кремний-магнетитовые наночастицы для молекулярно

КРЕМНИЙ-МАГНЕТИТОВЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
О. Н. Дерябин, Н. Н. Волкова, В. В. Янишпольский, Н. А. Дудченко
Институт прикладных проблем физики и биофизики НАНУ
Украина, Киев, 03142, ул. Служебная, 3
E-mail: zoranaty@voliacable.com
Модифицированные магнитные частицы сейчас широко используются в различных биологических и
медицинских приложениях (иммобилизация энзимов и белков, выделение и очистка клеток, ЯМР,
направленная доставка лекарств и др.). В основном, все типы магнитных частиц состоят из
магнитного ядра и неорганической или органической оболочки. Целью нашего исследования было
оценить возможность применения синтезированных кремний-модифицированных магнетитовых
частиц для выделения ДНК из разных биологических объектов.
Благодаря исключительной чувствительности молекулярно-биологических
методов, основанных на амплификации ДНК стало возможным диагностировать
инфекционные заболевания не только на ранней стадии их развития, но и выявлять
случаи скрытого носительства вирусов и микроорганизмов у человека, животных и
растений. Эти молекулярные методы стали стандартно применяться в клинических
лабораториях в последние годы. Значительный прогресс в ПЦР-диагностике был
достигнут благодаря проведению и учёту реакции полимеризации нуклеотидных
последовательностей ДНК в реальном времени. Этот прогрессивный подход
потребовал новых приемов выделения нуклеиновых кислот, которые бы
обеспечивали быстрое и эффективное выделение ДНК/РНК в нативном состоянии.
Кроме того, учитывая чрезвычайную опасность некоторых вирусных и
бактериальных заболеваний, одним из основных требований, которые выдвигаются
к современным методам ПЦР-диагностики, является возможность автоматизации
процессов выделения нуклеиновых кислот. Необходимость в быстрых методах
выделения плазмидной ДНК и вирусной ДНК/РНК диктуется возрастающим
количеством протоколов молекулярных исследований, которые используют высоко
очищенные генетические образцы [1, 2, 3].
Выделение нуклеиновых кислот традиционными приёмами практически
исключает роботизацию и автоматизацию процесса выделения и проведения ПЦРдиагностики, и, кроме того, не позволяет исключить влияние человеческого
фактора (оператора). К тому же, традиционные методы очистки нуклеиновых
кислот очень сложны, трудоёмки, опасны для оператора в случае инвазивного
материала. Одним из главных недостатков методов с применением органических
растворителей (фенол/хлороформ/этанол) является то, что в результате выделения
получают денатурированные нуклеиновые кислоты. Эффект денатурации во много
понижает чувствительность методов ПЦР и может способствовать получению
артефактов из-за остаточных примесей фенола, от которых сложно избавиться.
Модифицированные магнитные частицы в настоящее время широко
используются в различных биологических и медицинских приложениях
(иммобилизация белков и энзимов, выделение и очистка клеток, ЯМР,
направленная доставка лекарств, и др.) [4, 5]. Благодаря сильным магнитным
свойствам и низкой токсичности магнитных частиц, их применение в
биотехнологии и медицине привлекает значительное внимание. В основном, все
типы магнитных частиц состоят из магнитного ядра и неорганической или
органической оболочки. В процессе магнитной сепарации, молекулы или клетки
фиксируются на поверхности магнитных частиц, покрытых специфической
чувствительной оболочкой, что даёт возможность отделить их от несвязанных с
ними компонентами при помощи магнитного поля. Магнитная сепарация ДНК
321
имеет преимущества над традиционными методами выделения ДНК благодаря
быстроте и лёгкости выделения [6].
Поэтому, целью нашего исследования было оценить способность
синтезированных кремний-магнетитовых наночастиц выделять ДНК из различных
биологических тканей по сравнению с традиционными немагнитными сорбентами.
Кремний-магнетитовые наночастицы были получены путём со-осаждения железа
(ІІ) и железа (ІІІ) аммиком в водном растворе с дальнейшей гидролизацией
тетраэтоксисилана в спирто-водно-аммонийной смеси. Согласно данным
электронной микроскопии размер магнитных ядер был около 15 нм. По данным
метода широкоуглового рассеивания рентгеновских лучей, магнитное ядро
синтезированных наночастиц на 100% состояло из магнетита (Fe3O4).
Суперпарамагнитные свойства синтезированных наночастиц были подтверждены с
помощью измерений кривых намагниченности. Намагниченность насыщения
кремний-магнетитовых наночастиц была 37 эмю (А·м2/кг). Такая намагниченность
насыщения кремний-модифицированных магнитных наночастиц делает их
восприимчивыми к магнитному полю, и, поэтому, пригодными для магнитной
сепарации.
Применение силика-мегнетитовых наноматериалов в диагностике вирусных
заболеваний растений, сельскохозяйственных животных и птиц.
Синтезированные силика-магнитные нанокомпозиты были апробированы в
сравнении с коммерческими наборами для выделения ДНК и РНК разных
производителей. Так, например, определение наиболее распространённых
вирусных заболеваний сахарной свеклы показало, что выделение ДНК
наномагнитным сорбентом позволяет получить значительно большее число копий
праймерных вирусных последовательностей и более чёткую картину
электрофоретического выделения ампликонов по сравнению с традиционным
немагнитным сорбентом (Рис. 1).
Рис. 1. Разделение продуктов амплификации
вирусных последовательностей ДНК из экстрактов
сахарной свеклы в 1,5% агарозном геле.
Линия М – маркеры ДНК; линия 1 – силикагелевый
немагнитный сорбент; линия 2 – магнитные
наночастицы.
