На правах рукописи Бобрышев Юрий Вениаминович Структурно-функциональные особенности стенки артерий в развитии

На правах рукописи
Бобрышев Юрий Вениаминович
Структурно-функциональные особенности стенки артерий в развитии
иммунного воспаления в атерогенезе
14.03.03– патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
МОСКВА – 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-западного
отделения РАМН и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН
Научные консультанты:
Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
Нагорнев Владимир Анатольевич
Доктор биологических наук, профессор
Орехов Александр Николаевич
Официальные оппоненты:
Репин Вадим Сергеевич
Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский
институт общей патологии и патофизиологии» РАМН
Главный научный сотрудник лаборатории клеточной биологии и патологии развития
Кухарчук Валерий Владимирович
Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН
Научно-исследовательский институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова,
Российский
кардиологический
научно-производственный
комплекс
Минздравсоцразвития Российской Федерации
Руководитель отдела проблем атеросклероза
Кошелев Владимир Борисович
Доктор биологических наук, профессор
Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины
Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Заведующий кафедрой физиологии и общей патологии
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего
профессионального
образования
Первый
Московский
государственный медицинский
университет имени И.М. Сеченова
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится «____»______________2012 года в ______часов на заседании
Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и
патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук, по адресу: 125315,
Москва, ул. Балтийская, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.
Автореферат разослан «____»______________2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук
Скуратовская Лариса Николаевна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Атеросклероз и его осложнения продолжают оставаться наиболее частой
причиной смертности и инвалидности трудоспособного населения во всех
развитых странах. В связи с этим понятны усилия, направленные на изучение
механизмов
пато
-
и
морфогенеза
этого
заболевания.
Несмотря
на
значительный прогресс в исследовании атеросклероза и многочисленные
гипотезы, объясняющие его возникновение и течение, ряд ключевых моментов
пато - и морфогенеза за6олевания остаются дискуссионными и недостаточно
изученными. В частности, это касается роли структурно-функциональной
гетерогенности
клеточных
элементов
интимы
артерий
и
значимости
межклеточных взаимодействий в атерогенезе.
В патогенетических механизмах атеросклероза, особенно в начальных
стадиях, все большее значение придается иммунному воспалению артерий
(Нагорнев В.А., 2006). Основанием для таких взглядов являются результаты
исследований, демонстрирующие присутствие активированных лимфоцитов в
ранних и продвинутых атеросклеротических поражениях человека, а также
присутствие в крови и в сосудистой стенке антител “атеросклеротического
происхождения”.
Вовлеченность
иммунных
реакций
в
развитие
атеросклеротических поражений подтверждена в экспериментальных моделях,
утилизирующих
экспериментальных
животных.
Наибольшее
количество
информации получено при исследовании мышей с различными генетическииндуцированными дефектами. Несмотря на очевидную ценность полученной
информации, эти модели лишь частично отражают многообразие процессов,
имеющих место при атеросклерозе у человека, и не могут быть полностью
использованы для о6ьяснения механизмов развития атеросклеротических
3
поражений (Нагорнев В.А., 2005). Стоит лишь отметить, что в отличие от
артерий человека, которые характеризуются “толстой” многослойной интимой,
содержащей разнообразные клеточные элементы, интима артерий мышей,
представлена
только
эндотелием,
располагающимся
на
внутренней
эластической мембране и отделенной от последней лишь тонкой прослойкой
соединительно-тканного матрикса, практически не содержащего клеточных
элементов.
Ряд
классических
исследований,
выполненных
на
аутопсийном
и
биопсийном материале, позволил установить, что интима артерий представлена
гетерогенной клеточной популяций (Аничков Н.Н., 1947; Нагорнев В.А., 2006;
Ross R., 1999). Морфологическая разнородность клеточных популяций артерий
была подвергнута изучению и основные клеточные элементы, включая
эндотелиальные
клетки,
гладкомышечные
клетки,
моноциты-макрофаги,
лимфоциты, перициты и тучные клетки, были распознаны. Показано, что в
атеросклеротически пораженных артериях человека гладкомышечные клетки
претерпевают фенотипическую модификацию. Однако до настоящего времени
не
проведена
комплексная
морфофункциональная
характеристика
фенотипической модуляции гладкомышечных клеток артерий человека и не
доказан факт участия этих клеток в развитии патологического процесса на
ранних стадиях атеросклероза. Кроме того, не выяснено, какие изменения в
сосудах предшествуют появлению измененных гладкомышечных клеток.
Интима артерий и внутренняя часть медии не имеет нервных окончаний, и
поддержание гомеостаза осуществляется исключительно за счет межклеточных
взаимодействий. К настоящему времени накоплен большой объем информации
о различных факторах, способных регулировать деятельность клеток артерий в
in vitro условиях, однако структурные аспекты взаимодействия клеток в интиме
артерий человека и их роль в развитии атеросклеротических поражений
недостаточно изучены.
Проведенные до настоящего времени
исследования морфологической
гетерогенности интимы артерий человека, в основном, не носили системный
4
характер и не позволили связать фенотипическую модуляцию клеточных
элементов интимы с локальностью возникновения атеросклеротических
поражений в артериях, что затрудняет понимание значимости структурнофункциональной
гетерогенности
клеток
в
патогенезе
атеросклероза.
Взаимосвязь фенотипической модуляции клеточных элементов интимы с
иммунно-воспалительных реакциями при атеросклерозе также не получила
достаточного внимания.
Все вышесказанное свидетельствовало о необходимости проведения
комплексного и многопланового исследования с использованием новых
методических подходов и современных морфологических методов для анализа
аутопсийного и биопсийного материала, которое позволили бы понять
морфологическую сущность патофизиологических процессов, вовлеченных в
развитие атеросклероза.
Цель настоящей работы
Работа
посвящена
патогенетических
проблеме
механизмов
раскрытия
атеросклероза
и
фундаментальных
изучению
структурных
особенностей развития атеросклеротических поражений.
Целью настоящей работы являлось изучение роли иммунного воспаления в
развитии атеросклероза у человека. В процессе исследования было показано
присутствие в интиме артерий антиген-представляющих дендритных клеток и
проведено изучение характеристик и роли этих клеток в атеросклерозе.
Основные задачи исследования
В соответствии с указанной целью были определены следующие основные
задачи исследования:
1. Изучить изменение клеточной композиции интимы артерий человека на
самых ранних стадиях развития атеросклеротических поражений и роль
5
иммунно-воспалительных
реакций
в
инициации
атеросклеротического
процесса.
2. Изучить клеточную композицию артерий человека на “продвинутых”
стадиях атеросклеротического поражения с учетом значимости иммунного
воспаления в прогрессировании атеросклеротического процесса.
3. Исследовать особенности участия различных клеточных элементов интимы в
развитии атеросклеротических поражений.
4. Исследовать структурные особенности межклеточных взаимодействий в
интиме артерий человека и определить их значимость в формировании
атеросклеротических поражений.
5. Исследовать возможность появления фенотипически измененных клеток в
атеросклеротических поражениях артерий человека и определить возможную
взаимосвязь воспалительных реакций с фенотипической модуляцией клеток
артерий.
Научная новизна
Проведено комплексное исследование структурных особенностей интимы
артерий человека в норме и при развитии атеросклеротических поражений.
Впервые
выявлено
присутствие
в
артериях
человека
клеток,
принадлежащих семейству антиген-представляющих дендритных клеток.
Показано, что дендритные клетки являются обязательным элементом артерий
человека в норме. Охарактеризована ультраструктура дендритных клеток
нормальных артерий человека и распознаны два фенотипа, один из которых
является вариантом клеток Лангерганса. Показано, что посредством клеточных
отростков дендритные клетки формируют локальные клеточные “сети” в
интиме артерий, обеспечивая взаимосвязь различных типов клеток. Выявление
системы
клеточных
взаимодействий,
обеспечиваемых
присутствием
дендритных клеток в артериальной стенке, позволило составить более полное
представление о механизмах поддержания гомеостаза в артериях человека.
6
При сравнении предрасположенных и резистентных к поражению
атеросклерозом участков визуально неповрежденной аорты была показана
вовлеченность дендритных клеток в иммунное воспаление с самых ранних
стадий
развития
атеросклероза.
Показано,
что
система
клеточных
взаимодействий, свойственная нормальной интиме, нарушается, в частности, в
результате формирования дендритными клетками непосредственных контактов
с лимфоцитами и макрофагами. Показана активация дендритных клеток в
участках аорты, предрасположенных к поражению атеросклерозом.
Изучены особенности топографического распределения дендритных клеток
в
различных
типах
атеросклеротических
поражений.
Показана
преимущественная аккумуляция дендритных клеток в плечевых зонах
атеросклеротических бляшек. Показано, что увеличение числа дендритных
клеток в плечевых участках происходит параллельно с трансформацией
“стабильных” атеросклеротических бляшек в “нестабильные”. Показано
присутствие кластеров зрелых дендритных клеток с активированными Тлимфоцитами
в
плечевых
зонах
бляшек,
обогащенных
присутствием
микрососудов, связанных с неоваскуляризацией бляшек.
Показана повышенная эндоцитозная активность эндотелиальных клеток в
участках аорты человека, предрасположенных к поражению атеросклерозом. В
этих
же
участках
лимфоцитов
и
обнаружены
активированных
скопления
дендритных
моноцитов-макрофагов,
клеток.
Т-
Морфометрически
доказаны локальность и постоянство инфильтрации интимы моноцитамимакрофагами, которые вовлечены в воспалительные реакции и способны влиять
на изменения фенотипа гладкомышечных клеток.
Исследование атеросклеротических поражений артерий человека позволило
выявить существование ранее неизвестных фенотипов клеточных элементов, в
частности, существование различных фенотипов гладкомышечных клеток. В
участках нормальной интимы и в ранних атеросклеротических поражениях
артерий человека детально изучены характеристики “синтетического” и
“сократительного” фенотипов гладкомышечных клеток. Показано, что в
7
“зрелых” атеросклеротических бляшках, в дополнение к “синтетическому” и
“сократительному” фенотипам, существуют ранее неизвестные модификации
гладкомышечных
клеток,
обозначенные
нами
как
“остеоидный”
и
“хондроцитоидный” фенотипы. “Остеоидный“ и “хондроцитоидный” фенотипы
гладкомышечных клеток были обнаружены в атеросклеротических бляшках
аорты, коронарных и сонных артерий человека, что свидетельствует о
стереотипе структурно-функциональных перестроек в артериях мышечноэластического и эластического типов при атеросклерозе.
Перечисленные новые факты позволили уточнить последовательность
морфогенетических процессов, происходящих при атеросклерозе в артериях
человека, и выяснить участие различных клеточных элементов интимы в
атерогенезе. В работе детально изучены структурные аспекты межклеточных
взаимодействий в интиме артерий и показана значимость иммунного
воспаления в инициации и прогрессировании атеросклероза.
Теоретическая и практическая значимость
Практическая ценность данной работы состоит в том, что она, являясь
фундаментальным
исследованием,
дает
набор
базовых
сведений
для
последующих исследований архитектоники артерий и открывает новые
подходы в изучении пато - и морфогенеза атеросклероза.
Выявленные особенности структурной организации интимы артерий
человека имеют общебиологическое значение.
Выявление присутствия дендритных клеток в интиме артерий привело к
развитию самостоятельного направления исследований в области изучения
морфо - и патогенеза атеросклероза.
Выявление
присутствия
дендритных
клеток
в
интиме
артерий
способствовало развитию новых направлений исследований, направленных на
изучение роли дендритных клеток в разнообразных сосудистых заболеваниях, а
8
также исследований роли дендритных клеток в разнообразных хирургических
интервенциях, направленных на коррекцию функции сосудов.
