скрининг микроорганизмов-антагонистов фитопатогенов
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) - БИОЛОГИЯ ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа СКРИНИНГ МИКРООРГАНИЗМОВ-АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН. Работа завершена: Группа 01-102 « » _____________2015г. _________________ (И. И. Салахова) Работа допущена к защите: Научный руководитель доцент, к.б.н. « » _____________2015г. _________________ (Н.С. Карамова) Заведующий кафедрой профессор, д.б.н. « » _____________2015г. _________________ Казань-2015 (О.Н. Ильинская) Содержание стр. ВВЕДЕНИЕ 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 1.1 Возбудители инфекционных болезней растений 6 1.1.1 Бактериальные фитопатогены 7 1.1.2 Грибные фитопатогены 1.1.3 Актиномицеты, как агенты биоконтроля фитопатогенов растений ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 15 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23 2.1 Объект исследования 23 2.2 Питательные среды и условия культивирования 23 19 23 2.3 Выделение возбудителей бактериальной инфекции из клубней 24 картофеля 2.4 Идентификация бактерий на MALDI BioТyper (Bruker 24 Daltonik) 2.5 Проверка фитопатогенных свойств 24 2.6 Выделение актиномицетов из почвы 25 2.7 Исследование антагонистической активности в отношении грибных фитопатогенов 25 2.8 Исследование антагонистической активности в отношении 25 бактериальных фитопатогенов 2.9 Идентификация выделенных актиномицетов с антагонистической активностью 26 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 27 3.1 Выделение и идентификация возбудителей бактериальных 27 инфекций из клубня картофеля 2 3.2 Проверка фитопатогенных свойств штаммов бактерий и микромицетов 28 3.3 Выделение актиномицетов из почвы 29 3.4 Антагонистическая активность актиномицетов в отношении грибных фитопатогенов методом агаровых блоков 3.5 Антагонистическая активность актиномицетов в отношении бактериальных фитопатогенов методом агаровых блоков 3.6 Идентификация выделенных актиномицетов с антагонистической активностью 30 31 33 ВЫВОДЫ 35 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 36 3 г о в о р и т , А р т е м з о в у т . я г о в о р ю : к а к о й ? ВВЕДЕНИЕ В последние годы все более актуальной становится проблема обеспечения продовольствием всего населения планеты. Глобальное изменение климата в последние десятилетия является одним из важнейших факторов, влияющих на развитие всех отраслей экономики, и в первую очередь сельского хозяйства. Частые неблагоприятные погодные явления в период вегетации, проявляющиеся засухами, ливневыми дождями, поздними весенними заморозками, приводят к большим потерям урожая основных культур, что в свою очередь ведет к росту цен на сельскохозяйственную продукцию на продовольственном рынке. В связи с этим встает вопрос безопасности и обеспеченности республики основными продуктами сельского хозяйства, а также о привлекательности производства продовольственных товаров на экспорт. Картофель является высокопродуктивной, повсеместно возделываемой культурой. Клубни картофеля представляют собой не только ценный, богатый витаминами, микроэлементами, антиоксидантами о н : незаменимыми а получению высоких стабильных урожаев картофеля и его сохранению у препятствуют масштабные потери, связанные в первую очередь с массовым т е б я поражением комплексом инфекционных болезней. и х м н о г о ? производства аминокислотами крахмала Картофель и относится продукт множества к питания, но и и сырье для картофелепродуктов. культурам, сильно Однако поражаемым фитопатогенами. В значительной степени это обусловлено особенностями его биологии. Богатые углеводами и водой ботва и клубни представляют собой благоприятную среду для развития самых разных возбудителей заболеваний. Наряду с широко распространенными и вредоносными инфекционными болезнями грибной, вирусной, вироидной и фитоплазменной этиологии, заболевания, вызванные фитопатогенными б л и н . 4 бактериями, причиняют огромный ущерб картофелеводству во всем мире [Иванюк, 2010] В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось поиск новых штаммов актинобактерий антагонистов для биоконтроля микробных фитопатогенов картофеля . В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 1) Выделить в чистую культуру возбудителей бактериальных гнилей экономически важных сортов картофеля, возделываемых в Республике Татарстан. 2) Охарактеризовать и идентифицировать до вида возбудителей бактериальных гнилей картофеля. 3) Оценить фитопатогенные свойства штаммов бактерий и микромицетов, поенциальных возбудителей микозно-бактериальной гнили картофеля. 3) Выделить изоляты почвенных актинобактерий из почвы опытных полей ТатНИИСХ а. 4) Изучить антагонистические свойства выделенных изолятов актинобактерий в отношении фитопатогенных грибов и бактерий картофеля. 5) Определить систематическое положение наиболее активных изолятов актинобактерий антагонистов. 5 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Возбудители инфекционных болезней растений. Фитопатогенные организмы можно разделить по степени паразитизма (по типу питания) на следующие группы. Виды использующие для питания вещество других живых организмов - паразиты, а мертвое веществосапротрофы [Аветисов, 1999]. Облигатные сапротрофы поселяются только на мертвых остатках, напротив, облигатные паразиты питаются только за счет живых организмов. Факультативные - способны развиваться на поверхности или внутри живых организмов, а также вести сапротрофный образ жизни. Большинство фитопатогенов относится к этой группе, среди них возбудители корневой гнили, трахеомикозов, серой и белой гнили [Агур, 2000]. Степень паразитизма у них выражена различно, их жизненные цикл может проходить как на живых растениях, так и во внешней среде, причем паразитический образ жизни для них менее характерен. Борьба с факультативными патогенами строится в основном на создании неблагоприятных условий для их роста и развития, и, наоборот, на формировании оптимальных условий для растений. В таких условиях и в отсутствии травмирующих факторов вероятность заболевания этими патогенами не велика. Но в экстремальных условиях эти патогены в короткий срок способны нанести существенный вред, который выражается в быстрой гибели множества растений. Паразиты растений чаще всего имеют локальное распространение, но при благоприятных условиях одновременно многие растения оказываются зараженными. Подобные массовые заболевания растений, развивающиеся под действием болезнетворных микроорганизмов, на ограниченной территории в течении определенного времени, называются эпифитотиями [Абеленцев, 2006]. Любая эпифитотия имеет три стадии развития: подготовительную; собственно эпифитотию; затухающую. В первую происходит накопление инфекционного начала. Она может длиться довольно долго; при болезнях моноциклического характера-несколько лет. Во вторую стадию наблюдается 6 массовое поражение растений, часто заканчивающееся их гибелью. На заключительной стадии интенсивность развития болезни постепенно снижается, что обусловлено, или биологическими особенностями патогенна, или защитными мерами [Стройков, Шкаликов, 1998] Заболевания растений принято делить на две группы инфекционные и неинфекционные. Инфекционные, или паразитарные, болезни вызванные патогенными микроорганизмами, основной признак этих болезней – заразность. Возбудителями, или патогенами этих заболеваний могут быть грибы, бактерии, вирусы, вироиды, фитоплазмы, простейшие (Protozoa) и нематоды, которые развиваются внутри растения-хозяина. Неинфекционные заболевания, или нарушения являются результатом воздействия неблагоприятных условий окружающей среды или нарушения развития органов или всего растения в целом. 