Определение гидроксикоричных кислот в антиаллергическом

№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские науки
УДК 615.218.3:577.127.4]:543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ
КИСЛОТ В АНТИАЛЛЕРГИЧЕСКОМ
СБОРЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ
С. М. Марчишин, С. С. Козачок
ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет имени
И. Я. Горбачевского» Минздрава Украины (г. Тернополь)
Определены гидроксикоричные кислоты в сборе лекарственных растений
с антиаллергической активностью, его ингредиентах и отваре сбора методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием.
Установлено, что сбор антиаллергический в наибольшем количестве содержит
розмариновую кислоту — 0,18 %.
Ключевые слова: гидроксикоричныекислоты, сбор антиаллергический, розмариновая
кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, n-кумаровая кислота, феруловая
кислота, ВЭЖХ.
Марчишин Светлана Михайловна — доктор фармацевтических наук, профессор,
заведующий кафедрой фармакогнозии с медицинской ботаникой ГВУЗ «Тернопольский
государственный медицинский университет имени И. Я. Горбачевского», рабочий
телефон: 0352520518, e-mail: svitlanafarm@ukr.net
Козачок Соломия Степановна – магистр фармации, ассистент кафедры фармакогнозии
с медицинской ботаникой ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский
университет имени И. Я. Горбачевского», рабочий телефон: 0352520518, e-mail:
ternomiya@yahoo.com
В процессе аллергизации организма наряду со специфическими иммунологическими
изменениями происходят значительные метаболические, в том числе активация
свободнорадикального окисления на фоне сниженной активности антиоксидантных
систем. При аллергических реакциях наблюдается увеличение концентрации продуктов
перекисного окисления липидов. Поэтому антиоксиданты необходимы для профилактики
и фармакотерапии аллергических заболеваний [1].
Гидроксикоричные кислоты (ГКК) имеют выраженную физиологическою активность
и являются природными антиоксидантами. Они проявляют слабые бактериостатические
свойства, обладают противовоспалительным, гепатопротекторным (хлорогеновая,
кофейная, феруловая кислоты) и иммунотропным (хлорогеновая, кофейная кислоты),
желчегонным, антимикробным, антимикозным, радиопротекторным (феруловая кислота)
[6, 7]; противовирусным, противовоспалительным и антикомплементарным действиями
(розмариновая кислота) [3].
Цель нашей работы — качественное и количественное определение фенолокислот
в сборе лекарственных растений с антиаллергической активностью, его ингредиентах
(Bidentis herba, Violae herba, Plantaginis majoris folium, Urticae folium, Melissae folium,
Chamomillae flores, Agropyri rhizomata et radices) [5] и в отваре исследуемого сбора.
Согласно данным литературы, ГКК исследуемых ингредиентов сбора обладают
антиаллергическим действием, и их целесообразно использовать для лечения
и профилактики аллергических заболеваний.
Для определения ГКК в лекарственном растительном сырье, сборе антиаллергическом
и отваре сбора был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ). Хроматографическое разделение проводили на жидкостном хроматографе
Agilent 1200 3 D LC System Technologies (США) с диодноматричным детектором G1315С,
на колонке Supeico Discovery CI8 HPLC column 5 мкм (250 ? 4,6 мм) при температуре
термостата колонок 25 °С. Ввод пробы осуществлялся автосамплером, объем пробы
от 5 до 20 мкл, скорость потока — 0,7 мл/мин, рабочее давление элюента 100–120 bar
(10000–12000 кПа).
Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил марки Chromasolv
gradient grade, for HPLC, > 99,9 % (Sigma-Aldrich), ортофосфорную кислоту — Chromasolv
gradient grade, for HPLC, > 99,9 % (Sigma-Aldrich), бидистиллированную воду получали
на Simplicity SIMSV00 Water Purification System Millipore — (Merck KGaA, Darmstadt,
Germany). Для экстракции ГКК применяли метанол марки Chromasolv gradient grade, for
HPLC, > 99,9 % (Sigma-Aldrich). Стандартные вещества — хлорогеновая, кофейная,
n-кумаровая, феруловая, розмариновая кислоты — производства Sigma Chemical Co.
Подготовка проб для анализа около 1 г растительного сырья (точная навеска) и 5 г сбора
(точная навеска) тщательно измельчали, экстрагировали 50 мл 60 % раствора метанола
в течение 15 мин на водяной бане с обратным холодильником при перемешивании. После
этого фильтровали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл
и доводили до метки объем раствора 60 % метанолом. Полученный раствор
отфильтровывали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм [4, 7]. Отвар сбора
(1:10) готовили согласно ГФ XI [2].
