Проблемы туберкулеза. Подходы к созданию новых

ФГБОУ ВПО «Московский
государственный университет тонких
химических технологий имени
М.В. Ломоносова»
Кафедра биотехнологии и бионанотехнологии
«Принципы разработки готовых лекарственных форм »
Проблемы туберкулеза.
Подходы к созданию новых
лекарственных форм
противотуберкулезных препаратов
Авторы:
Сорокоумова Г.М. ,
2013
Селищева А.А.
ПЛАН ЛЕКЦИИ:
1. Рост заболеваемости туберкулезом во всем
мире
2. Строение и свойства микобактерий
туберкулеза ( МТ Б)
3. Влияние МТБ на свойства макрофага
4. Химиотерапия туберкулеза
5. Развитие устойчивости у МТБ к
противотуберкулезным препаратам (ПТП)
6. Новые формы лекарственных препаратов
2
Туберкулез - «большая белая чума»
(историческая справка)
5000 лет до н.э. – туберкулезные поражения позвоночника
человека, жившего в каменном веке;
2750-2000 лет до н.э. – признаки ТБ в мумифицированных трупах египтян
400 лет до н.э. - Гиппократ– описал туберкулез и ввел термин «фтиза»
(чахотка);
Средневековье – эпидемия «большой белой чумы»
1882 г. - Микобактерия туберкулеза, открыта немецким ученым
Робертом Кохом
Конец XlX - начало XX –эпидемия во всех государствах Западной
Европы.
1950 годы
– открытие противотуберкулезных препаратов (ПТП),
1985г. – подъем заболеваемости, рост смертности.
3
Распространение туберкулеза в мире
Заболеваемость туберкулезом в
мире. Случаев на 100 тысяч
жителей.
Данные на 2010 г.
> 300;
200 — 300;
100 — 200;
50— 100;
< 50;
нет данных.
Уровень заболеваемости
туберкулезом с множественной
лекарственной устойчивостью в
мире.
Светло-желтым обозначены
наименьшие, а темно-оранжевым –
наивысшие показатели
заболеваемости.
4
Чем вызвано такое распространение
туберкулеза в мире?
Причины
1. Социально-экономические в РФ, распространение СПИДа в
Северной Америке, Западной Европе, Азии и Африке
2. Неэффективная диагностика заболевания
3. Сложность лечения туберкулеза – особенности биологии
возбудителя (медленный рост, внутриклеточная локализация,
существование латентных форм микобактерий)
4. Появление микобактерий резистентных ко многим
лекарственным препаратам
5
Виды микобактерий
Род Mycobacterium, включает следующие виды микобактерий:
M. tuberculosis - вызывает туберкулез у человека (M. tuberculosis H37Rv)
M. bovis, M. africanum, M. microti, M. avium, M. leprae - внутриклеточные
патогены высших позвоночных,
M. bovis, M. africanum вызывают заболевание у человека, клинически не
отличающееся от классического туберкулеза.
M. microti - непатогенна для человека, однако вызывает заболевание у
мышей, напоминающее туберкулез.
M. avium активно развивается у ВИЧ-инфицированных людей.
M. africanum, M. microti, M. canettii, M. avium и M. smegmatis - группа
микобактерий характеризуется выраженным генетическим сходством.
M. smegmatis является непатогенной микобактерией
1919г. – французские ученые Кальметт и Жерен путем многократных (230)
последовательных пассажей M. bovis получили штамм непатогенный для
человека.
1921 г. Культура БЦЖ (бацилла Кальметта и Жерена ) – используется для
вакцинации людей.
6
Характеристика микобактерий
Микобактерии (Mycobacterium) – грамположительные;
кислотоустойчивые;
облигантые аэробы;
факультативные внутриклеточные
паразиты;
M. tuberculosis – размножается с
периодом удвоения 18-24 ч., сохраняет
жизнеспособность при +80 С и при -30 С.
Лиофилизирован. жизнеспособны до 30 лет.
