ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н. БАХА

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н. БАХА
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
ТАРАНОВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА
КОМПЛЕКСЫ АНТИТЕЛ С НАНОДИСПЕРСНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ:
СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ
03.01.04 Биохимия
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Научные руководители:
доктор химических наук,
профессор Б.Б. Дзантиев
кандидат биологических наук
А.В. Жердев
МОСКВА 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................... 5
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................. 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 9
1.1 Иммунохимические тест-методы.................................................................................... 9
1.1.1 Агглютинационный иммуноанализ ........................................................................... 13
1.1.2 Тест-системы, основанные на принципе иммуноферментного анализа ............... 15
1.1.3 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ ............................................... 18
1.1.4 Методы иммуноанализа на основе резонансного переноса энергии .................... 20
1.1.5 Иммунофильтрация ..................................................................................................... 23
1.1.6 Иммуноаффинные колонки ........................................................................................ 24
1.1.7 Микрофлюидные тест-системы ................................................................................. 25
1.1.8 Иммунохроматография ............................................................................................... 26
1.2. Маркеры для тест-систем: сравнительная характеристика ...................................... 29
1.3 Мультиплексная детекция и иммунохимические тест-методы ................................ 40
1.4. Кинетика иммунохимических взаимодействий в тест-системах и ее
математические описания .................................................................................................... 46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................. 56
2.1 Материалы и оборудование ........................................................................................... 56
2.2 Методы ............................................................................................................................. 58
2.2.1 Синтез конъюгата хлорамфеникол-соевый ингибитор трипсина .......................... 58
2.2.2 Определение титров антител против антибиотиков методом твердофазного
иммуноферментного анализа .............................................................................................. 59
2.2.3 Определение антибиотиков методом конкурентного твердофазного
иммуноферментного анализа .............................................................................................. 59
2.2.4 Синтез, выделение и характеристика конъюгатов квантовых точек с антителами
................................................................................................................................................. 60
2.2.5 Получение наночастиц коллоидного золота ............................................................ 62
2.2.6 Получение флоккуляционной кривой для взаимодействия коллоидного золота с
антителами ............................................................................................................................. 62
2.2.7 Синтез конъюгата антител с коллоидным золотом ................................................. 62
2
2.2.8 Определение относительного квантового выхода свободных квантовых точек и
их конъюгатов ....................................................................................................................... 63
2.2.9 Определение гидродинамических радиусов наночастиц и их конъюгатов с
антителами ............................................................................................................................. 63
2.2.10 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов методом
просвечивающей электронной микроскопии .................................................................... 64
2.2.11 Изготовление иммунохроматографических тест-систем ..................................... 65
2.2.12 Проведение иммунохроматографического анализа .............................................. 71
2.2.13 Определение аналитических характеристик тест-систем ..................................... 71
2.2.14 Измерение констант иммунохимических реакций антител против
хлорамфеникола и их конъюгата с квантовыми точками с использованием прибора
Biacore X ................................................................................................................................ 72
2.2.15 Расчет констант взаимодействия антитело-антиген, полученных с
использованием прибора Biacore X .................................................................................... 73
2.2.16 Определение титров антител против иммуноглобулина E методом
твердофазного иммуноферментного анализа .................................................................... 73
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................. 75
3.1 Синтез конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами ................................... 75
3.1.1 Синтез конъюгата квантовых точек с антителами .................................................. 75
3.1.2 Синтез конъюгата коллоидного золота с антителами ............................................. 78
3.2 Сравнительная характеристика нанодисперсных маркеров и их конъюгатов ........ 81
3.2.1 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов ........................................ 81
3.2.2 Характеристика оптических свойств квантовых точек и их конъюгатов............. 88
3.2.3 Пределы детекции маркеров ...................................................................................... 93
3.2.4 Оценка антигенсвязывающей способности конъюгатов квантовых точек .......... 97
3.2.5 Характеристика состава конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами . 103
3.3 Разработка иммунохроматографических тест-систем на основе квантовых точек
............................................................................................................................................... 107
3.3.1 Разработка и апробация иммунохроматографической тест-системы на основе
квантовых точек для определения хлорамфеникола в молоке ..................................... 108
3.3.2 Разработка и апробация иммунохроматографической тест-системы на основе
КвТ для определения иммуноглобулина E ...................................................................... 127
3
3.4 Разработка мультиплексных иммунохроматографических тест-систем ............... 143
3.4.1 Мультиплексная иммунохроматографическая тест-система с использованием
квантовых точек .................................................................................................................. 144
3.4.2 Мультиплексная иммунохроматографическая тест-система на основе
двумерного массива зон связывания ................................................................................ 158
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................... 174
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
............................................................................................................................................... 176
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................. 179
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................. 180
4
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТ – антитела
ББ – боратный буфер
БСА – бычий сывороточный альбумин
ДМФА – N,N-диметилформамид
ДРС – динамическое рассеяние света
ИФА – иммуноферментный анализ
ИХА – иммунохроматографический анализ
КвТ – квантовые точки
КЗ – коллоидное золото
ОВА – овальбумин
ОФЛ – офлоксацин
ПрО – предел обнаружения
ПФИА – поляризационный флуоресцентный иммуноанализ
ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия
СИТ – соевый ингибитор трипсина
СТМ – стрептомицин
ТМБ – 3,3',5,5'-тетраметилбензидин
ФБС – фосфатный буфер солевой
ФБСТ – ФБС с 0,05% Тритона Х-100
ХФ – хлорамфеникол
CCMS – 1-циклогексил-3-(2-морфолино-этил)карбодиимидмето-п-толуол сульфонат
(1-cyclohexyl-3-(2-morpholiny-(4)-ethyl)carbodiimide (me-p-tol sulfonate))
EDC
–
гидрохлорид
N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид
(N-(3-
dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)
FRET– резонансный перенос энергии Форстера (Förster resonance energy transfer)
IgE – иммуноглобулин Е
sulfo-NHS – сульфо-N-гидроксисукцинимид натрия (sulfo-N-hydroxysuccinimide)
UCP – преобразующие флуорофоры (up-converting phosphors)
5
ВВЕДЕНИЕ
В последние десятилетия биохимические методы активно применяются для
детекции широкого круга соединений, что обусловлено уникальной специфичностью
взаимодействий, характерной для многих классов биомолекул. К биохимическим
относят методы анализа, основанные на процессах трансформации соединений или
образовании межмолекулярных комплексов, осуществляемых с использованием
рецепторных биологических молекул – ферментов, антител, нуклеиновых кислот и др.
[1]. Исходя из основных требований, предъявляемых к анализу, – чувствительности и
специфичности – наиболее перспективны иммунохимические методы анализа,
основанные на высокоаффинном и специфичном взаимодействии антиген–антитело.
Иммунохимические методы анализа востребованы в клинической диагностике,
ветеринарии, оценке безопасности потребительской (прежде всего пищевой)
продукции, экологическом мониторинге [1].
К современным иммуноаналитическим методам предъявляются следующие
требования [2]: экспрессность (не более 30 мин.); простота реализации; высокая
чувствительность и точность детекции; высокая производительность; возможность
проведения внелабораторного анализа. Аналитические методы должны сочетать
высокую чувствительность и специфичность с экспрессностью и возможностью
проводить одновременное определение многих соединений (мультиплексностью) как
в лабораторных, так и во внелабораторных условиях.
Этим требованиям соответствует ряд современных иммуноаналитических систем,
но особое внимание привлекают тест-методы. Данное название объединяет простые
аналитические методы, которые позволяют быстро и с минимальной трудоемкостью
оценивать присутствие и / или содержание контролируемого соединения в пробе [1; 3].
Особое значение тест-методы имеют при проведении анализа «на месте», вне
лабораторий. Такой режим тестирования исключает необходимость в дорогом
стационарном оборудовании, экономит время и средства на получение результатов и
принятие основывающихся на них решений.
С учетом современного состояния исследований и разработок можно выделить
два наиболее перспективных направления в создании новых иммунохимических тест-
6
методов – применение в анализе новых маркеров и реализация мультиплексного
анализа.
Использование маркеров в иммуноанализе существенно снижает пределы
обнаружения
детектируемых
соединений.
Применение
в
качестве
маркеров
наночастиц обеспечивает простоту детекции, высокую воспроизводимость результатов
и ускорение специфических взаимодействий, лимитирующих время анализа. Детекция
наномаркеров может проводиться непосредственно на основании их оптических,
электрических, магнитных или иных свойств, что исключает необходимость в
дополнительных реагентах и стадиях анализа, возникающую, например, при работе с
ферментными метками. С учетом вышеизложенного нанодисперсные частицы
являются перспективными носителями и маркерами в системах качественного и
количественного определения различных соединений.
С
ростом
разнообразия
наночастиц
возникает
необходимость
оценки
эффективности их использования в качестве маркеров для аналитических систем.
Однако их выбор продолжает оставаться в значительной степени эмпирическим.
Доказательная сравнительная характеристика традиционных и новых аналитических
маркеров имеет существенное значение для развития современных тест-методов.
Расширение знаний о молекулярных механизмах патологических процессов,
разнообразии
токсичных
контаминант
обуславливают
востребованность
аналитических методов, позволяющих одновременно проводить быстрое определение
большого количества соединений [4-6]. Однако большинство существующих на
сегодняшний день иммунохимических тест-систем предназначено для детектирования
единственного соединения. Увеличение количества детектируемых соединений
приводит к усложнению систем и методик проведения анализа, выводя его за рамки
тест-методов.
Поэтому
необходимы
новые
решения,
повышающие
число
одновременно контролируемых веществ без потерь в экспрессности, чувствительности
и достоверности определения.
С учетом вышеизложенного, целью настоящей работы является изучение свойств
комплексов антител с нанодисперсными маркерами разной природы и применение
полученных реагентов для разработки новых иммунохроматографических тест-систем.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач,
определяющих структуру исследования:
7
1)
охарактеризовать размерные и оптические свойства комплексов антител с
наномаркерами разной природы,
2)
определить и сопоставить кинетические и равновесные константы
взаимодействия с антигеном конъюгата антитело–флуоресцентный маркер и
немодифицированных антител,
3)
изучить закономерности взаимодействия иммунореагентов, меченных
нанодисперсными маркерами, в иммунохроматографических тест-системах с фото- и
флуориметрической детекцией и провести сравнительную оценку этих тест-систем,
4)
разработать
иммунохроматографические
тест-системы
с
одним
и
несколькими флуоресцентными нанодисперсными маркерами и определить их
аналитические параметры,
5)
охарактеризовать
возможности
повышения
информативности
иммунохроматографии посредством проведения анализа с двумерно упорядоченным
массивом зон связывания разной специфичности.
Актуальность тематики диссертационной работы определяется получением
новых данных о применении нанодисперсных маркеров для высокочувствительного
иммуноанализа
и
разработкой
обеспечивающих
сочетание
иммунохроматографических
экспрессности
определения многих соединений.
8
с
возможностью
тест-систем,
одновременного
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Исходя из цели и задач диссертационной работы, рассмотрим современное
состояние
разработок
проведения
анализа
экспрессных
и
иммуноаналитических
регистрации
его
результатов,
систем,
способов
повышения
его
производительности и информативности. В обзоре представлены также теоретические
представления о взаимодействиях иммунореагентов, лежащих в основе аналитических
систем.
1.1 Иммунохимические тест-методы
Согласно [1] тест-методами (тестами) называются экспрессные, простые в
реализации способы оценки присутствия и / или содержания определенного вещества
в пробе. Экспрессность и простота означают, что тест-методы позволяют проводить
идентификацию и определение содержания аналита за минимальное время на месте
отбора проб без предварительной трудоемкой пробоподготовки; при этом проведение
всех стадий анализа и регистрации результатов не требует использования
стационарного оборудования. Тест-методы включают тест-системы и методики
проведения анализа (инструкции).
Для определения соединений с помощью тест-систем могут быть использованы
различные
специфические
взаимодействия
–
фермент-субстратные,
лиганд-
рецепторные и др. Широкий класс тест-методов составляют иммунохимические тестметоды, в основе которых лежит взаимодействие определяемого соединения с
соответствующими антителами [7; 8]. Образующиеся при этом комплексы антигенантитело могут детектироваться либо по изменению физико-химических параметров
среды, либо с помощью меток, связанных с одним из реагентов. Первые разработки
иммунохимических тест-методов (на основе агглютинации) появились в 1950-е годы
[9; 10]. Первоначально иммунохимические тест-методы применялись в рамках
клинической
диагностики,
сейчас
они
получили
большее
распространение:
мониторинг состояния окружающей среды, ветеринария, оценка качества сырья и
продуктов
питания,
безопасности
потребительской
технологических процессов [11; 12].
9
продукции,
контроль
Расширение практического использования иммунохимических тест-методов
вызвано несколькими причинами [13]. Во-первых, всё большее значение приобретает
оперативное получение сведений о рисках для здоровья и безопасности. Во-вторых,
новые
технологические
решения
повышают
конкурентоспособность
иммунохимических тестов, позволяя создавать тесты с высокой чувствительностью,
автоматизацией внелабораторного анализа, совместимые с современными средствами
обработки и накопления информации. Важно также, что иммунохимические тестсистемы могут быть использованы для работы с такими сложными матриксами, как
биологические жидкости, продукты питания и их экстракты.
Иммунохимические тест-методы являются частью более широкого понятия
«иммунохимические методы анализа». Часть иммуноаналитических методов имеет
портативную автономную реализацию и может быть отнесена к тест-методам, тогда
как другие варианты иммуноанализа реализуются исключительно в стационарных
условиях. Это разделение не постоянно; оно зависит от развития технологий
изготовления компонентов аналитических систем и средств измерений и меняется с
появлением новых технологических решений. Поэтому мы рассмотрим только
современные возможности создания иммунохимических тест-систем (рис. 1).
Ввиду значительного разнообразия для иммунохимических методов анализа
предлагаются различные классификации [7; 14; 15]. По режиму взаимодействия их
можно разделить на гомогенные и гетерогенные методы [16]. Гомогенный анализ
основан на реакциях, протекающих в растворе. В случае гетерогенного анализа
образование детектируемых иммунных комплексов идет с участием носителя –
твердой подложки, мембраны, геля и пр.
Иммуноаналитические
методы
можно
также
разделить
по
способу
детектирования образующихся иммунных комплексов: прямые – без использования
маркеров (например, преципитация), косвенные – детектируемый сигнал формируется
с помощью меток (латекс-агглютинация, иммунохроматография, иммуноферментный
анализ и др.). Способ детекции результатов анализа зависит от природы маркера, он
может быть оптическим, флуоресцентным, электрохимическим и др.
Как отмечалось выше, далеко не все виды иммунохимического анализа
трансформируются в формат тест-методов или имеют портативные варианты
реализации. Так, например, классический ИФА, капиллярный электрофорез, проточно10
инжекционный
анализ
характеризуются
значительной
продолжительностью,
необходимостью сложного аппаратурного обеспечения и отсутствием (во всяком
случае, на сегодняшний день) компактных тест-систем.
Успешно трансформируются в тест-системы следующие иммунохимические
методы: агглютинация, иммуноферментный анализ в кинетическом режиме, методы на
основе резонансного переноса энергии с флуоресцентной и хемилюминесцентной
регистрацией, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, иммунофильтрация,
иммунохроматография (см. рис. 1). Перечисленные виды анализа переходят в разряд
тест-методов при условии специальной комплектации набора для проведения
тестирования, включающей все необходимые реагенты в готовой к применению
форме, что сокращает время и снижает трудоемкость определения. Использование
тест-методов предполагает возможность быстрой нетрудоемкой фиксации получаемых
результатов. Например, для оптической детекции проводится визуальная оценка или
использование портативных приборов на основе фотоэлектронного умножителя, CCDкамер и др. [17; 18].
Рассмотрим более подробно существующие иммунохимические тест-методы, их
сравнительные преимущества и недостатки.
11
Рис. 1. Классификация иммунохимических методов анализа и тест-систем: желтый цвет – гомогенные методы анализа; синий
цвет – гетерогенные методы анализа (
– формирование аналитического сигнала с помощью маркеров).
12
1.1.1 Агглютинационный иммуноанализ
В агглютинационном анализе регистрируется осаждение иммунных комплексов,
образующихся в результате взаимодействия антител с содержащимися в тестируемой
пробе молекулами антигена. Для того чтобы иммунный комплекс выпадал в осадок,
антиген должен обладать несколькими сайтами связывания (молекулы антител всегда
поливалентны). Агглютинация относится к гомогенным методам анализа и
подразделяется на несколько видов: прямая агглютинация, латекс-агглютинация,
гемагглютинация. Каждый из вышеперечисленных видов агглютинации может быть
реализован в двух форматах: прямой – осаждение образованного комплекса аналита
пробы и антител (рис. 2, А) и ингибирование (торможение) агглютинации (рис. 2, Б)
[19]. Оценка результатов агглютинации осуществляется, как правило, визуально.
Рис. 2. Принципиальные схемы проведения иммуноанализа, основанного на прямой
агглютинации (А) и ингибирования агглютинации (Б).
Метод прямой агглютинации используется для крупных антигенов и позволяет
определять их только в высоких концентрациях [20]. В качестве дисперсного носителя
13
антител в коммерческих тест-системах, как правило, применяются латексные или
полистирольные частицы. Предел определения аналита с помощью латексагглютинации редко бывает ниже 1 нМ [21], а в большинстве случаев – находится в
микромолярном диапазоне [22]. Метод латекс-агглютинации широко используется для
определения многих аналитов бактериальной природы, специфических антител (см.
работу [23] как один из примеров). Применение окрашенных латексных частиц в
качестве дисперсного носителя в агглютинации позволяет одновременно определять
несколько аналитов с удобной визуальной детекцией [22].
Одним из методов анализа, основанных на осаждении, является гемагглютинация
(осаждение эритроцитов). Для регистрации взаимодействия антиген–антитело в этом
методе используются эритроциты крови с иммобилизованным на их поверхности
антигеном. Гемагглютинация – сравнительно длительный (~1 час) и трудоемкий анализ
[24]. Ограничения гемагглютинации заключаются в нестабильности эритроцитов при
хранении и, соответственно, необходимости свежеприготовленных иммунореагентов.
Метод ингибирования (торможения) агглютинации основан на конкурентном
взаимодействии свободного аналита и аналита, иммобилизованного на поверхности
носителя, со специфическими антителами в растворе [25]. Аналит (обычно
моновалентный) связывается с антителами, оставаясь в растворе и препятствуя
осаждению комплексов антител и поливалентного антигенного препарата. Данный
подход, в отличие от традиционной агглютинации, позволяет детектировать
низкомолекулярные соединения. Как правило, такой анализ проводится с применением
латексных носителей. Отметим, что при регистрации торможения агглютинации
степень агглютинации находится в обратной зависимости от концентрации
определяемого соединения [26].
Для прямой агглютинации, латекс-агглютинации и ее торможения характерны
простота реализации и экспрессность, а также возможность визуальной качественной
(«да-нет») регистрации результатов, что позволяет отнести их к тест-методам.
Существуют коммерческие агглютинационные тест-системы, например, системы для
диагностики мононуклеоза, определения С-реактивного белка, ревматоидного фактора
производства фирм «Ольвекс» (Россия), «Novamed» (Израиль), «BD» (США) и др.
Количественная оценка результатов агглютинации возможна при использовании
турбидиметрии, однако портативные турбидиметрические детекторы с приемлемой
14
чувствительностью и точностью измерений на сегодняшний день не разработаны.
Таким образом, к экспресс-тестам можно отнести реакции агглютинации только в
варианте с качественной детекцией.
1.1.2 Тест-системы, основанные на принципе иммуноферментного анализа
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) в микропланшетном варианте
на сегодняшний день реализован для большого числа соединений и широко
применяется в клинико-диагностической практике. ИФА включает несколько стадий:
предварительную
иммобилизацию
антител
или
антигена
на
поверхности
полистиролового микропланшета; добавление пробы, содержащей аналит; введение
иммунореагента, меченного ферментом; получение детектируемого продукта из
субстрата в ходе ферментативной реакции. Каждая стадия анализа предусматривает
инкубацию реагентов, а между стадиями проводится отмывка лунок микропланшета
для
отделения
несвязавшихся
комплексов,
иммобилизовавшихся
соединений.
К
достоинствам
на
ИФА
его
поверхности,
относится
от
высокая
чувствительность, обусловленная амплификацией сигнала с помощью ферментамаркера. Для определения низкомолекулярных соединений, как правило, используется
конкурентный формат ИФА – с мечением антител (рис. 3, А) либо антигена (рис. 3, Б).
Высокомолекулярные антигены благодаря наличию на их поверхности нескольких
неперекрывающихся
сайтов
связывания
(антигенных
детерминант)
можно
детектировать, используя не только конкурентный, но и обычно более чувствительный
«сэндвич»-формат анализа (рис. 3, В).
15
Рис. 3. Форматы иммуноферментного анализа: А, Б – форматы, основанные на
конкурентном взаимодействии; В – «сэндвич»-формат (S – субстрат, Р – продукт).
Несмотря на преимущества метода и различные способы совершенствования его
методик (снижения предела обнаружения, автоматизации анализа и др.), дальнейшее
расширение области применения ИФА ограничивают его два основных недостатка
[27]. Во-первых, это длительное время определения (2-3 часа), вызванное
необходимостью продолжительных инкубаций на каждой стадии анализа для
достижения
химического
равновесия
в
гетерогенных
реакциях
между
иммобилизованными и находящимися в растворе иммунореагентами. Второй
ограничивающий фактор – приборная регистрация результатов анализа (как правило –
оптической плотности продукта ферментативной реакции), необходимая для расчета
содержания определяемого аналита.
Необходимость экспрессного тестирования вызвала появление модификаций
ИФА, существенно сокращающих время определения. В работах [28; 29]
использование полимерных или магнитных наночастиц в качестве носителей
позволяет проводить реакции в гомогенной среде, что снижает продолжительность
анализа примерно до 30 мин [30]. Есть ряд работ по изучению кинетики
иммунохимических взаимодействий и соответствующей оптимизации методик ИФА
16
[31; 32]. Fu J. с соавт. предлагают заменить фермент-маркер на флуоресцентный
краситель, что позволяет исключить стадию развития сигнала, необходимую для
меток-ферментов [33]. Все эти способы приводят к сокращению времени анализа до
10-30 мин, но сохраняют приборную регистрацию результатов.
Альтернативный подход, реализованный фирмой «Neogen» для конкурентного
определения
низкомолекулярных
фумонизин),
позволяет
отнести
соединений
предложенный
(микотоксины
ими
ИФА
афлатоксин
к
и
тест-методам.
Разработчики предлагают проводить реакции в двух лунках (проба и ячейка
сравнения). Вспомогательные
растворы
реагентов
входят
в
состав
набора.
Продолжительность стадий ИФА сокращена до 2-3 мин. Промывку лунок от
несвязавшихся реагентов осуществляют вручную, используя флаконы-капельницы.
Конечный результат анализа оценивается визуально (рис. 4). Таким образом,
предложенный анализ удовлетворяет всем критериям тест-методов.
А
Б
Рис. 4. Интерпретация результатов конкурентного определения аналита с помощью
тест-системы фирмы «Neogen»; А – тестирование пробы, содержащей контролируемый
аналит,
Б
–
тестирование
пробы
без
аналита
(http://www.neogen.com/FoodSafety/FS_DA_Index.html/)
Ramachandran S. с соавт. [34] предложили автоматизированный ИФА с
использованием проточного портативного устройства (рис. 5). Уникальность
разработки заключается в том, что все реагенты находятся в лиофильно-высушенном
состоянии (что упрощает их хранение) и растворяются при добавлении пробы.
Внесение пробы в кассету – единственное действие, требуемое от оператора; все
последующие процессы инициируются движением жидкости по компонентам тестсистемы под действием капиллярных сил. Данная тест-система успешно применена для
определения биомаркера возбудителя малярии Plasmodium falciparum – белка 2,
17
богатого гистидином. Результат анализа детектируется через 20 мин после введения
пробы – либо качественно (по появлению окраски), либо количественно (с помощью
сканера).
Рис. 5. Портативное устройство для проведения ИФА [34].
1.1.3 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ
Существует
флуоресцентных
ряд
аналитических
маркеров.
К
ним
методов,
относится
использующих
гомогенный
свойства
поляризационный
флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА). Метод основан на изменении при
флуоресценции степени поляризации плоскополяризованного света, пропущенного
через раствор, который содержит пробу, флуоресцентно меченное производное
аналита (трейсер) и специфические антитела. Деполяризация плоскополяризованного
света зависит от размеров поглощающих молекул – см. рис. 6. Малые молекулы
(свободный трейсер) характеризуются быстрым вращением, что обеспечивает
деполяризацию излучаемого света (флуоресценции). При связывании трейсера с
антителом образуется комплекс, который медленно вращается и поэтому в момент
эмиссии частично сохраняет ту же ориентацию, что и при поглощении света, а значит,
частично сохраняет и поляризацию излучаемого света. Наличие аналита в пробе
приводит к конкуренции с трейсером за связывание с антителами и, соответственно, к
большей деполяризации излучаемого света. Регистрируемая величина поляризации
флуоресценции отражает отношение связанных и свободных молекул трейсера в
реакционной смеси, что позволяет на основании этого параметра рассчитывать
концентрацию аналита в пробе [35].
18
Рис. 6. Принцип ПФИА и зависимость деполяризации от размера комплекса
(http://www.glycoforum.gr.jp/).
Как следует из представленного выше описания ПФИА, данный метод может
быть реализован лишь для детекции низкомолекулярных соединений. При больших
размерах молекулы антигена трейсер будет сохранять поляризацию поглощаемого
света и в свободном состоянии, и в комплексе с антителами. Для традиционных
флуорофоров в качестве предельной молекулярной массы антигена, допускающей
проведение ПФИА, рассматривается величина, равная 10 кД. В последние годы этот
предел удалось преодолеть с помощью флуорофоров, характеризующихся большой
временной задержкой между поглощением света и его эмиссией [35].
Иммуноанализ с регистрацией поляризации флуоресценции активно применяется
в современной аналитической практике, как правило
стационарного
приборного
обеспечения
[35-37].
– с использованием
Существует
ряд
компаний,
специализирующихся на производстве наборов реагентов для иммуноанализа на
основе поляризации флуоресценции. В ряде случаев ПФИА характеризуется высокой
чувствительностью, позволяя детектировать пикомолярные концентрации аналита
[38].
Гомогенная аналитическая реакция с быстрым достижением равновесия,
отсутствие длительных инкубаций, появление в последние годы портативных
детекторов поляризации флуоресценции (производства фирм «Diachemix» (США),
«BMG Labtech» (США) и др.) позволяет проводить ПФИА во внелабораторных
условиях и рассматривать соответствующие варианты анализа как тест-методы [39;
19
40]. Например, фирма «Diachemix» выпускает портативные детекторы для ПФИА и
совместимые с ними наборы реагентов для определения микотоксинов и некоторых
возбудителей заболеваний.
1.1.4 Методы иммуноанализа на основе резонансного переноса энергии
Еще один вид гомогенного иммуноанализа, реализуемый как тест-метод, –
иммуноанализ, основанный на резонансном переносе энергии между донором и
акцептором. Резонансный перенос энергии Форстера (Förster resonance energy transfer
(FRET)) – это нерадиоактивный перенос на расстояния в несколько нанометров,
который происходит от возбужденного донора электронов к акцептору через дипольдипольное взаимодействие [41]. Регистрируется этот перенос по эмиссии акцептора
при длине волны, не совпадающей с пиком поглощения донора. Донорно-акцепторная
пара для аналитического применения подбирается таким образом, чтобы обеспечить
эффективный перенос энергии (рис. 7).
Рис. 7. Схема допустимых сочетаний доноров и акцепторов для FRET-анализа. Стрелки
указывают приоритетное направление потока энергии [42].
Эффективность переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени
расстояния донор–акцептор [43]. Для большинства используемых пар высокая
20
эффективность переноса достигается при сближении донора и акцептора на расстояния
до 4–6 нм [44; 45], что сопоставимо с размерами антител [46]. Поэтому, пометив
иммунореагенты донором и акцептором, можно регистрировать взаимодействие
антиген–антитело. Если донор и акцептор в результате иммунного взаимодействия
сближаются, то перенос энергии значительно возрастает. Избыточная энергия,
полученная акцептором, преобразуется в детектируемую люминесценцию (рис. 8).
Рис. 8. Эффект резонансного переноса энергии [41].
Существует несколько модификаций иммуноанализа на основе FRET. Наиболее
распространена конкуренция свободного и меченного акцептором антигена за
связывание с антителами, меченными донором электронов. При отсутствии аналита в
пробе донор передает энергию на акцептор (эффект FRET), флуоресценция донора не
регистрируется (рис. 9, А). Присутствие аналита в пробе препятствует взаимодействию
меченого антигена с антителом, что приводит к излучению энергии донором (рис. 9,
Б). Используя градуировочную зависимость интенсивности флуоресценции, можно
количественно определять содержание аналита.
А
Б
Рис. 9. Принцип конкурентного иммуноанализа на основе FRET (А – в отсутствии; Б –
в присутствии определяемого соединения) [43].
21
Детектируемый сигнал во FRET-анализе зависит от типа маркера: возможна
флуоресценция, хемилюминесценция, биолюминесценция. В анализе применяются
разнообразные
флуоресцентные
маркеры:
белки,
органические
красители,
наночастицы и др. [41; 47]. Используя два флуорофора, можно определять содержание
аналита по соотношению интенсивностей флуоресценции при длинах волн,
соответствующих максимумам излучения донора и акцептора [48].
В основе хемилюминесцентного FRET лежит использование энергии, выделяемой
при реакции между пероксидом водорода и люминолом (либо его производными,
эфирами щавелевой кислоты, акридинами, люцигенином и др.) [49; 50]. Маркер
получает эту энергию, а затем выделяет ее в виде детектируемой люминесценции [51].
Описано несколько вариантов хемилюминесцентного FRET-анализа: антитела к
определяемому соединению могут быть связаны с ферментом [51] или с производным
люминола [52].
Отметим, что для проведения FRET-иммуноанализа достаточно смешать пробу с
растворами маркеров. Иммунохимические взаимодействия осуществляются в растворе
и не требуют длительных инкубаций, а их результат может непосредственно
детектироваться без дополнительных стадий и вспомогательных реагентов.
Иммуноанализ на основе FRET характеризуется низким пределом обнаружения,
вплоть до пикомолярных концентраций аналита, и экспрессностью – 15-20 мин [53-55].
Предложены флуоресцентные детекторы Infinite® 200 PRO Nano Quant («Tecan»),
Qubit («Invitrogen»), позволяющие работать с тест-системами на основе FRET [56] (рис.
10).
Рис. 10. Портативный флуоресцентный детектор фирмы «Tecan» для регистрации
результатов FRET-иммуноанализа [56].
22
1.1.5 Иммунофильтрация
Одним из вариантов гетерогенного анализа является иммунофильтрация,
основанная на использовании пористых мембран или пористого сорбента в качестве
носителя, на котором иммобилизованы взаимодействующие с аналитом антитела [57].
Иммунофильтрационный анализ включает несколько стадий пропускания реагентов
через мембрану, чередующихся с промывкой мембраны от несвязавшихся реагентов.
Гетерогенные взаимодействия на этих стадиях, в отличие от ИФА, происходят под
давлением или действием силы тяжести, что позволяет существенно сократить их
продолжительность и затрачивать на весь анализ не более 15-20 мин.
В качестве маркеров в иммунофильтрации могут использоваться ферментные
маркеры либо наночастицы [58]. Применение ферментов увеличивает количество
стадий и время тестирования, тогда как использование наночастиц позволяет
проводить экспрессный анализ. В работах Wang C. и соавт., Thiryppathiraja C. и соавт.,
Дыкмана Л.А. и Богатырева В.А. [59-61] показано, что иммунофильтрация (маркер –
коллоидное
золото)
превосходит
по
пределу
обнаружения
и
скорости
иммуноферментные аналоги для определения маркеров болезни Альцгеймера,
возбудителей острых кишечных инфекций. Дополнительное снижение предела
обнаружения в иммунофильтрационных тест-системах достигалось при использовании
солей серебра [62] или золота [63], увеличивающих размеры маркерных наночастиц.
Предел детекции иммунофильтрационного анализа зависит от констант
связывания реагентов и скорости пропускания растворов через мембрану. Снизить этот
предел можно, используя дополнительные реагенты с высокой константой связывания,
например, водорастворимые полиэлектролиты. В таких тест-системах, описанных
Дзантиевым Б.Б. и соавт. [64-66], реакция между антигеном и антителом протекает в
гомогенных условиях, а связанный с антителами полиэлектролит в ходе фильтрации с
очень высокой скоростью взаимодействует с иммобилизованным на мембране
противоионом.
Иммунофильтрационные
тест-системы
с
использованием
полиэлектролитов, разработанные для определения метамфетамина, тестостерона,
симазина, позволяют проводить анализ за 20 мин., включая короткую стадию
трансформации ферментом-меткой субстрата с образованием на мембране осадка
нерастворимого окрашенного продукта.
23
1.1.6 Иммуноаффинные колонки
К иммунофильтрационным тест-системам по принципу работы наиболее близки
колоночные тесты, в которых роль носителя (твердой фазы) выполняет гель с
иммобилизованными антителами [67-69]. Анализ с использованием иммуноаффинных
колонок проводится так же, как и иммунофильтрация, и включает стадии пропускания
через гель пробы, специфических реагентов и промывочных растворов. Как правило,
иммуноаффинная хроматография рассматривается как предварительная стадия
анализа,
после
которой
выявление
контаминанта
проводится
с
помощью
хроматографии высокого давления с масс-спектрометрической идентификацией.
Однако существует и ряд разработок, в которых иммуноаффинная хроматография
используется как самодостаточный аналитический метод. Маркерами в таких системах
являются ферменты или наночастицы. Вывод о результате тестирования делается на
основании появившегося окрашивания самой колонки или элюата (рис. 11). В работах
Горячевой И.Ю. и соавт. [36; 68; 70; 71] описан ряд аналитических систем на основе
аффинных колонок, на определенных участках которых расположены зоны
связывания.
Рис. 11. Варианты иммуноаффинных колонок: 1 – детектирующий слой; 2 –
очищающий слой; 3 – фильтр с вспомогательным конъюгатом [36].
В современной практике для тестирования с помощью иммуноаффинных колонок
преобладает
качественная
(визуальная)
регистрация.
Количественная
оценка
результатов возможна при использовании портативных оптических детекторов [72].
Скорость пропускания растворов подбирается таким образом, чтобы обеспечить
наиболее полное протекание реакций за минимальное время. Время анализа не
24
превышает 10 мин, а предел детекции, как правило, находится в диапазоне
наномолярных концентраций [31; 73].
Отметим, что для проточных методов – иммунофильтрации и иммуноаффинных
колонок – существует дополнительный фактор, который, наряду с форматом анализа и
аффинностью антител, влияет на предел обнаружения. В проточной системе при
проведении анализа возможно концентрировать аналит из пробы. Через мембрану или
колонку можно пропустить большой объем пробы – до десятков миллилитров,
увеличивая количество молекул аналита, связанного с носителем. Дальнейший рост
этого объема и соответствующее снижение предела обнаружения лимитируются
неспецифическими взаимодействиями на носителе.
1.1.7 Микрофлюидные тест-системы
Микрофлюидные тест-системы представляют собой подложки с нанесенными
микроканалами, по которым при проведении анализа под действием капиллярных сил
или давления движутся реагенты [74]. Каналы соединяют углубления (реакторы), в
которых находятся молекулы антител, вспомогательных реагентов, маркеры.
Проба вносится в тест-систему и движется по каналам. Определяемые соединения
связываются с антителами или антигенами, которые могут быть иммобилизованы на
стенках каналов или вноситься вместе с пробой. Реагенты, связанные с носителем,
затем фиксируются в определенном месте под действием электрического или
магнитного поля. После этого вводится меченный маркером реагент, который
связывается с образовавшимся иммунным комплексом. Содержание маркера в этой
зоне связывания измеряется, и на основании полученной величины определяется
содержание аналита в пробе [75; 76].
Существующие микрофлюидные тест-системы, описанные в сотнях статей (см.
обзорные публикации [77-79]), крайне разнообразны по геометрии. Различают
двумерные (2-D) и трехмерные (3-D) (рис. 12) варианты тест-систем [78, 80].
Разветвленные каналы, сформированные на небольшой (несколько квадратных
сантиметров) подложке, позволяют за 10-20 минут одновременно определять
содержание десятков соединений в одной пробе.
25
А
Б
Рис. 12. Виды двумерных (А) и трехмерных бумажных (Б) микрофлюидных тестсистем [78].
Пределы обнаружения в микрофлюидном иммуноанализе с фотометрической или
флуоресцентной детекцией достигают наномолярных концентраций. Электрические
методы детектирования в ряде случаев позволяют выявлять пикомолярные
концентрации аналитов [81]. На сегодняшний день несколько фирм – «Abaxis»,
«Biosite»,
«TearLab» и
др.
–
выпускают
микрофлюидные
тест-системы
с
колориметрической, флуоресцентной или электрохимической детекцией [77].
1.1.8 Иммунохроматография
Иммунохроматографические
гетерогенным
аналитическим
тест-системы
системам.
(тест-полоски)
Тест-полоска
относятся
представляет
к
собой
мультимембранный композит, на определенные участки которого предварительно
нанесены все необходимые для анализа иммунореагенты и их комплексы с маркером
(рис. 13). Контакт с жидкой пробой инициирует движение ее компонентов вдоль
мембран
тест-полоски
под действием капиллярных сил, сопровождающееся
26
иммунохимическими взаимодействиями с находящимися в них реагентами [82].
Результатом анализа является формирование в определенных участках тест-полоски
иммунных комплексов, содержащих маркер. Исходя из наличия или отсутствия этого
связывания, делается качественный вывод о присутствии в пробе аналита или о
превышении
им
характерной
для
тест-системы
пороговой
концентрации.
Количественное определение содержания аналита проводится по интенсивности
окрашивания, флуоресценции или иной характеристики связанного маркера.
Рис. 13. Схематическое изображение иммунохроматографической тест-полоски: 1 –
пластиковая подложка; 2 – мембрана для пробы; 3 – мембрана для конъюгата маркера
с антителами; 4 – рабочая мембрана; 5 – впитывающая мембрана; 6 –тестовая зона; 7 –
контрольная зона с антивидовыми антителами [83].
Существуют варианты иммунохроматографических тест-систем, в которых
принцип «все реагенты предварительно нанесены на тест-полоску» не соблюдается.
Для усиления детектируемого сигнала могут использоваться дополнительные
реагенты, наносимые на тест-полоску после иммунохроматографии [84; 85]. Возможна
также
предварительная
инкубация
одного
из
иммунореагентов
с
пробой,
обеспечивающая бóльшую глубину протекания иммунохимической реакции по
сравнению с движением иммунореагентов в потоке вдоль мембран [86]. Эти и другие
подобные им приемы усложняют анализ, но и такие аналитические наборы могут быть
отнесены к тест-методам [87; 88].
Пределы обнаружения для иммунохроматографических тест-систем колеблются
от наномолярных до микромолярных концентраций в зависимости от свойств
иммунореагентов, маркера и способа детекции [89]. Использование портативных
детекторов [85] позволяет в отдельных случаях снизить эти пределы до пикомолярных
27
концентраций.
Продолжительность
иммунохроматографического
тестирования
варьирует от 5 до 20 минут.
Иммунохроматографические
коммерциализованный
класс
тест-системы
тест-методов.
–
наиболее
Тест-полоски
для
успешно
выявления
беременности, контроля употребления психоактивных соединений, диагностики
инфекционных заболеваний производятся десятками фирм («Dialab», «Novamed»,
«Alldiag» и др.). Выпускаются иммунохроматографические тест-системы для контроля
пищевых продуктов, сельскохозяйственного и экологического мониторинга («Charm
Sciences», «Thermo Fisher Scientific» и др.). Ряд фирм («Qiagen», «DCN», «Optricon» и
др.) предлагает портативные детекторы (преимущественно – фотометрические) для
регистрации результатов иммунохроматографии. В последние годы активно ведутся
разработки по использованию в качестве альтернативных иммунохроматографических
детекторов серийных коммуникационных средств – смартфонов, мобильных
телефонов, Google-камеры [90-92].
*
*
*
Как видим, иммунохимические тест-методы существенно отличаются друг от
друга по сложности тестирования. Наибольший интерес представляют варианты тестсистем, в которых проведение анализа не требует каких-либо действий с реагентами.
Если все соединения, необходимые для формирования детектируемого комплекса,
нанесены на тест-полоску или другое устройство, то всё, что должен сделать оператор,
– обеспечить контакт тест-системы с характеризуемой пробой (например, окунуть тестполоску в пробу). К таким, наиболее эффективным с точки зрения трудозатрат тестсистемам, на сегодняшний день можно отнести иммунохроматографические и часть
микрофлюидных тестов.
В подавляющем большинстве тест-систем детекция формирующихся иммунных
комплексов обеспечивается использованием того или иного маркера. Фактически
только агглютинация корпускулярных антигенов не требует применения маркера (и
при этом характеризуется довольно высокими пределами обнаружения).
Свойства маркеров определяют параметры иммунохимических тест-систем и
поэтому требуют более детального рассмотрения.
28
1.2. Маркеры для тест-систем: сравнительная характеристика
Маркеры, используемые в биохимических методах анализа (в том числе в тестсистемах), обеспечивают формирование детектируемого сигнала, величина которого
отражает
содержание
аналита.
Регистрация
специфических
комплексов
без
использования маркера – непосредственно по изменению того или иного параметра
реакционной среды – возможна лишь в крайне ограниченном числе случаев и при этом
обычно характеризуется невысокой чувствительностью. Использование маркера
может обеспечить амплификацию сигнала (например, для маркера-фермента, когда
детектируются продукты катализируемой им реакции) или возможность использовать
высокочувствительные методы детекции.
Существующее разнообразие маркеров крайне велико и классифицируется
разными способами. Все маркеры можно разделить на индивидуальные молекулы
(радиоактивные метки, ферменты, красители), молекулярные кластеры (наночастицы
разной природы) и метки со сложной структурой (латексные или кремниевые частицы
с инкапсулированными красителями). Из этого разнообразия можно выделить
маркеры, удовлетворяющие требованиям современных тест-методов. Маркеры,
используемые в иммунохимических тест-методах, должны обладать следующими
характеристиками:
- простота детекции;
- высокая чувствительность детекции (высокое значение отношения сигнал / шум)
в широком диапазоне условий;
- сохранение детектируемых свойств при работе со сложными матриксами;
- стабильность конъюгата маркер–иммунореагент при хранении.
Представленным требованиям в той или иной степени удовлетворяет лишь часть
из возможных маркеров – ферменты, органические флуорофоры, липосомы и
наночастицы различной природы, которые будут рассмотрены далее.
Важное значение при классификации маркеров имеют способы их детекции. В
основе прямой детекции лежат непосредственно регистрируемые физические свойства
маркера: поглощение света, флуоресценция, электропроводность, магнитные свойства
и др. Непрямые способы основаны на детекции продуктов реакции, проведенной с
29
участием маркера. Стоит отметить, что одни и те же маркеры могут детектироваться
разными способами и, соответственно, относиться к нескольким группам.
Ферменты
Фермент в качестве маркера обеспечивает эффективное усиление аналитического
сигнала, трансформируя большое число молекул субстрата (для ряда ферментов число
оборотов при катализе достигает нескольких тысяч в минуту) [93]. С использованием
ферментов в качестве маркеров реализовано несколько видов иммунохимических тестметодов – твердофазный иммуноферментный анализ, иммунофильтрационные тесты,
иммуноаффинные колонки [94; 95]. В большинстве тест-методов в качестве
ферментативного маркера используется пероксидаза; это обусловлено ее высокой
каталитической активностью, а также рядом детально охарактеризованных реакций
окислительной трансформации хромогенов, применяемых в иммуноферментных
аналитических наборах [96].
Однако детекция по продукту катализируемой реакции обуславливает и
определенные
недостатки
применения
ферментов-меток
в
тест-системах.
Продолжительность анализа увеличивается, т.к. после формирования специфического
комплекса нужно время для его выявления. Стабильность ферментов, особенно в
растворе, не очень велика. Поэтому, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов
анализа, нужны дополнительные разработки.
Отметим, что в некоторых тест-методах ферменты используются не как
непосредственные маркеры антител или антигенов, а как дополнительные средства
усиления сигнала. Описаны тест-системы, в которых детектируемый оптический
сигнал формируется с помощью двух маркеров – наночастицы и фермента [85]. После
проведения
стадии
иммунохимического
взаимодействия
образовавшиеся
на
наночастицах комплексы отмывали от несвязавшихся реагентов и погружали в раствор
субстрата пероксидазы.
