергнутые тепловому шоку (далее ТШ) до момента окрашивания антителами инкубировали необходимый период времени (5 мин, 30 мин, 60 мин и т. д.) в условиях повышенной влажности, при температуре 37°C в атмосфере с 5% СО2. 58 В ряде экспериментов перед ТШ проводили предварительную инкубацию нейтрофилов с глибенкламидом (0.5 мМ, 2 ч), хлоридом аммония (50 мМ, 2 ч) либо циклогексимидом (100 мкМ, 30 мин). 2.3. Проточная цитофлуориметрия В работе использовали цитофлуориметр FACSСalibur (BD Biosciences, США), укомплектованный двумя лазерами 488 и 640 нм со стандартными детекторами и фильтрами. Нейтрофилы определяли по морфологическим параметрам на диаграмме малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния и по окрашиванию антителами CD14 либо СD66b. Метод проточной цитометрии использовали для оценки в нейтрофилах внутриклеточного уровня HSP70, поверхностной локализации HSP70, внутриклеточной продукции АФК, поверхностной экспрессии маркеров дегрануляции. При каждом цитометрическом измерении анализировали не менее 5000 событий в выделенном регионе. Данные обрабатывали с помощью специализированных программ для обсчета цитометрических данных CellQuest ver. 3.3 (BD Biosciences, США), и FlowJo ver. 7.6.2. (FlowJo, LLC Software, Ashland, США). 2.3.1. Оценка жизнеспособности нейтрофилов После выделения нейтрофилов клетки окрашивали трипановым синим, доля живых нейтрофилов (не окрашенных реагентом) составляла не менее 95%. Процентное содержание некрозных и апоптозных клеток в образцах нейтрофилов определяли с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя PI. Для определения некрозных (PI-позитивных) нейтрофилов окрашивание образцов, содержащих живые интактные либо подвергнутые гипертермии нейтрофилы после их часовой инкубации, проводили в растворе DPBS, содержащем 2 мкг/мл PI. Для определения апоптозных клеток образцы фиксировали в охлажденном 70% растворе этанола (60 мин) с последующей двукратной 59 отмывкой, и переводили для измерения в раствор DPBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 50 ед./мл РНК-азы А. В каждом образце проводили подсчет не менее 10x103 нейтрофилов в популяции, включающей как живые, так и погибшие клетки. Клетки с пониженным содержанием ДНК оценивали как апоптозные. 2.3.2. Цитометрический анализ внутриклеточного уровня HSP70 Перед окрашиванием антителами внутриклеточных белков HSP70 предварительно проводили процедуру фиксации и пермеабилизации нейтрофилов. Для этого использовали фиксирующий буферный раствор на основе DPBS, содержащий 4% параформальдегида, и перфорирующий буферный раствор на основе DPBS, содержащий 0.2% BSA и 0.1% тритона X-100, смешанные в соотношении 1:1. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензии нейтрофилов проводили в перфорирующем буферном растворе в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей двукратной отмывкой после каждой стадии окрашивания в этом же буферном растворе. Уровень содержания HSP70 вычисляли по интенсивности флуоресценции в условных единицах с учетом с учетом уровня флуоресценции клеток в образцах, обработанных только вторыми антителами. Разбросы данных представлены в виде стандартной ошибки среднего. 2.3.3. Цитометрический анализ поверхностной экспрессии HSP70 и маркеров дегрануляции Уровень поверхностной экспрессии HSP70 сравнивали в образцах интактных клеток и в образцах, подвергнутых ТШ. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензии нейтрофилов первичнымими антителами (коммерческими антителами к HSP70, Hsp70, Hsc70, гибридомными антителами к разным концевым участкам белков HSP70) проводили через 30 мин после окончания нагревания в полной среде в объеме 100 мкл (30 мин при 4°C). После двукратной отмывки раствором PBA (DPBS с добавлением 60 0.2% BSA и 0.05% NaN3) проводили окрашивание вторичнымими флуоресцентномечеными антителами в растворе PBA (30 мин при 4°C). Вновь клетки отмывали, ресуспендировали в PBS и подвергали цитометрическому анализу. Использовали рекомендованное производителем количество антител, в некоторых случаях проводили их предварительную титровку. Уровень поверхностной экспрессии HSP70 вычисляли в условных единицах, аналогично внутриклеточному уровню HSP70. Аналогичную процедуру иммунофлуоресцентного окрашивания проводили для анализа поверхностной экспрессии СD63, CD66b, CD107a. В положительном контроле нейтрофилы активировали индуктором окислительного взрыва и дегрануляции fMLP (2 мкМ). 2.3.4. Цитометрическое измерение внутриклеточной продукции АФК Спонтанную продукцию АФК в нейтрофилах определяли с помощью DCFH-DA, уровень флуоресценции которого пропорционально зависит от внутриклеточной концентрации основного продукта АФК – пероксида водорода. К образцам нейтрофилов, переведенных в полную среду в объеме 500 мкл, добавляли DCFH-DA в конечной концентрации 5 мкг/мл. Затем проводили инкубацию образцов при 37°C в атмосфере 5% СО2 в течение 20 мин для проникновения DCFH-DA в клетки, после которой клетки двукратно отмывали холодным DPBS при 4°C. Флуоресценцию клеток, облученных лазером 488 нм, анализировали в канале FL1. 2.4. Анализ внутриклеточного содержания HSP70 методом Вестернблоттинга Нейтрофилы в количестве 2-5 млн лизировали буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl (pH7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ Na2EDTA, 1% тритон X-100 и смесь ингибиторов протеаз в объеме 100 мкл в течение 5 мин на льду. После центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин отбирали надосадок и 61 проводили измерение концентрации тотального белка в лизированных образцах нейтрофилов Фракционирование с белков использованием проводили в реагента условиях Брэдфорда. денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле с концентрацией разрешающего геля 10%. Общее количество белка, вносимого в лунку, в каждом образце было выравнено и составляло в среднем 50 мкг/лунку. После процедуры переноса на нитроцеллюлозную мембрану, проводили блокирование мембраны в буфере T-TBS (20 мМ Трис-HCl (pH7.6), 138 мМ NaCl, 0.1% Tween 20) c 5% содержанием обезжиренного сухого молока с последующей отмывкой в T-TBS. Затем мембрану окрашивали моноклональными антителами против HSP70 (BRM22) и β-актина (AC-15), разведенных в TTBS с 5% BSA в течение 12 ч при 4°C с последующей двукратной отмывкой, а затем антителами против Ig мыши, меченных пероксидазой хрена. Иммуноблот проявляли, используя субстрат, содержащий диаминобензидин и перекись водорода (0.003%). Результат фиксировали с помощью системы гель-документации (Vilber Lourmat, Франция). Анализ блотов проводили в программе обработки денситомтерических даных ImageJ 1.38х (Wayne Rasband, NIH, США). 2.5. Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции Для индукции избыточной продукции АФК нейтрофилы (1 млн/мл) стимулировали зимозаном A, опсонизированным свеже приготовленной сывороткой от 10 доноров, в конечной концентрации 20 мг/мл. Реакцию проводили при 37°C в 96-луночных темных планшетах (SPL, Корея) в 200 мкл раствора Хэнкса с добавлением 1 µM люминола. Уровень хемилюминесценции в образцах измеряли на хемилюминометре 3603 (Dialog Joint Venture, Moscow), регистрируя число импульсов в минуту (cpm). Спонтанную продукцию АФК измеряли в точке инициации реакции. За уровень зимозан-индуцированной продукции АФК брали максимальное 62 значение cpm, которое регистрировали в течение 30 мин. Каждый образец измеряли в дублях. 2.6. Статистический анализ данных Анализ данных и статистическую обработку проводили в программе SigmaPlot версия. 11.0 (Systat Software Inc., США). При наличии нормального распределения для анализа достоверности различий между двумя группами использовали параметрический t-тест для независимых выборок. При отсутствии нормального распределения данных для анализа, применяли непараметрический корреляционного тест анализа Манна-Уитни использовали (U-test). метод Для ранговой проведения корреляции Спирмана. Достоверными считались различия между группами при р<0.05. 2.7. Измерение транскрипционной активности генов HSP70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR) Тотальную РНК для каждого образца выделяли из 6х106 нейтрофилов с использованием TRIzol-реагента в соответствии с инструкцией производителя. Образцы выделенной РНК подвергали обработке ДНКазой I с целью избавления от возможной примеси тотальной ДНК. Измерение концентрации выделенной РНК (нг/мкл) производили на спектрофотометре NanoVue Plus при длинах волн 260/280 нм (GE Healthcare Life Science, Великобритания). Концентрацию рассчитывали с использованием калибровочной кривой. Процедуру обратной транскрипции для синтеза кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы MINT и рандомных гексамерных праймеров по методике, указанной в прилагаемой производителем инструкции. Гексамерные праймеры (12 пмоль) добавляли в смесь объемом 10 мкл, содержащую 2 мкг тотальной РНК. Смесь прогревали в течение 2 мин при 70°C, а затем переносили в лед на 10 мин. Для инициации реакции синтеза кДНК, реакционную смесь инкубировали при 42°C и 70°C в течение 120 и 15 мин, соответственно. Специфические 63 праймеры (5’-3’) к отдельным генам белков HSP70 и референсному гену были подобраны с помощью программного обеспечения Primer Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и программы OligoAnalyzer 3.1. Были выбраны и синтезированы (Евроген, РФ) следующие последовательности (название гена: прямой праймер, обратный праймер). HSPA1: AGGTGCAGGTGAGCTACAAG, CTCGGCGATCTCCTTCATC; HSPA8: TGCTGCTCTTGGATGTCACT, AAGGTCTGTGTCTGCTTGGT; b-актин:CACCACACCTTCTACAATGAG, GTCTCAAACATGATCTGGGTC. b-Актин использовали в качестве референс-гена, для нормализации количества кДНК в каждой временной точке измерения. Специфичность подобранных праймеров проверяли после проведения PCR и электрофореза продуктов PCR в 3% агарозном геле по наличию одного продукта с ожидаемой мол. массой. 2.7.1. Проведение qRT-PCR Экспрессию генов в режиме qRT-PCR оценивали в образцах интактных, подвергнутых ТШ при разных режимах ( 43°C, 10 мин; 40°С, 40 мин) спустя разные промежутки времени после окончания тепловой обработки. Каждый образец для проведения qRT-PCR (конечный объем составил 25 мкл) содержал 5 мкл коммерческой реакционой смеси qPCRmix-HS SYBR, 1 мкл 3 mM праймеров (прямого и обратного), 0.5 мкл кДНК и 17.5 мкл подготовленной (очищенной от РНК) воды. Реакцию амплификации проводили на приборе LightCycler480 (Roche Diagnostics, Германия). Применяли следующий протокол: прединкубация (95°C, 5 мин), затем 40 циклов, включающих режимы денатурации (95°C,10 с), отжига праймеров (60°C,10 с), и удлинения ДНК (72°C, 10 с). Перед окончанием реакции амплификации, кривая диссоциации была представлена в виде графика, чтобы подтвердить специфичность продукта. Каждую точку для амплификации вносили в триплетах. Для коррекции количества внесенного 64 материала в каждой временной точке, анализ результатов проводился с нормализацией по эндогенному референс-гену b-актину. 2.7.2. Статистическая обработка данных RT-PCR Уровень накопления мРНК оценивали по алгоритму с определением коэффициента эффективности отжига праймеров. Для этого использовали программные приложения LightCycler480 версия SW 1.5.1, Exor4, LinRegPCR, LC480Conversion. Разбросы данных представлены в виде стандартной ошибки среднего. 2.8. Оценка внеклеточного уровня HSP70 с помощью ИФА Уровень внеклеточного содержания HSP70 оценивали в супернатантах образцов нейтрофилов с помощью наборов для иммуноферментного анализа. В работе использовали два типа набора: для определения Hsp70 (Enzo Life Sciences, США) и Hsc70 (StressMarq, Канада). Для анализа отбирали культуральную жидкость из образцов, которые не подвергали ТШ (контроль), сразу после проведения ТШ, а также спустя разные промежутки времени после окончания ТШ. До проведения ИФА супернатанты держали замороженными при -20°С. Культуральную жидкость, отобранную из восьми идентичных образцов (2 млн/мл, 500 мкл), концентрировали на приборе SpeedVak Concentrator (ThermoSavant, CША) в 10 раз. В лунки планшета с иммобилизованными на их поверхности антителами к Hsp70 или Hsc70 наносили стандартные (раствор антигенного белка определѐнной концентрации) и исследуемые (концентрированные супернатанты) образцы. После инкубации (в условиях, указанных в инструкции производителя) и трехкратной промывки лунок от несвязавшегося антигена входящим в набор буфером для отмывки добавляли биотинилированные антитела к Hsp70 или Hsc70. После получасовой инкубации вновь три раза промывали лунки буфером для отмывки и добавляли в каждую лунку входящий в состав набора раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. После очередной инкубации и 65 трехкратной отмывки добавляли субстрат тетраметилбензидин (ТМВ) для развития цветной реакции. Реакцию останавливали через 30 мин добавлением в лунки блокирующего буфера на основе серной кислоты. Измерение оптической плотности образцов проводили на фотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, CША) при длине волны 450 нм (референсной длине волны 620 нм). По стандартным образцам строили калибровочную кривую зависимости величины оптической плотности от концентрации Hsp70 и Hsc70 (пг/мл), и по ней вычисляли концентрацию исследуемых белков в образцах. 66 III. Результаты 3.1. Внутриклеточное содержание HSP70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах Учитывая, что устойчивость к стрессу, опосредованная системой белков семейства HSP70, является важным фактором, влияющим на процессы клеточного старения, на первом этапе была поставлена задача оценить содержание HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах: 20-59 (молодые), 60-89 (пожилые) и 90 и более лет (долгожители). Детекция внутриклеточных HSP70 была проведена методом проточной цитометрии с использованием модифицированной методики фиксации и пермеабилизации клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводилось с помощью антител BRM-22, специфичных к консервативному участку белков семейства HSP70, распознающих как индуцированный Hsp70, так и конститутивный Hsc70 белки. Не было выявлено достоверных возрастных изменений в исходном содержании HSP70 (HSP70базальный) в нейтрофилах (Рис. 1). Однако наблюдалась тенденция к снижению значения медианы этого параметра с возрастом. Рис.1. Внутриклеточное содержание HSP70 (HSP70базальный) в нейтрофилах, измеренное в разных возрастных группах методом проточной цитометрии с помощью антител BRM-22 (распознающих как индуцированный Hsp70, так и конститутивный Hsc70 белки семейства HSP70). Здесь и далее отмечены и даны значения медианы в каждой группе. 67 3.2. Динамика изменения уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока Эффективность работы репарационной системы, к которой относятся белки HSP70, опосредована не только содержанием этих белков в интактных клетках: важным параметром является способность клеток реагировать на стресс и индуцировать синтез HSP70. Поэтому на следующем этапе работы была проанализирована способность нейтрофилов индуцировать синтез HSP70 в ответ на классический индуктор синтеза этих белков – тепловой шок (далее ТШ). Методами RT-PCR и проточной цитометрии были определены транскрипционная активность генов и содержание белков HSP70, а также динамика изменения этих параметров в нейтрофилах человека в условиях гипертермии, как модели клеточного стресса. 3.2.1. Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока Чтобы подобрать условия ТШ, при котором будет происходить активация транскрипции генов белков HSP70, в работе использовали две модели гипертермии in vitro: 40°C, 40 мин и 43°C,10 мин. Это позволило сравнить кинетический профиль внутриклеточного содержания HSP70, который сильно зависит не только от типа клеток, но от того, стрессирующему воздействию какой интенсивности и продолжительности подвергаются клетки или организм [Eid et al., 1987; Wang et al., 2003]. Транскрипционная активность генов семейства HSP70 в ответ на гипертермию оценивали как для гена HSPA1 индуцируемого белка Hsp70, так и для гена HSPA8 конститутивного белка Hsc70. Для того, чтобы нормировать количество клеток, из которых выделяли мРНК в каждой временной точке, в качестве референс-гена был выбран один из наиболее распространенных и часто анализируемых генов β-актин. Известно, что ТШ может временно ингибировать синтез большинства белков в клетке. Исследователями было показано, что воздействие ТШ (43°С, 20 68 мин) на мононуклеарные клетки не вызывает статистически значимых отличий уровня экспрессии таких генов белков «домашнего хозяйства», как рибосомальные белки, β-актин, β2-микроглобулин, GAPDH [Sonna et al., 2002]. В нашей работе экспрессия гена 18S-рибосомальной субъединицы была очень низкая, что соотносится с малым количеством рибосом в нейтрофилах, поэтому этот ген не мог быть использован в качестве референс-гена. Учитывая это, уровень транскрипционной активности генов белков HSP70 был представлен в виде отношения накопленных мРНК гена HSPA1 и HSPA8 к гену β-актина (Рис. 2А-Г). Из представленных данных (Рис. 2А, Б) видно, что индукция синтеза мРНК происходит в режиме проведения ТШ 43°C, 10 мин и практически отсутствует при режиме термообработки 40°C, 40 мин. Индукция происходит как для генов HSPA1, так и для HSPA8 с максимальным уровнем накопленной мРНК в интервале между 0.5 и 3 ч после окончания термической обработки в режиме 43° C, 10 мин (Рис. 2В, Г). Таким образом, для большинства последующих экспериментов был выбран режим ТШ 43°C, 10 мин. Было выяснено, что такие условия проведения тепловой обработки существенно не влияют на жизнеспособность нейтрофилов. Об этом свидетельствует отсутствие достоверных отличий в содержании некрозных (PI-позитивных) клеток между образцами, содержащими интактные либо подвергнутые гипертермии нейтрофилы после их часовой инкубации, а также в содержании апоптозных нейтрофилов содержащими интактные либо подвергнутые четырехчасовой инкубации (Рис. 3). 69 между образцами, ТШ клетки после их А Б Нормированный уровень мРНК Нормированный уровень мРНК 2,5 HSPA1 2,0 HSPA8 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1 0 1 2 3 4 5 6 Время, ч 2,5 HSPA8 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1 0 1 2 3 4 5 6 Время, ч Г HSPA1 Донор 2 2,5 Донор 3 Донор 4 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1 2 3 4 5 6 Время, ч HSPA8 3,0 Донор 1 Нормированный уровень мРНК 3,0 Нормированный уровень мРНК HSPA1 2,0 В -0,5 -1 43 C, 10 мин 3,0 40 C, 40 мин 3,0 Донор 1 Донор 2 2,5 Донор 3 Донор 4 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1 0 1 2 3 4 5 6 Время, ч Доля PI-позитивных клеток, % Рис. 2. Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием гипертермии. Индукция синтеза мРНК генов HSPA1 и HSPA8 под действием ТШ в режиме 40°C, 40 мин (А) и 43°C, 10 мин (Б). Динамика накопления мРНК генов HSPA1 (В) и HSPA8 (Г) при ТШ 43°C, 10 мин. Уровень мРНК нормировали по содержанию b-актина. Представленные на рисунках (А, Б) данные получены в рамках одного эксперимента на нейтрофилах донора 22 лет, на рисунках (В, Г) данные получены четырех независимых экспериментов на разных донорах. 100 Рис. 3. Влияние ТШ на жизнеспособность нейтрофилов. Сравнивали % апоптозных (по гиподиплоидному пику) клеток в образцах, содержащих интактные (1) либо подвергнутые ТШ (43°C, 10 мин) (2) нейтрофилы после их 4-часовой инкубации. Представлены объединенные данные двух экспериментов. 80 60 40 20 0 1 2 70 3.2.2. Анализ динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока Для изучения динамики внутриклеточных HSP70 в нейтрофилах под действием ТШ уровень HSP70 определяли методом проточной цитометрии в интактных клетках и сразу после тепловой обработки, затем анализировали изменение этого уровня через каждый час до 7 ч., а также в более поздние сроки (15-17 ч после окончания ТШ). Как правило, сразу после проведения ТШ в нейтрофилах определяли значительное возрастание уровня внутриклеточных HSP70 по сравнению с исходным уровнем. В течение 15-30 мин после завершения термического воздействия наблюдали фазу снижения этого уровня (типичные кривые динамики представлены на Рис. 4А. Необходимо было учитывать, что стресс-индуцированное увеличение внутриклеточного количества белков HSP70 происходит с учетом периода восстановления клеток, длительность которого может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от типа и условий обработки клеток [Eid et al., 1987; Wang et al., 2003; Polla et al., 1995; Schneider et al., 2002]. В используемой нами модели клеточного стресса с помощью метода проточной цитометрии не удалось выявить значительного увеличения внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах в промежуток времени 1-7 ч после нагревания, а также через 15 ч после ТШ (Рис. 4Б). Методами проточной цитометрии (Рис. 4В) и Вестерн-блоттинга (Рис. 4Г) ярко выраженного накопления индуцируемого Hsp70 с использованием специфических антител, в промежутке времени 1-7 ч после нагревания в нейтрофилах обнаружено тоже не было. Аналогичные эксперименты были проведены при температурном режиме 40°С, 40 мин. Как и ожидалось, в отсутствие индукции накопления мРНК для Hsp70 и Hsc70, при ТШ 40°С, 40 мин, не удалось выявить 71 увеличения внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в течение 4.5 ч после термообработки и через 15ч. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. А Б 50 40 30 20 10 0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, мин В Г Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 10 9 8 7 6 5 4 3 1 2 2 1 0 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время, ч Рис. 4. Динамика внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в ответ на ТШ (43°C, 10 мин), оцененная методами проточной цитометрии и Вестерн-блоттинга. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток проводили с помощью антител BRM-22 (А, Б) и антител С92F3A-5, распознающих только Hsp70 (В). А. Измерение уровня HSP70 проводили до ТШ (точка 0 мин), сразу после окончания ТШ (точка 10 мин), а также через 15,30 и 60 мин после окончания ТШ. Представлены результаты независимых экспериментов с нейтрофилами, полученными от четырех разных доноров в возрасте от 25 до 91 года, выбранных случайным образом. Б. Измерение уровня HSP70 проводили до ТШ, сразу после окончания ТШ и каждый час в течение 7 ч, а также через 15 ч с момента окончания ТШ. Представлены данные от двух независимых экспериментов. В. Измерение уровня Hsp70 до ТШ и каждый час после окончания ТШ в течение 7 ч, где 1 и 2 – доноры. Г. Анализ методом Вестерн-блоттинга внутриклеточного содержания Hsp70; в качестве референсного белка использовали β-актин. Здесь и далее разброс данных рассчитывали в виде ошибки среднего. 72 3.3. Анализ экспрессии HSP70 в мононуклеарных клетках человека. Анализ внутриклеточной экспрессии HSP70 в условиях гипертермии был проведен в клетках периферической крови моноцитарного ряда: лимфоцитах и моноцитах (Рис. 5А), в которых, как показано в целом ряде статей, происходит индукция и накопление Hsp70 в ответ на ТШ. Данные клетки были использованы в качестве положительного контроля, чтобы подтвердить, что используемые в данной работе цитометрические методы позволяют адекватно оценивать в клетках индукцию синтеза HSP70. Было проведено измерение уровня HSP70 при двух режимах гипертермии in vitro, используемых в публикациях: 43°С, 20 мин и 40°С, 90 мин. Помимо оценки с использованием антител BRM-22 общего уровня белков HSP70, с помощью соответствующих антител (С92F3A-5) была проанализирована динамика содержания индуцируемого Hsp70 в моноцитах (Рис. 5Б, В) и лимфоцитах (Рис. 5Г, Д). В Б Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 160 43°С, 20 мин 140 40°С, 90 мин 120 100 80 60 40 20 150 100 50 Время, ч 10 15 20 -5 0 5 10 15 20 Время, ч HSP70 в лимфоцитах 160 43°С, 20 мин 140 40°С, 90 мин 120 100 80 60 40 20 -5 0 5 Время, ч 10 15 20 Hsp70 в лимфоцитах 180 43°С, 20 мин 160 140 40°С, 90 мин 120 100 80 60 40 20 0 -5 0 5 10 Время, ч 73 15 20 Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 180 0 5 40°С, 90 мин 200 Д Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Г 0 43°С, 20 мин 250 0 0 -5 Hsp70 в моноцитах 300 HSP70 в моноцитах 180 Интенсивность флуоресценции, усл.ед. А Hsp70 в лимфоцитах 10 9 43°С, 20 мин 8 40°С, 90 мин 7 6 5 4 3 2 1 0 -5 0 5 10 Время, ч 15 20 Е Ж З Рис. 5. Анализ содержания внутриклеточных HSP70 в мононуклеарах методами проточной цитометрии (А-Д) и Вестерн-блоттинга (Е, Ж). Популяции лимфоцитов и моноцитов в виде Dot Plot (А). Внутриклеточное содержание HSP70 и Hsp70в моноцитах (Б, В) и лимфоцтах (Г, Д), измеренное методом проточной цитометрии. Сравнительный анализ экспрессии Hsp70 в лимфоцитах и нейтрофилах (E). Анализ методом Вестернблоттинга внутриклеточного содержания HSP70 с помощью антител BRM-22 (Ж) и Hsp70 с помощью антител С92F3A-5 (З) в мононуклеарах; в качестве референсного белка использовали β-актин. В популяции моноцитов при окрашивании антителами BRM22 регистрировали ярко выраженное накопление HSP70, тогда как в лимфоцитах такого увеличения не наблюдалось. В моноцитах при окрашивании антителами С92F3A-5 индукция Hsp70 происходила при воздействии 43°С, 20 мин и была слабовыраженной при 40°С, 90 мин. В лимфоцитах при 43°С, 20 мин индукция Hsp70 была на порядок (в 10 раз) меньше по сравнению с моноцитами, и отсутствовала при воздействии на 74 клетки в режиме 40°С, 90 мин. Сравнительный анализ экспрессии Hsp70 в лимфоцитах и нейтрофилах в нашей модели клеточного стресса показал, что в нейтрофилах индукция этих белков существенно слабее, чем в лимфоцитах, или, у некоторых доноров, отсутствует (Рис. 5Е). Для анализа содержания белков HSP70 использовали также метод Вестерн-блоттинга (Рис. 5Ж, З). Данные об индукции синтеза белков HSP70 под действием ТШ в лимфоцитах и моноцитах, полученные методами проточной цитометрии и Вестерн-блоттинга, оказались хорошо согласованы между собой. На основании полученных цитометрических результатов можно заключить, что: 1) используемый в данной работе метод проточной цитометрии позволяет регистрировать изменение экспрессии HSP70; 2) увеличение экспрессии HSP70 зависит от температуры и времени воздействия ТШ; 3) индукция Hsp70 в лимфоцитах происходит существенно слабее, чем в моноцитах; 4) использование антител BRM22 позволяет регистрировать ярко выраженное (более чем в десять раз) стрессиндуцируемое увеличение содержания HSP70, вероятно, за счет преимущественного связывания антител с превалирующим в клетках белком Hsc70, количество которого под действием стресса практически не изменяется. 3.4. Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока Дальнейшая работа была сосредоточена на двухфазной динамике внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах, связанной с быстрым действием ТШ (43°C,10 мин), зарегистрированной с помощью проточной цитометрии. В серии экспериментов было выявлено, что при снижении температуры воздействия резкое увеличение внутриклеточного уровня HSP70 после окончания ТШ также выявляется, но изменяется его амплитуда (Рис. 6А, Б). 75 Так, инкубация нейтрофилов при снижении температуры на 1°C (42°C, 10 мин) приводит к значительному меньшему возрастанию HSP70 по сравнению с инкубацией при 43°С (Рис. 6Б). Б 20 35 43°С, 10 мин 30 40°С, 40 мин 25 20 15 10 5 0 -1 0 1 2 3 Время, ч 4 5 6 Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. А 1 15 3 2 10 5 0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Время, мин Рис. 6. Изменение внутриклеточного уровня HSP70 в условиях проведения ТШ при 43°C, 10 мин и 40°C, 40 мин (А); при 43°C 10 мин (1), 42°C 10 мин (2), 42°C 40 мин (3) (Б); cтрелками 1,2 и 3 обозначено окончание ТШ. Значительная разница в динамике внутриклеточного уровня HSP70 была найдена при использовании двух способов пермеабилизации нейтрофилов. Модифицированная методика, с помощью которой были получены вышеописанные результаты, основана на добавлении тритона X-100 в качестве детергента, в то время как коммерческий набор Cytofix Cytoperm (Becton Dickinson, США) включает в качестве детергента сапонин. Как видно из рисунка (Рис. 7А), при пермеабилизации нейтрофилов сапонином двухфазная динамика c быстрым возрастанием и падением уровня внутриклеточных HSP70 в течение 15-30 мин после завершения ТШ выявляется, но со значительно меньшей амплитудой по сравнению с результатами, полученными при пермеабилизации тритоном Х-100. В то же время, независимо от способа пермеабилизации клеток, ярко выраженного увеличения внутриклеточного уровня HSP70 (Рис. 7А) и Hsp70 (Рис. 7Б) с учетом времени восстановления на более поздних этапах зарегистрировать не удалось. 76 Б 10 Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. А 9 8 тритон X-100 7 сапонин 6 5 4 3 2 1 0 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 Время, ч Hsp70 20 тритон X-100 сапонин 15 10 5 0 -1 0 3 7 11 Время, ч 15 19 Рис. 7. Динамика внутриклеточного уровня HSP70, выявленная при использовании двух способов пермеабилизации нейтрофилов: с тритоном X-100 и сапонином. Окрашивание проводили антителами BRM22 (А) и С92F3A-5 (Б). Можно предположить, что быстрое увеличение внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах после ТШ связано со стресс- индуцированным синтезом этих белков. Чтобы установить, связано ли зарегистрированное увеличение уровня HSP70 в нейтрофилах с процессом активации трансляции, использованием была ингибитора проведена белкового серия экспериментов синтеза с циклогексимида. Предварительная инкубация нейтрофилов с циклогексимидом не приводила к ингибированию фазы увеличения детектируемых внутриклеточных HSP70 после тепловой обработки (Рис. 8А). Эти данные указывают на то, что увеличение уровня HSP70 сразу после проведения ТШ не связано с синтезом белка de novo. Для проверки полученных методом проточной цитометрии данных об увеличении уровня внутриклеточных HSP70 после ТШ было проанализировано содержание в нейтрофилах HSP70 методом Вестернблоттинга. Нам не удалось зарегистрировать увеличение количества HSP70 после ТШ (Рис. 8Б). Это свидетельствует о том, что увеличение содержания HSP70 в нейтрофилах сразу после термического воздействия не связано с усилением синтеза этих белков. 77 А Б Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 40 интактные клетки 35 циклогексимид 30 25 20 15 10 5 0 -10 0 10 20 30 40 50 Время, мин Рис. 8. А. Влияние ингибитора белкового синтеза циклогексимида (100 мкМ, 30 мин) на внутриклеточный уровень HSP70, оцененный методом проточной цитометрии. Идентификацию HSP70 проводили с помощью моноклональных антител BRM-22. Представлены репрезентативные данные одного из двух независимых экспериментов. Б. Анализ внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах с помощью Вестернблоттинга. Идентификация HSP70 проведена с помощью антител BRM-22, в качестве референсного белка использовали β-актин. Сходные данные были полученные в двух независимых экспериментах. Необходимо было выяснить, с какой формой белка связано индуцированное ТШ двухфазное изменение внутриклеточного уровня HSP70. С этой целью динамика содержания HSP70 в нейтрофилах была проанализирована с использованием двух коммерческих антител, распознающих либо индуцируемый (Hsp70), либо конститутивный (Hsc70) белки HSP70. Зависимость внутриклеточного уровня этих белков от времени оказалась сходной для указанных типов антител (Риc. 9). Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 20 15 10 Hsp70+Hsc70 5 Hsc70 Hsp70 0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, мин 78 Рис. 9. Внутриклеточный уровень HSP70 в нейтрофилах до и после ТШ, оцененный методом проточной цитометрии с использованием антител к разным формам HSP70. Идентификацию белка проводили с помощью моноклональных антител к Hsp70 (С92F3A-5) и Hsc70 (1B5), а также антител, распознающих консервативный участок HSP70 (BRM-22). Как и с использованием антител BRM22, с помощью антител к Hsp70 и Hsc70 были выявлены связанные с ТШ фазы увеличения и последующего cнижения уровня HSP70. Таким образом, вклад в зарегистрированный методом проточной цитометрии двухфазный профиль динамики вносили как конститутивный, так и индуцируемый белки HSP70. Поскольку ранее было продемонстрировано, что увеличение уровня HSP70 после ТШ не связано с синтезом белка de novo, то можно предположить, что оно может быть связано с изменением молекулярной конформации молекулы HSP70. Внутриклеточное содержание HSP70 было проанализировано с помощью панели из шести моноклональных антител к HSP70, полученных нами ранее [Ветчинин и др., 2010 а, б]. Предварительно, также было показано, что антитела клеточных клонов гибридом 2Е4, 2Е11, 2F3 обладают специфичностью к консервативным эпитопам субстрат-связывающего СOOH-терминального домена HSP70. Антитела гибридом 6G2, 2E5, 3C5 специфичны к участку молекулы Hsp70 консервативного NH2-терминального домена с АТФ-азной активностью [Бойко и др., 2014]. Сравнительный анализ взаимодействия моноклональных антител, специфичных к С-фрагменту HSP70, и моноклональных антител, специфичных к N-фрагменту Hsp70, показал, что динамика уровня внутриклеточных белков HSP70 в ответ на ТШ, зарегистрированная методом проточной цитометрии, для указанных групп гибридом различна. С помощью антител 6G2, 2E5, 3C5 не удалось выявить фазу увеличения внутриклеточного уровня HSP70 сразу после окончания ТШ (Рис. 10А), в то же время антитела 2E4, 2E11, 2F3 позволили это увеличение зарегистрировать (Рис. 10Б). Таким образом, индуцируемое тепловой обработкой возрастание внутриклеточного уровня HSP70, по-видимому, опосредовано усилением доступности эпитопов субстрат-связывающего домена белка специфичными к этому домену антителами. 79 Б 30 Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. А 2E4 2E11 2F3 25 20 15 10 5 0 -10 0 10 20 30 40 Время, мин 50 60 30 6G2 2E5 25 3C5 20 15 10 5 0 -10 70 0 10 20 30 40 Время, мин 50 60 70 Рис. 10. Анализ взаимодействия антител из гибридом с HSP70. А. Внутриклеточный уровень HSP70 в нейтрофилах до и после ТШ, оцененный методом проточной цитометрии с использованием антител к N-концу HSP70 (клоны 6G2, 2E5, 3C5). Б. Внутриклеточный уровень HSP70 в нейтрофилах до и после ТШ, оцененный методом проточной цитометрии с использованием антител к С-концевому участку молекулы (клоны 2E4, 2E11, 2F3). Приведены типичные динамики, полученные в трех независимых экспериментах. В пользу сделанного нами заключения о конформационных изменениях белков HSP70 свидетельствуют данные следующего эксперимента, в котором образцы с нейтрофилами подвергали тепловой обработке 43°С, 10 мин (ТШ1 и ТШ2), с периодом восстановления клеток (инкубация 37°С, 2 ч, 5% СО2) между ТШ1 и ТШ2. Двухфазная динамика внутриклеточного уровня HSP70 в ответ на ТШ1 и ТШ2 оказалась сходной (Рис. 11А, Б). А Б 100 -60 ТШ1 90 ТШ2 Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 100 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 60 120 180 240 -60 90 ТШ 2 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 60 120 180 240 Время, мин Время, мин Рис. 11. А. Цитометрический анализ внутриклеточного уровня HSP70 при последовательном проведении двух ТШ (ТШ1 и ТШ2 проведены в режиме 43°С, 10 мин с периодом восстановления клеток 2 ч при 37°С между ними). Б. ТШ был проведен после двух часовой инкубации интактных клеток при 37°С. 80 Таким образом, обобщая данные, можно сделать вывод, что повышение внутриклеточного уровня HSP70, вызванное ТШ, связано с изменением конформации белков, что, по-видимому, обусловлено частичной диссоциацией субстрата из комплекса с HSP70. С этой точки зрения данный параметр косвенно может указывать на количество белков HSP70, взаимодействующих с измененными белками, нуждающимися в стабилизации белками-шаперонами 3.5. Воздействие гипертермии на уровень HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах Интенсивность стресс-индуцированного ответа на многие стимулы в старости снижается [Calderwood et al., 2009]. Для того чтобы оценить, как с возрастом в нейтрофилах в нашей модели клеточного стресса меняется уровень HSP70, было произведено сравнение уровня этого белка после воздействия ТШ в разных возрастных группах. Аналогично уровню HSP70базальный, уровень белка, зарегистрированный сразу после окончания ТШ (HSP70ТШ) достоверно не отличался между молодыми, пожилыми донорами и долгожителями (Рис. 12А). А Б Рис. 12. Изменение уровня HSP70 в нейтрофилах под действием ТШ в разных возрастных группах. A. Уровень HSP70, измеренный сразу после окончания ТШ (HSP70ТШ) Б. Увеличение уровня HSP70 (ΔHSP70ТШ), которое рассчитывали как разницу между HSP70ТШ и HSP70базальный. Здесь и далее звездочками помечены достоверные отличия между группами (p < 0.05). 81 В то же время, значение параметра, который рассчитывался в виде разницы между HSP70ТШ и HSP70базальный (ΔHSP70ТШ) для каждого донора, с возрастом достоверно увеличивалось (Рис.12Б). Таким образом, параметр ΔHSP70ТШ, который, как мы предполагаем, косвенно указывает на количество HSP70, взаимодействующего с нарушенными белками-субстратами, связан с процессом старения. 3.6. Высвобождение HSP70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство Известно, что клеточный стресс в ряде случаев инициирует транслокацию HSP70 на плазматическую мембрану и/или высвобождение этих белков во внеклеточное пространство. В данной модели клеточного стресса методом проточной цитометрии не удалось зарегистрировать HSP70 на поверхности нейтрофилов ни одними из используемых в работе коммерческих (в том числе к Hsp70 и Hsc70) и полученных к разным концевым участкам моноклональных антител. Поверхностная экспрессия белков была зарегистрирована только при окрашивании клеток поликлональными антителами к HSP70 (Рис. 13А). Это можно объяснить тем, что нейтрофилы экспонируют на своей поверхности слишком мало HSP70 с доступными для распознавания эпитопами. В то же время, на моноцитах, в которых индукция белков HSP70 ярко выражена, с помощью большинства имеющих в нашем распоряжении антител, распознающих HSP70, была зарегистрирована поверхностная экспрессия этих белков (Рис. 13Б, В), что подтверждает предположение о том, что на поверхности не всех клеток экспрессируются белки HSP70 либо представлено достаточное количество распознавания эпитопами. 82 HSP70 с доступными для А Интенсивность флуоресценценции, усл.ед. 40 35 30 25 20 Контроль ТШ 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 Эксперименты Б В Уровень флуоресценции, усл.ед. 14,0 Контроль 12,0 ТШ 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 С92F3A-5 BRM22 2F3 2Е4 2Е11 3C5 6G2 2Е5 Клоны антител Рис. 13. Поверхностная экспрессия HSP70, регистрируемая методом проточной цитомтерии. А. Окрашивание нейтрофилов поликлональными антителами к HSP70. Б. Окрашивании моноцитов моноклональными антителами к HSP70. В. Цитометрические данные поверхностной экспрессии HSP70 на моноцитах при окрашивании гибридомными антителами (клон 6G2) предсатвлены в виде гистограмм. Содержание внеклеточных HSP70 было измерено в культуральной среде нейтрофилов с помощью иммуноферментного анализа с использованием двух коммерческих тест-систем для определения конститутивного (Hsc70) и индуцируемого (Hsp70) белков семейства HSP70. Анализу подвергались образцы надосадочной жидкости, полученной от интактных, а также подвергнутых тепловой обработке нейтрофилов сразу после ТШ и через 60 мин после его окончания. Результаты экспериментов показали, что 83 содержание внеклеточных HSP70 возрастает после ТШ, причем это относится как к индуцируемой, так и конститутивной формам белка (Рис. 14А, Б). А Б Рис. 14. Содержание HSP70 в культуральной среде интактных и подвергнутых тепловой обработке нейтрофилов, измеренное с помощью иммуноферментного анализа. А. Уровень содержания Hsp70 в культуральной среде нейтрофилов. Б. Уровень содержания Hsc70 в культуральной среде нейтрофилов. В качестве контроля была использована полная среда для культивирования нейтрофилов. Как было упомянуто выше, в течение анализируемого периода времени жизнеспособность нейтрофилов практически не изменялась. Следовательно, присутствие внеклеточных белков HSP70 в клеточном надосадке не являлось следствием пассивного высвобождения исследуемых белков из некротических нейтрофилов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что в нейтрофилах в условиях клеточного стресса реализуется высвобождение как конститутивного, так и индуцируемого белков HSP70. 3.7. Анализ механизмов, регулирующих высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов Серия экспериментов была направлена на изучение механизмов высвобождения белков HSP70 из нейтрофилов в используемой модели клеточного стресса. Механизмы активного высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство описаны в литературе противоречиво, не 84 исключено, что универсального для всех типов клеток пути секреции этих белков не существует. Поскольку дегрануляция нейтрофилов сопровождается высвобождением содержимого гранул, включающего разнообразные белки, была поставлена задача выяснить, связано ли, и, если связано, то с каким типом гранул стрессиндуцированное высвобождение HSP70. Для этого было проведено окрашивание плазматической мембраны интактных клеток и клеток, подвергнутых ТШ, антителами к маркерными белкам азурофильных и специфических гранул (Рис. 15 А-Г). А В Б Г Рис. 15. Поверхностное окрашивание мембраны нейтрофилов антителами к маркерным молекулам азурофильных (А, Б) и специфических (В, Г) гранул. Окрашивание проводили на интактных, подвергнутых ТШ либо активированных fMLP нейтрофилах. Применяли антитела CD63 (входит в состав мембран азурофильных гранул), CD66b (рецептор содержится в специфических гранулах и в небольшом количестве в секреторных гранулах). В качестве положительного 85 контроля использовали активатор fMLP, который индуцирует в нейтрофилах развитие процесса дегрануляции. Результаты показали, что в ответ на ТШ дегрануляции и увеличения поверхностной экспресии азурофильных и специфических гранул не происходит. Таким образом, вероятно, процесс высвобождения HSP70 в ответ на ТШ не сопряжен с дегрануляцией охарактеризованных типов гранул. На следующем этапе была поставлена задача исследовать вовлеченность эндосомальных лизосом в процесс стресс-индуцируемой секреции HSP70. Ранее была показана локализация HSP70 в составе лизосом [Nylandsted et al., 2004], а также возможность высвобождения HSP70 в составе секреторных эндосомальных лизосом для некоторых опухолевых клеток и макрофагов [Mambula and Calderwood, 2006]. С другой стороны, было продемонстрировано, что транспорт HSP70 во внеклеточное пространство осуществляется в секреторно-подобных гранулах, не несущих специфических маркеров лизосом [Evdonin et al., 2006]. Вначале мы проверили, является ли ТШ индуктором выброса лизосом, следствием которого является увеличение экспрессии на поверхности плазматической мембраны маркера лизосомального (LAMP1, или CD107a) (Рис. 16). А Б 86 мембрано-ассоциированого белка В Г Доля LAMP1-PE-Cy5 позитывных нейтрофилов, % 30 Контроль 25 ТШ 20 15 10 5 0 1 2 Эксперименты Рис. 16. Поверхностное окрашивание мебраны нейтрофилов антителами к LAMP1. Окрашивание проводили на интактных и подвергнутых ТШ (А, Б) или активированных fMLP (В) нейтрофилах. Доля (%) СD107a позитивных клеток до и после проведения ТШ (Г). Оказалось, что ТШ индуцирует увеличение экспрессии LAMP1 на мембране нейтрофилов, однако такой эффект наблюдается на клетках, составляющих 10-13% от всех анализируемых нейтрофилов. В то же время, активация нейтрофилов fMLP увеличивает экспрессию LAMP1 во всей популяции. Известно, что для слияния эндосом с содержащимися в них белками с лизосомой необходимым условием является низкий рН. Чтобы исключить или подтвердить, что процесс созревания лизосом может влиять на динамику уровня HSP70 в нейтрофилах, было смоделировано нарушение созревания лизосом, для чего был использован лизосомотропный агент хлорид аммония, который является слабым основанием и способен проникать в лизосомы в протонированной форме, увеличивая внутрилизосомальный рН. Предварительная инкубация нейтрофилов с хлоридом аммония приводила к значительному возрастанию детектируемого сразу после ТШ уровня белков HSP70, преимущественно за счет превалирующей в клетках конститутивной формы, а также отмене последующего снижения уровня HSP70 после окончания тепловой обработки (Рис. 17А, Б). 87 А 80 NH4Cl Интенсивность флуоресценции, усл.ед. Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 80 Б интактные клетки 70 60 50 40 30 20 10 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 NH4Cl 70 интактные клетки 60 50 40 30 20 10 0 -5 0 5 Время, мин 10 15 Время, мин 20 25 30 Рис. 17. Влияние хлорида аммония (50 мМ, 2 часа) на внутриклеточный уровень HSP70, оцененный методом проточной цитометрии. А. Идентификация HSP70 проведена с помощью антител BRM-22, распознающих консервативный участок белков HSP70. Б. Идентификация HSP70 проведена с помощью антител, специфичных к Hsp70 (С92F3A-5). На графике представлены репрезентативные данные одного из двух независимых экспериментов. Полученные результаты, с одной стороны, могут свидетельствовать о том, что вызванное хлоридом аммония изменение созревания лизосом препятствует высвобождению HSP70 из нейтрофилов в составе эндолизосом. С другой стороны, возможно, что обработка клеток хлоридом аммония способствует удержанию связанных с эндолизосомами белков HSP70 в диссоциированном состоянии, свободном для связывания с антителами. Было сделано предположение, что в процессе транслокации HSP70 в лизосому в нейтрофилах суперсемейства может АTP-binding участвовать cassette транспортная система (ABC)-транспортеров – трансмембранных белков, принимающих участие в транслокации широкого спектра продуктов через внутриклеточные и наружные мембраны. Ранее было показано, что процесс секреции HSP70 в некоторых типах клеток происходит с вовлечением представителей ABC-транспортеров [Mambula and Calderwood, 2006]. Для того, чтобы определить, реализуется ли такой механизм транслокации/секреции HSP70 в нейтрофилах, был использован неспецифический ингибитор ABC-транспортеров, блокатор ATФ-зависимых калиевых каналов глибенкламид (Рис. 18). 88 А Б Интенсивность флуоресценции, усл.ед. 20 В 20 Глибенкламид Глибенкламид Интактные клетки Интактные клетки 15 40 Глибенкламид 35 Интактные клетки 30 15 25 10 20 10 15 5 5 10 5 0 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время, мин -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время, мин Время, мин Рис. 18. Влияние глибенкламида на оцененный методом проточной цитометрии внутриклеточный уровень HSP70. После инкубации с глибенкламидом (0,5 мМ, 2 ч) проведено окрашивание моноклональными антителами к консервативной части белков HSP70 (BRM-22) (А), антителами, специфичными к Hsp70 (С92F3A-5 (Б), антителами, специфичными к Hsc70 (1B5 В) (В). Предобработка клеток глибенкламидом приводила к частичной или полной отмене фазы снижения внутриклеточного уровня HSP70, регистрируемой спустя 15-30 мин после окончания ТШ. Сходное действие глибенкламида было показано в отношении как индуцируемого (Рис. 18Б), так и конститутивного белков (Рис. 18В). При этом глибенкламид не влиял на начальный уровень белков HSP70 в нейтрофилах. Полученные данные указывают на то, что снижение уровня HSP70 после ТШ в нейтрофилах может частично отражать процесс стресс-индуцируемого высвобождения HSP70, которое регулируеется с участием ABC-транспортеров. 3.8. Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах Для того чтобы выяснить, участвуют ли HSP70 в регуляции процессов продукции АФК нейтрофилами, мы оценили продукцию АФК в нейтрофилах и провели корреляционный анализ взаимосвязи параметров HSP70 и АФК в разных возрастных группах доноров. На первом этапе была измерена спонтанная продукция АФК в неактивированных выделенных нейтрофилах в указанных возрастных 89 группах. Несмотря на то, что интенсивная продукция АФК является одним из маркеров активированных нейтрофилов, без каких-либо дополнительных стимулов нейтрофилы разных доноров продуцировали разные количества АФК, что может отражать особенности их состояния еще до выделения, в кровеносном русле. Спонтанную продукцию АФК в неактивированных нейтрофилах измеряли двумя способами, с помощью проточной цитометрии, используя проницаемый флуоресцентный зонд DCFH-DA (DCF) и с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХ). Исходный (т.