Исследования, продемонстрировавшие вовлеченность дендритных клеток в
атерогенез, могут оказать помощь в разработке поиска новых методов,
направленных на регуляцию иммунных процессов в атеросклерозе.
Полученные в результате исследования новые данные могут быть
использованы в учебном процессе на кафедрах гистологии, патологической
анатомии, общей патологии и патологической физиологии медицинских ВУЗов
и институтов Усовершенствования врачей, а также в работах научноисследовательских
институтов,
занимающихся
проблемами
сердечнососудистой патологии человека.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Иммунно-воспалительные реакции в атеросклерозе связаны с изменениями
клеточной композиции клеток интимы и их фенотипической модуляцией.
2. В интиме сосудистой стенки артерий человека существует сложная система
межклеточных взаимодействий, опосредованная присутствием в интиме
дендритных клеток.
3. Участки артерий, предрасположенные к развитию атеросклеротических
поражений,
характеризуются
нарушением
системы
межклеточных
взаимодействий.
4. Иммунно-воспалительные реакции, опосредованные активированными
дендритными клетками, играют ключевую роль в инициации самых ранних
этапов развития атеросклеротических поражений.
5. Иммунно-воспалительные реакции, опосредованные активированными
дендритными клетками, вовлечены в прогрессирование атеросклероза.
6. Прогрессирование атеросклеротических поражений является результатом
нарушения межклеточных взаимодействий и сопровождается изменением
морфофункциональных свойств клеточных элементов интимы.
9
Реализация результатов работы
Диссертация является итоговым обобщением результатов, полученных при
выполнении грантовых тем: "Изменения фенотипа гладкомышечных клеток
артерий
человека
при
атеросклерозе"
(1989-1991
гг.),
"Исследование
морфофункциональных особенностей клеток и межклеточных взаимодействий
в интиме аорты человека при раннем атеросклеротическом поражении" (19911992 гг.) и "Регуляция фенотипа гладкомышечных клеток артерий человека при
атеросклерозе и в эксперименте" (1993-1995 гг), “Воспаление и атеросклероз”
(2010-2011 гг). Начиная с 1995 г. и по 2012 г. исследования также
финансировались St. Vincent's Hospital и St. Vincent's Clinic Foundation, Сидней,
Австралия, и представленные в диссертации результаты были получены при
выполнении следующих грантовых тем: "Investigation of the nature of vascular
dendritic cells and their involvement in atherosclerosis", "Investigation of the role of
intercellular contacts in development of atherosclerotic lesions", "Investigation of
maturation of vascular dendritic cells in atherosclerotic lesions"; "Investigation of
association between dendritic cell maturation and T cell activation in human
atherosclerotic lesions", "Analysis of the expression of co-stimulatory molecules by
dendritic cells accumulating in atherosclerotic lesions", "Investigation of structural
and functional characteristics of vascular dendritic cells in situ and in vitro" и
“Phenotyping dendritic cells in vulnerable atherosclerotic plaque". Финансирование
работы также осуществлялось из “Vascular Research Fund”, Surgical Professorial
Unit, St. Vincent's Hospital, Сидней.
Полученные новые данные о присутствия дендритных клеток в интиме
артерий и их участия в развитии атеросклероза привели к развитию
самостоятельного направления исследований в области изучения морфо - и
патогенеза атеросклероза. Идентификация дендритных клеток в нормальных
артериях
человека
также
способствовала
инициации
исследований,
10
направленных на выяснение возможной вовлеченности дендритных клеток в
другие заболевания сердечнососудистой системы.
Апробация результатов диссертации
Материалы диссертации были представлены в виде докладов и тезисов на
следующих
научных
мероприятиях:
"Липопротеиды
и
атеросклероз"
(Симпозиум, посвященный 110-летию со дня рождения Н.Н. Аничкова)"
(Санкт-Петербург, 1995), "5th St Vincent‟s Campus Research Symposium"
(Sydney, 1995), "Surgical Research Society of Australia and New Zealand
(Auckland, 1995), "Joint Conference on Arteriosclerosis, and Vascular Biology" (Salt
Lake City, 1996), "Annual Scientific Congress" (Melbourne, 1996), "4th World
Congress on Heart Failure - Mechanisms and Management" (Jerusalem, 1996), "36th
Conference on Cardiovascular Disease Epidemiology and Prevention" (San
Francisco, 1996), "The 23rd World Congress of the International Society for
Cardiovascular Surgery" (London, 1997), "Annual Scientific Congress, Royal
Australasian College of Surgeons" (Sydney, 1998; Melbourne, 2000; Brisbane, 2003;
Kuala Lumpur, 2012), "Third Congress of the Asian Vascular Society (CAVS' 98)"
(Beijing, 1998), "Vascular Symposium" (Singapore, 1998), "Vascular Biology
Society and International Vascular Biology Meeting" (Cairns, 1998; Sydney, 2008),
"55th Annual Meeting of the Society for Vascular Surgery" (Baltimore, 2001), "48th
Annual conference of Indian Association of Cardiovascular & Thoracic Surgeons"
(Chennai, 2002), "Joint 17th Annual Meeting of the European Association for
Cardio-thoracic Surgery and the 11th Annual Meeting of the European Society of
Thoracic Surgeons” (Vienna, 2003), "3rd International AIDS Society Conference on
HIV Pathogenesis and Treatment" (Rio de Janeiro, 2005), "International Meeting of
the Institute of Human Virology" (Baltimore, 2005), "7th World Congress on
Inflammation" (Melbourne, 2005), "14th Meeting of the International Society of
Atherosclerosis" (Rome, 2006), "40th Japan Atherosclerosis Society Annual
Meeting" (Tsukuba, 2008), "Актуальные вопросы медицинской биологии и
11
паразитологии (Юбилейная научно-практическая конференция, посвященная
200-летию кафедры биологии имени академика Е.Н. Павловского, ВМА)"
(Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийская конференция с международным
участием "Механизмы функционирования висцеральных систем" (СанктПетербург, 2009), "1st AMDI-International Biohealth Science Conference (IBSC)”
(Penang,
2010),
"45th
Congress
of
the European
Society
for
Surgical
Research"(Geneva, 2010), "2nd Annual Health Conference, Global Healthcare:
Differing Perspectives and Dimensions in Healthcare" (Kuala Lumpur, 2011), "79th
European Atherosclerosis Society Congress" (Gothenburg, 2011), "2011 National
Histotechnology Conference" (Sydney, 2011), "XVI International Symposium on
Atherosclerosis ISA2012" (Sydney, 2012), "European Atherosclerosis Society
(EAS)" (Milan, 2012).
Материалы диссертации были также представлены в виде докладов на
заседаниях Faculty of Medicine, University of New South Wales, Sydney (1997,
2003, 2007), на совместном научном заседании Отдела общей и частной
морфологии и Отдела биохимии НИИ Экспериментальной медицины РАМН
(2009), на заседании Laboratory of Immunopathology, St Vincent‟s Hospital
Sydney (2009) и на заседании Института атеросклероза, Инновационный центр
Сколково (2012).
Публикации по теме диссертации
По результатам исследований опубликовано 104 работы в отечественных и
международных журналах, одна глава в монографии и одна монография.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста и состоит
из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы,
результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Библиографический список
12
использованной литературы содержит 414 источников. Текст иллюстрирован
61 рисунком, преимущественно в виде блоков (Приложение на 35 страницах) и
3 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал
Результаты исследований, включенные в настоящую работу, получены в
основном при изучении тканевых сегментов артерий человека. Работа
выполнена с использованием срочного аутопсийного и материала (аорта и
коронарные артерии) и тканевых образцов полученных в результате биопсий
(аорта, коронарные и сонные артерии), полученных на базе ВКНЦ, Москва;
патологоанатомическом отделении клиник 1-го Ленинградского Медицинского
Института, Ленинград (Санкт-Петербург); St Vincent's Hospital Sydney,
Австралия; Tsukuba University Hospital, University of Tsukuba, Япония; и Institute
of Forensic Medicine, Сидней, Австралия, в течение 1989-2008 годов.
Для изучения структурных особенностей “здоровых” артерий и наиболее
ранних стадий формирования атеросклеротических поражений использовали
тканевые образцы грудного отдела аорты, полученные в результате срочных
аутопсийных вскрытий на базе ВКНЦ. Из грудного отдела аорты выделяли
фрагмент (около 20 см длиной), промывали его в культуральной среде 199 или
в забуференном физиологическом растворе. Сосуд вскрывали продольно по
задней стороне между двумя рядами межреберных артерий. В соответствии
рекомендациями Bhagwat and Roberstson (1973), Cornhill and Roach (1976) и
Svendsen and Eide (1980) различали предрасположенные к поражению (ПП)
атеросклерозом участки, локализованные вдоль ряда устий 3-9 пары
межреберных артерий, и резистентные к поражению (РП) атеросклерозом
участки, расположенные на том же уровне по передней поверхности аорты. В
каждом случае, часть тканевого материала использовали для последующей
13
электронной микроскопии, другую же часть погружали в ОСТ compound и
хранили при -70оС для последующего иммуногистохимического анализа. Часть
материала фиксировали, заливали в парафин и окрашивали гематоксилинэозином, а оставшуюся часть сосуда использовали для приготовления
пленочных (“Hautchen”) гистопрепаратов и для электронной микроскопии.
Помимо изучения наиболее ранних изменений интимы при атеросклерозе,
исследовали также атеросклеротические поражения, анализируя различные
стадии
атеросклеротического процесса. Для количественных исследований,
использовали
поперечные
серийные
срезы
центральной
части
атеросклеротических поражений. В сформированных атеросклеротических
бляшках диаметр бляшки определяли как отрезок прямой от внутренней
поверхности интимы до внутренней эластической мембраны, проходящий через
центр липидного ядра. Толщину фиброзного покрова бляшки определяли как
часть вертикального диаметра от внутренней поверхности интимы до
липидного ядра. Согласно рекомендациям Virmani et al. (2003, 2006), бляшки с
липидными ядрами, составляющими не менее 30% площади среза бляшки,
были рассортированы в две группы: 1) бляшки с фиброзный покровом
толщиной более 100 мкм (стабильные бляшки); 2) бляшки с фиброзный
покровом толщиной менее 100 мкм (нестабильных бляшки).
Для in vitro экспериментов использовали тканевые образцы, полученные
преимущественно в результате биопсий. Образцы крови для последующих in
vitro экспериментов были получены от здоровых доноров на базе St Vincent's
Hospital Sydney, Сидней, и на базе National University Hospital, National
University of Singapore, Сингапур.
В диссертационную работу включены также данные исследований
тканевых образцов аорт, полученных от животных с экспериментальным
атеросклерозом (крысы и апо Е-дефицитные мыши).
14
Методы
В зависимости от задач работы были использованы методы анализа,
наиболее соответствующие целям исследования. В наибольшем объеме в
диссертационной работе представлены данные, полученные при анализе
тканевых образцов, изученных посредством морфологических методов, таких
как
электронная
микроскопия
и
иммуногистохимический
анализ.
В
зависимости от свойств используемых первичных антител, иммунную окраску
осуществляли либо на криостатных срезах, либо на срезах, полученных из
тканевых образцов, заключенных в парафин. Иммуногистохимический анализ
осуществляли, используя как рутинный иммунопероксидазный метод анализа,
так
и
многоступенчатые
методы
с
использованием
разнообразных
коммерческих китов. При использовании коммерческих китов, процедуры
осуществлялись
согласно
рекомендациям
производителей.