Флуоресцентные органические красители
В качестве флуоресцентных маркеров в биохимических исследованиях
используется
большое
число
низкомолекулярных
30
органических
красителей:
флуоресцеин, техасский красный, нильский красный, Alexa 750 и др. [97]. Описано их
применение и в иммунохроматографических тест-системах [98; 99].
Недостатки органических флуорофоров как аналитических реагентов – низкая
фотостабильность, сильное концентрационное тушение и снижение интенсивности
флуоресценции под действием компонентов тестируемого матрикса [100]. Квантовый
выход большинства органических красителей в органических растворителях высокий
– 0,7–0,97, но в водной среде он не превышает 0,5 [101-103].
Чтобы увеличить интенсивность свечения, детектируемого при проведении
анализа, при мечении аффинных белковых реагентов (например, антител) можно
использовать высокие мольные соотношения флуорофора к белку. Однако это может
вызвать изменения структуры белка и его реакционной способности [104].
Альтернативные способы увеличить нагрузку маркера без непосредственного
воздействия на аналитический реагент основываются на инкапсуляции флуорофоров в
латексные, полимерные или кремниевые нано- или микроструктуры [105].
Общее преимущество наночастиц как аналитических маркеров заключается в
возможности использовать их большую суммарную поверхность, чтобы ускорить
аналитические реакции и увеличить количество целевого продукта. В ряде систем
применяются также особенности влияния размера на те или иные свойства наночастиц,
например, на их окраску, взаимодействие с разными видами излучения.
Описано иммуноаналитическое применение наночастиц различных классов –
коллоидное золото, коллоидное серебро, углеродные наночастицы, магнитные
наночастицы, преобразующие флуорофоры, инфракрасные маркеры, квантовые точки,
липосомы, латексные и кремниевые наночастицы и др. [7; 106]. Учитывая это
разнообразие маркеров, методов получения на их основе аналитических реагентов, а
также способов детекции, рассмотрим только основные классы наночастиц, чаще всего
используемых в иммунохимических тест-методах.
Коллоидное золото
Интенсивное
применение
коллоидного
золота
(КЗ)
как
маркера
для
иммуноанализа началось после работы 1981 года Horisberger M. [107], описывающей
получение конъюгата КЗ с антителами и его использование в микроскопии. На
31
сегодняшний день КЗ является самым распространенным маркером в мембранных
системах иммуноанализа благодаря доступности, простоте получения реагентов и
детектирования.
Интенсивная окраска частиц КЗ обусловлена эффектом поверхностного
плазмонного резонанса. Конъюгаты наночастиц КЗ с иммунореагентами могут быть
получены посредством как прямой адсорбции, так и иммобилизации тиол-содержащих
реагентов с последующей ковалентной модификацией.
Варьируя условия синтеза КЗ, можно получить препараты различной формы и
размера. Вопрос об оптимальном маркере для тест-систем до сих пор остается
открытым.
Имеются
эмпирические
рекомендации
по
использованию
в
иммунохроматографии наночастиц КЗ со средним диаметром 30-40 нм, но особенности
определяемого соединения и формата анализа могут существенно влиять на этот выбор
[108; 109]. В иммунохроматографии могут применяться препараты КЗ как малого
диаметра – 3-5 нм (с практически эквимолярным соотношением антитело : коллоид в
конъюгате), так и большого диаметра – до 50 нм [110; 111]. Переход к более крупным
частицам КЗ требует специальных решений по обеспечению их стабильности в
растворе и предотвращению агрегации.
Оптический сигнал, генерируемый частицами КЗ в тест-системах, может быть
усилен с помощью ферментов, наночастиц или солей серебра [112], либо
дополнительного препарата КЗ [113; 114]. В работе Parolo C. и соавт. [85] предложена
иммунохроматографическая
конъюгированы
с
тест-система,
антителами
и
в
которой
пероксидазой.
наночастицы
После
золота
проведения
иммунохроматографии тест-полоску отмывают от несвязавшихся реагентов и
погружают в раствор субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина, дающего яркосиний нерастворимый продукт окисления). Усиление окрашивания позволило снизить
предел обнаружения с 5 нг/мл до 200 пг/мл. Дрыгин Ю.Ф. и соавт. предложили другой
способ усиления аналитического сигнала в иммунохроматографии, который состоит в
использовании наночастиц серебра (диаметр 20 нм), агрегирующих на поверхности КЗ
(диаметр 20 нм) и в 10 раз увеличивающих интенсивность окрашивания [115].
Отметим, однако, что дополнительные стадии увеличивают продолжительность
анализа (например, в работе [85] – с 10 до 25 мин).
32
Свойства наночастиц КЗ позволяют проводить их выявление (и, соответственно,
регистрацию результатов иммуноанализа) не только по окрашиванию определенных
зон тест-системы, как это делается в традиционной иммунохроматографии, но и по
тушению флуоресценции [116; 117], изменениям электропроводности [118] либо
люминесценции [119], а также по изменениям спектров поглощения при агрегации
частиц КЗ, взаимодействующих с аналитом [120-122]. Однако самый простой и
быстрый вариант – колориметрическая детекция с возможностью визуальной
качественной оценки результатов – продолжает оставаться наиболее востребованным.
Наночастицы серебра
Для наночастиц серебра, как и для КЗ, характерны интенсивное поглощение света,
возможность варьирования размеров наночастиц и зависящих от размеров спектров
поглощения. При использовании в тест-системах наночастицы серебра могут
детектироваться колориметрическими и вольтамперометрическими способами [123], а
также по изменению оптических свойств в процессе агрегации [124].
Следует учитывать, что нестабилизированные наночастицы серебра в растворах
подвергаются быстрому окислению и легко агрегируют [125]. Поэтому ряд работ
посвящен изучению взаимодействия коллоидного серебра с различными средами и
разработке методов стабилизации таких частиц [126-128].
Углеродные наночастицы
Углеродные наночастицы разнообразны по структуре: наносажа, графен,
одностенные и многостенные нанотрубки, фуллерены, аморфный углерод [129]. В 1993
г. van Аmerongen А. и соавторы впервые использовали наночастицы аморфного
углерода как метки для иммунохроматографических тест-систем [130]. Данный подход
был успешно применен и в ряде последующих работ, преимущественно – той же
научной группы [131-134]. Основные достоинства углеродного маркера – высокая
стабильность и контрастность окрашивания на мембране (черные частицы на белом
фоне). Высокий коэффициент экстинкции наночастиц обеспечивает крайне низкий
предел их обнаружения, который для приборной регистрации достигает пикомолярных
концентраций (2 пМ) [135]. Кроме оптических свойств, для регистрации углеродных
наночастиц используют и их электрические характеристики, разрабатывая методы
33
анализа с амперометрической и вольамперометрической детекцией [136-138]. В работе
Munge B. и соавт. показано, что электродетекция углеродных наночастиц значительно
чувствительнее оптической детекции: пределы обнаружения – 10-21 М и 2·10-19 М,
соответственно [139].
Магнитные наночастицы
Эффективным аналитическим реагентом являются растворы парамагнитных
частиц – коллоидные препараты кластеров металлов или их оксидов, способные
перемещаться в магнитном поле. Наиболее широкое распространение в аналитических
системах получили ферромагнетики – смеси оксидов железа Fe2O3 и FeO. Магнитные
свойства
наночастиц
могут быть
использованы
как
для
концентрирования
аналитических реагентов, так и для выявления специфических комплексов.
Применение магнитных наночастиц в иммунохроматографии описано в ряде
работ [140-142]. Маркер может детектироваться как по отклику (намагничивание) на
внешнее магнитное поле, так и по окраске (ферромагнитные частицы – интенсивного
коричневого цвета). Магнитные детекторы выявляют маркеры во всем объеме
мембраны, без каких бы то ни было эффектов экранирования, характерных для
оптических методов.
В ряде исследований, например, в работе Gao Z. и соавт. при проведении
иммуноанализа
простатспецифического
антигена,
магнитные
наночастицы
используются и для разделения реагентов, и для детекции образующихся комплексов
[143].
Преобразующие флуорофоры
Преобразующие флуорофоры (up-converting phosphors (UCP)) представляют
собой комбинацию иона-донора и иона-акцептора энергии в одной субмикронной
кристаллической структуре. При инфракрасном облучении ион-донор высвобождает
энергию, квант энергии переходит на акцептор, который в свою очередь испускает
фотон в видимой или ближней инфракрасной области в зависимости от состава
кристалла [144]. При детекции маркера эти испускаемые фотоны регистрируются.
При получении преобразующих флуорофоров в качестве донора широко
применяются
кристаллы
итрий-фторида
34
натрия
(NaYF4)
с
гексагональной
кристаллической решеткой [145]. Роль акцептора в большинстве случаев играют
комплексы трехвалентных лантанидов – самарий, иттербий и др. [146]. Благодаря
эмиссии в ближней инфракрасной области тест-системы на основе лантанидных
комплексов характеризуются низким фоновым сигналом, что позволяет с их помощью
тестировать различные сложные матриксы, такие как кровь, слюна, экстракты
пищевых продуктов [146-148].
К недостаткам преобразующих флуорофоров следует отнести низкий квантовый
выход (0,01–0,1) [149] и склонность к агрегации [150]. На основе UCP реализованы
иммунохроматографические тест системы для определения ряда бактериальных
патогенов – Escherichia coli, Streptococcus pneumonia, Brucella sp. и др. [151; 152].
Инфракрасные маркеры
В качестве инфракрасных маркеров в тест-системах используются композитные
материалы Y2O3:Nd3+ или YF3: Er3+. При облучении светом в видимом диапазоне (500900 нм) эти соединения флуоресцируют в ближней инфракрасной области спектра
(900-1100 нм) [153; 154].
Как и для преобразующих флуорофоров, для данных соединений характерно
высокое соотношение сигнал : шум, обеспечиваемое благодаря низкому собственному
свечению носителя [147]. Главный недостаток инфракрасных маркеров на основе
лантанидов – нестабильность из-за тушения флуоресценции, которое можно снизить
введением меток в латексные, полимерные или кремниевые наночастицы [155].
Квантовые точки
Полупроводниковые квантовые точки (КвТ) представляют собой нанокристаллы
бинарных соединений из элементов II–VI и III–V групп Периодической системы
Менделеева, линейные размеры которых по всем трем направлениям меньше радиуса
экситона Бора данного соединения (1–10 нм) [156-158]. Например, для CdSe радиус
экситона Бора составляет 6 нм, и размер КвТ, соответственно, варьирует от 1 до 6 нм.
Малые размеры полупроводниковых нанокристаллов приводят к тому, что
образующаяся при облучении пара электрон – дырка (экситон) перемещается внутри
кристалла
и
испускает
характеризуются
высокой
фотон:
частица
внутренней
флуоресцирует.
энергией
35
носителей
Квантовые
заряда,
а
точки
также
зависимостью оптических параметров от размеров [159; 160]. Частицы такого же
состава, но больших (по сравнению с радиусом экситона Бора) размеров эти свойства
утрачивают.
Как правило, в состав квантовых точек, кроме ядра, входят и дополнительные
компоненты – металлическая оболочка и полимерное покрытие (рис. 14). Ядро,
формирующееся из таких соединений, как CdS, CdSe, InP и др., обеспечивает
флуоресцентные свойства КвТ, причем спектры эмиссии в существенной степени
зависят от состава ядра (рис. 15). Металлическая оболочка (ZnS, ZnSe и др.)
препятствует неизлучательному переходу энергии, стабилизирует наночастицу и
усиливает флуоресценцию. Кроме того, металлическая оболочка предотвращает фотоокислительную деградацию ядра, концентрирует свободные электроны в объеме [156].
Для большей стабильности, водорастворимости квантовых точек и исключения
негативного влияния металлических поверхностей на биомолекулы КвТ покрывают
полимерными оболочками. В состав таких покрытий вводят амино-, карбокси- или
другие функциональные группы, обеспечивающие возможность конъюгирования КвТ
с биомолекулами [161]. Модификация поверхности КвТ полимерами и биомолекулами
практически не влияет на их оптические свойства.
КвТ как аналитические маркеры могут регистрироваться по флуоресценции
(прямая детекция) [88] или электрохимическими способами (непрямая детекция) [162].
КвТ характеризуются широким спектром поглощения, возбуждением в широком
диапазоне длин волн, узким симметричным пиком эмиссии (полуширина 20–30 нм для
препаратов, гомогенных по размерам). Варьируя состав и размер КвТ, можно добиться
любой длины волны испускаемого света (см. рис. 15). В отличие от органических
красителей, которые подвергаются быстрому фотовыцветанию, КвТ могут быть
использованы в нескольких повторных циклах возбуждение–испускание [163; 164].
Квантовые точки характеризуются высоким квантовым выходом флуоресценции как в
органических, так и в водных средах (0,5–0,9), тогда как для органических
флуорофоров квантовый выход флуоресценции в водных растворах существенно ниже
(0,2–0,6) [165].
36
Рис. 14. Структура квантовых точек.
Рис. 15. Зависимость длины волны эмиссии квантовых точек от состава и размера их
ядра [166].
37
Липосомы
Липосомы
представляют
собой
структуры
из
амфифильных
молекул,
формирующие в результате самосборки оболочку и внутреннюю полость. Во
внутреннем слое оболочки находятся гидрофобные части молекул, образующих
липосому, тогда как гидрофильные части выходят на ее поверхность (наружную либо
внутреннюю). Для аналитических целей используются липосомы размером от 50 до
800 нм. В аналитических системах липосомы используются для концентрирования
маркера и его присоединения к селективному реагенту (обычно – антителу,
иммобилизуемому
на
инкапсулированными
внешней
внутри
поверхности
липосомы,
липосомы)
могут
быть
[167].
Маркерами,
цветные
красители,
флуоресцентные красители, ферменты, электроактивные компоненты и др. Включение
в липосому значительного числа молекул маркера позволяет снизить предел
обнаружения на 2-3 порядка по сравнению с непосредственным мечением иммунных
комплексов [168; 169].
Главным недостатком липосом является низкая стабильность при хранении и
работе в сложных матриксах. Липосомы легко подвергаются лизису при добавлении
поверхностно-активных веществ и разрушаются при использовании стандартных
протоколов высушивания.
Латексные наночастицы
Латексные
наночастицы
представляют
собой
частицы
из
полистирола,
полиметилметакрилата и других полимерных материалов диаметром от 50 до 500 нм
(т.е. находятся у верхней границы нанодиапазона, а порой – и за ее пределами).
Существуют методы синтеза цельных и полых латексных частиц [170; 171]. Основная
область аналитического использования латексов – агглютинация [21].
В состав латексных частиц могут входить маркеры разных типов – красители,
флуорофоры, магнитные наночастицы и др. При этом возможна как иммобилизация
маркеров на поверхности частицы, так и их включение в объем частицы при синтезе и
диспергировании. Имеется ряд коммерчески доступных латекстных частиц, меченных
флуорофорами [172]. Некоторые красители и флуорофоры сложно ковалентно
присоединить к антителам или антигенам, так как у них отсутствуют активные группы,
а модификация ухудшает флуоресценцию. Применение латексов решает эту проблему,
38
позволяя включить маркер в частицу в немодифицированном виде. Латексы, как и
липосомы, могут концентрировать большое число маркеров, амплифицируя
аналитический сигнал. Еще одним преимуществом является возможность сочетания в
латексной
частице
маркеров
разных
цветов
(что
позволяет
одновременно
идентифицировать до сотни соединений) или объединения в ее составе маркера и
средства разделения детектируемых комплексов (например, флуорофоров и магнитных
частиц) [146]. Наконец, важное достоинство латексных частиц – доступность и низкая
стоимость.
Ультрадисперсные частицы диоксида кремния
Кремниевые
наночастицы
могут
детектироваться
за
счет
собственных
флуоресцентных свойств (зависящих от размера) или инкапсулированных реагентов.
[173; 174]. Инкапсуляция разнообразных маркеров
позволяет
детектировать
получаемые комплексы по окраске, флуоресценции или электропроводности [175;
176]. Концентрирование красителей в кремниевых наночастицах (как и для
рассмотренных выше липосом и латексов) обеспечивает низкий предел обнаружения
аналита [155; 177; 178].
Инкапсулированные красители характеризуются высокой фотостабильностью,
устойчивостью к компонентам среды. Стабильна и собственная флуоресценция
наночастиц диоксида кремния.
*
*
*
Сравнение тест-методов с разными маркерами является сложной задачей, не
сводящейся к оценке возможностей детектирования маркеров как таковых. На
характеристики
анализа
существенное
влияние
оказывают
аффинность
иммунореагентов, состав тестируемых проб, особенности проведения анализа.
Поэтому сравнительная оценка маркеров возможна только для конкретных
форматов тест-систем и лишь при наличии достаточного числа экспериментальных
данных, относящихся к разным иммунореагентам.
Хотя комплексное сравнение широкого ряда маркеров в одной и той же тестсистеме не проводилось, на сегодняшний день известно несколько работ, посвященных
39
попарному сопоставлению маркеров (табл. 1). Большинство исследователей проводит
сравнение КЗ и КвТ с другими маркерами.
Таблица 1. Результаты экспериментального сопоставления маркеров для тест-систем
Тест-метод
Маркеры
Отличия пределов
Ссылка
детекции
Иммунофильтрационные
КЗ и КвТ
В 5 раз ниже для КвТ
колонки
Пероксидаза хрена Сопоставимы
[73]
[73]
и КвТ
Агглютинация
КЗ и КвТ
В 1000 раз ниже для КвТ
[179]
Магнитные
Сопоставимы
[180]
наночастицы и КвТ
ИХА
КЗ и углеродные В 100 раз ниже для
наночастицы
КЗ
и
[84]
углеродных наночастиц
латексные В 1000 раз ниже для КЗ
[84]
частицы
Из представленных в таблице 1 данных следует, что флуоресцентные
наночастицы обеспечивают самые низкие пределы обнаружения – в 5–1000 раз ниже,
чем
при
использовании
колориметрических
маркеров.
Таким
образом,
флуоресцентные КвТ являются перспективными реагентами для иммуноанализа.
1.3 Мультиплексная детекция и иммунохимические тест-методы
С расширением знаний о соединениях, участвующих в патологических процессах,
о потенциально опасных контаминантах окружающей среды и потребительской
продукции всё в большем числе случаев возникает необходимость контроля наличия
и/или уровня не одного, а нескольких соединений за минимальные сроки [4-6].
Высокопроизводительные тест-системы необходимы для детекции экотоксикантов,
патогенных микроорганизмов и аллергенов в продуктах питания, специфических
40
антител, гормонов и других регуляторных соединений в крови, при решении ряда
других задач.
Простое
одновременное
определение
нескольких
целевых
соединений,
проводимое по существующим методикам для монопараметрического анализа, не
является оптимальным решением, т.к. оно предполагает пропорциональное увеличение
трудоемкости, а в ряде случаев – еще и рост продолжительности тестирования.
Практически востребованы мультиплексные методы, позволяющие с помощью одной
тест-системы определять несколько соединений. Одновременность выявления разных
соединений обеспечивается либо применением в анализе ряда маркеров с разными
свойствами, либо разделением в пространстве зон связывания разных аналитов (рис.
16) [181-183]. Эти подходы легко применяются для стационарного приборного
обеспечения, тогда как их реализация в тест-системах требует дополнительных
методических решений.
Рис. 16. Два варианта реализации мультиплексного иммуноанализа [184].
Рассмотрим известные на сегодняшний день варианты мультиплексных
иммунохимических тест-систем.
Использование разнообразия маркеров в мультиплексном анализе
Как отмечалось в разделе 1.2, исследователи располагают большим числом
маркеров для иммуноанализа. Отличия в свойствах этих маркеров могут послужить
основой для создания мультиплексных тест-систем. Например, для коллоидного золота
41
и квантовых точек варьирование размеров позволяет получать маркеры с разной
окраской или флуоресценцией. При получении латексных и кремниевых наночастиц
возможно
инкапсулирование
различных
низкомолекулярных
красителей,
обеспечивающее формирование панели маркеров с разными оптическими свойствами.
На основе латексных частиц с инкапсулированными флуорофорами реализованы
коммерческие мультиплексные системы Luminex (США), позволяющие определять до
500 аналитов.
Мультиплексный
иммуноанализ
с
использованием нескольких маркеров
возможен в таких форматах, как агглютинация, FRET-анализ, ПФИА и ИФА.
Например, в работе Aoki K. и соавт. [22] предложен метод латексной агглютинации для
одновременного определения трех психоактивных соединений. В качестве маркеров
использованы три вида наночастиц окрашенного латекса. Квантовые точки с разными
пиками флуоресценции использованы в ИФА для определения четырех микотоксинов
[185]. Мультиплексный FRET-анализ комплексов каннабиноида, допамина и
аденозина с клеточными рецепторами описан Carriba P. и соавт. [186]. В работе Tian J.
и соавт. [187] предложено одновременное определение двух раковых маркеров
методом ПФИА.
Существуют варианты мультиплексных тест-систем, в которых несколько
маркеров используются для гомогенного микрофлюидного анализа. Schroeder H. и
соавт. [188] применили такой формат анализа с конъюгатами различных наночастиц
КЗ для одновременного определения четырех онкомаркеров.
Как видим, все реализованные на сегодняшний день варианты мультиплексных
тест-систем с несколькими маркерами предполагают оптическую (визуальную или
приборную) детекцию. При этом необходимость корректной идентификации каждого
маркера обуславливает использование разных источников света, светофильтров и
фотоприемников, усложняя комплектацию тест-системы.
Использование пространственного разделения зон связывания в мультиплексных
тест-системах
Обеспечение
мультиплексности
за
счет
пространственного
разделения
предполагает усложнение взаимного расположения элементов тест-системы. На рис.
17 представлена общая тенденция развития таких тест-систем – переход к многомерной
42
упорядоченности зон связывания. Рассмотрим примеры реализации мультиплексного
анализа с пространственным разделением в разных видах тест-систем.
Рис. 17. Варианты реализации мультиплексного иммунохроматографического анализа [7].
Производительность иммуноаффинных колонок как аналитических устройств
может быть повышена за счет расположенных друг над другом слоев носителя с
иммобилизованными антителами разной специфичности [189]. При пропускании
пробы через колонку каждый аналит связывается в определенном слое и детектируется
с
помощью
маркера.
Сходный
принцип
реализован
в
мультиплексных
микрофлюидных тест-системах, предложенных Zhang H. и соавт. для определения
онкомаркеров [190].
Для иммунохроматографических тест-системах также возможно нанесение
нескольких последовательно расположенных аналитических зон, содержащих
43
реагенты разной специфичности. Однако размеры тест-полосок, производимых с
использованием серийного оборудования, позволяют разместить лишь ограниченное
число таких зон – не более 10, а в коммерческих тест-системах, предполагающих
простоту и однозначность идентификации каждой окрашенной полосы, – не более
четырех [191; 192]. Увеличение количества аналитических зон вызывает их размытие
и перекрывание при нанесении и формировании окраски.
Простой вариант перехода к мультиплексной иммунохроматографии состоит в
объединении (например, в общей кассете) нескольких тест-полосок, каждая из которых
обеспечивает определение одного соединения (рис. 17). В работе Hong W. и соавт. [193]
предложено располагать тест-полоски в виде круга, в центр которого вносится проба
(рис. 17). Однако количество расходных материалов для изготовления таких тестов
увеличивается и, соответственно, стоимость анализа возрастает пропорционально
числу определяемых параметров. Кроме того, работа с кассетой требует большего
объема тестируемой пробы, что не всегда возможно (например, при анализе крови).
Для анализа в стационарных условиях успешно применяются мультиплексные
иммунохимические чипы. На их твердую (обычно стеклянную) подложку наносится
двумерный упорядоченный массив зон связывания небольших размеров, в каждой из
которых
при
определенной
последующих
инкубациях
специфичности.
формируется
Иммуночипы
иммунный
позволяют
комплекс
одновременно
характеризовать наличие и содержание сотен и даже тысяч соединений [194]. Однако,
кроме необходимости сложных и дорогостоящих стационарных устройств для
проведения анализа и регистрации его результатов, использование микрочипов
предполагает высокую квалификацию оператора и значительную продолжительность
тестирования (2–4 ч.) [195-197].
Одним из примеров микрочипового мультиплексного иммуноанализа является
разработанная Fall B.I. и соавт. [198] методика определения иммуноглобулинов Е
человека, специфичных к 24 аллергенам (рис. 18). Зона связывания формируется на
стекле нанесением реагентов из малых (5-15 нл) объемов. В качестве маркеров
используются органические флуорофоры.
44
Рис. 18. Одновременное определение иммуноглобулинов Е человека, специфичных к
разным аллергенам, с помощью иммуночипа [198].
Существенно увеличивает количество соединений, одновременно определяемых
с помощью иммунохроматографического теста, переход от одномерной геометрии зон
связывания (последовательность полос) к двумерной (точки, расположенные в виде
упорядоченного массива – несколько рядов в длину и в ширину) [199]. В
иммунофильтрационных тестах также возможно сформировать зону связывания в виде
массива точек с реагентами разной специфичности и благодаря этому одновременно
определять большое количество аналитов [200]. Для детекции флуоресценции
необходимы мощные источники возбуждения (например, лазер) и чувствительные
фотоприемники, что препятствует переходу иммуночипового анализа к портативным
вариантам.
Двумерное упорядочение аналитических зон на тест-полоске совмещает
преимущества иммуночипов и традиционной иммунохроматографии. Первая тестполоска с двумерной зоной связывания была разработана Gordon J. и соавт. [201],
использовавшими олигонуклеотиды в качестве рецепторных реагентов. Carry R. и
соавт. [202] реализовали двумерную иммунохроматографию для определения вирусов
цитрусовых (с объединением в тест-системе до 90 зон связывания).
Hong S. и соавт. [203] разработали иммунохроматографическую тест-систему с
двумерным массивом зон связывания (расположенных в шахматном порядке
моноклональных антител), но реализовали ее для определения одного соединения –
хрящевого олигомерного тканевого белка (COMP). Позднее мультиплексные системы
иммунохроматографического анализа были реализованы в работах Gantelius J. и соавт.
[204; 205] для определения высокомолекулярных антигенов – бактерий и антител.
45
В работе Corstjens P.L. и соавт. [206] отмечается, что в многозонных
иммунохроматографических тест-системах движение детектирующего конъюгата
через
ряды
иммобилизованных
реагентов
сопровождается
его
истощением,
вызывающим систематическую погрешность анализа.
Рассмотренные примеры позволяют заключить, что мультиплексные тестсистемы существенно повышают производительность определения, тогда как расход
реагентов и, соответственно, стоимость анализа (из расчета на одно соединение)
снижаются.
Двумерная
иммунохроматография
представляется
одним
из
наиболее
перспективных методических решений для мультиплексных тест-систем. В литературе
описано несколько вариантов таких тест-систем, но все они находятся на стадии
лабораторных образцов и не реализованы как коммерческая продукция. Все известные
разработки
относятся
к
определению
индивидуальных
высокомолекулярных
соединений с использованием однокомпонентных конъюгатов антитело–маркер.
1.4. Кинетика иммунохимических взаимодействий в тест-системах и ее
математические описания
Наиболее часто для внелабораторного анализа применяются различные виды
неравновесных тест-систем, содержащие иммобилизованные на твердой фазе
реагенты. Изучение кинетики биохимических процессов в этих системах позволяет
выявить закономерности реакций, протекающих при проведении анализа, и их
зависимости
от
взаимодействия.
концентраций
Использование
реагентов,
этих
продолжительности
закономерностей
дает
и
условий
возможность
прогнозировать аналитические характеристики тест-систем, оценивать влияние на них
различных факторов.
Рассмотрим
математические
описания
взаимодействий
в
экспрессных
иммуноаналитических системах.
Все иммуноаналитические методы основаны на реакциях между детектируемыми
соединениями (лигандами или антигенами) и рецепторными молекулами (антителами).
46
Реакция образования иммунного комплекса может быть описана кинетическими и
термодинамическими
параметрами,
характеризующими
бимолекулярные
взаимодействия [16].
Обратимое
взаимодействие
моновалентного
лиганада
и
моновалентного
рецептора может быть представлено в виде уравнения:
𝑘𝑎
→
𝐿+𝑅
←
𝐿𝑅, (1)
𝑘𝑑
где L – лиганд; R – рецептор; ka – константа связывания; kd – константа диссоциации.
Данный тип взаимодействий можно описать, используя систему трех нелинейных
дифференциальных уравнений [207]:
𝑑[𝑅]
= −𝑘𝑎 [𝑅][𝐿] + 𝑘𝑑 [𝐿𝑅]
𝑑𝑡
𝑑[𝐿]
= −𝑘𝑎 [𝑅][𝐿] + 𝑘𝑑 [𝐿𝑅]
𝑑𝑡
𝑑[𝐿𝑅]
𝑑𝑡
= 𝑘𝑎 [𝑅][𝐿] − 𝑘𝑑 [𝐿𝑅]
(2)
Эта система не решается в общем виде, но с учетом соотношения начальных
концентраций лигандов и рецепторов могут быть приняты те или иные допущения,
позволяющие охарактеризовать особенности комплексообразования.
Однако данная модель описывает лишь простейшую пару иммунореагентов –
взаимодействие моновалентного рецептора (Fab´-фрагмент антител) и моновалентного
антигена [208; 209]. В структуре нативных антител содержится несколько
антигенсвязывающих центров (от двух у IgG до десяти у IgM); многие антигены
характеризуются поливалентностью. Это приводит к большому разнообразию
образующихся
иммунных
комплексов,
усложняя
математическое
описание
иммунохимических взаимодействий. Поливалентные взаимодействия, их роль в
иммунных реакциях рассматриваются в ряде работ [210-215]. Однако общие
математические
описания
иммуноаналитических
систем,
учитывающие
многостадийность формирования иммунных комплексов, на сегодняшний день не
предложены.
47
Рассмотренная выше модель взаимодействия моновалентного лиганда и
моновалентного рецептора может быть применена к описанию тест-систем на основе
ПФИА [38] и FRET [216]. В этих случаях все реагенты находятся в растворе, а
определяемый низкомолекулярный антиген моновалентен.
Однако модель анализа должна дополнительно учитывать процессы, связанные с
появлением молекул-конкурентов. Такие работы были начаты исследованиями
Rodbard
D.
и
соавт.,
предложившими
модель
неравновесного
иммунорадиометрического анализа [217; 218]:
𝑑[𝑃𝑄]
= 𝑘1 [𝑃][𝑄 ] − 𝑘 ′1 [𝑃𝑄 ],
𝑑𝑡
𝑑[𝑅𝑄]
𝑑𝑡
−
= 𝑘2 [𝑅][𝑄 ] − 𝑘 ′ 2 [𝑅𝑄 ],
𝑑[𝑄]
𝑑𝑡
=
𝑑[𝑃𝑄]
𝑑𝑡
+
𝑑[𝑅𝑄]
𝑑𝑡
,
(3)
где P – концентрация антигена; Q – концентрация меченых антител; R – концентрация
иммобилизованного реагента.
Данная модель конкурентного иммуноанализа переносится и на другие
аналитические системы с гомогенными взаимодействиями. При этом, как отмечают
Surovtsev I.V. и соавт, математическое описание реакций, лежащих в основе метода
агглютинации, осложнено образованием продуктов разного состава [219].
Большинство иммунохимических тест-методов (ИХА, иммунофильтрация,
иммуноаффинные колонки, ИФА) относятся к гетерогенному иммуноанализу.
Описание
закономерностей
в
гетерогенных
системах
с
неравномерным
распределением реагентов в пространстве требует привлечения более сложного
математического аппарата [220]. Перенос «эффективных констант», определенных для
гомогенного варианта анализа, в гетерогенную систему весьма условен, как и
рассмотрение количества иммобилизованных реагентов в терминах объемных
концентраций.
Работы по моделированию методов ИФА ведутся наиболее интенсивно по
сравнению с другими гетерогенными иммуноаналитическими методами. Предложен
ряд математических моделей, описывающих взаимодействия для разных форматов
48
ИФА и основывающихся на разных допущениях [8; 221-223]. Рассмотрим некоторые
из них.
Choi D.H. и соавт. разработали и исследовали модель прямого конкурентного
формата ИФА, которая позволяет оптимизировать методику проведения анализа
расчетным путем, исключая длительный экспериментальный подбор условий [224]. В
данном формате ИФА свободный антиген пробы и антиген, меченный ферментом,
конкурируют за связывание с иммобилизованными на поверхности микропланшета
антителами. Изменения концентраций комплексов антиген – антитело и антитело –
антиген–фермент отражают следующие дифференциальные уравнения:
𝑑𝐶1𝐴
𝑑𝑡
𝑑𝐶1𝐸
𝑑𝑡
= 𝑘𝑜𝑛𝐴 𝐶1 𝐶𝐴 − 𝑘𝑜𝑓𝑓 𝐴 𝐶1𝐴 ,
= 𝑘𝑜𝑛 𝐸 𝐶1 𝐶𝐸 − 𝑘𝑜𝑓𝑓 𝐸 𝐶1𝐸 ,
(4)
где С1, СА и СЕ – концентрации антигенсвязывающих сайтов, свободного антигена и
свободного антигена, меченного ферментом; konA и koffA – кажущиеся константы
ассоциации и диссоциации антигена; konЕ и koffЕ – кажущиеся константы ассоциации и
диссоциации антигена, меченного ферментом.
Моделирование проводилось для равновесных условий проведения анализа. Для
получения
калибровочной
использованием
метода
зависимости
Рунге-Кутта
решалась
четвертого
система
порядка.
уравнений
Зная
(4)
с
исходную
концентрацию меченного ферментом антигена и используя кинетическую модель
ИФА, авторы показали зависимость предела обнаружения от концентрации маркера
(рис. 19).
49
Рис. 19. Влияние концентрации меченого антигена на предел обнаружения (правая ось
ординат, сплошная кривая) и на концентрацию комплекса антитело-антиген-фермент
(левая ось ординат, пунктирная кривая) при проведении ИФА. Заштрихованная
область показывает диапазон концентраций меченого антигена, оптимальных для
проведения высокочувствительного и достоверного анализа [224].
Показано
влияние
концентрации
конъюгата
антиген–маркер
на
предел
обнаружения и амплитуду детектируемого сигнала (оптической плотности при
колориметрической детекции). Имеется узкий диапазон значений этой концентрации,
обеспечивающих одновременно и низкий предел обнаружения, и высокую оптическую
плотность (заштрихованная область на рис. 19). Представленные авторами результаты
моделирования согласуются с экспериментальными данными [224].
В работе Kuznezow W. и соавт. [225] проводилась оценка времени, необходимого
для
достижения
максимального
аналитического
сигнала,
при
реализации
гетерогенного иммуноанализа для трех геометрически различных вариантов твердой
фазы: лунка микропланшета, пластина и ячейка. Эксперименты проводились при
постоянном перемешивании и без перемешивания. Установлено, что реакция в лунке
проходила быстрее в 2 раза, чем в ячейке, где для достижения максимального сигнала
требовалась инкубация в течение не менее чем 20 часов. Авторами предложена
математическая модель, описывающая систему ИФА в условиях ограниченного
массопереноса. В данной модели твердая фаза рассматривается как полностью
впитывающий диск на отражающей плоской поверхности. Используя теоретическое
описание двухстадийных взаимодействий, авторы предлагают для диффузионно-
50
ограниченного иммуноанализа следующее модифицированное уравнение, которое
описывает развитие сигнала (S(t)):
𝑆 (𝑡 ) =
𝑘+ 𝐿0 𝑆𝑚𝑎𝑥
1+𝐷𝑎
𝑡+
2𝐿0 𝐷𝑎2 𝑆𝑚𝑎𝑥
(1+𝐷𝑎 )2 𝜌
√𝐷𝑡/𝜋, (5)
где Da - число Дамкёлера, определяющее отношение скорости химической реакции к
скорости других одновременно протекающих в системе процессов; k+ – константа
ассоциации; L0 – начальная концентрация аналита; D – коэффициент диффузии
аналита; Smax – максимальный аналитический сигнал; ρ – поверхностная плотность
сайтов связывания антител.
Время, после которого реакция входит в режим стационарного потока с
постоянным массопереносом в зоне связывания, вычисляется по формуле:
𝜏𝑠𝑡𝑒𝑎𝑑𝑦 =
4𝐷𝑎4 𝐷
(𝑘+𝜌)2 (1+𝐷𝑎 )2 𝜋
, (6)
Предложенные Kuznezow W. и соавт. теоретические описания согласуются с
экспериментальными
данными,
которые
были
получены
для
определения
интерферона-γ с помощью иммуночипа. Подставив экспериментально установленные
величины коэффициента диффузии и количества сайтов связывания, авторы
определили, что время выхода в режим стационарного потока варьирует от нескольких
секунд до 15 минут.
Особый интерес вызывают теоретические описания миниатюризированных
аналитических
систем.
Анализ
с
зонами
связывания
микронных
размеров
характеризуется изменением кинетики массопереноса и особенностями распределения
связывающегося соединения в пространстве [226]. Кроме того, поверхностная
плотность иммобилизованных реагентов может сильно варьировать от участка к
участку, что при малых размерах зон связывания ухудшает воспроизводимость
результатов иммуноанализа.
В работе Zhao M. и соавт. [227] описаны ограничения массопереноса в проточных
иммуноаналитических системах, вызываемые уменьшением зон связывания. Скорость
потока влияет на время контакта антигена и антитела, а соответственно – и на
эффективность образования иммунного комплекса. Максимальная степень связывания
аналита на фронтальной границе микрозон отмечается при низкой скорости потока, что
вызвано концентрационным истощением реагента при движении вдоль зоны
связывания. С ростом скорости потока увеличивается ширина окрашенной части зоны.
51
Иммунореагент, иммобилизуемый на мембране, распределяется неравномерно и
концентрируется по периметру зоны. Это неравномерное распределение при низкой
скорости потока вызывает еще большую неравномерность связывания и отклонения от
теоретической модели [227].
Рассмотрим математические описания иммунохроматографических тест-систем.
Особенностью гетерогенных тестов является отличие иммунохимических свойств
реагентов в растворе и в иммобилизованном состоянии. Рассмотрение процессов,
происходящих при проведении ИХА, требует учета свойств мембранных носителей
[228; 229]. В работе [228] проводилось сравнение мембран трех производителей: Grace
Bio-Labs (США), GE Whatman (Великобритания) и Sartorius (Германия). Несмотря
на одинаковый химический состав, мембраны отличаются по размерам пор и их
взаимному расположению, что влияет на распределение иммобилизованного
иммунореагента и, как следствие, может вызывать неравномерное окрашивание зон
связывания.
Qian S. и Bau H.H. предложили модели, описывающие процессы в
иммунохроматографических тестах при проведении конкурентного и сэндвич анализа
[230; 231]. Модели рассматривают реакции первого порядка с предварительной
инкубацией образца и конъюгата маркер-антитело, т.е. детектирующий конъюгат не
наносится предварительно на тест-полоску, а добавляется в виде раствора к пробе. Это
упрощение позволяет считать, что весь аналит пробы связывается с конъюгатом и
попадает на мембрану. При создании моделей были приняты следующие приближения:
- иммобилизованный иммунореагент не изменяет структуру мембраны и ее
проницаемость для жидкости;
- частицы маркера движутся вместе с потоком жидкости и не остаются внутри
пористой матрицы мембраны.
Для конкурентного формата анализа модель устанавливает следующую
зависимость равновесной концентрации комплекса антиген – антитело ([PAe]) от
параметров системы:
[𝑃𝐴𝑒 ] =
𝑘
𝑘
[𝐴0 ]+[𝑃0 ]+ 𝑑1 −√([𝐴0 ]+[𝑃0 ]+ 𝑑1)2 −4[𝐴0 ][𝑃0 ]
𝑘𝑎1
𝑘𝑎1
2
52
, (7)
где [А0] – исходная концентрация аналита в пробе; [Р0] – исходная концентрация
антител в конъюгате с маркером; kd1 и ka1 – константы диссоциации и ассоциации для
реакции A+P↔PA.
Скорость образования комплекса антиген – антитело (PA) пропорциональна
концентрациям свободных антигена и конъюгата. В аналитической зоне образуется
комплекс конъюгата антитело-маркер (A) с иммобилизованным на мембране
антигеном (RT). Скорость образования этого комплекса (FRTP) описывается формулой:
𝐹𝑅𝑇𝑃 = 𝑘𝑎2 [𝑃]([𝑅𝑇0 ] − [𝑅𝑇 𝑃]) − 𝑘𝑑2 [𝑅𝑇 𝑃], (8)
где kd2 – кинетическая константа диссоциации комплекса антиген – антитело; ka2–
кинетическая
константа
ассоциации;
[RT0]
–
начальная
концентрация
иммобилизованного антигена.
Используя начальные концентрации реагентов и кинетические константы
ассоциации и диссоциации иммунохимического взаимодействия, авторы предложили
следующую формулу для теоретического расчета величины аналитического сигнала –
связывания маркера в аналитической зоне иммунохроматографической тест-полоски:
∆𝑆𝑇 ~
𝑘𝑑2 +𝑘𝑎2 ([𝑃0 ]+{𝑅𝑇0 ])
𝑘𝑑2 +𝑘𝑎2 [𝑃0 ]
[𝑃0 ]. (9)
Исходя из аналогичных приближений, в работе [231] Qian S. и Bau H.H.
предложили математическое описание «сэндвич»-формата ИХА. Для данной модели
концентрация комплекса маркер-антитело – антиген – антитело (RPA), образующегося
и детектируемого в аналитической зоне, определяется в соответствии с формулой.
[𝑅𝑃𝐴] =
𝑘𝑎3 𝑘𝑑2 [𝑅0 ][𝑃𝐴𝑒 ]
, (10)
𝑘𝑑2 (𝑘𝑑3 +𝑘𝑎3 [𝑃𝐴𝑒 ])+𝑘𝑎2 𝑘𝑑3 [𝐴𝑒]
где kd2 – кинетическая константа диссоциации комплекса антигена и антител,
иммобилизованных на мембране; kd3 – кинетическая константа диссоциации комплекса
RPA; ka2 – кинетическая константа ассоциации комплекса антигена и антител,
иммобилизованных на мембране; ka3 – кинетическая константа ассоциации комплекса
RPA; [P0] – начальная концентрация антител в конъюгате антитело–маркер; [R0] –
начальная концентрация иммобилизованных антител; [A0] – начальная концентрация
свободного аналита.
Полученные математические описания конкурентного и «сэндвич»-определения
аналитов согласуются с экспериментальными результатами [230; 231].
53
Влияние расположения аналитических зон на предел обнаружения в «сэндвич»формате иммунохроматографического анализа рассмотрено Ragavendar M.S. и Anmol
C.M. [232]. Авторами предложены математические описания процессов, протекающих
до попадания реагентов в аналитическую зону и непосредственно в аналитической
зоне. Моделирование в работе [232] основывается на предположении об одинаковой
скорости движения всех реагентов по мембране. До попадания в аналитическую зону
конъюгат маркер-антитело образует комплекс с аналитом (РА).
Аналитическая зона должна быть расположена на таком расстоянии от мембраны
с
конъюгатом, которое
позволяет концентрации
комплекса
РА достигнуть
максимального значения. С использованием расчетных значений концентрации
комплекса РА в статье определено, что это расстояние зависит от скорости
капиллярного потока и для разных типов мембран варьирует от 2,4 до 12,1 см.
Показано, что аналитическую зону, расположенную на оптимальном расстоянии,
фронт жидкости достигает в среднем за 240 с.
Кроме того, по мнению Ragavendar M.S. и Anmol C.M., необходим выбор
оптимальной ширины аналитической зоны, которая регулируется скоростью и
объемом нанесения реагентов на мембрану при изготовлении тест-системы. Ширина
аналитической зоны влияет на время анализа и объем пробы, необходимые для
достижения минимального предела обнаружения.
При прохождении реагентов через аналитическую зону смещается равновесие
иммунохимической реакции в растворе. Степень этого смещения зависит как от
концентрации иммобилизованного реагента, так и от скорости потока. Чем больше
время прохождения, тем существеннее изменяются концентрации реагентов. Для
поддержания этих концентраций на постоянном уровне необходимо увеличение
объема пробы, проходящего через аналитическую зону.
Представленные
результаты
моделирования
позволяют
утверждать,
что
возможности существующего теоретического аппарата как средства прогнозирования
свойств
гетерогенных
иммунохимических
тест-систем
весьма
ограничены.
Аналитические характеристики разрабатываемых тест-систем и условия, необходимые
для достижения анализом минимального предела обнаружения, должны определяться
экспериментально. Тем не менее, значения констант связывания иммунохимической
54
реакции в существенной степени влияют на возможности иммуноанализа и в связи с
этим должны учитываться при его разработке.
