1 влияние жизнедеятельности бактерий на коррозионное
advertisement
1 ВЛИЯНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ НА КОРРОЗИОННОЕ РАЗРУШЕНИЕ МЕТАЛЛОВ 1.1 Основные характеристики микробиологической коррозии, происходящие в трубопроводах Традиционный подход к коррозионным явлениям предполагает рассмотрение состояния разрушающегося металла и коррозионной среды, а также их взаимодействия. Применительно к биокоррозии металлов свойства биологически активных сред, имеющих практическое значение, изучены удовлетворительно. По-видимому, это обусловлено тем, что до самого последнего времени проблемой биокоррозии занимались в основном специалисты-биологи. Прогресс науки о коррозии металлов непосредственно связан с развитием электрохимических представлений о механизме этого физико-химического процесса. В основе современной электрохимической теории коррозии металлов лежит представление о взаимной независимости анодной и катодной реакций, составляющих процесс коррозионного разрушения металла в растворах электролитов. Скорости этих реакций, а, следовательно, и скорости коррозионного процесса при прочих равных условиях (температура, состав коррозионно-активной среды) однозначно определяются значением электродного потенциала, что является основным признаком электрохимического растворения металла. Анодная реакция, собственно и обуславливающая материальные потери в коррозионном процессе, заключается в ионизации металла с последующим переходом иона в раствор. В катодной реакции освобождающиеся электроны, ассимилируются определенными компонентами среды, например ионами водорода или растворенным кислородом. Принципиальная возможность протекания этих реакций в указанном направлении определяется соотношением между обратимым потенциалом соответствующей реакции (рассчитываемым по термодинамическим данным) и электродным потенциалом металла в заданной по составу и температуре среде. В частности, реакция ионизации металла реализуется лишь при условии, что электродный потенциал положительнее обратимого потенциала. В области потенциалов, отрицательнее обратимого потенциала (области коррозионной иммунности), протекает процесс восстановления ионов. Зависимости скоростей анодного и катодного процессов, которые могут быть выражены в единицах тока, от потенциала носят название поляризационных характеристик металла (3). Различают два основных типа анодных поляризационных характеристик – непассивирующихся и пассивирующихся систем «металл-электролит». В непассивирующейся системе смещение электродного потенциала в положительном направлении (обусловленное внешней анодной поляризацией или введением в среду окислителей) всегда сопровождается увеличением скорости растворения металла. В пассивирующейся системе увеличение скорости растворения металла с облагораживанием потенциала наблюдается лишь до определенного его значения – потенциала пассивации. Дальнейшее облагораживание потенциалов ведет к снижению скорости растворения металла вследствие образования на его поверхности пассивирующих слоев. Тип и параметры анодной характеристики определяются природой металла, кислотностью, температурой и составом среды. На катодную характеристику помимо этих факторов существенное влияние оказывают содержание и природа окисляющего реагента среды. В условиях самопроизвольного растворения металла (в отсутствии наложения внешнего тока) скорость коррозионного процесса определяется потенциалом, при котором число электронов, высвобождающихся при переходе ионов металла в раствор, равно числу электронов, ассимилируемых окислительным компонентом коррозионной среды, то есть потенциалом, отвечающим точке пересечения анодной и катодной характеристик данного металла. Этот потенциал определяется как потенциал коррозии. Способность к пассивации определяет устойчивость металлов и сплавов в различных коррозионно-активных средах к общей (равномерной) коррозии. Однако в определенных условиях (состав среды, температура, потенциал) пассивирующиеся металлы и сплавы подвержены опасным видам локализованных коррозионных разрушений – питтинговой, щелевой и межкристаллитной коррозии и коррозионному растрескиванию. Повышенная опасность локализованных коррозионных разрушений обусловлена высокими скоростями локального растворения металла. Это может привести к быстрому выходу из строя оборудования и конструкций вследствие сквозной перфорации. При этом общие материальные потери металла в коррозионном процессе незначительны. Установлено, что все виды локализованных коррозионных разрушений протекают по электрохимическому механизму. Основным признаком этого является наличие критического потенциала (или определенной области потенциалов), положительнее которого (или в пределах которой) может развиваться локализованная коррозия. Локализованной коррозии подвержены различные металлы и сплавы, в том числе нержавеющие стали, широко используемые в качестве конструкционного материала в различных отраслях промышленности. Хотя наиболее достоверным методом коррозионных испытаний являются натурные, то есть испытания в эксплуатационных условиях, в большинстве случаев коррозионное поведение металлов приходится прогнозировать на основании теоретических соображений, ускоренных испытаний и электрохимических исследований. Располагая, в частности, зависимостью скорости коррозии данного сплава в заданной среде от потенциала, а также кинетической зависимостью электродного потенциала, можно довольно точно предсказывать скорости коррозии при различных вариациях физико-химических параметров коррозионной среды (4). Разумеется, что такой метод применим и для оценки скорости коррозии в биологически активных средах. Иллюстрацией использования электрохимических методов могут служить данные по сравнительной оценке устойчивости стали 4X13 в двух биологически активных средах. Значения электродного потенциала стали в контрольной (стерильной) питательной среде и в присутствии культуры Trichoderma lignorum находятся в пределах пассивной области, установленной при измерении анодных характеристик, что свидетельствует об отсутствии влияния этих грибов на коррозионную устойчивость стали. В присутствии грибов Aspergillus niger потенциал стали достигает значений, при которых, согласно анодной характеристике, скорость коррозии резко возрастает и поэтому в этих условиях использовать сталь 4X13 нецелесообразно. Поскольку развитие микроорганизмов может значительно изменять физико-химические характеристики среды, постольку биологически активные среды могут заметно влиять как на анодный и катодный процессы, так и на формирование защитных и пассивирующих слоев на поверхности металла. Изменение рН среды, являющееся, как правило, следствием жизнедеятельности микроорганизмов, вызывает существенные изменения скорости коррозии и электрохимических характеристик. Например, скорость коррозии алюминиевого сплава в присутствии Aspergillus niger возрастает в десятки раз. Как было установлено из поляризационных кривых, пассивная область, характерная для алюминиевого сплава в контрольной среде, заметно сокращается в присутствии этих организмов. Это объясняется тем, что устойчивость алюминия и его сплавов обусловлена наличием на его поверхности защитной оксидной пленки, которая устойчива лишь в нейтральных и слабощелочных средах. Подкисление среды, вызываемое Aspergillus niger, приводит к нарушению этой пленки и интенсивному разрушению сплава (5). Важное значение для теоретического обоснования процессов коррозии и защиты металлов имеет развитие представлений об участии анионов коррозионно-активной среды в анодной реакции растворения металлов. Согласно ранее существовавшим представлениям, в электрохимической стадии анодной реакции образуются ионы металлов, переходящие в раствор, а участие компонентов среды, в том числе анионов, сводится к последующему их взаимодействию с этими простыми ионами. Однако детальные исследования показали, что во многих случаях анодное растворение протекает через стадию образования поверхностного, так называемого переходного комплекса металла с анионом среды, переходящего в раствор по электрохимической реакции (4). Участие анионов в анодном процессе проявляется в увеличении скорости растворения металла с повышением концентрации в растворе. В связи с этим при анализе коррозионной активности биологических сред необходимо учитывать также природу накапливающихся продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Иллюстрацией может служить значительная интенсификация коррозии свинца в среде Aspergillus niger. В этой среде образцы свинца полностью растворялись за 15 суток, в то время как в контрольной среде не отмечено коррозионных потерь. Высокая скорость коррозии свинца в среде с Aspergillus niger интерпретируется как следствие очень высокой растворимости соединений свинца с анионами органических кислот, которые выделяют микроорганизмы, что препятствует формированию защитных слоев. Рассматривая этот пример, следует дополнительно учитывать, что речь идет о свинце, высокая коррозионная стойкость которого в кислотах (включая концентрированную серную) широко известна, он находит практическое использование в химической и других отраслях промышленности [ (5), (6)]. Другим примером, свидетельствующим о необходимости строгого учета природы продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, может служить анализ коррозионной активности такой хорошо известной и исследованной культуры, как бактерии Thiobacillus thiooxcidans. Согласно данным электрохимических измерений, анодные и катодные характеристики стали 10ХСНД в среде, содержащей эти бактерии, и в модельной среде (полученной подкислением стерильного питательного раствора серной кислотой до значения рН культуральной среды) практически близки. Однако в присутствии бактерий скорость коррозии стали оказалась примерно в 5 раз выше, чем в модельной среде. Методом измерения зависимости «потенциал-коррозия» удалось установить, что это является следствием интенсификации анодного процесса стали, не связанной с серной кислотой. Вероятной причиной этого может служить наличие среди продуктов жизнедеятельности бактерии неизвестного пока реагента – стимулятора анодного процесса. Установлена еще одна особенность этой системы, проявляющаяся в наличии так называемого объемного эффекта в среде с бактериями и его отсутствии в модельном растворе. Увеличение объема среды с бактериями примерно в 6 раз при заданной поверхности образца ведет к интенсификации коррозионного процесса более чем в 3 раза. Для интерпретации этого явления в настоящее время проводятся дополнительные исследования (7). Следует однако отметить, что в коррозионных средах, не содержащих микроорганизмов, объемный эффект обычно связывают с накоплением продуктов коррозии металла. Природа анионов среды оказывает влияние не только на интенсивность коррозионного процесса, но и на характер (степень) локализации коррозионного разрушения. Большинство металлов и сплавов в присутствии определенных анионов, в том числе анионов органических соединений, подвержены одному из указанных выше видов локализованных коррозионных разрушений. Наиболее известными стимуляторами локализованной коррозии являются анионы хлора, брома и йода. Однако в последнее время выявляется все большее количество анионов, способных приводить к локализации коррозионного процесса. В частности, при определенных условиях нержавеющие стали подвержены питтинговой коррозии в растворах уксусной кислоты. С учетом существующих теорий локализованных видов коррозии можно ожидать заметной интенсификации коррозионного процесса в локальных очагах, например, по автокаталитическому механизму. Зарождение локальных очагов коррозии, не связанное первоначально с присутствием микроорганизмов, может приводить к локальным изменениям среды, благоприятствующим их развитию. В свою очередь, в процессе жизнедеятельности микроорганизмов могут накапливаться реагенты, стимулирующие локальный коррозионный процесс. Естественно, что возможны условия, в которых микроорганизмы будут выделять реагенты, непосредственно вызывающие локализацию коррозионного процесса. Идентификация продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и классификация последних по этому признаку позволили бы использовать накопленный коррозионистами значительный опыт научно обоснованного выбора оптимальных конструкционных материалов, предназначенных для работы в самых различных средах, применительно к той или иной биологически активной среде. Кроме того, информация о продуктах метаболизма, направлениях и предельных границах изменения характеристик среды микроорганизмами может значительно упростить коррозионные испытания и исследования, так как позволит чисто химическим путем моделировать условия, возникающие в биологически активных средах. Исторически сложилось, что основным объектом исследования биокоррозии металлических материалов было железо и низколегированные стали. Это, с одной стороны, очень усложнило задачу исследователей, так как железо подвергается значительной коррозии в естественных средах и в отсутствии биологически активных составляющих. С другой стороны, наиболее важные современные технические объекты сооружают из высоколегированных сталей, алюминия, титана и других материалов, биокоррозия которых практически не изучена. Это вызывает необходимость тщательной проверки основных металлических конструкционных материалов на биостойкость в различных биологически активных средах. Это направление исследований представляет и самостоятельный интерес для биологов, поскольку продукты коррозии ряда металлов могут быть ядами для микроорганизмов (например, медь, олово) или, наоборот, стимуляторами их развития (предположительно кобальт, молибден и другие) (8). Установлено, что сероводород и углекислый газ, продукты метаболизма СВБ, вызывают интенсивные процессы коррозии оборудования, связанного с системой добычи и переработки нефти и газа. Сероводород, реагируя с металлами, образует сернистое железо. Поверхность металла подвергается питтинговой и язвенной коррозии. Язвы покрываются сверху рыхлыми продуктами коррозии, преимущественно состоящими из сернистого железа и гидрата закиси железа. В присутствии кислорода коррозионные бугорки покрываются корочкой, состоящей из гидрата окиси железа. Под слоем продуктов коррозии СВБ углубляются в металл и разрушают его до сквозных отверстий. Отложение сернистого железа на поверхности оборудования и трубопроводов способствует возникновению гальванических пар (анода и катода). Сернистое железо при этом служит катодом, чистая поверхность разрушаемого металла - анодом. Двуокись углерода снижает рН, что препятствует образованию на поверхности металла защитной пленки. Пленка окислов становится рыхлой и легко смывается потоком жидкости. Снижение рН вызывает усиление химической коррозии металла. Сероводород, взаимодействуя с ионами железа, образует нерастворимый сульфат железа и, одновременно, мигрируя в зоны с окисленным режимом, окисляется до элементарной серы. Углекислота, выделяющая