M. smegmatis
Окраска по Циль-Нильсену :
карболовым фуксином, с
последующим обесцвечиванием
раствором серной кислоты и
доокрашиванием метиленовой синькой 7
SL
TDM
LOS
P
PIM
LAM
PGL
Схема клеточной стенки микобактерий
outer layer (~12 nm):
phospholipids, complex catamphiles,
phenolic glycolipids, sulfolipids, etc.
electron transparent layer (~8 nm):
mycolic acids
cell wall skeleton (~13 nm):
arabino galactan, peptidoglycan
cytoplasmic membrane (~7 nm)
PGL- фенольные гликолипиды, РIM-фосфатидилинозитманнозид,
LAM-липоарабиноманнан, Р-белки-порины, LOS-липоолигосахарид,
SL-сульфолипиды, TDM-димиколат трегалозы.
8
Характеристика липидов микобактерий
Общее содержание липидов в клетках микобактерии– 40% (от сухой
биомассы)
В клеточных стенках микобактерий содержится - 25-32% липидов
• Нейтральные липиды – моно-, ди-, триглицериды, воска, эфиры
вторичных спиртов с высшими жирными кислотами, менахиноны
• Фосфолипиды - 4,5-6% -КЛ, ФЭ, ФК, ФИ, ФИ -маннозиты
• Миколовые кислоты – кислоты, содержащие от 60 до 90 атомов
углерода
• Гликолипиды –гликозилдиглицериды и ацилированные сахара
(микозиды, кордфактор – димиколат трегалозы), сульфолипиды
• Пептидолипиды и пептидогликолипиды - «воск» D, микозиды
9
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ M.tuberculosis С
МАКРОФАГОМ
10
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОБАКТЕРИЯ – МАКРОФАГ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ:
Для макрофага
•1.Активация макрофага:
- индукция кислородного взрыва;
- выброс цитокинов;
- образование псевдоподий;
•2. Образование фагосомы;
•3. Созревание фагосом:
- ФИ-цикл;
- синтез белков слияния 1 и 2 стадии;
- понижение рН;
- изменение уровня Са;
•4. Слияние с лизосомами;
•5. Переваривание микобактерий
Для микобактерии
1. Связывание с рецепторами
макрофага;
2. Проникновение в макрофаг в
составе фагосомы;
3. .Блокирование слияния
ФАГОСОМА-ЛИЗОСОМА;
4 Секреция белков и пептидов
микобактерий, влияющих на
метаболизм макрофага;
5. Получение жирных кислот из
фосфолипидов фагосомы;
6.Размножение в фагосоме
11
Химиотерапия туберкулеза
Три группы противотуберкулезных препаратов (ПТП)
(классификация Международного союза борьбы с
туберкулезом):
I группа включает препараты наиболее эффективные против
МБТ: изониазид
рифампицин
O
O
NH NH2
O
OH
O
OH
O
OH
OH
NH
N
N
O
(1951г.) МПК
0,01-1 мкг/мл
OH
O
N
O
N
(1970г.)
МПК 0,1-10 мкг/мл
12
Противотуберкулезные препараты
II группу составляют препараты средней эффективности:
стрептомицин, канамицин, циклосерин, этамбутол,
этионамид (протионамид), пиразинамид,
NH
H 2N
NH
H 2N
C
OH
HO
C
NH
OH
N
H
N
OH
H
O
N
H
O
CHO
CH3
CH3
H
OH
OH
O
Этамбутол
HOH2C
O
HO
NHMe
МПК 5-40 мкг/мл
OH
Стрептомицин (МПК 1,25-40 мкг/мл)
III группа - препараты низкой эффективности: парааминосалициловая кислота (ПАСК), тиоацетазон
13
Схема химиотерапии туберкулеза
Интенсивная фаза - 2 месяца
Препараты – комбинированная таблетка:
Изониазид /рифампицин/пиразинамид/этамбутол
60мг
120мг
200 мг
300 мг
4-5 таблеток (5 дней в неделю)
Продолжение лечения – 4 месяца
Препараты – комбинированная таблетка:
Изониазид /рифампицин
150 мг
300мг
2 таблетки в день
14
Мишени, на которые направлено действие
ПТП
- Изониазид
- Этамбутол
- Пиразинамид
- Рифампицин
15
Развитие устойчивости МТБ к ПТП
Геном МБТ насчитывает 4,4 млн.пар основ., которые кодируют 4000 генов
Антимикроб
Механизм
ный
действия
препарат
Изониазид
Ингибирование
синтеза
миколовых
кислот
Ингибирование
Рифампицин ДНK-зависимой
РНK-полимеразы
Гены,
ответственные за
устойчивость
Механизм устойчивости
1) katG
(каталазапероксидаза)
1) Мутации в гене katG приводят к потере
активности интермедиатов изониазида.