Негативные
контроли были выполнены во всех сериях иммунных окрасок. При выполнении
двойного иммуногистохимического окрашивания использовали комбинации
различных вторичных антител и комбинации различных субстратов. Некоторые
иммунные окраски были выполнены с использованием компьютеризированной
автоматической установки для иммунных окрасок “Ventana system” на базе
Laboratory of Immunopathology, St Vincent‟s Hospital Sydney. В количественных
исследованиях
использовали
компьютеризированный
анализ
экспрессии
антигенов с применением Image-Pro Plus image analysis program, Media
Cybernetics.
В
диссертационной
работе
были
использованы
методы
электронной микроскопии и электронно-микроскопической иммуноцитохимии.
Для
электронно-микроскопических
иммуноцитохимических
исследований
образцы заключали в LR-White resin или ловикрил посредством использования
метода Progressive Lowering of Temperature technique (PLT). Для анализа
ультраструктурных характеристик клеточных элементов был использованы
стереометрический компьютерной анализ и метод лазерной захватывающей
15
микродиссекции иммуноокрашенных срезов, сопряженный с последующим
электронно-микроскопическим анализом.
Помимо морфологических методов были использованы методы культуры
клеток, поточная цитометрия и другие методы. Диссертационная работа
содержит детальное описание использованных методов.
Для оценки полученных результатов проводилась статистическая обработка
материала посредством использования общепринятых методов статистического
анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ АРТЕРИЙ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И НА РАННЕЙ
СТАДИИ РАЗВИТИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА
В работе исследована структурная целостность эндотелия аорты человека.
Исследование посредством сканирующей микроскопии поверхности РП и в ПП
участков визуально нормальной аорты не выявило присутствия зон со
структурным
повреждением
эндотелиального
монослоя.
Анализ
неспецифического эндоцитоза показал, что объем занимаемый везикулами в
цитоплазме эндотелиальных клеток был статистически выше в ПП участках по
сравнению с этим показателем в ПР участках аорты (3,57+0,13% и 3,09+0,11%
соответственно; разница достоверна при р < 0,01). С помощью набора антител,
специфически связывающихся с определенными типами клеток сосуда, был
исследован клеточный состав ПП и РП участков аорты. Этот анализ показал,
что интима сосудов содержала гладкомышечные клетки, моноциты-макрофаги
и Т-лимфоциты. Морфометрический анализ гистопрепаратов, окрашенных
двойным
иммунофлуоресцентным
методом,
показал,
что
во
всех
исследованных случаях число моноцитов-макрофагов в ПП участках было
выше, чем в РП участках тех же сосудов. Так в ПП участках доля моноцитов16
макрофагов была в 2-6 раз выше, чем РП участках, варьируя от 8% до 19%,
тогда как в РП участках доля моноцитов-макрофагов не превышала 5% от
общего числа клеток интимы. Электронная микроскопия позволила выявить
выраженный полиморфизм ультраструктуры гладкомышечных клеток. Кроме
типичных гладкомышечных клеток “сократительного” типа, большая часть
цитоплазмы которых была заполнена миофиламентами, присутствовали
гладкомышечные клетки, цитоплазма которых была заполнена хорошо
развитым
гранулярным
эндоплазматическим
ретикулумом
и
аппаратом
Гольджи при незначительном количестве миофиламентов, оттесненных к
периферии клетки (“синтетический” фенотип).
Исследование ультратонких срезов выявило присутствие “необычных”
клеток (рисунок 1).
Рисунок 1. Параллельные
ультратонкие срезы интимы
аорты, демонстрирующие
клетку (VDC),
характеризующуюся наличием
длинных отростков (звездочки),
связь которых с «телом» клетки
может быть не очевидной.
Отмечается контакт этих
отростков с эндотелиальной
клеткой (Е) и гладкомышечной
клеткой (SMC). Mn/Mph –
моноцит-макрофаг.
Трансмиссионная электронная
микроскопия (ТЭМ).
По ультраструктурным признакам эти клетки нельзя было отнести ни к одному
из типов клеток, присутствие которых было известно в артериальной стенке.
При анализе параллельных ультратонких срезов было обнаружено, что
необычные клетки характеризовались присутствием клеточных отростков,
17
длина которых часто превышала диаметр клеточного “тела”. Необычные клетки
характеризовались цитоплазмой, матрикс которой был низкой электронной
плотности и относительно гомогенным. Клетки содержали свободные
рибосомы, распределенные по всей цитоплазме, и крайне немногочисленные
органеллы, включая митохондрии и хорошо развитые цистерны гладкого
эндоплазматического ретикулума, зачастую врастающие “концентрическими
кольцами” из перинуклеарного пространства в клеточные отростки. В
цитоплазме практически не выявлялись наличие каких-либо филаментов.
Вокруг клеток отсутствовала базальная мембрана. Обнаружение необычным
клеток,
формирующих
длинные
клеточные
отростки,
определило
необходимость проведения дальнейшего реконструктивного анализа интимы
артерий посредством исследования серийных ультратонких срезов.
Анализ
серийных
срезов
позволил
составить
представление
о
существовании сложной системы клеточных коммуникаций в интиме, не
известной ранее. Организация такой “коммуникационной” системы базируется
на существовании сложной системы межклеточных контактов, образуемых
отростками вновь распознанных клеток, диссеминированных по всей толще
интимы. Наибольшая “концентрация” таких клеток была выявлена в
субэндотелиальном слое. Как показал реконструктивный анализ, эти клетки
имеют несколько клеточных отростков, радиально отходящих в разные
стороны подобно отросткам нейронов в нервной системе и поэтому в
несерийных срезах, как правило, можно было видеть лишь поперечные срезы
клеточных отростков. Изучение серий последовательных ультратонких срезов
позволило установить, что длина отростков таких клеток зачастую в 3-5 раз, а
иногда и значительно более, превышала размер клеточного тела. Как показал
анализ, хотя бы один из клеточных отростков обязательно имел контакт с
аналогичной клеткой. Часть отростков были значительно короче, составляя 2-5
мкм по длине, и заканчивались свободно, не контактируя с другими клетками.
Однако большинство отростков имело конечные "клетки-мишени" в пределах
интимы, формируя непосредственные контакты с последними. Клеточные
18
отростки вновь выявленных клеток были обнаружены в непосредственном
контакте с клетками различной природы, включая гладкомышечные клетки,
эндотелиальные
клетки,
межклеточных
лимфоциты,
"стыках"
не
макрофаги
удалось
и
тучные
обнаружить
клетки.
В
каких-либо
специализированных структур.
Поскольку интима не иннервируема, было логично предположить, что
интима может иметь уникальную клеточную коммуникационную систему,
образуемую особым вариантом “примитивных” нейрональных (нейральных)
клеток,
которые
локализованы
в
интиме.
Сегменты
неповрежденных
атеросклерозом участков аорт, а также атеросклеротические поражения аорт и
сонных артерий были иммуногистохимически окрашены с антителами,
выявляющими
нейральные
элементы,
включая
антитела
к
различным
нейрофиламентам (NF-H, NF-L, NF-M, NF-M/H) и S-100. Из перечисленных
маркеров только экспрессия S-100 протеина была выявлена в интиме.
Некоторые S-100+ клетки характеризовались присутствием длинных клеточных
отростков и могли бы быть описаны как “звездчатые” клетки. Анализ
литературы показал, что помимо нейрональных клеток, S-100 протеин
интенсивно экспрессируется в клетках из семейства специализированных
антиген-представляющих дендритных клеток. Поскольку дендритные клетки в
коже (в частности, клетки Лангерганса) и дендритные клетки в лимфатических
узлах также специфически экспрессируют молекулу СD1a, были проведены
иммунохимические окраски, в которых параллельные тканевые срезы аорты и
сонных артерий были окрашены с антителами против S-100 протеина, СD1a и
HLA-DR.
Результаты такого исследования показали, что артериальная интима
действительно содержит клетки, которые одновременно экспрессируют S-100
протеин, СD1a и HLA-DR. Ультраструктура вновь распознанных клеток была
почти идентична ультраструктуре описанных ранее в литературе дендритных
клеток, присутствующих в коже и в лимфатических узлах. Таким образом,
данные наших электронно-микроскопических и иммуногистохимических
19
наблюдений, вместе взятые, позволили считать, что дендритные клетки
присутствуют в интиме нормальных артерий. Повсеместное присутствие
дендритных клеток в артериях человека было подтверждено анализом
многочисленных образцов аорт, сонных и коронарных артерий сердца. Как
результат этих наблюдений было постулировано, что дендритные клетки
являются обязательным элементом интимы здоровых артерий человека.
Анализ дендритных клеток, присутствующих во всех перечисленных выше
типах артерий, показал, что дендритные клетки характеризуются аналогичными
во всех типах артерий ультраструктурными характеристиками. В частности
было показано, что дендритные клетки в интиме содержат ряд специфических
структур, включая атипичные гранулы и гранулы Бирбека, а также уникальную
для дендритных клеток трубчато-везикулярную систему. Было показано, что
гранулы Бирбека в дендритных клетках в интиме артерий представляют собой
овально-вытянутые
структуры
с
нефрагментированным
центрально-
расположенным электронно-плотным стержнем (рисунок 2).
Рисунок 2. Атипичные
гранулы и гранулы Бирбека в
дендритных клетках в
интиме аорты (А. Б). Б деталь рис А. ТЭМ.
Было показано, что гранулы Бирбека образуются из атипичных гранул.
Атипичные гранулы морфологически отличаются от лизосом наличием
электронно-прозрачного ореола, разделяющего наружную мембрану гранулы
от ее центральной зоны. Трубчато-везикулярная система представляет собой
модифицированный и гипертрофированный конгломерат комплекса Гольджи и
гладкого эндоплазматического ретикулума. Иммунохимическими маркерами
дендритных клеток в интиме артерий, также как и в других тканях, являются
фасцин и CD1a. Как было сказано выше, S-100 протеин, продуцируемый
дендритными клетками, также интенсивно экспрессируется нейрональными
20
клетками. Однако интима артерий лишена иннервации и поэтому S-100 протеин
является удобным маркером для идентификации дендритных клеток в артериях.
Гранулы Бирбека выявляются в одном из типов дендритных клетках (клетках
Лангерганса) с помощью Лаг-антитела, специфичного для клеток Лангерганса;
использование антитела к Лаг-антигену позволило выявить Лаг+ клетки в
интиме
артерий.
Присутствие
дендритных
клеток,
специфически
окрашивающихся антителом к CD1a, также было продемонстрировано в
первичной культуре клеток интимы аорты человека (рисунок 3).
Рисунок 3. СD1a+ клетка в первичной
культуре ткани интимы аорты (А, Б). А:
Стрелки показывают клеточные
отростки. Б: Электронномикроскопическое иммуноцитохимическое
выявление распределения СD1a молекул по
поверхности дендритной клетки с
использованием вторичных антител,
меченных коллоидным золотом (стрелки).
Рисунок 4. Сеть,
формируемая СD1a+
дендритными
клетками в
субэндотелиальном
слое интимы аорты.
Пленочный препарат
интимы аорты
человека.
Иммуногистохимия.
Сравнительный анализ ПП и РП участков аорты показал, что система
коммуникаций, формируемая дендритными клетками в интиме (рисунок 4),
различается в ПП и РП участках (рисунок 5). Было установлено, что в РП
участках дендритные клетки формируют контакты между собой, а также с
эндотелиальными и гладкомышечными клетками. В ультратонких срезах ПП
участков отростки дендритных клеток встречались значительно чаше, чем в РП
участках и, помимо контактных взаимодействий, обнаруженных в ПП участках,
21
отростки дендритных клеток были обнаружены в непосредственном контакте с
макрофагами и тучными клетками.