1.1.1 Бактериальные фитопатогены. Бактерии и фитоплазмы относят к прокариотам. Почти все фитопатогенные бактерии имеют палочковидную форму. Большинство фитопатогенных бактерий подвижно благодаря наличию жгутиков, неподвижных форм немного. Бактерии могут иметь один или несколько жгутиков. Фитопатогенные бактерии способны размножаться в широком интервале температуры: от 5 до 40˚С, оптимальная температура-25-30˚С. Для активной жизнедеятельности растений нужна нейтральная или слабощелочная среда, что отличает их от грибов, для роста которых благоприятна кислая среда. Бактериозы картофеля – черная ножка (Erwinia carotovora), кольцевая гниль (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum), бурый слизистый бактериоз (бурая гниль) картофеля (Ralstonia solanacearum) – являются серьезными барьерами для получения стабильного урожая картофеля высокого качества. Возникновение бактериальных заболеваний происходит, как правило, в результате совмещения двух групп факторов, это, накопление 7 большого запаса патогенных микроорганизмов, что связано со степенью зараженности семенного материала и наличия благоприятных условий окружающей среды для их размножения и развития. Необходимым условием патогенеза является также наличие достаточного количество инфекционного начала. Основным источником инфекции является материнские клубни, из которых бактерии проникают в растения и клубни нового урожая. Кроме того микроорганизмы могут попадать в клубни через механические повреждения, как и грибные патогены, нематоды, а также внедряться через раскрытые в условиях высокой влажности почвы чечевички. Факторами, которые благоприятствуют заражению клубней и дальнейшему развитию болезни в полевых условиях, являются: теплая погода с частыми дождями, применение водных гербицидов, приводящее к переуплотнению и ухудшению аэрации почвы за счет уменьшения количества междурядных обработок, большие дозы азотных удобрений. Повышенная влажность и относительно высокая температура во время хранения приводит к перезаражению клубней в хранилищах [Абеленцев, 2006]. В последние годы наблюдается усиление механизации основных процессов возделывания, бактериозов, из-за уборки, отсутствия устойчивых к механическим повреждениям и бактериозам сортов, что вызывает существенное увеличение ущерба, причиняемого картофелю бактериальными и смешанными гнилями в периоды хранения. Более заметным стало проявление бактериозов, когда началось повсеместное выращивание и размножение сортов зарубежной селекции. Бактериозы и смешанные инфекции причиняют наибольший ущерб картофелю в северо-восточных районах страны. Установлено, что на долю пораженных бактериями смешанных инфекций приходится от 70 до 100 % клубней. Содержание же бактериозов в чистом виде составляет не более 31 % от общего количества гнилей[Середа, 1996]. 8 Черная ножка – одна из самых вредоносных бактериальных болезней картофеля. Развитию данного заболевания способствует умеренная температура и повышенная влажность воздуха. Болезнь распространена практически во всех странах, где возделывается картофель [Киру, 2005]. Заболевание получило свое название из-за загнивания нижней части стебля молодых растений. Основание стебля и корневая система размягчаются и в зависимости от погодных условий сортовых особенностей принимают различную окраску (бурую, темную, желтую, темно-зеленую). Под действием собственной массы пораженные стебли растения падают, и оно погибает. В годы с малым количеством осадков и высокими температурами летнего сезона инфекция находится в скрытом состоянии, и внешние признаки поражения растений отсутствуют [Ильяшенко, 2010]. Распространяясь по сосудам стебля, фитопатогенные микроорганизмы через столоны проникают в молодые клубни, и при наступлении благоприятных условий развивается клубневая форма поражения картофеля черной ножкой, которая известна под названием мокрой (мягкой) гнили. Также, инфицирование может происходить путем проникновения микроорганизмов через поврежденную кожуру, а в условиях повышенной влажности почвы при контакте пораженного клубня со здоровым – через чечевички. Возбудителями черной ножки и сопутствующей ей мокрой гнили являются фитопатогенные бактерии рода Erwinia (Pectobacterium). Наиболее часто болезнь вызывают виды Erwinia carotovora subsp. antroseptica (van Hall 1902), Erwinia carotovora subsp. carotovora (Jones 1901), Erwinia phytophthora, Erwinia aroideae, Erwinia chrysanthemi . Основным способность свойством секретировать ферментов, которые (мацерацию) тканей упомянутых ряд внеклеточных обеспечивают растений. выше Эти ферменты является деполимеризующих неспецифическое вирулентности данных бактерий [Третьякова, 2010]. 9 бактерий являются разрушение факторами Благодаря высокой активности данных ферментов возбудитель черной ножки на ранних этапах развития болезни поражает паренхимные ткани, вызывая их загнивание. Быстрое развитие инфекционного процесса обусловлено в значительной мере закупоркой сосудов, приводящей к нарушению транспирации и передвижения пластических веществ, а также общим воздействием на растение выделяемых бактериями токсинов. Бактериальная кольцевая гниль, вызываемая Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum (Spieckermann and Kotthoff), широко распространенное заболевание картофеля, приносящее значительный экономический ущерб сельскому хозяйству и семеноводству. Возбудитель заболевания включен в список карантинных видов Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР) и в Перечень вредителей, болезней растений и сорняков, которые являются карантинными объектами для Республики Беларусь. Наличие латентной формы инфекции затрудняет диагностику болезни и способствует ее быстрому и незаметному распространению. Кольцевая гниль широко распространена в Российской Федерации, странах СНГ, Европы и Америки. Болезнь относится к числу вредоносных, потери урожая колеблются от 11 до 44 % и значительно увеличиваются при хранении картофеля. Некоторые авторы считают, что потери могут достигать 60-70 %. В ряде стран введена сертификация семенного картофеля, предполагающая отбраковку всей партии, если среди 400 проверенных клубней обнаружен хотя бы один пораженный кольцевой гнилью [Шафикова, 2010]. Латентность заболевания, отсутствие иммунных сортов и эффективных средств борьбы ставит кольцевую гниль в ряд наиболее опасных объектов, причиняющих огромный экономический ущерб сельскому хозяйству многих стран мира. Основными симптомами заболевания является увядание надземной части растения и кольцевая гниль клубней в виде поражения сосудистого 10 кольца с последующим загниванием. При проникновении бактерий через пораненную кожуру в осенний период возникает ямчатая гниль (желтая подкожная пятнистость), но обнаруживается она только в конце марта – начале апреля в виде округлых пятен кремового или светло-желтого цвета под кожурой. Мякоть клубня в местах пятен выгнивает с образованием ямок [Калач, 2010]. Из-за нарушения поступления воды происходит угнетение роста картофеля. Листья больных растений становятся пятнистыми с признаками явного хлороза. Проявление типичных симптомов сильно зависит от условий среды, штамма патогена, инфекционной нагрузки и сорта картофеля. Возбудитель кольцевой высокоспециализированным, гнили по поскольку своей патогенности единственным является известным природным хозяином является картофель Solanum tuberosum [Омеличкина, 2009]. Фитопатогенная бактерия может сохраняться как на поверхности, так и внутри клубней. Развитие скрытой формы кольцевой гнили зависит в значительной степени от погодных условий в год выращивания картофеля. После засушливого периода вегетации и высоких летних температур симптомы болезни на растениях бывают незначительными, однако можно прогнозировать увеличение числа клубней со скрытой формой инфекции [Рымарева, 2008]. В связи с потеплением создается угроза проникновения и массового размножения на территории республики карантинного объекта – бурой бактериальной гнили [Иванюк, 2009]. Бурая гниль или вилт широко распространенное заболевание картофеля преимущественно в странах с теплым и влажным климатом. В последние годы этот бактериоз распространился и в северных широтах – Швеции и Дании, стали поступать сведения о наличии бурой гнили в других странах Европы (Германии, Польше, Финляндии) и в России [Лазерев, 2010]. 11 Потери урожая, вызываемые этой болезнью, непредсказуемы. Во многих странах мира фермеры отказываются выращивать картофель, табак, томаты, бананы и многие другие культуры из-за сильного поражения этим бактериозом. Из-за повсеместного распространения и высочайшей вредоносности бурой гнили в странах Центральной и Южной Америки этот бактериоз считается самой серьезной болезнью картофеля. Заболевание проявляется внезапным пожелтением и увяданием растений, которое вызвано проникновением и быстрым размножением бактерий в проводящей системе, приводящим к нарушению транспорта воды и питательных веществ, а также выделением бактериями токсинов. В случае раннего заражения клубни формируются очень мелкие или не образуются вообще, а при позднем заражении клубни выглядят визуально здоровыми, однако они часто сгнивают в период зимнего хранения, а при посадке из них развиваются слабые, быстро увядающие растения, хотя чаще всходы вообще не появляются. В настоящее время у возбудителя бурой гнили Ralstonia solanacearum (Smith,1896) выявлено 5 рас, две из которых (высокотемпературная раса 1 и низкотемпературная раса 3) способны поражать картофель. Это типичный почвенный обитатель, встречается как на окультуренных почвах, так и на целинных. Высокая влажность почвы и периоды дождливой погоды (особенно при повышенных температурах) создают благоприятные условия для его развития [Лазерев,2010]. Трудности выделения, проверки патогенности и исследования биологическихсвойств изолятов R. solanacearum, а также быстрая потеря этим микроорганизмом патогенных признаков осложняют работу фитобактериологов по изучению и выявлению этого возбудителя [Турко, 