при окислении парафинов и восстановлении сульфатов, способствует выпадению вторичного кальцита. Таким образом, при восстановлении сульфатов СВБ усиливается как электрохимическая, так и химическая коррозия промыслового оборудования. Образцы стали в пластовой воде, где развиваются СВБ, подвергаются разрушению в 11-13 раз быстрее, чем в стерилизованной пластовой воде. Потеря в весе образцов металла в 19-20 раз больше при биохимическом восстановлении сульфатов до сероводорода, чем при отсутствии этого процесса. Как известно наличие клеток СВБ является причиной появления биогенного сероводорода, что в свою очередь вызывает сероводородное растрескивание металла трубопровода. На рисунке 1 приведена зависимость изменения скорости коррозии стали 20 во времени в среде, содержащей СВБ. В начальный период скорость коррозии резко возрастает за счет воздействия сероводорода, внесенного в среду вместе с культуральной жидкостью, и высокой минерализации питательной среды. Однако по мере формирования защитных сульфидных пленок (первые 3 суток) коррозия замедляется. В результате жизнедеятельности СВБ концентрация сероводорода в системе возрастает, что приводит к изменению структуры сульфидов, нарушению сплошности пленки. Этот процесс ограничивается стадией восстановления сульфидной пленкой своих защитных свойств. Кроме того, наличие в среде клеток СВБ является причиной сероводородного растрескивания металла под напряжением. Рисунок 1 - Изменение скорости коррозии образцов из стали 20 во времени ( = 300 мг/л) Растворимость сероводорода в водных и углеводородных средах превышает растворимость многих газов и зависит от температуры и парциального давления сероводорода в газовой фазе. Количество сероводорода зависит от количества растворенных в растворе сульфат-ионов. Рисунок 2 – Зависимость концентрации H 2 S от содержания ионов SO 4 2 На рисунке 2 показана зависимость изменения концентрации H 2 S от содержания ионов SO 4 2 (9). Необходимо учитывать, что при воздействии СВБ на металл микроорганизмы принимают участие в наиболее опасной части коррозионных процессов, а именно, в местных коррозионных разрушениях – питтинге, коррозионном растрескивании и так далее, на что указывает характер коррозионных повреждений. Влияние СВБ на процесс коррозии объясняется одним или несколькими из следующих механизмов: - прямое воздействие на скорость анодной или катодной реакции коррозионного процесса; - создание коррозионной среды за счет образования агрессивных по отношению к металлу продуктов метаболизма; - установление условий роста и размножения, при которых создаются концентрационные гальванопары или пары дифференцированной аэрации; - сульфидное растрескивание сталей в средах, содержащих H 2 S как агент, промотирующий наводораживание, как частный случай охрупчивания нагруженных металлических конструкций. Наиболее распространенное объяснение воздействия СВБ на протекание процессов коррозии связано с механизмом катодной деполяризации за счет использования ими в энергетических целях молекулярного водорода, выделяющегося на катоде коррозирующей стали. Сущность этого механизма описывается следующими реакциями: 8 Н 2 О 8 ОН- + 8 Н+ (ионизация воды); 4 Fe 4 Fe2+ + 8 e анод (ионизация железа); Н+ + 8е 8 Н0 катод (образование защитной пленки на катоде, препятствующей дальнейшему растворению металла); Далее в присутствии СВБ: SO 4 + 8 H0 S2- + 4 H 2 O катодная деполяризация (с катода металла). 2- После чего вторичные реакции: Fe2+ + S2- FeS анод; Fe2+ 2 ОН- Fe(ОН) 2 анод, приводят к образованию в качестве продуктов на аноде – сульфида и гидроксида железе, соответственно черного и серого цвета, чем и объясняется темный цвет продуктов коррозии. В пользу приведенной теории свидетельствуют также многочисленные данные об использовании СВБ молекулярного водорода в качестве донора электронов в процессе энергетического обмена. Однако с точки зрения значимости катодной деполяризации в процессе коррозии теория встречает ряд возрождений: стадия удаления водорода не является определяющей в кинетике электродных реакций коррозионного процесса, протекающего на железе благодаря достаточно легкой десорбции водорода с поверхности коррозирующего металла, и не может существенным образом влиять на измерении скорости коррозии металла. Предполагается, что деполяризирующая активность СВБ возникает, главным образом, за счет катодной активности сероводорода, то есть в результате реакции 2 H+ + S2- H2S анод. Этот механизм объясняет увеличение скорости коррозии в подкисленных средах с парами воды и сероводорода, однако критикуется рядом исследований, считающих H 2 S скорее стимулятором сульфидной коррозии или сероводородного растрескивания. Приведенная реакция не отражает истинный механизм процесса и сильно упрощает картину. Усиление коррозии связано не столько с непосредственным влиянием растворенного в электролите H 2 S, сколько со вторичным эффектов, обусловленным действием сульфида железа FeS в качестве эффективного катода. Кроме того, характер коррозии в присутствии СВБ обычно связан с наличием локальных повреждений (питтинги, язвенные поражения) металла, в то время как один H 2 S не вызывает питтингообразования. Состав продуктов коррозии, включающих оксиды и гидроксиды железа, также необъясним с точки зрения этой теории. Экспериментально установлена существенная разница в скоростях протекания процесса с участием H 2 S, поступающего в сферу реакции химическим путем и продуцируемого микроорганизмами. По-видимому, эта разница объясняется участием в коррозии метаболитов (продуктов активной жизнедеятельности СВБ) или вторичных коррозионных продуктов, возникающих при их участии. По следующей теории в качестве деполяризатора рассматривается сульфид железа. Установлено, что сульфид железа FeS сам по себе является анодным деполяризатором. Увеличение скорости коррозии при анодной деполяризации связано с функционированием FeS в качестве катода по отношению к анодным участкам железа в местах дефектов пленки. Однако в бесклеточных системах образование сульфидной пленки на металле приводит к резкому снижению скорости коррозии в результате проявления ее защитных свойств и торможения анодного процесса. Лишь дополнительное присутствие значительного избытка ионов Fe2+ в среде или в условиях непрерывной подачи в среду реакции сульфида железа приводит к сохранению высоких скоростей коррозии. Высокие скорости коррозии, обычно пропорциональные количеству сульфидов железа в среде, помимо описанных частных случаев достигаются для железосодержащих сред в условиях нарушения целостности сульфидной пленки или потери ею на отдельных участках своего защитного действия. В этом случае предполагается участие микроорганизмов, что выходит за рамки обсуждаемого механизма и оставляет ему лишь роль «старта» коррозионных процессов. К числу дополнительных факторов, определяющих потерю защитных свойств сульфидных пленок, следует отнести следующие: 1. Экстремально высокое накопление сульфидов в среде, когда происходит смена первоначальной тонкой, плотной пленки сульфидов с выраженным защитным действием на рыхлый слой продуктов коррозии. Рентгеноструктурный анализ продуктов коррозии установил, что при низких концентрациях сероводорода (до 2 мг/л) в состав пленок входит троилит FeS и пирит FeS 2 с размерами кристаллов до 200 Ǻ. При концентрациях H 2 S от 2 до 20 мг/л дополнительно появляется небольшое количество кансита FeS. При накоплении H 2 S от 20 до 600 мг/л в продуктах коррозии преобладает кансит и снижается содержание троилита. Размеры кристаллов при этом увеличиваются до 750 Ǻ. Сульфиды при рН 6,5-8,5 состоят в основном из кансита и обладают минимальными защитными свойствами; 2. Старение защитной пленки в условиях продолжающегося воздействия СВБ. Многими авторами [ (4), (5), (8)] отмечена потеря со временем защитных свойств сульфидных пленок в природных условиях или в непрерывной культуре СВБ. При этом воздействие микроорганизмов можно объяснить качественными особенностями формирования продуктов коррозии в присутствии СВБ. В результате разработки теории коррозионных метаболитов выдвинута новая гипотеза, согласно которой основную роль в процессах биокоррозии играют продуцируемые СВБ коррозионные метаболиты, отличные от сульфидов железа. Так, образование темных продуктов коррозии происходит не за счет реакции с сульфидами, а за счет присутствия фосфидов железа. Последние появляются в среде как результат восстановления фосфатов микрофлорой до фосфористого водорода и сильно ускоряют коррозию, если реагируют с железом до появления сульфидов. Таким образом, судьба металла при коррозии, будет зависеть от того, какие продукты метаболизма прореагируют с железом первыми – сульфидионы, образующие защитную пленку, или фосфид-ионы, продукты реакции которых с железом не обладают защитными свойствами. С этой точки зрения роль ионов железа в стимулировании коррозии объясняется ингибированием образования сульфидной пленки и обеспечением доступа фосфидов железа к поверхности металла. Этот механизм удовлетворительно объясняет развитие процессов именно локальной коррозии. Накопление сульфидов линейно зависит от концентрации основных питательных субстратов сульфатредукции – органического вещества и сульфатов. Известно, что сероводород восстановленные соединения серы являются мощными промоторами наводораживания металла. В настоящее время в нефтегазовой промышленности установилось общее мнение, что главная опасность при воздействии сероводородсодержащих сред заключается не в увеличении скорости коррозии, а в усилении процесса наводораживания стали, приводящем к охрупчиванию и коррозионному растрескиванию металла оборудования нефтяных и газовых объектов. Установлено, что коррозия и водородное охрупчивание промыслового оборудования протекают очень интенсивно при наличии влаги по механизму электрохимической коррозии. Необходимым условием наводораживания стали при электрохимической коррозии является выделение H 2 – водородная деполяризация. Термодинамическая возможность этого процесса определяется соотношением величин обратимых потенциалов железа и водородного электрода, то есть необходимо соблюдение следующей зависимости: E0 Fe / Fe 2 обр. E0 . Н /Н обр. Учитывая, что равновесные потенциалы наводораживания и выделения газообразного водорода в большинстве практических случаев мало различаются, было предложено следующее условие этого процесса: E0 Fe / Fe 2 обр. E0 Н / Fe( Н ) обр. . Водородное охрупчивание в условиях статического нагружения металла приводит к снижению его длительной прочности. Это явление называют статической водородной усталостью или при наводораживании в сероводородсодержащих средах – сульфидным растрескиванием. Кроме того, наводораживанию способствуют и другие серные соединения – SO 2 , Na 2 S, коллоидная сера. Представления о влиянии H 2 S на электродные реакции основаны на предположении образования промежуточных соединений, играющих роль поверхностных катализаторов. Подобным образом можно объяснить не только стимулирование наводораживания, но и активизацию сероводородной коррозии. На образцах водородного зонда экспериментально установлено, что большая часть водорода находится в металле в молекулярной форме, причем давление в металле достигает 30 МПа и выше. Помимо металлургических факторов, влияющих на прочность стали и подверженность ее сульфидному растрескиванию, очень большое значение имеет локальный характер коррозии. Водород имеет тенденцию концентрироваться в зоне локальных максимальных трехосных повреждений, находящихся на некотором расстоянии от вершины трещины. Сходным образом при питтинге анодные участки, фиксированные на дне пар в защитной пленке, покрытые слоем продуктов коррозии, могут являться точками концентрации водорода, где его парциальное давление очень велико. Помимо внутренней коррозии при транспортировке сероводородсодержащих нефтей и газов подобные условия могут реализоваться при катодной защите трубопроводов в условиях их контакта с H 2 S, поступающим при активной почвенной сульфатредукции. Несколько иным образом представлен механизм коррозии с участием СВБ в работах других авторов. Биогенный H 2 S уменьшает водородное перенапряжение вследствие протекания процессов H 2 S + H 2 O → HS- + H 3 O+. Ион HS- адсорбируется на поверхности металла Fe0 + HS- → Fe(HS-) адс. . Комплекс Fe(HS-) адс. может взаимодействовать с ионом гидроксония, образуя новый комплекс Fe(HS-) адс. + Н 3 О+ → Fe(H-S-H) адс. + Н 2 О. Этот комплекс затем принимает электроны по уравнению Fe(H-S-H) адс. + ē → Fe(HS-) адс. + Н0 адс. . Доказано, что разряд Н+ по данному уравнению идет значительно легче, чем по уравнению Н 3 О+ + ē → Н0 + Н 2 О. Одновременно с этими процессами на анодном участке происходит разрушение металла в соответствии с реакциями: Fe0 + H 2 S + Н 2 О → Fe(HS-) адс. + Н 3 O+; Fe(HS-) адс. – 2ē- → Fe(HS)+; Fe(HS)+ + Н 3 O+ → Fe2+ + H 2 S + Н 2 О. Каждая из этих реакций протекает с большой скоростью, потому, исходя из представлений о кинетике химических реакций, этот процесс должен осуществляться значительно быстрее, чем процесс без образования промежуточных соединений. Вследствие этого, на катоде с большей скоростью разряжаются ионы водорода, а на аноде происходит ионизация атомов железа, что и ускоряет локальную коррозию, внешне проявляющуюся во множественных язвенных или точечных поражениях, покрытых рыхлой коркой. Состав продуктов коррозии – сульфиды железа, покрытые гидратами закиси и иногда окиси железа (10). Таким образом, механизм стимулирующего коррозию действия СВБ обусловлен в значительной степени не столько непосредственным участием этих бактерий в коррозионном процессе, сколько воздействием продуктов их жизнедеятельности — сероводорода и затем сульфида железа. Поэтому борьба с СВБ означает, в сущности, борьбу с сероводородной коррозией, проявляющейся в специфических условиях. Успех борьбы с сероводородной коррозией в присутствии, СВБ зависит во многом от знания условий формирования биоценоза, особенностей жизнедеятельности СВБ (при добыче, транспорте и подготовке нефти, утилизации сточных вод) и других совокупных факторов. Применение предупредительных мер, направленных на предотвращение развития СВБ с начала разработки нефтяных месторождений, позволит исключить появление сероводорода в добываемой нефти. Поэтому актуальность изучения микробиологической коррозии для нефтяной промышленности и разработка эффективных мер борьбы с ней не вызывает никакого сомнения. 