Сравнительный анализ методов ин витро тестирования

Сравнительный анализ методов ин витро тестирования биологического
действия ТНЧ, используемых в отечественной и зарубежной практике, в том числе
методов, разрабатываемых в проектах Рамочных программ ЕС и рекомендуемых
нормативами Европейского Союза.
1 Введение
Наночастицы широко используются в электронике, наноустройствах, при адресной
доставке лекарств, в диагностических целях или имеют природное происхождение.
Несмотря на увеличение потенциального воздействия наночастиц на окружающую среду,
информации об их токсическом влияние на живые организмы, включая человека, не
достаточно. Всвязи с чем возникает необходимость в разработке методологии оценки
нанотоксичности на широкой панели наночастиц с целью получения сведений о
токсикологических эффектах.
Методы
характеристики
физико-химических
свойств
наночастиц
широко
представлены в литературе: электронная микроскопия, спектрофотометрия, атомносиловая микроскопия, динамическое рассеяние света, определение z-потенциала. Однако
ни один из этих методов не позволяет определять сами наночастицы в образце.
В действительности проведенные исследования in vivo и in vitro нанотоксичности в
естественных и клинических условиях позволяют формировать обрывочные знания, но не
дают полной картины влияния наночастиц на организм. Широко распространены методы
оценки in vivo с использованием методов токсикокинетики, распределение в органах и
тканях, выведение из организмов. Системы in vitro в основном используются для
идентификации конкретных характеристик наноматериалов, которые могут быть
использованы в качестве показателей токсичности.
Можно выделить несколько моделей определения нанотоксичности in vivo и in vitro
(рисунок 1.8.1) [1]. При наличии первоначальных сведений о токсичности наночастиц
проводятся опыты in vivo. В связи с недостаточным знанием факторов токсичности,
модели животных могут быть использованы для изучения показателей, которые не
доступны при исследовании систем in vitro (распределение в органах и тканях, выведение
из организма, метаболизм и др.). Системы in vitro могут использоваться в качестве
индикаторов токсичности наночастиц и для проведения механистических исследований.
Основным преимущество применения систем in vitro является то, что они
позволяют получать научно-обоснованные результаты, которые могут применяться не
только на практике, но и в развитии фундаментальных основ. Также методы «в пробирке»
- это идеальный способ быстрого и недорого получения точных результатов, без
использования лабораторных животных, что позволяет соблюдать этические нормы [2].
Рисунок 1.8.1 – Методы изучения in vivo и in vitro токсичности наночастиц.
Хотя эксперименты in vitro не могут заменить полноценных исследований на
животных, их применение является основой для оценки безопасности наночастиц
техногенной природы. Такой подход имеет значение, принимая во внимание уникальные
свойства наночастиц: большая площадь поверхности, большое соотношение площадь /
масса, малые размеры, которые могут способствовать их проникновению через мембраны
клеток, эпителиальные или эндотелиальные барьеры и достигать внутренних органов.
Использование in vitro систем для оценки нанотоксичности одобрено Европейским
центром валидации альтернативных методов ЕС [3]. Предложенные методы in vitroдиагностики охватываются различные области: репродуктивная токсичность, оценка
потенциальной канцеррогенности, трансфер через различные барьеры (кожа, эпителий
сосудов, желудочно-кишечного тракта, гематоэнцефалический барьер и др.). Можно
выделить несколько модельных систем для оценки токсичности наночастиц in vitro:
клеточные линии, экспрессия генов, окислительный стресс, повреждение митохондрий,
ДНК, клеточные дисфункции, поглощение, экспрессия генов.
Одним из вариантов in vitro тестирования является возможность визуального
исследования клеток при действии наночастиц. Существует несколько методических
решений, позволяющих провести визуализацию клеток. Первый заключается в
использовании фазового контраста в микроскопии, при этом свет из одной фазы, проходя
через образец, пересекается с другим источником света. Такой подход позволяет получать
изображения
с
необходимыми
топографическими
различиями.
Также
будут
фиксироваться различия в составе и плотности. Однако, основным недостатком является
невозможность анализировать плоские и прозрачные препараты.
Дифференциальная
микроскопия
с
интерференционным
контрастированием
сравнима с фазово-контрастной микроскопией и позволяет работать с прозрачными
образцами.
Последнее десятилетие особую популярность приобретают методы на основе
флуоресцентной
микроскопии,
характеризующиеся
высокой
чувствительностью.