Рисунок 5. Схема, иллюстрирующая контактные взаимодействия,
опосредованные дендритными клетками (VDC) в резистентных к поражению
атеросклерозом (РП; AR-area) и предрасположенных к атеросклерозу (ПП;
AP-area) участках визуально нормальной аорты. Е – эндотелиальная клетка;
SMC – ГМК; Mph - макрофаг; Т – Т клетка; В – В клетка; М – тучная
клетка;.К – клетка, проникающая из просвета сосуда.
Отростки дендритных клеток были также обнаружены в контакте с
лимфоцитами, причем в некоторых случаях можно было видеть формирование
контактов несколькими лимфоцитами с одним и тем же отростком дендритной
клетки. В некоторых отростках дендритных клеток, контактирующих с Тлимфоцитами, были обнаружены структурные признаки деструктивных
изменений. В ПП участках аорты были обнаружены контакты между
плазматическими клетками и отростками дендритных клеток. В ПП участках
клеточные отростки некоторых дендритных клеток, контактирующие с
22
эндотелиальными клетками и лимфоцитами, содержали гипертрофированные
цистерны трубчато-везикулярной системы, в других же дендритных клетках,
клеточные отростки были как бы набухшими и содержали “гомогеннокрупинчатый” материал низкой электронной плотности. Тучные клетки,
которые были обнаружены в контакте с дендритными клетками в ПП участках
аорты, содержали электронно-прозрачные гранулы, что могло означать процесс
освобождения содержимого гранул во внеклеточное пространство. В ПП
участках аорты также был выявлен феномен кластрации дендритных клеток
между собой; при этом клеточные “тела” дендритных клеток плотно прилежали
друг к другу вдоль значительной протяженности плазмолемм контактирующих
клеток.
В субэндотелиальном пространстве ПП и РП участков аорты, были
обнаружены
низкодифференцированные
Низкодифференцированные
дендритные
дендритные
клетки
сходны
в
клетки.
структурном
отношении с лимфоцитами, но в отличие от последних содержат единичные
профили цистерн трубчато-везикулярной системы, выявляемые в ультратонких
срезах.
Были
прослежены
последовательные
стадии
дифференцировки
дендритных клеток в интиме и на основании ультраструктурных характеристик
были выявлены два фенотипа дендритных клеток (рисунок 6).
Рисунок 6. Схема,
иллюстрирующая
существование двух
фенотипов дендритных
клеток (VDC) в интиме
артерий и возможную
взаимосвязь между ними.
VDC precursor – клетка
предшественник;
Type I VDC – 1-й фенотип;
Type II VDC – 2-й фенотип.
23
Дендритные клетки 1-го фенотипа характеризуются присутствием хорошо
развитой трубчато-везикулярной системой, в то время как атипичные гранулы и
гранулы Бирбека отсутствуют в цитоплазме. В противоположность дендритным
клеткам 1-го фенотипа, дендритные клетки 2-го фенотипа содержат атипичные
гранулы
и
гранулы
Бирбека.
Трубчато-везикулярная
система
хотя
и
присутствует в дендритных клетках 2-го фенотипа обычно относительно слабо
развита.
Являются
ли
эти
два
фенотипа
различными
стадиями
дифференцировки дендритных клеток, либо представляют собой клеточные
типы с различной функциональной предназначенностью, пока не выяснено.
Оба описанных выше фенотипа дендритных клеток были обнаружены как в
ПП, так и РП участках аорты.
При окраске параллельных срезов интимы антителами к HSP70 и к
различным типам клеток, а также посредством двойной иммуноокраски срезов,
было показано, что в интиме с признаками отека протеин HSP70, продукция
которого
как
известно
экспрессируется
является
исключительно
выражением
дендритными
клеточного
клетками.
стресса,
Электронно-
микроскопический анализ артериальных сегментов с визуально непораженной
атеросклерозом интимой, в которых была выявлена экспрессия HSP70, показал,
что
трубчато-везикулярная
система
в
дендритных
клетках
крайне
гипертрофированна, в особенности в их отростках, контактирующих с
эндотелиальными клетками. Подобной гипертрофии трубчато-везикулярной
системы не было отмечено в дендритных клетках, присутствующих в
неповрежденных атеросклерозом сегментах сосудов, в которых экспрессия
HSP70 не была зарегистрирована.
ИССЛЕДОВАНИЕ
ХАРАКТЕРИСТИК
ДЕНДРИТНЫХ
КЛЕТОК
В
ЛИПИДНЫХ ПЯТНАХ И АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШКАХ
В ранних атеросклеротических поражениях (липидные пятна и полоски),
незрелые и зрелые дендритные клетки были обнаружены в субэндотелиальном
24
слое артерий, иногда в непосредственном тесном контакте с эндотелиальными
клетками. Отмечалось увеличение количеств дендритных клеток в липидных
пятнах по сравнению с неповрежденной атеросклерозом интимой; так в
липидных пятнах сонной артерии было выявлено значительное увеличение
числа S-100+ дендритных клеток (7,9 ± 1,2 клеток в стандартной площади
[ст.пл.] среза) по сравнению с количеством дендритных клеток в прилежащих
неповрежденных участках интимы (2,6 ± 0,3 клеток/ст.пл.) (p < 0.001).
Иммунохимический
анализ
показал,
что
по
мере
формирования
атеросклеротических бляшек, содержащих выраженное липидно-некротическое
ядро, значительно менялось распределение дендритных клеток и появлялись
“излюбленные” зоны локализации дендритных клеток в поражениях. Так
наиболее часто дендритные клетки были обнаружены в плечевых зонах бляшек.
По мере прогрессирования атеросклероза, выражающегося в “объемном росте”
атеросклеротических бляшек, структура бляшек усложняется в результате
врастания в атеросклеротическую интиму капилляров (неоваскуляризации),
происходящих из микрососудов vasa vasorum, проникающих из адвентиции
через истонченную среднюю оболочку артерий. Было установлено, что
эндотелиальные клетки, формирующие неоваскуляризацию, экспрессируют
VE-кадгерин, а в зонах врастания капилляров в интиму была выявлена
интенсивная экспрессия VEGF. Картирование распределения дендритных
клеток в атеросклеротических поражениях позволило установить, что в зрелых
атеросклеротических
бляшках
дендритные
клетки
преимущественно
локализованы в зонах неоваскуляризации (рисунок 7).
Характеристики дендритных клеток в атеросклеротических бляшках были
детально исследованы. Анализируя иммуноокрашенные параллельные срезы, а
также используя метод двойной иммуноокраски, была показана экспрессия S100+ дендритными клетками антигенов CD1а, CD1c, CD1d и молекул CD83,
CD80, CD86 и DC-SIGN. Анализ также выявил, что в атеросклеротических
поражениях присутствуют клетки, специфически окрашивающиеся антителами
25
против BDCA-1 и BDCA-2 (миелоидные и плазмоцитоидные дендритные
клетки, соответственно).
Интима
Медия
Адвентиция
Рисунок 7. Схема, показывающая зоны преимущественной локализации
дендритных клеток (звездочки) и Т-лимфоцитов (кружочки) в
атеросклеротической бляшке. Plaque - бляшка; - Fibrous cap - фиброзная
покрышка; Necrotic core - некротическое ядро; – Neovascularization –
неоваскуляризация.
Было показано, что дендритные клетки экспрессируют CD40, VCAM-1,
ICAM-1, CD11c, NKR-1 и содержат ганглиозид GM3, GM3 синтазу,
фосфолипазу А2 (тип II) и C1q; однако экспрессия этих антигенов
обнаруживается также и в других клеточных типах, таких как Т-лимфоциты,
макрофаги и эндотелиальные клетки неоваскуляризации и таким образом
указанные выше молекулы не являются специфичными для выявления
дендритных клеток. Было выяснено, что в атеросклеротических бляшках
экспрессия HSP70 также не присуща только дендритным клеткам; в частности,
макрофаги интенсивно экспрессируют HSP70 в атеросклеротических бляшках.
Двойное иммуноокрашивание дендритных клеток и Т-лимфоцитов в срезах
атеросклеротических бляшек показало, что дендритные клетки и Т-лимфоциты
формируют клеточные кластеры, в которых дендритные клетки экспрессируют
CD40, CD80, CD86 и CD83. Было обнаружено, что в кластерах, формируемых
дендритными клетками и Т-лимфоцитами, дендритные клетки экспрессируют
26
не только повышенный уровень HLA-DR, но также молекулы CD1a, CD1b и
молекулу презентации антигенов липидной природы CD1d. Было показано, что
Т-лимфоциты
в
клеточных
кластерах
представлены
CD4+
и
CD8+
субпопуляциями и что некоторые из этих лимфоцитов экспрессируют антигены
CD27 и CD28.
Подсчет количеств дендритных клеток в бляшках с истонченными
фиброзными покрышками, толщина которых менее 100 мкм (нестабильные
бляшки), и в бляшках, характеризующихся более толстой фиброзной
покрышкой (стабильные бляшки), позволил установить, что нестабильные
бляшки содержат большее число дендритных клеток, чем стабильные бляшки.
Так в нестабильных бляшках сонных артерий число дендритных клеток в
плечевых зонах в 1,5 раз выше чем, в стабильных бляшках (27,8 ± 2,8 и 18,8 ±
2,0 клеток/ст.пл., соответственно, p < 0.01). Было найдено, что более 50%
дендритных клеток, находящихся в плечевых зонах нестабильных бляшек,
экспрессируют маркеры зрелости CD83, CD80 и CD86. Более того, была
выявлена интенсивная кластрация дендритных клеток с Т-лимфоцитами в
нестабильных бляшках (рисунок 8).
Рисунок 8. Клеточные
кластеры (показаны
стрелками),
сформированные CD83+
дендритными клетками
(коричневого цвета) и
CD3+ Т клетками
(розового цвета) в
плечевой зоне
атеросклеротической
бляшки в зоне
неоваскуляризации.
Двойная иммуноокраска;
комбинация ДАБ и Fast
Red субстратов.
Анализ также показал, что в нестабильных бляшках дендритные клетки,
экспрессирующие
CD1d
антиген,
формируют
контакты
не
только
с
“обычными” Т-лимфоцитами (CD3+/CD4+ и CD3+/CD8+), но также с NKT27
клетками
(CD3+/CD161+).
Структурные
особенности
контактных
взаимодействий между дендритными клетками и лимфоцитами в этих зонах
были изучены посредством электронно-микроскопического анализа, который
показал, что цистерны трубчато-везикулярного комплекса в контактирующих
дендритных клетках гипертрофированы.
В атеросклеротических артериях дендритные клетки были обнаружены не
только в интиме. Дендритные клетки были обнаружены также между
гладкомышечными клетками в медиальном слое, прилежащем к участкам
интимы с атеросклеротическими бляшками, а также в зонах адвентиции,
находящимися под этими атеросклеротическими бляшками и структурно
связанных с бляшками посредством неоваскуляризации. Сравнительный анализ
численности дендритных клеток в лимфатических узлах, прилежащих к
сегментам аорт с атеросклеротическими бляшками с численностью дендритных
клеток в лимфатических узлах, прилежащих к непораженным атеросклерозом
сегментам, показал, что количество дендритных клеток в лимфатических узлах,
прилежащих к сегментам аорты, пораженным атеросклерозом, в 1,9 раз
превышает
количество
дендритных
клеток
в
лимфатических
узлах,
прилежащих к неповрежденным атеросклерозом сегментам сосудистой стенки
(р < 0.01).