1.2 Составы перекачиваемых сред Подземные воды являются непременным спутником нефти и газа, находясь в тех же самых пластах (коллекторах) [ (11), (12)]. При этом происходит естественное разделение по плотности: самое высокое положение занимает газ, ниже - нефть, а ещё ниже - вода. Помимо пластов, в которых нефть залегает вместе с водой, в разрезах нефтяных и газовых месторождений могут находиться и самостоятельные водоносные горизонты, залегающие выше или ниже нефтяной или газовой залежи. В зависимости от положения подземных вод относительно нефтеносных или газоносных горизонтов их подразделяют на несколько разновидностей: 1) пластовые, залегающие в одном пласте с нефтью и извлекаемые вместе с ней на поверхность. Пластовые воды в свою очередь подразделяются на: а) нижние краевые или контурные воды, залегающие в пониженных частях нефтяного пласта и подпирающие нефтяную залежь; б) подошвенные воды, заполняющие поры коллектора под залежью; в) промежуточные воды, приуроченные к водоносным пластам, залегающим в самом нефтеносном пласте; 2) верхние и нижние воды, приуроченные к водоносным пластам, залегающим выше или ниже нефтеносного пласта; 3) погребенные или реликтовые воды, оставшиеся со времени образования залежи и находящиеся непосредственно в продуктивных пластах нефтяной и газовой части залежи. Эта вода остается неподвижной при движении в пласте нефти, поэтому ее называют также остаточной. Остаточная вода существует в виде адсорбционной, капиллярной и пленочной. Формы существования остаточной воды существенно влияют на нефтеотдачу пластов, что необходимо учитывать при эксплуатации месторождений [ (13), (14), (15)]. Химический состав вод нефтяных и газовых месторождений формируется обычно при затрудненном водообмене и активном воздействии нефти и газа. Поэтому пластовые воды характеризуются разнообразными химическими особенностями. Состав пластовых вод зависит от геологического возраста и химических свойств вмещающих пород, а также нефти и газа. Поэтому пластовые воды, как в пределах одной нефтяной или газовой залежи, так и особенно для разных месторождений, имеют существенные различия в количественном содержании и химическом составе растворенных минеральных солей, газов, компонентов нефти. Изменяются состав и свойства пластовых вод и по мере разработки залежи. Снижение давления, температуры, контакт с другими пластовыми водами, которые происходят в процессе добычи нефти, приводят к дегазации и к нарушению ионных равновесий. Для сравнения химического состава пластовые воды, как и другие природные воды, классифицируют по характерным признакам. Нефтяники нашей страны преимущественно используют классификацию, предложенную В.А. Сулиным (16). По этой классификации воды подразделяются на четыре типа: 1) сульфатно-натриевые; 2) гидрокарбонатно-натриевые; 3) хлоридно-магниевые; 4) хлоридно-кальциевые. Принадлежность воды к определенному типу устанавливается лабораторным анализом соотношения количеств в миллиграмм-эквивалентах отдельных ионов. В свою очередь, каждый тип делится по преобладанию аниона на три группы вод: гидрокарбонатные, сульфатные и хлоридные, а каждая группа включает три подгруппы по преобладанию катиона: натриевые, магниевые и кальциевые (17). Наиболее распространенными среди вод нефтяных месторождений являются гидрокарбонатно-натриевые и, особенно, хлоридно-кальциевые воды. Хлоридно-кальциевые воды характеризуются высокой минерализацией, плотность вод колеблется в широких пределах и достигает 1,2 г/см3. В хлоридно-кальциевых водах содержится значительное количество ионов Na+, Cl-, меньше ионов Са2+ и Mg2+ и ещё меньше CO 3 2-, HCO 3 -. Воды отдельных месторождений могут содержать большое количество железа (до 300 мг/л). Гидрокарбонатно-натриевые воды отличаются меньшей минерализацией, плотность редко превышает 1,07 г/см3. Основными компонентами гидрокарбонатно-натриевых вод являются ионы Na+, Cl-. Отличительной особенностью этих вод является незначительное содержание ионов Са2+. Данные о химическом составе подземных вод [ (18), (19)] лежат в основе гидрогеохимических методов поиска и разведки нефтегазовых месторождений. Прямыми показателями нефтегазоносности является наличие в подземных водах нафтеновых кислот, бензола, фенолов и газов, насыщенных этаном, пропаном, бутаном. Косвенными показателями являются высокая минерализация; низкое содержание сульфат-ионов или полное его отсутствие; наличие хлоридов кальция или гидрокарбоната натрия, высокое содержание йода, брома, бора, иона аммония; повышенная радиоактивность; высокая насыщенность азотом биохимического происхождения и повышенное содержание гелия и диоксида углерода. Низкое содержание сульфат-иона или полное отсутствие его в водах нефтяных месторождений объясняется тем, что присутствие органического углерода создает восстановительные условия в пласте. Процессу восстановления сульфатов (десульфатации) способствуют бактерии-десульфатизаторы, живущие в нефти. Бактерии используют кислород сульфатов для дыхания, а углеводороды служат им источником питания (20). Химические компоненты природных вод по предложению ученого О.А. Алекина условно делят на пять групп (21): 1) главные ионы; 2) растворенные газы; 3) биогенные вещества; 4) органические вещества; 5) микроэлементы. Главные ионы. Число различных ионов, встречающихся в природных водах, велико, но значительное распространение имеют лишь немногие из них. Наиболее распространенные катионы: Na+, Ca2+, Mg2+, анионы NCO- 3 , SO 4 2-, Cl- .Кроме этих шести главных ионов, распространены также ионы СО 3 2-, HSiO 3 -, K+, Fe2+. Однако они встречаются обычно в количествах, в десятки и сотни раз меньших, чем содержание шести главных ионов. Основной источник поступления ионов Ca2+ и Mg2+ в воду растворение пород, содержащих известняки, доломиты, гипс, сложные алюмосиликаты. Наличие гидрокарбонат-иона связано с растворением карбонатных пород под действием диоксида углерода. Сульфат-ионы поступают в природные воды в процессе растворения гипсовых пород, окисления сульфидов, серы и сероорганических соединений (22). Значительное количество сульфат-ионов имеется в водах атмосферных осадков вследствие загрязнения промышленными выбросами. Ионы К+, Na+, Сl- появляются в природных водах при растворении горных пород, содержащих хлориды солей. Ионы хлора в большом количестве выбрасываются при извержении вулканов в виде HCl. В значительном количестве хлорид-ионы содержатся в сточных водах. Концентрация основных ионов в природных водах зависит от степени минерализации (23). В пресных водах преобладают ионы НСО 3 -, Сa2+, Мg2+. По мере увеличения общей минерализации растет концентрация SO 4 2-, Cl-, Na+, K+, Mg2+. В высокоминерализованных водах преобладают ионы Cl-, Na+, реже встречаются Mg2+ и очень редко Ca2+. По количественному содержанию в составе (24) воды первое место всегда занимает какой-нибудь из главных анионов и какой-либо из главных катионов. Поэтому природные воды по химическому составу преимущественно классифицируют на основании преобладающих анионов и катионов. Растворенные газы. Все природные вода содержат растворенные газы: азот, кислород, диоксид углерода, водород, сероводород, инертные газы - гелий, аргон. Присутствие углеводородных газов (метана, этана, пропана) связано с нефтеносными и разовыми месторождениями. Газы в подземных водах находятся в виде молекулярных растворов. Количество растворенного газа в воде характеризуется газонасыщенностью, которая выражается в объёмных единицах – см3/л. Газонасыщенность и химический состав растворенных газов (25) также подвержен гидрохимической зональности. В поверхностных водах преобладает азот, кислород, диоксид углерода. В подземных водах, по мере погружения, среди водорастворимых газов появляется сероводород, гелий, углеводородные газы, растет газонасыщенность. Биогенные вещества. К этой группе относят соединения, необходимые для жизнедеятельности организмов и образуемые ими в процессе обмена веществ. Биогенными веществами являются органические и неорганические соединения азота, фосфора, железа и кремния. Азот. Органические соединения азота представлены белками и продуктами их распада. Под воздействием бактерий-аммонификаторов (26) при разложении белка образуется ион аммония NH 4 +. Иногда в воде присутствуют ионы аммония неорганического происхождения, образующиеся в результате восстановления нитратов и нитритов гумусовыми веществами, углеводородами, сероводородом и так далее. Кремний находится в природной воде в виде растворенной кремниевой кислот в ионов HSiO 3 -, кремнийорганических соединений, а также частиц кремниевой и поликремневых кислот, алюмосиликатов в коллоидном и взвешенном состоянии. Концентрация кремния в природных водах обычно не превышает 10-30 мг/л. Однако в водах нефтяных месторождения может достигать сотен миллиграммов на литр. Соединения кремния вызывают на стенках теплообменной аппаратуры трудноустранимую накипь (27). Соединения железа - содержатся преимущественно в подземных водах. Поступление их в раствор связано с окислением сульфидных руд, содержащих железо, и с растворением железосодержащих руд под действием кислот (угольной, гуминовой и др.). В природных водах железо наездится в виде ионов Fe2+ и Fe3+, комплексных соединений, главным образом органических, коллоидов и взвесей FeS, Fe(OH) 2 , Fe(OH) 3 . Обычно содержание железа не превышает нескольких десятков миллиграммов в 1 л воды. Наличие соединений азота, фосфора, железа в воде, используемой для промышленных нужд, нежелательно, так как они способствуют развитию микроорганизмов в трубах, оборудовании. Органические вещества. Химический состав растворенного органического вещества очень сложен и разнообразен. Он включает различные продукты жизнедеятельности организмов, населяющих воды, и гумусовые соединения, образующиеся при разложении их остатков. Водный гумус содержит в основном лигнино-протеиновые соединения, углевода, жиры и воск. В зависимости от размера молекул гуминовые соединения находятся в воде в виде истинных и коллоидных растворов и в виде взвесей. Концентрация органических веществ в природных водах невелика, но может достигать 50 мл/л и выше (28). Особенно много их в болотных водах, водах нефтяных месторождений, а также в сточных водах нефтяных промыслов и ряда промышленных производств. Микроэлементы. В природных водах, кроме основных элементов, содержится большое количество микроэлементов. Микроэлементами принято называть растворенные вещества, содержание которых в воде составляет менее 1 мг/л. Микроэлементы в природных водах могут присутствовать в виде ионов, молекул, коллоидных частиц и взвесей, входить в состав неорганических и органических комплексов. Наибольший интерес из них для инженеровнефтяников и геологов представляют J-, Br-, F-, B, Li, Sr, Ba, радиоактивные элементы, элементы рудообразующих минералов (29). Содержание йода и брома в природных водах колеблется от сотых долей до десятков мг/л. Больше всего йода и брома в водах нефтяных месторождений. 1.3 Типы бактерий вызывающих микробиологическую коррозию В настоящее время можно считать установленным, что из всех микроорганизмов в коррозии наибольшую роль играют бактерии из-за высокой скорости размножения и подвижности в химических преобразованиях. Микроорганизмы могут вызывать коррозию путем непосредственного влияния на кинетику электродных реакций, продуцирования веществ, вызывающих коррозию, создания на поверхности металла условий, которые обусловливают появление концентрационных электрохимических элементов. Данные факторы могут также действовать совокупно [ (30), (31), (32)]. К середине 60-х гг. полагали, что существует около 10 видов сульфатвосстанавливающих бактерий. Благодаря главным образом работам L.L. Campbell, J.R. Postgate, классификация известных видов была пересмотрена и уточнена. Они выделили 2 рода Desulfovibrio и Desulfotomaculum, включающие 8 видов. Недавно описано несколько новых видов. Из почвы Антарктиды выделен вид Desulfotomaculum antarcticus, отличающийся от других мезофильных штаммов Desulfotomaculum способностью сбраживать глюкозу и разжижать желатину. Из озера Ниар выделена неспорообразующая сульфатвосстанавливающая бактерия с необычной морфологией и составом пигментов. Е.П. Розанова выделила из пластовой воды термофильную неспорообразующую бактерию, отнесенную к новому виду Desulfovibrio thermophilus (33), а из отвалов марганцевой руды мезофильную неспорообразующую бактерию, не имеющую десульфовиридина и названную Desulfovibrio baculatus nov. sp. (34). Из морского ила выделена спорообразующая бактерия, использующая ацетат для восстановления сульфата, но не использующая водород, лактат и пируват; бактерия была названа Desulfotomaculum acetoxidans. Классификация сульфатвосстанавливающих бактерий по схеме Постгейта в Кемпбела с добавлением некоторых новых видов приводится в табл. 1. Эта классификация была одобрена Международным комитетом по классификации сульфатвосстанавливающих бактерий. Разделение pp. Desulfovibrio и Desulfotomaculum оказалось возможно проводить на основании ИК-спектров бактерий (35). Для многих штаммов Dm.nigrificans и нескольких штаммов D.vulgaris определены величины содержания Г+Ц в ДНК, которые хорошо совпадали с пределами этих величин для соответствующих родов. Позже отмечалось, что величина молярного процентного содержания Г+Ц у бактерий p. Desulfovibrio при определении ее на основании плавучей плотности ДНК может быть выше на 4-5%, если использовать для перерасчета не формулу Суеока, как это делали G.F. Sounders в соавт., а формулы трех других разных авторов. При этом, например, для D. gigas, получаются величины, сходные с величинами, полученными химическим методом. Величины содержания Г+Ц в ДНК типовых штаммов большинства видов были пересчитаны и исправлены. В.Pace, L.Campbell обнаружили высокую степень гомологии между рибосомальной РНК трех видов p. Desulfovibrio и ДНК D.vulgaris и низкую степень гомологии (38 %) между рРНК бактерий p. Desulfotomaculum и ДНК D.vulgaris. В двух работах рассматривалась возможность использования в качестве таксономического критерия состава фосфолипидов и необычных жирных кислот (36). Выделение новых видов и использование нумерического анализа позволит внести большую ясность в таксономическое положение сульфатвосстанавливающих бактерий. Ниже более подробно рассмотрена физиология тех групп бактерий, которые распространены в нефтяных пластах, принимают участие в окислении органического вещества нефти и прямо или косвенно связаны с процессами биогенной коррозии (37). 1. Железобактерии. К этой группе относят все микроорганизмы поглощающие железо в ионном состоянии и выделяющие его в виде нерастворимых соединений. Наиболее распространены бактерии рода Gallionella, Leptothrix, Crenotrix. Для их развития необходимы определённые условия - величина рН в пределах 4-7, температура от +5 °С до + 40 °С, наличие солей закисного железа. Эти бактерии - аэробные, то есть развиваются только в присутствии кислорода, причём концентрация его не имеет существенного значения. В основной массе железобактерии - это автотрофные микроорганизмы, не требующие для своего развития органических веществ. Источником углерода для них служит растворённая в воде углекислота. Для жизнедеятельности бактерии используют энергию, высвобождающуюся при реакции окисления закисного железа в окисное: 4 FeCО 3 + 6 Н 2 О + О 2 → 4 Fe(OH) 3 + 4 СО 2 + G кал. Энергия этой реакции невелика, что объясняет накопление относительно большого количества железа при незначительном количестве клеток. Поскольку железобактерии поглощают железо только в ионном состоянии, непосредственно металл они разрушать не могут. Однако под слоем отложений создаются весьма благоприятные условия для протекания коррозионных процессов, как за счёт появления областей с различными потенциалами, так и за счёт создания анаэробных условий, способствующих развитию анаэробных сульфатвосстанавливающих бактерий [ (38), (34)]. 