Оценка иммунного ответа у бройлеров и молодок яичных
advertisement
MERIAL Avian EMEA Информационный бюллетень Оценка иммунного ответа у бройлеров и молодок яичных кроссов птицы с использованием 2 видов тест-наборов для ИФА после вакцинации векторной вакциной HVT+IBD (VAXXITEK® HVT+IBD) in ovo или в суточном возрасте Быстрое развитие поствакцинального иммунного ответа является очень важным для защиты цыплят раннего возраста, так как по мере исчезновения материнских антител риск заражения возрастает. Однако, при использовании классических аттенуированных живых вакцин против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) («средних» и «средних плюс»), высокие титры материнских антител против этого вируса интерферируют с ранней вакцинацией. Используя 2 тест-набора для ИФА (Proflock IBD Ab test и «усовершенствованный» тест-набор Proflock Plus IBD Ab test) оценивали развитие активного гуморального ответа в коммерческих стадах бройлеров и молодок яичных кроссов птицы, вакцинированных различными вакцинами против ИББ. У цыплят, вакцинированных аттенуированными живыми вакцинами (включая вакцину на основе иммунного комплекса), наблюдали отсутствие защиты c третьей по пятую неделю выращивания. Напротив, у цыплят, вакцинированных vHVT13 (Vaxxitek® HVT+IBD) методом in ovo или подкожно в суточном возрасте, используя тестнабор Proflock Plus IBD Ab test, активный иммунный ответ выявляли с 2-недельного возраста, что подтверждает отсутствие интерференции материнских антител с этой вакциной. Комбинированное использование обоих тест-наборов позволяет дифференцировать цыплят, вакцинированных с помощью Vaxxitek ® HVT+IBD, от зараженных или вакцинированных аттенуированными живыми вакцинами: цыплята, вакцинированные Vaxxitek® HVT+IBD, в возрасте старше 3-4 недель демонстрировали более низкие титры антител при использовании тест-набора Proflock IBD Ab test и высокие титры антител (обычно более 4000) при использовании тест-набора Proflock Plus IBD Ab test. Напротив, у цыплят, инфицированных вирусом ИББ или вакцинированных аттенуированными живыми вакцинами, при исследовании после 6-недельного возраста, титры антител были высокими в обоих тест-наборах. VAXXITEK® – торговая марка, зарегистрированная компанией Мериал в США и других странах. PROFLOK® – торговая марка, зарегистрированная компанией Synbiotics Corporation в США и других странах. E. Prandini 1, M. Bublot 2, F.-X. Le Gros 2, A. Danger 2, L. Pizzoni 3, C. Lamichhane 4 Merial Italia s.p.a., Milanofiori – Strada 6 – Palazzo E/5 20090 Assago (MI) Italy. 1 Merial S.A.S., Laboratoire de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Mйrieux, 69007 Lyon France. 2 Merial Italia s.p.a., SS 234 per Cremona km 28.2 27013, Chignolo Po (Pavia) Italy. 3 Synbiotics Corporation, 11011 Via Frontera, 92127 San Diego, (CA) USA. 4 Введение Общие положения Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) или болезнь Гамборо вызывается небольшим безоболочечным вирусом с двуспиральной РНК, относящимся к семейству Birnaviridae. Хотя прошло более 40 лет с тех пор, как болезнь впервые была описана в 1962 году в Гамборо, США, она до сих пор вызывает серьезные экономические потери в птицеводческой отрасли всего мира. Фабрициева сумка является главной мишенью вируса ИББ, что вызывает иммуносупрессию у молодых птиц, особенно в возрасте от 3 до 6 недель. К прямым экономическим убыткам от клинического проявления заболевания добавляются потери, связанные со снижением устойчивости к другим инфекционным агентам и ухудшением иммунного ответа на повсеместно используемые вакцины. Заболевание высоко контагиозное для цыплят. Экономические потери зависят от штамма вируса ИББ, породы птиц (белый леггорн более восприимчив, чем бройлеры и коричневые несушки), сопутствующих первичных или вторичных патогенов, а также от условий внешней среды и факторов менеджмента (Muller et al., 2003). В конце 80-х в вакцинированных стадах птиц в США появились антигенные варианты, а в Европе – высоковирулентные штаммы вируса ИББ (vvIBDV) (антигенно-сходные с «классическими» штаммами), которые очень быстро распространились по всему миру. Инфекция классическими вирулентными штаммами и вариантными американскими штаммами проявляется высокой заболеваемостью и обычно низкой смертностью, тогда как vvIBDV штаммы могут вызывать до 90% смертности у яичной птицы (обзор Saif, 1998; van der Berg, 2000; Muller et al., 2003). Существует два серотипа вируса, обозначаемые 1 и 2. Вирусы обоих серотипов естественно инфицируют кур и индеек, но заболевание проявляется только у кур, и только вирус серотипа 1 является патогенным. Основные структурные белки VP2 и VP3 