Было отмечено, что в атеросклеротических поражениях некоторые из
дендритных клеток претерпевают дегенеративные альтерации, выражающиеся
в нарушении целостности плазмолеммы, а смерть этих клеток сопровождается
формированием
больших
количеств
микровезикулярных
структур,
высвобождающихся в межклеточное пространство. В этих же зонах интимы
наблюдали признаки кальцификации внеклеточного матрикса, формирующихся
на
базе
микровезикулярных
диссертационной
работе,
структур.
позволяют
Материалы,
полагать,
что
представленные
в
микровезикулярные
структуры, происходящие из разрушающихся дендритных клеток, содержащих
“мощный” кальций-связывающий протеин S-100, являются структурной
основой для процессов, связанных с начальными стадиями формирования
28
кальциевых отложений в артериальной стенке. Один из разделов работы
посвящен проблеме кальцификации артерий.
Поскольку в последние годы развитие атеросклероза часто связывают с
инфекционными агентами, в частности с Chlamydia pneumoniae (Campbell L.A.
and Kuo C.C., 2004), другой раздел диссертационной работы посвящен роли
инфекции
в
атерогенезе.
Ультраструктурный
анализ
позволил
идентифицировать присутствие в дендритных клетках включений, типичных
для C. pneumoniae (присутствие C. pneumoniae было подтверждено в этих
артериях также и другими методами). Анализ взаимодействия C. pneumoniae с
дендритными клетками in vitro показал, что C. pneumoniae может успешно
развиваться в цитоплазме дендритных клеток.
Выявление
способствовало
присутствия
развитию
дендритных
ряда
новых
клеток
в
интиме
направлений
артерий
исследований,
направленных на изучение роли дендритных клеток как в осложнениях
атеросклероза при вирусных инфекциях, так и в разнообразных сосудистых
заболеваниях, включая аневризму аорты и болезнь Такаясу, а также в
хирургических интервенциях, направленных на коррекцию функции сосудов.
ВЫЯВЛЕНИЕ ВОВЛЕЧЕННОСТИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК В РАЗВИТИЕ
АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ
ПОРАЖЕНИЙ
У
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
ЖИВОТНЫХ
В диссертационную работу включен раздел, посвященный исследованию
вовлеченности дендритных клеток в развитие атеросклеротических поражений
у экспериментальных животных, включая апо Е-дефицитных мышей и крыс с
экспериментальной гиперхолестеринемией. В работе впервые показано, что
дендритные клетки присутствуют в атеросклеротических поражениях апо Едефицитных мышей и крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией и
обсуждаются возможности использования экспериментальных моделей для
изучения функций дендритных клеток в сосудистой патологии.
29
ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ МОДУЛЯЦИИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ
КЛЕТОК В АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШКАХ
Исследование интимы артерий у человека показало, что основные
клеточные
элементы
гладкомышечные
атеросклеротических
клетки
и
макрофаги,
поражений,
представлены
включая
гетерогенными
популяциями. В отношении гладкомышечных клеток было показано, что
количественные соотношения между “синтетическим” и “сократительным”
фенотипами различны в различных типах атеросклеротических поражений,
однако во всех типах атеросклеротических поражений “сократительный”
фенотип является превалирующим.
Помимо
проведенный
известных
анализ
ранее
фенотипов
позволил
выявить
гладкомышечных
существование
клеток,
фенотипов
гладкомышечных клеток, существенно отличающихся от “сократительного” и
“синтетического” фенотипов. Были идентифицированы и охарактеризованы
“остеоидный” и “хондроцитоидный” фенотипы гладкомышечных клеток, оба из
которых характерны для атеросклеротических бляшек, но отсутствуют в
нормальной интиме артерий.
Одним из редких феноменов, связанных с развитием атеросклероза,
является формирование костеобразных структур в сосудистой стенке. Исследуя
костеобразные структуры с использованием антитела против специфического
фактора остеобластов Cbfa1 (osteoblast-specific factor-2/core binding factor-1;
Osf2/Cbfa1)
было
выявлено
присутствие
в
интиме
Cbfa1+
клеток,
располагающихся вне костеобразных структур. Как правило, присутствие
Cbfa1+ клеток отмечалось в глубоких слоях интимы атеросклеротическипораженных артерий, в то время как в ранних атеросклеротических поражениях
Cbfa1+ клетки не были обнаружены. Исследование характеристик Cbfa1+
клеток с использованием набора разнообразных антител позволило установить,
что Cbfa1+ клетки содержат гладкомышечный α-актин (α-SMA), хотя в
30
некоторых
клетках
Cbfa1+
незначительно.
Было
количество
установлено,
что
гладкомышечного
Cbfa1+
клетки
α-актина
экспрессируют
остеокалцин и проколлаген 1-го типа (Тype I procollagen). Cbfa1+ клетки,
которые интенсивно окрашивались с антителом к гладкомышечному α-актину,
были
выделены
из
бляшек
посредством
лазерной
захватывающей
микродиссекции и последующее ультраструктурное исследование этих клеток
позволило подтвердить, что такие Cbfa1+ клетки являются гладкомышечными
клетками. Так Cbfa1+ клетки содержали миофиламенты и "плотные тельца"
вдоль
хорошо
развитой
базальной
мембраны.
Cbfa1+
клетки,
характеризующиеся незначительной экспрессией гладкомышечного α-актина,
также были выделены из бляшек посредством лазерной захватывающей
микродиссекции и ультраструктурное исследование выявило присутствие вдоль
их
базальной
мембраны
электронно-плотного
материала,
типично
присутствующего вокруг остеобластов в других анатомических локализациях.
Было
отмечено,
что
гипертрофированного
наличием
клетки
Cbfa1+
шероховатого
единичных
характеризуются
эндоплазматического
миофиламентов.
Cbfa1+/α-SMA+
присутствием
ретикулума
клетки
и
были
поименованы как “остеоидный” фенотип гладкомышечных клеток.
“Хондроцитоидный” фенотип гладкомышечных клеток был изначально
выявлен в результате электронно-микроскопических исследований клеточного
состава атеросклеротической интимы. Анализ ультратонких срезов выявил
присутствие
клеток
с
ультраструктурными
признаками
хондробластов.
Хондробласто-подобные клетки, обнаруживаемые в интиме, были окружены
внеклеточным матриксом, образующим коконы-лакуны, подобные тем, что
типичны
для
хондробластов
в
других
анатомических
локализациях.
Использование специфического маркера для выявления хондробластов sox-9
показало присутствие в атеросклеротических поражениях sox-9+ клеток. Далее
было показано, что некоторые из гладкомышечных клеток (α-SMA+) в
атеросклеротических бляшках экспрессируют sox-9. Было выяснено, что
внеклеточный матрикс вокруг sox-9+ клеток содержит коллаген 2-го типа (Type
31
II collagen). Изучение ультраструктуры этих клеток показало присутствие
миофиламентов
и
“плотных”
телец
в
цитоплазме.
Ультраструктурное
исследование позволило проследить последовательные этапы трансформации
“типичных”
гладкомышечных
клеток
в
“хондроцитоидный”
фенотип
гладкомышечных клеток.
CD56+/CD3- NK-КЛЕТКИ В АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШКАХ
В диссертационной работе впервые показано, что клетки экспрессирующие
CD56 присутствуют в атеросклеротических бляшках артерий человека. Хотя
CD56+ клетки и обнаруживаются в поверхностном слое фиброзной выстилки,
часто
в
непосредственной
близости
к
эндотелию,
CD56+
клетки
преимущественно локализованы в плечевых зонах бляшек. Использование
метода двойной иммуногистохимический окраски позволило выявить, что по
крайней мере некоторые из экспрессирующих CD56 клеток не окрашиваются
одновременно с антителом против CD3. Было выяснено, что этот клеточный
тип (CD56+/CD3- клетки; “натуральные киллеры” - natural killer cells - NKклетки) является минорной клеточной популяцией, составляя порядка 0,5% от
общей клеточной популяции в плечевых зонах зрелых бляшек. Были выявлены
контакты между NK-клетками и эндотелиальными клетками, а также контакты
между NK-клетками и макрофагами. Электронная микроскопия позволила
выявить клетки, достаточно сходные по ультраструктуре с лимфоцитами, но
содержащими в цитоплазме значительное число электронно-плотных гранул,
располагающихся, как правило, вдоль наружной клеточной мембраны.
Результаты морфологического анализа позволяют полагать, что в зонах
непосредственных контактов NK-клеток с другими клеточными типами интимы
происходит освобождение содержимого гранул из NK-клеток, ведущее к
локальным повреждениям в контактируемых клетках.
32
ВЫВОДЫ
1. Интима здоровых артерий человека содержит клетки, которые являются
разновидностью дендритных клеток. Дендритные клетки обнаружены в аорте,
коронарных и сонных артериях, что позволяет считать дендритные клетки
обязательным элементом архитектоники артерий человека.
2. В интиме здоровых артерий человека популяция дендритных клеток
неоднородна. На основании ультраструктурных характеристик представляется
рациональным выделить два фенотипа, один из которых является вариантом
клеток Лангерганса.
3. В интиме здоровых артерий существует сложная система межклеточных
взаимодействий, опосредованная присутствием в интиме дендритных клеток.
Посредством клеточных отростков дендритные клетки формируют локальные
клеточные “сети” в интиме артерий, обеспечивая взаимосвязь различных типов
клеток.
4.
На
основании
резистентных
морфологического
к
поражению
сравнения
атеросклерозом
предрасположенных
участков
и
визуально
неповрежденной аорты человека можно считать, что предрасположенные к
поражению участи аорты характеризуются изменением свойств клеток и
нарушением системы межклеточных взаимодействий.
5. Показана повышенная эндоцитозная активность в эндотелиальных клетках в
участках аорты человека, предрасположенных к поражению атеросклерозом. В
этих
же
участках
лимфоцитов
и
обнаружены
активированных
скопления
дендритных
моноцитов-макрофагов,
клеток.
Т-
Морфометрически
доказаны локальность и постоянство инфильтрации интимы моноцитамимакрофагами, которые вовлечены в воспалительные реакции и способны влиять
на изменения фенотипа гладкомышечных клеток.
6.
В
участках
аорты
человека,
предрасположенных
к
поражению
атеросклерозом, система клеточных взаимодействий, свойственная нормальной
33
интиме, нарушается, в частности, в результате формирования дендритными
клетками непосредственных контактов с лимфоцитами и макрофагами.
7. Обнаружение непосредственных контактов между дендритными клетками,
лимфоцитами
и
макрофагами
в
предрасположенных
к
поражению
атеросклерозом участках визуально неповрежденной аорты позволяет считать,
что
очаги
иммунного
воспаления
существуют
уже
в
визуально
неповрежденных участках сосудов. Структурно-функциональное состояние
интимы, наблюдаемое в предрасположенных к поражению атеросклерозом
участках
визуально
нормальных
артерий,
может
рассматриваться
как
предатеросклеротическая стадия, поскольку клетки в таких участках находятся
в состоянии активации.
8. Иммунно-воспалительные реакции при развитии атеросклероза протекают на
фоне изменений клеточной композиций и топографического распределения
клеток в интиме. В частности, при развитии ранних атеросклеротических
поражений популяция дендритных клеток становится более гетерогенной и
меняется
топографическое
распределение
дендритных
клеток,
сопровождающееся преимущественной локализацией дендритных клеток в
“плечевых” зонах развивающихся атеросклеротических бляшек.