2) inhA
(енол-АСРредуктаза)
2) Суперэкспрессия гена inhA обеспечивает
продолжение синтеза миколовой кислоты и
вызывает инактивацию активного интермедиата
изониазида.
3) ahpC
(алкилгидроперокс
идредуктаза)
3) Мутации в гене ahpC способствуют
детоксикации активного интермедиата изониазида
rpoВ (βсубъединица Мутации приводят к снижению способности
РНKфермента связываться с рифампицином
16
полимеразы)
Антимикробный препарат
Механизм
действия
Гены,
ответственные за
устойчивость
Механизм устойчивости
Стрептомицин
1) rpsL
(рибосомный
Ингибирование белок S12)
синтеза белка
2) rrs (16S
рРНK)
Мутации приводят к изменению структуры
рибосом и снижению проницаемости внешних
структур микробной клетки
Этамбутол
Ингибирование
биосинтеза
арабиногалакта
на и
липоарабиномн
нана
embAB
(арабинозилтрансфераза)
Высокий уровень экспрессии или мутация в
гене embAB делает возможным продолжение
синтеза арабина
pcnA
Потеря активности пиразинамидазы нарушает
процесс превращения пиразинамида в
пиразиновую кислоту
gyrA
(субъединица
А ДНKгиразы)
Снижение аффинности фермента к препаратам
фторхинолоновой группы
Пиразинамид
Не известен
Ингибирование
ДНK-гиразы
Фторхинолоны
(топоизомеразы IV)
17
Пути повышения эффективности лечения
туберкулеза
1. Разработка ускоренных методов диагностики заболевания и
детекции резистентности микобактерий к ПТП
(2004г.- биочип ИМБ для определения устойчивости МБТ к
ПТП получил государственный сертификат.)
2. Получение новых противотуберкулезных препаратов.
(ОРС-67683 – производное нитро - дигидроимидазооасазола,
ИОС-41, R-207910 –диарилхинолин)
3. Разработка лекарственных препаратов направленного действия
на основе уже известных ПТП
(Изодекс –изониазид+декстран и т.п.)