формируют наружный и внутренний капсид вируса соответственно (Bottcher et al., 1997; обзор Saif, 1998; van der Berg, 2000; Muller et al., 2003). Антигенный сайт, ответственный за индукцию нейтрализующих антител, расположен в пределах области, называемой вариабельный домен VP2, и является сильно структурозависимым (Becht et al., 1988; Schnitzler et al., 1993). Этот сайт также ответственен за специфичность серотипа. Напротив, VP3 является группоспецифическим антигеном, который распознается не нейтрализующими антителами, которые могут перекрестно реагировать с обоими серотипами. Вакцины Вакцинация остается жизненно необходимой в силу большого экономического значения болезни и широкой распространенности вируса ИББ. Для защиты против вируса прежде всего необходимы антитела, хотя и клеточный иммунитет играет некоторую роль. Материнские антитела обеспечивают цыпленка превосходной пассивной защитой против инфекции. Для индуцирования высоких титров антител у родителей перед началом яйцекладки широко используются инактивированные масляные вакцины, затем эти антитела пассивно передаются потомству. С появлением высоковирулентных штаммов вируса стало невозможным далее полагаться только на пассивный иммунитет для защиты бройлеров, и возникла необходимость в более интенсивном использовании живых вакцин. Различные аттенуированные живые вакцины, содержащие классический или вариантные штаммы вирусов, доступны коммерчески и классифицируются в зависимости от их степени аттенуации на «мягкие», «средние», «средние плюс» и «горячие» вакцины (обзор Saif, 1998; van der Berg, 2000; Muller et al., 2003). Основная проблема активной иммунизации – это интерференция с материнскими антителами, которые могут нейтрализовать вакцину. Таким образом, очень важным является выбор времени вакцинации. Формула Девентера является полезным инструментом для вычисления оптимального времени вакцинации для каждого стада, поскольку учитывает уровень материнских антител и период их полураспада, возраст цыплят на момент отбора образцов сывороток, генетические данные цыплят и свойства вакцинного штамма вируса ИББ (de Witt, 2001). Два больших производственных опыта на нескольких стадах бройлеров, имевших определенный уровень материнских антител, четко показали важность вакцинации в оптимальный срок, вычисленный при помощи формулы Девентера. Если птице вводили «среднюю» вакцину против ИББ более чем за 1 день до рассчитанного оптимального срока вакцинации, гуморальный ответ был отсрочен или сероконверсия была низкой вплоть до убоя (Block et al., 2007). «Мягкие» и «средние» вакцины более безопасны в том смысле, что они вызывают меньшие поражения бурсы, чем «горячие», но они обладают низкой эффективностью в присутствии материнских антител и против высоковирулентных штаммов вируса ИББ. И напротив, менее аттенуированные штаммы («средние плюс» и «горячие» вакцины) могут преодолевать более высокие уровни материнских антител, но они же могут вызывать более тяжелые поражения в фолликулах бурсы, что заканчивается иммуносупрессией. Эти штаммы не рекомендуются для вакцинации цыплят моложе 10-дневного возраста. В качестве альтернативы разрабатываются другие виды вакцин, менее чувствительные к интерференции с пассивным иммунитетом. Для введения in ovo или для подкожного введения суточным цыплятам используется вакцина на основе иммунного комплекса (ИК), в которой вирус «средней плюс» вакцины связан с антителами в комплекс. Предполагается, что иммунный комплекс захватывается фолликулярными дендритными клетками (макрофагами), где вирус находится до тех пор, пока не исчезнут материнские антитела. В качестве потенциальных вакцин против ИББ описываются также векторные вирусные вакцины, экспрессирующие белки вируса ИББ. Используются такие векторы, как вирус оспы птиц, герпес вирус индеек (HVT) (Darteil et al., 1995), аденовирус птиц, вирус болезни Марека и вирус леса Семлики (обзор Saif, 1998; vaa den Berg, 2000; Muller et al.,2003). Вакцина на основе вектора HVT, экспрессирующего ген VP2 вируса ИББ, обозначенная как vHVT013-69 (vHVT13 или Vaxxitek® HVT+IBD), обладает тем преимуществом, что объединяет в себе безопасность и эффективность. Продемонстрирована эффективность вакцины как против болезни Марека (штамм HVT широко используется для вакцинации против этого заболевания), так и против различных штаммов вируса ИББ, включая классические, высоко вирулентные и американские вариантные штаммы. vHVT13 можно вводить либо методом in ovo (за 3 дня до выведения цыплят) или методом подкожного введения суточным цыплятам в присутствии высоких титров материнских антител (reviewed by Bublo et al., 2007). Серологические