2. Денитрифицирующие бактерии Pseudomonas denitrificans и Pseudomonas flourescens. Это гетеротрофные бактерии, восстанавливающие нитраты до свободного азота, причём источником энергии являются органические соединения нефти. Интенсивное развитие гетеротрофов родов Pseudomonas и Bacillus приводит к адсорбции их биомассы на горной породе пористой среды, в результате чего снижается приёмистость, пористость, ухудшается профиль приёмистости скважин (33). 3. Углеводородокисляющие бактерии, находящиеся в нефтепромысловых средах, принадлежат, преимущественно, к роду Pseudomonas. Развитию в недрах нефтяных месторождений СВБ предшествует формирование биоценоза углеводородокисляющих бактерий (УОБ). Эти аэробные микроорганизмы, используя растворенный в закачиваемой воде кислород, окисляют углеводороды нефти и сопутствующего газа с образованием промежуточных продуктов неполного окисления типа спиртов, альдегидов, диоксида углерода и кислот, чем в значительной мере способствуют развитию кислотной коррозии, которые далее в создавшихся анаэробных условиях потребляются СВБ. 4. Тионовые (сероокисляющие) бактерии относятся к роду Thiobacillus и являются крайне коррозионно-опасными. Тионовые бактерии осуществляют окисление различных восстановительных соединений серы до сульфатов и серной кислоты, которая вызывает сильное подкисление окружающей среды. Среди рода Thiobacillus различают несколько видов, являющихся аэробными либо анаэробными формами, автотрофами либо гетеротрофами. Общим признаком этого рода является то, что бактерии получают энергию от окисления неорганических соединений, то есть, являются литотрофами. Наиболее коррозионно-опасными видами тионовых микроорганизмов являются Т. thioparus, T. thiooxidans, T. ferrooxidans (39). Т. thioparus способны окислять сероводород, сульфид кальция, серу, тиосульфат, тетратионат, гидросульфид и некоторые другие соединения. Оптимальные значения рН для роста этих микроорганизмов сдвинуты в щелочную сторону. Они активно развиваются в аэробных условиях при рН 7-8 и способны снизить кислотность среды до рН 4-5. Эти бактерии способны развиваться в сероводородсодержащих средах. Роль тионовых бактерий как фактора коррозии металла сводится не только к образованию серной кислоты. Т. ferrooxidans окисляет закисное сернокислое железо до окисного, являющегося очень агрессивным по отношению к металлическим сооружениям, поскольку оно выступает как активный окислитель. Окисное железо, принимая электроны с поверхности стали или железа, восстанавливается до закисного, которое, в свою очередь, снова окисляется до окисного Т. ferrooxidans. В условиях благоприятных для развития тионовых бактерий процесс образования окисного железа может идти постоянно, вследствие чего существует угроза постоянного разрушения металла под воздействием этого соединения. Следует отметить, что под воздействием тионовых бактерий разрушается не только металл, но и каменные, бетонные сооружения, резиновые материалы. 5. СВБ – основные возбудители анаэробной коррозии стали, железа, и алюминия. Предполагается, что механизм вызываемой ими коррозии заключается в стимулировании катодной деполяризации твердыми сульфидами железа, которые образуются в результате жизнедеятельности бактерий или вследствие потребления ими поляризованного водорода (40). Среди микроорганизмов, участвующих в круговороте серы, ключевое положение занимает группа СВБ, биохимические свойства и высокая активность которых позволяет им вовлекать в биогеохимический цикл серы такое относительно инертное соединение, как сульфат, и использовать, таким образом, связанный кислород для окисления органического вещества. СВБ обнаруживают во многих системах, где имеется проблема образования отложений. Образующиеся сульфиды являются агрессивными по отношению ко многим металлам, применяемым в системах водоснабжения, включая мягкую сталь, нержавеющую сталь и алюминий. О присутствии СВБ свидетельствуют единственные в своем роде ямки травления на поверхности металла, иногда в виде концентрических колец (рисунок 3) (41). Также СВБ, образуя колонию, вызывают сужение рабочего сечения трубопровода (рисунок 4). СВБ особенно большой ущерб наносят нефтедобывающей и газовой промышленности. Активно коррозируют стальные хранилища нефти, топливное оборудование турбореактивных самолетов, трубопроводы и градирни оборотного водоснабжения. Хотя эти бактерии являются анаэробами, но они не погибают от воздуха. Очень часто они образуют ассоциации с азотными слизеобразующими микроорганизмами, которые продуцируют питательные вещества и создают необходимые для них анаэробные условия. Конечными продуктами их анаэробного дыхания является сероводород. Рисунок 3 - Образование коррозионных язв, заполненных объемными продуктами коррозии, в результате воздействия СВБ на стальной трубопровод Рисунок 4 – Сужение рабочего сечения трубопровода при наличии колонии бактерий Процесс подкисления среды может идти до рН 2,0-0,5. СВБ могут развиваться как в пресных, так и в минерализованных средах. Особенно интенсивно они развиваются в призабойной зоне нагнетательных скважин, где складываются благоприятные условия для формирования биоценоза (40). Электрохимическая коррозия металлов под действием СВБ происходит при деполяризации на локальных участках поверхности. В аэробных условиях процесс идет при участии кислорода воздуха. Естественно предположить, что в условиях анаэробиоза коррозия должна прекратиться после поляризации локальных участков. Однако при участии в процессе СВБ имеет место и анаэробная коррозия. В присутствии в среде СВБ основные стадии коррозионного процесса могут быть описаны следующими реакциями: 4 Fe → 4 Fe2+ + 8e- - анодная реакция; 8 Н 2 О → 8 Н+ + 8 ОН- - анодная реакция; 8 Н+ + 8 е- → 8 Н - катодная реакция; 2SО 4 + 8 Н → S2- + 4 Н 2 О - катодная реакция СВБ; Fe + S 2 - → FeS – продукты коррозии; 3 Fe + 6 ОН- → Fe(OH) 2 - продукты коррозии; 4 Fe2+ + SО 4 2- + 4 Н 2 О → FeS + 3 Fe(OH) 2 + 2 ОH- - суммарно. Образующийся при развитии бактерий сульфид железа может способствовать усилению коррозии. СВБ объединены в четыре рода: Desulfomonas, Desulforomonas, Desulfovibrio и Desulfotomaculum (таблица 1). Бактерии из рода Desulfomonas и Desulforomonas способны восстанавливать элементарную серу. Виды бактерий из рода Desulfomonas представлены прямыми неподвижными палочками, не образующими спор, бактерии из рода Desulforomonas обладают одним жгутиком, подвижны, спор не образуют. В основном выделяют 2 рода СВБ (42): 1. Desulfovibrio (D.desulfuricans, D.vulgaris, D.salexigens, D.africanus, D.gigas, D.thermophilus и др.); 2. Desulfotomaculum (Dt.orientis, Dt.nigrificans, Dt.ruminis, Dt.antarcticus и др.). По способу питания СВБ делят на 2 группы. Таблица 1 - Классификация сульфатвосстанавливающих бактерий (31) Признак Desulfovibrio Desulfotomaculum desulf vulga salexi african gigas therm бакт orienti nigri rumi antar urican ris gens us ophil ери s fican nis cticu s us и s s Джо нса Форма вибр вибр вибри сигмов спир пало пало изогн пало пало пало клетки ион ион он идная илла чка чка утая чка чка чка палочк палоч а ка Жгутик один один. один. лофот лофо один один перит пери пери пери и поляр поля поляр рих трих . . рих трих трих трих ный рный ный поля поля рны рный й Споры – – – – – – – + + + + Цитохр c3 c3 c3 c 3 +b+ c3 типа c3 b b b b ом d c Десуль + + + + + + + – – – – фовири дин ГЦ 58,6 64,8 49,2 64,8 64,8 н.д. 62,7 45,1 49,2 49,2 н.д. (мол, %) Рост на: + – – – – – – – + + пируват е без сульфат а холине + – – – – – – без сульфат а малате + + + – + – – и сульфат е формиа + – – + – те и сульфат е ацетате – – – – – – – – – – – и сульфат е Гелофи – – – – – – – – – – – лия Термоф илия Устойч ивость к хибитан у (мг/л) – – – – 0,25 2,5 1000 2,5 – + – – + – 0,25 0,25 1,0 – СВБ первой группы участвуют в разложении простых и сложных субстратов, в том числе белков, жиров, углеводов, клетчатки. В сообществе с углеводородокисляющими бактериями они принимают участие в окислении углеводородов. Таким образом, СВБ для своего развития необходимы как неорганические вещества (соединения серы), так и органические (43). Однако в отсутствие сульфатов некоторые представители этой группы бактерий могут существовать анаэробно, сбраживая пируват. В качестве акцептора электронов (и протонов) вместо соединений серы используется фумарат, восстанавливающийся до янтарной кислоты. Представителями этой группы являются вибрионы рода Desulfovibrio (наиболее широко известны Dv. desulfuricans и Dv. vulgaris) и споровые палочки, несущие множество жгутиков по всей клетке — род Desulfotamaculum. За последние годы среди СВБ обнаружены также бесспоровые палочки. Один из представителей выделен в новый род Desulfomonas, остальные отнесены к Desulfovibrio. Таким образом, морфологически СВБ первой группы относятся к трем типам и соответственно подразделяются на три рода. Представители разных родов имеют определенные отличия в физиологии и биохимии (44). Ко второй группе СВБ принадлежит единственный представитель – Desulfotomaculum acetooxidans. В качестве энергетических субстратов, кроме ацетата, окисляются этанол, пируват, а также яблочная, фумаровая и янтарная кислоты. Источниками углерода для конструктивного обмена являются пировиноградная и янтарная кислоты. Как следует из указанного, ни один известный представитель СВБ не развивается за счет окисления углеводородов. В качестве акцептора электронов (и протонов) или окислителя в энергетических процессах все известные СВБ помимо сульфатов используют сульфит. Ниже рассматриваются окислительно-восстановительный потенциал, рН, соленость, и температура, допускающие развитие СВБ. Эти облигатно-анаэробные микроорганизмы не развиваются в присутствии кислорода, несмотря на то, что клетки в этих условиях могут длительное время сохранять жизнеспособность. Коррозия, протекающая в присутствии СВБ, характеризуется определёнными признаками. На металлической поверхности появляются коррозионные отложения в виде тёмной корки и рыхлых бугорков. Они состоят из сульфидов, карбонатов и гидратов окиси железа и включают многочисленные колонии СВБ. Под слоем отложений быстро развиваются коррозионные поражения в виде питтингов. Сквозная перфорация может происходить в течение нескольких месяцев. В литературе отмечается, что СВБ способны развиваться в интервале рН 4,15-9,92, чистые же культуры СВБ обычно развиваются при рН 5,0-9,5 (45). СВБ развиваются в средах как при отсутствии NaCl, так и при ее наличии в количестве до 25-30 %. Отдельные виды вообще не способны развиваться в отсутствие NaCl – D. desulfuricans и D. salexigens. При этом первый организм требует присутствия в среде иона натрия, а второй – хлора. Оптимальные значения NaCl для культур этих видов колеблются от 2 до 6 %. Высокоминерализованные (220-270 г/л) пластовые воды нефтяных месторождений не способствуют развитию микроорганизмов, в частности СВБ, несмотря на устойчивость многих представителей к наличию NaCl. Диапазон температур, выдерживаемых СВБ, весьма широк. Обнаружены культуры, способные развиваться при 2 °С (Dv. baculatus и Dv. desulfuricans) и при 85 °С (Dv. thermophilus). Известны два вида термофильных организмов – Desulfotomaculum nigrificans с оптимумом 55 и максимумом 70 °С и Desulfovibrio thermophilus с оптимумом 65 и максимумом 85 °С. Мезофильные организмы обладают оптимумом 27-30 °С и максимумом 41 °С. Для развития СВБ необходима также определённая минерализация. Пластовые рассолы, по-видимому, оказывают отрицательное влияние на развитие СВБ не только вследствие высокой величины общей минерализации, но и в результате особенностей солевого состава. С повышением минерализации увеличивается степень метаморфизации пластовых рассолов, растёт содержание Са2+, Mg2+, Br-, J-, воды обогащаются ионами различных металлов. З.А. Кузнецова (30), изучая палеозойские отложения Куйбышевской области, показала, что при высокой минерализации распространение бактерий в пластовых водах ограничивается высоким содержанием Са2+ и Mg2+. СВБ встречались только в тех водах, где значения катионного коэффициента Са2+ + Mg2+/ K+ + Na+ (мг-экв.) - не превышали 0,36 – 0,40. Высокая температура в нефтяных пластах не является препятствием для распространения СВБ. Так, культуры СВБ обнаружены в пробах вод нефтяных пластов Апшерона, где температура достигала 85-91 °С. В этой связи отсутствие их в пластах ряда месторождений с высокой температурой объясняется, вероятно, другими причинами. Устойчивость к высокой температуре может быть связана с повышенным давлением в недрах. Согласно литературным данным одна из культур СВБ способна образовывать сероводород при 104 °С и давлении 100 МПа. Есть сведения о культурах СВБ, сохраняющих жизнеспособность при кипячении в течение 3 ч (46). Выявлена взаимосвязь распространения СВБ с содержанием в пластовых водах растворенных органических веществ. Развитие СВБ на месторождениях ГрозненскоДагестанского нефтяного региона имело место при среднем содержании органического вещества в пластовых водах 9-33 мг/л. При меньшем содержании органических веществ в воде бактерии обнаружены не были. Растворённое органическое вещество может представлять собой углеводороды, масла, азотсодержащие вещества, кислородсодержащие соединения типа нафтеновых, жирных кислот, смол, гуматов. Чаще всего коррозию подземных стальных сооружений вызывают СВБ, относящиеся к роду Desulfovibrio. Реже и при более высоких температурах коррозию может вызывать также род бактерий Desulfotomaculum. Каждый из родов подразделяется на виды. К роду Desulfovibrio принадлежат такие виды бактерий, как D. desulfuricans, D. gigas, D. africans, D. vulgaris. В свою очередь к роду Desulfotomaculum принадлежат два вида – D. arientis и D. nigrificans. По формам клеток эти бактерии представляют собой вибрионы, сигмы и палочки (47). В результате деятельности СВБ на поверхности стальных сооружений образуются отдельные каверны. Продукты коррозии имеют черный цвет и запах сероводорода при извлечении трубы. Они содержат около 40 % двухвалентного железа и 5 % серы в виде сульфидов. Скорость коррозии на металлической поверхности в значительной степени зависит от типа образующейся пленки. При высоком значении рН обычно образуется твердая, хорошо прилегающая защитная пленка. Наличие двухвалентного железа благоприятствует образованию плохо прилегающей пленки, что увеличивает скорость коррозии. Вокруг сооружения грунт обычно принимает черный цвет, что свидетельствует о наличии сульфида железа (48). Кислород. Гибель таких анаэробов, как СВБ, при доступе кислорода объясняют либо нефизиологической реакцией окисления, либо созданием