Причиной этому служит широкий ассортимент флуоресцентных маркеров. Ограничения
метода заключаются в том, чтобы интенсивность ультрафиолетового света не была
слишком сильной, что может вызвать токсические эффекты в клетках. Наиболее широко
используются органические флуоресцентные красители, которые позволяют различать
мертвые и живые клетки, проводить исследования целостности клеточных мембран,
определять концентрации ионом (кальций, магний и др.) в течение длительного времени.
Также в качестве маркеров могут выступать флуоресцентно меченные иммунореагенты,
специфически связывающиеся с определенными органеллами клетки.
В целом, in vitro системы позволяют контролировать следующие параметры
цитотоксичности:
морфология
клеток,
их
жизнеспособность,
пролиферация,
воспалительные процессы, окислительный стресс.
2 Основные in vitro методы оценки нанотоксичности.
2.1 Оценка жизнеспособности клеток.
Пролиферативный анализ (метаболические анализы). Анализ солей тетразолия
позволяет
измерять
жизнеспособность
клеточной
популяции
по
сравнению
с
необработанными клетками [4]. Клетки многократно подвергаются воздействию
наночастиц, после чего вводят растворимые соли тетразолия желтого в течение 2-4 часов
при 37С. Во время этого процесса жизнеспособные клетки с дыхательной активностью
митохондрий переводят растворимые соли тетразолия желтого в нерастворимый продукт
формазана
фиолетового
цвета
с
помощью
сукцин-дегидрогеназ
митохондрий.
Полученный продукт можно фиксировать спектрофометрическим способом. Этот метод
имеет ряд преимуществ: требуются минимальные трудозатраты, экспрессность, высокая
воспроизводимость. К недостаткам метода можно отнести то, что панель клеточных
линий, пригодных для проведения анализа, ограничена, необходимость использования
органического растворителя, ограничения получения нерастворимого продукта солей
тетразония.
Alamar Blue – анализ разработан сравнительно недалеко и применен к оценке
нанотоксичности путем определения окислительно-восстановительного потенциала
клеток. Alamar Blue-анализ является проверенным индикатором жизнеспособности
клеток. Анализ основан на снижении жизнеспособности клеток при преобразовании
резазурина во флуоресцентное вещество резоруфин. Активный компонент индикатора
(резазурин) является нетоксиченым, проникающим через мембраны веществом синего
цвета (нефлуоресцентным). При попадании в клетку резарузин преобразуется в
резоруфин, который обладает яркой флуоресценцией в красной области. Живые клетки
способны непрерывно преобразовывать резарузин в резоруфин, тем самым формируя
количественный сигнал [5]. Окислительно-восстановительный индикатор является
нетоксичным для клеток, персонала и окружающей среды. Данный метод позволяет
получать стабильные, воспроизводимые количественные результаты.
Включение [3H]тимидина в структуру ДНК является наиболее чувствительным
методом пролиферации клеток [6]. Применение производного тимидина ограничено его
токсичностью, стоимостью радиоактивного реагента, необходимостью использования
специального оборудования и знаний. Кроме того, этот метод требует длительного
инкубационного метода (24-48 ч).
Кологенный анализ. Взаимодействие наноматериалов и молекулярных зондов
можно избежать с помощью кологенного анализа [7]. Такой вариант анализа позволяет
проводить оценку и выявление конкретного эффекта на пролиферацию клеток.
2.2. Апоптоз клеток.
Изучение морфологических изменений клеток, которые приводят к апоптозу, под
действием наночастиц.
Лэддеринг ДНК, старейший метод анализа повреждений ДНК, характеризуется
фрагментацией молекулы, изолированием частей и их маркировкой из клеток,
подвергшихся воздействию потенциального токсиканта. Места повреждения ДНК
детектируются с помощью гель-электрофореза.
Анализ каспаз основан на измерении процессинга зимогена к активному
ферменту и протеолитической активности [8]. Как только в процессе апоптоза
включаются каспазы-3, неизбежна смерть клетки. Активированные каспазы-3 могут
быть обнаружены путем измерения расщепления субстрата каспазы-3, связанного с
хромофором или флуорофором, который поглощает или излучает свет только при
отделении подложки.
Метод
ДНК-комет
(гель-электрофорез
единичных
клеток)
является
чувствительным и быстрым способом количественной оценки повреждений ДНК в
единичных клетках. Отдельные клетки встроены в слое агарозного геля на стекле
микроскопа. Все клеточные белки удаляются с помощью лизиса. Поврежденные
фрагменты ДНК мигрируют от ядра клетки. Количество ДНК, вышедшей из «головы
кометы», прямо пропорционально количеству поврежденных молекул ДНК.