е. спонтанный) уровень продукции АФК, измеренный с помощью ЛЗХ (АФКЛЗХ спонт) в группах как пожилых людей, так и долгожителей был значительно выше, чем уровень АФКЛЗХ спонт в группе молодых доноров (Рис. 19А). Эти данные хорошо соотносятся с теорией Хармана о накоплении с возрастом АФК [Харман, 1956]. Спонтанная продукция внутриклеточных АФК, зарегистрированная с помощью DCF (АФКDCF спонт), также была значительно выше в группе пожилых доноров (Рис. 19Б), однако в группе долгожителей уровень АФКDCF спонт оказался сходным с аналогичным параметром в группе молодых доноров, в противоположность полученным данным для параметра АФКЛЗХ спонт (Рис. 19А). Не удалось выявить достоверных корреляций между параметрами АФКDCF спонт и АФКЛЗХ спонт ни в одной из групп доноров, что может указывать на то, что используемые нами методы позволяют различать АФК из различных источников. Также были проанализированы возрастные изменения индуцированной с помощью опсонизированного зимозана продукции АФК нейтрофилами (АФКЛЗХ инд) для того, чтобы оценить потенциальный функциональный ответ нейтрофилов на предполагаемый патоген. Этот параметр был рассчитан для клеток каждого донора, как отношение разницы между максимальным (АФКЛЗХ макс инд) и исходным уровнями продукции АФК к исходному уровню [АФКЛЗХ инд = (АФКЛЗХ макс инд – АФКЛЗХ спонт)/АФКЛЗХ спонт]. Следует отметить, 90 что в зависимости от индивидуальных особенностей доноров значения АФКЛЗХ макс инд достигались в диапазоне от 10 до 20 мин после внесения зимозана. Никаких достоверных отличий значений медиан АФКЛЗХ инд между группами долгожителей и молодых доноров найдено не было; в то же время, уровень АФКЛЗХ инд в группе пожилых был значительно ниже по сравнению с группой молодых доноров (Рис. 19В). А Б В Рис. 19. Сравнительный анализ продукции АФК нейтрофилами в разных возратсных группах. A. Спонтанная продукция АФК, зарегистрированная методом ЛЗХ (АФКЛЗХ спонт). Б. Спонтанная внутриклеточная продукция АФК, измеренная методом проточной цитомтреии с использованием DCF (АФКDCF спонт). В. Индуцированная опсонизированным зимозаном продукция АФК (АФК ЛЗХ инд). Таким образом, анализ возрастных изменений продукции АФК в нейтрофилах человека выявил, что функциональный ответ нейтрофилов в группе долгожителей не был снижен относительно контрольной группы молодых доноров в отличие от группы пожилых, у которых такой ответ был снижен. Спонтанная внеклеточная продукция АФК с возрастом увеличивалась, в то время как спонтанная внутриклеточная продукция АФК в группе долгожителей не отличалась от уровня этого параметра в группе молодых, а в группе пожилых указанный параметр был достоверно выше. 91 3.9. Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержания HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах Учитывая, что белки теплового шока принимают участие в клеточных механизмах защиты от накопления поврежденных белков, в том числе в результате воздействия АФК, следующей задачей в работе являлось изучение взаимосвязи методом корреляционного анализа между параметрами продукции АФК, описанных выше, и внутриклеточных уровней HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах. Принимая во внимание, что большинство параметров, рассматриваемых в исследовании (АФКDCF АФКЛЗХ спонт, АФКЛЗХ инд, ΔHSP70ТШ), зависят от возраста, спонт, мы проанализировали корреляции этих параметров между собой в группах молодых, пожилых доноров и долгожителей. В анализ также были включены параметры, которые по нашим данным, не имели возрастных отличий: HSP70базальный, HSP70ТШ (Таблица 1). Несколько достоверных корреляций между определенными параметрами АФК и HSP70 были выявлены во всех возрастных группах, указывающих на существование взаимосвязи между внутриклеточными HSP70 и продукцией АФК в нейтрофилах. Однако обнаруженные корреляции не были постоянными в разных возрастных группах, поэтому, вероятно, такая связь является непрямой. Кроме того, в разных возрастных группах корреляции между параметрами HSP70 и АФК носили как положительный, так и отрицательный характер. В группе молодых доноров параметр HSP70базальный отрицательно коррелировал с АФКЛЗХ спонт (Таблица 1), что означает, что низкий уровень спонтанной, преимущественно внеклеточной, продукции АФК связан с увеличенным внутриклеточным содержанием HSP70 в нейтрофилах. Эта связь исчезает с возрастом: никакой взаимосвязи между HSP70базальный и АФКЛЗХ спонт в группах пожилых доноров и долгожителей найдено не было. 92 Таблица 1. Корреляционный анализ внутриклеточного уровня HSP70 и продукции АФК в нейтрофилах в разных возрастных группах (r – коэффициент корреляции, p – величина достоверности). Параметр 1 HSP70базальный Молодые Пожилые Долгожители Параметр 2 r = –0.086, p = 0.698 Отрицательная r = –0.634, p = 0.014 r = –0.063, p = 0.834 r = –0.319, p = 0.258 АФКDCF спонт r = 0.082, p = 0.778 r = 0.273, p = 0.377 АФКЛЗХ спонт r = 0.220, p = 0.435 r = –0.033, p = 0.880 HSP70ТШ Отрицательная r = –0.719, p = 0.003 r = –0.073, p = 0.797 r = 0.029, p = 0.896 ΔHSP70ТШ r = –0.007, p = 0.976 r = –0.420, p = 0.129 Положительная r = –0.329, r = 0.615, p = 0.284 p = 0.024 Отрицательная r = –0.203, r = –0.61, p = 0.513 p = 0.020 r = 0.297, p = 0.313 r = –0.182, p = 0.557 Положительная r = –0.070, r = 0.692, p = 0.817 p = 0.008 Отрицательная r = –0.217, r = –0.626, p = 0.484 p = 0.016 Отрицательная r = 0.396, r = –0.671, p = 0.173 p = 0.015 Положительная r = 0.301, r = 0.560, p = 0.329 p = 0.044 АФКЛЗХ инд АФКDCF спонт АФКЛЗХ спонт АФКЛЗХ инд АФКDCF спонт АФКЛЗХ спонт АФКЛЗХ инд Вместе с тем, поскольку в группе молодых корреляции между параметрами АФКЛЗХ спонт и ΔHSP70ТШ не наблюдается, то можно предположить, что отрицательная взаимосвязь между HSP70 и продукцией внеклеточных форм АФК не связана с белками HSP70, вовлеченными в функциональные взаимодействия с белковыми субстратами. Множественные взаимосвязи между HSP70 и АФК были выявлены в группе пожилых доноров. Заметные положительные корреляции были обнаружены между АФКЛЗХ инд и всеми анализируемыми в работе параметрами HSP70 (HSP70базальный, HSP70ТШ , ΔHSP70ТШ ) (Таблица 1). Таким образом, в этой возрастной группе высокий уровень содержания 93 HSP70 в нейтрофилах связан с высокой индуцированной продукцией АФК и, следовательно, с более яркой иммунной реакцией. Можно предположить, что в возрасте между 60 и 89 лет, когда стимулированная продукция АФК в нейтрофилах значительно снижается, наличие внутриклеточных HSP70 каким-то образом становится критическим для сохранения адекватного уровня продукции АФК на патоген в нейтрофилах. Важно отметить, что в группе долгожителей, в которой индуцированная продукция АФК не изменяется по сравнению с группой молодых доноров, никаких достоверных взаимосвязей между АФКЛЗХ инд и параметрами HSP70 найдены не были, как и в группе молодых доноров. Единственная взаимосвязь параметра ΔHSP70ТШ с продукцией АФК была выявлена в группе долгожителей. Уровень ΔHSP70ТШ отрицательно коррелировал со спонтанной продукцией АФК (как АФКDCF АФКЛЗХ спонт). спонт, так и Это может свидетельствовать в пользу того, что накопление HSP70, «готового» взаимодействовать с новым субстратом в нейтрофилах, функционально связано с низкой спонтанной продукцией АФК (как внутриклеточной, так и внеклеточной) и может являться определенным критерием долголетия. Отсутствие взаимосвязи ΔHSP70ТШ с параметрами АФК в более раннем возрасте можно объяснить тем, что большинство доноров в этих группах, по-видимому, не попадут в группу долгожителей. Таким образом, на основе корреляционного анализа, выявлена взаимосвязь между определенными параметрами внутриклеточных HSP70 и продукции АФК в нейтрофилах, которая носит возраст-зависимый характер. 94 IV. Обсуждение Внутриклеточные белки HSP70 относятся к защитной системе за счет шаперонной активности. Количество HSP70 в клетке отражает эффективность репарации, и, в идеальном случае, должно возрастать по мере накопления поврежденных белков. С другой стороны, ассоциированное с возрастом накопление поврежденных, неправильно упакованных и агрегированных белков, в том числе из-за окислительной модификации биологических молекул в результате избыточной продукции и повреждающего действия АФК, может происходить на фоне снижения эффективности репарационной системы. В данной работе в интактных нейтрофилах при анализе внутриклеточного содержания HSP70 (HSP70базальный) не было выявлено никакой существенной разницы между тремя возрастными группами доноров, хотя ранее в мононуклеарных клетках было зарегистрировано увеличение внутриклеточного содержания HSP70 с возрастом [Njemini et al., 2007]. Известно, что помимо окислительного стресса, в очаге воспаления, куда мигрируют нейтрофилы, эти клетки подвергаются воздействию гипертермии. Необходимо учитывать, что ТШ вызывает два типа эффектов на клетки. Прямые эффекты выражены в изменениях конформации и активности белков, белок-белковых взаимодействий в результате различных химических модификаций. Вторичные эффекты опосредованы активацией определенных сигнальных путей и индукцией экспрессии HSP для последующей защиты клеток. С целью вызвать изменения в экспрессии HSP70 мы подвергали нейтрофилы воздействию ТШ. Было зарегистрировано увеличение транскрипционной активности генов белков HSP70 при воздействии ТШ в режиме 43°C, 10 мин. Интересно, что уровень мРНК не только для индуцируемого (Hsp70), но и для конститутивного (Hsc70) белков HSP70, хотя и в разной степени, увеличивался после ТШ. О способности 95 нейтрофилов быстро изменять экспрессию генов белков как Hsp70, так и Hsc70 в ответ на воспалительные стимулы было известно из ранее опубликованных данных [Zhang et al., 2004]. В то же время, в нейтрофилах не удалось выявить значительной индукции синтеза белков HSP70 в ответ на нагревание клеток. Вполне возможно, что для такой короткоживущей клеточной популяции как нейтрофилы не характерно значительное накопление белков HSP70. Известно, что пост-транскрипционная активность экспрессии Hsp70 в ответ на ТШ регулируется стабильностью мРНК [Theodorakis and Morimoto, 1987]. Незначительные увеличение уровня Hsp70 может быть связано с трансляционной активностью предсуществующих в нейтрофилах мРНК, без увеличения транскрипции генов, что ранее было показано на нейтрофилах в отношении синтеза цитокинов [Lindemann et al., 2004]. Также ранее был описан феномен, когда ТШ, несмотря на активацию HSF1, являющегося обязательным фактором для транскрипции генов белка Hsp70, не инициировал экспрессию этого белка [Mathur et al., 1994]. В используемой модели клеточного стресса в виде ТШ с помощью метода проточной цитометрии удалось выявить двухфазную динамику, характеризующуюся увеличением уровня HSP70 непосредственно после ТШ и последующим снижением этого уровня в течение 15-30 мин после завершения термического воздействия. Оказалось, что разница между первоначальным и зарегистрированным сразу после окончания ТШ уровнями внутриклеточных HSP70 (ΔHSP70ТШ), зависела от температуры ТШ, а завершение фазы увеличения было связано с окончанием тепловой обработки. Помимо этого, использование двух способов пермеабилизации нейтрофилов позволило обнаружить отличие в двухфазной динамике внутриклеточного уровня HSP70. Известно, что способ пермеабилизации клеток является одним из наиболее важных шагов для обеспечения чувствительности обнаружения антителами внутриклеточных антигенов, растворимых или локализованных в разных органеллах. Наиболее часто при внутриклеточном окрашивании используют такие детергенты, как 96 сапонин и тритон Х-100. Сапонин является мягким детергентом, взаимодействует с мембраносвязанным холестерином, селективно удаляя его и оставляя отверстия цитоплазматических в мембране, антигенов или и наиболее антигенов, подходит локализованных для на внутренней поверхности плазматической мембраны [Willingham, 1983]. В то же время, тритон Х-100, помимо плазматической мембраны, частично нарушает ядерную и митохондриальную мембраны, и поэтому позволяет детектировать более полно репертуар белков (в данном случае HSP70) с более разнообразной локализацией [Goldenthal et al., 1985]. В работе было показано, что вклад в двухфазную динамику HSP70 вносили как конститутивный, так и индуцируемый белки HSP70. Тот факт, что в нейтрофилах даже в отсутствие клеточного стресса обнаруживается индуцируемый белок Hsp70, был ранее продемонстрирован другими исследователями [Giraldo et al., 2010]. Присутствие Hsp70 в интактных нейтрофилах может быть связано с высокой реактивностью этих клеток. С помощью панелей гибридом, продуцирующих антитела, распознающие либо N-концевую часть, либо C-концевую часть молекулы HSP70, было показано, что в ответ на ТШ антитела позволяют проследить различную динамику внутриклеточных уровней HSP70. Вероятно, увеличение внутриклеточного уровня HSP70 сразу после окончания термического воздействия, зарегистрированного с помощью антител к Сконцевому участку, связано с конформационными изменениями в молекуле HSP70, приводящими к увеличению доступности определенных эпитопов субстрат-связывающего домена и усилению эффективности связывания с антителами. Это предположение подтверждает и тот факт, что параметр ΔHSP70ТШ не был обусловлен синтезом белка de novo. Подробная информация о конформационных изменениях в молекуле HSP70, при взаимодействии с белками, недавно была опубликована [Zhuravleva et al., 2012]. Можно предположить, что величина параметра ΔHSP70ТШ связана с распадом собственных агрегатов этого белка либо 97 отражает количество HSP70, которое высвобождается из комплексов с другими белками, и соответствует уровню шаперона, готовому для взаимодействия с новым субстратом. Белки HSP70 практически не встречаются в свободном от субстрата состоянии in vivo и находятся во взаимодействии с белками, нуклеотидами, мембранами, а также образуют аутоагрегаты (димеры, триммеры, олигомеры). Аутоагрегаты не обладают шаперонной активностью, при переходе белков в неагрегированное состояние активность восстанавливается. Соотношение в клетке олигомеровмономеров HSP70 зависит от температуры и определяется присутствием денатурированных белков [Angelidis et al., 1999]. Важно отметить, что в представленном анализе ΔHSP70ТШ был единственным параметром HSP70, который изменяется с возрастом. Было обнаружено достоверное увеличение значений медианы ΔHSP70ТШ как в группе пожилых доноров, так и в группе долгожителей в сравнении с контрольной группой молодых добровольцев. Учитывая, что процесс старения сопровождается накоплением агрегированных и неправильно свернутых белков [Cuanalo-Contreras et al., 2013], возможно, уровень ΔHSP70ТШ косвенно определяет количество поврежденных белков, которые провзаимодействовали с HSP70 в нейтрофилах, в то время как ТШ провоцирует смену поврежденных белков. Высвобождение внутриклеточных HSP70 в окружающую среду является иммунологически значимым событием: экспонированные на поверхности плазматической мембраны и циркулирующие в организме белки HSP70 рассматриваются как «сигнал опасности» для иммунокомпетентных клеток. Источником внеклеточных HSP70 могут служить сами клетки иммунной системы. Методом проточной цитометрии на поверхности нейтрофилов удалось зарегистрировать экспрессию HSP70 только при использовании поликлональных антител к этим белкам. Ранее уже было показано, что не все антитела к Hsp70 обладают способностью взаимодействовать с белком, связанным с плазматической мембраной [Multhoff and Hightower, 2011]. 