ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЧВЕННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ
advertisement
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЧВЕННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙАНТАГОНИСТОВ РОДА BACILLUS МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Ботбаева Ж.Т. к.б.н., Мустафина И.Е., Аюпова А.Ж., Кулмагамбетова Г.Н. Ph.D. «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» КН МОН РК, г. Астана, Науанова А.П. д.б.н., КАТУ им. С Сейфуллина Введение. Наряду с традиционными методами идентификации микроорганизмов с использованием культуральных и морфологических характеристик, а так же химических и биохимических реакции, в настоящее время методы, основанные на сравнении нуклеотидных последовательностей различных генов, широко используются для видовой идентификации бактерий [1, 2]. Методы определения нуклеотидной последовательности, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК имеют большое значение сами по себе. Но они также проложили путь к разработке исключительноэффективных методов секвенирования ДНК. Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной от 300 до 800 нуклеотидных пар. Настоящее время более 16000 последовательностей генов 16s РНК представлены в доступной базе данных [3]. Ранние работы по классификации бактерий основывались в основном на морфологических и физиологических признаках и на методиках изучения чистых культур. Хотя ископаемые остатки и известны для некоторых микробов, они оказались мало пригодными для построения филогении. Однако в последние 20 лет возможности для построения филогении бактерий существенно расширились в связи с использованием методов определения генетического родства. Наибольший прогресс в реконструкции филогении микроорганизмов был достигнут благодаря секвенированию генов рибосомных РНК. В частности, секвенирование рРНК малой субъединицы (16S) позволило пересмотреть взаимоотношения между разными бактериями [4]. Ген рРНК малой субъединицы рибосомы важен для оценки эволюционных отношений между бактериями, поскольку он эволюционирует медленно и его продукт жизненно важен и функционально консервативен. Несмотря на это, использование данного гена в качестве единственного критерия филогенетического расстояния проблематично, особенно для близких таксонов. Так, сравнительный анализ структуры гена рРНК малой субъединицы в сочетании с анализом гибридизации общей ДНК у разных родов (Fibrobacter, Bacillus, Enterobacter, Serratia) показал, что связь между получаемыми величинами не является линейной [5]. Эти авторы показали также, что гибридизация ДНК - ДНК дает наиболее значимые оценки сходства в том случае, когда гомология генов рРНК малой субъединицы рибосомы более 97%. Например, для различных видов Bacillus, разделенных с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации, последовательности гена 16S рРНК оказались идентичными [6]. Поэтому в случае гомологии генов рРНК малой субъединицы рибосомы свыше 97% определение границ вида возможно лишь при использовании дополнительных исследований, в том числе данных о гибридизации ДНК [7]. Материалы и методы исследования Выделение ДНК из исследуемых штаммов. Биомассу свежих культур брали с помощью одноразовой петли в количестве 10-20 мг биомассы, и разводили в 1 мл раствора 50мМ ЭДТА в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке. Микроцентрифужные пробирки с исследуемыми культурами центрифугировали 2 минуты при 13000-16000 об/мин. После этого сливаем супернатант, если исследуемые культуры грамм положительные, то на осадок добавляем лизоцим (лизоцим растворяем в воде для всех культур сразу в концентрациях 10 мг/мл). В пробирки с культурой добавляем 60 мкл разбавленного раствора лизоцима. Культуру с лизоцимом ставим в термостат и инкубируем 1-2-часа при температуре 37º С. После центрифугируем 2 минуты при 13000-16000 