TUNEL – анализ (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)
также определяет поврежденные фрагменты ДНК. Метод основан на включении
биотинилированных нуклеотидов, конъюгированных с бромдезоксиуридином с 3’ОН
концом ДНК-фрагмента. Также в системе используются биотинилированные антитела
против бромдезоксиуридина и конъюгат стрептавидин-пероксидаза [9].
Аннексин V, который обычно используется для обнаружения апоптотических
клеток, прочно связывается с фосфатидилсерином кальций-зависимым способом [10].
Фосфатидилсерин обычно исключен из структуры внешней части мембраны, но
вращается между внутренней и внешней сторонами мембраны при апоптозе. В связи с
чем флуоресцентно меченный аннексин может быть использован для обнаружения
апопототических клеток.
2.3 Некроз клеток.
Процедура
цитоксического
поглощения
нейтрального
красного
также
опредеяет жизнеспособность клеток. Анализ основан на способности живых клеток
включать и связывать слабо катионный краситель, пропуская его через клеточную
мембрану в процессе неионной диффузии. Краситель преимущественно накапливается в
внутриклеточно в лизосомах, подвергая их разрушению и приводя к необратимым
последствиям. В этом случае цитотоксичность выражают в виде зависимости снижения
поглощения от концентрации нейтрального красного. Это обеспечивает формирование
интегрированного сигнала, свидетельствующего о целостности клеток и ингибировании
роста колонии.
При методе исследования, основанного на использовании трипанового синего,
клетки первоначально обрабатывают трипсином, а затем окрашивали трипановым
синим, который поглощается мертвыми клетками. Количество неокрашенных клеток
свидетельствует об общем числе жизнеспособных клеток. Этот метод имеет
преимущество в том, что формирует прямую зависимость количества живых клеток от
аналитического сигнала.
Лактат дегидрогеназа (ЛДГ) является растворимым в цитозоле ферментом,
который
служит
в
качестве
индикатора
некротической
смерти
клеток.
Колориметрический ЛДГ анализ, который основан на окислении желтой соли тетразолия
в красный формазан, широко применяется в клинической практике при оценке
поврежденных тканей или клеток. Значительное количество ЛДГ высвобождается из
цитозоля при некрозе, и ее активность можно измерить в надосодочной жидкости
клеточной культуры.
3 Характеристика окислительного стресса.
Окислительный
стресс
определяется
избыточным
образованием
или
несвоевременным удалением молекул с высокой реакционной способностью из-за
нарушения окислительного баланса при введении наночастиц. В качестве кислородных
радикалов могут быть: супероксид радикал, оксид азота, гидроксипероксил и др.
Образование большого количества активных форм кислорода и свободных радикалов
приводит ко множеству токсикологических последствий. Радикалы вступают в реакцию с
липидами, белками, нуклеиновыми кислотами.
2,7-дихлорфлуоресцеин.
Флуоресцентный
краситель,
полученный
в
виде
диацетата флуоресцеина, расщепляется при высоких значениях рН с образованием
нефлуоресцирующего
вещества.
Наличие
свободных
радикалов
преобразует
дихлорфлуоресцеин снова во флуоресцентное производное.
Электропарамагнитный резонанс – технология, которая широко используется для
оценки наночастиц и радикальных
продуктов их
воздействия. Использование
специальных спиновых зондов в сочетании с определенными реагентами позволяет
проводить количественные определения, одновременно определяя природу радикалов.
Для обнаружения активных форм аддукт формирования спин-улавливающего агента для
гидроксида
или
супероксида
вводится
в
культуральную
среду,
содержащую
наночастицы, в течение определенного времени. После чего весь супернатант
анализируют с помощью электропарамагнитного спектрометра.
Пероксидное окисление липидов представляет собой окислительное разрушение
мембран, вызванное воздействие супероксидрадикалов. Кинетику данного процесса
можно измерить путем определения малонового диальдегида или других производных
тиобарбитуровой кислоты. Данный метод нашел широкое применение при оценки
способности наночастиц вызывать окислительный стресс.
Анализ плазмид может быть также использован для определения активных форм
кислорода. Линеаризация гибких бактериальных плазмид ДНК применяется для оценки
наличия радикалов или их воздействия. Однако, данный метод характеризуется низкой
чувствительностью, т.к. ДНК могут связываться с поверхностью наночастиц.
При
окислительном
стрессе
происходят
изменения
с
ферментом
супероксиддисмутазой и нарушается синтез глутатиона. Увеличение или уменьшение
количества этих соединений может свидетельствовать о протекании окислительного
процесса, т.к. клетка либо компенсирует повышение стресса положительной регуляцией
синтеза антиоксидантов, либо использует клеточные запасы супероксиддисмутазы или
глутатиона для окисления активных форм кислорода. Глутатиона яляется важным
антиоксидантом,
Определение
который
окисляется
количественного
производного
возможна
хроматографии.