исследования Антитела, специфичные к вирусу ИББ, можно определять в реакции нейтрализации (РН), методом ИФА или методом преципитации в агаровом геле (реакция иммунной преципитации, РИП). РН является единственной реакцией, в которой можно дифференцировать изоляты вируса ИББ на антигенные серотипы или подтипы. Титры РН точно отражают степень защиты цыплят от вируса ИББ (Macreadie et al., 1990, Fahey et al., 1991, AI Natour et al., 2004). РИП – быстрый тест, но недостаточно чувствительный и выявляет антитела против первичных группоспецифических растворимых антигенов (Lukert and Saif, 1997). Метод ИФА является наиболее распространенным, поскольку экономичен, прост, быстро воспроизводим и адаптирован к широкому диапазону использования. На рынке представлены несколько тест-наборов для ИФА, в них используются разные типы антигена вируса ИББ: антигены, полученные из клеточной культуры, VP2, VP3 и VP4-антигены экспрессированные бакуловирусами, (Jackwood et al., 1999), и антигены, полученные из бурсы. Материалы и методы А. Схема эксперимента Всего было задействовано 18 коммерческих бройлерных стад из различных стран (Италия, Франция и Венгрия). В каждом опыте vHVT13 (Vaxxitek® HVT+IBD) сравнивали с другими вакцинами против ИББ («средними», «средними плюс» и вакцинами на основе иммунокомплекса). Для каждого опыта птиц одного и того же стада случайным образом делили на 2 группы, после вакцинации их содержали в отдельных помещениях. Вакцинации проводили в соответствии с рекомендациями производителя вакцины – либо методом выпойки с питьевой водой, либо методом подкожной инъекции. vHVT13 вводили методом in ovo за 3 дня до выведения цыплят или методом подкожной инъекции суточным цыплятам. Стада молодок яичных кроссов птицы, полученные от родителей, вакцинированных только аттенуированными живыми вакцинами против ИББ, также вакцинировали «средними» вакцинами или vHVT13 (подкожно в суточном возрасте) и содержали в производственных условиях. Дополнительно был проведен эксперимент на молодках яичных кроссов птицы в экспериментальных условиях (изоляторах). Суточных цыплят распределили на 6 групп. Для двух групп применялась «средняя» вакцина методом закапывания в рот в возрасте 17 и 25 дней, одна группа получила «среднюю плюс» вакцину методом закапывания в рот в 17-дневном возрасте, и одну группу вакцинировали подкожно вакциной vHVT13 в суточном возрасте. Две группы оставались невакцинированными. Птиц всех групп, за исключением одной невакцинированной, на 42 день заражали высоковирулентным штаммом вируса ИББ (штамм 77165) (Martin et al., 2007). Начиная с суточного возраста, с регулярным интервалом отбирали образцы крови у 10-25 случайно выбранных птиц из каждой группы. Определяли титры антител с обоими тест-наборами ИФА. В. Тест-наборы ИФА для определения титров антител против вируса ИББ Были использованы 2 тест-набора для ИФА: Proflock IBD Ab test и «усовершенствованный» тестнабор Proflock Plus IBD Ab test (Synbiotics, Сан-Диего, США). Оба тест-набора предназначены для проведения непрямого ИФА и распознают антитела как против классического, так и против вариантных штаммов вируса ИББ. Оба тест-набора основаны на одном принципе. Специфические антитела против ИББ в тестируемых сыворотках крови формируют комплекс антиген-антитело с поверхностным антигеном, связанным с плашкой. Комплекс антиген-антитело выявляется конъюгатом пероксидазы (анти-куриные IgG(H+L). Разница между двумя тест-наборами основана на свойствах антигена вируса ИББ, покрывающего плашки. В тест-наборе Proflock IBD Ab test используется антиген, полученный из классического штамма, выращенного на клеточной культуре. В тест-наборе Proflock Plus IBD Ab test используется нативный антиген классического штамма, полученный из бурсы. Тест-набор Proflock Plus IBD Ab test позволяет более точно определить защитные антитела к VP2 вируса ИББ. Этот «усовершенствованный» тест-набор более чувствителен, чем классический и хорошо коррелирует с результатами РН (Lamichhane et al., персональное сообщение). Порог позитивности установлен в титре 554 для Proflock IBD Ab test и в титре 1002 для Proflock Plus IBD Ab test. С. Представление данных Полученные данные представлены в графическом виде, либо в виде кривой значений со стандартными отклонениями, либо в виде «биржевой» диаграммы. Такие диаграммы показывают распределение установленных данных вдоль определенных линий, разделяющих данные на 4 партии с использованием медиан и квартилей. Отклонения (чрезвычайно малые или большие значения) также указываются. Результаты А. Кинетика гуморального ответа Бройлеры. Было проведено несколько опытов. Кинетика гуморального