2010]. Поэтому бурая бактериальная гниль остается наименее изученной болезнью картофеля в нашей стране. Также следует отметить тот факт, что возбудители черной ножки и кольцевой гнили при соблюдении всех приемов уничтожения растительных 12 остатков картофеля не способны к длительному выживанию в почве. В отличие от них бактерии бурой гнили являются типично почвенными микроорганизмами. В связи с этим, для борьбы с R. solanacearum одинаково важны и обязательны подбор устойчивых к нему сортов и предпосадочное протравливание клубней, которое необходимо для подавления почвенной инфекции во время прорастания клубней. с е й ч а с Многие сорта картофеля обладают высокой степенью устойчивости к одной, двум и даже нескольким инфекционным заболеваниям. Такие сорта уменьшают количество фитопатогенных организмов и их агрессивность. На с устойчивых сортах снижается коэффициент размножения у вредителей, м а переносчиков инфекции, потомство их становится менее жизнеспособным. м Повышенная устойчивость позволяет уменьшить количество ой обработок пестицидами, тем самым существенно снизить загрязнение окружающей р среды и повысить эффективность защитных мероприятий. Насыщение агроценозов сортами с а з г о в а р и в а л а неспецифической и специфической устойчивостью к наиболее вредоносным фитопатогенам обеспечивает оптимальное их функционирование, исключая при этом возможность развития эпифитотий. Стабилизация, сохранение и использование имеющейся устойчивости картофеля к болезням является важнейшей задачей интегрированной защиты растений в современном с е картофелеводстве республики, поскольку, как известно, выращивание й ч устойчивых сортов – наиболее экономически эффективный и экологически а с безопасный ее элемент. Значительная высокоустойчивых распространенность сортах во многом бактериозов предопределяется с даже м а м о й на степенью механических повреждений клубней в процессе уборки и сортировки, что особенно опасно для позднеспелых сортов, кожура клубней которых ко р а з г о в а р и в а л времени уборки не всегда может быть окрепшей. Усугубляет ситуацию и возделывание картофеля на тяжелых по механическому составу почвах [Жукова, 2005]. 13 Недостаточно внимания в борьбе с болезнями картофеля уделяется индуцированной устойчивости, несмотря на то, что этому направлению в защите сельскохозяйственных культур в последние годы во всем мире уделяется огромное внимание. Основное преимущество этого метода в том, что обеспечивает системную невосприимчивость растений к комплексу вредных организмов на протяжении всей вегетации и наиболее близок к проявлению естественного иммунитета. Индукция устойчивости растений к патогенам осуществляется путем предварительной обработки семян или вегетирующих растений биологически активными веществами, обладающими свойствами стимуляторов иммунной системы. Эти вещества усиливают в растениях реакции защиты от патогенов так, что при последующем восприимчивый сорт реагирует на инфекцию как относительно устойчивый. Для картофелеводства наибольший интерес представляют препараты на основе арахидоновой кислоты, хитиназ и др., способные вызвать в обработанном растении синтез антипатогенных фитоантибиотиков – фитоалексинов. В настоящее время большое внимание уделяется препарату хитозану, источником получения которого является хитин. Хитин защищает растения от болезней посредством изменения обмена веществ в сторону, неблагоприятную для патогенов, однако в определенных условиях он проявляет противомикробную активность. Препарат существенно повышает устойчивость к бактериозам [Ильяшенко, 2010]. В то же время ведется изучение реакции сверхчувствительности (СЧ), которая развивается у некоторых растений в ответ на внедрение фитопатогенных бактерий. Например, такая реакция развивается при инокуляции растений табака суспензией вирулентных штаммов Cms и проявляется локальным некрозом тканей, не приводящим к возникновению заболевания [Бутенко, 2003]. В настоящее время реакцию СЧ связывают с развитием устойчивости всего растительного организма к последующему заражению фитопатогенами. Эта неспецифичная к патогену защита всего организма называется системной приобретенной устойчивостью. Такой 14 иммунитет, обусловленный экспрессией антимикробных белков, обеспечивает долговременную (недели, месяцы) защиту всего организма (системную защиту) от широкого спектра патогенов, включая вирулентные формы. Развитие СЧ у растений, а также вирулентность у бактерий определяют hrp-гены, кодирующие белки системы секреции III, а также эффекторные и регуляторные белки, контролирующие экспрессию этих генов. Бактерии с мутациями hrp-генов не способны вызывать заболевание у растений-хозяев, а также реакцию СЧ у других растений [Шафикова, 2010]. Таким образом, дальнейшее изучение механизмов реакции СЧ будет способствовать как пониманию механизмов защиты растений от патогенов, так и пониманию механизмов бактериальной патогенности. 1.1.2 Грибные фитопатогены Фитопатогенные грибы — возбудители инфекционных болезней растений, которые способны наносить огромный ущерб урожаю экономически важных сельскохозяйственных культур. В настоящее время известно более 10000 видов грибов, вызывающих различные болезней у растений [Pérez-García et al., 2011]. Потери урожая важных культур, таких как, рис, пшеница, кукуруза, соевые бобы и картофель от действия фитопатогенных грибов могут достигать до 125 млн. тонн ежегодно [Fisher et al., 2012]. За последние агроклиматических хозяйств, годы в Республике Татарстан условий и ухудшение экономического привело к массовому распространению с изменением состояния фитопатогенных микромицетов - возбудителей корневых гнилей сельскохозяйственных культур. В частности, возросла численность и разнообразие грибов р. Fusarium. В настоящее время к р. Fusarium относится несколько сотен видов грибов, многие из которых сельскохозяйственных растений являются патогенами самых разных [Du et al., 2012]. Фузариозы, которые проявляются в виде фузариозного увядания растений и сухой гнили клубней, 15 представляют особую опасность для картофеля, вызывая потери урожая до 25% [Wharton et al., 2007]. Сухая фузариозная гниль - заболевание, распространенное повсеместно, в местах выращивания картофеля. Ущерб от этого заболевания ежегодно наблюдается во всех областях. Вредоносность сухой гнили не исчерпывается лишь отходом гнили при хранении, который составляет около 7-11%, а в условиях повышенной температуры и влажности может достигать до 30-50%. Основной причиной широкого распространения данного заболевания являются посадочные клубни, изначально пораженные фузариозной гнилью и высаженные в почву. Часть зараженных клубней не прорастает вообще, что приводит к изреженности всходов, а при посадке здоровой частью от сильнопораженного клубня, также наблюдается выпад растений, достигающий 12%. Вследствие этого, можно наблюдать недобор урожая в большом количестве [Быкова, 1995]. Больные клубни являются причиной замедленного роста и развития растений в период вегетации, преждевременного их увядания, что в свою очередь приводит к уменьшению урожая. Потомство от больных клубней внешне может выглядеть здоровым, но в период хранения дает большой процент клубней, пораженных сухой гнилью. Первыми признаками поражения клубня сухой гнилью является появление серовато-буроватого тусклого пятна, слегка вдавленного вовнутрь и сопровождающегося легким сморщиванием покровных тканей клубня. Мякоть под пятном становится рыхлой, сухой и становится окрашенной в бурый цвет. Далее в пораженной ткани образуются пустоты, заполненные белым, желтым или красноватым пушистым мицелием гриба. При повышенной влажности воздуха в хранилищах, также может иметь водянистую консистенцию, при этом оставаясь рыхлой. В этом случае при разрезании выделяется жидкость. Разложения тканей, как при бактериальной гнили, не происходит[Турко и др., 2008] 16 Мицелий грибов, разрастаясь в полостях пораженной ткани, проникает через покровные ткани клубня наружу и образует на его поверхности подушечки спороношения серовато-белого, розового, желтого цвета. При соскабливании они в большинстве случаев имеют у основания синеватый цвет. Гриб быстро распространяется в тканях клубней и разрушает их. Пораженная ткань становится почти черной, а клубень - легким, в сухих условиях хранения превращающийся в мумию, покрытую сморщенной кожурой и настолько твердую что с трудом разрезается ножом. Сухую гниль вызывают почвенные грибы из рода Fusarium sp., относящегося к классу несовершенных грибов семейства Tuberculariaceae. Они являются факультативными паразитами. Узко выраженная специализация в отношении отдельных видов растений у грибов этого рода отсутствует. Также еще одним опасным заболеванием для картофеля является альтернариоз. Альтернариоз - заболевание, вызываемое несовершенными грибами Alternaria solani (Ell. et Mart.) J. et