*
*
*
Как следует из представленного рассмотрения литературы, на сегодняшний день
успешно реализован ряд подходов для экспрессного определения аналитов с помощью
иммунохимических
тест-методов.
Однако
необходимость
одновременного
определения нескольких соединений требует разработки новых тест-систем,
перспективными методическими решениями для которых являются пространственное
разделение аналитических зон и использование маркеров с разными оптическими
свойствами.
Поэтому целью данной диссертационной работы является изучение свойств
комплексов антител с нанодисперсными носителями и их применение в разработке
новых иммунохроматографических тест-систем.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач,
определяющих структуру исследования:

охарактеризовать размерные и оптические свойства комплексов антител с
наномаркерами разной природы,

определить и сопоставить кинетические и равновесные константы
взаимодействия с антигеном конъюгата антитело–флуоресцентный маркер и
немодифицированных антител,

изучить закономерности взаимодействия иммунореагентов, меченных
нанодисперсными маркерами, в иммунохроматографических тест-системах с фото- и
флуориметрической детекцией и провести сравнительную оценку этих тест-систем,

разработать
иммунохроматографические
тест-системы
с
одним
и
несколькими флуоресцентными нанодисперсными маркерами и определить их
аналитические параметры,

охарактеризовать
возможности
повышения
информативности
иммунохроматографии посредством проведения анализа с двумерно упорядоченным
массивом зон связывания разной специфичности.
55
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы и оборудование
В работе были использованы следующие реагенты:
хлорамфеникол (ХФ), натриевая соль сукцината хлорамфеникола (ХФ-Cу),
стрептомицин (СТМ), офлоксацин (ОФЛ), растворы морфина, амфетамина,
метамфетамина
и
бензоилэкгонина
в
метаноле
(1
мг/мл),
3,3',5,5'-
тетраметилбензидин (ТМБ), азид натрия, бычий сывороточный альбумин (БСА),
соевый ингибитор трипсина (СИТ), детергенты Твин-20, Х-305, Х-705, Х-45, Х-114,
Бридж L 35 и флуоресцентный краситель Родамин 6G, Трис – «Sigma» (США);
моноклональные
антитела
против
морфина,
метамфетамина
и
бензоилэкгонина, любезно предоставленные к.б.н. Кравченко И.В. (Институт
биохимии им. А.Н. Баха РАН);
моноклональные антитела против амфетамина, конъюгаты бензоилэкгонинБСА, морфин-БСА, амфетамин-БСА и метамфетамин-БСА, козьи антитела против
иммуноглобулинов мыши – «Arista Biologicals» (США);
конъюгаты коллоидного золота (КЗ) с антителами против бензоилэкгонина,
морфина, амфетамина и метамфетамина, иммунохроматографические моно-тесты
для индивидуального определения бензоилэкгонина, морфина, амфетамина и
метамфетамина, любезно предоставленные Бызовой Н.А. (Институт биохимии им.
А.Н. Баха РАН);
моноклональные антитела против иммуноглобулина Е человека (АТ/IgE)
(подкласс IgG 1, клон 4F4) – «Полигност» (Санкт-Петербург);
моноклональные антитела против хлорамфеникола и против стрептомицина,
любезно предоставленные проф. Свешниковым П.Г. (Всероссийский научный центр
молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ), Москва);
моноклональные антитела против офлоксацина и конъюгат офлоксацин-БСА «Proteogenix» (Франция);
гидрохлорид
N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид
dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide
гидроксисукцинимид
натрия
hydrochloride,
EDC),
(sulfo-N-hydroxysuccinimide,
золотохлористоводородная кислота – «Fluka» (Швейцария);
56
(N-(3сульфо-N-
sulfo-NHS),
сульфонат
1-циклогексил-3-(2-морфолино-этил)карбодиимидмето-п-толуол
(1-cyclohexyl-3-(2-morpholiny-(4)-ethyl)carbodiimide (me-p-tol sulfonate)) (CCMS),
N,N-диметилформамид (ДМФА) – «MP Biomedicals» (США);
водорастворимые квантовые точки (КвТ) состава CdSe/ZnS с пиками
флуоресценции 525, 585 и 625 нм, покрытые полимерной оболочкой с
карбоксильными группами, (кат. №№ Q21341MP, Q21311MP и А10200) –
«Invitrogen» (США);
конъюгат поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши с
пероксидазой хрена – опытное производство НИИ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи (Москва);
хлорид натрия, карбонат калия – «ДиаэМ» (Россия);
карбонат натрия, гидрокарбонат натрия, сульфат аммония, дигидрофосфат
калия, гидроксид калия, тетраборат натрия, этиловый спирт, пероксид водорода –
«Химмед» (Россия);
детергент Тритон Х-100 – «Panreac» (Испания);
флуоресцентный
тетрафеноксиперилен
краситель
N,N-бис(2,6-диизопропилфенил)-1,6,7,12-
3,4:9,10-тетракарбоксидиимид
(Rot-300)
–
«BASF»
(Германия);
комплект иммунохроматографических мембран «MdiEasypack» (пластиковая
подложка, рабочие нитроцеллюлозные мембраны CNPC, CNPF и CNPH с размером
пор от 5 до 15 мкм (CNPF 5, CNPF 8, CNPF 10, CNPC 10, CNPC 12, CNPC 15, CNPH
90, CNPH 200), предобработанная мембрана для пробы R7L, стекловолоконная
мембрана РТ-R7, впитывающая мембрана АР045) – «Advanced Microdevices» (MDI)
(Индия);
микроцентрифужные пробирки Amicon Ultracel 100K, нитроцеллюлозные
мембраны со скоростью капиллярного потока 75, 180 и 240 с/4 см – «Millipore»
(США);
гель-фильтрационные колонки (высота 75 мм, внутренний диаметр 5 мм) с
сорбентом Sephadex G-100 – «MP Biomedicals» (США);
диализные мешки D9277-100FT (молекулярная масса отсечения 14 000 Да) –
«Sigma-Aldrich» (США);
иммуноферментные
наборы
для
определения
57
уровня
общего
IgE
и
специфических IgE в сыворотке крови человека – «Dr. Fooke» (Германия);
HEPES-P буфер (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) – «Biacore
AB» (Швеция);
чипы СМ5 для работы с проточной сенсорной системой Biacore X – «GE
Healthcare Life Sciences» (Великобритания);
микропланшеты
из
оптически
прозрачного
полистирола
с
высокой
связывающей способностью, тип 9018, для проведения ИФА – «Costar» (США);
медные сетки для просвечивающей электронной микроскопии – «TedPella»
(США).
Все реагенты аналитической или химической чистоты. Все водные растворы
готовили на деионизированной воде (не менее 18,2 MΩ·см при 25ºС, система
«Simplicity» фирмы «Millipore», США).
2.2 Методы
2.2.1 Синтез конъюгата хлорамфеникол-соевый ингибитор трипсина
Модифицированное производное хлорамфеникола, ХФ-Су, было ковалентно
присоединено к СИТ методом карбодиимидно-сукцинимидного синтеза по [233] с
модификациями. Для активации производного хлорамфеникола в 1 мл ДМФА
последовательно вносили навески 8,5 мг (75 мкмоль) NHS, 32 мг (75 мкмоль) CCMS
и 22 мг (50 мкмоль) ХФ-Су и оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем
10 мг СИТ растворяли в 1 мл 50 мМ карбонатного буферного раствора, рН 9,6, и
добавляли ДМФА до конечного содержания 5%. Раствор белка выдерживали 1 час
при 4ºС, затем к нему по каплям добавляли полученный раствор активированного
ХФ-Су в ДМФА (200 мкл), постоянно перемешивая. В результате мольное
соотношение ХФ : СИТ составило 20:1. Смесь перемешивали в течение 2 часов при
комнатной температуре и затем инкубировали в течение ночи при 4ºС. Полученный
конъюгат диализовали против 50 мМ фосфатного буферного раствора, pH 7,4 (ФБС).
Концентрацию конъюгата определяли, измеряя значение оптической плотности
раствора при длине волны 280 нм и сравнивая с оптической плотностью исходного
раствора
СИТ.
Для
измерения
оптической
плотности
использовали
спектрофотометр «UV-1202» («Shimadzu», Япония). Диализованный препарат
конъюгата хранили при -20 ºC.
58
2.2.2
Определение
титров
антител
против
антибиотиков
методом
твердофазного иммуноферментного анализа
Растворы конъюгатов гаптен-белок (ХФ-СИТ, ОФЛ-БСА или СТМ-ОВА)
вносили в лунки микропланшета (0,5 мкг/мл, ФБС, по 50 мкл в лунку) и
инкубировали в течение ночи при 4ºC. Лунки подвергали четырехкратной промывке
ФБС с 0,05% Тритона Х-100 (ФБСТ). Далее вносили растворы антител против
соответствующего антигена в диапазоне концентраций от 10 мкг/мл до 150 пг/мл (в
ФБСТ, по 50 мкл в лунку) и инкубировали в течение 1 часа при 37ºC. Лунки
подвергали четырехкратной промывке ФБСТ. На следующем этапе вносили
препарат
антивидовых
(антимышиных)
антител,
меченных
пероксидазой
(разведение коммерческого препарата в ФБСТ составило 1:6000, по 50 мкл в лунку)
и инкубировали в течение 1 часа при 37ºC. Лунки подвергали четырехкратной
промывке ФБСТ и однократной промывке дистиллированной водой.
Пероксидазную активность метки, связавшейся в ходе анализа с поверхностью
лунки в составе иммунного комплекса, определяли следующим образом [8]. В
качестве субстрата использовали 0,42 мМ раствор ТМБ в 0,1 М цитратном буферном
растворе, рН 4,0, содержащий 1,8 мМ пероксида водорода. В лунки микропланшета
вносили по 50 мкл субстратного раствора и инкубировали 15 минут при комнатной
температуре
и
постоянном
перемешивании.
Ферментативную
реакцию
останавливали добавлением 25 мкл 1 М раствора серной кислоты. Оптическую
плотность продуктов реакции измеряли при длине волны 450 нм. Для регистрации
оптической плотности при проведении иммуноферментного анализа и гомогенных
реакций в лунках микропланшетов использовали вертикальный фотометр ZENYTH
3100 («Anthos Labtec Instruments», Австрия).
2.2.3 Определение антибиотиков методом конкурентного твердофазного
иммуноферментного анализа
Растворы конъюгатов гаптен-белок (ХФ-СИТ, ОФЛ-БСА или СТМ-ОВА)
адсорбировали в лунках микропланшета, как описано в п. 2.2.2. Затем лунки
подвергали четырехкратной промывке ФБСТ. На следующем этапе в лунки вносили
растворы антибиотиков-конкурентов в диапазоне концентраций: ХФ – от 1 мкг/мл
до 5 пг/мл; ОФЛ – от 10 мкг/мл до 56 пг/мл; СТМ – от 100 мкг/мл до 0,5 нг/мл в
ФБСТ, по 25 мкл в лунку. Также вносили по 25 мкл растворов соответствующих
59
антител в ФБСТ, чтобы их концентрации в лунке составили: для АТ/ХФ – 0,1 мкг/мл,
для АТ/ОФЛ – 0,08 мкг/мл и для АТ/СТМ – 0,13 мкг/мл (оптимальные концентрации
были выбраны на основании результатов титрования антител). Смеси инкубировали
в течение 1 часа при 37ºC, затем лунки подвергали четырехкратной промывке ФБСТ.
Последующие стадии инкубации антивидовых антител, меченных пероксидазой, и
определение ферментативной активности связавшейся метки проводили по
методике, описанной выше (см. п. 2.2.2).
2.2.4 Синтез, выделение и характеристика конъюгатов квантовых точек с
антителами
Конъюгаты
синтезировали,
используя
модифицированную
методику,
представленную в работе [234]. Синтез проводили в двух вариантах, отличающихся
мольным соотношением КвТ и антител, – 1:2 и 1:10.
В первом варианте в раствор антител в 10 мМ фосфатном буферном растворе,
рН 7,4, с концентрацией 0,2 мг/мл добавляли 25 мкл раствора квантовых точек в
боратном буферном растворе, 50 мМ, рН 8,4–8,6 (ББ), с концентрацией 8 мкМ. Затем
в смесь последовательно добавляли по 50 мкл растворов активаторов EDC и sulfoNHS с исходной концентрацией 0,8∙мМ. Навески активаторов растворяли в
деионизованной воде непосредственно перед использованием. Таким образом,
мольное соотношение КвТ : EDC : sulfo-NHS при синтезе составило 1 : 100 : 100.
Реакционную смесь инкубировали при постоянном перемешивании на шейкере в
течение 90 мин. при комнатной температуре в темноте. Пять циклов очистки от
свободных низкомолекулярных реагентов проводили посредством диализа против
ББ с помощью микроцентрифужных пробирок Amicon Ultracel 100K, осуществляя
разделение при 10.000 g в течение 15 минут при комнатной температуре. После
каждого центрифугирования фильтрат удаляли, а продукт конъюгирования
задерживался на поверхности мембраны, пропускающей низкомолекулярные
соединения.
После
пятикратного
центрифугирования
собирали
сконцентрированный в 10 раз конъюгат.
Очистку конъюгата от несвязавшихся антител и дополнительную очистку от
свободных низкомолекулярных соединений проводили на гель-фильтрационных
колонках с сорбентом Sephadex G-100, уравновешенных ФБС. В качестве элюента
использовали ФБС.
60
Иммунохимические
свойства
фракций
конъюгата,
полученных
после
разделения на гель-фильтрационных колонках, проверяли по образованию
иммунных комплексов в мембранной системе с иммобилизованными реагентами. На
нитроцеллюлозную мембрану Millipore 180 предварительно наносили в ФБС из
концентрации 1 мг/мл иммунореагенты, взаимодействующие с антителами в
конъюгате (ХФ-СИТ, либо антивидовые (антимышиные) антитела). К фракциям
конъюгата КвТ с антителами, разведенным в 10 раз ФБС, добавляли БСА (конечная
концентрация – 2%), после чего наносили на стекловолоконную мембрану. После
полного
высыхания
мембраны
иммунохроматографической
склеивали
тест-полоски
в
(см.
соответствии
раздел
с
2.2.11).
геометрией
Полученные
мембранные системы погружали в раствор, содержащий антиген. После того, как
фронт жидкости прошел через зону с иммобилизованным иммунореагентом,
проводили приборную регистрацию интенсивности флуоресценции связанного
конъюгата (см. раздел 2.2.12). Для дальнейшей работы отбирали фракции
конъюгата, для которых интенсивность флуоресценции в зоне связывания тестполоски была выше 2 отн. ед. Для количественной оценки интенсивности
флуоресценции в мембранной системе использовали портативный флуоресцентный
детектор «Рефлеком-УФ» с встроенным программным обеспечением «Видеотест»
(«Синтеко-Комплекс», Россия).
Отобранные фракции объединяли и повторно подвергали концентрированию с
одновременным диализом против ББ с помощью микроцентрифужных пробирок
Amicon Ultracel 100K, осуществляя разделение компонентов реакционной смеси при
10.000 g в течение 15 минут при комнатной температуре. После трехкратного
центрифугирования конъюгат, сконцентрированный в 10 раз, собирали в
микропробирку и хранили при 4ºС.
Вышеприведенную методику применяли для получения четырех видов
конъюгатов:
КвТ с пиком флуоресценции при 625 нм с антителами против офлоксацина
либо против хлорамфеникола,
КвТ с пиком флуоресценции при 585 нм с антителами против хлорамфеникола
и КвТ с пиком флуоресценции при 525 нм с антителами против стрептомицина.
Синтез конъюгата с мольным соотношением КвТ и антител, равным 1:10,
61
проводили по вышеописанной методике с изменениями. Для синтеза использовали
антитела против иммуноглобулина Е человека и КвТ с пиком флуоресценции при
625 нм. Концентрация антител была увеличена в 5 раз – до 1 мг/мл. Также было
увеличено количество активаторов, исходная концентрация каждого из них
составила 1,6∙10-3 М. Таким образом, мольное соотношение КвТ : EDC : sulfo-NHS
при синтезе равнялось 1 : 400 : 400. Дальнейший синтез проводился без изменений
описанной выше методики.
2.2.5 Получение наночастиц коллоидного золота
КЗ получали по протоколу [235], основанному на восстановлении катиона
золота. 1 мл 1% водного раствора HAuCl4 вносили в 100 мл воды, нагревали смесь
до кипения, а затем при интенсивном перемешивании добавляли 1,5 мл 1% водного
раствора цитрата натрия. (Процентные концентрации в обоих случаях – без учета
гидратной воды.) Раствор кипятили 15 мин, затем охлаждали и хранили при +4ºC.
2.2.6 Получение флоккуляционной кривой для взаимодействия коллоидного
золота с антителами
Использовали методику [235] с модификациями. Готовили ряд разведений
антител в воде в концентрациях от 200 до 0,5 мкг/мл. По 20 мкл этих растворов
добавляли в лунки микропланшета к 200 мкл синтезированного коллоидного золота
(А520=1). После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре в каждую
лунку вносили по 20 мкл 10%-ого раствора NaCl, через 10 мин измеряли А580 и
строили ее зависимость от концентрации антител.
2.2.7 Синтез конъюгата антител с коллоидным золотом
Синтез конъюгата КЗ с антителами проводили по методике [235] с
изменениями [83]. Антитела переводили в 10 мМ Трис-буфер, pH 8,5. Раствор
коллоидного золота доводили 1 М раствором карбоната калия до pH 8,5-9,0, после
чего антитела в количестве, выбранном на основании флоккуляционной кривой (см.
раздел 2.2.6 и главу «Результаты и их обсуждение»), при интенсивном
перемешивании вносили в раствор коллоидного золота. Раствор инкубировали при
комнатной температуре в течение 15 мин, затем добавляли 10%-ный водный раствор
БСА (v:v=40:1) и при интенсивном перемешивании инкубировали еще 10 мин.
Частицы золота с иммобилизованными на их поверхности антителами осаждали
центрифугированием при 13.000 g и 4ºC в течение 15 мин. Удаляли надосадок,
62
осадок перерастворяли в 10 мМ Трис-буфере, pH 8.5, с 1% БСА и 1% сахарозы и
вновь центрифугировали в тех же условиях. Закончив процедуру переосаждения,
осадок перерастворяли в том же буферном растворе, добавляли азид натрия до
конечной концентрации 0,05% и хранили при 4ºС.
2.2.8 Определение относительного квантового выхода свободных квантовых
точек и их конъюгатов
Применяемая методика (по [236] с модификациями) заключается в сравнении
исследуемого
и
стандартного
соединений
по
спектрам
пропускания
и
флуоресценции. Для работы использовали растворы реагентов в концентрациях
10-8 М (конъюгат КвТ и неконъюгированная форма КвТ), 10 -10 М (Rot-300) и 10-6 М
(Родамин 6G). В качестве растворителя для Rot-300 и Родамина 6G применяли
этиловый спирт, а для конъюгата КвТ и неконъюгированных КвТ – ББ. Для
измерения интенсивности флуоресценции использовали флуориметр «RF-5310»
(«Shimadzu», Япония). Спектры флуоресценции получали, возбуждая препараты
светом со спектральным максимумом при 340 нм.
Квантовый выход флуоресценции вычисляли по формуле:
I
x
x  
I
  st  (1  Tst )

 (1  Tx )
st
, (11)
где φх и φst – квантовые выходы исследуемого соединения и стандарта,
соответственно;
I
x
и
I
 st
– интегральные интенсивности флуоресценции
исследуемого соединения и стандарта; Т – пропускание исследуемого соединения и
стандарта при длине волны возбуждения флуоресценции.
Характеристикой интегральной интенсивности флуоресценции препарата
считали площадь под спектром флуоресценции.
2.2.9 Определение гидродинамических радиусов наночастиц и их конъюгатов
с антителами
Применяемая методика (по [237] с модификациями) заключается в регистрации
рассеяния света от индивидуальных наночастиц. Динамическое рассеяние света
(ДРС) регистрировали с использованием приборного комплекса «Photocor»
(«Photocor Instruments», США) c гелий-неоновым лазером (632,8 нм, мощность 10
мВт, «Coherent», США). Все препараты в течение 5 мин перед проведением
63
измерений термостатировали при 25°С в стеклянной цилиндрической кювете
(внутренний диаметр 6,3 мм) с плотной крышкой. Распределение частиц коллоидов
и их конъюгатов с антителами по величине гидродинамического радиуса получали
при 25°С, регистрируя рассеяние света под углом 90°. Накопление данных о
рассеянии света проводили в течение 1 мин, регистрируя автокорреляционную
функцию (как рекомендовано в [238]). Результаты измерений обрабатывали с
помощью программы DynaLS_v2.5.2 («Alango», Израиль), исходя из табличных
значений для воды при 26 °С – коэффициент преломления n=1.332389, вязкость
=0.8705, и расчетной вязкости для ББ – =0,8949. Обработка результатов
проводилась совместно с к.б.н. С.Г. Роман (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН).
Препараты КЗ и конъюгатов КЗ с антителами анализировали в концентрации,
соответствующей А520 = 1,0, препараты КвТ и их конъюгатов – в концентрации 50
нМ. Все эксперименты проводили в 10 повторах, объем пробы 500 мкл.
Значение гидродинамического радиуса частиц (R) рассчитывали для каждого
эксперимента с использованием уравнения Стокса-Эйнштейна для определения
константы диффузии (D):
D
kBT
, (12)
6 R
где kB – постоянная Больцмана, T – абсолютная температура (К), ŋ – вязкость
растворителя; D – значение константы диффузии.
Погрешность определения гидродинамического радиуса вычисляли на
основании статистической обработки данных последовательных измерений.
2.2.10 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов методом
просвечивающей электронной микроскопии
Препараты наночастиц и их конъюгатов с антителами наносили на медные
сеточки (по 5 мкл) и высушивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Для
получения снимков использовали электронный микроскоп CX-100 («Jeol», Япония)
при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографии в цифровой форме анализировали
с использованием программы «UTHSCSA ImageTool» («UTHSCSA», США),
характеризуя не менее 80 изображений одиночных наночастиц. Данное программное
обеспечение позволяет измерить размеры (большая и малая полуось) изображения
каждой частицы, вычислить эффективный диаметр, коэффициент эллиптичности и
64
площадь поверхности.
2.2.11 Изготовление иммунохроматографических тест-систем
В рамках исследования было разработано и изготовлено пять видов
иммунохроматографических тест-систем:
1) моно-тест с использованием КвТ для определения ХФ в конкурентном
формате;
2) моно-тест с использованием КвТ для определения уровня общего IgE в
«сэндвич»-формате;
3) моно-тест с использованием КЗ для определения ХФ в конкурентном
формате;
4) мульти-тест с использованием различных КвТ для одновременного
определения антибиотиков разных классов (ХФ, ОФЛ и СТМ) («светофор») в
конкурентном формате;
5) мульти-тест с использованием КЗ для одновременного определения
психоактивных
соединений
разных
классов
(бензоилэкгонина,
морфина,
амфетамина и метамфетамина) в конкурентном формате.
Изготовление иммунохроматографических тест-систем включало следующие
стадии (рис. 20): 1 – нанесение растворов на рабочую мембрану для формирования
аналитических и контрольной зон; 2 – нанесение раствора конъюгата маркерантитело на стекловолоконную мембрану; 3 – высушивание мембран с нанесенными
реагентами; 4 – последовательное приклеивание мембран на пластиковую основу; 5
– нарезка листа полученного мультимембранного композита на полоски с заданной
шириной; 6 – упаковка готовых тест-полосок в кассеты (при необходимости) и затем
– в пакеты из трехслойного высокобарьерного упаковочного материала с
силикагелем.
65
Рис. 20. Последовательность стадий изготовления иммунохроматографических тестполосок (описания стадий 1-6 см. в тексте); а-в – порядок сборки
мультимембранного композита.
Формирование аналитической и контрольной зон проводили с помощью
диспенсера IsoFlow dispenser («Imagene Technology», США), нанося в виде линий
реагенты на листы нитроцеллюлозной рабочей мембраны длиной 20-22 см и
66
шириной 8-10 см. Конъюгат маркер-антитела наносили на стекловолоконную
мембрану длиной 20-22 см и шириной 0,5 см с помощью диспенсера, используя
насадку-распылитель. После нанесения иммунореагентов мембраны высушивали в
течение 20 часов. Мембраны для образца и впитывающие мембраны использовали в
виде листов длиной 20-22 см и шириной 2 см. После склеивания мембран лист
мультимембранного композита нарезали с помощью гильотинного автоматического
нарезчика Index Cutter-1 («A-Point Technologies», США) на тест-полоски шириной
3,5-4,0 мм. Нарезанные тест-полоски упаковывали вместе с расфасованным по 0,5 г
силикагелем в индивидуальные фольгированные пакеты с помощью конвейерного
запаивателя FR-900 mini-conveyor («Wenzhou Dingli Packing Machinery», Китай). В
помещении, в котором производили нанесение реагентов, сборку, нарезку и
упаковку тест-систем, поддерживалась температура 20-22°С и влажность не выше
30%. Упакованные тест-полоски хранили при комнатной температуре.
Процесс изготовления мультитеста с использованием КЗ отличался порядком
стадий. На первой стадии на лист рабочей мембраны с помощью диспенсера
наносили раствор для формирования контрольной зоны. На стекловолоконную
мембрану наносили смесь конъюгатов КЗ-антитела. Мембраны высушивали и
проводили
сборку
мультимембранного
композита,
включающего
рабочую
мембрану, мембраны для конъюгата и образца и впитывающую мембрану. На
следующем этапе лист мультимембранного композита нарезали на тест-полоски
шириной 5,0 мм.
На последней стадии изготовления наносили аналитические зоны – массив из
микроточек, которые формировали контактным способом с помощью стального
пина (рис. 21). Программно-контролируемый манипулятор («Синтеко-Комплекс»,
Россия) использовали для перемещения реагентов посредством пина из 384луночного полистиролового планшета, периодически промывая пин. Внутренний
диаметр пина – 200 мкм, что позволяет набирать растворы иммунореагентов за счет
капиллярных сил. Объем наносимой капли – 20 нл, диаметр формирующейся точки
в аналитической зоне мембраны – 250 мкм.
67
А
Б
Рис. 21. Структура рабочего канала пина (А) и его использование для нанесения
реагентов на мембрану (Б).
Вышеперечисленные иммунохроматографические тест-системы отличаются
количеством аналитических зон, свойствами используемых маркеров и количеством
используемых иммунореагентов. Подробные условия формирования каждого вида
тест-полосок представлены в таблице 2.
.
68
Таблица 2. Условия нанесения реагентов при изготовлении иммунохроматографических тест-систем.
Вид иммунохроматографической тест-системы
Моно-тесты на основе КвТ
Параметр
ХФ
Рабочая мембрана
Состав
IgE
Мульти-тест на
Моно-тест на
основе КвТ для
основе КЗ для
определения
определения ХФ
антибиотиков
Мульти-тест на основе КЗ
для определения
психоактивных соединений
CNPC 12 мкм
CNPC 12 мкм
CNPF 10 мкм
Millipore 180
CNPF 10 мкм
КвТ 625-
КвТ 625-
КЗ-АТ/ХФ
Смесь
Смесь
АТ/ХФ
АТ/IgE
КвТ 625-АТ/ОФЛ,
КЗ-АТ/бензоилэкгонина,
КвТ 585-АТ/ХФ и
КЗ-АТ/морфина,
КвТ 525-АТ/СТМ
КЗ-АТ/амфетамина и
Конъюгат маркер-АТ
КЗ-АТ/метамфетамина
Концентрация
7 нМ
10 нМ
D520=2,0
4,8 нМ : 48 нМ : 72
D520=3,0 для каждого
нМ
Среда нанесения
ББ с 2% БСА
ББ с 2% БСА
Трис-буфер
ББ с 2% БСА
Трис-буфер (50 мМ, рН 7,5)
20
32
(50 мМ, рН 7,5)
Расход при нане-
20
20
32
сении, мкл/см
69
Состав
ХФ-СИТ
АТ/IgE
ХФ-СИТ
ХФ-СИТ, ОФЛ-БСА,
бензоилэкгонин-БСА;
СТМ-ОВА
морфин-БСА; амфетамин-
Реагент в аналитической зоне
БСА; метамфетамин-БСА
Концентрация,
3,0
0,25
0,3; 0,5; 1,0
мг/мл
Среда
0,06 или 0,25; 0,125 или 0,5;
1,25 или 5; 1,25 или 5
ФБС
ФБС
ФБС
ФБС
0,2 М карбонатный
буферный раствор, рН 9,0;
ФБС
Расход при нане-
1
1
2
1
Объем для нанесения 20 нл
козьи
козьи
козьи
козьи антимышиные
козьи антимышиные
антитела
антитела
сении, мкл/см
Состав
Реагент в контрольной зоне
0,15
антимышиные антимышиные антимышиные
антитела
антитела
антитела
0,25
1,0
0,25
1,0
0,25
Среда
ФБС
ФБС
ФБС
ФБС
ФБС
Расход при нане-
1
1
2
1
2
Концентрация,
мг/мл
сении, мкл/см
70
2.2.12 Проведение иммунохроматографического анализа
Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре.
Край тест-полоски погружали в тестируемую пробу на 10 мин, затем вынимали и
измеряли
интенсивность
окрашивания
или
флуоресценции
аналитических и
контрольной зон.
Для иммунохроматографических тест-систем на основе КЗ при количественной
оценке результатов использовали сканер CanoScan LiDE 90 («Canon», Япония) и
последующую обработку изображений с помощью программы TotalLAB («Nonlinear
Dynamics», Великобритания) [239]. Для иммунохроматографических тест-систем на
основе КвТ при регистрации результатов использовали портативный флуоресцентный
детектор «Рефлеком-УФ» с встроенным программным обеспечением «Видеотест»
(«Синтеко-Комплекс», Россия).
Для мультиплексной иммунохроматографической тест-полоски на основе КЗ при
количественной оценке результатов использовали сканер CanoScan LiDE 90 («Canon»,
Япония) и последующую обработку изображений с помощью программы «Видеодот»
(«Синтэко-Комплекс», Россия). Процедура вычислений включала определение границ
пятен – зон связывания, суммирование интенсивностей всех пикселей, относящихся к
данной зоне, с последующим нормированием полученных численных значений на
площадь пятна.
2.2.13 Определение аналитических характеристик тест-систем
Полученные калибровочные зависимости аналитического сигнала (Y) от
концентрации аналита (х) подвергались аппроксимации в соответствии с четырехпараметрическим уравнением:
Y = ((A – D)/(1 + (x/C)B)) + D, (13)
где
А
–
асимптотический
максимум;
В
–
точка
перегиба
кривой
в
полулогарифмических координатах; С – концентрация аналита в точке перегиба
кривой; D – асимптотический минимум (интенсивность фонового сигнала) [240].
Предел обнаружения аналитической системы (ПрО) – наименьшее содержание
аналита, при котором с помощью данной системы можно обнаружить определяемое
соединение с заданной вероятностью [241]. Предел обнаружения для конкурентного
формата иммуноанализа соответствует количеству аналита, которое ингибирует
связывание детектирующего конъюгата на 10% [223]. С учетом аппроксимации
71
калибровочных зависимостей ПрО определяли по формуле [242]:
ПрО = IC10 = C·((A+29·D)/(9·A - 19·D)1/B). (14)
Для «сэндвич»-формата анализа ПрО определяли как концентрацию аналита, при
которой регистрируемый сигнал (интенсивность окрашивания или флуоресценции
аналитической зоны) в 3 раза превосходит стандартное отклонение фонового сигнала:
ПрО = 3·sфон (15)
Степень открытия (R, %) в экспериментах «введено-найдено» вычисляли по
формуле:
R = (xэксп/xтеорет)∙100%, (16)
где xтеорет – вводимая концентрация аналита, xэксп – концентрация аналита, вычисленная
по градуировочной кривой.
2.2.14 Измерение констант иммунохимических реакций антител против
хлорамфеникола и их конъюгата с квантовыми точками с использованием прибора
Biacore X
Количественную характеристику взаимодействия антитело–антиген проводили с
помощью проточной сенсорной системы Biacore X производства «Biacore AB»,
Швеция, на основе регистрации поверхностного плазмонного резонанса. Для
измерений
использовали
сенсорные
чипы
CM5
с
двумя
последовательно
соединенными каналами (контрольным и опытным).
Иммобилизацию реагентов на поверхности чипа проводили согласно стандартной
процедуре [243], которая включала: 1) активацию карбоксильных групп на
поверхности чипа; 2) взаимодействие с активированными группами в первом канале
чипа конъюгата ХФ-БСА, а во втором – БСА в качестве отрицательного контроля; 3)
блокирование непрореагировавших активных групп. Чип активировали, пропуская
смесь водных растворов 1-гидрохлорид-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид
: N-гидроксисукцинимид, 1:1, с концентрациями 0,1 и 0,4 М, соответственно, объемом
70 мкл при скорости потока 5 мкл/мин. Затем при той же скорости пропускали раствор
иммобилизуемого реагента (70 мкл) выбранном концентрации и в выбранном буфере.
Конъюгат ХФ-БСА и БСА иммобилизовали в концентрации 100 мкг/мл в 10 мМ Naцитратном буферном растворе. Оптимальное значение рН буферного раствора
определяли экспериментально, сопоставляя варианты с рН от 2,5 до 5,5.
Непрореагировавшие активные группы блокировали 1 М этаноламином, pH 8,5 (70
72
мкл) при скорости потока 5 мкл/мин. Подготовленные таким образом чипы хранили
при 4°С, погруженными в буферный раствор 10 мM HEPES, pH 7,4, содержащий 150
мM NaCl и 0,005% детергента Твин-20.
Далее для регистрации иммунохимических взаимодействий в ячейку прибора
последовательно вводили: 1) антитела в концентрации от 26 до 400 нМ в 10 мM
буферном растворе HEPES, pH 7,4, содержащем 150 мM NaCl и 0,005% детергента
Твин-20; 2) 10 мM HEPES, pH 7,4, содержащий 150 мM NaCl и 0,005% детергента Твин20; 3) регенерирующий реагент (100 мМ глицин-HCl, pH 1,5). Скорость потока
составляла 10 мкл/мин. Для каждой концентрации антител или конъюгата регистрацию
иммунохимических взаимодействий проводили трехкратно.
Прибор автоматически определяет разницу между данными для канала с
иммобилизованным конъюгатом ХФ-БСА и контрольного канала с БСА в зависимости
от времени и генерирует сенсограмму – зависимость регистрируемого сигнала
(отражающего связывание молекул на поверхности сенсора) от времени. В качестве
отклика сенсора рассматривали значение ППР, измеренное через 5 мин после введения
образца в ячейку [244].
2.2.15 Расчет констант взаимодействия антитело-антиген, полученных с
использованием прибора Biacore X
Аппроксимацию концентрационных зависимостей и вычисление равновесных и
кинетических констант связывания и диссоциации проводили с помощью программы
BIAevaluation «1:1 (Langmuir) binding» («BiacoreAB», Швеция).
2.2.16 Определение титров антител против иммуноглобулина E методом
твердофазного иммуноферментного анализа
Растворы конъюгатов гаптен-белок (ХФ-СИТ, ОФЛ-БСА или СТМ-ОВА)
вносили в лунки микропланшета (0,5 мкг/мл, ФБС, по 50 мкл в лунку) и инкубировали
в течение ночи при 4ºC. Лунки подвергали четырехкратной промывке ФБС с 0,05%
Тритона Х-100 (ФБСТ). Далее вносили растворы антител против соответствующего
антигена в диапазоне концентраций от 10 мкг/мл до 150 пг/мл (в ФБСТ, по 50 мкл в
лунку) и инкубировали в течение 1 часа при 37ºC. Лунки подвергали четырехкратной
промывке ФБСТ. На следующем этапе вносили препарат антивидовых (антимышиных)
антител, меченных пероксидазой (разведение коммерческого препарата в ФБСТ
составило 1:6000, по 50 мкл в лунку) и инкубировали в течение 1 часа при 37ºC. Лунки
73
подвергали
четырехкратной
промывке
ФБТ
и
однократной
промывке
дистиллированной водой.
Пероксидазную активность метки, связавшейся в ходе анализа с поверхностью
лунки в составе иммунного комплекса, определяли следующим образом [8], описанном
в разделе 2.2.2.
74
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Целью работы является изучение свойств комплексов антител с нанодисперсными
носителями и их применение в новых иммунохроматографических тест-системах.
Достижение поставленной цели требует решения следующих задач:
1) Синтез и характеристика конъюгатов нанодисперсных маркеров с антителами;
2) Сравнительная характеристика маркеров с оптической и флуоресцентной
детекцией для иммунохроматографических тест-систем;
3) Разработка иммунохроматографических тест-систем на основе квантовых
точек;
4)
Разработка мультиплексных иммунохроматографических тест-систем.
В соответствии с этими задачами структурированы представленное ниже
изложение полученных экспериментальных результатов и их интерпретация.
В качестве исследуемых маркеров были выбраны коллоидное золото (КЗ) –
оптическая детекция – и квантовые точки (КвТ) – флуоресцентная детекция. Для
подтверждения общего характера наблюдаемых закономерностей работы проводились
с использованием антител против низкомолекулярных (антибиотики – хлорамфеникол,
стрептомицин, офлоксацин; психоактивные соединения – морфин, амфетамин,
метамфетамин, бензоилэкгонин) и высокомолекулярных (иммуноглобулин Е человека)
антигенов.
3.1 Синтез конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами
3.1.1 Синтез конъюгата квантовых точек с антителами
Конъюгирование наночастиц и антител может осуществляться различными
способами, включая иммобилизацию антител за счет физической адсорбции
(нековалентных взаимодействий), образование ковалентных связей между активными
группами антител и наночастиц, ковалентную пришивку антител к дополнительному
покрытию наночастиц [235; 245]. Для конъюгирования КвТ используют ковалентное
взаимодействие с полимерами, покрывающими оболочку КвТ [234; 246; 247].
В диссертационной работе для получения конъюгатов КвТ с антителами был
применен метод активированных эфиров (карбодиимидно–сукцинимидный), выбор
которого обусловлен высоким выходом, методической простотой, отсутствием
75
денатурирующих воздействий на антитела, а также возможностью контролировать
количество иммобилизованных антител и получать стабильные препараты [248]. По
данным производителя использованных в работе КвТ, фирмы «Invitrogen», на
поверхности одной наночастицы находится около 100 карбоксильных групп [249]. Для
увеличения выхода конъюгата КвТ-АТ карбоксильные группы на поверхности
полимерного покрытия КвТ активировали с помощью EDC и sulfo-NHS в количестве,
четырехкратно (в мольном выражении) превосходящем количество карбоксильных
групп. Конъюгирование с антителами происходило путем образования амидной связи
с аминогруппами остатков лизина (рис. 22).
Рис. 22. Схема получения конъюгата КвТ с белком карбодиимидно–сукцинимидным
методом.
Получено пять препаратов конъюгатов КвТ с антителами к различным антигенам:
КвТ 625-АТ/ХФ; КвТ 625-АТ/ОФЛ; КвТ 585-АТ/ХФ; КвТ 525-АТ/СТМ; КвТ 625АТ/IgE. При синтезе конъюгатов КвТ 585-АТ/ХФ и КвТ 625-АТ/IgE мольное
соотношение реагентов КвТ : IgG : EDC: sulfo-NHS составляло 1 : 10 : 400 : 400; для
конъюгатов КвТ 625-АТ/ХФ, КвТ 625-АТ/ОФЛ и КвТ 525-АТ/СТМ соотношение
равнялось 1 : 2 : 200 : 200. По окончании реакции для удаления избытка активаторов
76
проводили концентрирование конъюгата с одновременным диализом против
боратного буферного раствора (рН 8,3, 50 мМ) (ББ).
Для повышения уровня специфического взаимодействия конъюгата КвТ-антитело
и снижения предела обнаружения антигена требуется очистка синтезированного
иммунореагента от несвязавшихся антител и наночастиц. Для очистки конъюгатов КвТ
с биомолекулами от компонентов реакционной смеси после конъюгирования
применяются два способа: осаждение конъюгата центрифугированием [250; 251] и
разделение реакционной смеси на фракции с помощью гель-фильтрационных колонок
[252]. Нами был выбран второй способ очистки, реализованный пропусканием
реакционной смеси через колонку, заполненную Sephadex G-100 [253]. При гельфильтрационном разделении реакционной смеси конъюгат КвТ с антителами выходит
в первых фракциях, поэтому продукт синтеза начинали собирать с момента появления
окрашенного элюата, а заканчивали тогда, когда элюат становился визуально
прозрачным и достоверно не флуоресцировал при облучении ультрафиолетовым
светом.
Отбор фракций, включаемых в конечный препарат конъюгата, проводили по
иммунохимическим
свойствам.
Для
этого
проверяли
способность
фракций
формировать на мембране иммунные комплексы (иммобилизованные AT/IgE – IgE
человека – конъюгат КвТ – АТ/IgE) либо (иммобилизованный конъюгат белокантибиотик – конъюгат КвТ с антителами против антибиотика). К аликвотам
конъюгата КвТ с антителами, собранным при гель-фильтрации, добавляли БСА,
наносили на стекловолоконную мембрану и оставляли до полного высыхания. После
этого собирали мембранную систему (см. раздел 2.2.4) и, после элюирования
конъюгата, оценивали уровень связывания флуоресцирующей метки в зоне с
иммобилизованным
специфическим
иммунореагентом.
Результаты
тестирования на примере конъюгата КвТ – АТ/IgE представлены на рис. 23.
77
такого
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
Номер фракции
Рис. 23. Характеристика фракций конъюгата КвТ-АТ/IgE по интенсивности
флуоресценции в аналитической зоне с иммобилизованным специфическим
иммунореагентом – стандартным препаратом IgE человека.
Из рис. 2 видно, что конъюгированная форма КвТ содержится во фракциях 1–5, а
максимальное количество активного конъюгата находится во фракции 3, примерно на
40% превосходя фракции 2 и 4. Выбранные фракции 1–5 объединяли и
концентрировали со сменой использованного при конъюгировании фосфатного
буферного раствора (рН 7,4, 50 мМ) (ФБС) на ББ, т.к. для хранения препаратов,
содержащих КвТ, необходима щелочная среда [160; 249; 254].
3.1.2 Синтез конъюгата коллоидного золота с антителами
Для
сравнения
нанодисперсных
носителей
наночастицы
КЗ,
широко
используемые в коммерческих тест-системах, были выбраны в качестве маркера с
оптической детекцией.
КЗ синтезировали по протоколу [235], основанному на восстановлении катиона
золота. Полученный золь КЗ
был использован для синтеза
конъюгата с
моноклональными антителами методом физической адсорбции. Выбор оптимальной
концентрации антител для синтеза проводился с использованием флоккуляционной
кривой, получаемой по методике [235] с модификациями.
78
Флоккуляционная кривая отражает зависимость от концентрации антител
поглощения при 580 нм реакционной смеси антител и коллоида, регистрируемого
после добавления 10% NaCl. Увеличение ионной силы раствора, вызываемое NaCl,
приводит к изменениям в двойном электрическом слое наночастиц КЗ, сдвигу
равновесия между электростатическим отталкиванием и притяжением частиц и,
соответственно,
флоккуляции
КЗ,
нестабилизированного
или
недостаточно
стабилизированного иммобилизованным белком. Увеличение степени покрытия
поверхности НЧ белком приводит к стабилизации КЗ, предотвращая его агрегацию в
среде с высокой ионной силой. Процессы коагуляции регистрируются при 580 нм, что
позволяет исключить из рассмотрения поглощение немодифицированного КЗ, а также
формирование агрегатов небольшого размера [255]. С ростом количества антител
оптическая плотность во флоккуляционном эксперименте резко увеличивается,
достигая максимума, и затем снижается, выходя в точке флоккуляции на плато.
Как следует из представленных на рис. 24 экспериментальных данных (в качестве
примера рассмотрена иммобилизация антител против хлорамфеникола), диапазон
концентраций антител выше 4 мкг/мл соответствует завершению стабилизации
наночастиц. Отметим, что выход флоккуляционной кривой на плато отражает только
переход наночастиц КЗ в стабильное состояние благодаря формированию белковой
оболочки. Исходя из литературных данных, антитела в количестве, соответствующем
точке флоккуляции, занимают от 50 до 90% площади поверхности наночастицы [256].
Такие препараты нестабильны при использовании в тест-системах и требуют
дополнительной обработки. В связи с этим конъюгаты КЗ-АТ/ХФ были синтезированы
с использованием антител в концентрации вдвое большей, чем точка флоккуляции, – 8
мкг/мл.