Однако
при
с
образованием
содержания
дисульфида
глутатиона
использовании
хроматографическое
и
его
дисульфидного
высокоэффективной
разделение
глутатиона.
занимает
жидкостной
достаточно
длительное время, что приводит к автоокислению глутатиона, и, следовательно, к
завышению определяемого количества. На сегодняшний день в нанотоксикологии
применяют колориметрический метод определения глутатиона с использованием 5,50дитио-бис(2-нитробензойной)кислоты. Активность супероксиддисмутазы определяют
косвенно через ее ингибирование при окислении субстрата (нитро синего тетразолия),
где супероксид вырабатывается с помощью экзогенной ксантина-ксантиноксидазы.
4 Анализ воспаления.
Иммуноферментный анализ – биомедицинский метод, который широко
используется в иммунологии для определения антител или антигенов в образце. В
иммуноферментном анализе известное количество антигена иммобилизовано на фазе,
после чего вносятся специфические антитела, которые взаимодействуют с антигеном.
Специфические антитела затем взаимодействуют с реагентом, меченным ферментом,
который в свою очередь реагирует с субстратом с образованием окрашенного продукта.
Наиболее
часто
иммуноферментный
анализ
используют
для
определения
воспалительных маркеров (интерлейкин-8, TNF, IL-6). Иммуноферментный анализ
позволяет использовать в качестве пробы не только клетки, но и биологические
жидкости, такие как кровь, сыворотка или плазма крови, слюна и др.
Ниже приведены примеры использования in vitro систем для характеристики
токсичности наночастиц.
Большинство
альтернативных
методов
(без
использования
животных)
исследования наночастиц предполагают использование клеточных линий. В работе [11]
показана зависимость токсичности от размера и концентрации наночастиц (снижение
функциональной активности митохондрий, деструкция АТФ, влияние на целостность
структуры мембран) на примере введения наночастиц серебра, которые вызвали
продуцирование альвеолярных макрофагов. Высокая цитотоксичность наночастиц
никеля большого размера была обнаружена в мышиных клетках нейробластомы
(Neuro2A) [12]. Chithrani с коллегами наблюдали зависящее от размера проникновение
наночастиц коллоидного золота в клетки HeLa [13]. Наночастицы диоксида кремния
проникают в ядра эпителиальных клеток человека (HEp-2 клетки) разными путями в
зависимости от их размера, вызывая развитие аномальных нуклеоплазматических
белковых агрегатов [14]. Также показана зависимость степени проницаемости
фибропласт легких человека (MRC-9) от размера наночастиц диоксида церия [15].
Дифференциальная токсичность в зависимости от размера наночастиц CoCr была
обнаружена в первичных фибропластах кожного покрова человека [16]. Показана
различная способность поглощения свободных радикалов, вызванных введением
наночастиц селена разного размера [17]. Наночастицы диоксида титана диаметром от 20
до 200 нм способны увеличить микроядра и инициировать апоптоз фибропластов
эмбриона Сирийского хомяка [18].
Chen с коллегами в своей работе [19] показали, что на степень проникновения
наночастиц коллоидного золота кроме размера частиц оказывает влияние также их
форма. В своем исследовании авторы использовали частицы сферической формы и в
виде палочек. Однако, в исследовании Cha и Myung [20] было показано, что размер
микрочастиц кремния не оказывает токсического воздействия на клетки головного мозга,
печени, желудка и легких человека.
Современные методы in vitro, используемые для оценки нанотоксичности. Как и
при работе с другими техногенными материалами, для оценки токсичности наночастиц
должны быть проведены эксперименты in vitro и in vivo. Модельные системы in vitro
обеспечивают быструю и эффективную оценку токсичности наночастиц, позволяют
сделать методы оценки автоматизированными и получать точную информацию о том,
как
наночастицы
взаимодействуют
с
клетками
человека.
Сложность
выбора
соответствующей модели тестирования заключается в правильности выбора клеточной
линии. Также in vitro модели не могут обеспечить оценку рисков применения наночастиц
для следующих поколений клеток или организмов.
В таблице 1.8.1. представлены доступные in vitro системы для характеристики
отдельных клеточных линий, тканей и органов.
Основной проблемой нанотоксикологии является дизиметрия, которая зависит от
времени введения и концентрации используемых препаратов. В случае работы с
наночастицами дозиметрия зависит не только от количества наночастиц, но и от их
морфологических параметров: размера, формы, плотности, состояния агломерации,
заряда поверхности [21].