неподходящих окислительновосстановительных условий. Однако существует точка зрения, согласно которой СВБ в присутствии кислорода, не развиваясь, длительное время сохраняют жизнеспособность. Это подтверждается наблюдениями, относящимися к выживанию СВБ не только в условиях жидких культур, но и в микрокаплях среды, распыленных в воздухе, где СВБ сохраняют жизнеспособность в течение двух часов. В природных условиях, где СВБ находятся под защитой почвенных коллоидов, естественных спутников, потребляющих кислород, и продуктов коррозии металла, выживаемость СВБ еще выше – более двух лет в аэробных условиях, в частности в почвах с менее 50 % влажности от полной влагоемкости грунта. Установлено, что некоторые штаммы Desulfovibrio и Desulfotomaculum растут в средах в условиях кислородно-сульфидного градиента, предположительно за счет S 2 O 3 2- и S0, образующихся в результате химического окисления сульфидов. Выживанию СВБ в условиях доступа кислорода должно способствовать наличие у них ферментов каталазы и супероксидисмутазы, ликвидирующих токсичные перекиси, возникающие при действии кислорода. Окислительно-восстановительный потенциал. В природных водах, почвах и нефтях СВБ повсеместно распространены, несмотря на широкое (от +115 до –450 мВ) варьирование потенциала (Eh). По некоторым данным, чистые культуры начинают развиваться от –100 или –80 мВ. Наивысшей скорости роста культура Desulfovibrio vulgaris достигает при Eh 150 мВ и рН 6,95 в условиях минимального сульфидообразования. Уровень окислительновосстановительного потенциала, ниже которого начинается сульфидообразование, значительно варьируется. Так, основные потенциалы сульфидообразования, отмеченные для почв, лежат в интервале от +300 до +250 мВ и ниже +100 мВ, в некоторых случаях –75 мВ, – 150 мВ и даже –200 мВ. При этом предполагается, что сульфиды образуются в микрозонах с более низкими значениями Eh и диффундируют в более окисленные зоны. В условиях интенсивного перемешивания почвенных суспензий обнаружена линейная зависимость скорости сульфатредукции от Eh при всех изученных значениях рН. Установлено, что даже очень тонкие биопленки (12 мкм) достаточно снижают окислительно-восстановительный потенциал для обеспечения возможности роста анаэробов на колонизированной поверхности. Влажность. Почвенная влажность является одним из главных факторов, определяющих уровень развития биогенной сульфатредукции. В аэрируемых, хорошо дренируемых почвах процессы сбалансированы таким образом, что накопление восстановленных соединений серы и других продуктов анаэробного обмена не происходит. Не случайно обнаружено слабое развитие процесса сульфатредукции в почвах Австралии, где менее 1 % почв достаточно увлажнены. В то же время в почвах гидроморфного режима область активности сульфатредукции и господства восстановительных процессов приурочена к зонам постоянного переувлажнения. В ряде работ было показано, что максимальный уровень сульфидогенеза достигался при полном затоплении почвы (100 и 150 % от полной влагоемкости), а при 50 % он снижался за счет преобладания аэробных процессов. При этом уже через 48 часов после начала затопления начинается формирование глеевых и сульфидных горизонтов, мобилизируются окисленные формы железа и марганца, переходят в раствор гуминовые кислоты, накапливаются кислоты органические. Направление почвообразования в значительной степени определяются появляющимися в почвенном растворе сероводородом и содой. При достаточном количестве органического вещества в условиях затопления почв сода не будет накапливаться лишь в гипсоносных отложениях и в случае повышения активности тионовых бактерий, окисляющих сероводород и сульфиды. Показатель кислотности среды (рН). Экспериментально показано, что величины рН и Еh связаны друг с другом линейно. В анаэробных условиях на значение Еh в пределах от – 0,11 до –0,23 мВ при 25 0С приходится единица рН. В условиях лабораторной культуры СВБ способны развиваться в границах рН 6,0-9,0. В природе этот интервал значительно шире (4,210,5). Сообщения о кислотоустойчивых формах, выдерживающих значения рН 1,5-2,0, не подтвердились: в столь кислых условиях сульфид является исходным веществом для сероредукции. Следует отметить, что в коллоидных системах на заряженной поверхности коллоидных частиц эффективный рН ниже, чем в растворе, что объясняет снижение предела выживаемости СВБ (по рН) в условиях почвы, то есть адсорбированные на глинистых частицах бактерии способны пережить большее подкисление среды, нежели клетки в растворе. Особенно благоприятствуют развитию СВБ щелочные почвы. Это обстоятельство существенно и для грунтов в зоне действия катодной защиты магистральных трубопроводов, где отмечается защелачивание. Не случайно СВБ наряду с нитратредукторами и активными аммонификаторами относятся к наиболее устойчивым к воздействию щелочей бактериям, выживающим в средах с не менее 10 рН. Температура. В природе СВБ встречаются при температурах от 0 до 97 0С. При изучении биогенной сульфатредукции океанических осадков в многофакторных опытах с использованием регрессионного анализа некоторые авторы пришли к выводу, что в этих условиях температура является ведущим контролирующим сульфатредукцию фактором. Так, в лабораторных условиях установили, что воздействие температуры в пробах донных осадков (в интервале от 0 до 30 0С) в 2,6 раза более значимо, чем концентрация в среде лактата натрия и в 6,5 раза более значимо, нежели содержание ионов SO 4 2-. Показано, что оптимальные для сульфатредукции в пробах значения температуры лежат в пределах 30-37 0С. Количественный и качественный состав популяций СВБ мало меняется по сезонам. В целом активность процесса летом в 1,5 раза выше, чем зимой. Лишь при резких изменениях параметров среды (аномально высокое – до 15 мг/ 100 г осадков содержание сульфатов) становятся значимыми другие факторы, в частности, количество S / SO 4 2-. В нефтяных пластах температура рассматривается в качестве фактора, регулирующего распространение того или иного вида. В частности, при температуре 80 0С развивается вид Desulfotomaculum thermophilus, а ниже этой температуры, при 60-70 0С – Desulfotomaculum nigrificans. Количество сульфатов. Содержание окисленных соединений серы, главным образом в виде сульфатов, служащих СВБ в качестве акцепторов электронов, - один из основных лимитирующих факторов процесса сульфатредукции. СВБ распространены в природных ареалах со значительно варьирующим уровнем содержания SO 4 2- от 0,15 до 15 %. Нижняя граница содержания сульфатов, лимитирующих сульфатредукцию, обозначена недостаточно четко. СВБ способны выживать в бессульфатных средах при росте на органических соединениях. При этом дисмутируются пируват, фумарат, малат, холин. Кроме того, фумарат служит акцептором электронов у Desulfovibrio gigas и других организмов, восстанавливаясь до сукцината при окислении молекулярного водорода. Вместо сульфатов большинство СВБ способны использовать менее окисленные соединения серы – сульфиты, тиосульфаты и элементарную серу. Также в качестве акцепторов электронов возможен дитионат, тритионат, тетратионат и монооксид серы S 2 O. В почвах при незначительных концентрациях водорастворимых сульфатов от 0,05 до 0,1 % сульфатредукция протекает с использованием менее доступных соединений серы, например гипса и других малоподвижных форм. Однако в этом случае скорость сульфатредукции остается высокой лишь в природных условиях, в условиях лаборатории культуры СВБ нуждаются в длительной адаптации к подобным субстратам. Существенным фактором выживания СВБ являются межвидовые взаимодействия, в частности с метаногенами. В отсутствии сульфатов СВБ осуществляют передачу водорода другим микроорганизмам, играющим роль акцептора. Это реализуется бактериями рода Desulfovibrio и метаногенными спутниками благодаря функционированию гидрогеназ, локализованных в периплазматическом пространстве мембран. Содержание сульфатов оказалось определяющим лимитирующим фактором во многих почвах при их переувлажнении, и к тому же интенсивность процесса сульфатредукции значительно варьировалась, иногда на несколько порядков превышая величины, характерные для илов. Ингибирующего влияния высоких концентраций ионов SO 4 2- на сульфатредукцию в литературе не отмечено. Наличие органического вещества является фактором, наиболее тесно связанным с содержанием сульфатов при контроле почвенной сульфатредукции. Так, опыты с различными почвами Египта в условиях их инкубирования в вегетационных сосудах показали, что повышение содержания сульфатной серы с 0,15-2,75 до 5,68-7,77 мг/ 100 г осадка не повышало уровня накопления сульфидов, в то время как дополнительное внесение 2 % крахмала привело к редукции 90 % внесенных сульфатов. Органическое вещество. К настоящему моменту накоплена значительная информация о физиологии СВБ, которые по своим особенностям могут быть разделены на две группы. Первая группа включает виды, окисляющие органические субстраты до ацетата и СО 2 . Вторая группа объединяет виды, которые полностью окисляют органические вещества до СО 2 . В качестве доноров электронов и углерода СВБ способны использовать большое число органических соединений в процессе редукции сульфатов. Среди субстратов обычны лактат, ацетат, пропионат и другие жирные кислоты (С 2 -С 18 ), некоторые спирты (метанол, этанол, пропанол, бутанол, изобутанол, глицерин), органические кислоты, возникающие в ходе реакций цикла Кребса (малат, фумарат, сукцинат и другие). Кроме того, источником энергии и углерода для некоторых СВБ могут служить аминокислоты (аланин, серин, глицин, фенилаланин, глутамат, глутарат). Установлено, что род Desulfotomaculum nigrificans помимо глюкозы способен усваивать фруктозу. Desulfovibrio могут накапливать это соединение в качестве запасного полимера. Недавно было выяснено, что СВБ способны использовать также дикарбоновые кислоты, соединения ароматического строения (бензоат, фенилацетат, фенол, n-креозол, индол и др.), а также циклогексанкарбоксилат, гиппурат, никотиновую кислоту. Наконец, появились сообщения о СВБ с особым типом метаболизма, использующих до 50 различных сахаров. Установлено, что ацетат является наиболее важным субстратом сульфатредукции в природе, хотя в лабораторной практике многие микроорганизмы в его присутствии проявляют слабый рост. Кроме ацетата, к основным природным субстратам сульфатредукции относятся пропионат, бутират и молекулярный водород. С экологической точки зрения важнейшим субстратом сульфатредукции следует считать молекулярный водород, генерируемый почвенными микроорганизмами и катодно защищаемыми металлами и используемый СВБ в качестве донора электронов наряду с органическими соединениями. Считается, что для протекания сульфатредукции в затопленных почвах должно быть не менее 3 % органического вещества. Однако количество лактата, используемого всеми СВБ лактатной группы, в океанических осадках с интенсивной сульфатредукцией может не превышать 1 мг на 1 г осадка. В течение семинедельных лабораторных опытов 0,8 % органического вещества обеспечивало развитие сульфатредукции в почвах Испании. Модельные опыты показали, что в засоленных почвах в пределах 0,1-2,0 % органического вещества безусловно стимулирующим активность сульфатредукции фактором является сорбция на глинистых почвенных частицах. Прочие факторы. Кроме вышеприведенных факторов, определяющих активность сульфатредукции, заметную роль играют и такие, как содержание ионов Fe2+ и NO 3 - в почве, а также активность сопутствующей микрофлоры. При низких Fe2+ интенсивностях биогенной сульфатредукции количество Fe2+ не лимитирует этот процесс, однако при высоких интенсивностях наступает быстрое насыщение реакционноспособных форм железа, о чем свидетельствует появление свободного сероводорода в донных осадках, который является индикатором лимитации сульфатредукции уровнем ионов Fe2+. При недостатке железистых форм в почвах (10-15 мг/ 100г) сульфатредукция ограничена, несмотря на достаточное количество органического вещества и сульфатов, что свидетельствует о значимости этого фактора. В многочисленных работах отмечено, что почвенная сульфатредукция не начинается прежде, чем в среде не исчезнут нитраты. Это может быть связано как с экстремально высоким для сульфатредукции окислительно-восстановительным потенциалом в случае присутствия ионов NO 3 - так и с конкурентным ингибированием восстановления сульфатов нитратами, способными выступать в качестве акцептора электронов в процессе анаэробного дыхания. При этом в среде происходит накопление ионов аммония и значительное подщелачивание (30). Другим важным фактором, лимитирующим биогенную сульфатредукцию, является активность сопутствующей микрофлоры, причем проявление воздействия этого фактора тесно связано с уровнями каждого из них, рассмотренных выше. Так, контролирующее значение таких факторов, как температура в осадках, дополнительное внесение элементной серы или труднодоступность сульфатов могло быть прежде всего связано с активностью сопутствующей фотосинтезирующей или сероокисляющей микрофлоры. Кроме того, возможно, этот фактор действовал опосредованно, стимулируя появление в среде легкодоступных для СВБ форм органики. Аэробная микрофлора участвует в создании необходимого СВБ окислительно-восстановительного потенциала или же повышает общее количество доступного СВБ органического вещества. Связь сульфатредукции с биогенным углеводородокислением оказывается в ряде случаев столь тесной, что по ее активности предлагают судить об интенсивности биоразрушения нефти в аэробной зоне и контролировать процессы биокоррозии по уровню углеводородокисления. Биохимические воздействие СВБ на металл трубопровода Среди микроорганизмов, участвующих в круговороте серы, ключевое положение занимает группа сульфатвосстанавливающих бактерий, биохимические свойства и высокая активность которых позволяет им вовлекать в биогеохимический цикл серы такое относительно инертное соединение, как сульфат, и использовать таким образом связанный кислород для окисления органического вещества. Распространение в природе и свойства сульфатвосстанавливающих бактерий изучались многими исследователями, В работах 20-30-х гг. заложены основы изучения экологии и геохимической деятельности сульфатвосстанавливающих бактерий в воде и донных отложениях соленых и пресных водоемов. С активностью этой группы микроорганизмов стали связывать генезис и преобразование нефтей, образование месторождений самородной серы и сульфидных руд, отложение соды и карбонатов. 