98 В данной работе удалось показать, что в нейтрофилах происходит высвобождение не только индуцируемого, но и конститутивного белков HSP70. Феномен стресс-индуцируемого экзоцитоза в нейтрофилах был описан только для Hsp70 [Giraldo et al., 2010]. Локализация обнаружены в внутриклеточных цитоплазме, HSP70 ядре и весьма разнообразна: некоторых других они клеточных компартментах, где они выполняют различные функции [Daugaard et al., 2007]. Локализованные в лизосомах HSP70 играют важную роль в стабилизации их мембраны [Agarraberes and Dice, 2001]. В нейтрофилах, методом протеомного анализа HSP70 были найдены в специфических и желатиназных гранулах [Lominadze et al., 2005]. Поэтому можно было допустить, что высвобождение HSP70 в нейтрофилах сопряжено с процессом дегрануляции. Оказалось, что ТШ (43°C, 10 мин) не индуцирует увеличение экспрессии на поверхности плазматической мембраны нейтрофилов маркеров азурофильных, специфических гранул. В представленной работе в нейтрофилах ТШ инициировал появление на поверхности нейтрофилов маркера лизосом LAMP1. Это позволило предположить, что HSP70 могут высвобождаться в составе лизосом. Так как доля LAMP1-позитивных нейтрофилов после ТШ составляла не более 10%, а также учитывая скудное содержание этих белков в нейтрофилах, например, по сравнению с моноцитами, нейтрофилы нельзя рассматривать в качестве иммунологически значимого продуцента внеклеточных HSP70. Стресс-индуцированное высвобождение Hsp70 в составе лизосом ранее было продемонстрировано на опухолевых клетках [Mambula and Calderwood, 2006]. Нейтрофилы являются основными продуцентами АФК, которые регулируют протекание разнообразных клеточных сигнальных каскадов и экспрессию генов, а также окислительно модифицируют молекулы, число которых накапливается с возрастом [Squier,. 2001]. Поэтому в рамках работы была охарактеризована способность нейтрофилов в разных возрастных группах продуцировать АФК. 99 Данное исследование показало, что продукция АФК в нейтрофилах зависит от возраста. Нейтрофилы у пожилых доноров обладали менее эффективным ответом на стимул в виде продукции АФК (АФКЛЗХ инд) по сравнению с группой молодых, тогда как спонтанная продукция АФК (АФКЛЗХ спонт) в этой группе увеличивалась. В целом, это совпадает с опубликованными данными о возрастной зависимости продукции нейтрофилами АФК [Fortin et al., 2008; Ogawa et al., 2000]. Ранее уже было описано, что для пожилых характерно изменение кинетики индуцированной продукции АФК и снижение ответа на стимул [Fulop et al., 2004; Klut et al., 2002]. Внеклеточная продукция АФК, которая увеличивается с возрастом, может вносить вклад в состояние слабого воспаления, или статус «Inflamm aging», которое почти всегда сопровождает процесс старения [Peters et al., 2009]. С другой стороны, высокий уровень АФКЛЗХ спонт у долгожителей не соотносится с предположением, что увеличение продукции АФК является причиной уменьшения продолжительности жизни. Выявление особенностей клеточных параметров у долгожителей может быть полезным в контексте изучения модели «успешного старения» [Cevenini et al., 2008]. Нейтрофилы старых людей (старше 80 лет) по некоторым характеристикам (хемотаксис, фагоцитоз, экспрессия молекул адгезии, развитие апоптоза, параметры антиоксидантной системы и др) меньше отличаются от нейтрофилов молодых людей, по сравнению с нейтрофилами пожилых (60-70 лет) [Niwa et al., 1989; Moroni et al., 2005; Alonso-Fernández et al., 2008]. В нашем исследовании значения некоторых из параметров продукции АФК, зарегистрированных в группы долгожителей (90 лет и больше), были сходны со значениями аналогичных параметров в группе молодых доноров. В частности, медиана значений индуцированной продукции АФК (АФКЛЗХ инд) в группе долгожителей достоверно не отличалась от значений в группе молодых добровольцев, тогда как в группе пожилых доноров медиана была 100 ниже. Это указывает на то, что функции антимикробной иммунной защиты лучше выражены у долгожителей по сравнению с пожилыми донорами. Также уровень спонтанной внутриклеточной продукции АФК (АФКDCFспонт) в нейтрофилах долгожителей существенно не отличался от значений, зарегистрированных в группе молодых доноров, тогда как в группе пожилых этот уровень повышался. Это может означать, что регуляция внутриклеточных антиоксидантных механизмов нейтрофилах долгожителей, Следовательно, высокая чем в происходит нейтрофилах продукция АФК в лучше в пожилых доноров. нейтрофилах пожилых свидетельствует о высоком риске воздействия окислительного стресса на клетки. Учитывая, что уровень АФКЛЗХ спонт с возрастом возрастал, можно утверждать, что увеличение внеклеточной продукции АФК (АФКЛЗХ спонт) не подразумевает обязательного увеличения внутриклеточных АФК (АФКDCFспонт). Подтверждает это отсутствие взаимосвязи между спонтанным уровнем продукции АФК, зарегистрированной с помощью методов проточной цитометрии и ЛЗХ (АФКDCF спонт и АФКЛЗХ спонт, соответственно). По-видимому, внеклеточная продукция АФКЛЗХ спонт опосредована преимущественно работой NADPH-оксидазы, локализованной на внешней плазматической мембране, а продукция внутриклеточных АФК (АФК спонт) DCF связана с другими источниками. Соответственно, различные источники продукции АФК могут регулироваться по-разному. В то же время, разные методы измерения АФК могут определять разные формы АФК. Например, флуоресценция зонда DCF-DA считается пропорциональной концентрации перекиси водорода в клетках [Bass et al., 1983], тогда как другие типы АФК, в том числе супероксидный анион, могут быть измерены неспецифически ЛЗХ [Vladimirov and Proskurnina, 2009]. Один из основных вопросов, поставленных в этой работе, – есть ли связь между продукцией АФК и уровнем внутриклеточных HSP70 нейтрофилах. 101 Для того, чтобы ответить на этот вопрос, был проведен корреляционный анализ между параметрами HSP70 и АФК. Ряд корреляций (как положительных, так и отрицательных) выявил существование взаимосвязей между этими параметрами. Ранее уже было показано, что феномен термотолерантности клетки к термическому воздействию, обусловленному накоплением HSP70 в ответ на предварительный более щадящий ТШ, отменяет ингибирование активности ферментов NADPH–оксидазы после гипертермии, тем самым поддерживая постоянный уровень продукции АФК в фагоцитарных клетках [Polla et al., 1995]. Также известно, что спонтанная продукция АФК нейтрофилами отрицательно связана с концентрацией циркулирующих в плазме HSP70 [Ogawa et al., 2008]. Полученные нами данные демонстрируют, что взаимосвязь между параметрами внутриклеточного уровня HSP70 и продукции АФК в нейтрофилах имеет существенные различия в разных возрастных группах. В молодом возрасте низкий уровень спонтанной продукции АФКЛЗХ спонт связан с высоким уровнем HSP70. Это можно объяснить двумя механизмами: 1) базальный внутриклеточный уровень HSP70 лимитирует продукцию АФК; 2) первоначальный низкий уровень HSP70 может способствовать повышению АФКЛЗХ спонт, который, как уже было упомянуто, обусловлен преимущественно работой NADPH-оксидазы. Несмотря на то, что HSP70 рассматриваются в качестве компонента внутриклеточной защиты, сами эти белки могут подвергаться разрушительному действию АФК. Примером может служить АФК-опосредованное карбонилирование HSP70 с последующим расщеплением с помощью калпаина, который рассматривается в качестве механизма разрушения лизосом, связанного с окислительным стрессом [Yamashima, 2013]. Важно отметить, что ни одна из корреляций, обнаруженных в группе молодых добровольцев, не сохранялась в других возрастных группах. В группе долгожителей спонтанная продукция АФК (АФКDCF спонт, АФКЛЗХ спонт) отрицательно коррелировала с параметром ΔHSP70ТШ, который 102 как было в работе показано, зависит от возраста и достигает максимальных значений в группе долгожителей. Пожилые доноры образовали единственную возрастную группу, где уровень HSP70 (HSP70basal, HSP70HS and ΔHSP70HS) положительно коррелировал с индуцированной продукцией АФК (АФКЛЗХ инд). Вероятно, достаточное количество внутриклеточного HSP70 позволяет поддерживать ответ нейтрофилов в виде продукции АФК на патоген, который, как ранее было показано, снижен у пожилых доноров. В виду того, что корреляции между определенными параметрами HSP70 и АФК носили не постоянный характер и изменялись в разных возрастных группах, нельзя исключать, что существуют другие регуляторные механизмы, которые играют роль посредников между работой HSP70 и продукцией АФК в нейтрофилах. Принимая во внимание теорию старения, основанную на клеточной гиперфункции [Blagosklonny MV., 2012a], можно объяснить различия взаимосвязи внутриклеточного уровня HSP70 и продукции АФК в разных возрастных группах. Согласно упомянутой теории, активация метаболизма сигнального пути, ингибируемого рапамицином (mTOR), который приводит к чрезмерной стимуляции клетки и ее гиперфункции, является основным фактором, вызывающим старение [Blagosklonny MV., 2012b]. Хроническое воспаление рассматривается как пример гиперфункции [Franceschi et al., 2000]. В нейтрофилах mTOR-путь регулирует продукцию воспалительных цитокинов, образование NET и АФК [Lindemann et al., 2004; Itakura and McCarty 2013; Rolas et al., 2013]. В свою очередь, сами АФК вовлечены в регуляцию метаболизма mTOR-пути [Radisavljevic and Gonzalez-Flecha, 2004]. Учитывая это, можно предположить, TOR-сигнальные пути гиперактивированы в нейтрофилах большинства пожилых доноров, и это сопутствует или приводит к увеличению продукции АФК в этих клетках. Гиперактивация может инициировать 103 развитие компенсаторной резистентности, которая выражается в уменьшении индуцированной продукции АФК в ответ на опсонизированный зимозан в группе пожилых. В условиях резистентности к стимулирующим сигналам и гиперпродукции спонтанных АФК (АФКDCF спонт и АФКЛЗХ спонт) HSP70 принимают участие в регуляции сигнальных путей клетки, в том числе mTOR [Dokladny et al., 2013], которые могут поддерживать зимозан-индуцированный ответ нейтрофилов. Это может объяснить, наличие положительной корреляции между зимозан-индуцированной продукцией АФК и всех анализируемых параметров HSP70 (Таблица 1). Таким параметрами образом, HSP70 отсутствие и АФК в положительной нейтрофилах корреляции между долгожителей может рассматриваться как фактор, связанный с увеличением продолжительности жизни людей. И наоборот, положительная связь между уровнем внутриклеточных HSP70 и индуцированной продукцией АФК может ассоциироваться с высоким риском смертности до 90 лет. 104 Выводы 1. В нейтрофилах человека не обнаружено достоверных возрастных изменений в общем внутриклеточном содержании HSP70. В то же время, разница между уровнем HSP70 после теплового шока и исходным внутриклеточным уровнем HSP70 увеличивалась с возрастом. 2. Индуцированное тепловым шоком кратковременное возрастание внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах, измеренного методом проточной цитометрии, не связано с синтезом белка de novo, а обусловлено временными конформационными изменениями белка, сопровождающимися усилением доступности эпитопов субстрат-связывающего домена к специфичным антителам. 3. Вызванные тепловым шоком изменения внутриклеточного уровня HSP70 характерны для конститутивного (Hsc70) и индуцированного (Hsp70) белков семейства HSP70. 4. В нейтрофилах в условиях гипертермии реализуется активный механизм высвобождения как Hsp70, так и Hsc70, сопряженный с процессом дегрануляции лизосом. 5. В группе пожилых доноров спонтанная внутриклеточная и внеклеточная индуцированная продукция – АФК в нейтрофилах уменьшается. В группе увеличивается, долгожителей а величины спонтанной внутриклеточной и индуцированной продукции АФК ниже, чем в группе пожилых, и достоверно не отличаются от аналогичных параметров, определенных в группе молодых добровольцев. 6. С помощью корреляционного анализа в группе пожилых выявлена положительная взаимосвязь внутриклеточного уровня HSP70 и индуцированной продукции АФК в нейтрофилах, аналогичная взаимосвязь отсутствовала в группах молодых и долгожителей. Указанное различие между группами пожилых и долгожителей может быть связано с высоким риском смертности в пожилом возрасте до 90 лет. 105 Список литературы 1. Бойко А.А., Ветчинин С.С., Сапожников А.М., Коваленко Е.И. (2014). Изменение уровня белков теплового шока семейства 70 кДа в нейтрофилах человека под действием теплового шока. Биоорганическая химия. 40(5):528–540. 2. Ветчинин С.С., Белова Е.В., Баранов А.М., Сапожников А.М., Маргулис Б.А. (2010 а). Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus 2Е4 - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку теплового шока 70. Патент, номер публикации:2381271. http://www.fips.ru. 3. Ветчинин С.С., Николаева О.Г., Галкина Е.В., Сапожников А.М., Маргулис Б.А. (2010 б). Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus 6G2 - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку теплового шока 70. Патент, номер публикации:2380413. http://www.fips.ru. 4. Гужова И.В. и Маргулис Б.А. (2000). Индукция и накопление БТШ70 приводят к формированию его комплексов с другими клеточными белками. Цитология. 42:647-652. 5. Кулинский оксидативная В.И. (1999). модификация Активные макромолекул: формы польза, кислорода вред и и защита. Соросовский образовательный журнал. 5:17-26. 6. Мальцева В.Н. (2007). Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo. Диссертация кандидата биологических наук, Пущино. Библиогр. 137 РГБ ОД, 61:07-3/1564. 113. 7. Маргулис Б.А и Гужова И.В. (2000). Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42(4):323-342. 8. Маргулис Б.А. и Гужова И.В. (2009). Двойная роль шаперонов в ответе клетки и всего организма на стресс. Цитология. 51(3): 219-228. 106 9. Abram C.L. and Lowel C.A. (2009). The ins and outs of leukocyte integrin signaling. Annu. Rev. Immunol. 27:339-362. 10. Agarraberes F.A. and Dice J.F. (2001). A molecular chaperone complex at the lysosomal membrane is required for protein translocation. J. Cell. Sci. 114:2491-2499. 11. Ahluwalia J., Tinker A., Clapp L.H., Duchen M.R., Abramov A.Y., Pope S., Nobles M. and Segal A.W. (2004). The large-conductance Ca2+activated K+ channel is essential for innate immunity. Nature. 427:853–858. 12. Alonso-Fernández P., Puerto M., Maté I., Ribera J.M. and de la Fuente M. (2008). Neutrophils of centenarians show function levels similar to those of young adults. J Am. Geriatr. Soc. 56(12):2244-2251. 13. Andrei C., Dazzi C., Lotti L., Torrisi M.R., Chimini G. and Rubartelli A. (1999). The secretory route of the leaderless protein interleukin 1beta involves exocytosis of endolysosome-related vesicles. Mol. Biol. Cell. 10:1463-1475. 14. Angelidis C.E., Lazaridis I. and Pagoulatos G.N. (1999). Aggregation of hsp70 and hsc70 in vivo is distinct and temperature-dependent and their chaperone function is directly related to non-aggregated forms. Eur. J. Biochem. 259 (1-2):505-512. 15. Arai T., Yoshikai Y., Kamiya J., Nagino M., Uesaka K., Yuasa N., Oda K., Sano T. and Nimura Y.J. (2001). Bilirubin impairs bactericidal activity of neutrophils through an antioxidant mechanism in vitro. Surg. Res. 96(1):107-113. 16. Arispe N., Doh M. and De Maio A. (2002). Lipid interaction differentiates the constitutive and stress-induced heat shock proteins Hsc70 and Hsp70. Cell Stress Chaperones. 7:330–338. 17. Arispe N., Doh M., Simakova O., Kurganov B. and De Maio A. (2004). Hsc70 and Hsp70 interact with phosphatidylserine on the surface of PC12 cells resulting in a decrease of viability. FASEB J. 18:1636–1645. 18. Arita M., Ohira T., Sun Y.P., Elangovan S., Chiang N. and Serhan C.N. (2007). Resolvin E1 selectively interacts with leukotriene B4 receptor BLT1 and ChemR23 to regulate inflammation. J. Immunol. 178:3912-3917. 107 19. Arnhold J. (2004). Properties, functions, and secretion of human myeloperoxidase. Biochemistry (Mosc). 69(1):4–9. 20. Asea A., Kraeft S.K., Kurt-Jones E.A., Stevenson M.A., Chen L.B., Finberg R.W., Koo G.C. and Calderwood S.K. (2000). HSP70 stimulates cytokine production through a CD14-dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. Nat Med. 6(4):435-442. 21. Asea A., Rehli M., Kabingu E., Boch J.A., Bare O., Auron P.E., Stevenson M.A. and Calderwood S.K. (2002). Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J. Biol. Chem. 277:15028-15034. 22. Babior B.M., Kipnes R.S. and Curnutte J.T. (1973). Biological defense mechanisms: the production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52:741-744. 23. Bainton D.F. (1993). Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function. Adv. Exp. Med. Biol. 336:17–33. 