ВИРУСОЛОГИЯ ПРИМЕНЕНИЕ ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РАЗМЕРОВ ВИРУСОВ
advertisement
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016, Том 161, № 1 101 ВИРУСОЛОГИЯ ПРИМЕНЕНИЕ ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РАЗМЕРОВ ВИРУСОВ В.Н.Никифоров, С.Е.Виноградов*, А.В.Иванов*, Е.В.Ефремова**, Л.Б.Калнина**, А.Б.Быченко***, Ю.Ю.Тенцов**, А.А.Маныкин** Физический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, РФ; *РОНЦ им. Н.Н.Бло> хина РАМН, Москва, РФ; **Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского ФГБУ Фе> дерального научного центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Мин> здрава РФ, Москва; ***ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова, Москва, РФ Для определения размеров вирусов применяли метод динамического рассеяния света, или метод лазерной корреляционной спектроскопии света. Проводили измерения кор' реляционных функций света, рассеянных вирусами иммунодефицита (ВИЧ'1) и гепа' тита А человека. Получены размеры вирионов 104 нм для ВИЧ'1 (субтип А и В) и 28 нм для вируса гепатита А. Для контроля использовали метод электронной микроскопии с определением размера фиксированных образцов данных вирусов. Сравнение полу' ченных разными методами размеров вирионов показал их хорошее соответствие. Ключевые слова: размер вирусов, ВИЧ>1, вирус гепатита А, лазерная корреляционная спект> роскопия (динамическое рассеяние света), электронная микроскопия Метод динамического рассеяния света, или ла зерной корреляционной спектроскопии (ЛКС), ранее применялся для исследования вируса та бачной мозаики [11]. ЛКС проводится в режиме реального времени в культуральной среде или буфере. В отличие от методов электронной мик роскопии, он не требует фиксации образца конт растирующим водным раствором солей урана и фосфорновольфрамовой кислоты. Нахождение в растворе вириона предотвращает деформацию и “уплощение” образца на подложке вследствие поверхностного натяжения. В силу высокой гете рогенности ряда вирусов, в частности ВИЧ, ста тистические характеристики — средний размер и дисперсия — играют важную роль для метрологи ческой идентификации и паспортизации культу ральных вирусных штаммов [4]. Метод ЛКС обла дает всеми преимуществами оптических методов: Адрес для корреспонденции: nvn@lt.phys.msu.ru. Никифо' ров В.Н. позволяет работать с нативными инфекционными микроскопическими объектами, исследовать ста тистические характеристики штаммов вирусов, проводить анализ в среде обитания объекта, об наруживать весьма малые изменения исследуе мого объекта при сравнении спектров света, рас сеянного образцом до и после изменения усло вий, получать информацию в реальном времени о характере происшедших в изучаемой системе изменений, т.к. в процессе измерений состояние образца не меняется под действием внешних фак торов, в отличие от хроматографии, седимента ции, биохимических методов. В то же время ЛКС не является прямым методом наблюдения нано объектов, поскольку динамический радиус частиц вирионов вычисляется из корреляционной функ ции, поэтому сравнение данных двух методов в приложении к вирионам различных типов (ВИЧ1 и гепатит А) представляется целесообразным. Выбор вирусов — безоболочечного вируса гепатита А (ВГА) и оболочечного ВИЧ — для ис следования определялся большими различиями 102 Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016, Том 161, № 1 в физикохимических характеристиках, а также высокой социальной значимостью. ВГА относится к семейству пикорнавирусов, геном которых представлен одноцепочечной по ложительной РНК. ВГА не имеет оболочки. Его ге ном упакован в белковый капсид [5]. Капсид пи корнавирусов имеет кубическую симметрию и представляет собой икосаэдр, состоящий из 60 белковых субъединиц. Диаметр вириона 2730 нм [6]. С помощью рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии было показано, что поверхность вирионов имеет волнистую то пографию. На осях пятого порядка икосаэдра находятся пятиугольные плато, окруженные впа динами, а на локальных осях третьего порядка расположены выступы. ВИЧ — представитель семейства ретровиру сов (род Lentivirus), содержит одноцепочечную по ложительную молекулу РНК. Вирионы ВИЧ близ ки по форме к сферическим частицам, диаметр которых составляет около 100120 нм [13]. Пул вирионов этого инфекта обладает определенной гетерогенностью [7]. Развитие нанотехнологий позволило прово дить не