50-60-е гг. характеризовались накоплением новых данных о физиологии и биохимии сульфатвосстанавливающих бактерий, которые позволили улучшить методы их выделения в культивирования. В результате были описаны новые виды бактерий и выяснены многие стороны биохимии процесса сульфатредукции, являющегося cпeцифичecким энepгетичecким пpoцeccoм oкиcлительного типа у этих строгих анаэробов и получившего название диссимиляторной сульфатредукции в отличие от ассимиляторного восстановления сульфата до SH - групп серосодержащих аминокислот. Появление в этот период метода массспектрометрического анализа стабильных изотопов серы S32 и S34 в радиоизотопного метода определения интенсивности сульфатредукции непосредственно в природном материале (49) позволило подойти к количественной оценке геохимической деятельности сульфатвосстанавливающих бактерий, В последние годы получены новые интересные данные по экологии, физиологии и биохимии этих бактерий. Успехи в изучении сульфатвосстанавливающих бактерий регулярно освещаются в зарубежной литературе. В отечественной литературе после довольно устаревшей книги Л.И. Рубенчика (39) не выходило специального обзора, посвященного сульфатвосстанавливающим бактериям. Отдельные стороны жизнедеятельности этих бактерий освещались в книгах С.И. Кузнецова (38), M.В. Иванова (49) и Г.А. Заварзина (50). В настоящем обзоре сделана попытка показать достижения в изучении биохимии сульфатвосстанавливающих бактерий за последние 10-15 лет. 2. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН 2.1. Окисление трех- и четырехуглеродных органических соединений Вполне определенно можно говорить об использовании сульфатвосстанавливающими бактериями для получения энергии 3- и 4-углеродных органических кислот, таких как лактат, пируват, сукцинат, малат и фумарат, а также спиртов этанола, пропанола, бутанола и холина. B. Macpherson и G.D.A. Miller получили также рост D.vulgaris на сахарозе, фруктозе, глюкозе, лактозе, мальтозе, глицерине, метаноле, щавелевоуксусной кислоте и дрожжевом экстракте, но рост на этих субстратах был значительно хуже, чем на лактате. Только некоторые, органические соединения, включая лактат, пируват, фумарат, малат, этанол, пропанол, изобутанол и холин, бактерии могут использовать в качестве доноров электронов для восстановления сульфата. Во всех случаях окисление субстратов неполное и конечным продуктом реакции, как правило, является ацетат: 2СН 3 СНОНСООН + 2Н 2 О → 2 СН 3 СООН + 2СО 2 + 8Н+ 4СН 3 СОСООН + 4Н 2 О → 4СН 3 СООН+4СО 2 + 8Н+ Превращение лактата и пирувата происходит согласно следующей схеме: На первом этапе из лактата образуется пируват. О природе лактатдегидрогеназы у сульфатвосстанавливающих бактерий известно мало, главным образом, из-за, нестабильности фермента. Активная L(+)-лактатдегидрогеназа впервые обнаружена в экстрактах D. gigas (51). Она активна только в связанном с мембраной состоянии. Следующий этап - фосфорокластическое расщепление пирувата до ацетилфосфата, СО 2 и Н+ изучен довольно подробно у видов D.vulgaris, D.desulfuricans и Dm.nigrificans [ (52), (53)]. Для реакции требуются КоА, неорганический фосфат, тиаминпирофосфат и ионы Мg2+ и она стимулируется нуклеотидтрифосфатами. В качестве минорного продукта реакции образуется метан; ЭДТА подавлял реакцию почти полностью, но активность восстанавливалась при добавлении Со2+, Fe2+ или Mn2+. Ферредоксин из клеток Clostridium pasteurianum сцеплял пируватдегидрогеназу и гидрогеназу (54). Для полной активности фосфорокластической системы D.vulgaris в реакции между пируватдегидрогеназой и гидрогеназой требовалось одновременное присутствие ферредоксина и цитохрома С 3 (53). Обменная реакция пируват- СО 2 у D.vulgaris зависела от присутствия фосфата и КоА, но потребность в фосфате исчезала при увеличение концентрации КоА; активность реакции уменьшалась при отсутствии в системе ферредоксина и цитохрома С 3 . Превращение ацетилфосфата в ацетат и АТФ обеспечивает фосфорилирование на уровне субстрата. Фермент ацетокиназа, участвующий в расщеплении ацетилфосфата был очищен из клеток D.vulgaris. Он не зависит от КоА, специфичен в отношении ацетата и не активен с формиатом, пропионатом, бутиратом и сукцинатом. Реакция, катализируемая ацетокиназой, имеет оптимум рН 7,4 и нуждается в ионах Мg2+, Мn2+, Со2+ или Fе2+. ИТФ и слабее ГТФ или УТФ могут замещать АТФ. п-Хлормеркурибензоат подавляет активность ацетокиназы. 2.2. Дисмутация органических соединений Пируват, фумарат, малат и холин могут служить для некоторых штаммов сульфатвосстанавливающих бактерий источником энергии в отсутствие сульфата (55). Когда бактерии растут на пирувате в среде без сульфата, они поддерживают свое существование только за счет энергии, образующейся в результате фосфорокластической реакции. Таким же образом образуется энергия при использовании фумарата и малата, которые включаются в цепь следующим образом: фумараза L-малат: НАД-оксидоредуктаза +Н 2 0 декарбокси лирующая ) фумарат → малат ( пируват -Н 2 0 → ацетилфосфат + CO 2 → ацетат На среде без сульфатов процесс идет по типу реакции Каницарро, когда одна молекула окисляется, а другая восстанавливается и является акцептором электронов. Такие реакции дисмутации фумарата и малата способны осуществлять штаммы D. vulgaris, D.desulfuricans, D.salexigens и D.gigas. В качестве конечных продуктов образовывалась сукцинат, ацетат и фумарат при росте на малате и сукцинат, ацетат и малат при росте на фумарате. Штаммы, способные к дисмутации, отличались от штаммов, не способных к дисмутации, повышенной активностью сукцинатдегидрогеназы, но имели одинаковую активность фумаразы. О ферментах, участвующих в превращении фумарата и малата известно мало. Их активность обнаружена в целых клетках в бесклеточных экстрактах D.gigas, но высокоочищенные ферменты не получены. Конститутивные L-малат: НАДф-оксидоредуктаза (декарбоксилируюшая), известная как малик-фермент, и L-малатгидролиаза (фумараза) катализировали окислительное декарбоксилирование малата до пирувата и гидратацию фумарата до малата. Малик-фермент частично очистили. Он требовал для активности присутствия НАДф+ и ионов Мn2+, активировался ионами К+, не содержал активность оксалацетатдекарбоксилазы и имел величины К m для малата, НАДф+ и пирувата соответственно 6,8•10-5 , 6,2•10-7 и 6,2•10-3 М при рН 7,6. Не подтвердилась гипотеза о расщеплении малата до пирувата через лактат. H.R.Hayward, T.C.Stadtman выделили сульфатвосстанавливающую бактерию, способную расти на холине в присутствии или без сульфата. Впоследствии ее идентифицировали как Desulfovibrio desulfuricans (55). Превращение холина также происходит в реакции дисмутации: 2(CH 3 ) 3 -N+-СН 2 СН 2 ОН+H 2 O→3(CH 3 ) 3 N+H+CH 3 COOH+C 2 H 5 OH c образованием триэтаноламина, ацетата и этанола. Этапы образования АТФ в отсутствие сульфата не известны. В случае наличия сульфатов АТФ, по-видимому, образуется в цепи переноса электронов. Холин не используется в конструктивном обмене, но исключительно служит как донор протонов и источник энергии. 2.3. Использование глюкозы и аминокислот J.M. Akagi, G.Jackson (56) показали, что Dm. nigrificans может использовать глюкозу в рвачестве ростового субстрата. Глюкоза расщеплялась до ацетата, этанола и СО 2 по пути Эмбдена-Мейергофа и по пути Энтнера-Дудорова. По пути Эмбдена-Мейергофа расщеплялось более 90% глюкозы. Путь распада глюкозы: глюкоза → пируват → ацетат + СО 2 Бактерия также расщепляла до ацетата в СО 2 меченные С14 аминокислоты. Как глюкоза, так и аминокислоты использовались только в качестве источника энергии. 2.4. Использование других органических соединений Ряд соединений, используемых сульфатвосстанавливающими бактериями в качестве источника энергии, фактически не являются для них истинными субстратами. Это формиат (41), оксамат и, возможно, СО, которые бактерии предварительно расщепляют до водорода: Из клеток D.vulgaris выделена формиатдегидрогеназа (формиат: феррицитохром С 553 оксидоредуктаза), которая окисляла формиат и восстанавливала цитохром С 553 , несколько отличающийся от цитохрома С 3 . Фермент не реагировал с другими акцепторами электронов, такими как НАД, НАДф, ФАД, ФМН, цитохром С 3 , убихинон и ферредоксин. Активность фермента подавлялась KCN, но не п-хлормеркурибензоатом или о-фенантролином. Формиатдегидрогеназа, частчно очищенная из клеток D.gigas восствнавливала цитохром Сз, бензилвиологен и метиленовый синий. Ферментный препарат, полученный Амблером и соавт., восстанавливал цитохромы С 3 и С 553 из клеток D.vulgaris штамм Hildenborough, а также обладал гидрогеназной активностью (44). Сульфатвосстанавливающие бактерий способны использовать в качестве доноров электронов этанол, пропанол, бутанол и изобутанол. Однако о первичных дегидрогеназах этих субстратов, передающих протоны в электроны цепь, практически ничего не известно. 2.5. Окисление молекулярного водорода Способность сульфатвосстанавливающих бактерий к росту за счет окисления Н 2 сульфатом впервые показана R.L.Starkey, K.M.Wight. Ранее у сульфатвосстанавливающих бактерий была обнаружена гидрогеназа, участвовавшая в восстановлении сульфата до сероводорода в атмосфере Н 2 . Результаты ряда работ, выполненных с меченными С14 органическими соединениями и бикарбонатом [ (57), (42)], показали, однако, что сульфатвосстанавливающие бактерии не способны к автотрофному росту, но могут получать энергию, окисляя Н 2 в присутствии сульфата согласно реакции: 2 4Н 2 + SO 4 → S2- + 4H 2 O Гидрогеназа была выделена и очищена из клеток D.desulfuricans, Dm.ruminis и D.vulgaris. J.M. Akagi, L.L. Campbell (58) обнаружили гидрогеназную активность у Dm.nigrificans. Несколько форм фермента обнаружены как в растворимой фракции, так и во фракции клеточных частиц D.desulfuricans (48) и D.vulgaris. В клетках Dm.nigrificans (58) и Dm.ruminis гидрогеназа была связана с клеточными частицами, оседавшими при 105 000 g. Гидрогеназа содержит негемовое железо (Fe2+), без которого она не активна, и катализирует в атмосфере Н 2 восстановление цитохрома с 3 , ФАД и ФМН в присутствии цитохрома c 3 , а также некоторых красителей с окислительно-восстановительными свойствами. Кроме того, гидрогеназа катализирует образование Н 2 в присутствии пирувата, пируватдегидрогеназы и ферредоксина Clostridium pasteurianum (53) или в присутствии дитионита и цитохрома С 3 . 2 Несколько препаратов гидрогеназы были активны в обменной реакции: Н 2 + Н 2 О H2Н + HOH2, которая происходила в отсутствие переносчиков электронов. L.Yu и M.J.Wolin показали, что фермент катализирует превращение O = H 2 ± n = -Н 2 . Частично очищенная гидрогеназа D.vulgaris окисляла фотохимически восстановленный метилвиологен, но не восстанавливала метиленовый синий в атмосфере Н 2 . В нескольких лабораториях из клеток штамма D.vulgaris Hildenborouqh NCJB8303 (ранее относился к D.desulfuricans) выделены высокоочищенные гидрогеназы. Очищенная почти до гомогенного состояния гидрогенеза имела мол. вес 60 000 и изоэлектрическую точку при рН 6,25, содержала 0,72 % Fe (8 атомов Fe на молекулу), 0,064% Zn и 0,04% Сu. Она катализировала образование Н 2 в присутствии восстановленного цитохрома c 3 или метилвиологена, в атмосфере Н 2 восстанавливала цитохром С 3 и катализировала реакцию обмена. Эта гидрогеназа была одна из пяти, обнаруженных автором у D.vulgcris. R.Hascke и L.L.Campbell очистили растворимую гидрогеназу до гомогенного состояния. Она имела мол. вес 45 000, состояла из 417 остатков аминокислот, содержала 0,74 моля Fe2+ и 0,35 моля кислотолабильного сульфата на моль фермента. Гидрогеназа имела основной абсорбционный пик при 280 нм и меньший при 400 нм, характерные для негемового железа. Еще одна гидрогеназа, очищенная из клеток штамма Hildenborough, по своим свойствам была сходна с гидрогеназами клостридиального типа, имела мол. вес 60 000 и содержала 3,5 атома негемового железа и 3,2 кислотолабильных сульфида на молекулу. Она могла существовать в димерной форме с мол. весом 60 000 и в виде мономера с мол. весом 30 000. Ее диссоциация происходила легче, чем у гидрогеназ клостридиалъного типа, и зависела от концентрации. Спектр характеризовался наличием максимумов при 280 и 400 нм. При восстановлении белка, выделенного в окисленной форме, появлялся ЭПР-сигиал g + 1,86, характерный для содержащих железо и серу (g + 1,90). Гидрогеназа содержала следы молибдена, но не активировалась пермолибдатом и не восстанавливала молибден в атмосфере Н 2 ; очищенный белок катализировал восстановление метил- и бензилвиологена. Получены доказательства, что негемовое железо и лабильнный сульфид участвуют в 2 2 3 активном центре гидрогеназы. Ионы Mn2+, Co2+, Ni2+; Zn2+, Pb2+, MoО 4 , WО 4 , VO 4 , 2 3 CrO 4 , и BO 3 не замещали железо и не давали активность фермента при достаточной концентрации Fe. Соединения, связывающие металлы, п-хлормеркурибензоат, KCN, гидроксиламин и нитрит ингибировали гидрогеназу. Несмотря на большое количество работ по гидрогеназе cульфатвoccтанавливающиx бактерий, физиoлoгичecкая роль этого фермента пока что недостаточно ясна. В клетках D.gigas гидрогеназа локализована в периплазматическом пространстве (59). Высказывались предположения, что гидрогеназа обеспечивает сульфатвосстанавливающие бактерии дополнительным источником протонов за счет молекулярного водорода, особенно принимая во внимание ограниченное количество субстратов, доступных для них. Однако сообщается, что во время роста D.vulgaris на среде с лактатом в атмосфере Н 2 окисление последнего было полностью подавлено. Водород не оказывал никакого видимого эффекта как дополнительный источник электронов на среде с малым содержанием лактата. В опытах с пульсирующей подачей сульфата обнаружили, что в атмосфере Н 2 клетки восстанавливали бесполезно большинство сульфата в peакции связанной с ростом. Тем не менее в атмосфере Н 2 /СО 2 , ростовой выход культуры был значительно выше, чем в атмосфере. Гидрогеназа также участвует в реакциях окисления формиата, оксамата и окиси углерода (41) и в фосфорокластической реакции [ (52), (53)]. 