G. (синоним Macrosporium solani (Ell. et Mart.) и Alternaria alternatа Keissler (син. Alternaria solani Sor.) [Иванюк, 2005] Болезнь распространена во всех картофелеводческих странах мира. Случаи заболевания альтернариозом обнаруживаются ежегодно, но особенно сильно в годы с тёплым летом при выпадении частых кратковременных дождей или обильных ночных росах. Поражение катрофеля в годы эпифитотий может достигать 70%. Урожай клубней снижается на 20-40% изза отмирания листьев в период клубнеобразования [Абеленцев, 2006]. Альтернариоз в полевых условиях развивается отдельными очагами, которые могут постепенно распространяться на всё поле. Наиболее интенсивно болезнь проявляется в центре очага, преждевременно вызывая полное отмирание ботвы. Очаги диаметром 10-15 м хорошо выделяются 17 своей коричневой окраской на фоне зелёной ботвы. Урожай клубней в очагах снижается более чем на 60%. Болезнь на картофеле чаще всего появляется в конце первой – начале второй декады июня на листьях нижнего и среднего возрастов. Позже заболевание распространяется на черешки и стебли. Альтернариоз проявляется в двух формах в зависимости от возбудителя болезни. Поражение листьев, вызванное грибом A. solani начинается с появления мелких, хлоротичных пятен, которые постепенно темнеют и приобретают коричневую окраску с сероватым оттенком. Пятна диаметром 10-35 мм, угловато-округлые, резко ограниченны от здоровых тканей. На верхней стороне листа хорошо видна концентричность почти незаметная на нижней. Пятна расположены преимущественно в центре листовых пластинок, но могут встречаться и по краям. Поражённые ткани хрупкие и легко ломаются. При сильном развитии болезни листья полностью отсыхают. На нижней стороне листьев может образовываться слабый налёт спороношения, обнаруживающийся через 3-4 недели после появления первых признаков заболевания. На стеблях и черешках альтернариоз проявляется в виде штрихов, которые, соединяясь, образуют сплошные пятна, вытянутые в длину на 3-5 см, слегка погружённые в ткани стебля, с редкими концентрическими кругами. В природных условиях нашей республики в последние два года наблюдается заражение клубней картофеля A. Solani . A. alternatа поражает листья, черешки, стебли и очень редко клубни. При проникновении гриба в ткани первые хлоротичные пятна проявляются в виде мелких точек по краям листа между жилками. Позже они становятся округлыми или угловатыми, приобретают тёмно-бурую окраску, без концентричности. При наличии благоприятных условий для развития альтернариоза пятна сливаются, покрывая весь лист. Ботва полностью отмирает. В сухую погоду края поражённых листьев загибаются кверху в виде лодочки, а иногда закручиваются в трубку. Ткани хрупкие, легко ломаются, края листьев становятся бахромчатыми. При заражении центра 18 листа пятна вытягиваются по направлению к краям. Спороношение гриба формируется на 4-5-й день после появления симптомов в виде хорошо видимого оливкового налёта. На черешках и стеблях заболевание развивается в виде штрихов, которые, сливаясь, образуют сплошные тёмно-коричневые пятна без видимой концентричности [Иванюк, 2010] В благоприятные для болезни годы, этот возбудитель заболевания наиболее опасен, так как может поражать нижнюю часть стеблей (стеблевой рак) и такие растения картофеля легко ломаются во время уходов за посадками. На клубнях очень редко наблюдаются небольшие поверхностные пятна чёрного цвета. A. аlternatа обнаруживается только на повреждённых клубнях. Болезнь проявляется в виде небольших, несколько погруженных, с хорошо заметным бархатистым налётом спороношения гриба пятен. Заражённые ткани коричневые, сухие, легко отслаиваются от здоровых в виде сплошной ленты, толщиной 3-4 мм. Основным источником первичной инфекции являются поражённые растительные остатки, зимующие в поле, а также почва, в которой гриб может сохранять жизнеспособность до 3-х лет. Источником вторичных инфекций служат конидии патогена, формирующиеся на заражённых тканях в течение всей вегетации картофеля. 1.1.3 Актиномицеты как агенты биоконтроля фитопатогенов растений Применение биопрепаратов и физиологически активных веществ в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами представляется весьма перспективным направлением, которое открывает новые возможности в защите культуры от инфекций, для получения экологически безопасной продукции, а также сохранения баланса в агробиоценозах. Впервые о возможности применения актиномицетов и продуцируемых ими антибиотиков в растениеводстве было заявлено рядом ученых на конференции в г. Ереване в 1958 году. Принципы использования антагонистически активных микроорганизмов были разработаны Н. А. Красильниковым [Красильников, 1961]. 19 В настоящее время среди актиномицетов выделены штаммы, антагонистически активные в отношении возбудителей различных болезней. Так, в Турции для биологической борьбы с некоторыми видами почвенных патогенов рекомендована раса С/2-9 актиномицета Streptomyces ochraceiscieroticus, ею обрабатывают семена, рассаду, почву в целях защиты сельскохозяйственных культур [Абеленцев, 2006]. В Великобритании S. griseus, встречающийся на соломенных тюках и других субстратах с соломой, на которых выращивали огурцы в теплицах, также подавлял корневые гнили [Бондаренко, 1989]. Существуют штаммы актиномицетов, антагонистически активные в отношении фузариоза. Исследованиями М. М. Кулдыбаева, Г. Ш. Сейкетова получен спиртовой концентрат антибиотика актиномицета штамма 23/791 с активностью 19000-65000 ед/мл по отношению к F. oxysporum и F. solani [Кулдыбаев, 1974]. Имеются штаммы актиномицетов-антагонистов бактериоза томатов, вертициллезного увядания хлопчатника, антракноза цитрусовых, папайи и сахарного тростника, мучнистой росы огурцов [Tanvonen, 1982]. Большинство исследователей свидетельствует, что высокой антагонистической активностью обладают преимущественно представители рода Streptomyces. Доказана высокая эффективность использования метаболитов актиномицетов в качестве ингибиторов роста патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания сельскохозяйственных растений [Тулемисова, 1983]. Актиномицеты в процессе своей жизнедеятельности, помимо антибиотиков, способны синтезировать витамины, аминокислоты, ауксины, которые также применяются в растениеводстве для повышения урожайности и стимулирования прорастания семян [Красильников, 1986]. Одна из характерных особенностей актиномицетов - большая изменчивость. При наблюдении в микроскопе культур актиномицетов можно легко обнаружить разнообразие морфологии клеток. Одни клетки имеют однородную плазму, другие - зернистую, вакуолистую. Гифы мицелия в 20 отдельных участках могут выглядеть раздутыми и не окрашиваются основными красками. В других участках гифы могут покрываться почкообразными выростами. Величина отдельных клеток может также сильно варьировать. Можно сказать, что в культурах нет совершенно одинаковых двух-трех клеток. Такое явление называется полиморфизм, или возрастной изменчивостью организма. Благодаря разнообразию своих клеток актиномицеты имеют большую возможность приспособиться к различным условиям среды. Кроме того, они неразборчивы в выборе пищи. Благодаря таким свойствам они широко распространены в природе, могут легко выращиваться в лабораторных условиях. Большинство актиномицетов растет и развивается при температуре в пределах от плюс 25 до плюс 30ºС (мезофиллы). Встречаются термофильные организмы с температурным оптимумом роста от плюс 45 до плюс 60ºС. Термотолерантные актиномицеты выдерживают нагревание до плюс 60 и плюс 70ºС в течении часа. Наблюдается повышенная устойчивость к нагреванию у спор мезофильных актиномицетов. Оптимальная среда для нормального роста лучистых грибков нейтральная или слабо щелочная (рН 77,2). Актиномицеты хорошо переносят высушивание. Так, некоторые культуры актиномицетов после девятилетнего пребывания в сухом виде, в лабораторных условиях не потеряли своей жизнеспособности. Лучистые грибки могут развиваться при низкой влажности субстрата. Показано, что оптимальной влажностью для актиномицетов является 60% от ПВ. При 23-30% - преобладают над прочими микроорганизмами, а при 8-10% остаются единственными растущими представителями почвенной микрофлоры [Красильников, 1986]. Следует добавить, что актиномицеты по количественному составу и разнообразию продуцируемых антибиотиков занимают первое место среди 21 микроорганизмов. Они являются, очевидно, самой экологически пластичной и эволюционно продвинутой группой микроорганизмов. Таким образом, можно сказать, что благодаря своим особенностям актиномицеты могут успешно конкурировать с фитопатогенными микроорганизмами в почве. В некоторых почвах можно обнаружить сравнительно небольшое количество актиномицетов, но почти все они оказываются антагонистами. В литературе представлено немало данных об активном изучении возможности использования в защите растений синергического действия бактериальных культур для ростостимуляции растений и биоконтроля фитопатогенов. Ряд авторов изучали и продемонстрировали успешные сочетания соединений нескольких бактериальных штаммов [Duffy, 1996]. В проведенных исследованиях показано, что наиболее эффективно развитие заболеваний контролирует смесь, включающая большинство бактериальных видов, обитающих в ризосфере растения-хозяина. Однако, производство препарата, содержащего в себе большое количество бактериальных видов коммерчески не выгодно (подбор среды и оптимальных условий для каждого вида бактерий, стабилизация готового аппарата и т. д.), поэтому авторы данных работ приходят к выводу о том, что наиболее оптимальным является поиск и внедрение двухкомпонентных биофунгицидов [Schisler, 1997]. 