Таблица 1.8.1. Доступные in vitro системы для характеристики отдельных
клеточных линий, тканей и органов [1].
Список литературы к Главе:
1.
Sahu, S.C. and D.A. Casciano, Nanotoxicity: From In Vivo and In Vitro Models to
Health Risks2009: Wiley.
2.
Sabbioni, E., et al., Cytotoxicity and morphological transforming potential of
cobalt nanoparticles, microparticles and ions in Balb/3T3 mouse fibroblasts: an in vitro model.
Nanotoxicology, 2014. 8(4): p. 455-64.
3.
Hartung, T., et al., ECVAM's response to the changing political environment for
alternatives: consequences of the European Union chemicals and cosmetics policies. Altern
Lab Anim, 2003. 31(5): p. 473-81.
4.
Kroll, A., et al., Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment:
Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2009.
72(2): p. 370-377.
5.
Al-Nasiry, S., et al., The use of Alamar Blue assay for quantitative analysis of
viability, migration and invasion of choriocarcinoma cells. Hum Reprod, 2007. 22(5): p. 13049.
6.
Robledo, R.F., et al., Increased Phosphorylated Extracellular Signal-Regulated
Kinase Immunoreactivity Associated with Proliferative and Morphologic Lung Alterations after
Chrysotile Asbestos Inhalation in Mice. The American Journal of Pathology, 2000. 156(4): p.
1307-1316.
7.
Puck, T.T., et al., ACTION OF X-RAYS ON MAMMALIAN CELLS : II.
SURVIVAL CURVES OF CELLS FROM NORMAL HUMAN TISSUES. The Journal of
Experimental Medicine, 1957. 106(4): p. 485-500.
8.
Yamin, T.T., J.M. Ayala, and D.K. Miller, Activation of the native 45-kDa
precursor form of interleukin-1-converting enzyme. J Biol Chem, 1996. 271(22): p. 13273-82.
9.
Gavrieli, Y., Y. Sherman, and S.A. Ben-Sasson, Identification of programmed cell
death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992. 119(3): p.
493-501.
10.
Velde, L.F.t., et al., Apoptotic cell death, detected ex vivo in peripheral blood
lymphocytes of HIV-1 infected persons. Mediators of Inflammation, 1996. 5(5): p. 379-381.
11.
Carlson, C., In Vitro Toxicity Assessment of Silver Nanoparticles in Rat Alveolar
Macrophages, 2006, Wright State University.
12.
Yin, H., H.P. Too, and G.M. Chow, The effects of particle size and surface
coating on the cytotoxicity of nickel ferrite. Biomaterials, 2005. 26(29): p. 5818-5826.
13.
Chithrani, B.D., A.A. Ghazani, and W.C.W. Chan, Determining the Size and
Shape Dependence of Gold Nanoparticle Uptake into Mammalian Cells. Nano Letters, 2006.
6(4): p. 662-668.
14.
Chen, M. and A. von Mikecz, Formation of nucleoplasmic protein aggregates
impairs nuclear function in response to SiO2 nanoparticles. Experimental Cell Research, 2005.
305(1): p. 51-62.
15.
Limbach, L.K., et al., Oxide Nanoparticle Uptake in Human Lung Fibroblasts: Effects of Particle Size, Agglomeration, and Diffusion at Low Concentrations. Environmental
Science & Technology, 2005. 39(23): p. 9370-9376.
16.
Papageorgiou, I., et al., The effect of nano- and micron-sized particles of cobalt–
chromium alloy on human fibroblasts in vitro. Biomaterials, 2007. 28(19): p. 2946-2958.
17.
Huang, B., et al., Free radical scavenging efficiency of Nano-Se in vitro. Free
Radical Biology and Medicine, 2003. 35(7): p. 805-813.
18.
Rahman, Q., J. Norwood, and G. Hatch, Evidence that exposure of particulate air
pollutants to human and rat alveolar macrophages leads to differential oxidative response.
Biochem Biophys Res Commun, 1997. 240(3): p. 669-72.
19.
Chen, Z., et al., Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo.
Toxicology Letters, 2006. 163(2): p. 109-120.
20.
Cha, K.E. and H. Myung, Cytotoxic effects of nanoparticles assessed in vitro and
in vivo. J Microbiol Biotechnol, 2007. 17(9): p. 1573-8.
21.
Gurr, J.-R., et al., Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of
photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. Toxicology,
2005. 213(1–2): p. 66-73.