24. Balaban R.S., Nemoto S., Finkel T. (2005). Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120:483-495. 25. Barreto A., Gonzalez J.M., Kabingu E., Asea A. and Fiorentino S. (2003). Stress-induced release of HSC70 from human tumors. Cell. Immunol. 222: 97-104. 26. Bass D.A., Parce J.W., Dechatelet L.R., Szejda P., Seeds M.C. and Thomas M. (1983). Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: a graded response to membrane stimulation. J. Immunol. 130(4):19101917. 27. Basu S., Binder R.J., Suto R., Anderson K.M. and Srivastava P.K. (2000). Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, wich deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NF-kappa B pathway. Int. Immunol. 12:1539-1546. 108 28. Basu, S., Binder R.J., Ramalingam T., Srivastava P.K. (2001). CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity. 14:303-313. 29. Bausero M.A., Gastpar R., Multhoff G. and Asea A. (2005). Alternative mechanism by wich IFN-gamma enhances tumor recognition: active release of heat shock protein 72. J. Immunol. 175: 2900-2912. 30. Beaulieu A.D., Paquin R., Rathanaswami P. and McColl S.R. (1992). Nuclear signaling in human neutrophils: stimulation of RNA synthesis as a response to a limited number of proinflomatory agonists. . J. of Biol. Chem. 267 (1):426-432. 31. Becker T., Hartl F.U. and Wieland F. (2002). CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. J. Cell. Biol. 158:1277-1285. 32. Beere H.M. (2005). Death versus survival: functional interaction between the apoptotic and stress inducible heat shock protein pathways. J. Clin. Invest. 15:2633-2639. 33. Beere H.M. (2004). The stress of dying': the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J. Cell Sci. 117:2641-2651. 34. Behnke J. and Hendershot L.M. (2014). The large Hsp70 Grp170 binds to unfolded protein substrates in vivo with a regulation distinct from conventional Hsp70s. J. Biol. Chem. 289(5):2899-2907. 35. Bernadett K. and Greensmith L. (2009). Induction of heat shock proteins for protection against oxidative stress. Advanced Drug Delivery Reviews. 61:310-318. 36. Bhatnagar S., Shinagawa K., Castellino F.J. and Schorey J.S. (2007). Exosomes released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and in vivo. Blood. 110:3234–3244. 37. Binder R.J. (2009). CD40-independent engagement of mammalian hsp70 by antigen-presenting cells. J. Immunol. 182:6844–6850. 109 38. Binet F., Chiasson S. and Girard D. (2010). Evidence that endoplasmic reticulum (ER) stress and caspase-4 activation occur in human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 391(1):18-23. 39. Blagosklonny M.V. (2008). ROS or TOR. Cell Cycle. 7(21):3344- 3354. 40. Blagosklonny M.V. (2012a). Answering the ultimate question ― what is the proximal cause of aging?‖. Aging. 4(12):861-877. 41. Blagosklonny M.V. (2012b). Cell cycle arrest is not yet senescence, which is not just cell cycle arrest: terminology for TOR-driven aging. Aging (Albany NY). 4(3):159-165. 42. Blake, M.J., Udelsman R., Feulner, G.J., Norton, D.D. and Holbrook, N.J. (1991). Stress-induced heat shock protein 70 expression in adrenal cortex: an adrenocorticotropic hormone-sensitive, age-dependent response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9873–9877. 43. Bocanegra V., Manucha W., Peña M.R. and Cacciamani V. (2010). Caveolin-1 and Hsp70 interaction in microdissected proximal tubules from spontaneously hypertensive rats as an effect of Losartan. J. Hypertens. 28(1):143155. 44. Bokoch G.M. and Knaus U.G. (1994). The role of small GTP-binding proteins in leukocyte function. Curr. Opin. Immunol. 6(1):98-105. 45. Borregaard N. and Cowland J.B. (1997). Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89:3503–3521. 46. Borregaard N., Kjeldsen L., Rygaard K., Bastholm L., Nielsen M.H., Sengeløv H., Bjerrum O.W., Johnsen A.H. (1992). Stimulus-dependent secretion of plasma proteins from human neutrophils. J. Clin. Invest. 90(1):86–96. 47. Boveris A. (1984). Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria. Methods Enzymol. 105:429-435. 48. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S, Weinrauch Y. and Zychlinsky A. (2004). Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303(5663):1532-1535. 110 49. Brú, J.C., Souto S., Alcolea R., Antón A., Remacha M., Camacho M., Soler M., Brú I., Porres A. and Vila L. (2009). Tumour cell lines HT-29 and FaDu produce proinflammatory cytokines and activate neutrophils in vitro: possible applications for neutrophil-based antitumour treatment. Mediators Inflamm. 2009:817498. doi: 10.1155/2009/817498. 50. Bullen J.J. and Armstrong J.A. (1979). The role of lactoferrin in the bactericidal function of polymorphonuclear leucocytes. Immunology. 36:781–791. 51. Bundgaard J.R., Sengelov H., Borregaard N. and Kjeldsen L. (1994). Molecular cloning and expression of a cDNA encoding NGAL: a lipocalin expressed in human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 202:1468– 1475. 52. Calderwood S.K., Murshid A. and Prince T. (2009). The shock of aging: molecular chaperones and the heat shock response in longevity and aging. Gerontology. 55(5):550-558. 53. Calderwood, S.K., Theriault J.R. and Gong J. (2005). Message in a bottle: role of the 70 kilodalton heat shock protein family in anti-tumor immunity. Eur. J. immunol. 35:2518-2527. 54. Callahan M.K., Chaillot D., Jacquin C., Clark P.R. and Minoret A. (2002). Differential acquisition of antigenic peptides by Hsp70 and Hsc70 under oxidative conditions. J. Biol. Chem. 277(37):33604-33609. 55. Campisi J. and Fleshner M. (2003). Role of extracellular HSP72 in acute stress-induced potentiation of innate immunity in active rats. J. Appl. Physiol. 94:43-52. 56. Cash J.L., Christian A.R. and Greaves D.R. (2010). Chemerin peptides promote phagocytosis in a ChemR23- and Syk-dependent manner. J.Immunol. 184:5315-5324. 57. Cassatella M.A., Meda L., Bonora S., Ceska M. and Costantin G. (1993). Interleukin 10 inhibites the release of proinflammatory cytokines from human polymorphonuclear leukocytes. Evidence for an autocrine role of TNFα and 111 IL-1β in mediating the production of IL-8 triggered by lipopolysaccharide. J. Exp. Med. 178: 2207-2212. 58. Cassatella M. (2010). Fundamentals of inflammation, Neutrophils II. Cambridge University Press. 4B:52. 59. Cevenini E, Invidia L, Lescai F, Salvioli S, Tieri P, Castellani G and Franceschi C. (2008). Human models of aging and longevity. Expert. Opin. Biol. Ther. 8(9):1393-1405. 60. Chalmin F., Ladoire S., Mignot G., Vincent J., Bruchard M. Remy- Martin J.P., Boireau W., Rouleau A., Simon B., Lanneau D., De Thonel A., Multhoff G., Hamman A., Martin F., Chauffert B., Solary E., Zitvogel L., Garrido C., Ryffel B., Borg C., Apetoh L., Rébé C., Ghiringhelli F. (2010). Membraneassociated Hsp72 from tumor-derived exosomes mediates STAT3-dependent immunosuppressive function of mouse and human myeloid-derived suppressor cells. J. Clin. Invest. 120(2):457–471. 61. Chen, S. and Brown. I. R. (2007). Translocation of constitutively expressed heat shock protein Hsc70 to synapse-enriched areas of the cerebral cortex after hyperthermic stress. J. Neurosci. Res. 85(2):402-409. 62. Cieutat A.M., Lobel P., August J.T., Kjeldsen L., Sengeløv H., Borregaard N. and Bainton D.F. (1998). Azurophilic granules of human neutrophilic leukocytes are deficient in lysosome-associated membrane proteins but retain the mannose 6-phosphate recognition marker. Blood. 91(3): 1044-1055. 63. Clayton, A., Turkes A., Navabi H., Mason M.D. and Tabi Z. (2005). Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. J. Cell. Sci. 118:3631-3638. 64. Cline M. (1966). Phagocytosis and synthesis or ribonucleic acid in human granulocytes. Nature. 212(5069):1431-1433. 65. Colotta F.R., Polentarutti N., Sozzani S. and Mantovani A. (1992). Modulation of granulocyte survival and programmed cell death by cytokines and bacterial products. Blood. 80:2012-2020. 66. Coxon A., Cullere X., Knight S., Sethi S.,WakelinM.W., Stavrakis G., Luscinskas F.W., Mayadas T.N. (2001). FcγRIII mediates neutrophil recruitment 112 to immune complexes. A mechanism for neutrophil accumulation in immunemediated inflammation. Immunity. 14(6):693–704. 67. Cuanalo-Contreras K., Mukherjee A. and Soto C. (2013). Role of protein misfolding and proteostasis deficiency in protein misfolding diseases and aging. Int. J. Cell Biol. 2013:638083. doi: 10.1155/2013/638083. 68. Da Silva K.P. and Borges J.C. (2011). The molecular chaperone Hsp70 family members function by a bidirectional heterotrophic allosteric mechanism. Protein Pept. Lett. 18(2):132-142. 69. Daëron M., Jaeger S., Du Pasquer L. and Vivier E. (2008). Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs: a quest in the past and future. Immunol. Rev. 224:11-43. 70. Dahlgren C., Carlsson S.R., Karlsson A., Lundqvist H. and Sjölin C. (1995). The lysosomal membrane glycoproteins Lamp-1 and Lamp-2 are present in mobilizable organelles, but are absent from the azurophil granules of human neutrophils. J. Biochem. 311(2):667–674. 71. Daugaard M, Rohde M and Jäättelä M. (2007). The heat shock protein 70 family: Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions. FEBS Lett. 581(19):3702-3710. 72. Davies, E.L., Bacelar M.M., Marshall M.J., Johnson E., Wardle T.D., Andrew S.M. and Williams J.H. (2006). Heat shock proteins form part of a danger signal cascade in response to lipopolysaccharide and GroEL. Clin. Exp. Immunol. 145(1):183-189. 73. De Maio A. (2011). Extracellular heat shock proteins, cellular export vesicles, and Stress Observation System: a form of communication during injury, infection, and cell damage. It is never known how far a controversial finding will go! Dedicated to Ferruccio Ritossa. Cell Stress and Chaperones. 16:235-249. 74. Deban L., Russo R.C., Sironi M., Moalli F., Scanziani M., Zambelli V., Cuccovillo I., Bastone A., Gobbi M. and Valentino S. (2010). Regulation of leukocyte recruitment by the long pentraxin PTX3. Nat. Immunol. 11:328-334. 113 75. DeCoursey T.E., Morgan D. and Cherny V.V. (2003). The voltage dependence of NADPH oxidase reveals: why phagocytes need proton channels. Nature. 422:531–534. 76. Di Carlo E., Forni G., Lollini P. L., Colomobo M. P., Modesti A. and Musiani P. (2001). The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97:339-345. 77. Dokladny K., Zuhl M. N., Mandell M., Bhattacharya D., Schneider S., Deretic V. and Moseley P. L. (2013). Regulatory coordination between two major intracellular homeostatic systems: heat shock response and autophagy. J. Biol. Chem. 288:14959-14972. 78. Dubinina E.E. (2001). The role of reactive oxygen species as signal molecules in tissue metabolism in oxidative stress Vopr. Med. Khim. 47(6):561581. 79. Durant S., Korkmaz B., Horwitz M.S., Jenne D.E. and Gauthier F. (2010). Neutrophil elastase, proteinase 3, and cathepsin G as therapeutic targets in human diseases. Pharmacol. Rev. 62(4):726-759. 80. Edrey Y.H. and Salmon A.B. (2014). Revisiting an age-old question regarding oxidative stress. Free. Radic. Biol. Med. 71:368-378. 81. Edwards S.W. and Hallett M.B. (1997). Seeing the wood for the trees: the forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Immunol.Today. 18:320324. 82. Eid N.S., Kravath R.E. and Lanks K.W. (1987). Heat-shock protein synthesis by human polymorphonuclear cells J. Exp. Med. 165:1448-1452. 83. Evdokimovskaya Y., Skarga Y., Vrublevskaya V. and Morenkov O. (2010). Secretion of the heat shock proteins HSP70 and HSC70 by baby hamster kidney (BHK-21) cells. Cell. Biol. Int. 34(10):985-990. 84. Evdonin A.L., Martynova M.G., Bystrova O.A., Guzhova I.V., Margulis B.A. and Medvedeva N.D. (2006). The release of Hsp70 from A431 114 carcinoma cells is mediated by secretory-like granules. Eur. J. Cell. Biol. 85:443455. 85. Febbraio M.A., Steensberg A., Walsh R., Koukoulas I., van Hall G., Saltin B. and Pedersen B.K. (2002). Reduced glycogen availability is associated with an evation in HSP72 in contracting human skeletal muscle. J. Physiol. 538:911–917. 86. Ferrando-Martínez S., Romero-Sánchez M.C., Solana R., Delgado J., de la Rosa R., Muñoz-Fernández M.A., Ruiz-Mateos E. and Leal M. (2013). Thymic function failure and C-reactive protein levels are independent predictors of all-cause mortality in healthy elderly humans. Age. 35(1):251-259. 87. Fortin C.F., McDonald P.P., Lesur O. and Fülöp T.J. (2008). Aging and neutrophils: there is still much to do. Rejuvenation. Res. 11(5):873-882. 88. Fox S., Leitch A.E., Duffin R., Haslett C. and Rossi A.G. (2010). Neutrophil apoptosis: relevance to the innate immune response and inflammatory disease. J. Innate Immun. 2:216–227. 89. Franceschi C., Bonafè M., Valensin S., Olivieri F., De Luca M., Ottaviani E. and De Benedictis G. (2000). Inflamm-aging. An evolutionary perspective on immunosenescence. Ann. N. Y. Acad. Sci. 908:244-254. 90. Franceschi C., Valensin S., Bonafè M., Paolisso G., Yashin A.I., Monti D. and De Benedictis G. (2000). The network and the remodeling theories of aging: historical background and new perspectives. Exp. Gerontol. 35(6-7):879896. 91. Fulop T., Larbi A., Douziech N., Fortin C., Guérard K.P., Lesur O., Khalil A. and Dupuis G. (2004). Signal transduction and functional changes in neutrophils with aging. Aging Cell. 3(4):217-226. 92. Fülöp T.J., Fouquet C., Allaire P., Perrin N., Lacombe G., Stankova J., Rola-Pleszczynski M., Gagné D., Wagner J.R., Khalil A. and Dupuis G. (1997). Changes in apoptosis of human polymorphonuclear granulocytes with aging. Mech. Ageing. Dev. 96:15–34. 115 93. Fuortes M., Melchior M., Han H., Lyon G.J. and Nathan C. (1999). Role of the tyrosine kinase pyk2 in the integrindependent activation of human neutrophils by TNF. J. Clin. Invest. 104:327–335. 94. receptors Futosi K., Fodor S. and Mócsai A. (2013). Neutrophil cell surface and their intracellular signal transduction pathways. Int. Immunopharmacol. 17(3):638–650. 95. Galligan C. and Yoshimura T. (2003). Phenotypic and functional changes of cytokine-activated neutrophils. Chem. Immunol. Allergy. 83:24-44. 96. Gao B. and Tsan M.F. (2003). Endotoxin contamination in recombinant human heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor α release by murine macrophages. J. Biol. Chem. 278:174–179. 97. García-García E. and Rosales C. (2002). Signal transduction during Fc- receptor-mediated phagocytosis. J. Leukoc. Biol. 72:1092-1108. 98. Gastpar R., Gross C., Rossbacher L., Ellwart J., Riegger J. and Multhoff G. (2004). The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J. Immunol. 172:972–980. 99. Giraldo E., Multhoff G. and Ortega E. (2010). Noradrenaline increases the expression and release of Hsp72 by human neutrophils. Brain Behav. Immun. 24(4):672-677. 100. Goldenthal K.L., Hedman K., Chen J.W., August J.T. and Willingham M.C. (1985). Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. J. Histochem. Cytochem. 33(8):813-820. 101. Gresham H.D., Goodwin J.L., Allen P.M., Anderson D.C. and Brown E.J. (1989). A novel member of the integrin receptor family mediates Arg-GlyAsp-stimulated neutrophil phagocytosis. J. Cell. Biol. 108(5):1935-1943. 116 102. Gross C., Hansch D., Gastpar R. and Multhoff G. (2003). Interaction of heat shock protein 70 peptide with NK cells involves the NK receptor CD94. Biol. Chem. 384:267–279. 103. Gross C., Koelch W., DeMaio A., Arispe N. and Multhoff G. (2003). Cell surface-bound heat shock protein 70 (Hsp70) mediates perforin independent apoptosis by specific binding and uptake of granzyme B. J.Biol. Chem. 278:4117341181. 104. Gullberg U., Bengtsson N., Bulow E., Garwicz D., Lindmark A. and Olsson I. (1999). Processing and targeting of granule proteins in human neutrophils. J. Immunol. Methods; 232:201–210. 105. Günther E. and Walter L. (1994). Genetic aspects of the hsp70 multi- family in vertebrates. Experientia. 50: 987–1001. 