об/минут и сливаем супернатант. На осадок добавляем 600 мкл Nuclei Lysis Solution и перемешиваем до полного разрушения клеток с помощью пипетирования. После пипетирования инкубируем 5 минут при 80ºС. С целью расщепления рибонуклеиновых кислот в каждую пробирку добавляем специального раствора R Nase Solution по 3 мкл. и 2-3 раза пипетируем. Раствор инкубируем 15-60 минут при температуре 37ºС в термошейкере. В эти же пробирки добавляем специальный раствор от набора Protein Precipitation Solution откручиваем и инкубируем 5 минут во льду. После ценртифугируем 3 минуты при 13000-16000об/мин. Супернатант переносим в чистые 1,5 мл пробирки и добавляем 600 мкл изопропанола (температура раствора должна быть 20ºС). Пробирки перемешиваем 2-3 раза при этом визуально можно увидеть тонкие нити ДНК. Раствор центрифугируем 2 минуты, при 13000-16000 об/минут и сливаем супернатант, осадок промываем 70%-ным раствором холодного этанола. Снова ценрифугируем, выливаем и оставляем до полного высыхания при комнатной температуре. Для дальнейшего использования ДНК растворили в 100 мкл 1 кратного буфера ТЕ (Трис+ЭДТА) и инкубировали в течении одного часа, при температуре 65ºС в термошейкере. ДНК хранят в холодильники при температуре 2-8ºС. Электрофоретическое разделение фрагментов. Чтобы увидеть фрагменты выделенного ДНК провели электрофорез при напряжении 5V/см3 в течение 1 часа. Для этого готовят 1% агарозу. В качестве электрофоретического буфера использовали 1 кратный раствор ТАЕ (40 mM Трис, 40 mM СН3СOOH 2 mM EDTA–Na pH-8.0). 1 г агарозы на 100 мл дистиллированной воды нагревали до полного растворения, после добавили 5 мкл бромистого этидия (10 мг/мл). Затем немного остывшую агарозу разливали в планшеты с гребенкой до застывания. Сверху застывшего геля заливали 10х разбавленный раствор ТАЕ. В лунки агарозы вносили 5 мкл исследуемого образца, который окрашивали загрузочным буфером «loading buffer». Проведение амплификации 16s РНК с помощью ПЦР. Готовили 30 мкл реакционной смеси. Для амплификации использовали отработанный протокол для 16s РНК, состав которой указан ниже: 3 мкл буфера для ПЦР, 3 мкл Mg SO4, 3 мкл dNTRs - смесь свободных нуклеотидов, 1 единица фермента Tag-полимеразы (5 ед/мкл), специальные праймеры для ПЦР-2 (прямой праймер 8 — AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) и (обратный праймер 806 - GGA CTA CCA GGG TAT CTA AT), 2 мкл исследуемого образца деионизированную воду брали из расчета 16,5 мкл на каждую реакционную смесь. Режим амплификации: 96ºС - 4 минуты 96 ºС -10 секунд 55 ºС - 5 секунд 60ºС - 4 минуты 20 ºС - ∞ Очистка ПЦР продукта. Для всех образцов готовили общую реакционную смесь, конечный объем, который должен быть 10 мкл. Протокол для очистки ПЦР продукта: После очистки ПЦР продуктов с помощью двух расщепляющих ферментов, составили протокол для секвенирования ПЦР продукта. Режим для ПЦР продукта после очистки 37 ºС -30 минут 85 ºС - 10 минут 4 ºС - ∞ Для секвенирования ПЦР общую реакционную смесь готовили отдельно для каждого праймера. Конечное количество реакционной смеси составляет 15 мкл. Протокол для прямого праймера: Big dye – 1мкл buffer – 1 мкл Праймер для ПЦР прямой - 0,4 (3,2pmol) – 6 мкл Н2О - 5,6 мкл Протокол для обратного праймера: Big dye – 1 мкл buffer – 1 мкл Праймер для ПЦР обратный - 0,4 (3,2) – 2 мкл Н2О - 5,6 мкл Режим для секвенирования ПЦР продукта: 96ºС – 4 минуты 96 ºС - 10 секунд 55 ºС - 5 секунд 60ºС - 4 минуты 20 ºС - ∞ Очистка продуктов после секвенирования. Протокол для очистки приведен ниже, конечный объем которого составляет 30 мкл для каждой пробы: Ac Na(ацетат нария) – 6 мкл H2O(деионизированная вода) – 6 мкл 96 % этиловый спирт — 138 мкл Результаты и обсуждение. Идентификация бактерий вида Bacillus основана на обнаружении и амплификации фрагмента гена с помощью полимеразной цепной реакции, которая представляет собой многократное