только электронномикроскопические ис следования вирусов, но и атомносиловые и масс спектрометрические исследования ВИЧ [8,12]. Размер вириона является одним из ключевых критериев для его надлежащей классификации и имеет определяющее значение для многих прак тических приложений. Размер вириона, опреде ленный с помощью электронной микроскопии, имеет погрешность за счет аберраций до 10%. Ошибки при определении размера могут возни кать изза препаративной неточности, например, усадки образца или деформации вириона, а так же инструментальной ошибки, связанной с труд ностями калибровки в наномасштабе длин. В ис следовании, проведенном методом электронной микроскопии [9], определены диаметры зрелых и незрелых ВИЧ1 в диапазоне от 110 до 128 и от 132 до 146 нм соответственно. Проведение точ ных неразрушающих измерений в режиме реаль ного времени в культуральной среде представ ляется обоснованным. Целью исследования являлся сравнитель ный анализ размеров вирусов иммунодефицита (ВИЧ1) и гепатита А человека, определенных методами ЛКС и электронной микроскопии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали два разных по физико химическим характеристикам, в том числе и по размерам, вида вирусов: ВИЧ1 и ВГА (культу ральный штамм ИВА). Субтипы ВИЧ1: культу ральный штамм U455 (субтип А), культуральный штамм PokA (субтип А) и культуральный штамм Н9/IIIВ (субтип В). Для размножения ВИЧ in vitro использовали линии клеток МТ2 и МТ4. Обе куль туры представляют перевиваемые Тлимфоциты человека. Линии были получены из коллекций кле точных культур: ATCC и Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (Москва). Клетки выращива ли в культуральной среде RPMI1640 (“ПанЭко”) с 10% ЭТС при 37оС и 5% СО2. Суспензионные клетки пересевали 2 раза в неделю при достиже нии концентрации 23105/мл. Для размножения ВИЧ в конце логарифмической фазы роста клетки дважды промывали средой RPMI1640 и добав ляли вируссодержащие препараты (вирус, разве денный в среде) из расчета 1 ТКИД50 на клетку (инфекционная доза заражения). После инкубации в течение 1 ч при 37оС клетки однократно промы вали средой RPMI1640 и добавляли поддержи вающую среду (RPMI1640 с 1% ЭТС). В даль нейшем зараженные культуры инкубировали при 37оC. Время пассажа было ограничено цитопато генным действием (ЦПД) вируса и обычно состав ляло 23 сут для штаммов субтипа А и 35 сут для Н9/IIIВ. Через 1 сут после заражения в культуре определяли синцитии. На 23и сутки количество синцитиев значительно возрастало, а количество мертвых клеток могло превышать 70%. Процент мертвых клеток определяли с помощью виталь ных красителей (1% раствор трипанового синего) в камере Горяева. В конце пассажа после наступ ления цитопатического эффекта, когда гибель клеток составляла более 70%, полученные вирус содержащие пробы (суспензии вирусов с клеточ ным детритом) осветляли центрифугированием (5000 об/мин, 30 мин). Осветленные вируссодер жащие препараты наслаивали на сахарозный гра диент (2030% “сахарозная подушка”) и вращали на ультрацентрифуге “Beckman Coulter” (ротор 50.2 Ti; режим 160 000g, 1.5 ч, 5оС). Осадок ре суспензировали в ФСБ или культуральной среде, которые готовили ex tempore при том же режиме центрифугирования. Это было необходимо для из бавления образцов от посторонних конгломера тов. Очищенные образцы использовали для даль нейшего исследования. Полученные вируссодер жащие суспензии хранили при 4оС в течение 2 нед. При более длительных сроках хранения вирус хранили при 80оС или в жидком азоте. Для наи более стабильного хранения инфекционного виру са лучше использовать неосветленную, с клеточ ным детритом, культуральную жидкость. Для хра нения препаратов вирусного антигена можно ис пользовать пробы после концентрации и очистки. ВИРУСОЛОГИЯ Определение инфекционности проводили стандартным методом конечных разведений. Для ВИЧ1 использовали клеточные линии МТ2 и TZM. Клетки высевали на 24 или 48луночные планшеты. Время инкубации планшетов состав ляло 14 сут. При тестировании ВИЧ в течение это го периода фиксировали синцитиеобразование. В конце пассажа вирусную активность подтверж дали ИФА на наличие белка ВИЧ р24. Это и было главным критерием определения присутствия ин фекционного вируса. Инфекционность выражали в единицах ТКИД50/мл. В результате очистки и концентрации вируссодержащей культуральной жидкости были получены препараты ВИЧ, содер жащие до миллиарда и более копий РНК