22 ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследования Для выделения возбудителей бактериальных инфекций использовали клубни растений картофеля сортов «Удача», «Невский», собранных с опытных полей ТатНИИСХ (Лаишевский район Республики Татарстан), пораженные микозно - бактериальными гнилями, урожая 2013года, а также из частных хозяйств. В качестве известных бактериальных фитопатогенов использованы штаммы Pectobacterium atrosepticum SCR I 1043, Xantamonas campestris B5 46, любезно предоставленные лабораторией молекулярной биологии КИББ КНЦ РАН. В качестве грибных фитопатогенов использованы штаммы микромицетов из коллекции кафедры микробиологии КФУ: Alternaria tenuissima, Fusarium solani isolate TVD_Fungal-Culture126, Fusarium tricinctum strain Z5, Fusarium oxysporum strain CEF-06, Fusarium avenaceum strain. Морфологию фитопатогенных микромицетов, исследовали методом «раздавленная» капля. Грампринадлежность и морфологию бактерий исследовали, окрашивая препараты по методу Грама [Burillo et all.,2014]. 2.2 Питательные среды и условия культивирования Для культивирования и хранения бактерий использовали универсальную питательную среду МПА и среду Лоурия-Бертони (LB) следующего состава (г/л дистиллированной воды): триптон – 1.0, дрожжевой экстракт – 0.5, NaCl – 0.5, pH = 8.5 [Sambrook et al., 1989]. Для культивирования микромицетов использовали среду Чапека следующего состава (г/л дистиллированной воды): NaNO3 – 2.0 г, K2HPO4 – 1.0 г, MgSO4 × 7H2O – 0.5 г, KaCl – 0.5 г, FeSO4–0.01 г, сахароза – 30.0 г, агарагар (2%) – 20.0 г, pH = 7.2-7.4 [Гаузе с соавт., 1983]. 23 Для культивирования актиномицетов использовали среду Гаузе следующего состава (г/л дистиллированной воды): K2HPO4 –0.5 г, MgSO4 × 7H2O –0.5 г, KNO3 – 1.0 г, NaCl–0.5 г, FeSO4–0.01 г, крахмал–20.0 г, агарагар–20.0 г. 2.3. Выделение возбудителей бактериальных инфекций из клубней картофеля. Для выделения бактерий кусочки клубня, предварительно обработанные спиртом, раскладывали на среде МПА с помощью стерильного скальпеля и культивировали в течение 24 часов, при температуре 37°С. Отбирали колонии бактерий, выросшие вблизи клубней. Колонии бактерий рассеивали многократно истощающим штрихом для получения чистой культуры. Чистоту культуры контролировали микроскопированием. 2.4.Идентификация бактерий на MALDI BioТyper (Bruker Daltonik). Чистую 18-часовую культуру, выращенную при 37°С идентифицировали на MALDI BioТyper (Bruker Daltonik). Исследование с помощью MALDI BioTyper осуществляется на основе сравнения полученного ряда константных белков исследуемой культуры с базой данных. Видовая принадлежность определяется при значениях Score 2.300 ... 3.000 2.5. Проверка фитопатогенных свойств. Для проверки фитопатогенных свойств выделенных микроорганизмов и музейных штаммов бактерий и микромицетов были проведены эксперемнты по следующей схеме. В стерильные чашки Петри с фильтровальной бумагой, предварительно смоченной стерильной водопроводной водой для создания влажных условий раскладывались в стерильных условиях кружочки из картофеля. Далее стерильной иглой с патогенными микроорганизмами делали укол и оставляли в термостате при 28 24 на двое суток. 2.6. Выделение актиномицетов из почвы Для выделения актиномицетов был использован метод скученного высева на твердую питательную среду из суспензии почвы. Для приготовления суспензии использовали 1г почвы, стерильную дистиллированную воду в пробирках. Далее делали посев суспензии на среду Гаузе. Чашки инкубировали 7 суток при 28-30 Отбирали колонии с признаками антагонистической активности (наличие зоны задержки роста микроорганизмов вокруг колонии акиномицета) Для получения чистой культуры выделенных изолятов был произведен пересев микроорганизмов несколько раз на среду Гаузе. Чистоту культуры контролировали микроскопированием. 2.7. Исследование антагонистической активности актиномицетов в отношении грибных фитопатогенов методом агаровых блоков. На поверхность среды Чапека в чашки Петри засевали микромицеты методом укола. Чашки помещали в термостат при температуре 28° С на 5-7 суток. Актиномицеты-антагонисты также засевали газоном на поверхность среды Гаузе. Посевы инкубировали в течение 9 суток, при температуре 28 °С. Стерильным пробочным сверлом вырезали блоки микромицетов и помещали их в центр чашки Петри на среду Чапека. На расстоянии 2-2.5 см от блока с микромицетом размещали 3- 4 блока с актиномицетов. Культуры инкубировали при 28°С в течение 3-10 суток. Антагонистическую активность оценивали по диаметру зоны подавления роста микромицетов. 2.8. Исследование антагонистической активности актиномицетов в отношении бактериальных фитопатогенов методом агаровых блоков Исследуемые штаммы бактерий засевали газоном на поверхность среды МПА и культивировали при температуре 37°С в течение 24 часов. Тест – культуры актиномицетов, засеянные на среду Гаузе газоном, выращивались при 28 в течении 9 суток. Стерильным пробочным сверлом вырезали блоки агара с выросшей культурой и помещали на поверхность чашек Петри со 25 средой МПА, засеянной тест-культурой бактерий методом газона. Посевы инкубировали в течение нескольких суток и оценивали антагонистическую активность по величине зоны подавления роста тест-культуры вокруг блока с актиномицетом. 2.9. Идентификация выделенных актиномицетов с антагонистической активностью. Определение выделенного активного изолята актиномицета антогониста производили по морфологическим и биохимическим свойствам по определителю актиномицетов Г. Ф. Гаузе [Гаузе с соавт., 1983]. 26 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Выделение и идентификация возбудителей бактериальных инфекций из клубней картофеля. Из клубней картофеля, пораженных бактериальными гнилями, были выделены в чистую культуру 5 изолятов бактерий. Результаты идентификации изолятов представлены в таблице 1. Таблица 1 – Идентефикация бактерий на MALDI Bio Typer (Bruker Daltonik) Analyte Name Organism Score value ++ Lysinibacillus sphaericus 2.082 +++ Serratia liquefaciens 2.354 ++ Pectobacterium cartovorum 2.039 ++ Xantomonas campestris 2.081 Таким образом в бактериальных гнилях исследованных клубней картофеля присутствовали следующие виды бактерий: Lysinibacillus sphaericus, Serratia liquefaciens, Pectobacterium cartovorum, Xantomonas campestris. Для дальнейшей работы нами был выбран возбудитель одной из опасных заболеваний картофеля – черная ножка, - Pectobacterium cartovorum. Черная ножка – одна из самых вредоносных бактериальных болезней картофеля. Развитию данного заболевания способствует умеренная температура и повышенная влажность воздуха. Болезнь распространена практически во всех странах, где возделывается картофель [Киру, 2005]. Из литературы известно, что в годы с малым количеством осадков и высокими температурами летнего сезона инфекция может находиться в скрытом состоянии, и внешние признаки поражения растений отсутствуют [Ильяшенко, 2010]. Следует отметить что штамм Pectobacterium cartovorum был выделен из клубней картофеля, выращенный в частном хозяйстве. Данный факт можно объяснить тем, что в более крупных государственных 27 хозяйствах ведется постоянный контроль за распространением заболеваний и используется качественный посевной материал. Для подтверждения чистоты культуры штаммов бактерий была произведена окраска по Грамму. (рисунок1) Рисунок – 1 Морфология штаммов бактерий, возбудителей заболеваний картофеля. А) – Pectobacterium cartovorum,Б) – Xantomonas campestris, В) – Pectobacterium atrosepticum . 3.2 Проверка фитопатогенных свойств штаммов бактерий и микромицетов. Рисунок – 2 Заражение бактериальными фитопатогенами. А) – Xantomonas campestris, Б) – Pectobacterium atrosepticum, В) – Pectobacterium cartovorum. 28 Рисунок – 3 Заражение картофеля микромицетами. А) – Fusarium oxysporum, Б) – Alternaria tenuissima, В) – Fusarium solani, Г) – Fusarium avenaceum, Д) – Fusarium tricinctum. На рисунках 2 и 3 представлены результаты оценки фитопатогенных свойств штаммов бактерий и микромицетов, использованных в нашей работе. После заражения инфекционным материалом здоровых клубней и последующей инкубацией, мы наблюдали характерную картину развития заболевания карофеля, характерную для бактериальных и грибных инфекций. 