цикличное повторение трех процессов: тепловая денатурация ДНК в исследуемой пробе; гибридизация (отжиг) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами); синтез комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. выделение суммарной ДНК; ПЦР, то есть реакция амплификации фрагмента гена 16s РНК , электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Объектами исследования были 6 штаммов микроорганизмов показавшие наиболее лучшие результаты антагонистической активности (таблица 1). Для выделения ДНК из исследуемых микроорганизмов взяты 12 часовые культуры, выращенные на твердой питательной среде, в термостате при 30ºС. Таблица 1 - Штаммы бактерий рода Bacillus Номера образцов взятые на ПЦР анализ 1 2 3 4 5 6 Наименование штамма Выделенный объект Происхождение штамма Bacillus sp.18 Bacillus sp.2 Bacillus sp.46 Bacillus sp.31 Bacillus sp.9 Bacillus sp.29 Почва Почва Почва Почва Почва Почва Акмолинская область Акмолинская область Акмолинская область Акмолинская область Акмолинская область Акмолинская область Выделение ДНК из отобранных штаммов-антагонистов проводили с помощью набора для выделения ДНК «Wizard Genomic DNA Purification Kit» фирмы «Promega corporation», произведенной в США. После выделения ДНК нами поставлен электрофоретический анализ образцов (рисунок1). Рисунок 1 - Электрофоретическое разделение смеси ДНК 1. Контрольное ДНК (1, 2), 2. Bacillus sp.18 (3,4), 3. Bacillus sp.2 (5,6), 4. Bacillus sp.46 (7,8). 5. Bacillus sp.31 (9,10), 6. Bacillus sp.9 (11,12), 7. Bacillus sp.29 (13,14). Из рисунка 1 можно увидеть полосы ДНК в двух повторностях. Так же можно заметить полосы РНК, поскольку нами не расщеплены рибонуклеиновые кислоты. Далее проводили ампилификацию фрагментов 16S рДНК исследуемых штаммов (около 800 bp). Штаммы амплифицированы с помощью праймеров прямого (8 - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) и обратного (806 - GGA CTA CCA GGG TAT CTA AT). Амплификацию проводили с помощью амплификатора Bio Rad 2. Чистота и концентрация ДНК оценена с помощью электрофореза в сравнении с маркером λHind III, имеющим фрагменты ДНК известной концентрации (рисунок 2). Рисунок 2- Электрофоретическое разделение ДНК после амплификации 1. Контрольное ДНК (1, 2) 5. Bacillus sp.31 (9,10) 2. Bacillus sp.18 (3,4) 6. Bacillus sp.9 (11,12) 3. Bacillus sp.2 (5,6) 7. Bacillus sp.29 (13,14) 4. Bacillus sp.46 (7,8) После электрофореза проводили очистку ПЦР продуктов с помощью двух ферментов, из которых один фермент (SAP - фосфатазы) расщепляет остаток чужих нуклеотидов снизу и сверху, помимо основной полосы. Второй фермент (EXO-экзонуклеаза) очищает из двух сторон основной полосы. После очистки ПЦР продуктов с помощью двух расщепляющих ферментов, составляли протокол секвенирования - ПЦР продукта. Для секвенирования ПЦР общую реакционную смесь готовили отдельно для каждого праймера. Конечное количество реакционной смеси должно быть 15 мкл. Секвенирование ПЦР продукта проводили на амплификаторе Tet Rad 2 производство США. После секвенирования ПЦР продуктов проводим очистку с помощью ацетата натрия. Готовим реакционную смесь для всех проб, из расчета (на 10 проб по 50 мкл этанола). В нашем случае для четырех повторностей нам необходимо брать 138 мкл этилового спирта из расчета 35 проб на 150 мкл этанола. Реакционную смесь перемешиваем и по 30 мкл добавляем в каждую пробу после сиквенса ПЦР, с целью проведения очистки. После центрифугируем в течение 30минут, при 3000 об/минут. Супернатант сливаем и промываем 1 - 2 раза 60 мкл 75 % раствором этанола. Пробирки оставляем до полного высыхания при комнатной температуре. Высушенные образцы растворяем 20 мкл раствором формамида. Секвенирование чистых ПЦР продуктов проводили на секвенаторе 3730хL DNA Analyzer. В результате секвенирования определено порядка 800 - 1000 пар нуклеотидов гена 16S рРНК исследуемых штаммов. На рисунке 3 