ВИЧ в 1 мл или до 108 и более ТКИД50/мл. Препара ты ВИЧ были более стабильны, когда исходная инфекционность материала была высокая. Так же препараты ВИЧ после 48часовой инкубации были более стабильны, чем после 24часовой инкубации. Для проведения электронной микроскопии вирусную суспензию наносили на формваругле родные подложки, предварительно обработанные в газовом разряде. Контрастирование осуществ ляли 2% водным раствором уранилацетата. Пре параты анализировали в электронном микроско пе “JEM100S” при инструментальном увеличении 20103 и 40103. Суть метода динамического рассеяния света [1,2,9,10] состоит в следующем. В традиционной схеме измерения размеров частиц по спектру рассеяния сфокусированный луч лазера прохо дит через кювету с исследуемым образцом, а излучение, рассеянное под углом , подается на фотоприемник с помощью объектива, создающе го на диафрагме Ds малого диаметра перед като дом фотоприемника изображение луча лазера в кювете. Малый объем рассеяния вырезается из луча изображением диафрагмы Ds и ограничива ется диаметром лазерного луча и изображением диафрагмы Ds на луче. В схему может вводиться дополнительный опорный лазерный луч той же частоты или сдвинутый по частоте, обеспечиваю щий оптическое гомодинирование или гетероди нирование [1]. Спектр света, рассеянного монодисперсны ми частицами, имеет форму лоренциана с полу шириной G. Метод лазерного корреляционного рассеяния света ЛКС (или динамического рассея ния света — DLS) позволяет определить коэффи циент диффузии дисперсных частиц (вирионов) в культуральной жидкости путем анализа харак терного времени флюктуаций интенсивности рас сеянного света. Временная автокорреляционная 103 функция интенсивности рассеяния определяет характерные масштабы времени, на которых дви жение рассеивающих центров скоррелировано, т.е. зависит от их положения в предыдущие мо менты времени. Так, автокорреляционная функ ция для излучения, рассеянного на коллоидном растворе частиц одинакового размера, экспонен циально затухает со временем. По скорости зату хания можно определить коэффициент самодиф фузии частиц, а затем по формулам Стокса— Эйнштейна рассчитать их гидродинамический радиус. ЛКС, современный оптический метод для нанотехнологий, позволил нам не только опреде лить средний размер вирусов в колонии (линии), но и оценить нормальное отклонение (standard deviation). Оптические методы в силу известного ограничения (дифракционный предел) в нанооб ласти размеров напрямую не могут быть исполь зованы для исследования вирусов. ЛКС же по зволяет идентифицировать объекты с размера ми порядка нанометров. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛКСспектр распределения интенсивности рас сеяния для вирионов ВИЧ представлен на рисун ке 1. На вставке — лоренциан распределения интенсивности рассеяния на вирионах ВИЧ, где средний размер вириона — 105 нм с дисперсией 12 нм. Аналогичные эксперименты по ЛКС для ви рионов ВГА (рис. 2) показали диаметр 28 нм с дис персией 4 нм. На вставке — лоренциан распреде ления интенсивности рассеяния на частицах, где средний размер вириона ВГА 28 нм с дисперсией Рис. 1. Спектр ЛКС вирионов ВИЧ. На вставке — лоренциан распределения интенсивности рассеяния на частицах: средний размер вириона 105 нм с дисперсией 12 нм. 104 Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016, Том 161, № 1 4 нм. При бимодальном распределении метод ЛКС детектировал скопления вирионов (рис. 3) как наночастицы с диаметром 380 нм с дисперсией 20 нм. Оптические лазерные корреляционные (ЛКС) исследования ВИЧ и ВГА ранее не прово дились. Полученные результаты сравнивались с данными электронной микроскопии. По данным электронной микроскопии, раз меры вирионов ВГА и ВИЧ составили 28 и 100 нм соответственно с точностью 5%. Метод ЛКС (рис. 2), как и электронная микроскопия (рис. 3, а), детектировал скопления вирионов в кластере как наночастицы c размерами, на порядок больши ми, чем размер вириона ВГА. Размеры вирионов ВИЧ и ВГА, полученные методом ЛКС, хорошо коррелируют с данными электронной микроскопии. При ЛКС получается эффективный гидродинамический радиус, кото рый отличен от реального размера измеряемо го объекта в силу того, что не учитывается его формфактор (когда исследованный вирус имеет вытянутую форму). В нашем случае вирионы близ ки к сферической форме, и необходимости учиты вать формфактор не было. Простота, быстрота и точность ЛКС