Для разделения ГКК применялись следующие условия: градиентное элюирование смесью
бидистиллированной воды, подкисленной ортофосфорной кислотой, до рН = 2,85 («А»)
и ацетонитрила («В») (градиент ступенчастый): 0 хв 5 % «В», 8 хв 8 % «В», 15 хв 10 % «В»,
30 хв 20 % «В», 40 хв 40 % «В», 41–42 хв 75 % «В», 43–50 хв 5 %. Общее время анализа —
50 мин.
Для выбора оптимальной аналитической волны детектирования были изучены
УФ-спектры имеющихся стандартов ГКК. На основании полученных данных
детектирование ГКК при ВЭЖХ исследовании проводили при длине волны 330 нм для
хлорогеновой и розмариновой кислот, детектирование кофейной, n-кумаровой, феруловой
кислот — при длине волны 320 нм. Расчет концентраций ГКК проводили по площадям
пиков, используя метод внешнего стандарта.
В результате проведенных исследований в образцах были выявлены различные ГКК
и их конъюгаты. Показано, что в указанных условиях возможно определение
качественного и количественного состава ГКК в образцах на фоне сложного матрикса,
характерного для многокомпонентной смеси растительного сырья и особенно сбора
лекарственных растений.
По итогам исследования в спиртово-водном извлечении сбора антиаллергического
идентифицировано 5 ГКК и изомер хлорогеновой кислоты (рис. 1). В наибольшем
количестве сбор содержит розмариновую кислоту, что составляет 0,18 %, которая
поступает из мелиссы листьев (1,72 %) и подорожника большого листьев (0,48 %)
(табл. 1). Сбор антиаллергический содержит также значительное количество
хлорогеновой кислоты и ее изомеров, что в пересчете на хлорогеновую кислоту
составляет 0,06 %. Среди компонентов сбора в наибольшем количестве хлорогеновая
кислота и ее производные содержатся в череды траве (0,57 %). При 330 нм в сборе
идентифицирован скополетин в количестве 0,004 %.
Рис. 1. ВЭЖХхроматограмма водно-спиртового извлечения сбора и УФ-спектры
фенольных соединений: а — при ? = 330 нм: 1 — хлорогеновая кислота, 1.1 — изомер
хлорогеновой кислоты, 2 — скополетин, 3 — розмариновая кислота; b — при ? = 320 нм: 1 —
кофейная кислота, 2 — n-кумаровая кислота, 3 — феруловая кислота
Таблица 1
Количественное содержание гидроксикоричных кислот в сборе
антиаллергическом и в его отваре (%)
Антиаллергический сбор
Хлорогеновая
кислота
Изомер хлорогеновой
кислоты
в пересчете
на хлорогеновую
кислоту
Розмариновая
кислота
Кофейная
кислота
п-кумаровая
кислота
Феруловая
кислота
Спиртововодное
извлечение
(60 %) сбора
0,045
0,015
0,18
0,01
0,01
0,02
Отвар сбора
(1:10)
0,07
0,07
0,15
0,03
0,005
0,03
В водном извлечении сбора (отвар (1:10)) выявлены следующие ГГК: розмариновая —
0,15 %, производные хлорогеновой кислоты — 0,14 %, кофейная — 0,03 %, n-кумаровая —
0,005 %, феруловая — 0,03% кислоты (рис. 2, табл. 1). В отваре сбора скополетин
не обнаружен.
Рис. 2. ВЭЖХхроматограмма отвара сбора: а — при ? = 330 нм: 1 — хлорогеновая кислота,
1.1 — изомер хлорогеновой кислоты, 2 — розмариновая кислота; b — при ? = 320 нм: 1 —
кофейная кислота, 2 — n-кумаровая кислота, 3 — феруловая кислота
Таким образом, с помощью ВЭЖХ анализа в сборе антиаллергическом, его растительных
компонентах и отваре исследуемого сбора идентифицировано и установлено
количественное содержание 5-ти ГКК. Преобладает розмариновая кислота, которая,
по данным литературы, обуславливает терапевтический эффект при аллергических
заболеваниях.
Список литературы
1. Влияние ноопепта и мексидола на аллергические реакции / М. А. Демидова,
С. Я. Шнеур, Е. В. Галимская, А. А. Ковтун // Фармация. — 2007. — № 3. — С. 28–30.