9. Количество дендритных клеток в плечевых участках возрастает параллельно
с ростом и трансформацией “стабильных” атеросклеротических бляшек с
толстой фиброзной покрышкой в “нестабильные” бляшки, характеризующиеся
истонченной фиброзной покрышкой. Плечевые зоны бляшек становятся
обогащенными
микрососудами
неоваскуляризации
и
характеризуются
присутствием клеточных кластеров, формируемых контактирующими зрелыми
дендритными клетками с Т-лимфоцитами, представленными “типичными”
лимфоцитами (CD4+; CD8+) и NKT-клетками (CD161+/CD3+). В этих зонах
выявляется также
присутствие NK-клеток (CD56+/CD3-). Обнаружение
изменений в клеточной композиции по мере роста и дестабилизации
атеросклеротических бляшек дает основание полагать, что прогрессирование
34
атеросклероза сопровождается, а возможно и определяется, интенсификацией
иммуно-воспалительных процессов.
10. Изменения клеточного состава и матрикса артерий, протекающие на фоне
воспаления
при
атеросклерозе,
создают
благоприятные
условия
для
формирования кальциевых отложений в интиме. Разрушение дендритных
клеток, цитоплазма которых содержит мощный кальций-связывающий протеин
S-100, может инициировать процесс формирования кальциевых отложений в
артериальной стенке.
11. В артериях, содержащих Chlamydia pneumoniae, микроорганизм может
инфицировать
дендритные
клетки.
В
цитоплазме
дендритных
клеток,
присутствующих в атеросклеротических поражениях, выявляется присутствие в
различных стадиях развития C. pneumoniae. Можно предположить, что
инфицирование дендритных клеток в атеросклеротических поражениях может
вести к изменению направленности и интенсивности иммуно-воспалительных
процессов.
12. Показано, что атеросклеротические поражения апо Е-дефицитных мышей и
крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией содержат дендритные
клетки. Хотя результаты, полученные при анализе артерий животных,
утилизируемых в качестве экспериментальных моделей атеросклероза, не могут
быть
безоговорочно
использованы
для
объяснения
процессов
разыгрывающихся при атеросклерозе у человека, использование таких моделей
оправдано при изучении вопросов морфо- и патогенеза атеросклероза, которые
трудноразрешимы или вообще не разрешимы при использовании аутопсийного
материала.
13.
Интенсификация
иммунного
воспаления
при
прогрессировании
атеросклероза у человека сопровождается фенотипической модуляцией клеток
в атеросклеротических поражениях. В частности это касается гладкомышечных
клеток. Так в зрелых атеросклеротических бляшках, в дополнение к
“синтетическому” и “сократительному” фенотипам гладкомышечных клеток,
35
отмечается дифференциация двух особых фенотипов гладкомышечных клеток,
обозначенных нами как “остеоидный” и “хондроцитоидный” фенотипы.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1) Рассматривать дендритные клетки как обязательный структурный элемент
архитектоники здоровых артерий человека.
2)
Рассматривать
вовлеченность
дендритных
клеток
в
развитие
атеросклеротических поражений артерий как важный компонент морфо - и
патогенеза атеросклероза.
3) Рассматривать дендритные клетки в качестве инструмента при поиске новых
подходов, используемых в иммунотерапии атеросклероза.
4) Использовать данные, касающиеся присутствия и функционирования
дендритных клеток в артериях, в учебном процессе на кафедрах гистологии,
патологической анатомии, общей патологии и патофизиологии медицинских
ВУЗов и институтов Усовершенствования врачей, а также в работах научноисследовательских
институтов,
занимающихся
проблемами
сердечнососудистой патологии человека.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в журналах
1.
Нагорнев
В.А.,
Журавлева
Т.Б.
Бобрышев
Ю.В.
Структурно-
функциональная характеристика внутренней поверхности коронарных
артерий сердца человека при атеросклерозе // Архив патологии. – 1989. –
Т.51., №3. –С. 15-23.
36
2.
Бобрышев Ю.В., Кузнецов А.С. Структурный анализ взаимодействия
липопротеидов низкой плотности с клетками интимы артерий при
атеросклерозе // Архив патологии. – 1989. – Т. 51., №9. –С. 20-26.
3.
Бабаев
В.Р.,
Бобрышев
Ю.В.,
Стенина
О.В.,
Тарарак
Э.М.
Фенотипические варианты гладкомышечных клеток в атероматозной
бляшке аорты человека // Архив патологии. – 1990. –Т.52., №5. – С. 16-21.
4.
Babaev V.R., Bobryshev I.V., Stenina O.I., Tararak E.M., Gabbiani G.
Heterogeneity of smooth muscle cells in atheromatous plaque of human aorta //
American Journal of Pathology. – 1990. – Vol. 136., №5. – P. 1031-1042.
5.
Бабаев В.Р., Сухова Г.К., Бобрышев Ю.В., Сироткин В.Н., Скорова Н.Е.,
Тарарак Э.М. Моноцитарно-макрофагальная инфильтрация в участках
ранних атеросклеротических поражений аорты человека // Архив
патологии. – 1991. – Т. 53., №10. – С. 48-53.
6.
Бобрышев Ю.В., Сухова Г.К., Бабаев В.Р., Казанцева И.А. Межклеточные
контакты в участках раннего атеросклеротического поражения аорты
человека // Архив патологии. – 1991. – Т.53., № 11.– С. 38-42.
7.
Нагорнев В.А., Бобрышев Ю.В., Ивановский Ю.В., Богачев Ю.В. Роль
моноцитов-макрофагов в атерогенезе // Архив патологии. – 1991. –Т.53.,
№6. – С. 23-29.
8.
Babaev V.R., Bobryshev Y.V., Sukhova G.K., Kasantseva I.A. Monocytemacrophage accumulation and smooth muscle cell phenotypes in early
atherosclerotic lesions of human aorta // Atherosclerosis. – 1993. –Vol. 100.,
№2. – P. 237-248.
9.
Bobryshev Y.V., Lord RSA. S-100 positive cells in human arterial intima and
in atherosclerotic lesions // Cardiovascular Research. –1995. – Vol. 29., №5. –
P. 689-696.
10.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A Ultrastructural recognition of cells with dendritic
cells morphology in human aortic intima. Contacting interactions of Vascular
Dendritic Cells in athero-resistant and athero-prone areas of the normal aorta //
Archives of Histology and Cytology. –1995. – Vol. 58., №3. – P. 307-322.
37
11.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Detection of vascular dendritic cells and
extracellular calcium-binding protein S-100 in foci of calcification in human
arteries // Acta Histochemica et Cytochemica. – 1995. – Vol. 28., №2. – 371380.
12.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Warren B.A. Calcified deposit formation in
intimal thickenings of the human aorta // Atherosclerosis. – Vol. 118., №1. – P.
9-21.
13.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Structural heterogeneity and contacting
interactions of vascular dendritic cells in early atherosclerotic lesions of the
human aorta // Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology. – 1996. –
Vol. 28., №1. – P. 49 -60.
14.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Langhans cells of human arterial intima: uniform
by stellate appearance but different by nature. // Tissue & Cell. – 1996. – Vol.
28., №2. – P. 177-194.
15.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Rainer S., Jamal O.S., Munro V.F. Vascular
dendritic cells and atherosclerosis // Pathology, Research and Practice. – 1996.,
Vol. 192., №5. – P. 462-467.
16.
Bobryshev Y.V., Crozier J.A., Lord R.S.A., Tran D., Jamal O.S., Pärsson H.N.,
Scott K.F. Expression of secretory group II phospholipase A2 by CD1a
positive cells in human atherosclerotic plaques // Atherosclerosis. – 1996. –
Vol. 127., №2. – P. 283-285.
17.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Rainer S., Munro V.F. VCAM-1 expression and
network of VCAM-1 positive vascular dendritic cells in advanced
atherosclerotic lesions of carotid arteries and aortas // Acta Histochemica. –
1996. – Vol. 98., № 2. – P. 185-194.
18.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Gap junctional vesicles in intimal smooth muscle
cells in human atherosclerotic arteries // Ultrastructural Pathology. – 1997. –
Vol. 21. – №1. – P. 93-94.
38
19.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Vascular dendritic cells express intercellular
adhesion molecule-1 in atherosclerotic plaques // Biomedical Research-Tokyo.
– 1997. – Vol. 18., №1. – P. 179-182.
20.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Watanabe T. Structural peculiarities of vascular
dendritic cell tubulovesicular system in human atherosclerotic aorta // Journal
of Submicroscopic Cytology and Pathology. – 1997. – Vol. 29. – №4. – P. 553561.
21.
Bobryshev Y.V., Babaev V.R., Lord R.S.A., Watanabe T. Cell death in
atheromatous plaque of the carotid artery occurs through necrosis rather
through apoptosis // In Vivo. – 1997. – Vol. 11., №6. – P. 441-452.
22.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Golovanova N.K., Gracheva E.V., Zvezdina
N.D., Sadovskaya V.L., Prokazova N.V. Incorporation and localisation of
ganglioside GM3 in human intimal atherosclerotic lesions // Acta Biochimica
et Biophysica. – 1997. – Vol. 1361., №3. – P. 287-294.
23.
Bobryshev Y.V., Watanabe T. Ultrastructural evidence for association of
vascular dendritic cells with T-lymphocytes and with B-cells in human
atherosclerosis // Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology. –1997. –
Vol. 29., №2 – P. 209-221.
24.
Bobryshev Y.V., Watanabe T. Subset of vascular dendritic cells transforming
into foam cells in human atherosclerotic lesions // Cardiovascular Pathology. –
1997. – Vol. 6., №1. – P. 321-331.
25.
Bobryshev Y.V., Ikezawa T., Watanabe T. Formation of Birbeck granule-like
structures in vascular dendritic cells in human atherosclerotic aorta. Lagantibody to epidermal Langerhans cells recognizes cells in the aortic wall //
Atherosclerosis. – 1997. – Vol. 133., №2. – P. 193-202.
26.
Niederhoffer N., Bobryshev Y.V., Lartaud-Idjouadiene I., Giummelly P.
Involvement of S-100 protein and S-100(+) cells in aortic medial calcification.
// FASEB Journal. – 1997. – Vol. 11., №11. – P. 895.
39
27.
Niederhoffer N., Bobryshev Y.V., Lartaud-Idjouadiene I., Giummelly P.,
Atkinson J. Aortic calcification produced by vitamin D3 plus nicotine //
Journal of Vascular Research. – 1997. – Vol. 34., №5. – Р. 386-398.
28.
Bobryshev Y.V., Lord RSA. Detection of vascular dendritic cells accumulating
calcified deposits in their cytoplasm // Tissue & Cell. –1998. –Vol. 30., №3. –
P. 383-388.
29.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Mapping of vascular dendritic cells in
atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immuneinflammatory reactions // Cardiovascular Research. – 1998. – Vol. 37., №3. –
P. 799-810.
30.
Ozmen J., Lord R.S.A., Bobryshev Y.V., Ashwell K.W.S., Munro V.F. S100
protein
is
expressed
in
induced
atherosclerotic
lesions
of
hypercholesterolaemic rats // Biomedical Research. – 1998. –Vol. 19., №1. – P.
279-287.
31.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Watanabe T. Ikezawa T. The cell adhesion
molecule E-cadherin is widely expressed in human atherosclerotic lesions //
Cardiovascular Research. – 1998. – Vol. 40., №1. – P. 191-205.
32.
Bobryshev Y.V., Lord RSA, Pärsson H.N. Immunophenotypic analysis of the
aortic aneurysm wall suggests that vascular dendritic cells are involved in
immune responses // Cardiovascular Surgery. – 1998. – Vol. 6., №3. – P. 240349.
33.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Accumulation of co-localised unesterified
cholesterol and neutral lipids within vacuolised elastin fibres in athero-prone
areas of the human aorta // Atherosclerosis. – 1999. – Vol. 142., № 1. – P. 121131.