определяют значимый практи ческий потенциал данного метода. Особую значи мость имеет возможность исследования вирусов в нативном состоянии. Размеры вирусов и их дис персия в пуле имеют важное самостоятельное значение. Это не просто еще один измеряемый параметр вируса, но и отличительный метроло гический признак, важный как для идентифика ции вируса, так и для характеристики вирусных штаммов. ЛКС позволяет проводить дисперсион ный контроль в том числе вирусов с выраженной гетерогенностью, например, ВИЧ. Поскольку мно гие вирусы — это еще и перспективные агенты для доставки генов (включая терапевтические гены) [3], то и проблемы паспортизации и метро логического контроля вирусных векторов обосно вывают актуальность этой нанотехнологической разработки. В данной работе показана возможность при менения ЛКС для определения размеров виру сов, взвешенных в жидкости, описаны особен ности изучения суспензий вирусов этим методом и пределы его применения для получения допол нительных сведений о вирусологических и нано биологических объектах в нативном состоянии и для совершенствования нанобиологических тех нологий. В ряде случаев при использовании ЛКС микроскопия, как электронная, так и атомносило вая, может применяться в качестве метрологи ческого верификатора на разных стадиях микро биологических исследований. Рис. 2. Спектр ЛКС вирионов ВГА. На вставке — лоренциан распределения интенсивности рассеяния на частицах: средний размер вириона 28 нм с дисперсией 4 нм. Экспериментальные точки показаны кружками. Рис. 3. Вирионы ВГА (а) и ВИЧ (б) по данным электронной микроскопии. Размеры вирионов ВГА и ВИЧ составляют 28 и 100 нм соответственно с точностью 5%. ВИРУСОЛОГИЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Камминс Г., Пайк Э. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. М., 1978. 2. Лопатин В.Н., Приезжаев А.В., Апонасенко А.Д., Ше> пелевич Н.В., Лопатин В.В., Пожиленкова П.В., Прос> такова И.В. Методы светорассеяния в анализе дис' персных биологических сред. М., 2004. 3. Agosto L.M., Yu J.J., Liszewski M.K., Baytop C., Korokhov N., Humeau L.M., O’Doherty U. The CXCR4'tropic human immunodeficiency virus envelope promotes more'effi' cient gene delivery to resting CD4+ T cells than the vesicular stomatitis virus glycoprotein G envelope // J. Virol. 2009. Vol. 83, N 16. P. 8153'8162. 4. Aniagyei S.E., Kennedy C.J., Stein B., Willits D.A., Douglas T., Young M.J., De M., Rotello V.M., Srisathiyanarayanan D., Kao C.C., Dragnea B. Synergistic effects of mutations and nanoparticle templating in the self'assembly of cow' pea chlorotic mottle virus capsids // Nano Lett. 2009. Vol. 9, N 1. P. 393'398. 5. Cristina J., Costa>Mattioli M. Genetic variability and molecular evolution of hepatitis A virus // Virus Res. 2007. Vol. 127, N 2. P. 151'157. 6. Feinstone S.M., Kapikian A.Z., Purceli R.H. Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a virus like antigen associated with acute illness // Science. 1973. Vol. 182. P. 1026'1028. 105 7. Flexner C. HIV drug development: the next 25 years // Nat. Rev. Drug Discov. 2007. Vol. 6, N 12. P. 959'966. 8. Galkin A., Filinova E., Soloviev A., Bychenko A., Polyakov N., Nikiforov V., Ulezko D., Gagarina E., Samokhina N. Mass spectrometry analysis of HIV'1 envelop proteins // Retrovirology. 2009. Vol. 6, Suppl. 2. P. 1742. 9. Gentile M., Adrian T., Scheidler A., Ewald M., Dianzani F., Pauli G., Gelderblom H.R. Determination of the size of HIV using adenovirus type 2 as an internal length marker // J. Virol. Methods. 1994. Vol. 48, N 1. P. 43'52. 10. Katz A., Alimova A., Min Xu., Rudolph E., Shah M.K., Sava> ge H.E., Rosen R.B., McCormick S.A., Alfano R.R. Bacte' ria size determination by elastic light scattering // IEEE JSTQE. 2003. Vol. 9, N 2. P. 277'287. 11. Kubota K., Urabe H., Tominaga Y., Fujime S. Spectrum of light quasi'elastically scattered from suspension of to' bacco mosaic virus // Macromoleculs. 1984. Vol. 17, N 10. P. 2096'2104. 12. Kuznetsov Y.G., Victoria J.G., Robinson W.E., McPher> son A. Atomic force microscopy investigation of hu' man immunodeficiency virus (HIV) and HIV'in' fected lymphocytes // J. Virol. 2003. Vol. 77, N 22. P. 11 896'11 909. 13. McGovern S.L., Caselli E., Grigorieff N., Shoichet B.K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high'throughput screening // J. Med. Chem. 2002. Vol. 45, N 8. P. 1712'1722. Получено 16.04.15