3.3 . Выделение актиномицетов из почвы Известно, что стрептомицеты производят более половины из 10000 известных биологически активных соединений, что и объясняет пристальное внимание к этим бактериям в последние десятилетия [Anderson, Wellington, 2001; Clardy et al. 2006; Firáková et al., 2007 Costa et al., 2013 ]. В связи с этим, представлял большой интерес скрининг антагонистов бактериальных и грибных фитопатогенов среди микроорганизмов этой группы. Для экспериментов нами была использована почва из опытных полей ТатНИИСХ РТ, где происходи высадка культуры картофеля. После высева почвенной суспензии на твердую питательную среду Гаузе, нами были отобраны колонии с признаками антагонистической активности. 29 Всего нами было выделено 13 изолятов актиномицетов, которые далее были проверены на наличие антагонистических свойств по отношению к грибным и бактериальным фитопатогенам, поражающие картофель. 3.4. Антагонистическая активность актиномицетов в отношении грибных фитопатогенов методом агаровых блоков Сухую гниль вызывают почвенные грибы из рода Fusarium sp. Данное заболевание, распространенно повсеместно, в местах выращивания картофеля. Ущерб от этого заболевания ежегодно наблюдается во всех областях. По наблюдению специалистов, после засухи 2010 года в Республикие Татарстан отмечается сильное распространение фузариозных гнилей картофеля. Данный факт объясняется устойчивостью грибов рода Fusarium к более высоким температурам по сравнению с другими почвенными микроорганизмами. А впоследние 2 года также наблюдается распространение альтернариозов картофеля. Создание биопрепаратов на основе активных антагонистов в отношении данных видов фитопатогенных микромицетов является особенно актуальным в условиях Республики Татарстан. Все 13 выделенных нами изолятов актиномицетов были исследованы на наличие анагонистических свойств в отношении следующих грибных патогенов картофеля Alternaria tenuissima, Fusarium solani isolate TVD_Fungal-Culture126, Fusarium tricinctum strain Z5, Fusarium oxysporum strain CEF-06, Fusarium avenaceum strain Таблица 2 – Исследование фунгицидной активности актиномицетов методом блоков в отношении выделенных микромицетов. Название микромицета Зона подавления роста, мм Alternaria tenuissima 4 Fusarium solani 8 Fusarium tricinctum 5 Fusarium oxysporum 6 30 Fusarium avenaceum 5 Рисунок – 4 Антагонистическая активность актиномицета по отношению к микромицетам. А) – Alternaria tenuissima, Б) – Fusarium solani, В) – Fusarium tricinctum, Г) – Fusarium oxysporum, Д) – Fusarium avenaceum. Из результатов, представленных на рисунке 4, видно, что антагонистической активностью обладает только изолят №1. Данный изолят эффективно подавлял рост всех тестерных микромицетов. Зона подавления роста варьировала от 4, до 8 мм для разных видов грибов. Самая высокая антагонистическая активность изолята №1 показана в отношении штамма Fusarium solani isolate TVD_FungalCulture126, зона подавлен составляет, 8 мм. Для штамма Alternaria tenuissima активность изолята №1 выражена в размере 4 мм. 3.5. Антагонистическая активность актиномицетов в отношении бактериальных фитопатогенов методом агаровых блоков Известно, что по оценкам специалистов, потерей урожая картофеля от различных видов бактериальных гнилей могут достигать до 50% ежегодно [Иванюк, 2010]. Бактерии рода Pectobacterium, Xantamonas являются возбудителями распространенных заболеваний сельскохозяйственных культур. В нашей работе для проверки антагонистической активности актиномицетов были выбраны штаммы бактерий Pectobacterium atrosepticum SCR I 1043, Xantamonas campestris B5 46 и Pectobacterium cartovorum, выделенный нами из клубня картофеля пораженных бактериальной гнилью. 31 Как и в случае грибных фитопатогенов активным в подавлении роста фитопатогенных бактерий, оказался изолят №1. Зона подавления роста варьировала от 13 до 14мм, для разных штаммов. Таблица 3 - Исследование антибактериальной активности актиномицетов методом блоков в отношении выделенных бактериальных фитопатогенов. Название бактериального патогенна Зона подавления роста, мм Pectobacterium atrosepticum 14 Xantamonas campestris 14 Pectobacterium cartovorum 13 Рисунок – 5 Антагонистическая активность актиномицета по отношению к бактериальным фитопатогенам. А) – Xantomonas campestris, Б) – Pectobacterium atrosepticum, В) –Pectobacterium cartovorum. Следует отметить, что изолят №1 был более эффективен в отношении Pectobacterium atrosepticum SCR I 1043. Зона подавления его роста составила 14 мм. Таким образом, из 13 исследованных изолятов, изолят №1 показывает антагонистическую активность в отношении как бактериальных, так и грибных фитопатогенов. Данный факт свидетельствует о том, что антагонистическое действие изолята №1 обусловленно неспецифическим 32 фактором фактор, оказывает ответственный неспецифическое за антагонистическую воздействие на активность фитопатогенные микроорганизмы. 3.6 Идентификация выделенных актиномицетов с антагонистической активностью. Идентификацию изолята №1, проявившего антагонистические свойства, проводили по характеристике морфологических, культуральных, биохимических свойств. По морфологическим признакам данный изолят был отнесен к роду Streptomyces. Выделенный изолят образовывал белый воздушный мицелий при росте на среде Гаузе, что позволяет его отнести к секции Albus. Далее мы исследовали рост данного изолята на овсяном агаре, органическом агаре 2. Было установлено, что на органическом агаре №2 изолят не образует меланоидный пигмент. На овсяном агаре пигмент не образует. Для более точной идентификации выделенного изолята в дальнейшем предполагается. Нами был выделен активный изолят актиномицета, антагонистические свойства которого позволяют рассматривать его как перспективный агент биоконтроля микробных фитопатогенов картофеля. Для создания на его основе биопрепарата, необходима полная идентификация микроорганизма с использованием молекулярно-генетических методов и дальнейшее изучение физиолого-биохимических свойств, для понимания механизмов антагонизма. Известно, что стрептомицеты производят более половины из 10000 известных биологически активных соединений, что и объясняет пристальное внимание к этим бактериям в последние десятилетия [Anderson, Wellington, 2001; Clardy et al. 2006; Firáková et al., 2007]. Многие ризосферные бактерии проявляют выраженные антагонистические свойства в отношении фитопатогенов. В настоящее время появляется много работ посвященных скринингу стрептомицетов из ризосферы различных растений с целью выделения штаммов, обладающих способностью к синтезу метаболитов с 33 антимикробной активностью. Так был выделен штамм Streptomyces rochei ACTA1551, проявляющий активность в отношении возбудителя фузариоза томатов и рассматривается возможность использования этих стрептомицетов в качестве биоконтроля за данным патогеном [Kanini et.al., 2013]. Из растений кукурузы были выделены штаммы стрептомицетов, которые ингибировали рост фитопатогенных грибов Pythium aphanidermatum, вызывающих заболевания огурцов [Costa et al., 2013]. Показано, что штаммы Streptomyces halstedii, S. griseus и S. cavourensis SY224 проявляют очень высокую противофунгицидную активность, которая связана в значительной степени с синтезом противогрибковых хитиназ и это также делает их перспективными для использования в качестве агентов для биологической защиты культур. 34 ВЫВОДЫ 1) Из клубней картофеля, пораженных бактериальной гнилью, выделено 5 изолятов бактерий. 2) Из пяти выделенных изолятов по морфологическим признакам и данным MALDI TOF масс-спектроскопии был идентифицирован возбудитель заболевания черная ножка картофеля – Pectobacterium cartovorum. 3) Все штаммы бактерий и микромицетов (использованные в работе) обладают фитопатогенными свойствами в отношении растений картофеля. 4) Из почвы опытных полей ТатНИИСХ выделено 13 изолятов актинобактерий с признаками антагонистической активности. 5) Из 13 выделенных изолятов акитнобактерий изолят №1 обладал выраженным антагонистичеким действием в отношении фитопатогенных микромицетов – Alternaria tenuissima, Fusarium solani isolate TVD_FungalCulture126, Fusarium tricinctum strain Z5, Fusarium oxysporum strain CEF-06, Fusarium avenaceum strain. 6) Изолят№1 актинобактерий эффективно ингибировал рост фитопатогенных бактерий-названия 7) Активный изолят №1 актинобактерий по морфологическим и культуральным свойствам идентифицирован Streptomyces, секция Albus. 35 как представитель рода СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1) Иванюк В.Г., Журомский Г.К. Фитосанитарное состояние картофеля в Беларуси и пути его улучшения [Текст] / В.