34.
Bobryshev Y.V., Babaev V.R., Iwasa S., Lord R.S.A., Watanabe T.
Atherosclerotic lesions of apolipoprotein E deficient mice contain cells
expressing S100 // Atherosclerosis. – 1999. – V. 143. – №2. – P. 451-454.
35.
Prokazova N.V, Golovanova N.K., Gracheva E.V., Zvezdina N.D., Bobryshev
Y.V., Lord R.S.A. Incorporation, localization and possible biological function
40
of glycosphingolipids in human arteries in atherosclerosis // Angiology and
Cardiovascular Surgery. – 1999. – Vol. 5., №1. – P. 151-166.
36.
Wang A.Y., Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Liang H., Inder S.J., Lord R.S.A.,
Ashwell K.W.S., Farnsworth A.E. Structural features of cell death in
atherosclerotic lesions affecting long term aortocoronary saphenous vein
bypass grafts // Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology. – 1999. –
Vol. 31., №3. – P. 423-432.
37.
Cherian S.M., Bobryshev Y.V., Inder S.J., Lord R.S.A., Reddi K.H.,
Farnsworth A.E., Tran D., Munro V.F., Ashwell K.W.S. Involvement of
dendritic cells in long term aortocoronary saphenous vein bypass graft failure //
Cardiovascular Surgery. – 1999. – Vol. 7., №5. – P. 508-518.
38.
Cherian S.M., Bobryshev Y.V., Inder S.J., Lord R.S.A., Ashwell K.W.S.
Dendritic cells in venous pathologies // Angiology. – 1999. – Vol. 50., №5. –
P. 393-402.
39.
Bobryshev Y.V., Konovalov H.V., Lord R.S.A. Ultrastructural recognition of
dendritic cells in the intimal lesions of aortas of chickens with Marek's disease.
Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology. – 1999. – Vol. 31., №2. –
P. 179-185.
40.
Linton M.F., Babaev V.R., Bobryshev Y.V., Oates J.A., Fazio S.
Cyclooxygenase-2 expression in human and mouse atherosclerotic lesions. //
Circulation. – 1999. – Vol. 100. Suppl. 2146. – P. 408.
41.
Lord R.S.A., Bobryshev Y.V. Clustering of dendritic cells in athero-prone
areas of the aorta // Atherosclerosis. – 1999. – Vol. 146., №1. – P. 197-199.
42.
Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Inder S.J., Lord R.S.A. Neovascular expression
of VE-cadherin in human atherosclerotic arteries and its relation to intimal
inflammation // Cardiovascular Research. – 1999. – Vol. 43., №4. – P. 10031017.
43.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. 55 kDa actin-bundling protein (p55) is a specific
marker for identifying vascular dendritic cells // Journal of Histochemistry and
Cytochemistry. – 1999. – Vol. 47., №11. – P. 1481-1486.
41
44.
Bobryshev Y.V., Babaev V.R., Lord R.S.A., Watanabe T. Ultrastructural
identification of cells with dendritic cell appearance in atherosclerotic aorta of
apolipoprotein E deficient mice // Journal of Submicroscopic Cytology and
Pathology. – 1999. – Vol. 31., №4. – P. 527-531.
45.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. Vascular-associated lymphoid tissue (VALT)
involvement in aortic aneurysm // Atherosclerosis. – 2000. – Vol. 154., №1. –
P. 15-21.
46.
Wang A.Y., Bobryshev Y.V., Liang H., Cherian S.M., Inder S.J., Ashwell
K.W.S., Farnsworth A.E., Lord R.S.A. Electron-microscopic detection of
apoptotic and necrotic cell death in non-atherosclerotic areas of stenotic
aortocoronary saphenous vein bypass grafts // Journal of Submicroscopic
Cytology and Pathology. – 2000. – Vol. 32., №2. – P. 209-219.
47.
Cherian S.M., Bobryshev Y.V., Inder S.J.,Wang A.Y., Lord R.S.A.,
Farnsworth A.E. Dendritic cells in aortocoronary saphenous vein bypass grafts
// Heart, Lung and Circulation. – 2000. – Vol. 9., №1. – P. 40-42.
48.
Inder S.J., Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Lord R.S.A., Masuda K., Yutani C.
Accumulation of lymphocytes, dendritic cells and granulocytes in the aortic
wall affected by Takayasu's disease // Angiology. – 2000. – Vol. 51., №7. – P.
565-579.
49.
Inder S.J., Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Wang A.Y., Lord R.S.A., Masuda
K., Yutani C. Immunophenotypic analysis of the aortic wall in Takayasu's
arteritis: The involvement of lymphocytes, dendritic cells and granulocytes in
immuno-inflammatory reactions // Cardiovascular Surgery.– 2000. – Vol. 8.,
№2. – P. 141-148.
50.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. CD1 expression and the nature of CD1
expressing cells in human atherosclerotic plaques // American Journal of
Pathology. – 2000. – Vol. 156., №4. – P. 1477-1478.
51.
Bobryshev Y.V. Dendritic cells and their involvement in atherosclerosis //
Current Opinion in Lipidology. – 2000. – V. 11., №5. – C. 511-517.
42
52.
Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Inder S.J., Lord R.S.A., Tran D. Identification
of HIV-1 in the aortic wall of AIDS patients // Atherosclerosis. – 2000. – Vol.
152., №2. – P. 529-530.
53.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Golovanova N.K., Gracheva E.V., Zvezdina
N.D., Prokazova N.V. Phenotype determination of anti-GM3 positive cells in
atherosclerotic lesions of the human aorta. Hypothetical role of ganglioside
GM3 in foam cell formation // Acta Biochimica et Biophysica. – 2001. – Vol.
1535., №2. – P. 87-99.
54.
Ozmen J., Bobryshev Y.V., Lord R.S.A. CD40 co-stimulatory molecule
expression by dendritic cells in primary atherosclerotic lesions in carotid
arteries and stenotic aortocoronary saphenous vein bypass grafts //
Cardiovascular Surgery. – 2001. – V. 9., №4. – P. 162-166.
55.
Inder S.J., Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Lord R.S.A., Wang A.Y.
Identification of dendritic cells in ePTFE grafts explanted from humans //
Cardiovascular Surgery. – 2001. – Vol. 8., №4. – P. 265-273.
56.
Bobryshev Y.V., Inder S.J., Cherian S.M., Lord R.S.A., Ao P.Y., Hawthorne
W.J., Fletcher J.P. Colonisation of prosthetic grafts by immunocompetent cells
in a sheep model // Cardiovascular Surgery. – 2001. – Vol. 9., №2. – P. 93-99.
57.
Cherian S.M., Bobryshev Y.V., Liang H., Inder S.J.,Wang A.Y., Lord R.S.A.,
Tran D., Pandey P., Halaz P., Farnsworth A.E. Immunohistochemical and
ultrastructural evidence that dendritic cells infiltrate stenotic aortocoronary
saphenous vein bypass grafts // Cardiovascular Surgery.– 2001. – Vol. 9., №2.
– P. 41-47.
58.
Wang A.Y., Bobryshev Y.V., Cherian S.M., Liang H., Tran D., Inder S.J., Lord
R.S.A., Ashwell K.W.S., Farnsworth A.E. Expression of apoptosis-related
proteins and structural features of cell death in explanted aortocoronary
saphenous vein bypass grafts // Cardiovascular Surgery. – 2001. – Vol. 9., №4.
– P. 144-153.
43
59.
Bobryshev Y.V., Farnsworth A.E., Lord R.S.A. Expression of vascular
endothelial growth factor in aortocoronary saphenous vein bypass grafts //
Cardiovascular Surgery.– 2001. – Vol. 9., №5. – P. 492-498.
60.
Bobryshev YV, Taksir T, Lord RSA, Freeman MW. Evidence that dendritic
cells infiltrate atherosclerotic lesions in apolipoprotein E-deficient mice //
Histology and Histopathology. – 2001. – Vol. 16., №3. – P. 801-808.
61.
Santiago FS, Lowe HC, Bobryshev YV, Khachigian LM. Induction of the
transcriptional
repressor
Yin
Yang-1
by
vascular
cell
injury.
Autocrine/paracrine role of endogenous fibroblast growth factor-2 // Journal of
Biological Chemistry. – Vol. 276., №44 – P. 41143-41149.
62.
Bobryshev Y.V. Can dendritic cells be exploited for therapeutic intervention in
atherosclerosis? // Atherosclerosis. – 2001. – Vol. 154., №2. – P. 511-512.
63.
Ozmen J, Bobryshev YV, Lord RSA, Ashwell KW. Identification of dendritic
cells
in
aortic
atherosclerotic
lesions
in
rats
with
diet-induced
hypercholesterolaemia // Histology and Histopathology. – 2002. – Vol. 17.,
№1. – P. 223-237.
64.
Lord R.S.A., Bobryshev Y.V. Hallmarks of atherosclerotic lesion development
with special reference to immune inflammatory mechanisms // Cardiovascular
Surgery. – 2002. – Vol. 10., №4. – P. 405-414.
65.
Bobryshev Y.V, Lord R.S.A. Expression of heat shock protein-70 by dendritic
cells in the arterial intima and its potential significance in atherogenesis //
Journal of Vascular Surgery. – 2002. – V. 35., № 2.– P. 368-375.
66.
Al-Fakhri N., Wilhelm J., Hahn M., Heidt M., Hehrlein H.W., Endisch A.M.,
Hupp T., Cherian S.M., Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Katz N. Simultaneous
upregulation of disintegrin metalloproteinases ADAMs 9 and 15 with integrins
a5ß1 and avß3 in human atherosclerosis compared with normal arteries //
Journal of Cellular Biochemistry. – 2003. – Vol. 89., №4. – P. 808-23.
67.
Cao W., Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Oakley R.M.E., Lee S.H., Lu J.
Dendritic cells in the arterial wall express C1q: Potential significance in
atherogenesis // Cardiovascular Research. – 2003. – Vol. 60., №1. – P. 175-86.
44
68.
Bobryshev, Y.V., Cao W., Phoon M.C., Tran D., Chow V.T.K., Lord R. S.A.,
Lu J. Detection of Chlamydophilia pneumoniae in dendritic cells in
atherosclerotic lesions // Atherosclerosis. – 2004. – Vol. 173., №2. – C. 185195.
69.
Bobryshev Y.V. Transdifferentiation of smooth muscle cells into chondrocytes
in atherosclerotic arteries in situ: Implications for diffuse intimal calcification //
Journal of Pathology. – 2005. – Vol. 205., №5. – C. 641-650.
70.
Bobryshev Y.V, Lord R.S.A. Identification of Natural Killer cells in human
atherosclerotic plaque // Atherosclerosis. – 2005. – Vol. 180., № 2.– C. 423427.
71.
Bobryshev Y.V, Lord R.S.A. Co-accumulation of Dendritic Cells and Natural
Killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.
Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 2005. – Vol. 53., №6.– P. 781785.
72.
Bobryshev Y.V. Natural killer T cells in atherosclerosis // Arteriosclerosis,
Thrombosis and Vascular Biology. – 2005. – Vol. 25., № 5.– Р. e40.
73.
Yan W.X., Rahimi F., Bobryshev Y.V., Song C.J., Hsu K., Geczy C. Roles of
S100A12 in atherosclerosis // Inflammation Research. – 2005. – Vol. 54., №3.
– Р. S205.
74.
Mujawar Z., Rose H., Morrow M., Orenstein J., Bobryshev, Y., Sviridov D.,
Bukrinsky
M.