ответа в разных опытах была сопоставима. В связи с этим показаны только результаты репрезентативных опытов для каждой вакцины. После начального снижения уровня материнских антител в течение первых двух недель жизни, значения гуморального ответа, определенные в ИФА, зависели от типа введенной вакцины (диаграммы 1–3). Диаграмма 1а БРОЙЛЕРЫ PROFLOK Plus IBD Ab test 14000 титр антител ИФА титр антител ИФА 16000 БРОЙЛЕРЫ PROFLOK IBD Ab test 8000 6000 4000 2000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 день 1 день 21 день 28 день 1 день 42 «средняя» вакцина ИББ на 18 и 24 дни VAXXITEK® in ovo БРОЙЛЕРЫ PROFLOK IBD Ab test 10000 титр антител ИФА титр антител ИФА день 42 БРОЙЛЕРЫ PROFLOK Plus IBD Ab test 12000 8000 день 28 «средняя» вакцина ИББ на 18 и 24 дни VAXXITEK® in ovo Диаграмма 1б 10000 день 21 6000 4000 2000 0 8000 6000 4000 2000 0 день 1 день 17 день 26 день 45 день 56 день 1 «средняя» вакцина ИББ на 17 и 24 дни VAXXITEK® п/к 1 д. день 17 день 26 день 45 день 56 «средняя» вакцина ИББ на 17 и 24 дни VAXXITEK® п/к 1 д. Диаграмма 1 – Средние значения титров антител к ИББ в ИФА (± стандартное отклонение) у бройлеров, вакцинированных «средними» живыми вакцинами и Vaxxitek® HVT+IBD (in ovo (диаграмма 1а) или подкожно (диаграмма 1б)). БРОЙЛЕРЫ PROFLOK IBD Ab test БРОЙЛЕРЫ PROFLOK Plus IBD Ab test 14000 титр антител ИФА титр антител ИФА 10000 8000 6000 4000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 2000 0 0 день 1 день 15 день 29 день 42 день 54 день 1 «средняя плюс» вакцина ИББ на 15 д. VAXXITEK® п/к 1 д. день 15 день 29 день 42 день 54 «средняя плюс» вакцина ИББ на 15 д. VAXXITEK® п/к 1 д. Диаграмма 2 – Средние значения титров антител к ИББ в ИФА (± стандартное отклонение) у бройлеров, вакцинированных «средней плюс» живой вакциной и Vaxxitek® HVT+IBD (подкожно в суточном возрасте). БРОЙЛЕРЫ PROFLOK IBD Ab test 8000 БРОЙЛЕРЫ PROFLOK Plus IBD Ab test 12000 титр антител ИФА титр антител ИФА 10000 6000 4000 2000 8000 6000 4000 2000 0 0 день 1 день 21 день 42 день 1 ИББ вакцина на основе иммунного комплекса in ovo VAXXITEK® in ovo день 21 день 42 ИББ вакцина на основе иммунного комплекса in ovo VAXXITEK® in ovo Диаграмма 3 – Средние значения титров антител к ИББ в ИФА (± стандартное отклонение) у бройлеров, вакцинированных живой вакциной на основе иммунного комплекса и Vaxxitek® HVT+IBD (in ovo). Используя классический тест-набор определили, что титры антител оставались низкими у цыплят с 15-дневного до 21/28-дневного возраста, затем они увеличивались. При этом в группе vHVT13 наблюдаемая сероконверсия была ниже, чем в других вакцинированных группах. При использовании тест-набора Proflock Plus IBD Ab test, с 15/17-дневного до 26/29-дневного возраста значения титров антител в группе vHVT13 оставались высокими (>6000). Средние показатели титров у птиц, вакцинированных классическими живыми аттенуированными вакцинами, наоборот, снижались до 21/28 дня (<4000) и затем к 42/45 дню увеличивались, что означает отсутствие защиты у этих птиц. У молодок яичных кроссов птицы форма гуморального ответа после вакцинации в производственных условиях «средними» вакцинами и вакциной vHVT13 была очень схожа с таковой у бройлеров (сравните диаграммы 1 и 4). МОЛОДКИ PROFLOK IBD Ab test 8000 МОЛОДКИ PROFLOK Plus IBD Ab test 12000 10000 6000 8000 4000 6000 4000 2000 2000 0 0 день 1 день 8 день 15 день 22 день 29 день 36 день 1 день 8 день 15 день 22 день 29 день 36 «средняя» вакцина ИББ на 18 и 24 дни VAXXITEK® п/к 1 д. «средняя» вакцина ИББ на 18 и 24 дни VAXXITEK® п/к 1 д. Диаграмма 4 – Средние значения титров антител к ИББ в ИФА (± стандартное отклонение) у молодок яичных кроссов птицы, вакцинированных «средней» живой вакциной и Vaxxitek® HVT+IBD (подкожно в суточном возрасте). В.Опыт на молодках яичных кроссов птицы. Экспериментальная вакцинация / заражение Во всех группах при использовании обоих тест-наборов: классического и Proflock Plus IBD Ab test, перед заражением наблюдали снижение титров антител, за исключением группы, вакцинированной vHVT13. Мониторинг с Proflock Plus IBD Ab test показал, что титры антител у группы птиц, вакцинированных vHVT13, оставались высокими и стабильными. Отсутствие определяемого иммунного ответа на 42 день в группах, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами, возможно явилось результатом интерференции с материнскими антителами во время вакцинации. После заражения при использовании обоих тест-наборов было отмечено значительное возрастание титров антител во всех группах, за исключением группы, вакцинированной vHVT13, в которой отмечался только небольшой рост (график 5). Основываясь на