Г. Иванюк // Картофелеводство. – Минск, 2007. – Т.12. – С. 389-403. 2) Середа, Г.М. Вредоносность бактериальных болезней картофеля во время вегетации и хранения [Текст] / Г.М. Середа // Экологоэкономические основы усовершенствования интегрированных систем защиты растений от вредителей, болезней и сорняков: тез. докл.научн.-произв. конфер., Минск – Прилуки, 1996. Минск, 1996. – Ч.2. – С. 122. 3) Киру С.Д., Лазарев А.М. Источники устойчивости к Erwinia carotovora (Van Hall) среди образцов культурных и диких видов картофеля из коллекции ВИР [Текст] / С.Д. Киру // Фитосанитарное оздоровление экосистем: материалы второго Всероссийского съезда по защите растений, С.-Петербург, 5-10 декабря 2005 г. // ВИЗР. – С.Пб., 2005. – Т.1. - С. 466-468. 4) Малиновская, Л.В. Создание исходных форм картофеля, устойчивых к бактериальным болезням [Текст] / Л.В. Малиновская // Картофелеводство. – Минск, 2000. – Т.10. – С. 81-85. 5) Ильяшенко, Д.А. Методические указания по оценке картофеля на устойчивость к клубневым гнилям [Текст] / Д.А. Ильяшенко // РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству. – Самохваловичи, 2010. – 52 с. 6) Третьякова О.М., Евтушенков А.Н. Пектолитическая и мацерирующая активность штаммов Pectobacterium carotovorum, Pectobacterium antrosepticum и Dickeya Dadantii на тканях клубней картофеля [Текст] / О.М. Третьякова // Картофелеводство. – Минск, 2010. – Т.18. – С. 186-190. 7) Шафикова Т.Н., Омеличкина Ю.В., Солдатенко А.С., Алексеенко А.Л., Еникеев А.Г. Развитие локального и системного защитного 36 ответа у растений и культуры клеток табака на заражение Clabacter michiganensis subsp. Sepedonicus [Текст] / Т.Н. Шафикова // Картофелеводство. – Минск, 2010. – Т.18. – С. 191-198. 8) Калач В.И. Методические указания по локализации и ликвидации бактериальной кольцевой гнили картофеля Clabacter michiganensis subsp. Sepedonicum (Spieckermann and Kotthoff) Davis et al. [Текст] /Калач В. И. // РУП «Научно - практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству. – Самохваловичи, 2010. – 14с. 9) Омеличкина Ю.В., Шафикова Т.Н., Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Еникеев А.Г. Развитие реакций у растения табака при заражении возбудителем кольцевой гнили картофеля [Текст] / Ю.В. Омеличкина // Картофелеводство. – Минск, 2009. – Т.16. – С. 246-252. 10) Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г., Перфильева А.И., Копытчук В.Н., Варакина Н.Н. Влияние монойодацетата и теплового шока на выживаемость возбудителя кольцевой гнили картофеля [Текст] / Е.В. Рымарева // Картофелеводство. – Минск, 2008. – Т.14. – С. 430-439. 11) Иванюк, В.Г. Прогноз фитосанитарного состояния картофеля вусловиях потепления климата [Текст] / В.Г. Иванюк // Весцi Нацыянальнай акадэмii навук Беларусi. – Минск, 2009. - №1. – С. 5661. 12. Диагностика бактериальной бурой гнили картофеля и меры борьбы с ней / Методические указания // ВНИИ фитопатологии РАСХН. – Москва, 1994. – 39 c. 12) Лазарев А.М., Борисова Т.П. Бактериальные болезни картофеля: диагностика и меры борьбы [Текст] / А.М. Лазарев // Сельскохозяйственные вести. – С.- Петербург, 2010. - №4. – С. 48-50. 13) Завриев С.К., Рязанцев Д.Ю., Кошкина Т.Е., Абрамов Д.Д. Эффективный и экономичный метод чувствительной диагностики и идентификации патогенов картофеля [Текст] // Картофелеводство 37 России: актуальные проблемы науки и практики. М.: ФГНУ: «Росинформагротех», 2007. С. 100– 103. 14) Ерчик, В.М. Диагностика возбудителя кольцевой гнили картофеля методом непрямой иммунофлуоресценции [Текст] / В.М. Ерчик // Актуальные проблемы изучения фито- и микобиоты: сб. статей междун. научн.- практ. конфер., Минск, 25-27 октября 2004 г. БГУ. – Минск, 2004. – С. 142-143. 15) Иванюк, В.Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков [Текст] / В.Г. Иванюк, С.А. Банадысев, Г.К. Журомский.– Минск:Белпринт, 2005.– 696 с. 16) Ильяшенко Д.А., Иванюк В.Г., Калач В.И. Защита картофеля от клубневых гнилей [Текст] / Д.А. Ильяшенко // Земляробства i ахова раслiн. – Минск, 2010. - №2. – С. 60-63. 17) Анисимов, Б. В. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков [Текст] / Б. В.Анисимов, Г. Л. Белов, Ю. А. Варицев, С. Н. Еланский, Г. К. Журомский, С. К. Завриев, В. Н. Зейрук, В. Г. Иванюк, М. А. Кузнецова, М. П. Пляхневич, К. А. Пшеченков, Е. А. Симаков, Н. П. Склярова, З. Сташевски, А. И. Усков, И. М. Яшина // Москва: Издательский дом Ивана Корытова, 2009. —272 с. - ISBN 978-5903906-02-4. 18) Атрашкова, А.В. Влияние пестицидов на микрофлору дерновоподзолистых почв Беларуси [Текст] / А.В. Атрашкова // Известия Акдемии аграных наук Республики Беларусь. - М.: Биология – 2001. №2. – С. 61-64. 19) Баснакьян, И.А. Стресс у бактерий [Текст] / И.А. Баснакьян // Вестник Российской Академии медицинских наук. - М.: Медицина.2003. – 136 с. 20) Боронин, А. М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений[Текст] / А.М. Боронин // М.:Биология. - 1998, № 3. - С. 25- 1. 38 21) Бухарин, О. В. Способ определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий [Текст] / О. В. Бухарин, А. В. Семенов, С. В. Черкасов, А. В. Сгибнев //Патент РФ № 2376381. - 2009. Бюл. № 35. 22) Быков, В. Ю. Успехи медицинской микологии[Текст] / В.Ю. Быков, Е.В. Богомолова // М.: Национальная академия микологии. - 2005. - С. 12-13. 23) Дятлова, К. Д. Микробные препараты в растениеводстве [Текст] / К. Д. Дятлова // Соросовский образовательный журнал. — 2001. — Т. 7, № 5. — С. 17–22. 24) Желдакова Р. А.Фитопатогенные микроорганизмы[Текст] / Р. А. Желдакова, В. Е. Мямин// Учеб.- метод.комплекс для студентов биол. фак. спец. «Биология». – Мн. : БГУ, 2006. – С. 19 – 35. 25) Завалин, Ф.Ф. Биопрепараты, удобрения и урожай [Текст] / Ф. Ф. Завалин // М.: Издательство ВНИИА. - 2005. - 302 с. 26) Иванюк, В. Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков [Текст] / В.Г. Иванюк, С.А. Банадысев, Г.К. Журомский // Вестник национальной академии наук Белоруссии – Минск. - 2009. - №1. – С. 56-61. 27) Ильяшенко, Д. А. Методические указания по оценке картофеля на устойчивость к клубневым гнилям [Текст] / Д.А. Ильяшенко// РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству. - , 2010. – 52 с. 28) Карамова Н.С. Мутагенное действие экстрактов растений картофеля S. tuberosum L., обработанных пестицидами[Text] / Н.С. Карамова, З.Сташевски, А.П. Денисова // Ученые записки Казанского университета. - Сер.: Естеств. Науки. – 2009. – Т. 151. кн.1. С. 155-163 29) Лазарев, А. М. Бактериальные болезни картофеля: диагностика и меры борьбы [Текст] / А.М. 39 Лазарев, Т.П. Борисова // Сельскохозяйственные вести. – С.- Петербург, - 2010. - №4. – С. 4850. 30) Макеева А.М. Болезни клубней картофеля и меры борьбы с ними в лесостепи Самарской области [Текст] / А.М. Макеева, В.Г. Каплин, Н.В. Салманов. – Самара: РИЦ СГСХА, 2012. – 3 с. 31) Маханько, В.Л. Настольная книга картофелевода [Текст] / С.А. Турко, В.А. Козлов, В.Л. Маханько, Л.Н. Козлова, И.И. Бусько, Е.В. Радкевич, Г.А. Яковлева, А.О. Бобрик / РУП «Науч.-практ. центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству». – Минск, 2012. – С. 37-40. 32) Монастырский, О. А. Современные проблемы и решения создания биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от возбудителей болезней [Текст] / О. А. Монастырский // Агро XXI. 2009. - Т.7. - С.3-5. 33) Mоргун, В. В. Ростстимулирующие ризобактерии и их практическое применение [Текст] / В. В. Моргун, С. Я. Коць, Е. В. Куценко // Физиология и биохимия культ. растений. - 2009. - Т.41. - С.187-207. 34) Попкова, К. В. Болезни картлфеля [Текст] / К.В.Попкова, Ю.И.Шнейдер, А.С.Воловик, В.А.Шмыгля // – М.: Колос. – 1980. – 304 с. – С. 13-30. 35) Семенов, А. В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий [Текст] / А. В. Семенов, А. В. Сгибнев, С.В. Черкасов, О.В. Бухарин// Бюл. эксп. биол. и мед. - 2007 – Т. 15, № 11. - С. 545–548. 36) Третьякова О. М. Экспрессия PR-генов при бактериальной инфекции [Текст] / О.М. Третьякова, А.И. Евтушенков // Труды БГУ. 2011. – Т. 6, №1. – С. 163-167. 37) Тютерев, С. индуцированной Л. Биохимические болезнеустойчивости методы и растений[Текст] Тютерев, Т.А. Евстигнеева// СПб: ВИЗР. - 2001. – 67 с. 40 сследования / С.Л. 38) Черкасов, С. В. Бактериальные механизмы колонизационной резистентности [Текст] / С. В. Черкасов, А. В. Сгибнев // Журн. микробиол. - 2006.- Т. 5, № 4. - С. 100–105. 39) Штерншис, М. В. Тенденции развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России [Текст] / М.В. Штерншис // Вестник Томского государственного университета. – М.: Биология. 2012. – 92 с. 40) Afzal, M. Endophytic bacteria: prospects and applications for the phytoremediation of organic pollutants [Text] / M. Afzal., Q. Khan. M., A.Sessitsch // Chemosphere. - 2014. - V. 11, No. 7. - P. 232 – 242. 