2.6. Промежуточные этапы и ферменты при восстановлении сульфата Известны два пути восстановления сульфатов у живых организмов. Наиболее широко распространен ассимиляторный путь, через который все микроорганизмы и высшие растения восстанавливают сульфат до тиоловых групп, входящих в состав аминокислот и некоторых других соединений. Для ассимиляторного пути восстановления была предложена следующая последовательность реакций: Ассимиляторное восстановление сульфата происходит с затратой энергии и требует АТФ на начальную активацию сульфата. В качестве промежуточных продуктов в большинстве случаев образуются последовательно два серосодержащих нуклеотидааденозин-5'-фосфосульфат (АФС) и аденозин-3’ -фосфат-5'-фосфосульфат (ФАФС). Продуктом восстановления сульфита является сульфид, промежуточных продуктов не обнаружено. Восстановленная форма серы, полученная по этому пути, используется для биосинтеза аминокислот и сероводород не накапливается. Диссимиляторный путь восстановления сульфата, специфичный только для одной физиологической группы бактерий – сульфатвосстанавлнваюших бактерий, характеризуется вовлечением в обмен в 100-1000 раз больших количеств серы, чем при ассимиляторном пути. Фактически диссимиляторная сульфатредукция является процессом сульфатного дыхания и аналогична дыханию с кислородом или нитратом, так как анаэробные сульфатвосстанавливающие бактерии используют сульфат как конечный акцептор электронов. Как и в ассимиляторном пути, сульфат должен быть сначала активирован с помощью АТФ, причем образуется только АФС и не образуется ФАФС. Первый восстановленный продукт сульфит, а восстановление сульфата до сульфита включает 3 этапа: 2 АТФ сульфурила за 1) SO 4 + АТФ АФС + пирофосфат пирофосфат аза 2) пирофосфат + Н 2 О 2 Н 3 РО 4 2 АФС редуктаза SO 3 + АМФ 3) АФС + 2е Наличие АТФ-сульфурилазы, неорганической пирофосфатазы и АФС-редуктазы и образование АФС в качестве промежуточного продукта у сульфатвосстанавливающих бактерий подтверждено рядом исследований. Предполагается, что они имеются у всех сульфатвосстанавливающих бактерий, но их присутствие показано только в нескольких случаях. Образование сульфита в качестве промежуточного продукта при сульфатредукции наблюдали с целыми клетками D.desulfuricans и с бесклеточными экстрактами. АТФ-сульфурилазу [ КФ 2.7.7.4] обнаружили у D.vulgaris штамм Hildenborough [ (60), (51)], Dm. nigrificans (60) и в препаратах АТФазы D.gigas. Бесклеточный экстракт D.vulgaris катализировал образование S35-АФС в реакционной смеси, содержавшей трис-буфер (рН 7,0) 2 и S35О 4 , при отсутствии Н 2 и метилвиологена. Единственный меченый нуклеотид S35-АФС был очищен и идентифицирован методами электрофореза и радиоавтографии. АТФсульфурилазу очистили из клеток D.vulgaris (60) и Dm. nigrificans [ (60), (51)]. Она была активна в пределах рН 6,6-9,5 и резко уменьшала активность при рН ниже 6,0. Ионы Мg2+ стимулировали на 20% активность фермента D.vulgaris, а ионы Са2+ и Мn2+ в концентрации 10-3 М подавляли на 60%, АТФ-сулъфурилаза была высокоспецифична в отношении АТФ и не активна с ГТФ, УТФ и ИТФ. Фермент из клеток термофильной Dm. nigrificans оказался значительно стабильнее при высоких температурах (55-65 °С), чем фермент из клеток D.vulgaris (60). По своим свойствам обе сулъфурилазы были сходны с АТФ-сульфурилазой дрожжей. У разных видов сульфатвосстанавливающих бактерий АТФ-сульфурилазы отличались по электрофоретической подвижности. В клетках штамма D.vulgaris Hildenborough обнаружили 2 неорганические пирофосфатазы [ (61), (51)]; одна, растворимая, активировалась ионами Мg2+ и Со2+ и сульфитом, а другая, связанная с клеточными частицами, активировалась только ионами Со2+ Клетки, выращенные на сульфате или тиосульфате, имели более высокую удельную активность неорганической пирофосфатазы, чем клетки, выращенные на сульфите. Неорганическую пирофосфатазу (КФ 3.6.1.1) выделили и очистили из клеток D.desulfuricans (61). Она оказалась сходной по своим свойствам с пирофосфатазами других видов Desulfovibrio и некоторых клостридий. Очищенный белок имел мол. вес 43 ООО, активировался ионами Мg2+, Со2+ или Мn2+ и существовал в двух формах, отличавшихся по электрофоретической подвижности при рН 10. Неактивная форма содержала три свободные SH-группы, а форма, активированная восстановителями, содержала 9 свободных SH-групп на молекулу. Пирофосфатаза инактивировалась после инкубации клеток на воздухе, но снова становилась активной после обработки дитионитом натрия; фермент, очищенный непосредственно из клеток, выращенных в анаэробных условиях, был активным и не реагировал на восстановители. Авторы предположили, что внутриклеточная регуляция неорганической пирофосфатазы в ответ на изменение окружающих условий представляет собой физиологическую функцию и позволяет бактериям сохранять АТФ в неблагоприятной среде. Следующая схема иллюстрирует это предположение: Пирофосфатаза, катализирующая стадию 2, фактически «тянет» за собой всю цепь реакций, поэтому обратимая инактивация этого фермента будет способствовать консервации АТФ, препятствуя образованию АТФ на стадии 1. АФС-редуктазу (аденилилсульфатредуктаза; КФ 1.8.99.2) обнаружили у Dm. nigrificans и D.africanus и частично очистили из клеток штамма D.vulgaris Hildenborough. Очищенный фермент имел мол. вес 220 000, содержал 1 моль ФАД и 6-8 атомов негемового железа на моль белка (т.е. являлся железосодержащим флавопротеином), включал S35 из S35-АФС, восстанавливал ГФС, ЦФС и УФС кроме АФС и ингибировался п-оксимеркурибензоатом. У сульфатвосстанавливающих бактерий найдено 5 изоферментов АФС-редуктазы, отличавшихся по электрофоретической подвижности. Штаммы D.vulgaris, D.gigas и Dm. orientis имели по 3 сходных изофермента, штаммы D.desulfuricans, Desulfovibrio sp. и D.africanus имели по одному или по два изофермента, сходных с одним из трех изоферментов первой группы, а штаммы D.salexigens, Dm.nigrificans и Dm.rumini имели изоферменты, отличавшиеся по электрофоретической подвижности от изоферментов первой группы. Реакция восстановления АФС, катализируемая АФС-редуктазой, обратима: АФС восстанавливался до сульфита в присутствии АМФ, а сульфит окислялся в присутствия АМФ и феррицианида. Окисление сульфита происходило согласно реакции: 2 3 4 SO 3 + АМФ+ 2Fe (CN) 6 АФС + 2Fe(CN) 6 Редуктаза была высокоспецифична в отношении сульфита и не реагировала с нитратом, нитритом, селенитом, фосфатом или гипофосфитом. АМФ замешался дезоксиАМФ, ИМФ и ГМФ, но не УМФ или ЦМФ. Реакция окисления сульфита в присутствии АМФ представляет большой интерес в связи с тем, что в результате образуется богатая энергией фосфосульфатная связь с ΔF0 18-19 ккал. Предполагается следующий механизм реакции, включающий образование промежуточного комплекса между ферментом и сульфитом со связью по N-5 изоаллаксазинового кольца флавина: На первой стадии образуется соединение со связью 5-N-SO 3 (X представляет собой хромофор, который может быть негемовым железом); на второй стадии сульфит переносится от ФАД к АМФ или какому-то другому мононуклеотидному акцептору и на стадии три хромофор восстанавливается в связи с условиями равновесия реакции. Способность АФСредуктазы образовывать АФС, вероятно, не имеет физиологического значения у сульфатвосстанавливающих бактерий, так как во время роста они восстанавливают сульфат. По своим свойствам аденилилсульфатредуктаза сульфатвосстанавливающих бактерий сходна с аналогичными ферментами тионовых бактерий, окисляющих восстановленные соединения серы до сульфата (табл. 2). Удельная активность АФС-редуктазы в клетках D.vulgaris зависела от субстрата, использованного в качестве акцептора электронов: на среде с сульфитом она была в 4 раза ниже, чем на среде с сульфатом. Таблица 2 - Сравнение аденилинсульфатредуктаз различных бактерий Свойства Desulfovibrio vulgaris 220000 Thiobacillus denitrificans н.о. Молекулярный вес Коэффициент 9,2 9,54 седиментации ФАД на 1 0,7 на 105г молекулу белка Негемовое Fe на 10-12 5 на 105г белка молекулу Гем на 0 0 молекулу Акцепторы электронов: + + Fe(СN) 36 7,5 7,2 оптимум рН цитохром С + н.о. оптимум рН 9,5 н.о. О2 + + Обозначения: н.о. - не определялось. Thiobacillus thioparus 170000 Thiocapsa roseopersicina 180000 н.о. 9,7 1 1 8-10 4 0 0 + 7,4 + 8,0 + 9,5 н.о. + 9,0 н.о. Сульфит является общим промежуточным продуктом при ассимиляторном и диссимиляторном восстановлении сульфата. Дальнейший путь восстановления сульфита, однако, совершенно различен. Ассимиляторная сульфитредуктаза (КФ 1.8.1.2) представляет собой сложную молекулу, включающую несколько белков и кофакторов, и катализирует восстановление сульфита непосредственно до H 2 S без образования промежуточных продуктов. Диссимиляторное восстановление сульфита включает по крайней мере 3 промежуточных этапа и происходит возможно с участием трех ферментов сульфитредуктазы, тритионатредуктазы и тиосульфатредуктазы: 3SO 32 + 2e- + 6H+ → S 3 O 62 + 3H 2 O (также образуются S 2 O 32 и H 2 S) S 3 O 62 + 2e- → S 2 O 32 + SO 32 S 2 O 32 + 6e-+ 6H+ → S2- + 3H 2 O _____________________________ 2 Суммарно: SO 3 + 6e-+ 6H+ → S2- + 3H 2 O Восстановление сульфита до H 2 S продемонстрировано с бесклеточным экстрактом D.desulfuricans, инкубировавшимся в атмосфере Н 2 . Для реакции требовалось присутствие гидрогеназы, сульфитредуктазы, цитохрома С 3 и некоторых других компонентов. J.R.Postgate представил доказательства, что тиосульфат не является промежуточным продуктом при восстановлении сульфита, хотя целые клетки D.desulfuricans и, как показал M.Ishimoto в соавт., бесклеточные экстракты восстанавливали тиосульфат. Однако позже при исследовании восстановления меченных S35 сульфита и бисульфита бесклеточным экстрактом D.vulgaris обнаружили накопление тиосульфата. Кроме того, в качестве промежуточного продукта в начальную фазу реакции образовывался тритионат, который затем исчезал при одновременном накоплении тиосульфата. Предположено, что фактическим субстратом при образовании тиосульфата являлся 2 бисульфит (HSO 3 ), а не сульфит (SO 3 ), т.к. оптимум рН реакции был 6,0, а восстановление сульфита является рециклическим процессом, состоящим по крайней мере из трех стадий с участием нескольких редуктаз: На основании исследований с очищенной сульфитредуктазой, в которых найдено, что тритионат, тиосульфат и Н 2 и H 2 S образуются ферментом одновременно, авторы изменили схему, включив два лабильных промежуточных продукта X и Y, которые превращаются в тритиоиат или тиосульфат и сульфид в зависимости от концентрации сульфита и доноров электронов: Позже нашли, что количество каждого из конечных продуктов, образующихся при восстановлении сульфита очищенной сульфитредуктазой зависит от способов и условий анализа при измерении восстановления бисульфита. Такие параметры как концентрация гидрогеназы, метилвиологена, субстрата и Н 2 решающе влияли на выход конечных продуктов реакции. J.M.Akagi в соавт. (62) предположили, что бисульфитредуктаза (Р582), выделенная из клеток Dm.nigrificans, восстанавливала бисульфит до тритионата и что тиосульфат в сульфид были эндогенными побочными продуктами реакции. В экспериментах с целыми клетками и бесклеточными экстрактами D.desulfuricans и D.gigas, а также с очищенной сульфитредуктазой D.gigas L.A.Chambers и P.A.Trudinger получили восстановление сульфита только до сульфида и выразили сомнения в том, что тритионат является промежуточным продуктом при восстановлении бисульфита H.L.Drаke и J.M.Akagi тщательно провели исследования с меченными S35 субстратами и высокоочищенной сульфитредуктазой D.vulgaris и подтвердили образование тритионата в качестве основного конечного продукта и как минорного продукта. Они сделали вывод, что у сульфатвосстанавливающих бактерий восстановление сульфита может идти по двум путям: по пути, включающему промежуточное образование тритионата и тиосульфата, как это предложили K.Kobayashi с соавт., и по пути, катализируемому сульфитредуктазой ассимиляторного типа, обнаруженной у D.vulgaris. Сульфитредуктазы выделены из клеток сульфатвосстанавливающих бактерий и получены в высокоочищенном состоянии (табл. 3). Бисульфитредуктаза или тритионатобразующий фермент идентифицировали как десульфовиридин и выделили из клеток D.vulgaris и D.gigas. Уже давно было известно, что все виды p.Desulfovibrio, за исключением D.desulfuricans штамма Norway, coдержат термолабильный растворимый пигмент десульфовиридин, являющийся кислым порфириновым белком и дающий характерную флуоресценцию в УФ-свете, однако физиологическая функция его была не ясна. Десульфовиридин имеет мол. вес 200000 - 225000, а его спектр характеризуется максимумами при 280, 390, 410, 585 и 630 нм. Предполагается, что некоторые различия в спектре пигмента, выделенного различными авторами, связаны с небольшими структурными изменениями и частичным отделением хромофора при очистке. Десульфовиридин восстанавливает бисульфит тритионата и может восстанавливать нитрит и гидроксиламин. G.W.Skyring в P.A.Trudinger разработав метод определения активности сульфитредуктаз с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, нашли, что десульфовиридин восстанавливает сульфит по крайней мере частично до Н 2 S. Они обнаружили также, что десульфовиридины разных видов сульфатвосстанавливающих бактерий отличались по электрофоретической подвижности, и предположили, что различные электрофоретические формы могут отличаться по ферментным свойствам. Из клеток штамма D.desulfuricans Norway выделили пигмент десульфорубидин, который аналогично десульфовиридину, восстанавливал сульфит до тритионата. Таблица 3 - Свойстве сульфитредуктаз сульфатвосстанавливающих бактерий В клетках D.vulgaris, кроме десульфовиридина, присутствовала еще сульфитредуктаза ассимиляторного типа. Она была названа так из-за того, что подобно другим ассимиляторным сульфитредуктазам восстанавливала сульфит прямо до сульфида и имела типичный спектр с пиком 590 нм. Белок с мол. весом 268 000 мог быть отделен от десульфовиридина и имел оптимум рН в кислой области. Известно еще о двух сульфитредуктазах у D.vulgaris. Первый фермент с мол. весом 14 000, очевидно, отличался от десульфовиридина, также, как и второй с мол. весом 40 000, который восстанавливал сульфит и другие соединения серы и проявлял сильную абсорбцию при 260 нм. Однако подробных данных об очистке и свойствах этих ферментов не сообщалось. Совсем недавно выделили сульфитредуктазу нового типа, названную бисульфитредуктаза II. Она присутствовала в бесклеточных экстрактах D.vulgaris и восстанавливала бисульфит до сульфида и тиосульфата, причем высокие концентрации субстрата подавляли образование сульфида, но не тиосульфата. Тритионат не являлся продуктом реакции и не восстанавливался бисульфитредуктазой II. Фермент имел мол. вес 50000 и абсорбционные максимумы при 275, 400 и 590 нм. По цвету и спектральным свойствам бисульфитредуктаза II сходна с ассимиляторной сульфитредуктазой D.vulgaris. Отсутствие десульфовиридина у бактерий p. Desulfotomaculum является характерным признаком. Сульфитредуктаза выделенная из клеток Dm.nigrificans, оказалась связывающим окись углерода коричневым пигментом Р582, восстанавливала сульфит до сульфида и в неочищенных экстрактах передавала электроны с лактата, пирувата и НАДН 2 на гидрогеназу. Она имела мол. вес 145000 с максимумами при 280, 392, 582 и 700 нм, восстанавливала бисульфит (до сульфида), нитрит и гидроксиламин. Фермент был очищен до гомогенного состояния [ (63), (62)] и в экспериментах с меченными S35 субстратами показано, что основным продуктом реакции при восстановлении бисульфата был тритионат, а тиосульфат и сульфид образовывались как эндогенные побочные продукты реакции. Таким образом, к настоящему времени у сульфатвосстанавливающих бактерий известно по крайней мере 5 сульфитредуктаз (табл. 3): бисульфитредуктаза бактерий p. Desulfovibrio или десульфовиридин, десульфорубидин, бисульфитредуктаза II, ассимиляторная сульфитредуктаза и бисульфитредуктаза, связывающая СО (пигмент Р582), причем три из них восстанавливают сульфит до тритионата. Широкое распространение тритионатобразующих ферментов среди сульфатвосстанавливающих бактерий, по-видимому, свидетельствует о большом значении тритионатного пути, хотя присутствие сульфитредуктаз другого типа и данные о наличии элементарной серы и окиси серы в культурах D.desulfuricans предполагают наличие и иных путей восстановления сульфата. Мало известно о ферментах, восстанавливающих тритионат и тиосульфат. Бесклеточный экстракт D.desulfuricans восстанавливал тиосульфат и политионаты до H 2 S в присутствии метилвиологена, гидрогеназы и молекулярного водорода, причем цитохром С 3 заменял метилвиологен в качестве переносчика электронов. Позже сообщалось о разделении активности гидрогеназы и тиосульфатредуктазы в экстрактах Desulfovibrio, а также о разделении активности тиосульфатредуктазы и ферментной системы, образующей тиосульфат. Тиосульфатредуктаза отделялась от десулъфовиридина при электрофорезе в геле. Фермент частично очищенный из клеток Dm.nigrificans . восстанавливал только наружный атом серы тиосульфата до H 2 S. Он не активен с сульфатом, сульфитом, тетратионатом и дитионатом и ингибировался сульфитом и соединениями, реагирующими с SH-группами. У Dm.nigrificans также была обнаружена роданаза (тиосульфат: цианид-сератрансфераза; КФ 2.8.1.1), катализирующая разрыв связи S=S тиосульфата с образованием серы и сульфита. Однако пока что неизвестно необходим ли разрыв связи S=S при восстановительном процессе у Dm.nigrificans. Из клеток D.vulgaris выделили гомогенную тиосульфат-редуктазу с мол. весом 15500 16300, которая состояла из 128 остатков аминокислот и содержала 9,2 моля углеводов и 4,8 моля органического фосфора. Восстановление тиосульфата происходило согласно следующим реакциям: S 2 O 32 + H 2 H 2 S + SO 32 SO 32 + 3H 2 S2- + 3H 2 O при использовании реконструированной ферментной системы, аналогичной системе Исимото и Койама. Тиосульфат-редуктаза восстанавливала до H 2 S наружный атом тиосульфата, а внутренний атом серы выделялся в виде сульфита. Тиосулъфатредуктазу с близкими свойствами из клеток D.gigas очистили в 415 раз. Фермент имел мол. вес 22 000, катализировал стехиометрическое восстановление тиосульфата до H 2 S и сульфита, обладал тетратионатредуктазной активностью и был чувствителен к соединениям, связывающим SH-группы. Практически ничего не известно о свойствах тритионат-редуктазы или тиосульфатобразующего фермента. Хотя химическая природа редуктаз у сульфатвосстанавливающих бактерий еще окончательно не выяснена, их функция ясна - она подобна функции цитохромоксидазы, конечного фермента в цепи переноса электронов: 2Н+ цитохром(ы) сульфат-, сульфит- и тиосулъфитредуктазы SO 24 , SO 32 , S 2 O 32 . 