клинических признаках, проявляющихся после заражения, полную защиту наблюдали в группе птиц, вакцинированных vHVT13, и частичную защиту у птиц, вакцинированных «средней» или «средней плюс» вакциной. МОЛОДКИ В ИЗОЛЯТОРАХ PROFLOK IBD Ab test 8000 МОЛОДКИ В ИЗОЛЯТОРАХ PROFLOK Plus IBD Ab test 14000 титр антител ИФА титр антител ИФА 12000 6000 4000 заражение 2000 заражение 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 день 1 день 17 день 31 день 42 день 53 день 1 «средняя» вакцина ИББ на 17 и 25 дни «средняя» вакцина ИББ на 17 и 25 дни контрольная группа без заражения VAXXITEK® п/к 1 д. «средняя плюс» вакцина ИББ на 17 д. контрольная группа с заражением день 17 день 31 день 42 день 53 «средняя» вакцина ИББ на 17 и 25 дни «средняя» вакцина ИББ на 17 и 25 дни контрольная группа без заражения VAXXITEK® п/к 1 д. «средняя плюс» вакцина ИББ на 17 д. контрольная группа с заражением График 5 – Средние значения титров антител к ИББ в ИФА у молодок яичных кроссов птицы, содержащихся в изоляторах, невакцинированных и вакцинированных «средними», «средней плюс» живыми вакцинами и Vaxxitek® HVT+IBD (подкожно в суточном возрасте). Все группы были заражены на 42 день, за исключением одной группы невакцинированных молодок. С. Гуморальный ответ, соответствующий статусу вакцинации, в течение 2 периодов жизни Все результаты по уровням титров антител, полученные с первого по 56 день в производственных испытаниях на бройлерах, вакцинированных различными вакцинами, были объединены (количество образцов n = 2472). Так как производственных результатов по восприимчивым (не вакцинированным и не инфицированным) и зараженным вирусом ИББ бройлерам в нашем распоряжении не было, мы использовали показатели титров антител, выявленные у молодок яичных кроссов птицы, содержащихся в изоляторе, зараженных или не зараженных (n = 200 образцов). Гуморальный ответ, наблюдаемый в течение 2 периодов жизни (от 21 дня до 31 и от 42 дня до 56), представлен на диаграмме 6. 6 4 2 0 вакцина PROFLOK IBD, возраст 42–56 дн. (бройлеры) PROFLOK Plus IBD, возраст 42–56 дн. (бройлеры) 16 1 восприимчивая птица восприимчивая птица иммунный комплекс VAXXITEK® «средняя плюс» 0 8 иммунный комплекс 1 10 VAXXITEK® 2 12 «средняя» ELISA титр (х 1000,0) 3 «средняя» ELISA титр (х 1000,0) 4 вакцина PROFLOK Plus IBD, возраст 21–31 дн. (бройлеры) 14 «средняя плюс» PROFLOK IBD, возраст 21–31 дн. (бройлеры) 5 6 4 2 восприимчивая птица вакцина инфицированные 0 иммунный комплекс восприимчивая птица инфицированные иммунный комплекс VAXXITEK® вакцина «средняя плюс» 0 8 VAXXITEK® 0,2 10 «средняя плюс» 0,4 12 «средняя» ELISA титр (х 1000,0) 0,6 «средняя» ELISA титр (х 1000,0) 14 0,8 Диаграмма 6 – Распределение значений титров антител к ИББ в ИФА у бройлеров с разным статусом в течение двух периодов жизни. В течение периода 21–31 день при использовании классического тест-набора ИФА были выявлены сравнительно низкие титры антител во всех группах, тогда как при использовании Proflock Plus IBD Ab test более высокие титры антител наблюдали в группе vHVT13. В период 42–56 дней значения титров антител в группе vHVT13 были ниже, чем в других вакцинированных и инфицированных группах в классическом IBD ELISA test, и отмечались высокие титры во всех вакцинированных и инфицированных группах в Proflock Plus IBD Ab test (диаграмма 6). Такую стратегию с определением иммунного статуса птиц на каждом периоде жизни с использованием обоих тест-наборов ИФА, можно постоянно использовать с целью дифференциации цыплят, вакцинированных vHVT13 от цыплят восприимчивых, инфицированных или вакцинированных классическими вакцинами (таблица 7). PROFLOK Plus IBD Ab test возраст 21–31 дн. +++ +++ + или – не наблюдается* PROFLOK IBD Ab test + или – птица, вакцинированная Vaxxitek® PROFLOK Plus IBD Ab test возраст 42–56 дн. маловероятно +++ + или – +++ инфицированные или вакцинированные «средними» живыми вакцинами маловероятно + или – птица, вакцинированная Vaxxitek® восприимчивая птица PROFLOK IBD Ab test птица, вакцинированная «средними» живыми вакцинами или восприимчивая * По данным наших исследований, но может встречаться при раннем заражении вирусом ИББ. Таблица 7 – Иммунный ответ, соответствующий вакцинному статусу в течение двух периодов жизни. D. Общий гуморальный ответ в группах, вакцинированных vHVT13 Вакцинация vHVT13 in ovo или подкожно в суточном возрасте. После вакцинации vHVT13 гуморальный ответ у бройлеров в возрасте с 21 по 56 день был одинаков, независимо от способа введения (in ovo n = 370; или подкожно в суточном возрасте n = 700) (диаграмма 8). PROFLOK Plus IBD иммунный ответ с 21 по 56 дн. (бройлеры) 15 8 ELISA титр (х 1000,0) ELISA титр (х 1000,0) PROFLOK IBD иммунный ответ с 21 по 56 дн. (бройлеры) 6 4 2 0 in ovo п/к в 1 д. 12 9 6 3 0 in ovo вакцинация п/к в 1 д. вакцинация Диаграмма 8 – Распределение значений титров антител к ИББ в ИФА у бройлеров после вакцинации Vaxxitek® HVT+IBD методом in ovo или подкожно в суточном возрасте. Распределение титров антител, определенных с тест-набором Proflock Plus IBD Ab test. Из всех образцов сывороток, собранных в различных опытах у бройлеров в возрасте с 21 по 56 день жизни (всего 1101 образец), антитела не выявлялись только в 4 образцах (0,4%). В 93% образцов титры антител были выше 4000 (диаграмма 9). Среднее значение титра антител составляло 8345 (разброс от 0 до 14737) с коэффициентом вариации 30%. 45% Бройлеры, вакцинированные Vaxxitek® PROFLOK Plus IBD Ab test 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Ab < 2000 b < 4000 Ab < 6000 Ab < 8000 Ab < 10000 Ab < 12000 Ab < 15000 ELISA титр Диаграмма 8 – Распределение значений титров антител к ИББ в ИФА у бройлеров после вакцинации Vaxxitek® HVT+IBD методом in ovo или подкожно в суточном возрасте. Оценка эффективности вакцинации vHVT13 Отбирали пробы сыворотки крови в одном из стад бройлеров, вакцинированных vHVT13 в суточном возрасте. Значение титров антител, определенное с использованием тест-набора Proflock Plus IBD Ab test, было аномально низким, стремящимся к 2500 на 30 день жизни (данные не приведены). В инкубатории на 800 цыплятах из 90 000 была проведена проверка с использованием голубой краски. Выяснилось, что более 20% цыплят не были вакцинированы надлежащим образом в результате чрезвычайно высокой скорости работы персонала в сочетании с некоторыми техническими проблемами с автовакцинатором. Обсуждение При вакцинации главной проблемой является наличие у цыплят материнских антител к вирусу ИББ, поскольку они могут интерферировать с классическими живыми аттенуированными вакцинами, такими как «средние», «средние плюс» и вакцины на основе иммунных комплексов. В присутствии материнских антител иммунизация классическими вакцинами остается рискованной. После исчезновения материнских антител птица, которая не ответила на вакцинацию, остается восприимчивой к инфекции вируса ИББ. Полученные нами результаты ИФА иллюстрируют отсутствие защиты, наблюдаемое приблизительно между 15 и 28 днями жизни в группах, вакцинированных аттенуированными живыми вакцинами (включая вакцину на основе иммунного комплекса). Напротив, при использовании специфического тест-набора IBD Plus, коррелирующего с реакцией нейтрализации, активный и сильный анти-VP2 ответ наблюдали с 15 дня жизни у цыплят, вакцинированных vHVT13 (Vaxxitek® HVT+IBD). Поэтому отсутствия защиты в промежутке с 3 по 5 неделю жизни, в наиболее опасный период в отношении заражения вирусом ИББ, не наблюдали. Такой более ранний ответ может быть получен в результате того, что эффективность vHVT13 не снижается в присутствии высокого уровня материнских антител, и вакцина, следовательно, может быть введена либо методом in ovo, либо цыплятам суточного возраста. Клеточно-ассоциированная структура вакцины vHVT13 (состоящей из vHVT13-инфицированных эмбриональных фибробластов), отсутствие экспрессии VP2 на поверхности инфицированных клеток или векторного вируса HVT, и способ репликации вектора vHVT13, по всей видимости, придают вакцине свойство преодолевать барьер материнских антител (Bublot et al., 2007). 10 Анти-VP2 антитела, индуцированные вакциной vHVT13, являются защитными, как уже было описано (Goutrbroze et al., 2003; Bublo et al., 2007) и как подтверждено экспериментами по вакцинации и заражению на молодках яичных кроссов птицы в условиях изолятора и на бройлерах. Интересно, что иммунный ответ, выявляемый «классическим» IBD-набором ИФА, был ниже в группах, вакцинированных vHVT13, и сравнительно более высоким в группах, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами. Это можно объяснить свойствами антигена, использованного для выявления антител. В «классическом» IBD-наборе используется антиген классического культурального происхождения, а в IBD Plus ИФА тест-наборе используется вирус, выращенный в бурсе. Время от времени появляются сообщения, что вирус, адаптированный к культуре тканей, антигенно меняется. Например, моноклональные антитела 21 распознавали все высоко вирулентные штаммы вируса ИББ, но не связывали адаптированный к клеточной культуре вирус (Mengel-Whereat, 1995; Vakharia et al., 2000). Нейтрализующие моноклональные антитела 8 выявляли расположение антигенных детерминант вируса ИББ и распознавали только вирус, выращенный в бурсе, но не вирус, адаптированный к клеточной культуре (Lamichane et al, персональное сообщение). Аминокислоты, участвующие в адаптации к культуре клеток, вирулентности и клеточном тропизме вируса ИББ, были картированы в гипервариабельной области VP2 (обозначаемой также как Р домен) (Boot et al., 2000; Brandt et al., 2001, Letzel et al., 2007; Lim et al., 1999; Mundt, 1999; van Loon et al., 2002). С учетом факта, что адаптация к клеточным культурам может менять антигенность VP2, был разработан новый тестнабор ИФА – Proflock Plus IBD Ab test, в котором плашки покрыты нативным (натуральным) антигеном вируса ИББ бурсального происхождения. Этот улучшенный тест более чувствителен, чем классический и коррелирует с тестированием в РН (Lamichhance et al., персональное сообщение). Наши результаты демонстрируют, что vHVT13 индуцирует у бройлеров и молодок яичных кроссов птицы одинаковый активный иммунный ответ. У бройлеров, вакцинированных vHVT13, гуморальный ответ одинаков, независимо от способа введения, методом in ovo или подкожно (диаграмма 8). Для оценки эффективности вакцинации или персистенции антител очень полезно вести серомониторинг стада. После вакцинации vHVT13 титры антител обычно бывают выше 4000 в течение периода 21-56 день при использовании тест-набора ELISA Plus test (диаграмма 9). Коэффициент вариации в vHVT13-вакцинированной группе обычно бывает удовлетворительным (≤30%), что свидетельствует о гомогенном иммунном ответе. Доля «не ответивших» была низкой (0,4% от общего количества тестированных птиц). Более высокое количество «не ответивших» птиц, наблюдаемое на одной из ферм, может отражать проблему, существовавшую на момент вакцинации. Серологический мониторинг также является ключевым в диагностике полевой инфекции, которая может иметь драматические последствия, особенно с высоко вирулентными штаммами вируса ИББ. Использование векторной вакцины vHVT13 предоставляет возможность дифференцировать восприимчивых, вакцинированных или зараженных полевым вирусом цыплят. При комбинированном использовании двух IBD-тест-наборов ИФА можно эффективно контролировать производственную ситуацию, различая антитела, индуцированные vHVT13 (антитела только против VP2, выявляемые с тест-набором Proflock Plus IBD Ab test) и антитела, индуцированные инфекцией вируса ИББ (включая анти-VP3, выявляемые классическим тест-набором ИФА). Высокие титры антител были выявлены у цыплят, инфицированных вирусом ИББ, или у цыплят, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами, с использованием обоих тест-наборов. В то же время, цыплята, вакцинированные vHVT13, имели высокие титры антител с тест-набором ИФА IBD Plus test и низкие при исследовании с «классическим» тест-набором (диаграмма 7). Применяемые в настоящее время ИФА IBD тест-наборы не позволяют дифференцировать инфицированных цыплят и цыплят, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами. Это является проблемой, особенно если выявляют поражения бурсы. В отличие от vHVT13 классические вакцины, даже содержащие «средние» штаммы, могут также индуцировать поражение бурсы, и единственный путь отличить вакцинированных цыплят от зараженных – это амплифицировать и секвенировать РНК штамма вируса ИББ, ответственного за поражение бурсы (Block et al., 2007; Bublo et al., 2007). В заключение, очень ранний активный иммунный ответ может быть индуцирован у цыплят после вакцинации vHVT13 in ovo или в суточном возрасте, даже в присутствии высокого уровня материнских антител. 11 Отсутствие защиты, наблюдаемое у всех птиц, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами, тестированных в возрасте 3-5 недель, не выявляется у птиц, вакцинированных vHVT13. Индукция антител вакциной vHVT13 может быть измерена с использованием тест-набора ИФА IBD Plus test, полученные данные коррелируют с результатами РН. Комбинированное использование «классического» тест-набора ИФА и тест-набора ИФА IBD Plus test предоставляет возможность дифференцировать птиц, вакцинированных vHVT13, и птиц, инфицированных или вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами. Ссылки 1. Al-Natour MQ, Ward LA, Saif YM, Stewart-Brown B, Keck LD. Effect of diffferent levels of maternally derived antibodieson protection against infectious bursal disease virus. Avian Dis. 2004 Jan-Mar;48(1):177-82. 2. Becht H, Muller H, Muller HK. Comparative studies on structural and antigenic propertiesof two serotypes of infectious bursal disease virus. J Gen Virol. 1988 Mar; 69 (Pt3): 631-40. 3. Block H, Meyer-Block K, Rebeski DE, Scharr H, de Wit S, Rohn K, Rautenschlein S. A field study on the significance of vaccination against infectious bursal disease virus (IBDV) at the optimal time point inbroiler flocks with maternally derived IBDVantibodies. Avian Pathol. 