79
0,24
A 580
0,22
0,20
0,18
Оптимум
0,16
0,14
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
C(АТ/ХФ), мкг/мл
Рис. 24. Флоккуляционная кривая иммобилизации антител против хлорамфеникола на
частицах КЗ.
В случае антител против IgE человека оптимальная концентрация для
иммобилизации, определенная в аналогичном эксперименте, составила 20 мкг/мл (рис.
25). Соответствующее количество антител против IgE стабилизирует частицы КЗ и
предотвращает их агрегацию.
0,95
0,90
0,85
0,80
A580
0,75
0,70
0,65
Оптимум
0,60
0,55
0,50
0
5
10
15
20
25
C (АТ/IgE), мкг/мл
Рис. 25. Флоккуляционная кривая иммобилизации антител против иммуноглобулина Е
на частицах КЗ.
80
3.2 Сравнительная характеристика нанодисперсных маркеров и их конъюгатов
3.2.1 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов
Размерную характеристику препаратов КвТ, КЗ и их конъюгатов проводили с
помощью
методов
просвечивающей
электронной
микроскопии
(ПЭМ)
и
динамического рассеяния света (ДРС).
Метод ПЭМ позволяет установить истинные размеры наночастиц и их
конъюгатов и провести качественную оценку степени агрегации их препаратов.
Электронно-микроскопические исследования проводили для всех препаратов
использованных в работе наночастиц и синтезированных конъюгатов. На рис. 26 в
качестве примера представлены результаты, полученные для КвТ с пиком эмиссии при
625 нм и их конъюгата с антителами против IgE человека. По данным ПЭМ средний
диаметр неконъюгированных КвТ составляет 8,9±0,1 нм (размер выборки – 194
изображения частиц) (см. рис. 26, А). Эти результаты сопоставимы с литературными
данными для КвТ сходного состава и с той же длиной волны флуоресценции [257].
Наночастицы КвТ имеют форму, близкую к сферической (коэффициент эллиптичности
1,20±0,04).
Анализ электронных микрофотографий конъюгатов (см. рис. 26, В) показал, что
конъюгированные с антителами КвТ не агрегируют, сохраняя дисперсное состояние.
На рис. 26, Г представлено распределение конъюгированных КвТ по размерам. По
данным
просвечивающей
электронной
микроскопии
частицы
конъюгата
характеризуются средним диаметром 13,5±0,3 нм (размер выборки – 178 изображений
частиц). Увеличение диаметра наночастиц конъюгата по сравнению с нативными КвТ
является следствием наличия молекул антител на поверхности КвТ.
Наночастицы КЗ были также охарактеризованы методом ПЭМ. На рис. 27
приведены электронные микрофотографии и распределение по размерам наночастиц
КЗ и их конъюгата с АТ/IgE. Средний диаметр немодифицированных частиц составил
29,3±0,5 нм (размер выборки – 114 изображений частиц), что согласуется с
экспериментальными значениями Френса – 30 нм [235] (см. рис. 27, А). Средний
диаметр наночастиц с иммобилизованными на их поверхности антителами равнялся
30,4±0,5 нм (размер выборки – 139 изображений частиц) (см. рис. 27, В).
81
Количество наночастиц, штю
Б
В
Г
Рис. 26. Данные ПЭМ для немодифицированных КвТ 625 и КвТ 625 с ковалентно
иммобилизованными антителами против IgE (разведения препаратов в ББ): А –
микрофотография свободных КвТ; Б – гистограмма распределения по размерам
свободных КвТ; В – микрофотография конъюгата КвТ-АТ/IgE; Г – гистограмма
распределения по размерам конъюгата КвТ-АТ/IgE.
82
Б
В
Г
Рис. 27. Данные ПЭМ для немодифицированных наночастиц КЗ и КЗ с
иммобилизованными антителами против IgE (разведения препаратов в 10 мМ Трисбуфере, pH 8,5): А – микрофотография свободных наночастиц КЗ; Б – гистограмма
распределения по размерам свободных наночастиц КЗ; В – микрофотография
конъюгата КЗ-АТ/IgE; Г – гистограмма распределения по размерам конъюгата КЗАТ/IgE.
Метод ПЭМ позволяет определять истинные размеры и форму наночастиц или их
агрегатов, оценивать однородность препарата, получать наглядные изображения [258].
Однако, несмотря на перечисленные достоинства, электронная микроскопия может
работать только с фиксированными на твердой поверхности объектами. При
высушивании золя наночастиц существует риск их агрегации, вызывающей искажение
регистрируемых размерных характеристик.
Так как конъюгаты наночастиц предполагается использовать в виде водных золей,
целесообразно иметь данные об их размерных характеристиках в объеме. Поэтому
препараты наночастиц и их конъюгатов были также охарактеризованы методом ДРС.
83
Метод ДРС позволяет количественно определить степень агрегации коллоидных
частиц и их размеры в растворах.
Для синтезированных препаратов маркеров и их конъюгатов проведена
регистрация гидродинамического радиуса (Rh) в течение 60 мин для каждого
препарата, позволяющая получить массив из 40 результатов измерений. На рис. 28 в
качестве примеров приведены значения Rh немодифицированных наночастиц КвТ и
КЗ.
50
40
Rh, нм
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин.
А
50
40
Rh, нм
30
27.3
20
10
1.68
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин.
Б
Рис. 28. Значения гидродинамического радиуса для немодифицированных КвТ (А) и
КЗ (Б); пунктир – дополнительная фракция наночастиц КЗ, состоящих из небольшого
количества атомов.
84
Обработка полученных массивов данных с использованием программы
DynaLS_v2.5.2 показала, что значения Rh для неконъюгированных форм КвТ и КЗ
составляют соответственно 14,3±0,6 и 27,3±0,4 нм (рис. 29). В препарате КЗ также
содержатся
наночастицы,
состоящие
из
небольшого
числа
атомов
и
характеризующиеся гидродинамическим радиусом 1,68±0,08 нм (см. рис. 29, Б).
Погрешности определения гидродинамического радиуса вычисляли на основании
статистической обработки данных последовательных измерений.
Относительное количество частиц
0,30
14.3±0.6 нм
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,1
1
100
1000
Rh, нм
Относительное количество наночастиц
А
Б
10
27.3±0.4 нм
0,30
0,25
0,20
1.68±0.04 нм
0,15
0,10
0,05
0,00
0,1
1
10
100
1000
Rh, нм
Рис. 29. Данные ДРС для немодифицированных наночастиц КвТ (А) и КЗ (Б).
85
Аналогичные эксперименты по определению гидродинамических характеристик
были проведены для конъюгатов наночастиц КвТ и КЗ с антителами. Значения Rh для
конъюгатов КвТ с антителами против ХФ (соотношение КвТ:АТ при синтезе 1:2) и КвТ
с антителами против IgE человека (соотношение КвТ:АТ при синтезе 1:10) составляют
Относительное количество частиц
соответственно 14,9±0,5 нм (рис. 30, А) и 22,4±0,4 нм.
0,15
14.9±0.5 нм
0,12
0,09
0,06
0,03
0,00
0,1
1
10
100
1000
Rh, нм
Относительное количество частиц
А
0,15
28.3±0.6 нм
0,12
0,09
0,06
1.44±0.04 нм
0,03
0,00
0,1
1
10
100
1000
Rh, нм
Б
Рис. 30. Данные ДРС для конъюгатов КвТ (А) и КЗ (Б) с антителами против ХФ.
В отличие от конъюгата с квантовыми точками, конъюгат моноклональных
антител против IgE человека с коллоидным золотом дает при измерении ДРС два пика
со средними значениями гидродинамических радиусов 1,68±0,04 нм и 28,3±0,3 нм (рис.
30, Б). Второй пик принадлежит конъюгату наночастиц, а первый – фракции
86
наночастиц,
состоящих
из
небольшого
числа
атомов.
Данные
результаты
соответствуют распределению по размерам препарата нативных наночастиц КЗ (см.
рис. 29, Б).
В таблице 3 суммированы полученные размерные характеристики исследуемых
препаратов КвТ и КЗ и их конъюгатов с антителами. Для удобства данные ДРС
представлены в виде диаметров, а не гидродинамических радиусов, что упрощает
сравнение результатов измерений с данными ПЭМ.
Таблица 3. Размерные характеристики препаратов наночастиц и их конъюгатов.
Препарат
Диаметр (ПЭМ), нм
Гидродинамический диаметр (ДРС), нм
КвТ
8,9±0,1
27,2±0,6
КвТ-АТ/ХФ (1:2)
10,5±0,1
29,8±0,5
КвТ-АТ/IgE (1:10) 13,8±0,2
44,8±0,4
КЗ
29,3±0,9
52,4±0,4
КЗ-АТ/ХФ
29,8±2,5
54,6±0,4
КЗ-АТ/IgE
30,4±1,5
56,6±0,6
Отличия значений диаметров наночастиц, полученных методами ПЭМ и ДЛС,
обусловлены действием двух факторов. Во-первых, ПЭМ позволяет «видеть» только
электронно плотные структуры, т.е. металлическую составляющую наночастиц.
Соответственно из рассмотрения исключаются полимерное покрытие КвТ и слой
цитрата на поверхности КЗ. При переходе к ДРС эти покрытия включаются в
учитываемые
размеры
частиц
[259-261].
Во-вторых,
регистрируемый
гидродинамический радиус может быть больше, чем радиус самой частицы, из-за
структурированных и вращающихся вместе с частицей слоев, образованных
компонентами раствора – слоев воды (гидродинамической оболочки) и/или для
заряженных частиц – абсорбированных ионов вместе с их гидратными оболочками
[97]. Малое стандартное отклонение (не более 3%) и отсутствие дополнительных
значений свидетельствуют о гомогенности исследуемых препаратов, отсутствии
агрегатов, а также примесей (за исключением минорной фракции, выявляемой в
препаратах КЗ и его конъюгатов методом ДРС).
87
3.2.2 Характеристика оптических свойств квантовых точек и их конъюгатов
Уникальным свойством КвТ является зависимость их спектров флуоресценции
от размеров, тогда как возбуждение флуоресценции разных препаратов может быть
инициировано одинаковыми источниками света [257]. Для исследования КвТ и их
конъюгатов были использованы наночастицы одного состава (ядро CdS, оболочка
ZnS), но с разным размером ядра и, соответственно, с разным положением пика
эмиссии – при 525, 585 и 625 нм.
Спектральные исследования были начаты с получения спектров флуоресценции
наливных КвТ (рис. 31). Для возбуждения эмиссии всех препаратов использовали
Относительная флуоресценция
источник света с длиной волны 340 нм (ширина полосы возбуждения 1,5 нм).
3
1
2
27 нм
30 нм
1,0
0,8
0,6
29 нм
0,4
0,2
0,0
450
500
550
600
650
700
em, нм
Рис. 31. Спектры флуоресценции КвТ с пиками эмиссии при 525 (1), 585 (2) и 625 (3)
нм.
Как следует из рис. 31, спектры флуоресценции используемых препаратов КвТ
характеризуются полушириной пиков (шириной на уровне, соответствующем 50% от
максимума эмиссии) в диапазоне от 27 до 30 нм. Благодаря этому три спектра
эмиссии не перекрываются или почти не перекрываются (не более 20% для КвТ 585
и КвТ 625) и хорошо различимы (в т. ч. по визуальному восприятию цветов – зеленый,
88
желтый и красный), что обеспечивает достоверную детекцию флуоресценции каждой
из трех наночастиц.
Иммобилизация молекул антител на поверхности КвТ может привести к
снижению интенсивности флуоресценции, затрудняя использование КвТ в качестве
аналитических маркеров. Поэтому принципиальной задачей была оценка сохранения
оптических свойств КвТ в синтезированных конъюгатах.
С этой целью для препаратов нативных КвТ и их конъюгатов с концентрациями
(по КвТ) 5 нМ были получены спектры поглощения и флуоресценции. Результаты
сравнительной характеристики оптических свойств свободных и модифицированных
КвТ представлены на рис. 32 на примере КвТ 625 и их конъюгата с антителами против
IgE человека.
Спектры поглощения КвТ и конъюгата КвТ-АТ/IgE не совпадают со спектрами
раствора КвТ той же концентрации (рис. 32, А), но в диапазоне длин волн 400–630 нм
(см. рис. 9, А, вставка) сохраняется форма спектров, а отношение оптических
плотностей конъюгата и свободных КвТ варьирует незначительно, составляя примерно
1,2. Отсутствие смещения в конъюгате КвТ-АТ/IgE пиков поглощения (475 и 610 нм
(см. рис. 32, А, вставка)), характерных для свободных КвТ, отражает стабильность КвТ
в конъюгате.
Как следует из эксперимента, представленного на рис. 32, Б, снижение
интенсивности флуоресценции конъюгированной формы КвТ относительно свободной
формы невелико – около 20%. Пик флуоресценции конъюгата КвТ с антителами
наблюдается при 623±2 нм, что достоверно не отличается от положения пика
флуоресценции свободных КвТ – 625 нм.
89
ОптическаяА плотность
0,20
Оптическая плотность
0,5
0,4
2
0,3
0,18
0,16
0,14
2
0,12
0,10
1
0,08
0,06
0,04
400
450
500
550
600
650
700
 нм
0,2
1
0,1
0,0
300
400
500
600
700
, нм
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
А
1000
1
800
2
600
400
200
0
500
550
600
650
700
750
нм
Б
Рис. 32. Спектры поглощения (А) и флуоресценции (Б) свободных КвТ 625 (1 –
сплошная кривая) и конъюгата КвТ 625 с антителами против IgE (2 – пунктирная
кривая).
90
Изменение интенсивности флуоресценции маркера после его конъюгирования с
антителами может оказать существенное влияние на аналитическое применение
конъюгата. В связи с этим для всех трех используемых препаратов КвТ были
сопоставлены квантовые выходы флуоресценции свободных и конъюгированных
препаратов.
Квантовый выход (φкв) – параметр, который показывает эффективность
флуоресценции и определяется отношением количества испускаемых и поглощаемых
фотонов:
𝜑кв =
𝑁𝑒𝑚
𝑁𝑎𝑏𝑠
, (17)
где Nem – количество испускаемых квантов энергии; Nabs – количество поглощенных
квантов энергии.
На основании литературных данных [262-265] в качестве стандартных
флуорофоров для сопоставления значений квантовых выходов были выбраны Rot-300
и Родамин 6G. Абсолютный вантовый выход флуоресценции Rot-300 в этаноле равен
0,98 [266], Родамина 6G – 0,95 [267]. Пик эмиссии Rot-300 находится в диапазоне 610–
615 нм и близок к пику эмиссии КвТ 625, пик эмиссии Родамина 6G – в диапазоне 575–
585 нм, что близко к пику эмиссии КвТ 585 и незначительно отличается от КвТ с пиком
эмиссии при 525 нм. Близкое спектральное расположение пиков эмиссии эталонных
флуорофоров и исследуемых КвТ обеспечивает точность и достоверность получаемых
результатов определения φкв.
Измерения проводили для растворов реагентов в концентрациях 10 -8 М (конъюгат
КвТ и неконъюгированная форма КвТ), 10 -10 М (Rot-300) и 10-6 М (Родамин 6G).
Использование таких достаточно больших разведений флуорофоров позволяет
исключить из рассмотрения избыточное поглощение возбуждающего света и
самотушение флуоресценции [236].
Определены
относительные
квантовые
выходы
флуоресценции
немодифицированных КвТ с разными длинами волн эмиссии (525, 585 и 625 нм) и их
конъюгатов с антителами против антибиотиков (мольное соотношение КвТ : АТ при
синтезе равнялось 1:2). Установленные величины φ кв представлены на рис. 33. КвТ с
пиком флуоресценции при 625 нм характеризуются максимальным квантовым
выходом (0,85±0,04), для КвТ с пиками эмиссии при 585 и 525 нм получены почти
91
вдвое меньшие величины φкв (0,58±0,05 и 0,56±0,03, соответственно). Как видим, после
ковалентной иммобилизации антител на поверхности КвТ φ кв снижается на 3–17%
относительно немодифицированных КвТ. При этом максимальный φкв наблюдается
для конъюгата КвТ с пиком флуоресценции при 625 нм – 0,83±0,04. Конъюгаты КвТ с
пиками эмиссии при 585 и 525 нм характеризуются квантовыми выходами, также
меньшими почти вдвое – 0,48±0,06 и 0,47±0,04, соответственно.
1,0
0,85±0,04
0,83±0,04
0,8
0,58±0,05
кв
0,6
0,56±0,03
0,48±0,06
0,47±0,04
0,4
0,2
0,0
ФЛ
6 25
Т/О
КвТ
А
5
62
КвТ
ТМ
5 85
/ХФ
5 25
Т/С
-АТ
вТ
А
КвТ
5
К
8
5
5
52
КвТ
КвТ
Рис. 33. Значения относительных квантовых выходов флуоресценции препаратов КвТ
и их конъюгатов с антителами против антибиотиков (мольное соотношение КвТ: АТ =
1:2).
Поскольку иммобилизация антител на поверхности КвТ вызывала снижение
флуоресценции маркера, дополнительным фактором риска для аналитического
применения КвТ являлась степень сохранения ими способности к флуоресценции при
увеличении числа антител, иммобилизуемых на одной наночастице. Поэтому была
проведена характеристика эмиссии конъюгата КвТ с бóльшим количеством антител
(соотношение КВт:Ат при синтезе – 1:10). Экспериментально установлено, что
квантовый выход флуоресценции конъюгата КвТ (пик эмиссии при 625 нм) с
антителами, синтезированного при мольном отношении реагентов 1:10, составляет
0,60±0,05, что ниже, чем при нагрузке 1:2, но сопоставимо с φ кв органических
флуорофоров. Таким образом, негативное влияние на интенсивность флуоресценции,
оказываемое иммобилизованными на поверхности КвТ молекулами антител,
92
возрастает с увеличением содержания антител в конъюгате. Однако это влияние не
критично для использования конъюгатов КвТ в аналитических целях.
3.2.3 Пределы детекции маркеров
Существенным фактором, влияющим на возможность использования наночастиц
в качестве маркеров, является минимальное детектируемое количество маркера. В
рамках характеристики изучаемых маркеров были экспериментально сопоставлены
пределы детекции КЗ и КвТ с поверхности мембраны и в растворе.
При работе с мембранами для количественных измерений интенсивности
флуоресценции или окрашивания использовали: портативный оптический детектор
Рефлеком-УФ (производства «Синтэко-Комплекс», Россия) и программу «Видеотест»
для оценки интенсивности флуоресценции КвТ; сканер и программу «Total Lab» для
оценки интенсивности окрашивания КЗ. С помощью флуориметра (RF-5310,
«Shimadzu», Япония) и спектрофотометра (UV-1202, «Shimadzu», Япония) оценивали,
соответственно, интенсивность флуоресценции и поглощение маркеров в растворах.
На нитроцеллюлозную мембрану Milipore 180 с помощью автоматической
пипетки наносили растворы маркеров. Объем наносимых растворов составлял 0,2 мкл,
что позволило формировать зоны площадью 2 мм2. Объемы и площади зон для КЗ и
КвТ одинаковы. КвТ наносили из ФБС в диапазоне концентраций от 10 пМ до 1 мкМ,
а КЗ – из ФБС в диапазоне концентраций от 15 пМ до 5 нМ. В таблице 4 приведены
абсолютные
значения
интенсивности
окрашивания
или
флуоресценции
со
стандартными отклонениями.
Таблица 4. Регистрируемые на мембране интенсивности флуоресценции или
окрашивания в зависимости от концентрации маркера
Концентрации маркера, нМ
0
Интенсивности
флуо- 0,2±0,1
0,02
0,05
0,30±0,05 1,7±0,1
0,15
0,3
2,7±0,1
5±0,2
ресценции КвТ, отн. ед.
Интенсивности
окра- 1250±825 1400±710 580±285 6700±560 13500±1980
шивания КЗ, отн. ед.
93
Чтобы обеспечить корректность сравнения пределов детекции, интенсивности
флуоресценции или окрашивания были нормированы по максимальному значению;
Аналитический сигнал, отн. ед.
полученные зависимости представлены на рис. 34.
100
80
60
40
20
0
0,01
0,1
1
10
100
1000
С (КвТ), нМ
Аналитический сигнал, отн. ед.
А
100
80
60
40
20
0
0,01
0,1
1
C (КЗ), нМ
Б
Рис. 34. Зависимости интенсивности флуоресценции КвТ (А) и окрашивания КЗ (Б) от
концентрации маркеров и внешний вид флуоресцентных (окрашенных) зон на
нитроцеллюлозной мембране.
Аналогичные измерения оптических свойств проводились и для растворов КвТ и
КЗ в объеме 200 мкл для тех же диапазонов концентраций.
94
На основании полученных зависимостей интенсивностей флуоресценции или
окрашивания от концентраций маркеров определены пределы детекции КвТ и КЗ на
поверхности и в растворе (табл. 5). С учетом использованных в эксперименте объемов
растворов (площадей зон) минимально детектируемые концентрации наночастиц
представлены в формате удельного количества частиц, отнесенных на единицу объема
или площади. Расчеты для мембран проводили, исходя из толщины мембраны 0,1 мм
[268] и площади формируемой зоны 2 мм2. При этом объем мембраны, в котором
распределяются частицы маркеров, составляет 0,23 мм3 = 0,23 мкл.
Таблица 5. Пределы детекции нанодисперсных маркеров на поверхности мембраны и
в растворе.
Раствор*, частиц/ мм3 Мембрана**, частиц/мм2
Мембрана**, частиц/мм3
КвТ
4,2∙104
1∙106
1∙107
КЗ
54∙104
9∙106
9∙107
*измерения проводили в кювете с внутренним объемом 2,5×2,5×35 мм;
**средний диаметр образованных на мембране пятен – 1,7 мм, толщина мембраны 0,1 мм
Минимально детектируемая концентрация КвТ на мембране равна 0,02 нМ, для
КЗ соответствующая величина составляет 0,15 нМ. Пределы детекции маркеров
соответствуют следующим абсолютным значениям интенсивности флуоресценции и
окрашивания: КвТ – 0,3±0,05 отн.ед., КЗ - 6700±560 отн. ед. Минимально
детектируемое количество наночастиц КвТ с поверхности мембраны площадью 1 мм 2
в 24 раз больше минимального количества частиц, детектируемого из раствора
объемом 1 мкл (1∙106 и 4,2∙104 частиц, соответственно). В случае КЗ (для тех же
объемов) предел детекции частиц на мембране в 17 раз выше минимального количества
частиц, определяемого в растворе (54∙104 и 9∙106 частиц, соответственно). Из таблицы
6 следует, что предел детекции КвТ в 9 раз ниже предела детекции КЗ, и составляет
1 000 000 частиц на мм2.
Значительные
различия
пределов
детекции
объясняются,
во-первых,
использованием более чувствительных оптических средств регистрации при работе с
растворами. Второй, не менее важный фактор, состоит в том, что при работе с
мембранными носителями детекция сигнала (поглощения или флуоресценции)
95
возможна только с приповерхностного слоя. Мембраны состоят из непрозрачных
волокон, трехмерная структура взаимного расположения которых препятствует
детекции наночастиц, попавших во внутренние слои [228]. Кроме того, распределение
маркеров (или их конъюгатов) по мембране неравномерно; оно зависит от
смачиваемости материала мембраны и размеров пор [229]. По данным, полученным
фирмой Millipore для производимых ей мембран, пористая структура позволяет
детектировать окрашенные частицы, удаленные от поверхности не более чем на 10%
от толщины мембраны [268].
Представляет интерес, исходя из минимально детектируемого количества
маркеров и их размеров, оценить, какая часть поверхности мембраны оказывается
покрытой наночастицами при данном их содержании. В таблице 6 представлены
использованные для этого параметры и результаты расчетов, включающие размерные
характеристики наночастиц (по данным ПЭМ), поперечную площадь, занимаемую
одной
частицей,
суммарную
поперечную
площадь
частиц
в
количестве,
соответствующем минимально детектируемым концентрациям. Для расчетов были
использованы следующие допущения: каждая наночастица имеет строго сферическую
форму; наночастицы на плоскости имеют плотную упаковку шаров (кругов); удельная
площадь равна 1 мм2.
Таблица 6. Оценка степени покрытия мембраны нанодисперсными маркерами
Маркер
Параметр
КвТ
КЗ
1
Средний диаметр частицы (по данным ПЭМ), нм
8,9
29,3
2
Средняя площадь, занимаемая одной частицей, нм2
62,2
674
4,2×104
54×104
1,05×106
1,35×107
6,5×107
9×109
Измерения в растворе
3
Количество минимально детектируемых частиц на 1 мм3в
кювете с длиной оптического пути 2,5 мм, шт.
4
Количество минимально детектируемых частиц на 1 мм3 в
объеме раствора с длиной оптического пути 0,1 мм, шт.
5
Суммарная площадь, занимаемая частицами в растворе,
соответствующими п. 4,
нм2
96
6
Степень покрытия минимально детектируемым
количеством наночастиц, %
6,5×103
9×105
1×106
9×106
6,2×107
6,7×108
6,2×103
6,7×104
1,05 раз
13,5 раз
Измерения с мембраны
7
Количество минимально детектируемых частиц на 1 мм2,
шт.
8
Суммарная площадь, занимаемая частицами на мембране,
соответствующими п. 7,
9
нм2
Степень покрытия мембраны минимально детектируемым
количеством наночастиц, %
10 Соотношение степеней покрытия минимально
детектируемым количеством наночастиц
Показана возможность более чувствительного детектирования (в 9 раз) КвТ по
сравнению с КЗ с поверхности мембраны. Проведенные расчеты позволяют
предположить:
1) для
достижения
предела
детекции
в
растворе
требуется
покрыть
наночастицами 6,5×103 % (для КвТ) и 9×105 % (для КЗ) поверхности;
2) для достижения предела детекции на мембране требуется покрыть
наночастицами 6,2×103 % (для КвТ) и 6,7×104 % (для КЗ) поверхности;
3) на мембране не происходит экранирования наночастиц.
3.2.4 Оценка антигенсвязывающей способности конъюгатов квантовых точек
В конъюгатах антител с наночастицами должны сохраняться все их
функциональные свойства. Поэтому, рассмотрев изменения свойств маркера, перейдем
к характеристике свойств (аффинности) антител. Нами было экспериментально
исследовано, в какой степени иммобилизованные на поверхности КвТ антитела
сохранили способность взаимодействовать с антигеном. Для решения этой задачи были
измерены и сопоставлены константы связывания нативных и конъюгированных
антител с антигеном. Данные параметры определяли с помощью оптической сенсорной
системы BIAcore X, регистрирующей изменения поверхностного плазмонного
резонанса (ППР) при формировании специфических комплексов на подложке [243].
97
Характеристика взаимодействий с антигеном свободных антител и антител,
иммобилизованных на поверхности КвТ, с помощью прибора Biacore X проводилась
по схемам, приведенным на рис. 35.
А
Б
Рис. 35. Схемы экспериментов, проводимых на приборе Biacore X: А – определение
констант для свободных антител; Б – определение констант для конъюгата КвТ-АТ.
Оба варианта эксперимента включали ковалентную иммобилизацию на
поверхность чипа конъюгата гаптен–белок (ХФ-БСА). Белок выполнял функцию
носителя
низкомолекулярного антигена. Перед
ковалентной
иммобилизацией
конъюгата гаптен-белок проводился выбор оптимального рН буферного раствора,
обеспечивающего эффективное предварительное электростатическое взаимодействие
конъюгата с декстрановыми группами на поверхности чипа, которое предшествует
последующему
ковалентному
связыванию.
Сопоставляемые
растворы
имели
молярность 10 мМ, выбранную исходя из рекомендаций производителя биосенсора и
чипов [243]. Конъюгат ХФ-БСА вводился в ячейку BIAcore X с чипом СМ5,
содержащим декстрановые группы, в ацетатных буферных растворах с рН от 2,5 до 5,5.
Каждый раствор вносился последовательно, при этом происходило формирование
комплекса конъюгат-декстран, который затем под действием 10 мM раствора HEPES,
pH 7,4, содержащего 150 мM NaCl и 0,005% детергента Твин-20, распадался [269]. На
рис. 36 приведена сенсограмма, отражающая зависимость отклика сенсора от времени
98
при различных рН раствора, используемого для внесения конъюгата ХФ-БСА. Отклик
сенсора регистрировался в величинах RU – генерируемых прибором относительных
единицах, в которые трансформируется оптический сигнал.
А
Б
В
20000
pH 4,5
pH 2,5
pH 3,5
pH 5,5
19000
Сигнал сенсора, RU
Г
3
2
18000
17000
1
16000
0
250
500
750
1000
1250
1500
Время, сек
Рис. 36. Регистрируемые изменения поверхностного плазмонного резонанса при
электростатической иммобилизации конъюгата ХФ-БСА на поверхности чипа СМ5
при разных рН: А – 2,5; Б – 3,5; В – 4,5; Г – 5,5. 1 – смена буферного раствора при
введении конъюгата ХФ-БСА в ячейку чипа; 2 – электростатическое взаимодействие
карбоксильных групп декстрана с аминогруппами белка при пропускании конъюгата
ХФ-БСА через ячейку; 3 – смена буферного раствора после выхода ХФ-БСА из ячейки.
При контакте конъюгата ХФ-БСА с поверхностью чипа наблюдается резкое
снижение сигнала сенсора, объясняющееся сменой буферного раствора (рис. 36, В, 1).
Затем происходит рост сигнала за счет электростатического взаимодействия
карбоксильных групп декстрана с аминогруппами белка (см. рис. 36, В, 2). При рН
раствора конъюгата ХФ-БСА, равном 4,5, наблюдалась максимальная амплитуда
сигнала сенсора (см. рис. 36, В, разница между уровнями сигнала для стадий 1 и 2
составляла около 3500 RU), что свидетельствует об оптимальном соотношении зарядов
поверхности чипа и конъюгата. Таким образом, данный буферный раствор
способствует максимальному приближению положительно заряженных групп белка к
99
отрицательно заряженной поверхности чипа. Так как ковалентная иммобилизация ХФБСА происходит в проточном режиме, важное значение имеет быстрая стадия
электростатического взаимодействия конъюгата с поверхностью чипа, которая и
определяет количество связавшегося соединения. Поэтому 10 нМ ацетатный буфер с
рН 4,5 был выбран в качестве оптимального для ковалентной иммобилизации
конъюгата ХФ-БСА.
При проведении ковалентной иммобилизации белкового конъюгата поверхность
чипа СМ5 активировали смесью водных растворов EDC : NHS, 1:1, с концентрациями
0,1 и 0,4 М (рис. 37, А). Потом вносили конъюгат ХФ-БСА в выбранном ацетатном
буферном растворе с рН 4,5. Аминогруппы конъюгата ковалентно взаимодействовали
с активированными СООН-группами декстрана (см. рис. 37, Б). После этого проводили
блокировку непрореагировавших активированных групп этаноламином (см. рис. 37, В)
(см. раздел 2.2.14).
Г
45000
Д
В
Е
Сигнал сенсора, RU
40000
35000
Б
А
30000
25000
7 400
20000
15000
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
Время, сек
Рис. 37. Изменения величины ППР при проведении ковалентной иммобилизации
конъюгата гаптен-белок на поверхность чипа СМ5: А – активация поверхности чипа
введением растворов активаторов; Б – выход активаторов из канала чипа; В – введение
конъюгата ХФ-БСА (100 мкг/мл); Г – выход несвязавшегося конъюгата ХФ-БСА из
канала чипа; Д – введение раствора, блокирующего активированные группы на
поверхности чипа; Е – выход блокирующего раствора из канала чипа.
100
Итоговое увеличение сигнала сенсора после иммобилизации конъюгата ХФ-БСА
составляло ~7 400 RU (см. рис. 37, Е), что, согласно [243], соответствует поверхностной
плотности иммобилизации белка 7,4 нг/мм2. Данного количества иммобилизованного
антигена достаточно для достоверной регистрации и количественной характеристики
связывания антител.
В
качестве
контроля
использовали
ковалентно
иммобилизованный
на
поверхности второй дорожки чипа белок-носитель (БСА). Исследуемые растворы
антител или конъюгата КвТ-АТ вводили в чип, включающий контрольный канал с
иммобилизованным БСА и аналитический канал с иммобилизованным конъюгатом
ХФ-БСА. Программное обеспечение учитывает при расчетах неспецифическое
взаимодействие антител или конъюгата с белком-носителем, автоматически вычитая
отклик сенсора для контрольного канала из отклика сенсора для аналитического канала
[244].
На следующем этапе в ячейку чипа вводили либо антитела против антигена (ХФ),
либо конъюгат КвТ-АТ/ХФ, получая сенсограммы (рис. 38). Для определения констант
использовали растворы антител или конъюгата в диапазоне концентраций от 26 до 400
нМ (см. раздел 2.1.14). Молярные концентрации конъюгата КвТ-АТ/ХФ представлены
в расчете на содержание антител, исходя из соотношения маркер-белок при синтезе
конъюгата, равнявшегося 1:2. По полученным сенсограммам (см. рис. 38) вычисляли
константы реакций антиген-антитело и антиген-(антитело-КвТ).
Для вычисления констант использовали программу BIAevaluation. Расчеты
проводили в режиме 1:1 (Langmuir) binding (Лэнгмюровское взаимодействие 1:1),
соответствующем модели взаимодействия антиген-антитело при их соотношении в
образующихся комплексах, равном 1:1. Данная модель основана на положениях теории
изотерм адсорбции Ленгмюра [243]. Программа автоматически обрабатывает каждую
сенсограмму,
получая
значения
кинетических
и
равновесных
констант
взаимодействия. Значения констант усредняли внутри каждой группы повторов (n=3)
и между разными концентрациями антител (конъюгата) в исследуемом диапазоне. В
таблице 7 приведены вычисленные значения кинетических и равновесных констант
взаимодействия антител и конъюгата КвТ-АТ с иммобилизованным конъюгатом ХФБСА.
101
2
Сигнал сенсора, RU
6000
3
5000
400 нМ
267 нМ
133 нМ
67 нМ
46 нМ
33 нМ
26 нМ
4000
3000
1
2000
1000
0
0
100
200
300
400
500
600
Время, сек
А
2
Сигнал сенсора, RU
4000
3
400 нМ
267 нМ
133 нМ
67 нМ
46 нМ
33 нМ
26 нМ
3000
2000
1
1000
0
0
100
200
300
400
500
Время, сек
Б
Рис. 38. Кинетика связывания антител (А) и конъюгата КвТ-АТ (Б) с
иммобилизованным на поверхности чипа СМ5 антигеном (ХФ-БСА), полученные для
разных концентраций антител (1 – введение антител или конъюгата КвТ-АТ в канал
чипа; 2 – выход непрореагировавших антител или конъюгата КвТ-АТ из канала чипа;
3 – введение буферного раствора для регенерации чипа).
102
Таблица 7. Кинетические и равновесные константы связывания и диссоциации
иммунных комплексов для свободных АТ/ХФ и конъюгата КвТ-АТ/ХФ.
ka (1/Ms)
kd (1/s)
КA (1/M)
КD (M)
АТ
(7,5±0,1)·104
(3,9±0,2)·10-4
(2,2±0,1)·108
(4,7±0,3)·10-9
КвТ-АТ (1:2)
(5,4±0,5)·104
(7,2±0,6)·10-5
(7,4±0,2)·108
(1,3±0,5)·10-9
Полученные значения констант образования комплексов АТ – антиген и КвТ-АТ
– антиген сопоставимы, что свидетельствует о сохранении функциональной
активности антител, ковалентно иммобилизованных на поверхности КвТ. Трехкратное
увеличение равновесной константы связывания конъюгата относительно свободных
антител (2,2·108 и 7,4·108 1/М) может быть вызвано поливалентностью конъюгата.
3.2.5 Характеристика состава конъюгатов антител с нанодисперсными
маркерами
Определение
количества
антител,
иммобилизованных
на
поверхности
коллоидного маркера, необходимо для количественного описания и прогнозирования
взаимодействий конъюгатов в тест-системах. Для оценки состава конъюгатов
наночастица-белок используют различные методы: электрофорез, аналитическое
ультрацентрифугирование, твердофазный ИФА и др. [248; 270] Электрофоретические
методы позволяют отделить конъюгат наночастица-белок от несвязавшегося белка и
свободных наночастиц, но определение с их помощью состава конъюгата весьма
затруднительно, поскольку комплексы с разным соотношением белок:наночастица
отличаются по электрофоретической подвижности [234; 271]. Аналогичными
ограничениями характеризуется метод ультрацентрифугирования; к тому же режим
для эффективного осаждения КвТ не универсален и требует специального подбора
условий в каждом конкретном случае. С учетом вышеизложенного, нами был
реализован метод характеристики состава конъюгата, включающий отделение
продукта синтеза методом гель-фильтрации и последующее применение ИФА для
оценки
количества
иммобилизованных
антител,
сохранивших
реакционную
способность (способность взаимодействовать с антигеном). При выборе метода
учитывались такие преимущества ИФА, как точность и чувствительность измерений,
возможность быстрого получения результатов. Эффективность использования ИФА
103
для определения состава конъюгата маркер:белок подтверждена, в частности, в работе
[272].
Ниже представлены подробное изложение используемой методики и анализ
получаемых результатов на примере характеристики конъюгата КвТ 625 – АТ/ХФ,
синтезированного при исходном мольном соотношении реагентов, равном 1:2.
Эксперимент по определению количества иммунохимически активных антител на
поверхности КвТ включал два этапа:
- проведение в иммуноферментной микропланшетной системе взаимодействия
свободных АТ/ХФ с иммобилизованным конъюгатом ХФ и получение градуировочной
зависимости оптической плотности от концентрации АТ/ХФ;
- проведение аналогичного взаимодействия для конъюгата КвТ-АТ/ХФ и
сопоставление полученных концентрационных зависимостей.
В лунках микропланшета иммобилизовали конъюгат ХФ-СИТ (0,5 мкг/мл). Затем
в лунки вносили растворы либо АТ/ХФ (в диапазоне концентраций от 10 мкг/мл до 150
пг/мл), либо конъюгата КвТ-АТ/ХФ (в диапазоне концентраций от 30 нМ до 0,5 пМ по
КвТ). После инкубации и отмывки непрореагировавших компонентов образовавшиеся
иммунные комплексы взаимодействовали с антивидовыми антителами, меченными
пероксидазой. Пероксидазную активность метки, связавшейся в ходе анализа с
поверхностью лунки в составе специфического иммунного комплекса, определяли с
помощью субстрата ТМБ [8]. Оптическую плотность продуктов реакции измеряли при
длине волны 450 нм.
На рис. 39 представлена полученная при проведении ИФА для свободных АТ/ХФ
зависимость оптической плотности в лунках микропланшета от концентрации антител.
Зависимость
аппроксимировали
четырехпараметрическим
сигмоидной
функцией:
−4
𝑦 = ((4,7 ∙ 10
−1
− 1,7 ∙ 10 )/(1 + (
𝑥
)
9,15
1
1,06
)) + 1,7 ∙ 10−1 (18).
где х – концентрация антител в лунке микропланшета, у – оптическая плотность
продуктов пероксидазной реакции.
104
0,20
A 450
0,15
0,10
0,05
0,00
0,01
0,1
1
10
100
1000
10000
C(АТ/ХФ), нг/мл
Рис. 39. Градуировочная кривая зависимости оптической плотности при
иммуноферментной регистрации взаимодействия АТ/ХФ + ХФ-СИТ от концентрации
АТ/ХФ.
Рассмотрение зависимости в полулогарифмических осях и использование
четырехпараметрического уравнения (а не потенциально возможного линейного
приближения) позволяет работать в более широком диапазоне концентраций и
получать результаты с высокой точностью [273].
На рис. 40 представлена полученная в аналогичном эксперименте для конъюгата
зависимость оптической плотности от концентрации конъюгата КвТ-АТ/ХФ (по КвТ)
в лунках микропланшета. При сопоставлении концентрационных зависимостей
использовали их участки, соответствующие оптической плотности выше 0,05 и прямой
пропорциональности между количеством иммунореагента и детектируемым в ИФА
сигналом, т.е. 2–11 нг/мл – для свободных антител, 10-5 – 10-4 мкМ – для их конъюгата.
Данное решение обеспечивает низкую погрешность при определении количества
иммунохимически активных антител в составе конъюгата.
105
Рис. 40. Зависимость оптической плотности при иммуноферментной регистрации
взаимодействия АТ/ХФ + ХФ-СИТ в лунках микропланшета от концентрации
конъюгата КвТ-АТ.
При расчете концентрации иммунологически активных молекул антител в составе
конъюгата использовали следующую трансформацию уравнения (18):
𝑥 = 9,15 ∙ (
Далее,
учитывая
4,7∙10−4 −1,7∙10−1 1⁄
) 1,06
𝑦−1,7∙10−1
разведения
конъюгата,
(19).
вычислили
концентрации
иммунохимически активных антител в составе конъюгата КвТ-АТ. Полученные
результаты приведены в таблице 8.
Таблица 8. Определение концентраций иммунохимически активных антител в
конъюгате КвТ-АТ/ХФ
Разведение
Концентрация
Установленная
Концентрация антител в
конъюгата КвТ-
конъюгата по
концентрация
неразведенном конъюгате
АТ, раз
КвТ, мкМ
антител, мкМ
КвТ-АТ, мкМ
36450 (150·35)
10-4
2,1∙10-4
8,9
109350 (150·36)
4∙10-5
8∙10-5
8,7
328050 (150·37)
1,4∙10-5
2,4∙10-5
7,8
984150 (150·38)
4,6∙10-6
8,2∙10-6
7,7
106
Учитывая разведение конъюгата с исходной концентрацией 4,5 мкМ,
экспериментально установленная концентрация иммобилизованных на поверхности
КвТ антител составила 8,4±0,5 мкМ (среднее арифметическое четырех величин,
приведенных в последнем столбце таблицы 8). Эта концентрация антител
соответствует соотношению КвТ : АТ, равному 1:1,9. Отметим, что данная величина
практически не отличается от мольного соотношения маркер-белок при синтезе
конъюгата КвТ-АТ/ХФ, равнявшемуся 1:2. Наблюдаемое совпадение является
дополнительным свидетельством в пользу примененного метода, подтверждая
отсутствие влияния на получаемые результаты стерических факторов, вызванных
особенностями расположения антител на поверхности квантовой точки.
3.3 Разработка иммунохроматографических тест-систем на основе квантовых
точек
В ходе работ, описанных в разделах 3.1 и 3.2 диссертации, были получены и
охарактеризованы специфические реагенты – комплексы КвТ-АТ и КЗ-АТ,
необходимые для использования в разрабатываемых системах иммунодетекции. В
качестве детектируемых антигенов были выбраны как высокомолекулярный
иммуноглобулин Е человека, так и несколько низкомолекулярных соединений –
антибиотики хлорамфеникол, офлоксацин и стрептомицин. В соответствии с этим
были синтезированы и охарактеризованы следующие конъюгаты флуоресцентных
маркеров: КвТ 625-АТ/ХФ; КвТ 625-АТ/ОФЛ; КвТ 585-АТ/ХФ; КвТ 525-АТ/СТМ; КвТ
625-АТ/IgE; а также конъюгат колориметрического маркера: КЗ-АТ/ХФ. С
использованием
полученных
препаратов
реализовано
5
вариантов
иммунохроматографических тест-систем:
- на основе КвТ 625 для определения ХФ в молоке;
- на основе КвТ 625 для определения IgE в сыворотке крови;
- на основе КЗ для определения ХФ в молоке;
- на основе КвТ 625, 585 и 525 для одновременного определения ХФ, ОФЛ и СТМ;
- на основе КЗ для одновременного определения бензоилэкгонина, морфина,
амфетамина и метамфетамина в моче.
107
Конъюгаты КвТ с антителами против антибиотиков были синтезированы при
исходном мольном соотношении маркер белок 1:2 (см. раздел 2.2.4); конъюгат КвТАТ/IgE синтезирован при соотношении, равном 1:10 (см. раздел 2.2.4). Препараты с
меньшим количеством антител применяли для определения низкомолекулярных
соединений; конъюгат с большим соотношением антитело:маркер – для определения
высокомолекулярного антигена.
3.3.1 Разработка и апробация иммунохроматографической тест-системы на
основе квантовых точек для определения хлорамфеникола в молоке
Конъюгат КвТ-АТ/ХФ с мольным соотношением маркер-белок 1:2 был
использован
для
разработки
иммунохроматографической
тест-системы
для
определения ХФ в молоке. ХФ запрещен для использования в ветеринарии и медицине
из-за выраженного негативного действия на ряд физиологических процессов, однако
риски несанкционированного применения обуславливают необходимость его контроля
[274; 275].