4. Улучшение исполнительность пациентов в неблагополучных
социальных группах при внедрении простых программ
"непосредственно контролируемой терапии"
5. Разработка новых вакцинных препаратов
18
Новые противотуберкулезные препараты
19
ПТП нового поколения
их мишени
Механизм действия
PA824
(нитроимидазооксазины)
Подавление синтеза белка и
липидов клеточной стенки, в
т.ч. в анаэробных
условиях; образование
интермедиатов,
высвобождающих активные
оксиды азота
Подавление синтеза
липидов клеточной
стенки и биосинтеза
миколовых кислот
Подавление синтеза АТФ
F420-зависимая
нитратредуктаза
Мутация
генов rv0407,
rv3547,
rv3261, rv3262
Нитратредуктаза
Мутация гена
rv3547
F0F1 АТФ-синтаза
Мутация гена
atpE
Подавление синтеза
клеточной стенки
Н/д
Н/д
Н/д
Н/д
Н/д
Подавление синтеза
белка
Рибосомы
Н/д
Подавление синтеза
арабинана
DprE1-субъедини-ца
фермента декапренил-фосфорил-βО-рибозы 2‘эпимеразы
Протеинкиназы PknA
и PknB
Мутация гена
rv3790
ОРS67683
(нитроимидазооксазины)
TMC207 (R207910)
(диарилхинолины)
SQ109 (диэтиамины)
LL3858 (пирролы)
Линезолид
(оксазолидиноны)
BTZ043
(нитробензотиазиноны)
Тритразин-Н
(азолотетразины)
Ингибирование серинтреониновых протеинкиназ
Мишень
Механизм
образования
устойчивости
Препарат
(класс соединений)
Н/д
20
Системы доставки
противотуберкулезных препаратов
1. Липосомы
2. Микросферы (микрочастицы, наночастицы) на
основе полимеров
3. Полимерные имплантанты
21
Системы доставки противотуберкулезных
препаратов
L.C.Toit, V.Pillay, M.P.Dancwerts Tuberculosis chemotherapy: current drug
delivery approaches.// Respiratory research. 2006.V.7.P.118-135
22
Липосомные формы противотуберкулезных
препаратов
Преимущества перед традиционными
лекарственными формами:
1.Защита препарата от деструкции, связанной с
воздействием ферментов биологических жидкостей;
2. Пролонгированное действие препарата, вызванное
постепенным высвобождением лекарства из ЛС;
3. Направленный транспорт лекарства к органумишени
(липосома
инфицированный макрофаг).
23
Распределение "пустых" липосом в организме
экспериментальных животных
Состав липосом
Процент введенной дозы через 1 ч
после инъекции
Печень
Селезенка
Легкие
I
ФХ/ХС
II
ФХ/ХС/О-САП
III
ФХ/ХС/О-САП/ДЦФ
IV
ФХ/ХС/О-САП/ДЦФ/GM1
30,3 ± 1,7 1,7 ± 0,5
29,7± 1,5
V
ФХ/ХС/ОСАП/ДЦФ/ДСФЭ-ПЭГ
27,1 ± 0,4 3,2 ± 0,9
28,0± 0,4
VI
ФХ/ХС + ФХ/ХС/ОСАП/ДЦФ/ДСФЭ-ПЭГ
17,3 ± 0,5 1,0 ± 0,05 37,3± 0,5
60,0 ±1,73 3,70±
1,62
53,6 ± 3,1 4,0 ± 0,5
4,70±
1,06
19,0± 2,0
47,1 ± 1,8 2,56 ± 0,5 23,0± 2,0
ФХ-фосфатидилхолин,ХС-холестерин, О-САП-стеариламинопектин, ДЦФ – дицетилфосфат
ДСФЭ-ПЭГ-дистеароилфосфатидилэтеноламинполиэтиленгликоль, GM1- моносиало24
ганглиозид
Влияние фосфолипидного состава на
степень включения рифампицина в
липосомы
22
Cтепень включения РФ, %
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
ФХ
Ф Х :К Л 1 0 :1
Ф Х :л Ф Х 1 0 :1
Ф Х :Х С 4 :1
Ф Х :Ф Э :л Ф Х 7 :1 :0 ,3
концентрация рифампицина 7 мг/мл, фосфолипидов 40 мг/мл
25
Жизнеспособность Mycobacterium smegmatis
внутри макрофагов (in vitro) и после аэрозольного
введения липосомного рифампицина in vivo
%
жизнеспособности
Биосистема
Исходная жизнеспособность M. smegmatis
76,0 ± 5,6
Макрофаги + M. smegmatis
69,5 ± 5,2
Свободный рифампицин (РФ) + макрофаги + M.
Smegmatis
45,7 ± 4,7
Липосомы (ФХ:ХЛ+РФ)
smegmatis
M.
31,6 ± 3,8
Липосомы (ФХ:ХЛ+РФ с ДЦФ) + макрофаги + M.