YesHIV
impairs
reverse
cholesterol
transport
from
macrophages: A possible mechanism of atherogenic effect of HIV-1 infection
// Retrovirology. – 2005. – Vol. -. Suppl. 1. – P. S151.
75.
Bobryshev Y.V. Subset of cells immunopositive for neurokinin-1 receptor
identified as arterial interstitial cells of Cajal in human large arteries // Cell and
Tissue Research. – 2005. – Vol. 321., №1. – P. 45-55.
76.
Bobryshev Y.V. Intracellular localization of oxidized low density lipoproteins
in atherosclerotic plaque cells revealed by electron microscopy combined with
Laser Capture Microdissection // Journal of Histochemistry and Cytochemistry.
–2005. – Vol. 53., №6. – Р.793-797.
45
77.
Bobryshev Y.V. Calcification of elastic fibers in human atherosclerotic plaque
// Atherosclerosis. – 2005. – Vol. 180., №2. – Р. 293-303.
78.
Bonello M.R., Bobryshev Y.V., Khachigian L.M. Peroxide-Inducible Ets-1
Mediates
Platelet-Derived
Growth
Factor
Receptor-{alpha}
Gene
Transcription in Vascular Smooth Muscle Cells // American Journal of
Pathology. – 2005. – Vol. 167., №4. – P. 1149-1159.
79.
Bobryshev Y.V. Dendritic cells in atherosclerosis: Current status of the
problem and clinical relevance // European Heart Journal. – 2005. – Vol. 26.,
№17.– P. 1700-1704.
80.
McCormick M.M., Rahimi F., Bobryshev Y.V., Gaus K., Zreiqat H., Cai H.,
Lord R.S.A., Geczy C.L. S100A8 and S100A9 in human arterial wall:
Implications for atherogenesis // Journal of Biological Chemistry. – 2005. –
Vol. 280., №50.– P. 41521-41529.
81.
Bobryshev Y.V. Monocyte recruitment and foam cell formation in
atherosclerosis // Micron. – 2006. – Vol. 37., №3.– P. 208-222.
82.
Mujawar Z., Rose H., Morrow M.P., Pushkarsky T., Dubrovsky L.,
Mukhamedova N., Fu Y., Dart A., Orenstein J.M., Bobryshev Y.V., Bukrinsky
M., Sviridov D. Human immunodeficiency virus impairs reverse cholesterol
transport from macrophages // PLoS Biology. – 2006. – Vol. 4., № 11. – Р.
1970-1983.
83.
Bobryshev Y.V., Golovanova N.K., Tran D., Samovilova N.N., Gracheva E.V.,
Efremov E.E., Sobolev A.Y., Yurchenko Y.V., Lord R.S.A., Cao W., Lu J.,
Saito M., Prokazova N.V. Expression of GM3 synthase in human
atherosclerotic lesions // Atherosclerosis. – 2006. – Vol. 184., №1. – P. 63-71.
84.
Bobryshev Y.V., Lord R.S.A., Tran D. Chlamydia pneumoniae in foci of
„early‟ calcification of the tunica media in arteriosclerotic arteries: An
incidental presence? // American Journal of Physiology - Heart and Circulatory
Physiology. – 2006. – Vol. 290., №4 .– C. H1510-1519.
85.
Bobryshev Y.V., Killingsworth M.C., Huynh T.G., Lord R.S., Grabs A.J.,
Valenzuela S.M. Are calcifying matrix vesicles in atherosclerotic lesions of
46
cellular origin? // Basic Research in Cardiology. – 2007. – Vol. 102., №2. – P.
133-143.
86.
Bobryshev Y.V., Killingsworth M.C., Tran D., Lord R. Amalgamation of
Chlamydia pneumoniae inclusions with lipid droplets in foam cells in human
atherosclerotic plaque // Virchows Archiv. – 2008. – Vol. 453., №1. – P. 69-77.
87.
Bobryshev Y.V., Killingsworth M.C., Lord R.S.A. Spatial distribution of
osteoblast-specific transcription factor Cbfa1 and bone formation in
atherosclerotic arteries // Cell and Tissue Research. – 2008. – Vol. 333., №2. –
P. 225-235.
88.
Bobryshev Y.V., Killingsworth M.C., Lord R.S.A., Grabs A.J. Matrix vesicles
in the fibrous cap of atherosclerotic plaque: Possible contribution to plaque
rupture // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2008. – Vol. 12.,
№5В. – P. 2073-2082.
89.
Kavurma M.M., Schoppet M., Bobryshev Y.V., Khachigian L.M., Bennett
M.R. TRAIL stimulates proliferation of vascular smooth muscle cells via
activation of NF-kappaB and induction of insulin-like growth factor-1 receptor
// Journal of Biological Chemistry. – 2008. – Vol. 283. , №12. – P. 7754-7762.
90.
Goyette J., Yan W.X., Yamen E., Chung Y.M., Lim S.Y., Hsu K., Rahimi F.,
Di Girolamo N., Song C., Jessup W., Kockx M., Bobryshev Y.V., Freedman
S.B., Geczy C.L. Pleiotropic roles of S100A12 in coronary atherosclerotic
plaque formation and rupture // Journal of Immunology. – 2009. – Vol. 183.,
№1.– P. 593-603.
91.
Бобрышев Ю.В., Лорд Р.С.А., Нагорнев В.А. Дендритные клетки и их
роль в атеросклерозе. // Медицинский Академический Журнал. – 2009. –
Т. 9. – С. 11-24.
92.
Cherian S., Bharati S, Bobryshev Y., Nayar S., Jagannath B. Association of
Chlamydia pneumoniae within calcified coronary atherosclerosis // British
Journal of Surgery. – 2010. – Vol. 97., Suppl. 4. – P. S20.
93.
Bobryshev Y.V. Dendritic cells and their role in atherogenesis // Laboratory
Investigation. – 2010. – Vol. 90., №7.– P. 970-984.
47
94.
Orekhov A.N., Andreeva E.R., Andrianova I.V., Bobryshev Y.V. Peculiarities
of cell composition and cell proliferation in different type atherosclerotic
lesions in carotid and coronary arteries // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 212.,
№2. – P. 436-443.
95.
Bobryshev Y.V. Vitamin D3 suppresses immune reactions in atherosclerosis,
affecting regulatory T cells and dendritic cell function // Arteriosclerosis,
Thrombosis, and Vascular Biology. – 2010. –Vol. 30., №12. – P. 2317-2319.
96.
Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П., Ковалевская Ж.И., Мясоедова В.А.,
Шапырина Е.В., Салямов В.И., Каргополова Ю.М., Галактионова Д.Ю.,
Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Численность и клеточная пролиферация
в интиме различных артерий человека // Цитология. – 2011. – Т. 53., №10.
– С. 815-825.
97.
Perrins C.J., Bobryshev Y.V. Current advances in understanding of
immunopathology of atherosclerosis // Virchows Archiv. – 2011. – Vol. 458.,
№2. – P. 117-123.
98.
Bobryshev Y.V., Tran D., Botelho N.K., Lord R.V.N., Orekhov A.N.
Musashi-1 expression in atherosclerotic arteries and its relevance to the origin
of arterial smooth muscle cells: Histopathological findings and speculations //
Atherosclerosis. – 2011. – Vol. 215. , №2. – P. 355-365.
99.
Bobryshev Y.V., Andreeva E.R., Mikhailova I.A., Andrianova I.V.,
Moisenovich M.M., Khapchaev S., Agapov I.I., Sobenin I.A., Lusta K.A.,
Orekhov A.N. Correlation between lipid deposition, immune-inflammatory cell
content and MHC class II expression in diffuse intimal thickening of the
human aorta // Atherosclerosis. – 2011. – Vol. 219., №1. – P. 171-183.
100. Bobryshev YV, Orekhov AN, Killingsworth MC, Lu J. Decreased expression
of Liver X Receptor-a in macrophages infected with Chlamydia pneumoniae in
human atherosclerotic arteries in situ // Journal of Innate Immunity. –2011. –
Vol. 3., №5. – P. 483-494.
101. Bobryshev Y.V., Karagodin V.P., Kovalevskaya Z.I., Myasoedova V.A.,
Shapyrina E.V., Salyamov V.I., Kargapolova Y.M., Galaktionova
D.Y.,
48
Melnichenko A. A., Orekhov A. N. The number of cells and the cell
proliferation in intima of various human arteries // Cell and Tissue Biology. –
2012. – Vol. 6., №1.– P. 29-39.
102. Chistiakov D.A., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Mitochondrial
dysfunction
and
mitochondrial
DNA
mutations
in
atherosclerotic
complications in diabetes // World Journal of Cardiology. – 2012. – Vol. 4.,
№5.– P. 148-156.
103. Bobryshev Y.V., Moisenovich M.M., Pustovalova O.L., Agapov I.I., Orekhov
AN. Widespread distribution of HLA-DR-expressing cells in macroscopically
undiseased intima of the human aorta: A possible role in surveillance and
maintenance of vascular homeostasis // Immunobiology. – 2012. – Vol. 217.,
№5. – P. 558-568.
104. Bobryshev Y.V., Killingsworth M.C., Orekhov A.N. Increased shedding of
microvesicles from intimal smooth muscle cells in athero-prone areas of the
human aorta: Implications for understanding of the pre-disease stage //
Pathobiology. – 2013. – Vol. 80., №1. – P. 24-31.
Глава в монографии
Bobryshev Y.V. Dendritic cells in atherosclerosis. In: Dendritic cells: Biology
and Clinical Applications / Eds. M.T. Lotze, A.W. Thomson / San-Diego,
Acad. Press. – 2001. - PP. 547-557.
Монография
Бобрышев Ю.В., Орехов А.Н. Клеточные механизмы атеросклероза:
Архитектоника атеросклеротических поражений и роль дендритных
клеток. LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH & Co. KG,
Saarbrücken, Germany, – 2012. –172 c.
49
Bobryshev Yuri Veniaminovich
Structural and functional peculiarities of arteries at immune inflammation in
atherogenesis
Abstract
Atherosclerosis and vascular disorders which result from atherosclerosis represent one
of the major problems in the modern medicine and public health. Despite the enormous
investments in investigation of atherosclerosis have been made, the mechanisms that initiate
the development of this disease and changes in the cell compositions in affected arteries
remain not well understood. The initial aim of the present thesis was to elucidate the
structural and functional aspects of the development of atherosclerosis in humans, with
special attention to the role of immune inflammation. During the analysis of human arterial
tissue specimens, a new cell type was found and, eventually, it was understood that this cell
belongs to the family of antigen-presenting dendritic cells. The studies summarized in the
present thesis show that vascular dendritic cell is an essential element of human normal
arteries. The thesis shows that, by means of their cellular processes, dendritic cells form
local cellular networks in the intima of the arterial wall, allowing the relationship between
different cell types. The identification and characterization of cellular interactions provided
by vascular dendritic cells allows us a better understanding of the mechanisms that maintain
homeostasis in normal human arteries. In the studies outlined in this thesis, the features and
the topographic distribution of dendritic cells in the normal arterial wall and different types
of atherosclerotic lesions are detailed. In advances atherosclerotic plaques, preferential
accumulations of dendritic cells were found to be the shoulder areas of lesions. An increase
in numbers of dendritic cells in the plaque shoulder areas was found to occur in parallel with
the transformation of stable atherosclerotic plaques to unstable plagues. The formation of
multiple clusters of mature CD83+ dendritic cells with activated T-lymphocytes in the
shoulder regions was found to characterize unstable plagues.
The results of the analysis that are provided in the thesis give a comprehensive picture
of the cellular mechanisms of immune inflammation which are involved in the initiation of
early atherosclerotic lesions and the formation and destabilization of atherosclerotic
plaques.
50