106. Gupta S.C., Siddique H.R., Mathur N., Vishwakarma A.L., Mishra R.K.,Saxena D.K. and Chowdhuri D.K. (2007). Induction of hsp70, alterations in oxidative stress markers and apoptosis against dichlorvos exposure in transgenic Drosophila melanogaster: modulation by reactive oxygen species. Biochim. Biophys. Acta. 1770(9):1382-1394. 107. Guzhova I. and Margulis B. (2006). Hsp70 Chaperone as a survival factor in cell pathology international. Int. Rev. Cytol. 254: 101–149. 108. Guzhova I.V., Darieva Z.A., Melo A.R. and Margulis B.A. (1997). Major stress protein Hsp70 interacts with NF-kB regulatory complex in human Tlymphoma cells. Cell Stress Chaperones. 2:132-139. 109. Halliwell B. (1989). Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis. Br. J. Exp. Pathol. 70:737–757. 110. Halliwell B. (2007). Oxidative stress and cancer: have we moved forward. J. Biochem. 401: 1–11. 117 111. Harman D. (1956). Ageing: a theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol. 11:298-300. 112. Hauet-Broere F., Wieten L., Guichelaar T., Berlo S., van der Zee R. and Van Eden W. (2006). Heat shock proteins induce T cell regulation of chronic inflammation. Ann. Rheum. Dis. 65(3): iii65–iii68. doi:10.1136/ard.2006.058495. 113. Hazeldine J., Harris P., Chapple I.L., Grant M., Greenwood H., Livesey A., Sapey E. and Lord J.M. (2014). Impaired neutrophil extracellular trap formation: a novel defect in the innate immune system of aged individuals. Aging Cell. 13(4):690-698. 114. Helmbrecht K., Zeise E. and Rensing L. (2000). Chaperone in cell cycle regulation and mitogenic signal transduction: a review. Cell Prolif. 33: 341365. 115. Henderson L.M., Chappell J.B. and Jones O.T. (1988). Superoxide generation by the electrogenic NADPH oxidase of human neutrophils is limited by the movement of a compensating charge. Biochem. J. 255:285–290. 116. Hibbs M.S. and Bainton D.F. (1989). Human neutrophil gelatinase is a component of specific granules. J. Clin. Invest. 84:1395–1402. 117. Hightower L. E. and Guidon P.T. (1989). Selective release from cultured mammalian cells of heat-shock (stress) proteins that resemble gliaaxon transfer proteins. J. Cell Physiol. 138:257-266. 118. Höhfeld J. (1998). Regulation of the heat shock conjugate Hsc70 in the mammalian cell: the characterization of the anti-apoptotic protein BAG-1 provides novel insights. Biol. Chem. 379(3):269-274. 119. Höhn A., König J. and Grune T. (2013). Protein oxidation in aging and the removal of oxidized proteins. J. Proteomics. 92:132-159. 120. Hole P.S., Pearn L., Tonks A.J., James P.E., Burnett A.K., Darley R.L. and Tonks A. (2010). Ras-induced reactive oxygen species promote growth factorindependent proliferation in human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 115(6):1238-1246. 118 121. Hunter-Lavin C., Davies E.L, Bacelar M. M., Marshall M. J., Andrew S. M. and William J.H. (2004). Hsp70 release from peripheral blood mononuclear cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324(2): 511–517. 122. Hut H.M., Kampinga H.H. and Sibon O.C. (2005). Hsp70 protects mitotic cells against heat-induced centrosome damage and division abnormalities. Mol.Biol. Cell. 16:3776-3785. 123. Iking-Konert C., Vogl T., Prior B., Wagner C., Sander O., Bleck E., Ostendorf B., Schneider M., Andrassy K., Hänsch G.M. (2008). T lymphocytes in patients with primary vasculitis: expansion of CD8+ T cells with the propensity to activate polymorphonuclear neutrophils. Rheumatology (Oxford). 47(5):609-616. 124. Itakura A. and McCarty O.J.T. (2013). Pivotal role for the mTOR pathway in the formation of neutrophil extracellular traps via regulation of autophagy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305:C348–C354. 125. Iyer S.S., Pearson D. W., Nauseef W. M. and Clark R. A. (1994). Evidence for a readily dissociable complex of p47phox and p67phox in cytosol of unstimulated human neutrophils. J. Biol. Chem. 269(35):22405-22411. 126. Jaattela M. (1999). Heat shock proteins as cellular lifeguards. Ann. Med. 31:261–271. 127. Jack R.M. and Fearon D.T. (1988). Selective synthesis of mRNA and proteins by human peripheral blood neutrophils. J. Immunol. 140(12):4286-4293. 128. Jaillon S., Galdiero M.R., Del Prete D., Cassatella M.A., Garlanda C. and Mantovani A. (2013). Neutrophils in innate and adaptive immunity. Semin. Immunopathol. 35(4):377-394. 129. Jiang J., Prasad K., Lafer E. M. and Sousa R. (2005). Structural basis of interdomain communication in the Hsc70 chaperone. Mol. Cell. 20:513–524. 130. Johnson J. and Fleshner M. (2006). Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J. Leukoc. Biol. 79:425-434. 119 131. Jornot L., Mirault M.E. and Junod A.F. (1991). Differential expression of hsp70 stress proteins in human endothelial cells exposed to heat shock and hydrogen peroxide. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 5(3):265-275. 132. Kallenberg C.G. (2011). Pathogenesis of ANCA-associated vasculitis, an update. Clin. Rev. Allergy. Immunol. 41(2):224-231. 133. Kampinga H.H, Hageman J.,Vos M.J., Kubota H., Tanguay R.M., Bruford E.A., Cheetham M.E., Chen B. and Hightower L.E. (2009). Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress and Chaperones. 14:105–111. 134. Kaufmann S.H. (1990). Heat-shock proteins: a link between rheumatoid arthritis and infection? Curr. Opin. Rheumatol. 2:430–435. 135. Kensler T.W., Wakabayashi N., Biswal S. (2007). Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway. Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol. 47: 89-116. 136. Khan N.A. and Sotelo J. (1989). Heat shock stress is deleterious to CNS cultured neurons microinjected with anti-HSP70 antibodies. Biol. Cell. 65:199–202. 137. Kirkwood T.B. (2005). Understanding the odd science of aging. Cell. 120(4):437-447. 138. Kityk R., Kopp J., Sinning I. and Mayer M. (2012). Structure and dynamics of the ATP-bound open conformation of Hsp70 chaperones. Molecular Cell. 48: 863-874. 139. Klebanoff S.J. (1974). Role of the superoxide anion in the myeloperoxidase-mediated antimicrobial system. J. Biol. Chem. 249(12):37243728. 140. Klut M.E., Ruehlmann D.O., Li L., Whalen B.A., Van Breemen C. and Hogg J.C. (2002). Age-related changes in the calcium homeostasis of adherent neutrophils. Exp. Gerontol. 37:533–541. 120 141. Kobayashi K., Takahashi K. and Nagasawa S. (1995). The role of tyrosine phosphorylation and Ca2+ accumulation in Fc gamma-receptor-mediated phagocytosis of human neutrophils. J. Biochem. 117(6):1156-1161. 142. Kotoglou P., Kalaitzakis A., Vezyraki P., Tzavaras T., Michalis L.K., Dantzer F., Jung J.U. and Angelidis C. (2009). Hsp70 translocates to the nuclei and nucleoli, binds to XRCC1 and PARP-1, and protects HeLa cells from single-strand DNA breaks. Cell Stress Chaperones. 14(4):391-406. 143. Kovalchin J.T., Wang R., Wagh M.S., Azoulay J., Sanders M. and Chandawarkar R.Y. (2006). In vivo delivery of heat shock protein 70 accelerates wound healing by up-regulating macrophage-mediated phagocytosis. Wound Repair Regen. 14:129–137. 144. Kregel K.C. and Zhang H.J. (2007). An integrated view of oxidative stress in aging: basic mechanisms, functional effects, and pathological considerations. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292(1):18-36. 145. Krepuska M., Szeberin Z., Sótonyi P., Sarkadi H., Fehérvári M., Apor A., Rimely E., Prohászka Z. and Acsády G. (2011). Serum level of soluble Hsp70 is associated with vascular calcification. Cell Stress Chaperones. 16(3):257-265. 146. Lacy P. and Eitzen G. (2008). Control of granule exocytosis in neutrophils. Front. Biosci. 13:5559-5570. 147. Lancaster G. I. and Febbraio M.A. (2005). Exosome - dependent trafficking of HSP70: a novel secretory pathway for cellular stress proteins. J. Biol. Chem. 280:23349-23355. 148. Levy O.A (2000). Neutrophil-derived anti-infective molecule: bactericidal/permeability-increasing protein antimicrob. Antimicrob. Agents Chemother. 44(11): 2925-2931. 149. Lew D.P., Andersson T., Hed J., Di Virgilio F., Pozzan T. and Stendahl O. (1985). Ca2+-dependent and Ca2+-independent phagocytosis in human neutrophils. Nature. 315(6019):509-511. 121 150. Lew P.D., Monod A., Waldvogel F.A., Dewald B., Baggiolini M. and Pozzan T. (1986). Quantitative analysis of the cytosolic free calcium dependency of exocitosis from three subcellular compartmentes in intact human neutrophils J. Cell Biol. 102:2197-2204. 151. Li Z., Jiang H., Xie W., Zhang Z., Smrcka A.V. and Wu D. (2000). Roles of PLC-β2 and -β3 and PI3Kγ in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287:1046–1049. 152. Lindemann S.W., Yost C.C., Denis M.M., McIntyre T.M., Weyrich A.S., Zimmerman G.A. (2004). Neutrophils alter the inflammatory milieu by signal-dependent translation of constitutive messenger RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 101(18):7076-7081. 153. Lindquist S. (1986). The heat-shock response. Annu. Rev. Biochem. 55:1151-1191. 154. Liu Q.L., Kishi H., Ohtsuka K. and Muraguchi A. (2003). Heat shock protein 70 binds caspase-activated DNase and enhances its activity in TCRstimulated T cells. Blood. 102:1788-1796. 155. Liu W., Chen Y., Lu G., Sun L. and Si J. (2011). Down-regulation of HSP70 sensitizes gastric epithelial cells to apoptosis and growth retardation triggered by H. Pylori. BMC Gastroenterol. 11:146. doi: 10.1186/1471-230X-11146. 156. Lominadze G, Powell DW, Luerman GC, Link AJ, Ward RA and McLeish KR. (2005). Proteomic analysis of human neutrophil granules. Mol. Cell Proteomics. 4(10):1503-1521. 157. Lowell C.A. and Berton G. (1999). Integrin signal transduction in myeloid leukocytes. J. Leukoc. Biol. 65:313–320. 158. Maloyan A. and Horowitz M. (2002). Adrenergic signaling and thyroid hormones affect HSP72 expression during heat acclimation. J. Appl. Physiol. 93:107–115. 122 159. Mambula S.S. and Calderwood S.K. (2006). Heat shock protein 70 is secreted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes. J. Immunol. 177:7849-7857. 160. Mambula S.S., Stevenson M.A., Ogawa K. and Calderwood S.K. (2007). Mechanisms for Hsp70 secretion: crossing membranes without a leader. Methods. 43(3):168-175. 161. Marber M.S., Mestril R., Chi S.H., Sayen M.R., Yellon D.M. and Dillman W.H. (1995). Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury. J. Clin. Invest. 95:1446–1456. 162. Maridonneau-Parini I., Clerc J. and Polla B.S. (1988). Heat shock inhibits NADPH oxidase in human neutrophils. Biochem. and biophys. Res. Commun. 154(1):179-186 163. Maridonneau-Parini I., Malawista S E., Stubbe H., Russo-Marie F. and Polla B. S. (1993). Heat shock in human neutrophils: superoxide generation is inhibited by a mechanism distinct from heat-denaturation of NADPH oxidase and is protected by heat shock proteins in thermotolerant cells. J. Cell. Physiol. 156(1):204–211. 164. Martin- Martin B., Nabokina S.M., Blasi J., Lazo P.A. and Mollinedo F. (2000). Involvement of SNAP-23 and syntaxin 6 in human neutrophil exocytosis. Blood. 96:2574-2583. 165. Mathur S.K., Sistonen L., Brown I.R., Murphy S.P., Sarge K.D. and Morimoto R.I. (1994). Deficient induction of human hsp70 heat shock gene transcription in Y79 retinoblastoma cells despite activation of heat shock factor 1. Proc.Natl. Acad. Sci. 91:8695–8699. 166. Matute J.D., Arias A.A., Dinauer M.C. and Patino P.J. (2005). p40phox: the last NADPH oxidase subunit. Blood Cells Mol. Dis. 35:291–302. 167. Mayer, M.P. and Bukau B. (2005). Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62:670-684. 123 168. Mazengera R.L. and Kerr M.A. (1990). The specificity of the IgA receptor purified from human neutrophils. Biochem. J. 272:159-165. 169. McColl S.R., Paquin R., Menard C. and Beaulieu A.D. (1992). Human neutrophils produce high levels of the interleukln 1 receptor antagonist in response to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and tumor necrosis factor α. J. Exp. Med. 176:593-598. 170. Mócsai A., Bánfi B., Kapus A., Farkas G., Geiszt M., Buday L., Faragó A., Ligeti E. (1997). Differential effects of tyrosine kinase inhibitors and an inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade on degranulation and superoxide production of human neutrophil granulocytes. Biochem. Pharmacol. 54:781–789. 171. Monteseirin J., Bonilla I., Camacho M.J., Conde J. and Sobrino F. (2001). IgE-dependent release of myeloperoxidase by neutrophils from allergic patients. Clin. Exp. Allergy. 31:889–892. 172. Morgan M.J. and Liu Z. (2011). Crosstalk of reactive oxygen species and NF-κB signaling.Cell Research. 21:103-115. 173. Moroni F, Di Paolo ML, Rigo A, Cipriano C, Giacconi R, Recchioni R, Marcheselli F, Malavolta M and Mocchegiani E. (2005). Interrelationship among neutrophil efficiency, inflammation, antioxidant activity and zinc pool in very old age. Biogerontology. 6:271-281. 174. Multhoff G., Botzler C., Jennen L., Schmidt J., Ellwart J. and Issels R. (1997). Heat shock protein 72 on tumour cells: a recognition structure for natural killer cells. J. Immunol. 158:4341–4350. 175. Multhoff G., Botzler C., Wiesnet M., Muller E., Meier Т., Wilmanns W. and Issels R.D. (1995). A stress-inducible 72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells. Int. J. Cancer. 61(2):272-279. 176. Multhoff G. and Hightower L.E. (2011). Distinguishing integral and receptor-bound heat shock protein 70 (Hsp70) on the cell surface by Hsp70specific antibodies. Cell Stress Chaperones. 16(3): 251–255. 124 177. Murphy P. (1976). Morphology and cellular physiology of neutrophil granulocyte.The Neutroph. Plenum. Publishing. Corp., NY. 17-20. 178. Nathan C. (2006). Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6:173–182. 179. Neuzil J., Rayner B.S., Lowe H.C. and Witting P.K. (2005). Oxidative stress in myocardial ischaemia reperfusion injury: a renewed focus on a longstanding area of heart research. Redox. Rep. 10(4):187-197. 180. Niforou K., Cheimonidou C. and Trougakos I.P. (2014). Molecular chaperones and proteostasis regulation during redox imbalance. Redox Biol. 30(2):323-332. 181. Niwa Y, Kasama T, Miyachi Y and Kanoh T. (1989). Neutrophil chemotaxis, phagocytosis and parameters of reactive oxygen species in human aging: cross-sectional and longitudinal studies. Life Sci. 44(22):1655-1664. 182. Njemini R., Abeele M.V., Demanet C., Lambert M., Vandebosch S. and Mets T. (2002). Age-related decrease in the inducibility of heat-shock protein 70 in human peripheral blood mononuclear cells. J. Clin. Immunol. 22:195-205. 183. Njemini R., Bautmans I., Onyema O.O., Van Puyvelde K., Demanet C. and Mets T. (2011). Circulating heat shock protein 70 in health, aging and disease. BMC Immunol. 28:12-24. 184. Njemini R., Demanet C. and Mets T. (2004). Inflammatory status as an important determinant of heat shock protein 70 serum concentrationsduring aging. Biogerontology. 5:31–38. 185. Njemini R., Lambert M., Demanet C., Kooijman R. and Mets T. (2007). Basal and infection-induced levels of heat shock proteins in human aging. Biogerontology. 8(3):353-364. 186. Nylandsted J., Gyrd-Hansen M., Danielewicz A., Fehrenbacher N., Lademann U., Hoyer-Hansen M., Weber E., Multhoff G., Rohde M. and Jaattela M. (2004). Heat shock protein 70 promotes cell survival by inhibiting lysosomal membrane permeabilization. J. Exp. Med. 200:425–435. 125 187. Nylandsted J., Rohde M., Brand K., Bastholm L., Elling F. and Jäättelä M. (2000). Selective depletion of heat shock protein 70 (Hsp70) activates a tumor-specific death program that is independent of caspases and bypasses Bcl-2. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 97:7871—7876. 188. Ogawa K., Suzuki K., Okutsu M., Yamazaki K. and Shinkai S. (2008). The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade inflammation in the elderly. Immun. Ageing. 24(5):13. doi: 10.1186/1742-4933-5-13. 189. Oishi K. and Machida K. (1997). Inhibition of neutrophil apoptosis by antioxidants in culture medium. Scand. J. Immunol. 45(1):21-27. 