В связи с тем, что ХФ иммунохимически моновалентен, его детекция возможна
только в конкурентных форматах иммуноанализа. Нами был реализован формат
иммунохроматографического анализа, при котором происходит конкуренция за
образование комплексов с конъюгатом маркер-антитело между свободным антигеном,
содержащимся в тестируемой пробе, и иммобилизованным конъюгатом гаптен-белок.
Результаты
анализа
оценивали
визуально,
облучая
тест-полоску
ультрафиолетовым светом с помощью ультрафиолетовой лампы (модель PRO-4), или
регистрировали с помощью портативного флуориметрического детектора «РефлекомУФ»
(«Синтэко-Комплекс»,
Россия)
со
изображений (рис. 41).
108
встроенной
программой
обработки
А
Б
Рис. 41. Портативный флуоресцентный детектор (А) и представление результатов
измерений с помощью программного обеспечения «Видеотест» (Б) для
количественной обработки флуоресцентных тест-полосок.
При использовании портативного детектора изображение тест-полоски после
возбуждения
флуоресценции
регистрировалось
цифровой
видеокамерой
и
обрабатывалось программой «Видеотест». Программная обработка изображения
включала выделение границ зон связывания, определение интенсивностей всех
пикселей, относящихся к этим зонам, суммирование значений интенсивности для
каждого расстояния вдоль тест-полоски и для выделенной зоны связывания в целом,
построение профиля интенсивности флуоресценции по всей длине тест-полоски и
расчет суммарных интенсивностей флуоресценции в аналитической и контрольной
зонах тест-полоски. Интенсивность фонового сигнала определялась и вычиталась
автоматически.
Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения ХФ
включала синтез препаратов конъюгатов, оптимизацию комплектации тест-системы и
условий проведения анализа. Оптимизация тест-системы направлена на обеспечение
минимального уровня достоверно выявляемых концентраций антигена и точности
количественной детекции в рабочем диапазоне детектируемых концентраций. Работы
по оптимизации включали выбор рабочих и вспомогательных мембран для тестполоски, концентраций реагентов в составе тест-системы, состава среды проведения
анализа (рис. 42).
109
Рис. 42. Внешний вид иммунохроматографической тест-полоски и параметры тестсистемы, варьируемые при ее оптимизации.
Мембранные компоненты. Физические и химические свойства мембран,
используемых в иммунохроматографической тест-системе, влияют на свойства
капиллярного потока. В свою очередь свойства капиллярного потока оказывают
влияние на формирование аналитической зоны, на время детекции и предел
обнаружения. Нами были апробированы рабочие мембраны (производства фирмы
MDI, Индия), отличающиеся по размер пор, скорости движения пробы и степени
связывания белков: CNPC (средняя степень связывания белков) с размерами пор 10 и
12 мкм; CNPF (низкая степень связывания белков) с размерами пор 5, 8, 10 мкм; CNPH
(высокая степень связывания белков) с временем прохождения 4 см рабочей мембраны
за 90 и 200 сек. В качестве пробы использовали не содержащее аналита молоко
(жирность 3,2%), разбавленное на 20% ФБС с 1% Твин-20 [83]. Критерии при выборе
оптимальной рабочей мембраны заключались в равномерном движении жидкости, а
также
в
высокой
степени
связывания
маркера
в
аналитической
зоне
и
воспроизводимости результатов иммунохроматографии. На рис. 43 представлена
полученная зависимость интенсивности флуоресценции аналитической зоны от вида
рабочей мембраны.
110
Интенсивность флуоресценции, отн. ед
6
5
4
3
2
1
0
F5
F10
CNP
CNP
--
F8
C10 NPC12 NPH90 PH200
CNP
CNP
C
C
CN
Рабочие мембраны
Рис. 43. Сравнение рабочих мембран как компонентов иммунохроматографической
тест-системы для определения ХФ в пробах молока без аналита, разбавленных на 20%
ФБС с 1% Твин-20. Приведены средние значения интенсивности флуоресценции в
аналитической зоне тест-полоски в отсутствие аналита (n=10).
Как
видим,
минимальной
максимальное
погрешностью
значение
отмечено при
интенсивности
флуоресценции
использовании
мембраны
с
CNPC
(относящейся, по данным производителя, к мембранам со средней степенью
связывания белка) с размером пор 12 мкм. Мембрана CNPH90 также позволяет
получить высокую интенсивность флуоресценции, но степень варьирования
регистрируемых значений для нее существенно больше. Другие апробированные
мембраны
характеризуются
более
низкой
(в
1,5-3
раза)
интенсивностью
флуоресценции в аналитической зоне после проведения иммунохроматографии, что
ограничивает возможности достижения разрабатываемой тест-системой высокой
точности и низкого предела обнаружения. Отметим, что в ранее разработанной
иммунохроматографической тест-системе на основе КЗ в качестве оптимальной была
выбрана рабочая мембрана CNPF с размером пор 10 мкм [83].
Далее были сопоставлены различные мембраны для нанесения пробы, основное
требование к которым состоит в отсутствии неспецифического взаимодействия между
компонентами пробы и мембраной. В работе были использованы предварительно
обработанная нитроцеллюлозная мембрана (R7L) и необработанная стекловолоконная.
111
Соотношение интенсивности флуоресценции в аналитической зоне и фоновой
флуоресценции рабочей мембраны (сигнал: шум) для пробы без антигена (n=3) в
случае использования мембраны R7L выше и составляет 16,5±1,7, тогда как для
стекловолоконной мембраны эта величина равняется 4,5±1,3. Полученные результаты
показывают, что предварительно обработанная мембрана (R7L) позволяет снизить
фоновую флуоресценцию при регистрации результатов анализа за счет уменьшения
неспецифического взаимодействия.
Режим
формирования
аналитической
зоны.
Значительное
влияние
на
аналитические характеристики тест-системы оказывают природа и концентрация
конъюгата гаптен-белок, иммобилизованного в аналитической зоне тест-полоски.
Нами были апробированы конъюгаты ХФ-БСА с соотношением гаптен:белок при
синтезе, равным 100:1, и ХФ-СИТ, для которого данная величина равнялась 20:1.
Соотношения реагентов для разных белковых носителей выбирались с учетом
предшествующих
исследований
[83]
и
коррелировали
с
количеством
реакционноспособных групп (аминогрупп) на поверхности белка. В качестве среды для
нанесения реагентов в экспериментах по сравнению разных белковых носителей
использовали ФБС как наиболее распространенный вариант, успешно ранее
примененный в работах [83; 276]. На рис. 44 представлены изображения
флуоресцирующих
аналитических
зон,
формируемых
после
проведения
иммунохроматографии, и профили распределения флуоресценции, построенные с
использованием программы «Total Lab».
Как видно из рисунка, свойства белка-носителя оказывают влияние на форму и
размер аналитической зоны. При нанесении конъюгата ХФ-БСА наблюдается
значительное размывание зоны и, как следствие, - снижение воспроизводимости и
точности количественного результата анализа. В случае же нанесения конъюгата ХФСИТ становится возможным точно определять границы зоны связывания и корректно
проводить количественную обработку данных об интенсивности флуоресценции
связанной в этой зоне метки.
112
А
Б
В
Г
Рис. 44. Внешний вид аналитических зон, сформированных конъюгатами ХФ с
разными белками-носителями (концентрация ХФ-белок 0,15 мг/мл), при проведении
ИХА в отсутствии ХФ в тестируемой пробе: А – изображение аналитической зоны,
сформированной ХФ-БСА, Б – профиль распределения флуоресценции в
аналитической зоне, сформированной ХФ-БСА; В – изображение аналитической зоны,
сформированной ХФ-СИТ; Г – профиль распределения флуоресценции в
аналитической зоне, сформированной ХФ-СИТ.
На аналитический сигнал влияет также состав буферного раствора, из которого
проводится иммобилизация конъюгата гаптен-белок. Экспериментальные результаты
представлены в таблице 9.
Таблица 9. Интенсивности флуоресценции в аналитической зоне тест-системы
определения ХФ от рН и состава раствора ХФ-СИТ, используемого для
иммобилизации.
Состав буферного раствора
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
Цитратный буферный раствор, рН 5,0
0,6±0,2
ФБС, рН 7,4
1,1±0,03
ББР, рН 8,3
1,0±0,08
Карбонатный буферный раствор, рН 9,6
1,0±0,02
113
В учетом выбранного буфера для иммобилизации были проведены эксперименты
по определению оптимальной концентрации конъюгата ХФ-СИТ. Данную величину
варьировали от 0,1 до 1,0 мг/мл. Полученные в этих экспериментах конкурентные
кривые иммунодетекции ХФ представлены на рис. 45. При выборе оптимальной
концентрации учитывались предел обнаружения ХФ, амплитуда флуоресценции и
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
возможность визуального детектирования результата.
2,0
5
4
1,6
1,2
0,8
3
2
1
0,4
0,0
0,01
0
0,1
1
10
С (ХФ), нг/мл
Рис. 45. Зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации ХФ при
проведении иммунохроматографического анализа, полученные для разных
концентраций иммобилизованного конъюгата ХФ-СИТ: 1 – 0,1 мг/мл, 2 – 0,15 мг/мл, 3
– 0,25 мг/мл, 4 – 0,5 мг/мл, 5 – 1,0 мг/мл. Иммобилизацию проводили из ФБС (рН 7,4).
Визуальный контроль наличия связывания становится возможным, начиная со
значения интенсивности флуоресценции, равного 0,6 отн. ед. Поэтому, учитывая
индивидуальную вариабельность этого порога для разных пользователей, было
установлено, что для обеспечения достоверного анализа, в том числе количественного,
интенсивность флуоресценции в отсутствие аналита должна быть не ниже 1,0 отн. ед.,
а при высокой концентрации ХФ (100 нг/мл) – не должна превышать 0,3 отн. ед. Как
следует из представленных на рис. 45 графиков, начиная с концентрации ХФ-СИТ,
равной 0,25 мг/мл, наблюдается большая остаточная флуоресценция при анализе
пробы с высоким содержанием аналита (0,6 и более отн. ед. при 100 нг/мл ХФ).
Концентрация конъюгата ХФ-СИТ 0,15 мг/мл была выбрана как максимальная, для
114
которой регистрируется полное ингибирование связывания метки аналитом (при 100
нг/мл ХФ) и при этом достаточно высокий – 1,15 отн. ед. – сигнал в отсутствие аналита.
Режим формирования контрольной зоны. Козьи антимышиные антитела,
иммобилизованные в концентрации 0,25 мг/мл в ФБС, использовались в тест-полоске
в качестве контрольной зоны. Их концентрация и режим нанесения выбраны с учетом
результатов, ранее полученных для других тест-систем [277]. Отметим, что данная
концентрация антивидовых антител обеспечивает (в отсутствие аналита в пробе)
сопоставимую интенсивность флуоресценции в контрольной и аналитической зонах,
что облегчает качественную оценку результатов тестирования.
Концентрация и режим нанесения конъюгата КвТ-АТ/ХФ. Необходимым
условием достижения высокой точности иммунохроматографического анализа
является полное вымывание детектирующего конъюгата маркер-антитело из
мембраны. Кроме того, рядом авторов [268] отмечается, что замедление вымывания
детектирующего конъюгата за счет нанесения дополнительных стабилизаторов и
вязких реагентов не только повышает эффективность перехода конъюгата на рабочую
мембрану, но и обеспечивает снижение предела обнаружения из-за увеличения
времени взаимодействия конъюгата с аналитом, содержащимся в пробе.
Стекловолоконные мембраны, широко применяемые для нанесения конъюгата,
имеют неплотную структуру и большие поры, что позволяет наносить большое
количество конъюгата маркер-белок. Экспериментально установлено, что при
использовании нативной стекловолоконной мембраны для нанесения с помощью
диспенсера конъюгата КвТ-АТ/ХФ (в концентрации 7 нМ со скоростью 20 мкл/см)
конъюгат при проведении иммунохроматографии плохо вымывается. Неравномерное
движение фронта конъюгата приводит к появлению больших погрешностей при
определении интенсивности флуоресценции в аналитической зоне (рис. 46, кривая 3).
115
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
1,2
1,0
0,8
0,6
1
0,4
2
0,2
3
0,0
0,01
0,1
1
10
С(ХФ), нг/мл
Рис. 46. Зависимости интенсивности флуоресценции в аналитической зоне тестполоски от концентрации ХФ в пробе при разном количестве БСА в конъюгате КвТАТ/ХФ: кривые 1–3 соответствуют концентрациям БСА 2%, 5% и 0% в ББ (n=3).
Для увеличения времени контакта пробы с конъюгатом КвТ-АТ/ХФ Wong R.C. и
соавт.
рекомендуют
предварительную
обработку
стекловолоконных
мембран
растворами белков (например, БСА) или сахарозы [82]. Использование БСА позволяет
блокировать сайты неспецифической сорбции конъюгата маркер-белок. К тому же
полное пропитывание тестируемой пробой мембраны, обработанной дополнительным
вязким реагентом (например, БСА), требует большего времени, что увеличивает
период контакта компонентов пробы с конъюгатом маркер-антитело. Был проведен
выбор концентрации БСА в конъюгате КвТ-АТ/ХФ при его нанесении на
стекловолоконную
мембрану.
Критерием
оптимальности
была
высокая
воспроизводимость регистрируемой интенсивности флуоресценции. На рис. 47
представлены зависимости интенсивности флуоресценции в аналитической зоне тестполоски от концентрации ХФ в пробе при содержании БСА в наносимом на
стекловолоконную мембрану конъюгате КвТ-АТ/ХФ, равном 2 и 5%. Концентрация
БСА, равная 2%, позволяет получать значения интенсивностей флуоресценции с
погрешностью не более 10% (см. рис. 46, кривая 1), тогда как высокая концентрация
белка (5%) приводит к снижению интенсивности флуоресценции на 30% и высокой
погрешности (до 25%) (см. рис. 46, кривая 2). Исходя из этих результатов, в
116
последующих экспериментах в качестве реагента, блокирующего взаимодействие
конъюгата КвТ-АТ/ХФ со стекловолоконной мембраной, использовали 2% раствор
БСА в составе буферного раствора ББ (рН 8,3, 50 мМ), который рекомендован
производителем КвТ.
В следующей серии экспериментов проводили варьирование концентрации
конъюгата КвТ-АТ/ХФ в диапазоне 7-48 нМ. Установленные при этом характеристики
градуировочных кривых определения ХФ суммированы в табл. 10. Выбираемая в
качестве оптимальной концентрация конъюгата маркер-антитела должна обеспечивать
минимальную достоверно детектируемую концентрацию аналита в пробе.
Таблица
10.
Характеристики
градуировочных
кривых
определения
ХФ
с
использованием разрабатываемой иммунохроматографической тест-системы на
основе КвТ, полученные при варьировании концентрации конъюгата КвТ-АТ/ХФ.
КвТ-АТ/ХФ, нМ
48
24
16
7
ПрО (ХФ), нг/мл
5
2
1
0,2
3,1
0,9
1,1
0,6
0,4
0,2
Интенсивность флуоресценции при тестировании пробы, 3,8
не содержащей ХФ, отн. ед.
Интенсивность флуоресценции при тестировании пробы 1,1
с концентрацией ХФ, равной 100 нг/мл, отн. ед.
Как видно из представленных в таблице данных, с уменьшением концентрации
конъюгата снижается предел обнаружения – от 5 до 0,2 нг/мл. Эти результаты
соответствуют теоретическим представлениям о конкурентном иммуноанализе – при
меньшей концентрации конъюгата требуется меньшая концентрация аналита, чтобы
блокировать связывание конъюгата в аналитической зоне. Полученные данные
позволяют выбрать в качестве оптимальной концентрацию конъюгата КвТ-АТ/ХФ,
равную 7 нМ. При этой концентрации наблюдается низкий предел обнаружения ХФ –
0,2 нг/мл – и стабильный воспроизводимый сигнал – около 1,1 отн. ед. в отсутствие
аналита и 0,3 отн. ед. при концентрации ХФ 100 нг/мл. Дальнейшее уменьшение
концентрации конъюгата до 5 нМ снижает интенсивность флуоресценции в
аналитической зоне в отсутствие ХФ в пробе до 0,4 отн. ед., что приводит к получению
статистически недостоверных величин при количественных измерениях концентрации
117
аналита и исключает возможность визуальной качественной оценки результатов
анализа.
Пробоподготовка. Анализ содержания хлорамфеникола в молоке не требует
сложных и трудоемких стадий гомогенизации и экстракции перед проведением
иммунохроматографии. Однако выбор среды, используемой для предварительного
разведения пробы, потенциально может оказать влияние на аналитические
характеристики
тест-системы.
Для
обеспечения
хорошей
смачиваемости
нитроцеллюлозных мембран и формирования ровного фронта движущихся по рабочей
мембране пробы и конъюгата КвТ-АТ/ХФ целесообразно использование детергента
как реагента, добавляемого к тестируемой пробе на стадии пробоподготовки.
Проведена оценка влияния аналитический сигнал тест-системы различных
поверхностно-активных
веществ
(ПАВ).
Были
охарактеризованы
следующие
детергенты: Твины 20 и 80, Тритоны Х-100, 114, 305, 705, 45 и Бридж L 35,
тестирование которых проводилось в 1%-ной концентрации с учетом рекомендаций
производителя рабочих мембран [268]. Данные об интенсивности флуоресценции для
разных вариантов ИХА суммированы в таблице 11.
Таблица 11. Средние (n=3) значения интенсивностей флуоресценции аналитической
зоны иммунохроматографической тест-системы в зависимости от концентрации ХФ и
природы детергента, добавляемого к тестируемой пробе молока.
Детергент
С (ХФ), нг/мл
5
1
0,3
0,1
0,0
Твин-20
0,45
0,5
0,6
0,75
0,8
Твин-80
0,2
0,85
0,75
0,8
0,75
Тритон X-100
0,0
0,0
0,3
0,0
0,2
Тритон X-114
0,25
0,0
0,25
0,0
0,25
Без детергента
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Установлено, что некоторые из детергентов не могут быть использованы для
проведения ИХА - Тритоны Х-305, Х-705, Х-45 и Бридж L 35 существенно
увеличивают вязкость пробы и препятствуют ее движению вдоль мембраны при
проведении иммунохроматографии.
118
Использование детергентов Твин-20, Твин-80, Тритон Х-100 и Тритон Х-114
обеспечивало движение иммунореагентов вдоль рабочей мембраны и формирование
флуоресцирующей аналитической зоны.
Отметим, что все четыре представленных в таблице детергента вызывали
увеличения движение иммунореагентов вдоль рабочей мембраны по сравнению со
средой без детергента. Однако при этом для Тритона Х-100, Тритона Х-114 и Твина-80
в аналитической зоне наблюдалась низкая, плохо воспроизводимая интенсивность
флуоресценции без достоверно регистрируемой концентрационной зависимости, что
не позволяет получить монотонную градуировочную кривую для определения ХФ.
Учитывая
вышеперечисленные
недостатки
семи
из
восьми
исследованных
детергентов, для дальнейших работ мы использовали Твин-20.
Практическая задача выявления хлорамфеникола прежде всего связана с
контролем продуктов питания животного происхождения (молоко, мясо и др.), т.к. его
попадание в пищевые цепи обусловлено применением в ветеринарии [275; 276].
Сложный состав пробы может влиять на процессы, происходящие при проведении
ИХА, и, в конечном счете, на интенсивность флуоресценции аналитической зоны тестполоски по окончании анализа. Поэтому целесообразен выбор оптимального
протокола пробоподготовки, который бы, минимизируя негативное влияние матрикса
пробы, несущественно влиял на продолжительность и трудоемкость определения.
Были сопоставлены два варианта пробоподготовки молока: наиболее часто
применяемый способ – разбавление буферным раствором с детергентом и
обезжиривание методом центрифугирования, позволяющее удалить избыточный белок
[278]. В качестве контрольных препаратов использовали пробы цельного молока, не
подвергавшегося пробоподготовке. Результаты эксперимента представлены на рис. 47.
119
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1
2
3
4
Milk pretreatment, n=10
Рис.
47.
Интенсивность
флуоресценции
аналитической
зоны
иммунохроматографической тест-полоски для детекции ХФ для разных вариантов
пробоподготовки препарата молока с содержанием жира 3,2%: 1 – цельное
неразбавленное молоко, 2 – цельное молоко, разбавленное ФБС на 20%, 3 –
обезжиренное неразбавленное молоко, 4 – обезжиренное молоко, разбавленное ФБС на
20%. Представлены средние значения (n=10) для проб, не содержащих ХФ.
Интенсивности флуоресценции в аналитической зоне при работе с цельным и
обезжиренным молоком составили 0,8±0,2 отн. ед. и 1,0±0,14 отн. ед., соответственно
(столбцы 1 и 3 на рис. 47). Как видим, аналитический сигнал в случае обезжиренного
молока выше, но использование дополнительной аппаратуры не позволяет включить
пробоподготовку с помощью центрифугирования в протокол тест-метода. В отличие
от центрифугирования, разбавление пробы не препятствует быстрому проведению
тестирования во внелабораторных условиях.
Интенсивности флуоресценции в аналитической зоне при работе с разбавленным
цельным и обезжиренным молоком составили 1,1±0,03 отн. ед. и 1,1±0,2 отн. ед.
(столбцы 2 и 4 на рис. 47). Погрешность анализа в случае использования
обезжиренного разбавленного молока достаточно велика – 18%. Погрешность
определяется как относительное стандартное отклонение значений интенсивности
флуоресценции от среднего. Для дальнейшей работы использовали вариант
пробоподготовки, соответствующий второму столбцу на рис. 48: разбавление цельного
молока на 20% ФБС с 1% Твин-20.
120
Время проведения анализа. Время анализа с использованием тест-полосок зависит
от
динамики
формирования
комплекса
маркер-антитело-антиген-белок
в
аналитической зоне. Определение оптимального времени анализа проводили на
основании зависимости интенсивности флуоресценции в аналитической зоне от
времени, прошедшего после контакта тест-полоски с пробой.
Из экспериментальных данных (рис. 48) следует, что аналитический сигнал
достоверно не увеличивается после 8 мин иммунохроматографии. Регистрация
интенсивности флуоресценции через 10 мин. обеспечивает максимальную амплитуду
и высокую воспроизводимость результатов анализа.
Рис. 48. Зависимость интенсивности флуоресценции в аналитической зоне от времени
после контакта тест-полоски с пробой молока, не содержащей ХФ.
Результаты проведенной оптимизации иммунохроматографической тест-системы
детекции ХФ с использованием КвТ в качестве маркера суммированы в таблице 12.
Для дальнейших экспериментов тест-полоски изготавливали, исходя из этих
требований.
121
Таблица 12. Оптимальная комплектация иммунохроматографической тест-системы на
основе квантовых точек для детекции хлорамфеникола в молоке и условия проведения
анализа с ее использованием.
Параметр
Значение
Рабочая мембрана
CNPC 12мкм, MDI
Мембрана для пробы
R7L, MDI
Пробоподготовка молока с жирностью 3,2%
Разбавление на 20%
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
с 1% Твин-20
Режим нанесения конъюгата
Концентрация конъюгата КвТ 625-АТ/ХФ и расход при 7 нМ, 20 мкл/см
нанесении
Состав среды для нанесения конъюгата КвТ 625-АТ/ХФ
ББ (рН 8,4, 50 мМ) с
2% БСА
Режим формирования аналитической зоны
Концентрация конъюгата ХФ-СИТ и расход при нанесении
0,15 мг/мл, 1 мкл/см
Состав среды для нанесения конъюгата ХФ-СИТ
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Режим формирования контрольной зоны
Концентрация и расход при нанесении антивидовых козьих 0,25 мг/мл, 1 мкл/см
антимышиных антител
Состав среды для нанесения антивидовых антител
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Характеристика тест-системы. Для определения аналитических параметров
разработанной тест-системы было проведено тестирование проб молока с разным
содержанием ХФ.
Как видно из рис. 49, с ростом концентрации аналита в пробе интенсивность
флуоресценции в аналитической зоне постепенно снижается до полного исчезновения,
что соответствует принципу конкурентного иммуноанализа.
122
Рис. 49. Внешний вид иммунохроматографических тест-полосок после тестирования
проб с разным содержанием ХФ: (1) 0; (2) 0,1; (3) 0,3; (4) 1,0 и (5) 5,0 нг/мл.
Предел визуальной детекции ХФ (концентрация, соответствующая исчезновению
флуоресценции) составил 1,0 нг/мл.
По результатам измерений, проведенных для проб с различным содержанием ХФ
(n=10), построена градуировочная кривая (рис. 50), позволяющая определить
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
аналитические характеристики разработанного тест-метода.
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,01
0
0,1
1
10
100
C(ХФ), нг/мл
Рис. 50. Градуировочная кривая определения ХФ с помощью разработанной
иммунохроматографической тест-системы на основе КвТ.
123
Полученная зависимость интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
тест-полоски от логарифма концентрации ХФ в пробе описывается линейным
уравнением (R2=0,998):
y = 0,717 – 0,211 lg x, (20)
где х – концентрация аналита, у – интенсивность флуоресценции.
Исходя из подходов, описанных в [217; 223; 241], были установлены
аналитические характеристики тест-системы. Предел обнаружения ХФ составил 0,2
нг/мл, рабочий диапазон количественного определения содержания ХФ в пробах – 0,320 нг/мл. Для этого диапазона концентраций аналита стандартное отклонение
измеренных значений концентрации ХФ не превышает 7,4%, что свидетельствует о
высокой воспроизводимости результатов анализа.
Апробация тест-системы. Проведенные эксперименты «введено-найдено» в
пробах молока показали, что полнота выявления ХФ (R, %) варьирует от 93,3 до 110%,
а стандартное отклонение измеренных значений концентрации ХФ не превышает 10%
(табл. 13).
Таблица 13. Степень выявления ХФ в пробах молока (n=3).
С (ХФ), нг/мл
R, %
Стандартное отклонение, %
1
110,0
3,7
3
106,7
9,8
6
93,3
10,0
Хранение тест-системы. Исследовано влияние условий хранения тест-полосок на
стабильность характеристик разработанной аналитической методики. Упакованные в
фольгированные пакеты тест-полоски (3 серии по 100 штук) хранили при 4°С, при
комнатной температуре (20–23°С) и при 37 °С. По истечении 30 дней были определены
аналитические характеристики тест-системы с использованием стандартных растворов
ХФ в молоке в диапазоне концентраций от 0 до 100 нг/мл. Для каждой концентрации
ХФ определение проводили в 10 повторах. Погрешность анализа с использованием
тест-полосок, хранящихся при 4°С, составила 30-70%; для тест-полосок, хранящихся
при 37 °С, – 7-80%. Наилучшие результаты наблюдались при работе с тестами,
хранящимися при комнатной температуре. Погрешность анализа составила 3-6%, что
124
сопоставимо с характеристиками для свежеприготовленных тест-полосок. Кроме того,
хранение
тест-полосок
при
комнатной
температуре
в
течение
месяца
не
сопровождается изменениями рабочего диапазона тест-метода.
Тест-система с оптической детекцией. Для оценки возможностей квантовых точек
как
маркера
для
иммунохроматографии
принципиальное
значение
имеет
сравнительная характеристика тест-систем, реализованных с использованием одних и
тех же иммунореагентов, но разных маркеров – квантовых точек и традиционного
маркера, коллоидного золота. Данное сопоставление было проведено на примере тестсистем для определения ХФ в молоке.
Иммунохроматографические
тест-системы
для
определения
ХФ
с
использованием КЗ были изготовлены в соответствии с методиками, ранее
реализованными в лаборатории [83]. Конъюгирование КЗ с антителами против ХФ
проводили методом физической адсорбции (см. разделы 2.2.6 и 3.1.2). При
изготовлении тест-полосок оптическая плотность (А520) используемого раствора
конъюгата КЗ-АТ/ХФ составила 2,0. Концентрация раствора конъюгата ХФ-СИТ,
используемого для адсорбции в аналитической зоне, равнялась 0,25 мг/мл.
Корректное сравнение двух тест-систем обеспечивалось использованием одних и
тех же антител и одинаковой пробоподготовки. Было проведено тестирование проб
молока с жирностью 3,2%, отличавшихся по содержанию ХФ. Внешний вид тестполосок на основе КЗ после проведения иммунохроматографии представлен на рис. 51.
1
2
Рис. 51. Внешний вид иммунохроматографических тест-полосок на основе КЗ после
тестирования проб молока с разным содержанием ХФ. 1 – контрольная зона, 2 –
аналитическая зона.
125
На
основании
полученной
зависимости
интенсивности
окрашивания
аналитической зоны от содержания ХФ построена градуировочная кривая (рис. 52),
которая описывается четырехпараметрическим уравнением:
𝑦=
59156
𝑥 1,3
)
25,3
1+(
+ 1299, (21)
Интенсивность окрашивания, отн. ед.
где y – интенсивность окрашивания аналитической зоны; x – концентрация аналита.
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0,1
1
10
100
C(ХФ), нг/мл
Рис. 52. Градуировочная кивая иммунохроматографического определения содержания
ХФ в молоке с помощью тест-полосок на основе КЗ.
Исходя из градуировочной кривой, определены аналитические характеристики
тест-системы. Иммунохроматографический анализ ХФ на основе КЗ характеризуется
пределом обнаружения 4,8 нг/мл и рабочим диапазоном 8,7–214 нг/мл.
Сравнение аналитических характеристик иммунохроматографических тестсистем для определения ХФ в молоке с фото- и флуоресцентными маркерами
свидетельствует о том, что КвТ позволяют существенно снизить предел обнаружения
ХФ
(в
24
раза),
принципиально
иммунохроматографического
анализа.
не
изменяя
методику
проведения
Наблюдаемое
отличие
тест-систем
объясняется двумя факторами. Во-первых, как было показано экспериментально (см.
126
раздел 3.2.3), предел детекции КвТ в 9 раз ниже предела детекции КЗ. Во-вторых, в
конкурентном формате анализа значительное влияние на минимально определяемое
количество
аналита
оказывает
количество
антител,
иммобилизованных
на
поверхности маркера. При ковалентной иммобилизации антител на поверхности КвТ
их количество не превышало двух, тогда как при адсорбции антител на КЗ
происходит заполнение всей поверхности частицы.
Количество антител на поверхности коллоидного золота вычисляли, используя
допущение, что антитела взаимодействуют с КЗ Fc-фрагментами. Зная среднюю
площадь поверхности наночастицы (2,8∙10 -3 мкм2) и площадь, которую занимает Fcфрагмент диаметром 4 нм, определено теоретическое содержание антител в
конъюгате. Максимальное количество антител, которое может быть иммобилизовано
на поверхности наночастицы КЗ диаметром 30 нм, составляет около 190 шт., что в 95
раз превышает количество антител в комплексе с КвТ.
3.3.2 Разработка и апробация иммунохроматографической тест-системы на
основе КвТ для определения иммуноглобулина E
Задача представленного в данном разделе диссертации исследования состояла в
разработке иммунохроматографической тест-системы с флуоресцентным маркером
для определения высокомолекулярных соединений, для которых наиболее часто
применяется «сэндвич»-формат анализа.
В качестве высокомолекулярного аналита был выбран иммуноглобулин Е (IgE)
человека, являющийся маркером аллергических реакций [278; 279]. При диагностике
аллергических
заболеваний
наибольшую
значимость
представляют
IgE–
опосредованные реакции (реакции первого типа). Иммунопатологический механизм
аллергической реакции обусловлен повышением продукции специфических антител
класса IgE в ответ на контакт с определенным аллергеном, что и определяет
диагностическую значимость контроля уровня IgE в сыворотке крови [280].
Отличие
разработки
иммунохроматографической
тест-системы
для
определения IgE от рассмотренной выше системы определения ХФ состоит в
применении не конкурентного, а «сэндвич»-формата анализа (см. раздел 1.1.2, рис. 3,
В), предусматривающего формирование в ходе иммунохроматографии комплекса
антитело-антиген-антитело-маркер
и,
как
127
правило,
обеспечивающего
для
поливалентных антигенов более низкий предел обнаружения по сравнению с
конкурентными методами. Для «сэндвич»-формата иммунохроматографии степень
связывания маркера в аналитической зоне тест-системы находится в прямой
зависимости от концентрации аналита в пробе и зависит от свойств и концентрации
используемых в тест-системе антител.
Проведенные
исследования
по
реализации
и
характеристике
иммунохроматографического определения содержания IgE с использованием КвТ в
качестве маркеров были направлены на достижения максимального предела
обнаружения и включали:
выбор рабочих и вспомогательных мембран для тест-полоски,
выбор концентраций иммобилизованных антител и конъюгата КвТ-АТ/IgE,
выбор состава среды для проведения анализа.
Исследования проводили с использованием коммерческих стандартных
растворов IgE человека с разным содержанием аналита (фирма «Dr. Fooke»).
Мембранные
компоненты.
Принципиальным
элементом
разработки
иммунохроматографической тест-системы для определения IgE в сыворотке крови
является выбор рабочей мембраны, позволяющей работать со сложным матриксом
пробы
без
дополнительной
прободготовки.
Нами
сопоставлено
9
видов
нитроцеллюлозных мембран разных производителей, отличающихся по размеру пор
и степенью связывания белка. Полученные данные об относительных уровнях
связывания маркеров в аналитической зоне приведены на рис. 53. Отметим, что,
кроме обеспечения высокого аналитического сигнала, рабочая мембрана должна
удовлетворять
дополнительным
требованиям.
Во-первых,
движение
пробы
(сыворотки крови) должно быть равномерным. Во-вторых, анализ, соответствуя
временному интервалу экспресс-тестов (не боле 15 мин.), должен обеспечивать
наиболее
полное
протекание
иммунохимической
обнаружения и высокую точность результатов.
128
реакции,
низкий
предел
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
4
3
2
1
0
8
H
H
10
12
15
10
75
20
CNP 90CNP CNPF CNPC CNPC CNPC Millip. illip. 1 CNPF
M
150
Тип рабочей мембраны
Рис. 53. Сравнение рабочих мембран как компонентов иммунохроматографической
системы для определения IgE человека в сыворотке крови. Представлены средние
значения интенсивности флуоресценции в аналитической зоне тест-полоски (n=5).
Как следует из рис. 54, максимальный аналитический сигнал с малой
погрешностью (не более 13%) отмечен при использовании мембраны CNPC 12 со
средней степенью связывания белка и с номинальным размером пор 12 мкм.
Мембрана
CNPC
10
также
позволяет
получить
высокую
интенсивность
флуоресценции, но со значительной погрешностью (30%). Другие апробированные
мембраны характеризуются существенно более низкой (в 1,5-2 раза меньше по
сравнению с мембраной CNPC 12) интенсивностью флуоресценции и высокой
погрешностью регистрируемых результатов анализа (до 50%).
Характеристика антител. В работе исследовали четыре вида мышиных
моноклональных антител против IgE человека: клоны 4F4, 5D4, МЕ-113 и МЕ-111
(согласно каталогам фирмы «Полигност» и ВНЦМДЛ). Взаимодействие антител с
целевым
антигеном
предварительно
охарактеризовали
методом
ИФА
с
использованием коммерческих реагентов фирмы «Dr. Fooke» (см. раздел 2.2.16). При
проведении ИФА в лунках микропланшета иммобилизовали растворы антител в
концентрации 3 мкг/мл, проводили их взаимодействие со стандартными образцами
IgE («Dr. Fooke») в диапазоне концентраций от 0 до 200 МЕ/мл, а образовавшиеся
129
иммунные комплексы выявляли с помощью антител против IgE, меченных
пероксидазой, и субстрата пероксидазы на основе ТМБ. Полученные зависимости
представлены на рис. 54.
Рис. 54. Зависимости оптической плотности в иммуноферментном анализе от
концентрации IgE для разных клонов антител, иммобилизованных в лунках
микропланшета: 1 – клон МЕ-111; 2 – клон 5D4; 3 – клон МЕ-113; 4 – клон 4F4
Из приведенных на рисунке кривых следует, что два клона антител - МЕ-111 и
5D4 - достоверно не связываются с антигеном. Клоны антител МЕ-113 и 4F4
эффективно связываются с IgE. Большую аффинность иммунохимического
взаимодействия проявляют антитела клона 4F4. Дальнейшая характеристика всех
антител проводилась в мембранных системах.
Для реализации анализа в «сэндвич»-формате нужна пара специфических
антител, одно из которых иммобилизовано на поверхности маркера, а второе – в
аналитической зоне тест-полосок. Взаимодействие этих антител с антигеном в ходе
иммунохроматографии приводит к формированию детектируемых комплексов
антитело-антиген-антитело-маркер. Используя четыре имеющихся клонов антител,
потенциально можно реализовать 16 вариантов анализа, отличающихся по антителам
в составе детектируемых комплексов.
Проведен выбор оптимального сочетания антител для «сэндвич»-формата
иммунохроматографии. Критерием выбора было достижение максимального
аналитического сигнала при фиксированной концентрации антигена. Были получены
130
конъюгаты всех клонов антител с КвТ (КвТ-АТ МЕ-111, КвТ-АТ 5D4, КвТ-АТ МЕ113 и КвТ-АТ 4F4) с мольным соотношением наночастица : белок, равным 1:10.
Комплектация тест-полосок, используемая для сравнительной оценки различных
сочетаний антител в иммунохроматографии, представлена в таблице 14.
Таблица 14. Комплектация иммунохроматографической тест-системы определения
IgE, используемой для выбора оптимального сочетания антител.
Параметр
Значение
Концентрация конъюгата КвТ-АТ и его расход при
0,8 мкМ, 20 мкл/см
нанесении
Состав среды для нанесения конъюгата КвТ-АТ
ББ (рН 8,4, 50 мМ) с
2% БСА
Концентрация антител и их расход при нанесении в
1 мг/мл, 1 мкл/см
аналитической зоне
Состав среды для нанесения антител
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
В качестве тестируемой пробы использовали стандартный раствор IgE человека
с концентрацией 1000 МЕ/мл («Dr. Fooke», Германия). Полученные результаты
представлены в таблице 15 и на рис. 55.
Таблица
15.
Интенсивность
иммунохроматографической
флуоресценции
тест-системы
для
в
аналитической
определения
IgE
зоне
человека
использованием КвТ при различных комбинациях антител против IgE человека.
Антитела в составе
конъюгата с КвТ
Антитела, иммобилизованные в аналитической зоне
Клон 4F4
Клон ME-113
Клон МЕ-111
Клон 5D4
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
Клон 4F4
1,1
1,6
0,4
0,0
Клон ME-113
30,8
6,8
1,8
0,0
Клон МЕ-111
0,0
0,0
0,0
0,0
Клон 5D4
0,9
0,0
0,0
0,0
131
с
Рис. 55. Связывание в аналитической зоне иммунохроматографической тест-системы
определения IgE с использованием КвТ для разных сочетаний антител против IgE.
Максимальная интенсивность флуоресценции отмечалась для сочетания: клон
МЕ-113 в составе конъюгата с квантовыми точками + адсорбированный на мембране
клон 4F4. По интенсивности флуоресценции в аналитической зоне (т.е. количеству
образующихся и детектируемых иммунных комплексов) данное сочетание в 4 и более
раз превосходило остальные варианты (см. табл. 15). Отметим, что из 16
протестированных сочетаний антител лишь для 5 наблюдалось достоверное
образование иммунных комплексов. Эффективное взаимодействие с антигеном на
мембране наблюдалось для тех же клонов антител, что и в микропланшетной системе
(см. рис. 54). Отметим также, что при использовании одного и того же клона антител
(МЕ-113 или 4F4) в конъюгате, и в аналитической зоне происходило образование
«сэндвич»-комплекса, регистрируемое как высокие значения интенсивности
флуоресценции
в
аналитической
иммунохроматографии.
Этот
зоне
эффект,
тест-полоски
характерный
после
лишь
проведения
для
части
иммуноаналитических систем в «сэндвич»-формате [281], объясняется тем, что IgE
имеет симметричную димерную структуру, благодаря которой повторяющиеся
эпитопы могут связаться и с иммобилизованным и с меченым антителом.
132
Выбранное сочетание антител (клон МЕ-113 в составе конъюгата с квантовыми
точками и адсорбированный на мембране клон 4F4) использовалось во всех
последующих экспериментах.
Режим формирования аналитической зоны. Состав буферного раствора для
иммобилизации специфических антител на мембране (50 мМ ФБС, рН 7,4) был
выбран на основании результатов работы по твердофазному иммуноферментному
определению IgE [282].
Концентрацию антител 4F4, иммобилизуемых в аналитической зоне тестполоски, варьировали от 1 до 3 мг/мл (расход реагентов при нанесении - 1 мкл/см).
Для концентраций в этом диапазоне получены (рис. 56) зависимости интенсивности
флуоресценции в аналитической зоне после проведения иммунохроматографии от
содержания в IgE тестируемой пробе. Оптимальную концентрацию антител 4F4
выбирали, основываясь на двух требованиях:
- минимальное значение предела обнаружения IgE;
- для пробы, соответствующей содержанию IgE в норме (около 100 МЕ/мл)
[283], интенсивности флуоресценции в аналитической и контрольной зонах должны
быть сопоставимы.
Рис. 56. Зависимости интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
иммунохроматографической системы определения IgE от концентрации IgE,
полученные при концентрациях иммобилизуемых антител 4F4, 1, 2 и 3 мг/мл (кривые
1-3, соответственно).
133
Как видно из рис. 56, с ростом концентрации иммобилизуемых антител в
исследованном диапазоне регистрируемый сигнал увеличивается, а предел
обнаружения IgE снижается (хотя различия между кривыми 2 и 3 уже
незначительны).
При максимальной охарактеризованной концентрации иммобилизованных
антител, равной 3 мг/мл, интенсивность флуоресценции в аналитической зоне для
стандартного раствора с содержанием аналита 100 МЕ/мл составила 3,9±0,2 отн. ед.,
в контрольной зоне – 3,3±0,2 отн. ед. Таким образом, концентрация АТ/IgE 4F4,
равная 3,0 мг/мл, удовлетворяет установленным требованиям. Данная концентрация
была выбрана в качестве оптимальной для формирования аналитической зоны и
использовалась в последующих экспериментах.
Режим нанесения конъюгата КвТ-АТ/IgE. Следующая задача, решаемая в ходе
разработки тест-системы, состоит в выборе оптимальной концентрации конъюгата
КвТ-АТ/IgE. Для «сэндвич»-формата анализа критерием сравнения различных
концентраций данного реагента является максимальная достоверно детектируемая
интенсивность флуоресценции в аналитической зоне. Варьирование концентрации
конъюгата проводили в диапазоне от 4 до 20 нМ (по КвТ). Получена зависимость
интенсивности флуоресценции в аналитической зоне после иммунохроматографии от
концентрации конъюгата КвТ-АТ/IgE, приведенная на рис. 57. В качестве пробы
использовали стандартный раствор IgE человека с концентрацией 200 МЕ/мл («Dr.
Fooke», Германия).
Как следует из рис. 57, с увеличением концентрации конъюгата интенсивность
флуоресценции в аналитической зоне растет и достигает максимума при 12 нМ
(стандартное отклонение не превышает 5%). При дальнейшем росте концентрации
конъюгата увеличение детектируемого сигнала незначительно и сопровождается
ростом его стандартного отклонения (до 10%). Кроме того, в этой области
концентраций конъюгата происходит рост фонового сигнала, обусловленный
равномерным распределением несвязавшегося конъюгата по поверхности мембраны.
С учетом изменений, наблюдавшихся при более высоких концентрациях, выбранная
оптимальная концентрация конъюгата КвТ-АТ/IgE составила 10 нМ. На мембрану
конъюгат наносили из ББ, содержащего 2% БСА (в соответствии с рекомендациями
[284]).
134
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
Концентрация конъюгата КвТ-АТ/IgE, нМ
Рис. 57. Зависимость интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
иммунохроматографической тест-системы определения IgE от концентрации
конъюгата КвТ-АТ/IgE. Концентрация IgE в тестируемой пробе – 200 МЕ/мл.
Пробоподготовка. В связи со сложным матриксом проб (сыворотки крови)
проводили оценку его влияния на результаты определения. Выбранная комплектация
тест-системы (прежде всего – рабочая мембрана CNPC, 12 мкм) позволяет работать с
неразбавленными пробами сыворотки крови. Однако для повышения подвижности в
пробу необходимо добавлять детергент Твин-20 до концентрации 1% (данный эффект
показан нами в экспериментах, аналогичных описанным в разделе 3.3.1). Из практики
иммунохимического определения специфических антител известно [285], что в
некоторых случаях необходимо использовать разбавление пробы. Достигаемое при
этом снижение влияния матрикса является более значимым, чем потеря
чувствительности определения, и обеспечивает в конечном счете снижение
минимальной выявляемой концентрации аналита. Степень разбавления пробы
выбирали для препарата IgE (стандартный раствор IgE человека с концентрацией 100
МЕ/мл («Dr. Fooke», Германия)), соответствующего реальной сыворотке крови по
основным компонентам и вязкости. В результате проведенных экспериментов
получена представленная на рис. 58 зависимость интенсивности флуоресценции в
аналитической зоне тест-полоски от степени разбавления тестируемой пробы (рис.