приведены результаты секвенирования штамма бактерий рода Bacillus. Рисунок 3 - Пиктограмма нуклеотидной последовательности штаммовантагонистов На следующем этапе с помощью базы данных GenBank проводили поиск последовательностей, гомологичных cеквенированной 16S рДНК. В таблице 2 приведены данные о генетической последовательности исследуемых образцов и их процентная достоверность. Таблица 2 – Идентификация микроорганизмов на основе молекулярно генетических методов фрагмента 16s РНК № образцов Наименовани е штамма Идентифицированн ый вид % гомологии 1 2 Bacillus sp.18 Bacillus sp.2 Bacillus pumilus Bacillus subtilis 99% 99% 3 4 5 6 Bacillus sp.46 Bacillus sp.31 Bacillus sp.9 Bacillus sp.29 Bacillus pumilus Bacillus cereus Bacillus cereus Bacillus subtilis 99% 99% 99% 99% На основе выше приведенных данных нами определена процентная гомология по нуклеотидной последовательности штаммов. Штаммы, максимально близкие к исследуемой бактерии Bacillus sp.18, Bacillus sp.46 относятся к виду Bacillus pumilus (максимальная гомология 99,%), штаммы Bacillus sp.2 Bacillus sp.29 к Bacillus subtilis (99,%), и штаммы Bacillus sp.31, Bacillus sp.9 гомологичны со штаммом Bacillus cereus (99 %). Заключение Таким образом, в результате молекулярно-генетического метода типирования нами идентифицированы почвенные штаммы рода Bacillus sp.18 как Bacillus pumilus, штамм Bacillus sp.2 как Bacillus subtilis, штамм Bacillus sp.46 как Bacillus pumilus, штамм Bacillus sp.31 как Bacillus cereus,Bacillus sp.9 как Bacillus cereus, штамм Bacillus sp.29 как Bacillus subtilis, а также доказана их процентная достоверность на 99%. Литература 1. Клаг У. С., Каммингс М. Р. Основы генетики. Москва: Трансфера, 2007. - 896 с. 2. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х т. Перевод с английского.М.:Мир, 1998. - 391 с.0 3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. 4. M. V. Olson, J.E. Dutchik, M. Y. Graham, G. M. Brodeur, C. Helms, M. Frank, M. MacColin, R.Scheinman, T.Frank. 1986. Random-Clone Strategy for Genomic Restriction Mapping in Yeas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83 7826-7830 5. Дейвис К. Анализ генома. Методы. - М.: Мир, 1990. 6. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. - М.: Мир, 1988. 7. Wallace D.M. Precipitation of Nucleic Acids // Methods in Enzymology. V. 152. Guide to Molecular Cloning Techniques / S.L. Berger. - New York: Academic Press, 1987. - P. 41 Түйін Бұл мақалада Ақмола облысының топырағынан бөлініп алынған Bacillus туысына жататын бактерияларды, қазіргі заманға сай идентификациялау әдістері келтірілген. Келтірілген әдіс топырақ бактерияларын, әсіресе бейтаныс микроорганизмдерді гендік деңгейде идентификациялауға мүмкіндік береді. Нәтижелер бөлімінде штаммалардың ДНҚ-н бөліп алу әдістері арнайы реактивтер жиынтығының көмегімен жүргізілген. Бактериялардың генетикалық нуклеотидтік реті 3730хL DNA Analyzer сeквенаторында жасалған және пайыздық сәйкестігі GenBank базасындағы ақпарат арқылы дәлелденген. Микроорганизмдердің тегін анықтауға ұсынылып отырған гендік-молекулярлық әдістер көптеген ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Summary In the article resulted a method for identifying active strains of bacteria of the genus Bacillus isolated from soil Akmola region. Methods described here at the gene level allows the identification of soil that is unknown microorganisms. Identification of microorganisms in genetic molecular techniques is relevant because this technique gives more accurate information. The outcome of this work a method of DNA extraction from strains with a special recruitment and sеquencing on modern sеquenatore 3730hL DNA Analyzer, as well as data about the genetic sequences of the samples and their percentage accuracy. Since, at present the identification of microorganisms at the genetic level, an interest of many scientists.