190. Ortega E., Hinchado M.D., Martín-Cordero L. and Asea A. (2009). The effect of stress-inducible extracellular Hsp72 on human neutrophil chemotaxis: a role during acute intense exercise. Stress. 12(3):240-249. 191. Owen C.A., Campbell M.A., Sannes P.L. Boukedes S.S. and Campbell E.J. (1995). Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. J. Cell Biol. 131 (3):775–789. 192. Palmer L.J, Cooper P.R., Ling M.R., Wright H.J., Huissoon A. and Chapple I.L. (2012). Hypochlorous acid regulates neutrophil extracellular trap release in humans. Clin. Exp. Immunol. 167:261–268. 193. Panjwani N.N., Popova L. and Srivastava P.K. (2002). Heat shock proteins gp 96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. J. Immunol. 168: 2997-3003. 194. Pederzoli M., Lepelletier Y., Canteloup S., Nusbaum P., Lesavre P. and Witko-Sarsat V. (2004). Apoptosis-induced proteinase 3 membrane expression is independent from degranulation. J. Leukoc. Biol. 75(1):87-98. 195. Peng, P., Menoret A. and Srivastava P. K. (1997). Purification of immunogenic heat shock protein 70-peptide complexes by ADP-affinity chromatography. J. Immunol. Methods. 204:13–21. 126 196. Peters T., Weiss J.M., Sindrilaru A., Wang H., Oreshkova T., Wlaschek M., Maity P., Reimann J. and Scharffetter-Kochanek K. (2009). Reactive oxygen intermediate-induced pathomechanisms contribute to immunosenescence, chronic inflammation and autoimmunity. Mech. Ageing Dev. 130(9):564-587. 197. Peters, A.M. (1998). Just how big is the pulmonary granulocyte pool? Clin. Sci. ( Lond). 94:7–19. 198. Pirkkala L., Nykanen P. and Sistonen L. (2001). Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond. FASEB J. 15:1118-1131. 199. Pittet J.F., Lee H., Morabito D., Howard M., Welch W. and Mackersie R. (2002). Serum levels of Hsp 72 measured early after trauma correlate with survival. J. Trauma. 52:611–617. 200. Pockley A.G. (2002). Heat shock proteins, inflammation, and cardiovascular disease. Circulation. 105: 1012-1017. 201. Pockley A.G., De Faire U., Kiessling R., Lemne C., Thulin T. and Frostegard J. (2002). Circulating heat shock protein and heat shock protein antibody levels in established hypertension. J. Hypertens. 20:1815-1820. 202. Pockley A.G., Georgiades A., Thulin T., de Faire U. and Frostegard J. (2003). Serum heat shock protein 70 levels predict the development of atherosclerosis in subjects with established hypertension. Hypertension. 42:235238. 203. Pockley A.G., Muthana M. and Calderwood S.K. (2008). The dual immunoregulatory roles of stress proteins. Trends Biochem. Sci. 33:71–79. 204. Polla B.S., Stubbe H., Kantengwa S., Maridoneau-Parini I. and Jacquier-Sarlin M.R. (1995). Differential induction of stress proteins and functional effects of heat shock in human phagocytes. Inflammtion. 19(3):363-378 205. Prohaszka Z., Singh M., Nagy K., Kiss E., Lakos G., Duba J., Füst G. (2002). Heat shock protein 70 is a potent activator of the human complement system. Cell Stress Chaperones. 7(1):17–22. 127 206. Purdom-Dickinson S.E., Sheveleva E.V., Sun H., Chen Q.M. (2007). Translational control of nrf2 protein in activation of antioxidant response by oxidants. Mol. Pharmacol. 72:1074-1081. 207. Radisavljevic Z.M. and Gonzalez-Flecha B. (2004). TOR kinase and Ran are downstream from PI3K/ Akt in H2O2-induced mitosis. J Cell Biochem. 91:1293-1300. 208. Rea I.M., McNerlan S. and Pockley A.G. (2001). Serum heat shock protein and anti-heat shock protein antibody leveles in aging. Exp. Gerontol. 36(2): 341-352. 209. Reeves E.P, Lu H., Jacobs H. L., Messina. C.G., Bolsover S., Gabella G., Potma E.O., Warley A., Roes J. and Segal A.W. (2002). Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416(6878):291-297. 210. Robinson J.M. (2008). Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochem. Cell Biol. 130:281-297. 211. Robinson M. B., Tidwell J.L., Gould T., Taylor A.R., Newbern J.M., Graves J., Tytell M., Milligan C.E. (2005). Extracellular heat shock protein 70: a critical component for motoneuron survival. J. Neurosci. 25(42):9735-9745. 212. Rolas L., Makhezer N., Hadjoudj S., El-Benna J., Djerdjouri B., Elkrief L., Moreau R. and Périanin A. (2013). Inhibition of mammalian target of rapamycin aggravates the respiratory burst defect of neutrophils from decompensated patients with cirrhosis. Hepatology. 57(3):1163-1171. 213. Rozhkova E., Yurinskaya M., Zatsepina O., Garbuz D., Karpov V., Surkov S., Murashev A., Ostrov V., Margulis B., Evgen'ev M. and Vinokurov M. (2010). Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1197:9491. 214. Salway K.D., Gallagher E.J., Page M.M. and Stuart J.A. (2011). Higher levels of heat shock proteins in longer-lived mammals and birds. Mech. Ageing. Dev. 132(6-7):287-297. 128 215. Sapozhnikov A.M., Ponomarev E.D., Gusarova G.A. and Telford G.V. (2002). Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis. Cell prolif. 35:193-206. 216. Satoh M., Nakai A., Sokawa Y., Hirayoshi K. and Nagata K. (1993). Modulation of the phosphorylation of glucose-regulated protein, GRP78, by transformation and inhibition of glycosylation. Exp. Cell Res. 205(1):76-83. 217. Saunders L.R. and Verdin E. (2009). Cell biology.Stress response and aging. Science. 323:1021-1022. 218. Scapini P., Gasperini S., Bazzoni F. and Cassatella M.A. (2008). Regulation of B-cell-activating factor (BAFF)/B lymphocyte stimulator (BlyS) expression in human neutrophils. Immunol. Lett. 116:1-6. 219. Scapini P., Lapinet-Vera J.A., Gasperini S., Calzetti F., Bazzoni F. and Cassatella M.A. (2000). The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177:195-203. 220. Schneider E.M., Niess A.M., Lorenze I., Northoff H. and Fehrenbach E. (2002). Inducible hsp70 expression analysis after heat and physical exercise: transcriptional, protein expression, and subcellular localization. Ann. N.Y. Acad. Sci. 973:8-12. 221. Schwab J.M., Chiang N., Arita M. and Serhan C.N. (2007). Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447:869-874. 222. Segal A. (2005). How neutrophils kill microbes. Annu. Rev.Immunol. 23:197-223. 223. Segal A.W., Dorling J. and Coade S. (1980). Kinetics of fusion of the cytoplasmic granules with phagocytic vacuoles in human polymorphonuclear leukocytes. Biochemical and morphological studies. J. Cell Biol. 85:42–59. 224. Sengelov H., Kjeldsen L. and Borregaard N. (1993). Control of exocytosis in early neutrophil activation. J. Immunol. 150:1535-1543. 129 225. Sengelov H., Kjeldsen L., Kroeze W., Berger M. and Borregaard N. (1994). Secretory vesicles are the intracellular reservoir of complement receptor 1 in human neutrophils. J. Immunol. 153:804–810. 226. Sheppard F.R., Kelher M.R., Moore E.E., McLaughlin N.J.D, Banerjee A., and Silliman C.C. (2005). Structural organization of the netrophil NADPH oxidase: phosphorilation and translocation during priming and activation. J. Leukoc. Biol. 78: 1025-1042. 227. Solana R., Tarazona R., Gayoso I., Lesur O., Dupuis G. and Fulop T. (2012). Innate immunosenescence: effect of aging on cells and receptors of the innate immune system in humans. Semin. Immunol. 24(5):331-341. 228. Sonna L.A., Gaffin S.L, Pratt R.E., Cullivan M.L., Angel K.C. and Lilly C. M. (2002). Molecular biology of thermoregulation selected contribution: effect of acute heat shock on gene expression by human peripheral blood mononuclear cells. J. Appl. Physiol. 92:2208–2220. 229. Squier T.C. (2001). Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp. Gerontol. 36(9):1539-1550. 230. Srivastava P. K. (2002). Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 2:185–194. 231. Srivastava, P. K. (2000). Heat shock protein-based novel immunotherapies. Drug. News Perspect. 13:517-522. 232. Suh C.I., Stull N.D., Li X.J., Tian W., Price M.O., Grinstein S., Yaffe M.B., Atkinson S., Dinauer M.C. (2006). The phosphoinositidebinding protein p40phox activates the NADPH oxidase during Fc-gammaIIA receptor-induced phagocytosis. J. Exp. Med. 203:1915-1925. 233. Suzuki Y.J., Forman H.J. and Sevanian A. (1997). Oxidants as stimulators of signal transduction. Free Radic. Biol. Med. 22(1-2):269-285. 234. Tan H., Xu Y., Xu J., Wang F., Nie S., Yang M., Yuan J., Tanguay R. M. and Wu T. (2007). Association of increased heat shock protein 70 levels in the lymphocyte with high risk of adverse pregnancy outcomes in early pregnancy: a nested case-control study. Cell Stress Chaperones. 12(3): 230–236. 130 235. Tazzyman S., Lewis C.E. and Murdoch C. (2009). Neutrophils: key mediators of tumour angiogenesis. Int. J. Exp. Pathol. 90(3):222-231. 236. Terry D.F., Wyszynski D.F., Nolan V.G., Atzmon G., Schoenhofen E.A., Pennington J.Y., Andersen S.L., Wilcox M.A., Farrer L.A., Barzilai N., Baldwin C.T. and Asea A. (2006). Serum heat shock protein 70 level as a biomarker of exceptional longevity. Mech. Ageing. Dev. 127:862–868. 237. Theodorakis N.G. and Morimoto R.I. (1987). Posttranscriptional regulation of hsp70 expression in human cells: effects of heat shock, inhibition of protein synthesis, and adenovirus infection on translation and mRNA stability. Mol. Cell Biol. 7:4357-4368. 238. Thériault, J.R., Adachi H. and Calderwood S. K. (2006). Role of scavenger receptors in the binding and internalization of heat shock protein 70. J. Immunol. 177:8604-8611. 239. Theriault, J.R., Mambula S.S., Sawamura T., Stevenson M.A., Calderwood S.K. (2005). Extracellular HSP70 binding to surface receptors present on antigen presenting cells and endothelial/epithelial cells. FEBS Lett. 579:19511960. 240. Tkalcevic J., Novelli M., Phylactides M., Iredale J.P., Segal A.W. and Roes J. (2000). Impaired immunity and enhanced resistance to endotoxin in the absence of neutrophil elastase and cathepsin G. Immunity. 12:201–210. 241. Tohyama Y. and Yamamura H. (2006). Complement-mediated phagocytosis – the role of Syk. IUBMB Life. 58(5-6):304 – 308. 242. Tortorella C., Piazzolla G., Spaccavento F., Pece S., Jirillo E. and Antonaci S. (1998). Spontaneous and Fas-induced apoptotic cell death in aged neutrophils. J. Clin. Immunol. 18(5):321-329. 243. Tortorella C., Simone O., Piazzolla G., Stella I., Cappiello V. and Antonaci S. (2006). Role of phosphoinositide 3-kinase and extracellular signalregulated kinase pathways in granulocyte macrophage-colony-stimulating factor failure to delay fas-induced neutrophil apoptosis in elderly humans. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 61(11):1111–1118. 131 244. Tsukahara F. and Maru Y. (2010). Bag1 directly routes immature BCR-ABL for proteasomal degradation. Blood. 116(18):3582-3592. 245. Tytell M., Greenberg S.G. and Lasek R.J. (1986). Heat shock-like protein is transferred from glia to axon. Brain Res. 363: 161-164. 246. Udono H. and Srivastava P.K. (1993). Heat shock protein 70- associated peptides elicit specific cancer immunity. J. Exp. Med. 178(4):13911396. 247. Urban C.F., Ermert D., Schmid M., Abu-Abed U., Goosman C., Nacken W., Brinkmann V., Jungblut P.R. and Zychlinsky A. (2009). Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog. 5(10):e1000639. doi:10.1371/journal.ppat.1000639. 248. Valen G., Kawakami T., Tahepold P., Dumitrescu A., Lowbeer C. and Vaage J. (2000). Glucocorticoid pretreatment protects cardiac function and induces cardiac heat shock protein 72. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279: 836–843. 249. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M. and Mazur M. (2006). Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact. 160(1):1-40. 250. Van der Steen L.P., Bakema J.E., Sesarman A., Florea F., Tuk C.W., Kirtschig G., Hage J.J., Sitaru C., van Egmond M. (2012). Blocking Fcα-receptor I on granulocytes prevents tissue damage induced by IgA autoantibodies. J. Immunol. 189:1594–1601. 251. Vega V.L., Rodríguez-Silva M., Frey T., Gehrmann M., Diaz J.C., Steinem C., Multhoff G., Arispe N. and De Maio A. (2008). Hsp70 translocates into the plasma membrane after stress and is released into the extracellular environment in a membrane-associated form that activates macrophages. J. Immunol. 180(6):4299-4307. 252. Vladimirov Y.A. and Proskurnina E.V. (2009). Free radicals and cell chemiluminescence. Biochemistry (Mosc). 74(13):1545-1566. 132 253. Voganatsi A., Panyutich A., Miyasaki K.T. and Murthy R.K. (2001). Mechanism of extracellular release of human neutrophil calprotectin complex. J. Leukoc. Biol. 70(1):130-134. 254. Wang S., Diller K. and Aggarwal S. (2003). Kinetics study of endogenous heat shock protein 70 expression. J. Biomech. Eng. 125:794-979. 255. Wang Y., Kelly C.G., Singh M., McGowan E.G., Carrara A.S., Bergmeier L.A. and Lehner T. (2002). Stimulation of Th1-polarizing cytokines, CC chemokines, maturation of dendritic cells, and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70. J. Immunol. 169:2422–2429. 256. Wei J., Zhao X., Kariya Y., Teshigawara K. and Uchida A. (1995). Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by abrogation of heat-shock protein (HSP) 70 expression in tumor cells. Cancer Immunol. Immunother. 40: 7378. 257. Westerheide S.D. and Morimoto R.I. (2005). Heat shock response modulators as therapeutic tools for diseases of protein conformation. J. Biol. Chem. 280:33097–33100. 258. Willingham M.C. (1983). An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. J. Histochem. Cytochem. 31(6):791-798. 259. Winterbourn C.C. (1983). Lactoferrrin-catalysed hydroxyl radical production. Additional requirement for a chelating agent. Biochem. J. 210:15-19. 260. Witko-Sarsat V., Rieu P., Descamps-Latscha B., Lesavre P. and Halbwachs-Mecarelli L. (2000). Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects. Lab Invest. 80(5):617-653. 261. Wu D., Huang C.K. and Jiang H. (2000). Roles of phospholipid signaling in chemoattractant- induced responses. J. Cell Sci. 113:2935–2940. 262. Xie Y., Chen C., Stevenson, M.A., Auron P.E. and Calderwood S.K. (2002). Heat shock factor 1 represses transcription of the IL-1β gene through 133 physical interaction with the nuclear factor of interleukin 6. J. Biol. Chem. 277: 11802–11810. 263. Xu C., Bailly-Maitre B. and Reed J.C. (2005). Endoplasmic reticulum stress: cell life and death decisions. J. Clin. Invest. 115(10): 2656–2664. 264. Yamashima T. (2013). Reconsider Alzheimer's disease by the 'calpain- cathepsin hypothesis'-a perspective review. Prog. Neurobiol. 105:1-23. 265. Young J.C., Barral J.M. and Ulrich Hartl F. (2003). More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem. Sci. 28(10):541-547. 266. Zalba G., Beloqui O., San Jose G., Moreno M.U., Fortuno, A. and Diez, J. (2005). NADPH oxidase–dependent superoxide production is associated with carotid intima-media thickness in subjects free of clinical atherosclerotic disease arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25:1452–1457. 267. Zhang X., Kluger Y., Nakayama Y., Poddar R., Whitney C., DeTora A., Weissman S.M. and Newburger P.E. (2004). Gene expression in mature neutrophils: early responses to inflammatory stimuli. J. Leukoc. Biol. 75:358-372 268. Zhao Т., Benard V., Bohl B.P. and Bokoch G.M. (2003). The molecular basis for adhesion-mediated suppression of reactive oxygen species generation by human neutrophils. J. Clin. Invest. 112:1732-1740. 269. Zheng H., Nagaraja G.M., Kaur P., Asea E.E. and Asea A. (2010). Chaperokine function of recombinant Hsp72 produced in insect cells using a baculovirus expression system is retained. J. Biol. Chem. 285:349–356. 270. Zheng L., He M., Long M., Blomgran R. and Stendahl O. (2004). Pathogen-induced apoptotic neutrophils express heat shock proteins and elicit activation of human macrophages. J. Immunol. 173(10):6319-6326. 271. Zhou M.J. and Brown E.J. (1994). CR3 (Mac-1, alpha M beta 2, CD11b/CD18) and Fc-gamma RIII cooperate in generation of a neutrophil respiratory burst: requirement for Fc- gamma RIII and tyrosine phosphorylation J. Cell Biol. 125:1407-1416. 134 272. Zhuravleva A., Clerico E.M. and Gierasch L.M. (2012). An interdomain energetic tug-of-war creates the allosterically active state in Hsp70 molecular chaperones. Cell. 151(6):1296-1307. 135