58).
135
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1:10 1:5 1:4
1:2
1
Разведение пробы
Рис. 58. Зависимость интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
иммунохроматографической системы определения IgE от разбавления пробы с
содержанием IgE, равным 100 МЕ/мл.
Из полученных данных видно, что при разбавлении пробы более чем в 2 раза
наблюдается отклонение от линейной зависимости и искажение результатов. Таким
образом, при необходимости можно использовать сыворотки крови, разбавленные в
2 раза ФБС (рН 7,4, 50 мМ).
Продолжительность анализа. С целью определения оптимального времени
анализа
получена
представленная
на
рис.
59
зависимость
интенсивности
флуоресценции в аналитической зоне от времени контакта тест-полоски с пробой –
стандартным раствором IgE с концентрацией 200 МЕ/мл.
Как видно из экспериментальных данных (см. рис. 59), 80% от максимального
сигнала в аналитической зоне достигается за 10 мин. Дальнейший рост
интенсивности флуоресценции приводит к увеличению погрешности определяемых
значений. Поэтому в последующих экспериментах время между началом анализа и
регистрацией его результатов составляло 10 мин.
136
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Время, мин
Рис. 59. Зависимость интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
иммунохроматографической системы определения IgE от продолжительности
анализа.
Результаты проведенной оптимизации иммунохроматографической тест-системы
детекции IgE с использованием КвТ в качестве маркера суммированы в таблице 16. Для
дальнейших экспериментов тест-полоски изготавливали, исходя из этих требований.
Таблица 16. Оптимальная комплектация и условия проведения анализа для
иммунохроматографической
системы
детекции
IgE
в
сыворотке
крови
с
использованием КвТ в качестве маркера.
Параметр
Значение
Рабочая мембрана
CNPC 12мкм, MDI
Пробоподготовка сыворотки крови человека
Добавление Твин-20
до
конечной
концентрации 1%
Режим нанесения конъюгата
Концентрация и расход при нанесении конъюгата КвТ 625- 10 нМ, 20 мкл/см
АТ/IgE
137
Состав среды для нанесения конъюгата КвТ 625-АТ/ IgE
ББ (рН 8,3, 50 мМ)
с 2% БСА
Режим формирования аналитической зоны
Концентрация и расход при нанесении АТ/IgE, клон 4F4,
3 мг/мл, 1 мкл/см
Состав среды для нанесения АТ/IgE, клон 4F4
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Режим формирования контрольной зоны
Концентрация и расход при нанесении антивидовых козьих 1 мг/мл, 1 мкл/см
антимышиных антител
Состав среды для нанесения антивидовых антител
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Апробация тест-системы. Исходя из выбранной комплектации тест-системы и
методики ее применения, было проведено тестирование стандартных препаратов IgE
с концентрациями от 5 до 1000 МЕ/мл. На основании результатов измерений
интенсивности флуоресценции в аналитической зоне тест-полосок (n=10) была
построена градуировочная кривая для определения содержания IgE, представленная
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
на рис. 60.
16
14
12
10
8
6
4
2
0
10
100
1000
Концентрация общего IgE, ME/мл
Рис. 60. Градуировочная кривая для определения содержания IgE в сыворотке крови
человека с использованием разработанной иммунохроматографической тестсистемы на основе КвТ (n=10).
138
На
основании
полученной
градуировочной
зависимости
определены
аналитические характеристики тест-системы: предел обнаружения составил 2 МЕ/мл,
рабочий диапазон – 5-1000 МЕ/мл, стандартное отклонение в рабочем диапазоне не
превышает 9,5% (n=10) (табл. 17).
Таблица
17.
Сравнительная
оценка
воспроизводимости
результатов
иммунохроматографического и иммуноферментного определения уровня IgE (n=5).
[IgE],
ИХА
ИФА
ME/мл
Среднее значение
Отклонение
Среднее значение
Отклонение
сигнала, отн. ед.,
(SD), %
сигнала, ОП450
(SD), %
5
0,38
9,3
0,15
1,0
20
1,06
6,6
0,31
2,1
50
1,94
9,5
0,59
0,9
100
3,90
4,6
0,99
0,2
200
7,12
2,5
1,50
5,4
1000
16,1
2,0
2,70
0,6
В качестве референсного метода оценки содержания аналита использовался
микропланшетный иммуноферментный набор производства фирмы «Dr. Fooke»
(Германия), характеризующийся таким же рабочим диапазоном определяемых
концентраций IgE – 5-1000 МЕ/мл.
Экспериментально
полученные
значения
стандартного
отклонения
интенсивности флуоресценции для иммунохроматографического определения IgE в
рабочем диапазоне концентраций не превышают 9,5%. Измерения методом ИФА с
фотометрической детекцией характеризуются стандартным отклонением не более
5,4%. Полученные результаты позволяют рассматривать разработанную тест-систему
как средство количественного определения аналита.
Для апробации разработанной тест-системы на панели проб сыворотки крови с
количественным
представлением
результатов
необходимо
определить
вид
зависимости, наиболее точно описывающей полученную градуировочную кривую
(рис. 60). Построенная в линейных координатах зависимость интенсивности
139
флуоресценции (у) от концентрации аналита (х) описывается, как рекомендовано в
[286], экспоненциальным уравнением (R2=0,9988):
𝑦 = −17,4 × 𝑒 (−𝑥/402) + 17,6. (22)
Следует, однако, учитывать, что большинство коммерческих наборов
используют либо линейную аппроксимацию, либо калибровочные кривые,
построенные в полулогарифмических координатах, и их описание с помощью
четырехпараметрического сигмоидного уравнения. Калибровочная кривая для
иммунохроматографической тест-системы, построенная в полулогарифмических
координатах, описывается уравнением (R2=0,999):
𝑦 = ((0,23 − 22)/(1 + (
1,1
𝑥
407
) )) + 22, (23)
Для дальнейшей работы применяли приближение градуировочной кривой в
полулогарифмических координатах четырехпараметрической сигмоидной функцией.
При апробации разработанную тест-системы сравнивали с иммуноферментной
тест-системой производства фирмы «Dr. Fooke». Результаты измерений для шести
стандартных
препаратов
IgE
человека,
полученные
двумя
методами,
характеризовались высокой степенью корреляции (R2=0,9989) – см. рис. 61.
1,6
1,4
ИФА (А450)
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
ИХА (интенсивность флуоресценции, отн. ед.)
Рис. 61. Корреляция результатов по определению IgE человека в стандартных
растворах методом ИФА (с использованием набора фирмы «Dr. Fooke») и методом
ИХА с КвТ (с использованием разработанной иммунохроматографической тестсистемы), R2=0,9989.
140
Разработанная иммунохроматографическая тест-система для определения IgE
была апробирована на выборке, состоящей из 95 проб сыворотки крови. Выборка
включала 43 пробы, полученные от здоровых доноров, и 52 пробы от пациентов с
аллергическими реакциями. Содержание IgE в пробе определялось на основании
интенсивности флуоресценции в аналитической зоне иммунохроматографической
тест-полоски с использованием следующей аппроксимации градуировочной кривой:
21,7
0,9
𝑥 = 406,7 × (− (𝑦−21,9)) , (24)
где х – определяемая концентрация IgE, у – интенсивность флуоресценции в
аналитической зоне тест-полоски после анализа пробы.
Данное уравнение, отражающее сигмоидную зависимость, было выбрано с
учетом практически совпадающих характеристик двух способов расчета (на
основании сигмоидной аппроксимации), а также возможности унифицировать
обработку данных ИФА и ИХА. Уравнение (24) было использовано для расчета
концентрации IgE в 95 тестируемых пробах сывороток. На рис. 62 представлены
Концентрация общего IgE, МЕ/мл, ИФА
данные о корреляции уровней IgE, определенных методами ИХА и ИФА.
1000
800
600
400
200
0
0
200
400
600
800
1000
Концентрация общего IgE, МЕ/мл, ИХА
Рис. 62. Сравнение результатов по определению IgE в 95 пробах сыворотки крови
человека методом ИФА (с использованием коммерческой системы «Dr. Fooke») и
методом ИХА (с использованием разработанной тест-системы).
Результаты, полученные с помощью иммунохроматографической тест-системы
с КвТ в качестве маркера, хорошо коррелируют с данными ИФА. Экспериментально
141
определенный коэффициент корреляции данных составляет 0,988. Разработанная
тест-система позволяет достоверно определять содержание IgE в широком диапазоне
концентраций – от 5 до 1000 МЕ/мл, соответствующем возможной вариации данного
параметра в биопробах.
Отличия интенсивности флуоресценции в аналитической зоне при тестировании
проб сывороток крови здоровых доноров и доноров с аллергическими реакциями
показаны на рис. 63. Как видим, разработанная тест-система позволяет достоверно
Б
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
А
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
отличать препараты, относящиеся к этим двум группам.
10
здоровые доноры
A
1000 МЕ/мл
9
8
7
6
5
4
200 МЕ/мл
3
100 МЕ/мл
2
50 МЕ/мл
20 МЕ/мл
5 МЕ/мл
1
0
0
10
20
30
40
Номер пробы
доноры с аллергическими реакциями
B
10
1000 МЕ/мл
9
8
7
6
5
4
200 МЕ/мл
3
100 МЕ/мл
2
1
0
0
10
20
30
40
50
Номер пробы
Рис. 63. Распределения по интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
иммунохроматографической тест-системы для проб сывороток крови здоровых
доноров, n =43 (А) и проб сывороток крови доноров с аллергическими реакциями, n
=52 (Б).
142
Хранение тест-системы. Для разработанной тест-системы проведена оценка
условий хранения, обеспечивающих стабильность аналитических характеристик.
Тест-полоски, упакованные в фольгированные пакеты, хранились при 4°С,
комнатной температуре (20-23°С) и 37 °С в течение 30 дней (режим ускоренного
старения). По истечении срока хранения были определены аналитические
характеристики тест-систем с использованием стандартных растворов IgE человека.
Стандартное отклонение результатов анализа с использованием тест-полосок,
хранившихся при 4°С, составила 2,0-10% (для диапазона концентраций IgE от 5 до
1000 МЕ/мл); стандартное отклонение для тест-полосок, хранившихся при 37 °С –
1,3-10%. Наилучшие результаты наблюдались при работе с тестами, хранившимися
при комнатной температуре. Погрешность анализа составила 1,0-5%. Отметим
соответствие полученных результатов по оптимальному режиму хранения данным
для
иммунохроматографической
системы
определения
хлорамфеникола,
представленным в разделе 3.3.1 диссертационной работы. В целом проведенная
предварительная характеристика свидетельствует о возможности использования
разработанных тест-систем в течение длительного времени.
3.4 Разработка мультиплексных иммунохроматографических тест-систем
Как
было
отмечено
иммунохроматографического
в
разделе
анализа
1,
увеличение
является
весьма
производительности
актуальной
задачей.
Доминирующий подход к ее решению состоит в изготовлении мультиплексных тестсистем, обеспечивающих одновременный контроль нескольких соединений. Как
правило [191; 287], для этого на тест-полоску наносят несколько последовательно
расположенных зон, содержащих иммунореагенты разной специфичности. Каждый
из иммобилизованных иммунореагентов, связывая окрашенный маркер, позволяет
контролировать присутствие в пробе и содержание определенного соединения.
Безусловным преимуществом такого подхода является снижение (из расчета на один
контролируемый параметр) расхода пробы и мембранных материалов. Однако из-за
необходимости идентификации близко расположенных полос интерпретация
143
результатов
перестает
быть
такой
же
простой,
как
в
традиционном
монопараметрическом анализе, в котором вывод делается исходя из наличия или
отсутствия окрашенной полосы в аналитической зоне.
Учитывая вышеописанные ограничения существующих методов, в рамках
диссертационной работы был реализован альтернативный подход, основанный на
использовании в одной тест-полоске нескольких маркеров разных цветов. Этот
подход упрощает интерпретацию результатов мультиплексного анализа – зона
связывания и соответствующее контролируемое соединение идентифицируются по
окраске маркера, а не по точно определяемой локализации на тест-полоске.
3.4.1
Мультиплексная
иммунохроматографическая
тест-система
с
использованием квантовых точек
Целесообразным для разработки мультиплексных иммунохроматографических
тест-систем представляется использование в качестве маркеров флуоресцентных
КвТ, длины волн эмиссии которых находятся в видимом диапазоне.
Проведенные в рамках работы предварительные исследования (см. раздел 3.3)
показали
возможность
их
высокочувствительного
детектирования
в
иммунохроматографии. КвТ любых размеров хорошо поглощают в широком
диапазоне - 280–800 нм, поэтому их можно возбуждать светом одной длины волны.
Чтобы не препятствовать регистрации эмиссии, оправдано использование для
возбуждения света в диапазоне от 300 до 450 нм. Спектр эмиссии КвТ, гомогенных
по размерам ядер, представляет собой узкий симметричный пик с шириной на
полувысоте от 20 до 40 нм. С изменением размера КвТ, ядро которых сформировано
CdSe, от 2 до 8 нм происходит сдвиг пика эмиссии от 450 до 650 нм, что дает
возможность одновременно детектировать КвТ нескольких цветов [156].
Для реализации мультицветной тест-системы «светофор» выбраны КвТ с
пиками эмиссии при 525 (зеленый цвет), 585 (желтый цвет) и 625 нм (красный цвет).
КвТ конъюгировали с моноклональными антителами против трех антибиотиков по
методике, описанной в разделе 3.1. На поверхности КвТ с пиком эмиссии при 525 нм
иммобилизовали антитела против стрептомицина (СТМ); КвТ с пиком эмиссии при
585 нм – антитела против хлорамфеникола (ХФ), КвТ с пиком эмиссии при 625 нм –
антитела против офлоксацина (ОФЛ). Соотношение КвТ : АТ при синтезе для всех
144
конъюгатов составило 1:2, что соответствует требованиям к обеспечению высокой
чувствительности конкурентного анализа [288]. Отметим, что определяемые
антибиотики относятся к разным фармакологическим группам антимикробных
препаратов: амфениколы – ХФ, аминогликозиды – СТМ и фторхинолоны – ОФЛ.
Предлагаемые к использованию в тест-системе взаимодействия между
моноклональными антителами против антибиотиков и конъюгатами (белковый
носитель
–
производное
антибиотика
(гаптен))
были
предварительно
охарактеризованы методом ИФА. Результаты микропланшетного конкурентного
определения целевых антигенов представлены на рис. 64. Аппроксимацию
полученных концентрационных зависимостей с учетом рекомендаций работы [240]
проводили с использованием четырехпараметрического сигмоидного уравнения.
1,4
2
1,2
А 450
1,0
1
0,8
0,6
0,4
3
0,2
0,0
0,01
0,1
1
10
100
1000
10000
100000
С(антибиотик), нг/мл
Рис. 64. Характеристика моноклональных антител против антибиотиков и
конъюгатов гаптен-белок методом конкурентного ИФА: 1 – АТ/ХФ, ХФ-СИТ; 2 –
АТ/ОФЛ, ОФЛ-БСА; 3 – АТ/СТМ, СТМ-ОВА. По оси абсцисс – концентрация в
реакционной смеси конкурента – свободного антибиотика, по оси ординат –
оптическая плотность при 450 нм продукта пероксидазной реакции, отражающая
количество иммунных комплексов, образовавшихся на поверхности микропланшета
при проведении ИФА.
На основании аппроксимаций вычислили аналитические характеристики систем
ИФА, приведенные в таблице 18. В качестве предела обнаружения рассматривали
145
величину IC10; рабочего диапазона количественного определения антигена –
интервал от IC20 до IC80 (как рекомендовано в [242]). Представленные в таблице
характеристики
ИФА
обеспечивают
возможность
контроля
содержания
антибиотиков с помощью данных иммунореагентов в соответствии с нормативами по
допустимому содержанию
антибиотиков
в
молоке.
Согласно
европейским
нормативам [275] предельно допустимая концентрация (ПДК) в молоке для
офлоксацина составляет 30 нг/мл; для стрептомицина – 200 нг/мл. Хлорамфеникол
является запрещенным препаратом, т.е. его содержание определяется порогом
детекции используемых для контроля хроматографических методов, составляя не
более 0,3 нг/мл. По нормативам Таможенного Союза [276] ПДК для офлоксацина не
установлена; для стрептомицина она равняется 200 нг/мл. Хлорамфеникол также
является запрещенным препаратом, но его содержание должно быть меньше 10 нг/мл.
Антитела против ХФ характеризуются высокой аффинностью и позволяют
определять антибиотик в концентрациях, установленных нормативами, – предел
обнаружения ИФА (8,0 нг/мл) близок к российскому ПДК (10 нг/мл). Антитела
против ОФЛ со средней аффинностью позволяют определять антибиотик в
диапазоне, включающем ПДК – предел обнаружения ИФА (37,5 нг/мл) близок к ПДК
(30 нг/мл). Антитела против СТМ, характеризующиеся самой низкой аффинностью в
ряду
исследуемых
препаратов,
также
позволяют
детектировать
аналит
в
концентрациях, близких к ПДК, поскольку ПДК СТМ больше, чем других
антибиотиков. Предел обнаружения ИФА, равный 64,4 нг/мл, меньше ПДК СТМ (200
нг/мл) примерно в 3 раза.
Таблица
18.
Характеристики
ИФА,
реализованного
с
использованием
иммунореагентов для детекции трех антибиотиков
СТМ, нг/мл
ХФ, нг/мл
ОФЛ, нг/мл
IC10
64,4
8,0
37,5
IC20
159
15,7
96,4
IC80
2680
200
2720
Полученные характеристики антител и конъюгатов гаптен-белок (см. таблицу
19) позволяют использовать их для разработки иммунохроматографических тест146
систем, контролируя содержание антибиотиков с высокой чувствительностью и в
широких диапазонах концентраций. Высокая степень специфичности используемых
в работе антител была показана ранее в работах [83; 278]. Кросс-реактивность
антител по отношению к соединениям из других химических классов не превосходит
0,001%. Таким образом, реагентная база для иммунохроматографии потенциально
позволяет проводить
высокочувствительный
и
высокоспецифичный
анализ,
реализовав практически востребованную тест-систему.
Предлагаемая тест-система содержит три аналитические зоны, сформированные
конъюгатами ОФЛ-БСА, ХФ-СИТ и СТМ-ОВА (рис. 65). Выбор СИТ в качестве
белка-носителя для конъюгата с ХФ обоснован в разделе 3.3.1. Детектирующий
конъюгат антител с маркером представляет собой смесь индивидуальных конъюгатов
КвТ со специфическими антителами в соотношении КвТ 625 : КвТ 585 : КвТ 525,
равном 1:10:15.
Рис. 65. Схема расположения аналитических зон на мембране для мультицветной
иммунохроматографической тест-системы определения трех антибиотиков.
Работы
по
разработке
иммунохроматографической
и
тест-системы
оптимизации
включали
выбор
мультицветной
рабочих
и
вспомогательных мембран для тест-полоски, концентраций иммобилизованных и
детектирующих реагентов, состава среды проведения анализа. Критерием выбора
оптимальных условий было достижение минимального предела обнаружения (по
каждому из аналитов) при сохранении достоверного отличия результатов
тестирования положительных и отрицательных проб.
147
Мембранные компоненты. Учитывая ранее полученные результаты разработки
иммунохроматографической тест-системы на ХФ с флуоресцентной детекцией
(раздел 3.3.1), для реализации мультиплексной системы первоначально был
использован выбранный ранее набор мембран: рабочая мембрана – CNPC 12,
мембрана для пробы – R7L, мембрана для конъюгата – стекловолоконная,
впитывающая мембрана - нитроцеллюлозная (все «MDI», Индия). Для получения
количественных результатов мультиплексного анализа вместо портативного
детектора «Рефлеком-УФ» с красным светофильтром использовали обработку с
помощью программы «Total Lab» видеоцифровых изображений, полученных при
облучении
тест-полоски
фотоаппаратом
CanoScan
ультрафиолетовым
LiDE
90
цветом
(«Canon»,
и
Япония)
зарегистрированных
без
использования
светофильтров. При этом для результатов, полученных с использованием мембраны
CNPC 12, обнаружен высокий фоновый сигнал (собственная флуоресценция), в
отсутствие светофильтров не отделяемый от аналитического сигнала и не
позволяющий получать низкие пределы обнаружения в случае использования в
качестве маркеров КвТ 525 и 585 (характеризующихся меньшими квантовыми
выходами). В связи с этим в качестве альтернативной рабочей мембраны была
апробирована нитроцеллюлозная мембрана Millipore 180, характеризующаяся
сопоставимой скоростью движения фронта жидкости ~180 сек / 4 см. На рис. 66
представлено сравнение интенсивности фоновой флуоресценции при работе с
нитроцеллюлозными мембранами Millipore 180 и CNPC 12 без нанесенных
аналитических и контрольных зон.
148
Рис. 66. Фоновый сигнал нитроцеллюлозных мембран (n=3) в мультицветной
иммунохроматографической тест-системе. Детектирующий конъюгат представлял
собой смесь трех конъюгатов КвТ со специфическими антителами к антибиотикам в
соотношении КвТ 625:КвТ 585:КвТ 525, равном 1:10:15. В качестве пробы
использовано молоко (жирность 3,2%), не содержащее антибиотиков.
Как следует из рис. 66, нитроцеллюлозная мембрана
Millipore 180
характеризуется меньшим фоновым сигналом – почти вдвое ниже, чем для CNPC 12.
Невысокая фоновая флуоресценция для мембраны Millipore 180 позволит
реализовать тест-систему с низким пределом обнаружения не только с КвТ 625 в
качестве маркера, но и с КвТ 585 и КвТ 525.
Режим формирования аналитических зон. Концентрации конъюгатов гаптенбелок, иммобилизуемых в аналитических зонах, подбирались таким образом, чтобы
обеспечить минимальный предел обнаружения, сопоставимые интенсивности
флуоресценции в трех зонах и достоверный аналитический сигнал. При выборе
условий концентрации конъюгатов варьировали от 0,25 до 3 мг/мл. На рис. 67 на
примере конъюгата ХФ-СИТ представлены конкурентные кривые, получаемые при
этом варьировании.
149
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
1
250000
200000
3
2
150000
100000
4
50000
5
0
0,1
1
10
С(ХФ), нг/мл
Рис. 67. Зависимости интенсивности флуоресценции в аналитической зоне
иммунохроматографической тест-системы от концентрации ХФ, полученные для
разных концентраций иммобилизованного конъюгата ХФ-СИТ: 1 – 3 мг/мл, 2 – 1 мг/мл,
3 – 0,5 мг/мл, 4 – 0,3 мг/мл, 5 – 0,25 мг/мл. Иммобилизацию проводили из 50 мМ ФБС,
при расходе реагента 1 мкл/см.
При использовании концентраций ХФ-СИТ 0,3 и 0,25 мг/мл (см. кривые 4, 5 на
рис. 67) с ростом содержания антигена в пробе наблюдается монотонное снижение
интенсивности флуоресценции вплоть до ее полного исчезновения – в отличие от
более высоких концентраций конъюгата ХФ-СИТ (см. кривые 1-3 на рис. 67). При
этом в отсутствие ХФ значение интенсивности флуоресценции для концентрации 0,3
мг/мл выше, чем для 0,25 мг/мл, что позволяет выбрать в качестве оптимального
первый вариант.
Исходя из полученных экспериментальных данных, были выбраны следующие
условия нанесения конъюгатов гаптен-белок при формировании аналитических зон
мультицветной тест-системы:
– ОФЛ-БСА - 0,5 мг/мл; в 0,15 M ФБС, pH 7,4, расход при нанесении 1 мкл/см;
– ХФ-СИТ - 0,3 мг/мл; в том же растворе, расход при нанесении 1 мкл/см;
– СТМ-ОВА - 1,0 мг/мл; в том же растворе, расход при нанесении 1 мкл/см.
150
Буферный раствор, используемый для иммобилизации конъюгатов гаптенбелок, выбран на основании предшествующих работ [83; 278].
Конъюгаты КвТ-АТ. Исходя из данных о тест-системе для определения ХФ,
разработка и оптимизация которой описана в разделе 3.3.1, для нанесения смеси
конъюгатов маркер-антитела использовался такой же состав буферного раствора – 50
мМ ББ, рН 8,3 с 2% БСА. Соотношение конъюгатов в смеси определяли на основании
данных о квантовых выходах флуоресценции каждого из компонентов (раздел 3.2.2).
На рис. 68 в качестве примера приведена зависимость предела обнаружения ОФЛ от
концентрации конъюгата КвТ 625 – АТ/ОФЛ. Как видим, снижение концентрации
конъюгата до 4,8 нМ (по КвТ) позволяет достигнуть минимального предела
обнаружения и погрешности анализа, не изменяя интенсивности аналитического
сигнала.
Рис. 68. Влияние концентрации конъюгата КвТ 625-АТ/ОФЛ на предел обнаружения
ОФЛ в иммунохроматографической тест-системе.
Таким образом, оптимальная концентрация конъюгата КвТ 625 – АТ/ОФЛ
составляет 4,8 нМ. Концентрации конъюгатов КвТ 525 – АТ/СТМ и КвТ 585 – АТ/ХФ
подбирали таким образом, чтобы интенсивности флуоресценции всех аналитических
зон были сопоставимы. Использование смеси флуорофоров с разными длинами волн
эмиссии может быть сопряжено с мешающим эффектом, обусловленным тушением
151
одного флуорофора при поглощении испускаемого им излучения другим маркером.
В связи с этим конъюгаты КвТ 525 и КвТ 585 в смеси присутствуют в избытке соотношение КвТ 525:КвТ 585:КвТ 625 составляет 15:10:1.
Результаты
проведенной
иммунохроматографической
оптимизации
тест-системы
суммированы
мультиплексной
в
таблице
19.
Для
экспериментов по дальнейшей характеристике тест-системы использовали тестполоски, изготовленные в соответствии с этими требованиями.
152
Таблица 19. Оптимальная комплектация и
использованием
мультиплексной
условия проведения анализа с
иммунохроматографической
тест-системы
определения антибиотиков.
Параметр
Значение
Рабочая мембрана
Millipore 180
Мембрана для пробы
R7L
Пробоподготовка молока жирностью 3,2%
Разбавление на 20%
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
с 1% Твин-20
Режим нанесения конъюгатов КвТ
Концентрация и расход при нанесении конъюгата КвТ 625- 4,8 нМ, 20 мкл/см
АТ/ОФЛ
Состав среды для нанесения конъюгата КвТ 625-АТ/ОФЛ
ББ (рН 8,3, 50 мМ) с
2% БСА
Концентрация и расход при нанесении конъюгата КвТ 585- 48 нМ, 20 мкл/см
АТ/ХФ
Состав среды для нанесения конъюгата КвТ 585-АТ/ХФ
ББ (рН 8,3, 50 мМ) с
2% БСА
Концентрация и расход при нанесении конъюгата КвТ 525- 72 нМ, 20 мкл/см
АТ/СТМ
Состав среды для нанесения конъюгата КвТ 525-АТ/СТМ
ББ (рН 8,3, 50 мМ) с
2% БСА
Режимы формирования аналитических зон
Концентрация и расход при нанесении конъюгата ОФЛ- 0,5 мг/мл, 1 мкл/см
БСА
Состав среды для нанесения конъюгата ОФЛ-БСА
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Концентрация и расход при нанесении конъюгата ХФ-СИТ 0,3 мг/мл, 1 мкл/см
Состав среды для нанесения конъюгата ХФ-СИТ
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Концентрация и расход при нанесении конъюгата СТМ- 1,0 мг/мл, 1 мкл/см
ОВА
Состав среды для нанесения конъюгата СТМ-ОВА
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Режим формирования контрольной зоны
Концентрация и расход при нанесении антивидовых козьих 1,0 мг/мл, 1 мкл/см
антимышиных антител
Состав среды для нанесения антивидовых антител
153
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Характеристика тест-системы. С учетом выбранных условий изготовления тестполосок и реализации анализа проведена экспериментальная характеристика
разработанной мультиплексной иммунохроматографической тест-системы на основе
КвТ. Для качественной визуальной оценки результатов анализа использовали
облучение тест-полосок источником ультрафиолетового света (модель PRO-4) с
длиной волны около 340 нм (рис. 69).
Рис. 69. Внешний вид мультицветных иммунохроматографических тест-полосок при
отсутствии целевых аналитов (А) и в присутствии каждого из антибиотиков: ОФЛ
(200 нг/мл) (Б); ХФ (10 нг/мл) (В) и СТМ (500 нг/мл) (Г).
Результаты характеристики тест-системы с использованием проб, содержащих
каждый из аналитов, представлены на рис. 69. Контрастный цвет аналитических зон
позволяет быстро и просто оценить наличие каждого из аналитов. При отсутствии в
пробе аналитов в аналитической зоне тест-полоски наблюдаются три линии красного,
желтого и зеленого цветов (см. рис. 69, А). При наличии в пробе ОФЛ в концентрации
200 нг/мл красная линия исчезает (см. рис. 69, Б), при концентрации ХФ, равной 10
нг/мл, исчезает желтая линия (см. рис. 69, В), а при концентрации СТМ, равной 500
нг/мл, исчезает зеленая линия (см. рис. 69, Г). Использованные в эксперименте
концентрации аналитов, при которых происходит исчезновение флуоресценции,
были выбраны на основании результатов проведенной оптимизации тест-системы.
Как видим, тест-система позволяет проводить качественную оценку присутствия
антибиотиков в пробе.
154
Кроме того, регистрация интенсивности флуоресценции в аналитических зонах
дает возможность количественной характеристики содержания аналитов. Оценка
интенсивности флуоресценции в аналитических зонах осуществляется путем
программной обработки видеоцифровых изображений тест-полосок, полученных с
помощью цифрового фотоаппарата при возбуждении флуоресценции УФ-светом с
длиной волны около 340 нм.
Градуировочные
кривые
зависимости
интенсивности
флуоресценции
в
аналитических зонах тест-полоски от концентрации каждого из антибиотиков
представлены на рис. 70. В таблице 20 приведены вычисленные по градуировочным
кривым аналитические характеристики мультицветной иммунохроматографической
тест-системы.
Таблица
20.
Аналитические
характеристики
мультицветной
иммунохроматографической тест-системы.
Параметры тест-системы
Аналит
Офлоксацин
Хлорамфеникол
Стрептомицин
Маркер
КвТ 625
КвТ 585
КвТ 525
Предел обнаружения, нг/мл
0,3
0,1
0,2
Рабочий диапазон, нг/мл
1,5-200
0,14-10,0
0,3-500
Разработанная
мультиплексная
тест-система
характеризуется
широким
диапазоном определяемых концентраций – 70–кратного для ХФ до 1700–кратного
для СТМ. Относительные стандартные отклонения в рабочих диапазонах
калибровочных кривых составили для ОФЛ – 0,5-7,6%, для ХФ – 0,9-9,7% и для СТМ
–
0,1-6,0%
(n=5),
т.е.
результаты
воспроизводимостью.
155
анализа
характеризуются
высокой
А
Б
В
Рис. 70. Градуировочные кривые зависимости интенсивности флуоресценции в
аналитических зонах мультицветной иммунохроматографической тест-системы от
концентраций ХФ (А), СТМ (Б) и ОФЛ (В), полученные с помощью программы «Total
Lab».
156
Апробация
тест-системы.
Разработанная
мультицветная
иммунохроматографическая тест-система была апробирована для определения
антибиотиков
в
пробах
молока
(жирность
3,2%).
Тестируемые
пробы
контаминировали антибиотиками в разных концентрациях и характеризовали
полноту выявления целевых соединений с помощью тест-системы (эксперименты
«введено-найдено»). Пробы молока перед анализом разбавляли в 2 раза ФБС с 1%
Твин-20 с целью минимизации влияния матрикса. Результаты экспериментов
представлены в таблице 21.
Таблица 21. Характеристика полноты выявления антибиотиков, добавленных к
пробам молока, с использованием мультицветной иммунохроматографической тестсистемы
Антибиотик
Введено, нг/мл
Офлоксацин
Хлорамфеникол
Стрептомицин
Найдено (n=5),
Полнота выявления
нг/мл
R, %
3,0
3,02±0,11
100,7
15,0
13,7±1,5
92,0
40,0
38,3±5,0
95,7
0,2
0,2±0,02
100,0
0,5
0,495±0,04
99,0
3,0
2,93±0,10
98,0
0,5
0,49±0,03
98,0
5,0
4,91±0,02
98,2
30,0
29,4±1,0
98,0
Как видим, тест-система характеризуется высокой степенью полноты выявления
– от 92 до 101%, что свидетельствует о возможности получения достоверных данных
о контаминации при тестировании проб молока.
Время
достижения
аналитических
зонах
максимальной
сопоставимо
интенсивности
с
данными,
флуоресценции
полученными
в
для
монопараметрической системы определения ХФ (см. раздел 3.3.1). Показано, что
значения интенсивности флуоресценции выходят на плато через 7 мин после
контакта тест-полоски с пробой. Методика одновременного определения трех
157
антибиотиков в пробах молока с помощью разработанной мультицветной
иммунохроматографической тест-системы с учетом установленной кинетики
взаимодействий обеспечивает получение результатов тестирования за 10 мин.
Результаты,
полученные
в
ходе
разработки
мультицветной
иммунохроматографической тест-системы, могут быть суммированы в виде
следующих положений:
Тест-система позволяет легко качественно идентифицировать определяемое
соединение по цвету аналитической зоны. Тест-система характеризуется низкими
пределами обнаружения и широкими рабочими диапазонами. ПрО для ОФЛ, ХФ и
СТМ составляют 0,3; 0,12 и 0,2 нг/мл соответственно, что ниже ПДК в 100 раз для
ОФЛ, в 2,5 (ЕС) – 80 (Таможенный Союз) раз – для ХФ и в 1000 раз – для СТМ.
Стандартные отклонения определения с использованием приборной детекции не
превышают
9%.
Показана
возможность
применения
тест-системы
для
характеристики контаминации проб молока с сохранением пределов обнаружения,
при этом полнота выявления составила 92-101%.
3.4.2 Мультиплексная иммунохроматографическая тест-система на основе
двумерного массива зон связывания
Как отмечалось в разделе 3.4.1, традиционный формат иммунохроматографии,
применяемый
для
мультиплексного
анализа,
позволяет
одновременно
контролировать лишь крайне ограниченное число соединений. Увеличение числа
последовательно
расположенных
линий,
предназначенных
для
связывания
иммунореагентов разной специфичностью, затрудняет их идентификацию и/или
приводит к наложению соседних зон. Поэтому в коммерчески доступных тестполосках количество контролируемых аналитов, как правило, не превосходит
четырех.
В качестве способа существенно увеличить число параметров, одновременно
контролируемых при проведении иммунохроматографии, нами предлагается переход
от одномерной к двумерной геометрии расположения аналитических зон: зоны
связывания разной специфичности образуют упорядоченный массив точек,
расположенных в несколько рядов как в продольном, так и в поперечном
направлении тест-полоски.
158
Нами впервые разработана иммунохроматографическая мультиточечная тестсистема
для
одностадийного
определения
нескольких
низкомолекулярных
соединений. Состав тест-полоски и расположение на ней иммунореагентов
схематично изображены на рис. 71. Аналитическая зона тест-полоски представляет
собой несколько десятков регулярно расположенных микроточек с различными
иммобилизованными
иммунореагентами,
обеспечивающими
детекцию
определенных соединений. Выявление (визуализация) иммунных комплексов
осуществляется с помощью конъюгатов антител с нанодисперсным маркером, в
качестве которого в данной серии экспериментов было использовано коллоидное
золото.
Рис. 71. Иммунохроматографическая тест-система с двумерным массивом зон
связывания для одновременного определения нескольких соединений: 1 –
пластиковая подложка; 2 – мембрана для пробы; 3 – рабочая нитроцеллюлозная
мембрана; 4 – мембрана для конъюгата; 5 – впитывающая мембрана; 6 –
аналитические зоны; 7 – контрольная зона.
Задача мультиплексного анализа решалась на примере детекции четырех
психоактивных
соединений:
бензоилэкгонина
(основного
морфина,
продукта
амфетамина,
трансформации
метамфетамина
кокаина
в
и
тканях).
Аналитическая зона тест-полоски представляет собой массив точек, образующих 8
вертикальных рядов и 3 или 4 горизонтальных ряда (рис. 72). Каждому аналиту
соответствует определенный горизонтальный ряд точек, для формирования которого
159
используется или одна концентрация конъюгата гаптен-белок (8 точек), или две
концентрации, отличающиеся в 4 раза (по 4 точки для каждой концентрации).
4
3
2
1
Рис. 72. Расположение аналитических зон в разработанной мультиплексной тестсистеме (результаты тестирования отрицательной пробы). Ряды 1-4 образованы
точками с иммобилизованными конъюгатами морфина, метамфетамина, амфетамина
и бензоилэкгонина, соответственно.
Для получения количественных результатов анализа с использованием
мультиплексной иммунохроматографической тест-системы применяли сканер в
сочетании с программным обеспечением «Видеодот» («Синтэко-Комплекс», Россия),
регистрирующим интенсивность окрашивания в каждой зоне связывания тестполоски. Задаваемые оператором параметры обработки изображения с помощью
программы «Видеодот» включают количество и расположение зон, геометрические
размеры выделяемых областей. Пример количественной обработки видеоцифрового
изображения
мультиплексной
иммунохроматографической
тест-полоски
представлен на рис. 73. В качестве фонового сигнала рассматривалась интенсивность
окрашивания участка тест-полоски, расположенного ниже зон связывания.
160
А
Б
Рис. 73. Обработка изображения мультиплексной иммунохроматографической тестполоски с помощью программы «Видеодот»: А – параметры, варьируемые при
локализации зон связывания; Б – выделение границ зон связывания.
При выборе оптимального протокола изготовления мультиплексной тест-системы
и проведения анализа руководствовались следующими требованиями к формируемым
и
программно
идентифицируемым
зонам
связывания,
обеспечивающими
максимальную достоверность и точность получаемых результатов анализа:
– одинаковые размеры всех выделяемых областей, охватывающих окрашенные
зоны;
– отсутствие захвата соседних зон при выделении индивидуальной окрашенной
зоны.
Проведенные исследования по разработке и оптимизации тест-системы
включали выбор концентраций иммобилизуемых конъюгатов гаптен-белок и
режимов их нанесения, выбор концентраций и режимов нанесения для конъюгатов
коллоидного золота с антителами, а также выбор состава среды для проведения
анализа. Выбор оптимальных величин основывался на применении следующих
критериев: близкие значения интенсивности окрашивания в отсутствие аналитов,
достижение минимальных пределов обнаружения аналитов, достоверные отличия
результатов анализа для положительных и отрицательных проб (в том числе при
визуальной оценке).
Режим формирования аналитических зон. Были установлены оптимальные
концентрации конъюгатов, иммобилизуемых в аналитических зонах тест-полоски, и
161
составы сред для их нанесения. Концентрации конъюгатов варьировали от 0,06 до 5
мг/мл. В качестве сред для нанесения рассматривали 0,15 М ФБС (рН 7,4) и 0,2 М
карбонатный буферный раствор (рН 9,0). Выбор оптимальной концентрации
реагента, иммобилизованного в аналитической зоне тест-полоски, показан на рис. 74
Интенсивность окрашивания, отн. ед.
на примере конъюгата метамфетамин-БСА.
50
4
40
3
30
2
20
10
1
0
0,1
100
10
1
1000
С(Метамфетамин), нг/мл
Рис. 74. Зависимости интенсивности окрашивания аналитических зон при проведении
иммунохроматографии от концентрации метамфетамина, полученные для разных
концентраций иммобилизуемого конъюгата метамфетамин-БСА: 1 – 0,06 мг/мл, 2 –
0,25 мг/мл, 3 – 1,25 мг/мл, 4 – 5 мг/мл. Иммобилизацию конъюгата проводили из 0,15
М ФБС, рН 7,4.
На основании полученных данных выбраны оптимальные концентрации
конъюгата метамфетамин-БСА для иммобилизации в аналитической зоне, равные 5
и 1,25 мг/мл (рис. 74, кривые 4 и 3). Среда для иммобилизации - 0,15 М ФБС, рН 7,4;
расход реагента – 20 нл на одну микро-зону. Выбранные концентрации позволяют
формировать зоны связывания, интенсивность окрашивания которых при проведении
иммунохроматографии сопоставима с зонами других гаптенов.
Для
трех
использованием
остальных
психоактивных
разрабатываемой
соединений,
тест-системы,
в
контролируемых
результате
с
проведенных
аналогичных экспериментов выбраны следующие концентрации конъюгатов гаптенбелок и условия их иммобилизации:
162
- бензоилэкгонин-БСА - 0,06 и 0,25 мг/мл из 0,2 М карбонатного буферного раствора,
рН 9,0, расход при нанесении 20 нл;
- морфин-БСА - 0,125 и 0,5 мг/мл из того же буферного раствора, расход при
нанесении 20 нл;
- амфетамин-БСА– 1,25 и 5 мг/мл из 0,15 М ФБС, рН 7,4, расход при нанесении 20 нл.
Время проведения анализа. Получены зависимости интенсивности окрашивания
в
аналитических
зонах
иммунохроматографической
тест-полоски
с
иммобилизованными в виде массива точек конъюгатами морфин-БСА (первый ряд)
и бензоилэкгонин-БСА (последний ряд) от времени инкубации тест-полоски с
Интенсивность окрашивания, отн. ед.
пробой, представленные на рис. 75.
100
1
80
60
2
40
20
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Время, мин.
Рис. 75. Зависимости интенсивностей окрашивания в аналитических зонах
мультиплексной иммунохроматографической тест-системы с иммобилизованными
конъюгатами бензоилэкгонин-БСА (0,25 мг/мл) (1) и морфин-БСА (0,5 мг/мл) (2) от
продолжительности инкубации тест-полоски с пробой.
Интенсивность окрашивания выходит на максимальный стационарный уровень
через 10 минут после контакта тест-полоски с пробой. Появление ступени в
диапазоне 150-300 с может быть вызвано перемещением фронта пробы с конъюгатом
через аналитические зоны и последующим вымыванием несвязавшегося маркера.
Исходя из полученных результатов, для разрабатываемого мультиплексного
анализа предложена продолжительность тестирования, равная 10 мин.
163
Результаты
проведенной
иммунохроматографической
оптимизации
тест-системы
суммированы
мультиплексной
в
таблице
22.
Для
экспериментов по дальнейшей характеристике тест-системы использовали тестполоски, изготовленные в соответствии с этими требованиями.
Таблица 22. Оптимальная комплектация и
использованием
мультиплексной
условия проведения анализа с
иммунохроматографической
тест-системы
определения антибиотиков.
Параметр
Значение
Рабочая мембрана
CNPF 10
Мембрана для пробы
R7L
Пробоподготовка мочи
Добавление Твин-20 до
конечной концентрации
1%
Режим нанесения конъюгатов
Оптическая плотность и расход при нанесении 3,0; 32 мкл/см
конъюгата КЗ-АТ/бензоилэкгонина
Состав
среды
для
нанесения
конъюгата
КЗ- Трис-буфер (50 мМ, рН 7,5)
АТ/бензоилэкгонина
Оптическая плотность и расход при нанесении 3,0; 32 мкл/см
конъюгата КЗ-АТ/амфетамин
Состав
среды
для
нанесения
конъюгата
КЗ- Трис-буфер (50 мМ, рН 7,5)
АТ/амфетамин
Оптическая плотность и расход при нанесении 3,0; 32 мкл/см
конъюгата КЗ-АТ/метамфетамин
Состав
среды
для
нанесения
конъюгата
КЗ- Трис-буфер (50 мМ, рН 7,5)
АТ/метамфетамин
Оптическая плотность и расход при нанесении 3,0; 32 мкл/см
конъюгата КЗ-АТ/морфин
Состав среды для нанесения конъюгата КЗ-АТ/морфин Трис-буфер (50 мМ, рН 7,5)
Режимы формирования аналитических зон
164
Концентрация и расход при нанесении конъюгата 0,06 и 0,25 мг/мл, 20 нл
бензоилэкгонин-БСА
Состав
среды
для
нанесения
конъюгата 0,2
бензоилэкгонин-БСА
М
карбонатный
буферный раствор, рН 9,0;
ФБС
Концентрация и расход при нанесении конъюгата 0,125 и 0,5 мг/мл, 20 нл
морфин-БСА
Состав среды для нанесения конъюгата морфин-БСА
0,2
М
карбонатный
буферный раствор, рН 9,0;
ФБС
Концентрация и расход при нанесении конъюгата 1,25 и 5,0 мг/мл, 20 нл
амфетамин-БСА
Состав среды для нанесения конъюгата амфетамин- ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
БСА
Концентрация и расход при нанесении конъюгата 1,25 и 5,0 мг/мл, 20 нл
метамфетамин-БСА
Состав среды для нанесения конъюгата метамфетамин- ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
БСА
Режим формирования контрольной зоны
Концентрация и расход при нанесении антивидовых 0,25 мг/мл, 1 мкл/см
козьих антимышиных антител
Состав среды для нанесения антивидовых антител
ФБС (рН 7,4, 50 мМ)
Характеристика тест-системы. В соответствии с выбранными оптимальными
условиями
изготовлены
экспериментальные
образцы
мультиплексной
иммунохроматографической тест-системы для контроля психоактивных веществ.