2. Государственная фармакопея СРСР. Вип. 2. Общие методы анализа. Лекарственное
растительное сырье / МЗ СРСР. — 11-е изд. — М. : Медицина, 1989. — 408 с.
3. Зузук Б. М. Мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.) : аналитический обзор / Б. М.
Зузук, Р. В. Куцик // Провізор. — 2002. — № 1. — 5 c.
4. Определение гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье
и обьектах растительного происхождения / Ю. В. Медведев, О. И. Передеряев, А. П.
Арзамасцев [и др.] // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. — 2010. — № 3. — С. 25–31.
5. Пат. UA 73556 МПК A 61 K 35/00 Збір лікарських рослин для лікування і профілактики
хворих з алергічними захворюваннями / Марчишин С. М., Яковлєва Л. В., Козачок С. С,
Леницька О. Б. — № 2012 03896. Заявлено 30.03.2012. Опубл. 25.09.2012, Бюл. № 18.
— 5 с.
6. Пчелкин В. П. Природные фенольные и липофильные комплексы хлорогеновой
кислоты / В. П. Пчелкин // Хим.-фармацевт. журн. — 2003. — № 1. — С. 27–29.
7. Determination of caffeoylquinic acids and flavonoids in Cynara scolymus L. by high
perfomance liquid chromatography / M. H?user, M. Ganzera, G. Abel [et al.] //
Chromatographia. — 2002. — Vol. 56, N 7/8. — Р. 407–411.
ESTIMATION
OF HYDROXYCINNAMIC ACIDS
IN ANTIALLERGENIC TEA
BY HELC METHOD
S. M. Marchishin, S. S. Kozachok
SHPE «Ternopol state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky» of Ministry of Health of the
Ukraine (Ternopol, the Ukraine)
Hydroxycinnamic acid in antiallergenic herbs tea and its ingredients are defined by method
of a highly effective liquid chromatography (HELC) with UV. It is established that the
antiallergenic tea contains rosemary acid in the greatest amount — 0,18%.
Keywords: hydroxycinnamic acid, antiallergenic tea, rosemary acid, chlorogenic acid, coffee
acid, n- cumaric acid, ferulic acid, HELC.
About authors:
Marchishin Svetlana Mikhaelovna — doctor of pharmaceutical sciences, professor, head of
chair of pharmacognosy with medical botany at SHPE «Ternopil state medical university n. a. I.
Y. Gorbachevsky», office phone: 0352520518, e-mail: svitlanafarm@ukr.net
Kozachok Solomia Stepanovna — master of pharmaceutics, assistant of chair of
pharmacognosy with medical botany at SHPE «Ternopil state medical university n. a. I. Y.
Gorbachevsky», office phone: 0352520518, e-mail: ternomiya@yahoo.com
List of the Literature:
1. Influence of noopept and Mexidol on allergic reactions / M. A. Demidova, S. Y. Shneur, E. V.
Galimskaya, A. A. Kovtun // Pharmaceutics. — 2007. — № 3. — P. 28-30.
2. State pharmacopeia of the USSR. Iss. 2. General methods of the analysis. Medicinal
vegetable raw materials / MH of the USSR. — 11th publ. — M: Medicine, 1989. — 408 P.
3. Zuzuk B. M. Melissa medicinal (Melissa officinalis L.) : state-of-the-art review / B. M. Zuzuk,
R. V. Kutsik // Provizor. — 2002. — № 1. — 5 P.
4. Definition of hydroxycinnamic acid in medicinal vegetable raw materials and objects
of phytogenesis / Y. V. Medvedev, O. I. Perederyaev, A. P. Arzamastsev [etc.] // Quest.
of biol., medical and pharm. chemistry. — 2010. — № 3. — P. 25-31.
5. Pat. UA 73556 MPC A 61 K 35/00 Herbs tea for treatment and prophylaxis of patients with
allergic Diseases / Marchishin S. M., Yakovleva L. V. Kozachok S. S., Lenitsky O. B.
— № 2012 03896. Applied 30.03.2012. Publ. 25.09.2012, Bulletin № 18. — 5 P.
6. Pchelkin V. P. Natural phenolic and lipophilic complexes of chlorogenic acid / V. P. Pchelkin
// Chem.- pharm. journ. — 2003. — № 1. — P. 27–29.
7. Determination of caffeoylquinic acids and flavonoids in Cynara scolymus L. by high
perfomance liquid chromatography / M. H?user, M. Ganzera, G. Abel [et al.] //
Chromatographia. — 2002. — Vol. 56, N 7/8. — Р. 407–411.