41) Baldi, E. Mineralization dynamics of different commercial organic fertilizers from agro-industry organic waste recycling: an incubation experiment. [Text] / E. Baldi, M. Toselli // Plant Soil Environ - 2014. V.60, No. 3. – P. 93–99. 42) Berg, G. Unraveling the plant microbiome: looking back and future perspectives [Text] / G. Berg, M. Grube, M. Schloter, K. Smalla // Front Microbiol. - 2014. - V. 5, No. 148. - P. 1-7. 43) Branda, SS. Fruiting body formation by Bacillus subtilis [Text] / Branda SS, Gonzalez-Pastor JE, Ben-Yehuda S, Losick R, Kolter R. Proc Natl Acad // Sci USA. / 2001. - V.98. - P.11621–11626. 44) Cardoso, R. Mitotic crossing-over induced by two commercial herbicides in diploid strains of the fungus Aspergillus nidulans [Text] / R. Cardoso, L. Pires, T. Zucchi // Gen Mol Res. – 2010. – V. 9. – P. 231-238. 45) Chandran, P. Scope of horticultural land-use system in enhancing carbon sequestration in ferruginous soils of the semi-arid tropics[Text] / P. Chandran, S.K. Ray, S.L. Durge, P. Raja, A.M. Nimkar, T. Bhattacharyya // Curr. Sci. - 2009. – V. 97. – P. 1039-1046. 46) Charkowski, A. 2007. The soft rot Erwinia. The Plant Associated Bacteria Gnanamanickam, Samuel S Eds [Text] / A. Charkowski //. Kluwer Academic Publishers. – 2007. V.23. - P. 21–35. 41 47) Costa, F. Biological Control of Phytopathogenic Fungi by Endophytic Actinomycetes Isolated from Maize (Zea mays L.) [Text] / F. Gh.Costa, T.D. Zucchi //Brazilian archives of Biology and technology. – 2013. V.56, N6. – P. 948-955. 48) Dean, R. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [Text] / R. Dean, A. Jan, L. Van Kan, A. Zacharias, A. Di Pirtro // Molecular plant pathology. – 2012. – V.13. – P. 415 – 421. 49) Du, M. Characterization of Fusarium spp. сausing potato dry rot in China and susceptibility evaluation of Chinese potato germplasm yto the pathogen [Text] /.M. Du, X. Ren, Q. Sun, Yi.Wang, R. Zhang//Potato Research. – 2012. - V. 55. – P. 175-184. 50) Favel, D. Commercialization and implementation of biocontrol [Text] / D. Favel // Annual review of phytopathology. – 2005. Vol.43. — P.337. 51) Favret, M. Thuricin: the bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis [Text] / M.E. Favret, A.A. Yousten // J. Invertebr. Pathol. – 1989. – V.53. – P. 206-216. 52) Fermor, T. Bacteriolysis by Agaricus bisporus [Text] / T.Fermor // J.Gen. Microbiol.- 1991.- V. 130. - P. 761–769. 53) Fisher, M. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health [Text] / M. C. Fisher, D. A. Henk, Ch. J. Briggs, J. S. Brownstein, L. C. Madoff, S. L. McCraw // Gurr Nature. – 2012. – V. 484. - P. 186–194. 54) Flemming, H. Biofouling in water systems – cases, causes and countermeasures [Text] / H. C. Flemming // Appl. Microbiol. Biotechnol. − 2002. − Vol.59. – P. 629–640. 55) Gill, S. Identification, isolation and cloning of a Bacillus thuringiensis Cry-IAc toxin-binding protein from midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens [Text] / S.S Gill, L. Ray, S.L. Durge, P. Raja, A.M. Nimkar, T. Bhattacharyya // Curr. Sci. - 2009. – V. 97. – P. 39-56. 56) Gartemann, K. Lavibacter michiganensis subsp. michiganensis: first steps in the understanding of virulence of a Gram- positive phytopathogenic 42 bacterium [Text] / K.H. Gartemann, O. Kirchner, J. Engemann, I. Grefen, R. Eichenlaub, A. Burger// Journal of Biotechnology,. - 2003. - V. 106. - P. 179-191. 57) Gohlke, J. Plant responses to Agrobacterium tumefaciens and crown gall development [Text] /J. Gohlke, R. Deeken // Front Plant Sci. 2014. - V. 20. - P. 1-11. 58) Huang, T. DNA polymorphisms and biocontrol of Bacillus antagonistic to citrus bacterial canker with indication of the interference of phyllosphere biofilms [Text] / T. Huang, D. Tzeng, A. Wong, C. Chen, K. Lu, Y. Lee, , W. Huang, B. Hwang, K. Tzeng // PLoS One. - 2012. - V.7, No.7. - P.1 11. 59) Lambers, H. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: an evolutionary perspective [Text] / H. Lambers, Ch. Mougel, B. Jaillard, Ph. Hinsinger //Plant Soil. - 2009.- Vol. 321.- P. 83-115. 60) Leeman, M. Induction of systemic resistance against Fusarium wilt of radish by lipopolysaccharides of Pseudomonas fluorescens [Text] / M. Leeman, A. Van Pelt, F. Den Ouden, M. Heinsbroek, A. Bakker, B. Schippers // Phytopathology. - 1995. - V.85. - P.1021 - 1027. 61) Liu, D. Biological control of potato scab in the field with antagonistic Streptomyces scabiei [Text] / Liu D., Anderson N.A., Kinkel L.L. // Phytopathology. - 1995. - V8.5. – P.827-831. 62) Long, R. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria[Text] / R. Long, F. Azam // Appl. Environ. Microbiol. – 2001.− Vol. 67, N 11. – P. 4975−4983. 63) Mausam,V. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control [Text] / V.Mausam, S.K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R. Val'ero // Biochemical Engineering Journal. – 2007. – V. 37. – P. 1-20. 64) Maule, A. Sources of natural resistance to plant viruses: Status and prospects [Text] / A.J. Maule, C. Caranta, M.I. Boulton / Mol. Plant Pathol. – 2007. - V.8. - P. 223-231. 43 65) Pal, K. Biological Control of Plant Pathogens [Text] / K.Pal, B.Gardener //The Plant Health Instructor. 2006. – P. 5-25. 66) Park, J. Bolan N., Mallavarapu M. Enhancing the solubility of insoluble phosphorus compounds by phosphate solubilizing bacteria [Text] / J. Park, N. Bolan, M. Mallavarapu // 19-th World Congres of Soil Science. – Brisbane, 2010. - Р. 65-68. 67) Pérez-García, A. Biological control of phytopathogenic fungi by aerobic endospore-formers[Text] / A. Pérez-García, D Romero, H. Zeriouh, A ,de Vicente // Endospore-forming soil bacteria // Soil Biology - 2011. – V. 27. - P. 157-180. 68) Rasmussen, T. A Bargain of Effects[Text] / T.Rasmussen, M. Givskov // Microbiology.- 2006. - Vol. 152. – P. 895–904. 69) Reino, J.Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma [Text] / J. L. Reino, R. F. Guerriero, R. Herna'ndez-Gala', I. G. Collado // Phytochem Rev. - 2008. — V. 7. — P. 89–123. 70) Richmond, Т.Chasing the dream: plant EST micro-arrays[Текст] / Т.Richmond, S. Somerville// Plant Biol. - 2000. - V.3. - P.108-116. 71) Ryan, A.D. Effect of pathogen isolate, potato cultivar and antagonist strain on potato scab severity and biological control [Text] / Ryan, A.D. Kinkel, L.L.; Schottel, J.L. // Biocontrol Science and Technology. - 2004. – V.14. – P.301-311. 72) Schleifer, K. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications [Text] / K. Schleifer, O.Kandler // Bacteriol. Rev. – 1972. - V. 36, № 4. – Р. 407–437. 73) Slusarenko, A. Resistance to Plant Diseases [Текст] / A.J. Slusarenko, R.S.S. Fraser, L.C. Van Loon // Dordrecht - 2000. - P. 77-100. 74) Starchak,V. Agro-ecological problems of protection environment [Text] / V. Starchak, I. Puschkaryova // Machulski G Agroecological journal. — 2009. — № 1. — Р. 11–15. 44 75) Stowell, L.The bacteriostatic activity of fluorescent pigment on Pseudomonas fluorescens [Text] / L.J. Stowell, M.E. Stanghellini, I.J. Misaghi // J. Phytopathology. - 1981. - N8. - P.906. 76) Sumíková, T. Mycotoxin Production, Chemotypes and Diversity of Czech Fusarium graminearum Isolates on Wheat [Text] / T. Sumíková, L. Gabrielová, L. Kučera, M.Žabka, J. Chrpová // Czech J. Food Sci. 2013. V.31.- No.4. 77) Szczechura, W. Fusarium oxysporum f. Sp. Radicis-lycopersici – the cause of fusarium crown and root rot in tomato cultivation [Text] / W. Szczechura, M. Staniaszek, H. Habdas //Journal of plant protection research. – 2013. – V. 53, No. 2. – P.172-176. 78) Thomson, N. Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control [Text] / N.R. Thomson, M.A. Crow, SJ. McGowan // Mol. Microbiol. - 2000. - N.36. P. 539-556. 79) Tilak, R. Mycotic keratitisin India: afive-year retrospective study. [Text] / R.Tilak, S. Abhisek, O. Prakash, A. Chandra, A.Kumar2010. // J Infect Dev Ctries. – 2010. - V. 4(3). - P. 171-174. 80) Van, L. Significance of Inducible defense-related proteins in infected plants [Text] / L.Van, C. Loon, M. Rep, C. Pieterse // Annu. Rev. Phytopathol. - 2006. – V. 44. – P. 135- 162. 81) Vinale, F. Trichoderma-plant-pathogen interactions [Text] / F. Vinale, K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti, R. Marra,M. Lorito // Soil Biology & Biochemistry. – 2008. – V. 40. - P. 1-10. 82) Wharton, P. Seed treatment application-timing option for control of Fusarium decay and sprout rot of cut seedpieces [Text] / P. Wharton, W. Kirk, D. Berry, P. Tumbalam // American Journal of Potato Research. 2007.- V. 84. - P. 237-244. 83) Yasmin, H. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soil of weeds of khewra salt range and attock 45 [Text] / H. Yasmin, A. Bano // Pakistan Journal of Botany. – 2011. - № 3. - Р. 1663-1668. 84) Zhou, Y. Novel roles of Bacillus thuringiensis to control plant diseases [Text] /Y, Zhou, Y.L, Choi, M // Appl Microbiol Biotechnol. – 2008. V.80. – P 563–572. 46