Кроме того, полученные магнитные наноматериалы были апробированы для
выделения ДНК из кисломолочных продуктов питания для установления спектра
бифидобактерий, применяемых в пищевых технологиях и выявления условнопатогенной микрофлоры. Было показано более высокая разрешающая способность
полученных материалов по сравнению с результатами аналогичной диагностики,
выполненной на основе коммерческих наборов. Применение синтезированных
нанокомпозитов для выполнения более сложного варианта амплификации
нуклеотидных последовательностей, а именно, обратной транскрипции с
последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) продемонстрировало
эффективность изучаемых наноматериалов для быстрого эффективного выделения
вирусной РНК и получения его к-ДНК из крови сельскохозяйственных животных
(классическая чума свиней).
Применение силика-мегнетитовых наноматериалов для диагностике сибирской
язвы.
Bacillus anthracis является возбудителем сибирской язвы, одного из самых
опасных заболеваний млекопитающих, имеющих, как правило, летальный исход.
322
Согласно последним молекулярно-биологическим исследованиям в лабораторных и
диких штаммах возбудителя выявлены две нуклеотидные последовательности:
плазмиды pXO1 и pXO2, которые кодируют специфический сибириязвенный
токсин и белки капсульной оболочки, соответственно. Изучение биологии штаммов
близких к возбудителю сибирской язвы, которые относятся к условно-патогенным,
показало, что в ДНК этих бактерий при определённых условиях могут включаться
одна, чаще капсульная, плазмида pXO2. Такие изменения ДНК сопровождаются
усилением вирулентности и возникновению заболеваний сельскохозяйственных
животных и персонала их обслуживающего. Поэтому экспертиза штаммов бактерий
которые применяются для изготовления вакцин против сибирской язвы строго
контролируются не только традиционными методами, но и ПЦР-диагностикой
плазмиды, кодирующей капсульный антиген.
Результаты анализа коллекции вакцинных штаммов приведены на Рис. 2. Линии
от 1 по 8 - слабо иммуногенные штаммы бактерий; линия 9 – штамм Bacillus
anthracoides с плазмидой, кодирующей неполный капсульный антиген; линия M –
маркеры ДНК; линии от 10 до 13 – выявление протективного (защитного) антигена
в высоко иммуногенных вакцинных штаммах бактерий.
Рис. 2. Електрофоретическое разделение продуктов амплификации фрагментов ДНК, выделенной с
помощью силика-магнетитового наносорбента из вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы
с высокой (Bacillus anthracis) и низкой (Bacillus anthracoides) иммуногенностью.
Результаты амплификации специфических праймерных последовательностей с
ДНК-материалом, полученных из разных лабораторных штаммов бактерий,
позволил разделить их на две группы: несодержащих протективные антигены и
содержащих протективные антигены, которые являются редуцированным
фрагментом плазмиды, кодирующей капсульные структуры возбудителя.
Кроме того, были проанализированы архивные материалы, полученные в разное
время из тканей больных и здоровых диких животных, которые являются
естественным резервуаром сибириязвенного возбудителя (дикие кабаны).
Результаты проведенных исследований представлены на Рис. 3.
Рис. 3. ПЦР - дианостика возбудителя сибирской язвы в архивных образцах тканей диких
животных, выполненная с применением традиционного ДНК – сорбента и силика - магнетитового
нанокомпозита. Результаты електрофореза в 1,5 % агарозном геле продуктов амплификации
специфических праймеров.
323
Линии 1, 2 - положительный контроль (фрагменты ДНК, кодирующие
капсульные белки Bacillus anthracis; линия M – маркеры ДНК; линии от 3 до 7 и 9
– образцы тканей здоровых диких животных (не содержащих возбудителя); линия 8
–положительный результат выявления возбудителя сибирской язвы (ткани
инфицированного дикого кабана, архив 1999 года), полученный при использовании
магнетитового наносорбента; линия 10 – слабо положительный (сомнительный)
результат, полученный при использовании коммерческого ДНК-сорбента.
По данным приведенным на электрофореграмме продуктов амплификации
специфических капсульных нуклеотидных последовательностей видно, что
синтезированные магнитные нанокомпозиты обладают значительно большей
эффективностью для выделения суммарной, в том числе и бактериальной, ДНК
(линия 8) из архивных материалов, которые хранились в течение нескольких лет по
сравнению с традиционными коммерческими сорбентами (линия 10).
Полученные данные показывают высокую эффективность синтезированных
кремний-модифицированных магнитных наночастиц для выделения ДНК из
различных биологических объектов.
Работа выполнена благодаря частичной финансовой поддержке НаучноТехнологического Центра в Украине (НТЦУ) в рамках проекта № 3074.
1. M. K. Hourfar, U. Michelsen, M. Schmidt et.al., Clin. Chem., 15, 1217-1222, 2005.
2. I. J. Bruce, J. Taylor, M. Todd, M. J. Davies, E. Borioni, C. Sangregorio and T. Sen.,
JMMM, 284, 145-160, 2004.
3. D.A. Marshall, S.H. Kleinmann, J.B. Wong et.al., Vox Sang, 86, 28-40, 2004.
4. P. Gould. Nanotoday, 1, 34 (2006).
5. U. Hafely, W. Schutt, J. Teller, M. Zborowski (Eds.), Scientific ans Clinical
Applications of Magnetic Carriers, Plenum Press, New York, 1997.
6. C.-L. Chiang, C.-S. Sung, C.-Y. Chen, JMMM, 305, 483-490, 2006.
Modified magnetic particles now are widely used in different biological and medical applications (enzyme
and protein immobilization, cells separation and purification, MRI, targeted drug delivery, etc.). Basically,
all types of magnetic particles consist of magnetic core with inorganic or organic shell. The purpose of our
study was to reveal the possibility of synthesized silica-modified magnetite particles for DNA-isolation
from different biological objects.
324