Проведена оценка воспроизводимости интенсивностей окрашивания зон связывания,
сформированных
растворами
конъюгата
одной
концентрации.
Стандартное
отклонение для четырех повторов не превышает 10%. Однако для получения
достоверных данных и учета вариабельности результатов между разными тест-
165
полосками усреднение результатов проводили для данных, полученных с
использованием 10 тест-полосок с 4 повторами.
Изучены зависимости интенсивностей окрашивания аналитических зон тестполоски после проведения иммунохроматографии от концентраций детектируемых
психоактивных соединений. С ростом концентрации аналита в пробе интенсивность
окрашивания точек соответствующего ряда постепенно снижается до полного
исчезновения: см. в качестве примера данные для иммунодетекции морфина (нижний
ряд точек в тест-полосках на рис. 76).
1
2
3
А
Б
В
Г
Рис. 76. Внешний вид мультиплексных иммунохроматографических тест-систем при
тестировании проб с концентрациями морфина, равными 0, 12,5, 25 и 200 нг/мл для
тест-полосок А-Г, соответственно (1 – бензоилэкгонин; 2 – амфетамин; 3 - морфин).
Проведена оценка влияния каждого из аналитов на интенсивности окрашивания
зон, соответствующих другим соединениям. Показано, что при введении каждого из
психоактивных соединений интенсивность окрашивания точек с конъюгатами других
гаптенов достоверно не меняется. Так, например, средние значения интенсивности
окрашивания точек с конъюгатом амфетамин-БСА при отсутствии морфина и при его
концентрации 50 нг/мл составляют 60±2 и 62±2 отн. ед.; для конъюгата
бензоилэкгонин-БСА соответствующие величины равны 65±2 и 68±3 отн. ед. (n тестполосок = 10).
166
Геометрия расположения аналитических зон тест-полоски предусматривает
нанесение растворов гаптен-белок из двух концентраций, что позволяет получать две
концентрационные зависимости для каждого из определяемых соединений и таким
образом расширить рабочий диапазон определения, установив два порога для
контроля исчезновения окрашивания. Используя видеоцифровую
обработку
изображений, для каждой концентрации иммобилизованного конъюгата гаптенбелок установили градуировочные зависимости интенсивности окрашивания
аналитических зон от концентрации аналитов в пробе, на основании которых
определили аналитические характеристики тест-системы. На рис. 77 представлены
Интенсивность окрашивания, отн. ед.
градуировочные кривые для бóльших концентраций адсорбированных конъюгатов.
1
70
60
2
50
40
30
3
4
20
10
0
0,1
1
10
100
1000
С(психоактивное соединение), нг/мл
Рис. 77. Градуировочные зависимости определения психоактивных соединений с
помощью мультиплексной иммунохроматографической тест-системы: 1 – морфин; 2
– бензоилэкгонин; 3 – метамфетамин; 4 – амфетамин (n тест-полосок = 10).
На основании полученных градуировочных зависимостей
установлены
аналитические характеристики тест-системы применительно к детектированию
каждого из аналитов, суммированные в таблице 23.
167
Таблица
23.
Аналитические
характеристики
мультиплексной
иммунохроматографической тест-системы для определения психоактивных веществ.
Соединение
Концентрации
Предел
Рабочий
Объединенный
конъюгата
обнаружения,
диапазон
рабочий
гаптен-белок
нг/мл
определяемых
диапазон
при
концентраций,
определяемых
иммобилизации,
нг/мл
концентраций,
мг/мл
Морфин
Бензоилэкгонин
Амфетамин
Метамфетамин
нг/мл
0,125
3
3,5-13
0,5
3,5
5-18
0,06
6,5
10-136
0,25
7,5
13,5-430
1,25
1,5
2,5-21,5
5
2
3-18
1,25
27,5
44-1000
5
60,5
83-1000
3,5-18
10-430
2,5-18
44-1000
Рассмотрим преимущества, достигаемые за счет иммобилизации конъюгатов
гаптен-белок из разных концентраций. Для метамфетамина получены пороговые
уровни, отличающиеся в 2 раза (27,5 и 60,5 нг/мл), что позволяет увеличить диапазон
определяемых
концентраций.
Для
бензоилэкгонина
двум
концентрациям
иммобилизованного конъюгата соответствуют рабочие диапазоны 5,5–87 нг/мл и 20–
550 нг/мл, при объединении которых достигается 4-кратное расширение рабочего
диапазона.
Результаты
повторных
измерений
характеризуются
высокой
степенью
воспроизводимости. Для морфина в рабочем диапазоне градуировочной кривой
среднеквадратичное отклонение определяемых концентраций составляет 0,3–1,7%,
амфетамина – 0,4–1,5%, бензоилэкгонина – 0,3–2,0%, метамфетамина – 0,4–1,7 (n тестполосок = 10).
Апробация тест-систем. Доминирующим объектом наркоконтроля является моча
[289], в связи с чем тест-система была охарактеризована при работе с пробами мочи.
168
На рис. 78 представлен внешний вид аналитических зон тест-полосок при обнаружении
психоактивных соединений в пробах мочи. Пределы обнаружения и рабочие
диапазоны не изменяются при переходе к тестированию мочи по сравнению с
измерениями для стандартных растворов.
1
2
3
4
А
Б
В
Г
Рис. 78. Внешний вид аналитических зон иммунохроматографической тест-полоски
при обнаружении психоактивных соединений в моче: А – проба содержит амфетамин
(30 нг/мл), метамфетамин (10 мкг/мл) и морфин (100 нг/мл); Б – проба содержит
амфетамин и метамфетамин; В – проба содержит амфетамин, метамфетамин и морфин;
Г – проба содержит амфетамин, бензоилэкгонин (3 мкг/мл), метамфетамин и морфин.
В ряду с иммобилизованным конъюгатом морфин–БСА (ряд 4) интенсивность
окрашивания снижается на 10% по сравнению с буферным раствором в качестве
пробы, что не вызывает изменений аналитических характеристик. На связывание
маркера с остальными конъюгатами матрикс пробы достоверно не влияет. С
использованием проб мочи, не содержащих изначально психоактивных соединений,
проведена серия экспериментов «введено-найдено». Представленные в таблице 24
результаты свидетельствуют о высокой полноте выявления целевых антигенов – от 95
до 114%.
Отметим, что определяемые с помощью данных тест-полосок концентрации
психоактивных соединений существенно ниже, чем контролируемые уровни их
содержания в моче, установленные в наркодиагностике и равные 300 нг/мл для
морфина и бензоилэкгонина, 500 нг/мл для метамфетамина и 1000 нг/мл для
амфетамина [191; 290]. Низкий предел обнаружения тест-системы позволяет с ее
помощью выявлять содержание психоактивных соединений в течение большого
времени после приема и характеризовать общий статус пациента и эффективность
лечения.
169
Таблица 24. Выявление психоактивных соединений в моче с использованием
разработанной мультиплексной иммунохроматографической тест-системы (n тестполосок = 10)
Концентрация конъюгата
Введенная
Найденная
гаптен-БСА при
концентрация
концентрация
иммобилизации, мг/мл
аналита, нг/мл аналита, нг/мл
Степень
выявления
аналита (R), %
Бензоилэкгонин
0,03
0,25
40
38.2±0,3
95
200
> 87
-
40
43±1
107
200
195±5
97
5
5,7±0,1
114
10
10.9±0.4
109
5
5.2±0,2
104
10
10.2±0.7
102
5
5,2±0,4
104
10
9,9±0,6
99
5
5,1±0,5
102
10
10,6±0,4
106
500
499,3±7,0
100
1000
1065±109
107
500
501±17
100
1000
1051±65
105
Морфин
0,125
0,5
Амфетамин
1,25
5
Метамфетамин
1,25
5
170
Для оценки возможности использования мультиплексных тест-систем как средств
диагностики
большое
значение
существующими
тестами
использованием
тех
для
же
иммунохроматографические
имеет
сравнение
определения
разработанных
индивидуальных
иммунореагентов
тест-полоски
для
систем
с
соединений.
С
были
индивидуального
изготовлены
определения
психоактивных веществ с традиционным полосочным нанесением аналитической зоны
(моно-тесты).
Для
этих
иммунохроматографических
тест-систем
получены
градуировочные кривые (рис. 79) и определены аналитические характеристики (табл.
Интенсивность окрашивания, отн. ед.
25).
С (психоактивное соединение), нг/мл
Рис. 79. Градуировочные зависимости интенсивности окрашивания аналитических зон
иммунохроматографических моно-тестов
от концентраций
психоактивных
соединений: 1 – амфетамин; 2 – метамфетамин; 3 – морфин и 4 – бензоилэкгонин.
171
Таблица 25. Аналитические характеристики иммунохроматографических моно-тестов
для определения психоактивных веществ.
Психоактивные
соединения
Предел
обнаружения, нг/мл
Рабочий диапазон определяемых
концентраций, нг/мл
Морфин
1,0
1,5-5,0
Бензоилэкгонин
2,0
4-48,0
Амфетамин
4,5
6,5-19,0
Метамфетамин
6,0
12,0-360
Сравнение аналитических характеристик двух видов тест-систем проводили,
используя таблицу 23 и таблицу 25. В случае амфетамина рабочие диапазоны
мультиплексной системы и моно-теста почти совпадают (2,5-18 нг/мл и 6,5-19 нг/мл,
соответственно). В других случаях (морфин, бензоилэкгонин, метамфетамин) рабочие
диапазоны мультиплексной иммунохроматографической тест-системы шире в 3-14 раз.
Пределы обнаружения для двух форматов анализа сопоставимы, а в случае
амфетамина мультиплексные тест-системы характеризуются более низким пределом
детекции – 1,5 нг/мл по сравнению с 4,5 нг/мл (см. табл. 23 и 25).
Предложенный новый формат иммуноанализа, который основан на расположении
в аналитической зоне тест-полоски двумерного упорядоченного массива точек – зон
связывания,
позволяет
проводить
одновременное
выявление
и
определение
содержания в пробе большого количества соединений. Основным преимуществом
данного подхода является объединение экспрессности (10 минут), характерной для
иммунохроматографических
систем,
с
мультиплексностью,
свойственной
иммуночипам. Как следует из представленных данных экспериментальной реализации
этого подхода, разработанная методика определения психоактивных соединений
характеризуется низкими пределами детекции и высокой воспроизводимостью.
Предложенный подход может применяться при определении различных
биологически активных соединений (как в конкурентном, так и в «сэндвич» формате),
172
а также антител к этим соединениям. Количество точек в аналитической зоне без
изменения
технологии
нанесения
Иммунохроматографические
может
мультиплексные
быть
увеличено
системы
могут
до
быть
100-150.
крайне
эффективны как средство экспрессного мультиплексного анализа при диагностике
инфекционных и аллергических заболеваний, выявлении онко- и кардиомаркеров, а
также при решении других клинико-диагностических и биоаналитических задач.
173
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе проведенных исследований в соответствии с поставленной целью
диссертационной работы проведена характеристика размерных, оптических и
антигенсвязывающих свойств комплексов флуоресцентных наночастиц с антителами
против антибиотика хлорамфеникола и иммуноглобулина Е человека. Показана
возможность применения и выявлены преимущества флуоресцентных наночастиц –
квантовых точек – как маркеров в иммунохроматографических тест-системах.
Реализованы
новые
форматы
мультиплексного
иммунохроматографического
определения антибиотиков и психоактивных соединений. Полученные результаты
носят универсальный характер и могут быть использованы для определения других
антигенов.
Научная новизна работы заключается в следующем:
Изучена степень сохранения функциональных свойств компонентами конъюгатов
квантовые
точки
–
антитела.
интенсивности
флуоресценции.
взаимодействия
свободных
и
Показано
Проведена
сохранение
конъюгатами
сравнительная
конъюгированных
с
60-97%
характеристика
квантовыми
точками
моноклональных антител к антибиотику хлорамфениколу. Показан рост кинетических
констант ассоциации и равновесных констант связывания антител в составе
конъюгатов, обусловленный иммунохимической поливалентностью конъюгатов.
Охарактеризована взаимосвязь между пределами детекции нанодисперсных
маркеров – коллоидного золота и квантовых точек – в гомогенных и гетерогенных
системах и минимальными концентрациями аналитов, определяемыми с помощью
иммунохимических тест-систем на основе этих маркеров.
Выполненная работа обладает существенной практической значимостью,
заключающейся в том, что в ходе ее проведения:
- показано, что использование флуоресцентного маркера, квантовых точек,
обеспечивает снижение предела детекции иммуноанализа в 24 раза по сравнению с
колориметрическим маркером, коллоидным золотом;
- разработаны и апробированы иммунохроматографические тест-системы на
основе квантовых точек для определения содержания антибиотика хлорамфеникола в
молоке и иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека; показана возможность
174
количественного определения аналитов при регистрации флуоресценции с помощью
портативного детектора; проведена метрологическая характеристика предложенных
тест-систем;
- предложен формат иммунохроматографического мультиплексного анализа с
использованием в качестве маркеров флуоресцентных наночастиц с разными
спектрами эмиссии; на основании данного подхода реализована и охарактеризована
тест-система для одновременного контроля содержания антибиотиков разных классов;
- предложен формат иммунохроматографического мультиплексного анализа,
основанный на формировании на мембране упорядоченного двумерного массива зон
связывания с реагентами разной специфичности; реализована и апробирована тестсистема для одновременного контроля содержания психоактивных веществ разных
классов.
Выносимые на защиту положения диссертационной работы:
1. Установлена высокая степень сохранения интенсивности флуоресценции
квантовыми точками (ядро CdSe / оболочка ZnS) разного размера в составе конъюгатов
с антителами.
2. На модели взаимодействия с хлорамфениколом количественно установлено
сохранение
антигенсвязывающих
свойств
антителами,
ковалентно
иммобилизованными на поверхности квантовых точек.
3. Показано преимущество квантовых точек в сравнении с наночастицами
коллоидного золота при использовании их в качестве маркеров антител в
иммунохроматографии.
4. Разработана
иммунохроматографическая
тест-система,
основанная
на
применении квантовых точек, для определения уровня иммуноглобулина Е в
сыворотке крови человека.
5. Предложено использование квантовых точек с разными спектрами эмиссии для
одновременного иммунохроматографического определения трех соединений по
исчезновению красной, желтой или зеленой тестовой линии (тест-система «светофор»).
6. Предложен способ проведения мультиплексного иммунохроматографического
анализа, основанный на формировании аналитической зоны в виде двумерного массива
точек с реагентами разной специфичности.
175
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Berlina A.N., Taranova N.A., Zherdev A.V., Vengerov Yu.Yu., Dzantiev B.B.
Quantum dot-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk. –
Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2013. v. 405, N 14, p. 4997-5000.
2. Taranova N.A., Byzova N.A., Zaiko V.V., Starovoitova T.A., Vengerov Yu.Yu.,
Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Integration of lateral flow and microarray technologies for
multiplex immunoassay: application to the determination of drugs of abuse. – Microchimica
Acta, 2013. v. 180, N 11-12, p. 1165-1172
3. Berlina A.N., Taranova N.A., Zherdev A.V., Sankov M.N., Andreev I.V., Martynov
A.I., Dzantiev B.B. Quantum-dot-based immunochromatographic assay for total IgE in
human serum. – PLoS ONE. 2013, v. 8, N 10, e77485. doi:10.1371/journal.pone.0077485.
4. Берлина А.Н., Венгеров Ю.Ю., Голубев С.С., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В.,
Киселева Ю.В., Короленко Ю.А., Кудеяров Ю.А., Малюченко В.М., Таранова Н.А.
Метод калибровочных кривых для иммунохроматографических экспресс-тестов. Часть
2. Иммунохроматографические экспресс тесты с квантовыми точками. – Метрология.
2012, № 10, с. 31-41.
5. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Квантовые точки как
маркер
в
иммунохроматографических
диагностических
тест-системах.
–
Нанотехнологии и охрана здоровья. 2012, т. 4, № 4, с. 44-47.
Материалы конференций:
1. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Получение
конъюгатов
квантовые
точки
–
антитела
и
их
использование
в
иммунохроматографическом анализе. – Материалы 2-ой международной школы
«Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина»,
пансионат "Заря", Московская область, 19-24 сентября, 2011 г., с. 102.
2. Berlina N.A., Taranova N.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Preparation of the
antibodies labeled by quantum dots and their use in immunochromatography assay. – IV
международный форум RUSNANOTECH, Москва, 26-28 октября, 2011 г.
176
3. Berlina N.A., Taranova N.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development of quantum
dots-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk. – V
International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA-2011), Prague,
Czech Republic, November 1-4, 2011. Book of abstracts, p. 397.
4. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка
иммунохроматографических тест-систем с флуоресцентной детекцией на основе
квантовых точек. – Сборник тезисов конкурса молодых ученых в рамках научной
конференции по биоорганической химии и биотехнологии «Десятые чтения памяти
академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Том 2: Конкурс молодых ученых.
Москва-Пущино, 14-17 ноября 2011 г., с. 68.
5. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка
иммунохроматографических тест-систем для экспресс-диагностики в мультизонном
формате с использованием квантовых точек в качестве маркеров. – Материалы VII
Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы
развития» Москва, 20–22 марта 2012 г., с. 263-264.
6. Берлина А.Н., Таранова Н.А., Жердев А.В., Санков М.Н., Андреев И.В.,
Мартынов А.И. Дзантиев Б.Б. Разработка иммуно-хроматографических тест-систем на
основе квантовых точек для определения общего IgE в сыворотке крови человека. –
Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и
перспективы развития» Москва, 19–22 марта 2013 г., с. 382-383.
7. Таранова Н.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Тест-полоска – светофор:
Разработка иммунохроматографических тест-систем с использованием квантовых
точек для одновременного определения нескольких антибиотиков. – Материалы
Второго съезда аналитиков России, Москва, 23-27 сентября, 2013 г., с. 478.
8. Дзантиев Б.Б., Таранова Н.А., Бызова Н.А., Жердев А.В., Венгеров Ю.Ю.
Многоточечный формат иммунохроматографии: Тест-системы для экспрессного
одновременного определения разных психоактивных соединений. – Сборник тезисов I
Международной
научно-практической
конференции
«Современная
химико-
токсикологическая экспертиза». 27-28 ноября 2013 г., Москва, с. 70-71.
9. Zvereva E., Byzova N., Taranova N., Berlina A,., Zherdev A., Dzantiev B.
Immunochromatographic tests for quantitative and multiparametric control of veterinary
177
drugs in foodstuffs. – Seventh International Symposium on Hormone and Veterinary Drug
Residue Analysis. Ghent, Belgium, 2-5 June, 2014. Book of abstracts, p. 31.
Личный вклад диссертанта. Диссертантом лично проведена основная часть
экспериментальных работ, представленных в диссертации, обработка полученных
данных, подготовка и написание публикаций.
Характеристика результатов, полученных в соавторстве. Определение
общего плана работ по изучению межмолекулярных взаимодействий и аналитической
характеристике тест-систем, анализ и интерпретация результатов проведены совместно
с д.х.н., проф. Б.Б. Дзантиевым. Характеристика особенностей различных антигенов и
биоматриксов, их влияния на требования к разрабатываемым тест-системам,
планирование экспериментов по оптимизации и апробации тест-систем проведены
совместно с к.б.н. А.В. Жердевым. Получение и характеристика конъюгатов с
флуоресцентными маркерами, интерпретацию экспериментальных данных проведены
совместно с к.х.н. А.Н. Берлиной. В сотрудничестве с Н.А. Бызовой проведены
экспериментальные работы по реализации мультиплексного анализа. Д.б.н., проф.
Ю.Ю. Венгеровым, д.м.н. Т.А. Старовойтовой, к.б.н. В.В. Зайко предоставлены
портативный флуоресцентный детектор и программное обеспечение для обработки
результатов мембранных тестов. Совместно с к.т.н. С.С. Голубевым, к.т.н. Ю.А.
Кудеяровым, Ю.В. Киселевой, Я.А. Короленко и В.М. Малюченко (ВНИИ
метрологической службы, Москва) проведена метрологическая оценка данных
иммунохроматографического
анализа
с
использованием
квантовых
точек,
охарактеризованы способы аппроксимации градуировочных кривых. К.м.н. А.И.
Мартыновым, к.м.н. М.Н. Санковым и к.м.н. И.В. Андреевым (ГНЦ Институт
иммунологии, Москва) предоставлена панель сывороток для характеристики
разработанной
просвечивающей
системы
детекции
электронной
иммуноглобулина
микроскопии
Е.
проведены
Эксперименты
совместно
с
по
С.М.
Придворовой; по регистрации динамического светорассеяния – совместно с к.б.н. С.Г.
Роман. В подготовленных совместно с к.б.н. Е.А. Зверевой тезисах представлены
разработки тест-систем для контроля антибиотиков с флуоресцентными маркерами,
выполненные диссертантом, и их сравнение с другими вариантами тест-систем.
178
ВЫВОДЫ
1.
Исследованы
изменения
оптических
и
размерных
характеристик
полупроводниковых квантовых точек (ядро CdSe / оболочка ZnS) при конъюгировании
с антителами. Показано сохранение конъюгатами с квантовыми точками разного
размера от 60 до 97% интенсивности флуоресценции. Установлено, что при
двухкратном мольном избытке антител при синтезе конъюгата с квантовыми точками
размером 9 нм происходит количественная иммобилизация антител (состав конъюгата
1:2) с сохранением антигенсвязывающих свойств.
2.
Определены кинетические и равновесные константы комплексообразования
с антигеном хлорамфениколом свободных антител и антител в составе конъюгатов с
квантовыми точками. Показано трехкратное увеличение эффективного значения
равновесной константы связывания конъюгата (2,2·108 и 7,4·108 1/М).
3.
Проведено сравнительное определение пределов детекции квантовых точек
и коллоидного золота на мембране для иммунохроматографического анализа.
Установлено, что в условиях эксперимента квантовые точки детектируются в 9 раз
меньшем количестве, чем наночастицы коллоидного золота. Показано, что применение
в качестве маркера для иммунохроматографических систем квантовых точек позволяет
снизить предел обнаружения хлорамфеникола в 24 раза по сравнению с тест-системами
на основе коллоидного золота.
4.
Разработана иммунохроматографическая тест-система с использованием
квантовых точек для определения уровня иммуноглобулина Е в сыворотке крови
человека. На 95 клинических образцах показана высокая степень соответствия
полученных результатов с данными иммуноферментного анализа (коэффициент
корреляции 0,988).
5.
Предложено применение квантовых точек с разными флуоресцентными
свойствами в качестве маркеров в мультиплексном иммунохроматографическом
анализе. Показана эффективность данного подхода для одновременного контроля трех
антибиотиков разных классов.
6. Предложен новый формат мультиплексного иммунохроматографического
анализа, основанный на формировании упорядоченного двумерного массива зон
связывания на мембране. Данный подход апробирован для одновременной детекции
четырех психоактивных соединений с двумя пороговыми уровнями каждого из
аналитов.
179
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические методы анализа. — М.:
Едиториал УРСС, 2002. — 304 c.
2. Hu J., Wang S., Wang L., Li F., Pingguan-Murphy B., Lu T.J., Xu F. Advances in paperbased point-of-care diagnostics // Biosensors and Bioelectronics. 2014. — V. 54. — P. 585597.
3. Золотов Ю.А. Тест-методы // Журнал аналитической химии. 1994. — Т. 49. № 2. —
C. 149.
4. Marquette C.A., Blum L.J. State of the art and recent advances in immunoanalytical
systems // Biosensors and Bioelectronics. 2006. — V. 21, No 8. — P. 1424-1433.
5. Gordon J., Michel G. Discerning trends in multiplex immunoassay technology with
potential for resource-limited settings // Clinical Chemistry. 2012. — V. 58, No 4. — P. 690698.
6. Tothill I.E. Biosensors for cancer markers diagnosis // Seminars in Cell and
Developmental Biology. 2009. — V. 20, No 1. — P. 55-62.
7. Dzantiev B.B., Byzova N.A., Urusov A.E., Zherdev A.V. Immunochromatographic
methods in food analysis // Trends in Analytical Chemistry. 2014. — V. 55. — P. 81-93.
8. Wild D. The Immunoassay Handbook. Amsterdam: Elsevier, 2005. — 930 p.
9. Plotz C.M., Singer J.M. The latex fixation test. I. Application to the serologic diagnosis
of rheumatoid arthritis // American Journal of Medicine. 1956. — V. 21, No 6. — P. 888-892.
10. Gella F.J., Serra J., Gener J. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis // Pure
and Applied Chemistry. 1991. — V. 63, No 8. — P. 1131-1134.
11. Mohd Hanafiah K., Garcia M., Anderson D. Point-of-care testing and the control of
infectious diseases // Biomarker in Medicine. 2013. — V. 7, No 3. — P. 333-347.
12. Anfossi L., Baggiani C., Giovannoli C., D'Arco G., Giraudi G. Lateral-flow
immunoassays for mycotoxins and phycotoxins: a review // Analytical and Bioanalitycal
Chemistry. 2013. — V. 405, No 2-3. — P. 467-480.
13. Aguilera-Herrador E., Cruz-Vera M., Valcarcel M. Analytical connotations of point-ofcare testing // Analyst. 2010. — V. 135, No 9. — P. 2220-2232.
180
14. Ермолаева
Т.Н.,
Калмыкова
Е.Н.
Пьезоэлектрические
иммуносенсоры.
Аналитические возможности и перспективы // Успехи химии. 2006. — Т. 75, № 5. — С.
445-459.
15. Schall R.F., Jr., Tenoso H.J. Alternatives to radioimmunoassay: labels and methods //
Clinical Chemistry. 1981. — V. 27, No 7. — P. 1157-1164.
16. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика
иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. — 287 с.
17. Arayanarakool R., Shui L., Kengen S.W.M., van den Berg A., Eijkel J.C.T. Singleenzyme analysis in a droplet-based micro- and nanofluidic system // Lab on a Chip. 2013. —
V. 13, No 10. — P. 1955-1962.
18. Delaney J.L., Hogan C.F., Tian J., Shen W. Electrogenerated chemiluminescence
detection in paper-based microfluidic sensors // Analytical Chemistry. 2011. — V. 83, No 4.
— P. 1300-1306.
19. von Lode P. Point-of-care immunotesting: Approaching the analytical performance of
central laboratory methods // Clinical Biochemistry. 2005. — V. 38, No 7. — P. 591-606.
20. Dressler D., Dirnberger G. Botulinum toxin antibody testing: comparison between the
immunoprecipitation assay and the mouse diaphragm assay // European Neurology. 2001. —
V. 45, No 4. — P. 257-260.
21. Ortega-Vinuesa J.L., Bastos-González D. A review of factors affecting the performances
of latex agglutination tests // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 2001. — V.
12, No 4. — P. 379-408.
22. Aoki K., Itoh Y., Yoshida T. Simultaneous determination of urinary methamphetamine,
cocain and morphine using a latex agglutination inhibition reaction test with colored latex
particles // Japanese Journal of Toxicology and Environmental Health. 1997. — V. 43, No 5.
— P. 285-292.
23. Gao H., Wang W., Wang Z., Han J., Fu Z. Amorphous carbon nanoparticle used as novel
resonance energy transfer acceptor for chemiluminescent immunoassay of transferrin //
Analytica Chimica Acta. 2014. — V. 819. — P. 102-107.
24. Koivunen M.E., Krogsrud R.L. Principles of immunochemical techniques used in clinical
laboratories // LabMedicine. 2006. — V. 37, No 8. — P. 490-497.
181
25. Fitzpatrick J., Fanning L., Hearty S., Leonard P., Manning B.M., Quinn J.G., O'Kennedy
R. Applications and recent developments in the use of antibodies for analysis // Analytical
Letters. 2000. — V. 33, No 13. — P. 2563-2609.
26. Aoki K., Kuroiwa Y. A screening method for urinary methamphetamine – latex
agglutination inhibition reaction test // Forensic Science International. 1985. — V. 27, No 1.
— P. 49-56.
27. Crowther J.R. The ELISA Guidebook. Totowa: Humana Press, 2001. — 436 p.
28. Radoi A., Targa M., Prieto-Simon B., Marty J.L. Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) based on superparamagnetic nanoparticles for aflatoxin M1 detection // Talanta.
2008. — V. 77, No 1. — P. 138-143.
29. Tudorache M., Bala C. Sensitive aflatoxin B1 determination using a magnetic particlesbased enzyme-linked immunosorbent assay // Sensors. 2008. — V. 8, No 12. — P. 75717580.
30. Garden S.R., Strachan N.J.C. Novel colorimetric immunoassay for the detection of
aflatoxin B1 // Analytica Chimica Acta. 2001. — V. 444, No 2. — P. 187-191.
31. Rokni M., Lesan S., Massoud J., Kia E., Gh. M. Comparative evaluation of fast enzyme
linked immunosorbent assay (fast-ELISA) and standard-ELISA for the diagnosis of human
hydatidosis // Archives of Iranian Medicine. 2006. — V. 14, No 1. — P. 18-21.
32. The Kinetic ELISA Advantage in Quantitative Assays. Hidhland Park: Biotek
Instruments, 2013. — 8 p.
33. Fu J., Wang Y., Cao J., Yu Z., Zhang J. A sensitive, rapid chemiluminescence ELISA for
the detection of 1, 4-bisdesoxycyadox residue in chicken muscle and liver // Analytical
Methods. 2013. — V. 5, No 16. — P. 3933-3941.
34. Ramachandran S., Fu E., Lutz B., Yager P. Long-term dry storage of an enzyme-based
reagent system for ELISA in point-of-care devices // Analyst. 2014. — V. 139, No __. — P.
1456-1462.
35. Smith D.S., Eremin S.A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods
for simple, high-throughput screening of small molecules // Analytical and Bioanalytical
Chemistry. 2008. — V. 391, No 5. — P. 1499-1507.
36. Горячева
И.Ю.,
Русанова
Т.Ю.,
Бурмистрова
Н.А.,
Де
Саегер
С.
Иммунохимические методы определния микотоксинов // Журнал аналитической
химии. 2009. — Т. 64. № 8. — C. 768-785.
182
37. Xu Z.L., Wang Q., Lei H.T., Eremin S.A., Shen Y.D., Wang H., Beier R.C., Yang J.Y.,
Maksimova K.A., Sun Y.M. A simple, rapid and high-throughput fluorescence polarization
immunoassay for simultaneous detection of organophosphorus pesticides in vegetable and
environmental water samples // Analytica Chimica Acta. 2011. — V. 708, No 1-2. — P. 123129.
38. Lea W.A., Simeonov A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening //
Expert Opinion on Drug Discovery. 2011. — V. 6, No 1. — P. 17-32.
39. Gall D., Nielsen K., Bermudez M.R., Moreno F., Smith P. Fluorescence polarization
assay for detection of Brucella abortus antibodies in bulk tank bovine milk samples // Clinical
and Diagnostic Laboratory Immunology. 2002. — V. 9, No 6. — P. 1356-1360.
40. Cullum M.E., Lininger L.A., McArthur A.L., Schade S.Z., Simonson L.G. Fluorescence
polarization instruments and methods for detection of exposure to biological materials by
fluorescence polarization immunoassay of saliva, oral or bodily fluids. // US Patent No
8114582 B2, 2012.
41. Sahoo H. Förster resonance energy transfer – a spectroscopic nanoruler: Principle and
applications // Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews.
2011. — V. 12, No 1. — P. 20-30.
42. Alexander P.D. Nanoparticles and nanocomposites for fluorescence sensing and imaging
// Methods and Applications in Fluorescence. 2013. — V. 1, No 2. — P. 022001.
43. Kreisig T., Hoffmann R., Zuchner T. Highly efficient Forster resonance energy transfer
in a fast, serum-compatible immunoassay // ChemBioChem. 2013. — V. 14, No 6. — P. 699702.
44. Piston D.W., Kremers G.J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly //
Trends in Biochemical Sciences. 2007. — V. 32, No 9. — P. 407-414.
45. Patterson G.H., Piston D.W., Barisas B.G. Forster distances between green fluorescent
protein pairs // Analytical Biochemistry. 2000. — V. 284, No 2. — P. 438-440.
46. Silverton E.W., Navia M.A., Davies D.R. Three-dimensional structure of an intact human
immunoglobulin // Proceedings of the National Academy Science USA. 1977. — V. 74, No
11. — P. 5140-5144.
47. Willard D.M., Carillo L.L., Jung J., Van Orden A. CdSe−ZnS Quantum dots as resonance
energy transfer donors in a model protein−protein binding assay // Nano Letters. 2001. — V.
1, No 9. — P. 469-474.
183
48. Chen G., Song F., Xiong X., Peng X. Fluorescent nanosensors based on fluorescence
resonance energy transfer (FRET) // Industrial and Engineering Chemistry Research. 2013.
— V. 55, No 33. — P. 11228-11245.
49. Maruyama T., Sugishita H., Kujira H., Ichikawa M., Hattori Y., Motoyoshiya J.
Chemiluminescence behavior of fluorescent aromatics tethered 9-methylidene-10methylacridans involving chemiluminescence resonance energy transfer (CRET) quenching
// Tetrahedron Letters. 2013. — V. 54, No 11. — P. 1338-1343.
50. He Y., Cui H. Label free and homogeneous histone sensing based on chemiluminescence
resonance energy transfer between lucigenin and gold nanoparticles // Biosensors and
Bioelectronics. 2013. — V. 47. — P. 313-317.
51. Huang X., Ren J. Nanomaterial-based chemiluminescence resonance energy transfer: A
strategy to develop new analytical methods // Trends in Analytical Chemistry. 2012. — V.
40. — P. 77-89.
52. Qin G., Zhao S., Huang Y., Jiang J., Liu Y.-M. A sensitive gold nanoparticles sensing
platform based on resonance energy transfer for chemiluminescence light on detection of
biomolecules // Biosensors and Bioelectronics. 2013. — V. 46. — P. 119-123.
53. Algar W.R., Tavares A.J., Krull U.J. Beyond labels: a review of the application of
quantum dots as integrated components of assays, bioprobes, and biosensors utilizing optical
transduction // Analytica Chimica Acta. 2010. — V. 673, No 1. — P. 1-25.
54. Freeman R., Girsh J., Willner I. Nucleic acid/quantum dots (QDs) hybrid systems for
optical and photoelectrochemical sensing // ACS Applied Materials and Interfaces. 2013. —
V. 5, No 8. — P. 2815-2834.
55. Bi S., Zhao T., Luo B. A graphene oxide platform for the assay of biomolecules based on
chemiluminescence resonance energy transfer // Chemical Communications. 2012. — V. 48,
No 1. — P. 106-108.
56. Mannila R., Pulli T., Saari H., Tappura K., Tuppurainen J., Valimaki H., Niskanen A.
Fluorescence-based fast diagnostics platform for the direct and indirect immunodiagnostic
analysis methods // Diagnostic Optical Spectroscopy in Biomedicine IV. 2007. — V. 6628.
— P. 66280Q-1-66280Q-10.
57. Morais S., Maquieira A., Puchades R. Selection and characterisation of membranes by
means of an immunofiltration assay. Application to the rapid and sensitive determination of
184
the insecticide carbaryl // Journal of Immunological Methods. 1999. — V. 224, No 1-2. — P.
101-109.
58. Nadala Jr E.C.B., Loh P.C. Dot-blot nitrocellulose enzyme immunoassays for the
detection of white-spot virus and yellow-head virus of penaeid shrimp // Journal of
Virological Methods. 2000. — V. 84, No 2. — P. 175-179.
59. Wang C., Liu D., Wang Z. Gold nanoparticle based dot-blot immunoassay for sensitively
detecting Alzheimer's disease related beta-amyloid peptide // Chemical Communication
(Cambridge). 2012. — V. 48, No 67. — P. 8392-8394.
60. Thiruppathiraja C., Kamatchiammal S., Adaikkappan P., Alagar M. An advanced dual
labeled gold nanoparticles probe to detect Cryptosporidium parvum using rapid immuno-dot
blot assay // Biosensors and Bioelectronics. 2011. — V. 26, No 11. — P. 4624-4627.
61. Dykman L.A., Bogatyrev V.A. Use of the dot-immunogold assay for the rapid diagnosis
of acute enteric infections // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2000. — V. 27,
No 2. — P. 135-137.
62. Hacker G.W., Muss W.H., Hauser-Kronberger C., Danscher G., Rufner R., Gu J., Su H.,
Andreasen A., Stoltenberg M., Dietze O. Electron microscopical autometallography:
Immunogold-silver staining (IGSS) and heavy-metal histochemistry // Methods. 1996. — V.
10, No 2. — P. 257-269.
63. Ma Z., Sui S.F. Naked-eye sensitive detection of immunoglubulin G by enlargement of
Au nanoparticles in vitro // Angewandte Chemie International Edition. 2002. — V. 41, No
12. — P. 2176-2179.
64. Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Izumrudov V.A., Gee S.J., Hammock B.D.
Immunoassay techniques for detection of the herbicide simazine based on use of oppositely
charged water-soluble polyelectrolytes // Analytical Chemistry. 1999. — V. 71, No 16. — P.
3538-3543.
65. Zherdev A.V., Byzova N.A., Izumrudov V.A., Dzantiev B.B. Rapid polyelectrolytebased immunofiltration technique for testosterone detection in serum samples // Analyst.
2003. — V. 128, No 10. — P. 1275-1280.
66. Dzantiev B.B., Byzova N.A., Zherdev A.V., Hennion M.C. Rapid polyelectrolyte-based
membrane immunoassay for the herbicide butachlor // Journal of Immunoassay and
Immunochemistry. 2005. — V. 26, No 3. — P. 231-244.
185
67. Visconti A., Pascale M., Centonze G. Determination of ochratoxin A in wine by means
of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid chromatography // Journal
of Chromatography A. 1999. — V. 864, No 1. — P. 89-101.
68. Beloglazova N.V., De Boevre M., Goryacheva I.Y., Werbrouck S., Guo Y., De Saeger S.
Immunochemical approach for zearalenone-4-glucoside determination // Talanta. 2013. — V.
106. — P. 422-430.
69. Sibanda L., De Saeger S., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. Development of a solid-phase
cleanup and portable rapid flow-through enzyme immunoassay for the detection of ochratoxin
a in roasted coffee // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002. — V. 50, No 24. —
P. 6964-6967.
70. Speranskaya E.S., Beloglazova N.V., Lenain P., De Saeger S., Wang Z.H., Zhang S.X.,
Hens Z., Knopp D., Niessner R., Potapkin D.V., Goryacheva I.Y. Polymer-coated fluorescent
CdSe-based quantum dots for application in immunoassay // Biosensors and Bioelectronics.
2014. — V. 53. — P. 225-231.
71. Njumbe Ediage E., Di Mavungu J.D., Goryacheva I.Y., Van Peteghem C., De Saeger S.
Multiplex flow-through immunoassay formats for screening of mycotoxins in a variety of
food matrices // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2012. — V. 403, No 1. — P. 265278.
72. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Y., de Saeger S., Scippo M.L., Niessner R., Knopp D.
New approach to quantitative analysis of benzo[a]pyrene in food supplements by an
immunochemical column test // Talanta. 2011. — V. 85, No 1. — P. 151-156.
73. Beloglazova N., Goryacheva I., Niessner R., Knopp D. A comparison of horseradish
peroxidase, gold nanoparticles and qantum dots as labels in non-instrumental gel-based
immunoassay // Microchimica Acta. 2011. — V. 175, No 3. — P. 361-367.
74. Золотов Ю.А., Беленький Б.Г., Курочкин В.Е., Комяк Н.И. Микрофлюидные
системы для химического анализа. M.: Физматлит, 2011. —528 c.
75. Chen S.P., Yu X.D., Xu J.J., Chen H.Y. Gold nanoparticles-coated magnetic
microspheres as affinity matrix for detection of hemoglobin A1c in blood by microfluidic
immunoassay // Biosensors and Bioelectronics. 2011. — V. 26, No 12. — P. 4779-4784.
76. Sardesai N., Kadimisetty K., Faria R., Rusling J. A microfluidic electrochemiluminescent
device for detecting cancer biomarker proteins // Analytical and Bioanalytical Chemistry.
2013. — V. 405, No 11. — P. 3831-3838.
186
77. Chin C.D., Linder V., Sia S.K. Commercialization of microfluidic point-of-care
diagnostic devices // Lab on a Chip. 2012. — V. 12, No 12. — P. 2118-2134.
78. Gervais L., de Rooij N., Delamarche E. Microfluidic chips for point-of-care
immunodiagnostics // Advanced Materials. 2011. — V. 23, No 24. — P. 151-176.
79. Han K.N., Li C.A., Seong G.H. Microfluidic chips for immunoassays // Annual Review
of Analytical Chemistry. 2013. — V. 6, No 1. — P. 119-141.
80. Liana D.D., Raguse B., Gooding J.J., Chow E. Recent advances in paper-based sensors //
Sensors (Basel). 2012. — V. 12, No 9. — P. 11505-11526.
81. Tekin H.C., Gijs M.A.M. Ultrasensitive protein detection: a case for microfluidic
magnetic bead-based assays // Lab on a Chip. 2013. — V. 13, No 24. — P. 4711-4739.
82. Wong R.C., Tse H.Y. Lateral Flow Immunoassay. — NY: Humana Press, 2009. —236
p.
83. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Rapid
pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk // Talanta.
2010. — V. 81, No 3. — P. 843-848.
84. Linares E.M., Kubota L.T., Michaelis J., Thalhammer S. Enhancement of the detection
limit for lateral flow immunoassays: evaluation and comparison of bioconjugates // Journal
of Immunological Methods. 2012. — No 1-2. — P. 264-270.
85. Parolo C., de la Escosura-Muñiz A., Merkoçi A. Enhanced lateral flow immunoassay
using gold nanoparticles loaded with enzymes // Biosensors and Bioelectronics. 2013. — V.
40. — P. 412-416.
86. Jin S., Chang Z.Y., Ming X., Min C.L., Wei H., Sheng L.Y., Hong G.X. Fast dipstick dye
immunoassay for detection of immunoglobulin G (IgG) and IgM antibodies of human
toxoplasmosis // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2005. — V. 12, No 1. —
P. 198-201.
87. Hoile R., Yuen M., James G., Gilbert G.L. Evaluation of the rapid analyte measurement
platform (RAMP) for the detection of Bacillus anthracis at a crime scene // Forensic Science
International. 2007. — V. 171, No 1. — P. 1-4.
88. Bai Z., Luo Y., Xu W., Gao H., Han P., Liu T., Wang H., Chen A., Huang K.
Development of a new fluorescence immunochromatography strip for detection of
chloramphenicol residue in chicken muscles // Journal of the Science of Food and Agriculture.
2013. — V. 93, No 15. — P. 3743-3747.
187
89. Gordon J., Michel G. Analytical sensitivity limits for lateral flow immunoassays //
Clinical Chemisry. 2008. — V. 54, No 7. — P. 1250-1251.
90. Coskun A.F., Wong J., Khodadadi D., Nagi R., Tey A., Ozcan A. A personalized food
allergen testing platform on a cellphone // Lab on a Chip. 2013. — V. 13, No 4. — P. 636640.
91. O'Driscoll S., MacCraith B.D., Burke C.S. A novel camera phone-based platform for
quantitative fluorescence sensing // Analytical Methods. 2013. — V. 5, No 8. — P. 19041908.
92. Eriksson M., Iqbal Z. Two measurement modes for mobile phone optical sensing //
Sensors and Actuators B: Chemical. 2014. — V. 195. — P. 63-70.
93. Veitch N.C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme //
Phytochemistry. 2004. — V. 65, No 3. — P. 249-259.
94. Cho I.H., Irudayaraj J. Lateral-flow enzyme immunoconcentration for rapid detection of
Listeria monocytogenes // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2013. — V. 405, No 10.
— P. 3313-3319.
95. Glassy M.C., Cleveland P.H. Use of mouse and human monoclonal antibodies in enzyme
immunofiltration // Methods in Enzymology. 1986. — V. 121. — P. 525-541.