Smegmatis
21,6 ± 3,1
Липосомы, (ФХ:ХЛ+РФ с МА)+ макрофаги + M.
Smegmatis
10,9 ± 2,1
Липосомы, (ФХ:ХЛ+РФ с О-САП) + макрофаги + M.
Smegmatis
7,1 ± 1,6
+
макрофаги
+
26
АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
ЛИПОСОМАЛЬНОГО РИФАМПИЦИНА in vivo
Схема эксперимента:
Мышей заражали внутривенным введением M. tuberculosis Н37Rv в ретроорбитальный
синус глаза в дозе 5х10^5 КОЕ;
лечение осуществляли через 2 недели после заражения, ежедневно, в течение 2-х
месяцев;
Липосомальную форму рифампицина вводили ингаляцион., изониазид - внутрижелудочно
Количество
высеваемых M.tuberculosis из органов зараженных мышей
через 2 месяца лечения
Препарат
КОЕ / селезенка
1.Контроль
(7,2±0.5)х10^5
2.Изониазид+рифампицин
3.Изониазид
0
(2.3±
±0.6)*10^3
4. Изониазид +липосомы с РФ
(ингаляционно)
0
КОЕ /легкое Х±SD
(3.9±0.5)х10^6
0
(4.3±
±0.6)*10^3
0
ДОЗА РИФАМПИЦИНА В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЕ В 15 РАЗ
МЕНЬШЕ ДОЗЫ РАСТВОРА РИФАМПИЦИНА, ВВОДИМОГО
ВНУТРИЖЕЛУДОЧНО, И НЕ ВЫЗЫВАЕТ ТОКСИЧНЫХ ЭФФЕКТОВ
27
Фторхинолоны – применяемые в
лечении туберкулеза
офлоксацин
левофлоксацин
ломефлоксацин
28
Метод активной загрузки фторхинолонов (ОФ, ЛФ и ЛМ) в
липосомы
Влияние липидного состава липосом на эффективность
включения ОФ, ЛФ и ЛМ
Раствор липидов в
хлороформе
Упаривание,
диспергирование раст
вором 0,3М (NH4)2SO4
Фторхинолоны Состав липидов
ФХ (10 мг/мл)
Эффективно Эффективно
Размер
масса АБ,
сть
сть Загрузки
липосом,
мг
включения, препарата,
нм
%
%
0,8
225
55
7
0,8
235
58
6
1
269
60
10
4:1:1 по массе(15
мг/мл)
1
235
58
6
ФХ (10 мг/мл)
0,2
225
50
1
0,2
202
54
1
МЛВ
ОФ
ФХ/ХОЛ
4:1 по массе (10
мг/мл)
ОЛВ
ФХ/ХОЛ
гельхроматография
липосомы
ЛФ
(NH4)2SO4
+ АБ в 1% CH3COOH
Инкубировали при
температуре 50°С до 2040мин
ЛМ
4:1 по массе (10
мг/мл)
ФХ/ХОЛ/КЛ
ФХ/ХОЛ
4:1 по массе (10
мг/мл)
Влияние липосомальной формы левофлоксацина на рост штамма
Mycobacterium tuberculosis CN-37 (ШЛУ)
Зависимость начала роста клеток M. tuberculosis CN-37 (105 КОЕ/мл) от вносимого препарата
Состав липосом
| Конц. КЛ. , мкг/мл
Конц. ЛФ, мкг/мл
Контроль рост МТБ (ШЛУ)
ЛФ
ФХ/ХОЛ/КЛ
(4:1:1 по массе)
ФХ/ХОЛ/КЛ
(5,5:1:0,5 по массе)
ФХ/ХОЛ
(5:1 по массе)
100
50
0
Начало роста (сутки)
8
0
8
1
9
2
4
0
10-11
нет роста
17 (нет роста)
1
2
нет роста
нет роста
4
нет роста
0
8-9
1
9
2
нет роста
4
нет роста
0
8
1
8
2
4
9
нет роста
Благодарю за внимание!