2007; 36 (5):401-409. 4. Boot HJ, ter Huurne AA, Hoekman AJ, Peeters BP, Gielkens AL. Rescue of very virulent and mosaic infectious bursal disease virus from cloned cDNA: VP2 is not the sole determinant of the very virulent phenotype. J Virol. 2000 Aug; 74 (15): 6701-11. 5. Bottcher B, Kiselev NA, Stel’Mashchuk VY, Perevozchikova NA, Borisov AV, Crowther RA. Three-dimensional structure of infectious bursal disease virus determined by electron cryomicroscopy. J Virol. 1997 Jan;71(1):325-30. 6. Brandt M, Yao K, Liu M, Heckert RA, Vakharia VN. Molecular determinants of virulence, cell tropism, and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus. J Virol. 2001 Dec;75(24):11974-82. 7. Bublot M, Pritchard N, Le Gros FX, Goutebroze S. Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody. J Comp Pathol. 2007 Jul;137 Suppl 1:S81-4. Review. 8. Darteil R, Bublot M, Laplace E, Bouquet JF, Audonnet JC, Riviere M. Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 immunogen induce protection against an IBDV virulent challenge in chickens. Virology.1995 Aug 20;211(2):481-90. 9. de Wit JJ. Gumboro Disease: estimation of optimal time of vaccination by the Deventer formula. Annual report and proceedings of COST Action 839: Immunosuppressive viral diseases in Poultry. Luxembourg (2001) pp 170-178. 10.Fahey KJ, McWaters P, Brown MA, Erny K, Murphy VJ, Hewish DR.Virus-neutralizing and passively protective monoclonal antibodies to infectious bursal disease virus of chickens. Avian Dis. 1991 Apr-Jun;35(2):365-73. 11.Goutebroze S, Curet M, Jay ML, Roux C, Le Gros FX. Efficacy of a recombinant vaccine HVT-VP2 against Gumboro disease in the presence of maternal antibodies. Br Poult Sci. 2003 Dec;44 (5): 824-5. 12.Jackwood DJ, Sommer SE, Odor E. Correlation of enzyme-linked immunosorbent assay titers with protection against infectious bursal disease virus. Avian Dis. 1999 Apr-Jun;43(2):189-97. 13.Letzel T, Coulibaly F, Rey FA, Delmas B, Jagt E, van Loon AA, Mundt E. Molecular and structural bases for the antigenicity of VP2 of infectious bursal disease virus. J Virol.2007 Dec;81(23):12827-35. 14.Lim B L, Cao Y, Yu T, Mo C W. Adaptation of very virulent infectious bursal disease virus to chicken embryonic fibroblasts by sitedirected mutagenesis of residues 279 and 284 of viral coat protein VP2. J. Virol. 1999,73, 2854–62. 15.Lukert PD, Saif YM. Infectious bursal disease.In: BW Calnek, HJ Barnes, CW Beard, LR McDougald, YM Saif (Eds), Diseases of Poultry, 10th ed., Iowas State University Press, Ames, IA, 1997, pp. 721-738. 16.Macreadie IG, Vaughan PR, Chapman AJ, McKern NM, Jagadish MN, Heine HG, Ward CW, Fahey KJ, Azad AA. Passive protection against infectious bursal disease virus by viral VP2 expressed in yeast. Vaccine. 1990 Dec;8(6):549-52. 17.Martin AM, Fallacara F, Barbieri I, Tosi G, Rivallan G, Eterradossi N, Ceruti R, Cordioli P. Genetic and antigenic characterization of infectious bursal disease viruses isolated in Italy during the period 2002-2005. Avian Dis. 2007 Dec;51(4):863-72. 18.Mengel-Whereat, SA. Development of a monoclonal antibody for the detection of highly virulent classic infectious bursal disease virus. M.S. thesis.1995 University of Maryland, College Park. 19.Muller H, Islam MR, Raue R. Research on infectious bursal disease--the past, the present and the future. Vet Microbiol. 2003 Dec 2;97(1-2):153-65. 20.Mundt E. Tissue culture infectivity of different strains of infectious bursal disease virus is determined by distinct amino acids in VP2. J. Gen. Virol. 1999, 80:2067–76. 21.Oppling V, Muller H, Becht H. The structural polypeptide VP3 of infectious bursal disease virus carries group- and serotypespecific epitopes. J Gen Virol. 1991 Sep;72 ( Pt 9):2275-8. 22.Saif YM. Infectious bursal disease and hemorrhagic enteritis. Poult Sci. 1998 Aug;77(8):1186-9. 23.Schnitzler D, Bernstein F, Muller H, Becht H. The genetic basis for the antigenicity of the VP2 protein of the infectious bursal disease virus. J Gen Virol. 1993 Aug;74 ( Pt8):1563-71. 24.Vakharia VN, Snyder DB, Mengel-Whereat SA. Chimeric infectious bursal disease virus cDNA clones, expression products and vaccines based thereon. December 2000. U.S.patent 6,156,314. 25.van den Berg TP, Infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathol. 2000; 29:175-194. 26.van Loon AA, de Haas N, Zeyda I, Mundt E, Alteration of amino acids in VP2 of very virulent infectious bursal disease virus results in tissue culture adaptation and attenuation in chickens, J Gen Virol. 2002 Jan;83 (Pt 1):121-9. 12