96. Метелица Д.И., Савенкова М.И., Курченко В.П. Применение пероксидазы хрена и
ее конъюгатов с антителами в иммуноферментном анализе // Прикладная биохимия и
микробиология. 1987. — Т. 23. № 1. — C. 116-124.
97. Lu K. Nanoparticulate Materials: Synthesis, Characterization, and Processing. NY:
Wiley, 2012. — 464 p.
98. Oh S.W., Kim Y.M., Kim H.J., Kim S.J., Cho J.S., Choi E.Y. Point-of-care fluorescence
immunoassay for prostate specific antigen // Clinica Chimica Acta. 2009. — V. 406, No 1-2.
— P. 18-22.
99. Wen L., Zhu P., Liu Y., Pan Q., Qu Y., Xu X., Li X., Fu N. Development of a fluorescence
immunochromatographic assay for the detection of zeta globin in the blood of (--(SEA))
alpha-thalassemia carriers // Blood Cells, Molecules and Diseases. 2012. — V. 49, No 3-4.
— P. 128-32.
100. Mason W.T. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity: A Practical
Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis. Amsterdam: Elsevier Science,
1999. — 647 p.
188
101. Soper S.A., Mattingly Q.L. Steady-state and picosecond laser fluorescence studies of
nonradiative pathways in tricarbocyanine dyes: implications to the design of near-IR
fluorochromes with high fluorescence efficiencies // Journal of the American Chemical
Society. 1994. — V. 116, No 9. — P. 3744-3752.
102. Soper S.A., Nutter H.L., Keller R.A., Davis L.M., Shera E.B. The photophisical
constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy //
Photochemistry and Photobiology. 1993. — V. 57. — P. 972-977.
103. Mujumdar R.B., Ernst L.A., Mujumdar S.R., Lewis C.J., Waggoner A.S. Cyanine dye
labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters // Bioconjugate Chemistry. 1993. —
V. 4, No 2. — P. 105-111.
104. Chan W.C.W. Bio-Applications of Nanoparticles. Berlin: Springer Science + Business
Media, 2007. — 207 p.
105. Ozin G.A., Arsenault A.C., Cademartiri L., Nanochemistry: A Chemical Approach to
Nanomaterials. London: Royal Society of Chemistry, 2009. — 820 p.
106. Goryacheva I.Y., Lenain P., De Saeger S. Nanosized labels for rapid immunotests //
Trends in Analytical Chemistry. 2013. — V. 46. — P. 30-43.
107. Horisberger M. Colloidal gold: a cytochemical marker for light and fluorescent
microscopy and for transmission and scanning electron microscopy // Scanning Electron
Microscopy. 1981. — Pt 2. — P. 9-31.
108. Safenkova I.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Factors influencing the detection limit
of the lateral-flow sandwich immunoassay: a case study with potato virus X // Analytical and
Bioanalytical Chemistry. 2012. — V. 403, No 6. — P. 1595-1605.
109. Makhsin S.R., Razak K.A., Noordin R., Zakaria N.D., Chun T.S. The effects of size
and synthesis methods of gold nanoparticle-conjugated M alpha HIgG(4) for use in an
immunochromatographic strip test to detect brugian filariasis // Nanotechnology. 2012. — V.
23, No 49. — P. 495603.
110. Bio-Rad Lab Blotting detection systems: how do you choose? // Bulletin 1310, BioRad Lab., Richmond (CA, USA). 1987.
111. Dykman L., Khlebtsov N. Gold nanoparticles in biomedical applications: recent
advances and perspectives // Chemical Society Reviews. 2012. — V. 41, No 6. — P. 22562282.
189
112. Anfossi L., Di Nardo F., Giovannoli C., Passini C., Baggiani C. Increased sensitivity
of lateral flow immunoassay for ochratoxin A through silver enhancement // Analytical and
Bioanalytical Chemistry. 2013. — V. 405, No 30. — P. 9859-9867.
113. Shen G., Xu H., Gurung A.S., Yang Y., Liu G. Lateral flow immunoassay with the
signal enhanced by gold nanoparticle aggregates based on polyamidoamine dendrimer //
Analytical Sciences. 2013. — V. 29, No 8. — P. 799-804.
114. Hu J., Wang L., Li F., Han Y.L., Lin M., Lu T.J., Xu F. Oligonucleotide-linked gold
nanoparticle aggregates for enhanced sensitivity in lateral flow assays // Lab on a Chip. 2013.
— V. 13, No 22. — P. 4352-4357.
115. Дрыгин Ю.Ф., Блинцов А.Н., Осипов А.П., Григоренко В.Г., Андреева И.П.,
Усков А.И., Варицев Ю.А., Анисимов Б.В., Новиков В.К., Атабеков И.Г.
Высокочувствительный иммунохроматографический экспресса-метод опредления
зараженности растений вирусом табачной мозаики // Биохимия. 2009. — Т. 74, No 9. —
С. 986-993.
116. Zhang H., Wang L., Jiang W. Label free DNA detection based on gold nanoparticles
quenching fluorescence of Rhodamine B // Talanta. 2011. — V. 85, No 1. — P. 725-729.
117. Seydack M. Nanoparticle labels in immunosensing using optical detection methods //
Biosensors and Bioelectronics. 2005. — V. 20, No 12. — P. 2454-2469.
118. Cao X., Ye Y., Liu S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing //
Analytical Biochemistry. 2011. — V. 417, No 1. — P. 1-16.
119. Huang T., Murray R.W. Visible luminescence of water-soluble monolayer-protected
gold clusters // The Journal of Physical Chemistry B. 2001. — V. 105, No 50. — P. 1249812502.
120. Gasparyan V.K. Hen egg immunoglobulin Y in colloidal gold agglutination assay:
comparison with rabbit immunoglobulin G // Journal of Clinical Laboratory Analysis. 2005.
— V. 19, No 3. — P. 124-127.
121. Vilela D., Gonzalez M.C., Escarpa A. Sensing colorimetric approaches based on gold
and silver nanoparticles aggregation: chemical creativity behind the assay. A review //
Analytica Chimica Acta. 2012. — V. 751. — P. 24-43.
122. Hirsch L.R., Jackson J.B., Lee A., Halas N.J., West J.L. A whole blood immunoassay
using gold nanoshells // Analytical Chemistry. 2003. — V. 75, No 10. — P. 2377-2381.
190
123. Szymanski M.S., Porter R.A. Preparation and quality control of silver nanoparticleantibody conjugate for use in electrochemical immunoassays // Journal of Immunological
Methods. 2013. — V. 387, No 1-2. — P. 262-269.
124. Gasparyan V.K. Silver sol immunoagglutination assay for determination of human IgG
// Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010. — V. 80, No 2. — P. 180-183.
125. Khlebtsov N.G., Trachuk L.A., Mel’nikov A.G. The effect of the size, shape, and
structure of metal nanoparticles on the dependence of their optical properties on the refractive
index of a disperse medium // Optics and Spectroscopy. 2005. — V. 98, No 1. — P. 77-83.
126. Hardikar V.V., Matijević E. Coating of nanosize silver particles with silica // Journal
of Colloid and Interface Science. 2000. — V. 221, No 1. — P. 133-136.
127. Vadakkekara R., Chakraborty M., Parikh P.A. Synthesis, characterization, and
application of monodisperse gelatin-stabilized silver nanospheres in reduction of aromatic
nitro compounds // Colloid Journal. 2014. — V. 76, No 1. — P. 12-18.
128. Garden A.L., Scholz K., Schwass D.R., Meledandri C.J. Optimized colloidal chemistry
for micelle-templated synthesis and assembly of silver nanocomposite materials // Colloids
and Surfaces. A. Physicochemical and Engineering Aspects. 2014. — V. 441. — P. 367-377.
129. Scida K., Stege P.W., Haby G., Messina G.A., Garcia C.D. Recent applications of
carbon-based nanomaterials in analytical chemistry: critical review // Analytica Chimica
Acta. 2011. — V. 691, No 1-2. — P. 6-17.
130. van Amerongen A., Wichers J.H., Berendsen L.B., Timmermans A.J., Keizer G.D.,
van Doorn A.W., Bantjes A., van Gelder W.M. Colloidal carbon particles as a new label for
rapid immunochemical test methods: quantitative computer image analysis of results //
Journal of Biotechnology. 1993. — V. 30, No 2. — P. 185-195.
131. Mujawar L.H., Moers A., Norde W., van Amerongen A. Rapid mastitis detection assay
on porous nitrocellulose membrane slides // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2013.
— V. 405, No 23. — P. 7469-7476.
132. Noguera P., Posthuma-Trumpie G.A., van Tuil M., van der Wal F.J., de Boer A., Moers
A., van Amerongen A. Carbon nanoparticles in lateral flow methods to detect genes encoding
virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli // Analytical and Bioanalytical
Chemistry. 2011. — V. 399, No 2. — P. 831-838.
133. Posthuma-Trumpie G.A., Korf J., van Amerongen A. Development of a competitive
lateral flow immunoassay for progesterone: influence of coating conjugates and buffer
191
components // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2008. — V. 392, No 6. — P. 12151223.
134. Rayev M., Shmagel K. Carbon-protein covalent conjugates in non-instrumental
immunodiagnostic systems // Journal of Immunological Methods. 2008. — V. 336, No 1. —
P. 9-15.
135. Posthuma-Trumpie G.A., Wichers J.H., Koets M., Berendsen L.B., van Amerongen A.
Amorphous carbon nanoparticles: a versatile label for rapid diagnostic (immuno)assays //
Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2012. — V. 402, No 2. — P. 593-600.
136. Lonnberg M., Drevin M., Carlsson J. Ultra-sensitive immunochromatographic assay
for quantitative determination of erythropoietin // Journal of Immunological Methods. 2008.
— V. 339, No 2. — P. 236-244.
137. Kim S.N., Rusling J.F., Papadimitrakopoulos F. Carbon nanotubes for electronic and
electrochemical detection of biomolecules // Advaced Materials. 2007. — V. 19, No 20. —
P. 3214-3228.
138. Liu G., Lin Y. Nanomaterial labels in electrochemical immunosensors and
immunoassays // Talanta. 2007. — V. 74, No 3. — P. 308-317.
139. Munge B., Liu G., Collins G., Wang J. Multiple enzyme layers on carbon nanotubes
for electrochemical detection down to 80 DNA copies // Analytical Chemistry. 2005. — V.
77, No 14. — P. 4662-4666.
140. Liu C., Jia Q., Yang C., Qiao R., Jing L., Wang L., Xu C., Gao M. Lateral flow
immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle
aggregates as color reagents // Analytical Chemistry. 2011. — V. 83, No 17. — P. 6778-6784.
141. Oh S., Anandakumar S., Lee C., Kim K.W., Lim B., Kim C. Analytes kinetics in lateral
flow membrane analyzed by cTnI monitoring using magnetic method // Sensors and Actuators
B: Chemical. 2011. — V. 160, No 1. — P. 747-752.
142. Yan J., Liu Y.Y., Wang Y.L., Xu X.W., Lu Y., Pan Y.J., Guo F.F., Shi D.L. Effect of
physiochemical property of Fe3O4 particle on magnetic lateral flow immunochromatographic
assay // Sensors and Actuators B: Chemical. 2014. — V. 197. — P. 129-136.
143. Gao Z., Xu M., Hou L., Chen G., Tang D. Magnetic bead-based reverse colorimetric
immunoassay strategy for sensing biomolecules // Analytical Chemistry. 2013. — V. 85, No
14. — P. 6945-6952.
192
144. Guo H., Sun S. Lanthanide-doped upconverting phosphors for bioassay and therapy //
Nanoscale. 2012. — V. 4, No 21. — P. 6692-6706.
145. Pakkila H., Yliharsila M., Lahtinen S., Hattara L., Salminen N., Arppe R., Lastusaari
M., Saviranta P., Soukka T. Quantitative multianalyte microarray immunoassay utilizing
upconverting phosphor technology // Analytical Chemistry. 2012. — V. 84, No 20. — P.
8628-8634.
146. Dosev D., Nichkova M., Kennedy I.M. Inorganic lanthanide nanophosphors in
biotechnology // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2008. — V. 8, No 3. — P.
1052-1067.
147. Kodaira C.A., Lourenço A.V.S., Felinto M.C.F.C., Sanchez E.M.R., Rios F.J.O.,
Nunes L.A.O., Gidlund M., Malta O.L., Brito H.F. Biolabeling with nanoparticles based on
Y2O3: Nd3+ and luminescence detection in the near-infrared // Journal of Luminescence. 2011.
— V. 131, No 4. — P. 727-731.
148. Cháfer-Pericás C., Maquieira A., Puchades R. Functionalized inorganic nanoparticles
used as labels in solid-phase immunoassays // Trends in Analytical Chemistry. 2012. — V.
31. — P. 144-156.
149. Pokhrel M., Gangadharan A.k., Sardar D.K. High upconversion quantum yield at low
pump threshold in Er3+/Yb3+ doped La2O2S phosphor // Materials Letters. 2013. — V. 99. —
P. 86-89.
150. Soukka T., Rantanen T., Kuningas K. Photon upconversion in homogeneous
fluorescence-based bioanalytical assays // Annals of the New York Academy of Sciences.
2008. — V. 1130. — P. 188-200.
151. Niedbala R.S., Feindt H., Kardos K., Vail T., Burton J., Bielska B., Li S., Milunic D.,
Bourdelle P., Vallejo R. Detection of analytes by immunoassay using up-converting phosphor
technology // Analytical Biochemistry. 2001. — V. 293, No 1. — P. 22-30.
152. Corstjens P.L., van Lieshout L., Zuiderwijk M., Kornelis D., Tanke H.J., Deelder
A.M., van Dam G.J. Up-converting phosphor technology-based lateral flow assay for
detection of Schistosoma circulating anodic antigen in serum // Journal of Clinical
Microbiology. 2008. — V. 46, No 1. — P. 171-176.
153. Bettinelli M., Speghini A., Piccinelli F., Neto A.N.C., Malta O.L. Luminescence
spectroscopy of Eu3+ in Ca3Sc2Si3O12 // Journal of Luminescence. 2011. — V. 131, No 5. —
P. 1026-1028.
193
154. Bazzi R., Brenier A., Perriat P., Tillement O. Optical properties of neodymium oxides
at the nanometer scale // Journal of Luminescence. 2005. — V. 113, No 1–2. — P. 161-167.
155. Xia X., Xu Y., Zhao X., Li Q. Lateral flow immunoassay using europium chelateloaded silica nanoparticles as labels // Clinical Chemistry. 2009. — V. 55, No 1. — P. 179182.
156. Smith A.M., Nie S. Semiconductor nanocrystals: structure, properties, and band gap
engineering // Accounts of Chemical Research. 2010. — V. 43, No 2. — P. 190-200.
157. Meulenberg R.W., Lee J.R.I., Wolcott A., Zhang J.Z., Terminello L.J., van Buuren T.
Determination of the exciton binding energy in CdSe quantum dots // ACS Nano. 2009. —
V. 3, No 2. — P. 325-330.
158. Laheld U.E.H., Einevoll G.T. Excitons in CdSe quantum dots // Physical Review B.
1997. — V. 55, No 8. — P. 5184-5204.
159. Rogach A.L. Semiconductor Nanocrystal Quantum Dots Synthesis, Assembly,
Spectroscopy and Applications, Berlin: Shpringer, 2008. — 372 p.
160. Yu W., Qu L., Guo W., Peng X. Experimental determination of the extinction
coefficient of CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals // Chemistry of Materials. 2003. — V. 15,
No __. — P. 2854-2560.
161. Rosenthal S.J., Chang J.C., Kovtun O., McBride J.R., Tomlinson I.D. Biocompatible
quantum dots for biological applications // Chemistry and Biology. 2011. — V. 18, No 1. —
P. 10-24.
162. Nian H., Wang J., Wu H., Lo J.-G., Chiu K.-H., Pounds J.G., Lin Y. Electrochemical
immunoassay of cotinine in serum based on nanoparticle probe and immunochromatographic
strip // Analytica Chimica Acta. 2012. — V. 713. — P. 50-55.
163. Jamieson T., Bakhshi R., Petrova D., Pocock R., Imani M., Seifalian A.M. Biological
applications of quantum dots // Biomaterials. 2007. — V. 28, No 31. — P. 4717-4732.
164. Chan W.C., Nie S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection
// Science. 1998. — V. 281, No 5385. — P. 2016-2018.
165. Resch-Genger U., Grabolle M., Cavaliere-Jaricot S., Nitschke R., Nann T. Quantum
dots versus organic dyes as fluorescent labels // Nature methods. 2008. — V. 5, No 9. — P.
763-775.
194
166. Michalet X., Pinaud F.F., Bentolila L.A., Tsay J.M., Doose S., Li J.J., Sundaresan G.,
Wu A.M., Gambhir S.S., Weiss S. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and
diagnostics // Science. 2005. — V. 307, No 5709. — P. 538-544.
167. Rongen H.A.H., Bult A., van Bennekom W.P. Liposomes and immunoassays // Journal
of Immunological Methods. 1997. — V. 204, No 2. — P. 105-133.
168. Beloglazova N.V., Shmelin P.S., Goryacheva I.Y., Saeger S. Liposomes loaded with
quantum dots for ultrasensitive on-site determination of aflatoxin M1 in milk products //
Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2013. — V. 405. — P. 7795-7802.
169. Bally M., Voros J. Nanoscale labels: nanoparticles and liposomes in the development
of high-performance biosensors // Nanomedicine (London). 2009. — V. 4, No 4. — P. 447467.
170. McDonald C.J., Devon M.J. Hollow latex particles: synthesis and applications //
Advances in Colloid and Interface Science. 2002. V. 99, No 3. — P. 181-213.
171. Yu L., Fei X. Synthesis, characterization and biological evaluation of functionalized
polystyrene particles // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2013. — V. 13, No 8.
— P. 5814-5822.
172. Wang Y., Xu C., Ow H. Commercial nanoparticles for stem cell labeling and tracking
// Theranostics. 2013. — V. 3, No 8. — P. 544-560.
173. Fan A., Cao Z., Li H., Kai M., Lu J. Chemiluminescence platforms in immunoassay
and DNA analyses // Analytical Sciences. 2009. — V. 25, No 5. — P. 587-97.
174. Khlebtsov B., Khlebtsov N. Enhanced solid-phase immunoassay using gold
nanoshells: effect of nanoparticle optical properties // Nanotechnology. 2008. — V. 19, No
43. — P. 435703.
175. Vertegel A.A., Siegel R.W., Dordick J.S. Silica nanoparticle size influences the
structure and enzymatic activity of adsorbed lysozyme // Langmuir. 2004. — V. 20, No 16.
— C. 6800-6807.
176. Climent E., Groninger D., Hecht M., Walter M.A., Martinez-Manez R., Weller M.G.,
Sancenon F., Amoros P., Rurack K. Selective, sensitive, and rapid analysis with lateral-flow
assays based on antibody-gated dye-delivery systems: the example of triacetone triperoxide
// Chemistry. 2013. — V. 19, No 13. — P. 4117-4122.
195
177. Nooney R.I., McCormack E., McDonagh C. Optimization of size, morphology and
colloidal stability of fluorescein dye-doped silica NPs for application in immunoassays //
Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2012. — V. 404, No 10. — P. 2807-2818.
178. Bamrungsap S., Apiwat C., Chantima W., Dharakul T., Wiriyachaiporn N. Rapid and
sensitive lateral flow immunoassay for influenza antigen using fluorescently-doped silica
nanoparticles // Microchimica Acta. 2013. — V. 181, No 1-2. — P. 223-230.
179. Liu X., Dai Q., Austin L., Coutts J., Knowles G., Zou J., Chen H., Huo Q. A One-step
homogeneous immunoassay for cancer biomarker detection using gold nanoparticle probes
coupled with dynamic light dcattering // Journal of the American Chemical Society. 2008. —
V. 130, No 9. — P. 2780-2782.
180. Teste B., Descroix S. Colloidal nanomaterial-based immunoassay // Nanomedicine
(London). 2012. — V. 7, No 6. — P. 917-29.
181. Sasso L.A., Johnston I.H., Zheng M., Gupte R.K., Undar A., Zahn J.D. Automated
microfluidic processing platform for multiplexed magnetic bead immunoassays //
Microfluidics and Nanofluidics. 2012. — V. 13, No 4. — P. 603-612.
182. Snowden K., Hommel M. Antigen detection immunoassay using dipsticks and
colloidal dyes // Journal of Immunological Methods. 1991. V. 140, No 1. — P. 57-65.
183. He Q.-H., Xu Y., Wang D., Kang M., Huang Z., Li Y. Simultaneous multiresidue
determination of mycotoxins in cereal samples by polyvinylidene fluoride membrane based
dot immunoassay // Food Chemistry. 2012. — V. 134, No 1. — P. 507-512.
184. Demchenko A.P. Introduction to Fluorescence Sensing // Berlin: Springer, 2008. —
516 p.
185. Goldman E.R., Clapp A.R., Anderson G.P., Uyeda H.T., Mauro J.M., Medintz I.L.,
Mattoussi H. Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents //
Analytical Chemistry. 2004. — V. 76, No 3. — P. 684-688.
186. Carriba P., Navarro G., Ciruela F., Ferre S., Casado V., Agnati L., Cortes A., Mallol
J., Fuxe K., Canela E.I., Lluis C., Franco R. Detection of heteromerization of more than two
proteins by sequential BRET-FRET // Nature Methods. 2008. — V. 5, No 8. — P. 727-733.
187. Tian J., Zhou L., Zhao Y., Wang Y., Peng Y., Zhao S. Multiplexed detection of tumor
markers with multicolor quantum dots based on fluorescence polarization immunoassay //
Talanta. 2012. — V. 92. — P. 72-77.
196
188. Schroeder H., Adler M., Gerigk K., Müller-Chorus B., Götz F., Niemeyer C.M. User
configurable microfluidic device for multiplexed immunoassays based on DNA-Directed
assembly // Analytical Chemistry. 2009. — V. 81, No 3. — P. 1275-1279.
189. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Y., Rusanova T.Y., Yurasov N.A., Galve R., Marco
M.P., de Saeger S. Gel-based immunotest for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol
and ochratoxin A in red wine // Analytica Chimica Acta. 2010. — V. 672, No 1-2. — P. 3-8.
190. Zhang H., Liu L., Fu X., Zhu Z. Microfluidic beads-based immunosensor for sensitive
detection of cancer biomarker proteins using multienzyme-nanoparticle amplification and
quantum dots labels // Biosensors and Bioelectronics. 2013. — V. 42. — P. 23-30.
191. Zhang M.-Z., Wang M.-Z., Chen Z.-L., Fang J.-H., Fang M.-M., Liu J., Yu X.-P.
Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous
detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine // Analytical and Bioanalytical
Chemistry. 2009. — V. 395, No 8. — P. 2591-2599.
192. Venkataramasubramani M., Tang L. Development of gold nanorod lateral flow test for
quantitative multi-analyte detection, In: 25th Southern Biomedical Engineering Conference
2009, 15 – 17 May 2009, Miami, Florida, USA // V. 24. McGoron A.J., Li C.-Z., Lin W.-C.,
Magjarevic R. Berlin: Springer Berlin Heidelberg, 2009. — P. 199-202.
193. Hong W., Huang L., Wang H., Qu J., Guo Z., Xie C., Zhu Z., Zhang Y., Du Z., Yan
Y., Zheng Y., Huang H., Yang R., Zhou L. Development of an up-converting phosphor
technology-based 10-channel lateral flow assay for profiling antibodies against Yersinia
pestis // Journal of Microbiologycal Methods. 2010. — V. 83, No 2. — P. 133-40.
194. Lucas J.M. Microarrays: molecular allergology and nanotechnology for personalised
medicine (I) // Allergology and Immunopathology. 2010. — V. 38, No 3. — P. 153-161.
195. Trietsch S.J., Hankemeier T., van der Linden H.J. Lab-on-a-chip technologies for
massive parallel data generation in the life sciences: A review // Chemometrics and Intelligent
Laboratory Systems. 2011. — V. 108, No 1. — P. 64-75.
196. Soe A.K., Nahavandi S., Khoshmanesh K. Neuroscience goes on a chip // Biosensors
and Bioelectronics. 2012. — V. 35, No 1. — P. 1-13.
197. Kumar Khanna V. Existing and emerging detection technologies for DNA
(Deoxyribonucleic Acid) finger printing, sequencing, bio- and analytical chips: A
multidisciplinary development unifying molecular biology, chemical and electronics
engineering // Biotechnology Advances. 2007. V. 25, No 1. — P. 85-98.
197
198. Fall B.I., Eberlein-König B., Behrendt H., Niessner R., Ring J., Weller M.G.
Microarrays for the screening of allergen-specific IgE in human serum // Analytical
Chemistry. 2002. — V. 75, No 3. — P. 556-562.
199. Pla-Roca M., Leulmi R.F., Tourekhanova S., Bergeron S., Laforte V., Moreau E.,
Gosline S.J., Bertos N., Hallett M., Park M., Juncker D. Antibody colocalization microarray:
a scalable technology for multiplex protein analysis in complex samples // Molecular and
Cellular Proteomics. 2012. — V. 11, No 4. — P. M111 011460.
200. Noya O., Alarcon de Noya B. The multiple antigen blot assay (MABA): a simple
immunoenzymatic technique for simultaneous screening of multiple antigens // Immunology
Letters. 1998. — V. 63, No 1. — P. 53-56.
201. Gordon J., Hoijer J., Jou C., Rhoads J. Test strip having a diagonal array of capture
spots. // USA Patent No 6100099. — 2000.
202. Cary R.B., Stubben C.J. Multiplexed lateral flow microarray assay for detection of
citrus pathogens Xylella fastidiosa and Xantho. // USA Patent, No 7910309. — 2011.
203. Hong S., Park Y., Jang Y., Min B.-H., Yoon H. Quantitative lateral-flow immunoassay
for the assessment of the cartilage oligomeric matrix protein as a marker of osteoarthritis //
BioChip Journal. 2012. — V. 6, No 3. — P. 213-220.
204. Gantelius J., Hamsten C., Neiman M., Schwenk J.M., Persson A., Andersson-Svahn
H. A lateral flow protein microarray for rapid determination of contagious bovine
pleuropneumonia status in bovine serum // Journal of Microbiologycal Methods. 2010. — V.
82, No 1. — P. 11-18.
205. Gantelius J., Bass T., Sjöberg R., Nilsson P., Andersson-Svahn H. A lateral flow
protein microarray for rapid and sensitive antibody assays // International Journal of
Molecular Sciences. 2011. — V. 12, No 11. — P. 7748-7759.
206. Corstjens P.L.A.M., Kardos K., Niedbala R.S., Tanke H.J., Zuiderwijk M., Feindt
H.H., Mokkapati V.K., Kimball J.A. Lateral flow assay device with multiple equidistant
capture zones. // Patent USA No 7858396. — 2007.
207. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс: [Учебное
пособие]. M.: Издательско-торговый дом Гранд, 1999. — 720 c.
208. Dandliker W.B., Levison S.A. Investigation of antigen-antibody kinetics by
fluorescence polarization // Immunochemistry. 1968. — V. 5, No 2. — P. 171-183.
198
209. Bell G.I., DeLisi C.P. Antigen binding to receptors on immunocompetent cells: I.
Simple models and interpretation of experiments // Cellular Immunology. 1974. — V. 10, No
3. — P. 415-431.
210. Hornick C.L., Karush F. Antibody affinity: III. The role of multivalence //
Immunochemistry. 1972. V. 9, No 3. — P. 325-330.
211. Holmes D.T., Buhr K. Mathematical modeling: Assumptions affect results // Clinical
Chemistry. 2006. — V. 52, No 8. — P. 1606-1608.
212. Ylander P.J., Hanninen P. Modelling of multi-component immunoassay kinetics – A
new node-based method for simulation of complex assays // Biophysical Chemistry. 2010. —
V. 151, No 3. — P. 105-110.
213. Vorup-Jensen T. On the roles of polyvalent binding in immune recognition:
Perspectives in the nanoscience of immunology and the immune response to nanomedicines
// Advanced Drug Delivery Reviews. 2012. — V. 64, No 15. — P. 1759-1781.
214. Hendrickson O.D., Zherdev A.V., Kaplun A.P., Dzantiev B.B. Experimental study and
mathematical modeling of the interaction between antibodies and antigens on the surface of
liposomes // Molecular Immunology. 2002. — V. 39, No 7-8. — P. 413-422.
215. Sanny C.G., Price J.A. Analysis of polyvalent antibody: antigen interactions using
size-exclusion high-performance (pressure) liquid chromatography // FASEB Journal. 1999.
— V. 13, No 7. — P. A1491.
216. Srisa-Art M., Sharma S. Droplet-based microfluidics for binding assays and kinetics
based on FRET // Methods in Molecular Biology. 2013. — V. 949. — P. 231-240.
217. Rodbard D., Weiss G.H. Mathematical theory of immunoradiometric (labeled
antibody) assays // Analytical Biochemistry. 1973. — V. 52, No 1. — P. 10-44.
218. Feldman H., Rodbard D., Levine D. Mathematical theory of cross-reactive
radioimmunoassay and ligand-binding systems at equilibrium // Analytical Biochemistry.
1972. — V. 45, No 2. — P. 530-556.
219. Surovtsev I.V., Yurkin M.A., Shvalov A.N., Nekrasov V.M., Sivolobov G.F.,
Grazhdantseva A.A., Maltsev V.P., Chernyshev A.V. Kinetics of the initial stage of
immunoagglutionation studied with the scanning flow cytometer // Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces. 2003. — V. 32, No 3. — P. 245-255.
220. Wadsworth M.E. Kinetics of heterogeneous systems // Annual Review Physical
Chemistry. 1972. — V. 23. — P. 355-384.
199
221. Calamel M., Lambert M. ELISA – Use of a computerized mathematical-model to
express toxoplasmosis diagnosis in international units // Revue de Medecine Veterinaire.
1985. — V. 136, No 4. — P. 295-302.
222. Ballegaard M., Hunding A., Rubin I. A reliable method to estimate the assisiation
constant for a monoclonal-antybody and a protein antigen by enzyme-linked-immunosorbentassay, ELISA // Journal of Immunoassay. 1995. — V. 16, No 2. — P. 123-136.
223. Sittampalam G.S., Smith W.C., Miyakawa T.W., Smith D.R., McMorris C.
Application of experimental design techniques to optimize a competitive ELISA // Journal of
Immunologycal Methods. 1996. — V. 190, No 2. — P. 151-161.
224. Choi D.H., Katakura Y., Matsuda R., Hayashi Y., Ninomiya K., Shioya S. Simulation
model for predicting limit of detection and range of quantitation of competitive enzymelinked immunosorbent assay // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2007. — V. 103,
No 5. — P. 427-431.
225. Kusnezow W., Syagailo Y.V., Ruffer S., Baudenstiel N., Gauer C., Hoheisel J.D., Wild
D., Goychuk I. Optimal design of microarray immunoassays to compensate for kinetic
limitations: theory and experiment // Molecular and Cellular Proteomics. 2006. — V. 5, No
9. — P. 1681-1696.
226. Kusnezow W., Syagailo Y.V., Goychuk I., Hoheisel J.D., Wild D.G. Antibody
microarrays: the crucial impact of mass transport on assay kinetics and sensitivity // Expert
Review of Molecular Diagnostic. 2006. — V. 6, No 1. — P. 111-124.
227. Zhao M., Wang X., Nolte D. Mass-transport limitations in spot-based microarrays //
Biomedical Optics Express. 2010. — V. 1, No 3. — P. 983-997.
228. Mujawar L.H., Maan A.A., Khan M.K., Norde W., van Amerongen A. Distribution of
biomolecules in porous nitrocellulose membrane pads using confocal laser scanning
microscopy and high-speed cameras // Analytical Chemistry. 2013. — V. 85, No 7. — P.
3723-3729.
229. Starov V.M., Zhdanov S.A., Kosvintsev S.R., Sobolev V.D., Velarde M.G. Spreading
of liquid drops over porous substrates // Advances in Colloid and Interface Science. 2003. —
V. 104. — P. 123-158.
230. Qian S., Bau H.H. Analysis of lateral flow biodetectors: competitive format //
Analytical Biochemistry. 2004. — V. 326, No 2. — P. 211-224.
200
231. Qian S., Bau H.H. A mathematical model of lateral flow bioreactions applied to
sandwich assays // Analytical Biochemistry. 2003. — V. 322, No 1. — P. 89-98.
232. Ragavendar M.S., Anmol C.M. A mathematical model to predict the optimal test line
location and sample volume for lateral flow immunoassays // Engineering in Medicine and
Biology Society. 2012. — P. 2408-2411.
233. Fodey T., Murilla G., Cannavan A., Elliott C. Characterisation of antibodies to
chloramphenicol, produced in different species by enzyme-linked immunosorbent assay and
biosensor technologies // Analytica Chimica Acta. 2007. — V. 592, No 1. — P. 51-57.
234. Liškova M., Voračova I., Kleparnik K., Hezinova V., Přikryl J., Foret F. Conjugation
reactions in the preparations of quantum dot-based immunoluminescent probes for analysis
of proteins by capillary electrophoresis // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. —
V. 400. No 2. — P. 369-379.
235. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. NY: Academic Press, 2008. — 1323 p.
236. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М: Мир, 1972. — 512 c.
237. Li Z.M., Wang Y.J., Shen J., Liu W., Sun X.M. The measurement system of
nanoparticle size distribution from dynamic light scattering data // Optics and Lasers in
Engineering. 2014. — V. 56. — P. 94-98.
238. Lorber B., Fischer F., Bailly M., Roy H., Kern D. Protein analysis by dynamic light
scattering: Methods and techniques for students // Biochemistry and Molecular Biology
Education. 2012. V. 40, No 6. — P. 372-382.
239. Бызова Н.А., Баландина Ю.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка
иммунохроматографических тест-систем и методов количественной регистрации
результатов мембранного анализа // Аллергия, астма и клиническая иммунология.
2003. — Т. 7. № 9. — C. 189-192.
240. Kurganov B.I., Lobanov A.V., Borisov I.A., Reshetilov A.N. Criterion for Hill
equation validity for description of biosensor calibration curves // Analytica Chimica Acta.
2001. — V. 427, No 1. — P. 11-19.
241. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии: В 2-х кн. M.: Высшая школа, 1996ю
— 864 (361+503) c.
242. DeLean A., Munson P.J., Rodbard D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal
curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves //
American Journal of Physiology. 1978. — V. 235, No 2. — P. 97-102.
201
243. Biacore X Handbook. Uppsala: Biacore AB, 2001. — 54 p.
244. Ashish B., Murthy G.S. Analysis of human chorionic gonadotropin-monoclonal
antibody interaction in BIAcore // Journal of Biosciences. 2004. — V. 29, No 1. — P. 57-66.
245. Arruebo
M.,
Valladares
M.,
Gonzalez-Fernandez
A.
Antibody-conjugated
nanoparticles for biomedical applications // Journal of Nanomaterials. 2009. — P. 1-24.
246. Hlavacek A., Bouchal P., Skládal P. Biotinylation of quantum dots for application in
fluoroimmunoassays with biotin-avidin amplification // Microchimica Acta. 2012. — V. 176,
No 3-4. — P. 287-293.
247. Shi C., Huang X.Y., Dong C.Q., Chen H.J., Ren J.C. Interaction of CdTe/CdS quantum
dots with antibodies // Chinese Chemical Letters. 2009. — V. 20, No 9. — P. 1119-1122.
248. Pereira M., Lai E.P. Capillary electrophoresis for the characterization of quantum dots
after non-selective or selective bioconjigation with antibodies for immunoassay // Journal of
Nanobiotechnology. 2008. — V. 6, No 10. — P. 1-15.
249. Qdot® ITK™ carboxyl quantum dots. Waltman: Thermo Fisher Scientific, 2010. — 5
p.
250. Yang H., Li D., He R., Guo Q., Wang K., Zhang X., Huang P., Cui D. A novel quantum
dots-based point of care test for syphilis // Nanoscale Research Letters. 2010. — V. 5, No 5.
— P. 875-881.
251. Pinwattana K., Wang J., Lin C.T., Wu H., Du D., Lin Y., Chailapakul O. CdSe/ZnS
quantum dots based electrochemical immunoassay for the detection of phosphorylated bovine
serum albumin // Biosensors and Bioelectronics. 2010. — V. 26, No 3. — P. 1109-1113.
252. Hua X.F., Liu T.C., Cao Y.C., Liu B., Wang H.Q., Wang J.H., Huang Z.L., Zhao Y.D.
Characterization of the coupling of quantum dots and immunoglobulin antibodies //
Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2006. — V. 386, No 6. — P. 1665-1671.
253. Wang H.Q., Zhang H.L., Li X.Q., Wang J.H., Huang Z.L., Zhao Y.D. Solubilization
and bioconjugation of QDs and their application in cell imaging // Journal of Biomedical
Materials Research. Part A. 2008. — V. 86, No 3. — P. 833-841.
254. Goldman E.R., Medintz I.L., Hayhurst A., Anderson G.P., Mauro J.M., Iverson B.L.,
Georgiou G., Mattoussi H. Self-assembled luminescent CdSe-ZnS quantum dot bioconjugates
prepared using engineered poly-histidine terminated proteins // Analytica Chimica Acta.
2005. — V. 534, No 1. — P. 63-67.
202
255. Niemeyer C.M. Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: biotechnology meets
materials science // Angewandte Chemie International Edition. 2001. — V. 40, No 22. — P.
4128-4158.
256. De Roe C., Courtoy P.J., Baudhuin P. A model of protein-colloidal gold interactions //
Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1987. — V. 35, No 11. — P. 1191-1198.
257. Dorfs D., Krahne R., Falqui A., Manna L., Giannini C., Zanchet D. 1.08 – Quantum
dots: synthesis and characterization // In: Comprehensive Nanoscience and Technology
Editors-in-Chief: David L.A., Gregory D.S., Gary P.W. — Amsterdam: Academic Press,
2011. — P. 219-270.
258. Sattler K.D. Handbook of Nanophysics: Nanoparticles and Quantum Dots. London:
Taylor & Francis, 2010. — 716 p.
259. Hoshino A., Fujioka K., Oku T., Suga M., Sasaki Y.F., Ohta T., Yasuhara M., Suzuki
K., Yamamoto K. Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum
dots depend on their surface modification // Nano Letters. 2004. — V. 4, No 11. — P. 21632169.
260. Liu W., Choi H.S., Zimmer J.P., Tanaka E., Frangioni J.V., Bawendi M. Compact
cysteine-coated CdSe(ZnCdS) quantum dots for in vivo applications // Journal of the
American Chemical Society. 2007. — V. 129, No 47. — P. 14530-14531.
261. Derfus A.M., Chan W.C.W., Bhatia S.N. Intracellular delivery of quantum dots for live
cell labeling and organelle tracking // Advanced Materials. 2004. — V. 16, No 12. — P. 961966. —
262. Siejak P., Fra̧ckowiak D. Spectral properties of fluorescein molecules in water with the
addition of a colloidal suspension of silver // Journal of Physical Chemistry B. 2005. — V.
109, No 30. — P. 14382-14386.
263. Cook A., Le A. The effect of solvent and pH on the fluorescence excitation and
emission spectra of solutions containing fluorescein // Journal of Physical Chemistry Lab.
2006. — V. 10. — P. 44-49.
264. Magde D., Wong R., Seybold P.G. Fluorescence quantum yields and their relation to
lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for
quantum yields // Photochemistry and Photobiology. 2002. — V. 75, No 4. — P. 327-334.
203
265. Gvishi R., Reisfeld R., Burshtein Z. Spectroscopy and laser action of the “red
perylimide dye” in various solvents // Chemical Physics Letters. 1993. — V. 213, No 3-4. —
P. 338-344.
266. Lumogen® F Red 300. Ludwigshafen: BASF. 1997. — 6 p.
267. Бутенин А.В., Коган Б.Я., Гундобин Н.В. Определение абсолютного квантового
выхода флуоресценции растворов родамина 6Ж колориметрическим методом с
использованием перестраиваемого лазера на кристалле // Оптика и спектроскопия.
1979. — Т. 47. № 5. — C. 1022-1024.
268. Rapid Lateral Flow Test Strips. Billerica: Millipore, 2006. — 41 p.
269. Gopinath S.C.B. Biosensing applications of surface plasmon resonance-based Biacore
technology // Sensors and Actuators B: Chemical. 2010. — V. 150, No 2. — P. 722-733.
270. Lees E.E., Gunzburg M.J., Nguyen T.L., Howlett G.J., Rothacker J., Nice E.C.,
Clayton A.H., Mulvaney P. Experimental determination of quantum dot size distributions,
ligand packing densities, and bioconjugation using analytical ultracentrifugation // Nano
Letters. 2008. — V. 8, No 9. — P. 2883-2890.
271. Sang F.M., Huang X.Y., Ren J.C. Characterization and separation of semiconductor
quantum dots and their conjugates by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2014. —
V. 35, No 6. — P. 793-803.
272. Song F., Chan W.C. Principles of conjugating quantum dots to proteins via
carbodiimide chemistry // Nanotechnology. 2011. — V. 22, No 49. — P. 494006.
273. Голубев С.С., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Кононогов С.А., Кудеяров Ю.А.,
Попов В.О. Метрологическое обеспечение систем быстрой медицинской диагностики
// Метрология. 2012. — № 10. — C. 5-13.
274. Consolidated version of Commission Regulation (EU) No 37/2010 of December 2009
on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue
limits in foodstuffs of animal origin.
275. Технический регламент Таможенного союза 021/2011. О безопасности пищевой
продукции.
276. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Sveshnikov P.G., Dzantiev
B.B. Pretreatment-free immunochromatographic assay for the detection of streptomycin and
its application to the control of milk and dairy products // Analytica Chimica Acta. 2011. —
V. 701, No 2. — P. 209-217.
204
277. Sakharov I.Y., Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Advantages of soybean
peroxidase over horseradish peroxidase as the enzyme label in chemiluminescent enzymelinked immunosorbent assay of sulfamethoxypyridazine // Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 2010. — V. 58, No 6. — P. 3284-3289.
278. Bennich H., Rowe D.S., Tackett L., Ishizaka K., Johansson S.G., Anderson S.G. A
research standard for human serum immunoglobulin E // Bulletin of World Health
Organization. 1970. — V. 43, No 4. — P. 609-11.
279. Expert Committee on Biological Standartization Twenty-Fifth Repot // 1973. Geneva:
World Health Organization. — P. 10-11.
280. Blank U. The mechanisms of exocytosis in mast cells // Advances Experimental
Medicine and Biology. 2011. — V. 716. — P. 107-122.
281. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д., Кандрор В.И. Иммунология. // M.: Мир, 2000ю
— 582 c.
282. Kadooka Y., Idota T., Gunji H., Shimatani M., Kawakami H., Dosako S., Samori T. A
method for measuring specific IgE in sera by direct ELISA without interference by IgG
competition or IgG autoantibodies to IgE // International Archives of Allergy and
Immunology. 2000. — V. 122, No 4. — P. 264-269.
283. Johansson S.G. The history of IgE: From discovery to 2010 // Current Allergy and
Asthma Reports. 2011. — V. 11, No 2. — P. 173-177.
284. Бызова Н.А., Сотников Д.В., Жердев А.В., Андреев И.В., Санков М.Н.,
Мартынов
А.И.,
Дзантиев
Б.Б.
Иммунохроматографический
анализ
уровня
специфического сыворотчного IgE человека для диагностики аллергии на пыльцу
тимофеевки луговой // Иммунология. 2010. — Т. 31. № 1. — C. 47-51.
285. Сотников Д.В., Бызова Н.А., Староверова Н.П., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.
Применение иммунохроматографического анализа для серодиагностики бруцеллеза
крупного рогатого скота // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные
животные. — 2013. № 3. — C. 15-18.
286. Giannini A.J. Drugs of Abuse. Rocklin: Practice Management Information Corp.,
1997. — 313 p.
287. Oku Y., Kamiya K., Kamiya H., Shibahara Y., Ii T., Uesaka Y. Development of
oligonucleotide lateral-flow immunoassay for multi-parameter detection // Journal of
Immunological Methods. 2001. — V. 258, No 1–2. — P. 73-84.
205
288. Urusov A.E., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Advantages of the use labeled secondary
antibodies in competitive lateral flow assay: A case study for aflatoxin B1 // Microchimica
Acta. 2014. — DOI 10.1007/s00604-014-1288-4.
289. Иванец Н.Н., Тюльпин Ю.Г., Чирко В.В., Кинкулькина М.А. Психиатрия и
наркология: учебник [для студентов]. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. — 829 с.
290. Wilson D.S., Nock S. Functional protein microarrays // Current Opinion in Chemical
Biology. 2002. — V. 6, No 1. — P. 81-85.
206