2.7. Компоненты цепи переноса электронов 2.7.1. Цитохромы Несмотря на то, что в настоящее время известно довольно много компонентов, способных участвовать в переносе электронов в клетках сульфатвосстанавливающих бактерий, и имеется много данных о химической структуре этих соединений, точная последовательность цепи переноса электронов не установлена. Фактически не известна даже функциональная роль хорошо изученных соединений, таких как цитохром С 3 и ферредоксин, и обычно сообщается, что тот или иной переносчик электронов «оказывает стимулирующее действие» на активность отдельных ферментных систем. В некоторых случаях сообщалось, что два или три различных переносчика электронов стимулировали одну и ту же реакцию. У сульфатвосстанавливающих бактерий обнаружили несколько цитохромов типа С 3 , цитохромы b и d, флаводоксин, ферредоксин, рубредоксин и менахинон. Свойства некоторых из этих компонентов приведены в табл. 4. Цитохром С 3 , характерный для многих сульфатвосстанавливающих бактерий, был первым цитохромом, обнаруженным у нефотосинтезирующих анаэробных бактерий. Согласно классификации сульфатвосстанавливающих бактерий, разработанной Постгейтом и Кемпбелом, бактерии p.Desulfovibrio содержат только цитохром типа с, а виды p.Desulfotomaculum только цитохром типа b. Как показали более поздние исследования, это не совсем так. Цитохром типа с, связанный с клеточными частицами, обнаружен у всех видов Desulfovibrio и в небольшом количестве также у Dm.nigrificans и Dm.orientis, а протогем, простетическая группа цитохрома b, найден у всех видов сульфатвосстанавливающих бактерий. У D.africanus, кроме цитохрома С 3 , присутствовали цитохромы b и d (прежнее название а 2 ). Все же для всех видов Desulfovibrio характерно преобладание в составе пигментов цитохромов типа с. Таблица 4 Некоторые сульфатвосстанавливающих бактерий Переносчик электронов Цитохром b Цитохром с 3 Цитохром c 553 Цитохром СС 3 Ферредоксин Флаводоксин Рубредоксин свойства переносчиков электронов у Мол. вес Простетическая Донор электронов Акцептор группа электронов не известен гем гидрогеназа фумаратредуктаза 13 000 гем (4) гидрогеназа Восстановление сульфата 9 000 гем (1) формиатдегидрог не известно еназа 26 000 гем (8) не известен Восстановление тиосульфата 6 500 негемовое восстановл. Восстановление железо (4) цитохром С 3 сульфата 16 000 ФМН восстановл. Восстановление . цитохром С 3 сульфата 6 500 негемовое НАДН 2 цитохром железо (1) С3 Цитохром С 3 - растворимый, термостабильный, самоокисляющийся гемопротеин с мол. весом 13 000, низким окислительно-восстановительным потенциалом (E 0 = - 0,205 В) и содержанием Fe 0,9%. Предполагалось, что цитохром С 3 содержит 2 гема на молекулу, но после выяснения последовательности аминокислот в цитохромах D.desulfuricans (64) и D.gigas (65) стало ясно, что они содержат 4 участка для связывания гема. Наличие 4 гемов у цитохромов С 3 D.vulgaris было подтверждено позднее. Спектр окисленного цитохрома С 3 характеризуется максимумами при 350, 410 и 535 нм и перегибом при 568 нм, а восстановленного цитохрома С 3 максимумами при 419, 525 и 553 нм. Цитохром С 3 выделили и получили в кристаллическом виде из клеток D.vulgaris (47). D.desulfuricans (64), D.gigas и D.salexigens (47). Они были сходны по мол. весу, окислительновосстановительному потенциалу и абсорбционному спектру, но отличались по составу аминокислот, электрофоретической подвижности, изопотенциальной точке и антигенным свойствам. У штамма D.desulfuricans Norway, который в отличие от остальных сульфатвосстанавливающих бактерий, не содержит десульфовиридин, оказался цитохром С 3 с мол. весом 16 000. Аминокислотный состав цитохромов С 3 из 7 штаммов сульфатвосстанавливающих бактерий представлен в таблице 5. Была установлена полная последовательность аминокислот в цитохромах С 3 D.vulgaris штамм Hildenborough (47). D.desulfuricans El Agheila L и D.gigas NCIB 9332 [ (65), (64)]. Цитохром С 3 значительно отличается от цитохромов С другого происхождения. Для него характерно повышенное содержание остатков цистеина (57) гистидина [ (39) - (57)] и лизина. В молекуле цитохрома С 3 обнаружены 2 симметричные части, причем каждая часть имеет характерную последовательность аминокислот, необходимую для присоединения гема и одинаковую у всех цитохромов С: цис-А-Б-цис-гист(где А в Б непостоянные аминокислоты). Но, кроме того, у каждой части имеется еще последовательность типа -цис-А-Б-В-Г-цис-гист-, которая не наблюдается в других цитохромах (44). Нет прямого сходства между последовательностью аминокислот в автохроме С 3 и последовательностью аминокислот в цитохромах типа С млекопитающих. Цитохром, очищенный из клеток D.gigas, назван цитохромом С 3 ’. Он отличался от других цитохромов С 3 по изоэлектрической точке (5,2 вместо 10,5), электрофоретическим и иммунологическим свойствам, что связывали с различиями в составе аминокислот. Установление аминокислотного состава подтвердило это предположение: оказалось, что около 50% аминокислот в цитохромах С 3 D.gigas и D.vulgaris различно (табл. 5). Однако у обоих цитохромов имеется по 8 остатков цистеина, расположенных в тех же положениях. Такая же ситуация наблюдается со всеми, кроме одного, остатками гистидина (65). Хотя цитохромы С 3 разных видов сульфатвосстанавливающих бактерий отличались по ряду свойств, изучение спектров кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения цитохромов (44) показало, что положение гемов в молекуле, по-видимому, одинаково во всех случаях. Образование лигандных связей цитохрома С 3 с нитритом, цианидом, азидом, аммонием и другими соединениями было исследовано методом низкотемпературного электронного парамагнитного резонанса. Показано, что цитохром в полуокисленном состоянии реагировал с аммонием и структурными аналогами с образованием комплексов фермент-субстрат, регистрируемых ЭПР. Величина сигналов g ЭПР свидетельствовала о наличии взаимодействия между остатком гистидина и гемовым железом в шестом положении. Этим цитохром С 3 отличается от других бактериальных цитохромов с, у которых с гемовым железом в этом положении взаимодействует метионин. При восстановлении цитохромом С 3 гидроксиламина образовывался стабильный полувосстановленный промежуточный продукт, в котором азот взаимодействовал с гемовым железом как раз в шестом положении. Отсюда предполагается, что в восстановленном белке происходят конформационные изменения, способствующие освобождению этой позиции. По некоторым спектральным свойствам цитохром C 3 сходен с цитохромоксидазой млекопитающих. Таблица 5 - Состав аминокислот цитохромов С 3 сульфатвосстанавливающих бактерий Аминокисло D. vulgaris D. vulgaris D. D. D. D. D. gigas ты штамм штамм desulfurica desulfuric desulfurica salexige NCJB9332 Hildenboro Miyaxaki ns штамм ans ns штамм ns (65) ugh (66) (64) El Agheila штамм cholinlcus NCJB84 L Norway 4 (56) 03 (66) (64) (67) Лизин 20 17 15 16 17 22 17 Гистидин 9 9 8 9 9 6 8 Аргинин 1 0 1 2 0 0 0 Треонин 5 6-7 5 10 5 6 5 Серин 6 5 8 6 6 12 6 Аспараг иновая 12 12-13 8 15 7 9 18 кислота Глутаминова 5 5 6 10 11 5 4 я кислота Пролин 4 4 6 8 6 5 4 Глицин 9 8 8 10 9 11 11 Аланин 10 9 13 13 9 13 9 Цистин 8 8 8 8 6 8 (1/2) 8 Метионин 3 1 4 1 1 2 0 Ввлин 8 9 5 6 9 8 8 Изолейцин 0 1 2 4 1 2 4 Лейцин 2 6 0 5 6 4 4 Триптофан 0 0 1 0 0 0 1 Тирозин 3 2 1 2 2 1 2 Фенилалани 2 3 3 4 3 3 2 н 107 107-111 102 127 118 109 111 Общее количество Физиологическая функция цитохрома С 3 еще окончательно еще расшифрована. Цитохром с 3 присутствует в клетках в растворимой и связанной формах. Показано, что он участвует как переносчик электронов в восстановлении водородом сульфата, сульфита, тиосульфата, тетратионата и дитионата. Роль цитохрома С 3 в переносе электронов от гидрогеназы и на гидрогеназу с образованием Н2 подробно изучалась на бесклеточных экстрактах сульфатвосстанавливающих бактерий, с суспензиями отмытых клеток и реконструированными ферментными системами. Удалось показать видовую специфичность цитохрома с 3 в реакции с гидрогеназой D.vulgaris. Активность последней с собственным цитохромом С 3 была выше, чем с цитохромом С 3 D.desulfuricans или D.salexigens. С другой стороны, гидрогеназа Dm.ruminis использовала в качестве акцептора электронов не цитохром С 3 , а ферредоксин. Восстановленный цитохром С 3 служил донором электронов для АФСредуктазы, тиосульфатредуктазы, гидрогеназы при расщеплении формиата и для неспецифического восстановления гидроксиламина до NH 3 . Есть указание на участие цитохрома С 3 в фосфорокластической реакции (53). Цитохром С 3 D.vulgaris был не активен в формиаттидрогенлиазной системе Escherichia coli. Высокую стимуляцию активности тиосульфатредуктазы D.desulfuricans штамм Norway получили с цитохромом С 3 , выделенным из этой же бактерии. Активность ферментной системы возрастала с увеличением концентрации цитохрома. Чрезвычайно низкий окислительно-восстановительный потенциал - 500 мВ, обнаруженный у цитохрома С 3 из штамма Norway, позволял, видимо, ему участвовать в переносе электронов от гидрогеназы на тиосульфат (стандартный потенциал восстановления тиосульфата до сульфида и сульфита по данным Вагнера и соавт. составляет -420 мВ). С другой стороны, цитохром С 3 D.gigas не являлся переносчиком электронов при восстановлении тиосульфата и эту функцию выполнял другой цитохром типа С. Кроме классического цитохрома С 3 , у сульфатвосстанавливающих бактерий были обнаружены несколько других цитохромов типа С. У D.vulgaris штамм Hildenborough нашли цитохром С 533 с мол. весом 9000 и одним гемом на молекулу. Спектр цитохрома С 553 отличался от спектра цитохрома С 3 только наличием большого пика при 280 нм. Цитохром С 533 имел однако более высокий окислительно-восстановительный потенциал (между 0 и 100 мВ). Он найден также у D.desulfuricans штамм El Agheila L, но не обнаружен у D.gigas. Цитохром С 553 получен в кристаллической форме. Он состоит из одной полипептидной цепи, включающей 82 аминокислотных остатка. Сравнение аминокислотной последовательности в цитохромах С 533 и С 3 показало отсутствие гомологии. В то же время наблюдалось определенное сходство в первичных структурах цитохрома С 553 D.vulgaris и цитохрома С 551 Pseudomonas: y обоих гем присоединен в молекуле ближе к N-концу, соответственно метионин-64 и мотионин-61 связаны с гемом и в молекуле только один остаток гистидина. Предполагается, что цитохром С 553 может принимать электроны от лактатдегидрогеназной системы. Еще один цитохром типа С был найден в клетках двух штаммов, содержащих цитохром С 553 , и у D.gigas. Этот цитохром был предварительно назван СС 3 ’ по аналогии с цитохромными системами Rhodospirillum и Chromatium. Большинство исследований выполнено с цитохромом СС 3 ’ из D.gigas, который имел мол. вес 26000 ± 2000 и по спектральным свойствам был сходен с цитохромом С 3 . Он содержал 16 остатков цистеина и 16 остатков гистидина на молекулу, по-видимому, мог присоединять 8 гемов и не диссоциировал на субъединицы. Согласно аминокислотному составу (242 остатка аминокислот) цитохром СС 3 ’ не являлся димером цитохрома С 3 . Также, как цитохромы С 3 и С 551 , новый цитохром был самоокисляющимся. Цитохром СС 3 ’ оказался специфическим переносчиком электронов при восстановлении тиосульфата в присутствии гидрогеназы. Из клеток штамма D.vulgaris Miyazaki Яги экстрагировал три цитохрома с, включая цитохром С 3 с мол. весом 13000, цитохром с мол. весом 70 000 и цитохром С 553 с мол. весом 6500. Последний – самый маленький из известных цитохромов С. Он восстанавливался в присутствии формиата препаратом формиатдегидрогеназы, полученным из того же штамма, и передавал далее электроны на цитохром С 3 . В отличие от цитохромов С 3 других штаммов D.vulgaris цитохром С 3 штамма Miyazaki не реагировал непосредственно с формиатдегидрогеназой. Таким образом, у сульфатвосстанавливающих бактерий к настоящему времени выделены в кристаллическом виде и химически охарактеризованы три цитохрома, в том числе С 3 , С 553 , СС 3 ’, причем для цитохрома С 3 показаны значительные внутри- и межвидовые различия. На основании данных оптических исследований и спектров ЭПР изученные цитохромы типа С сульфатвосстанавливающих бактерий были разделены на 3 группы: цитохромы: С 553 , цитохромы С 3 и С 3 ’ и цитохромы СС 3 , Это деление соответствует делению цитохромов на основе состава и последовательности аминокислот. Однако пока что, за исключением, возможно, цитохрома СС 3 ’ D.gigas, не известно для каких редуктаз цитохромы С являются специфическими переносчиками электронов. Очень мало данных о строении и функции цитохромов b и d у сульфатвосстанавливающих бактерий. Наличие цитохрома b или его протогема на основании спектральных свойств предполагается почти у всех бактерий Desulfovibrio и Desulfotomaculum. В клетках D.gigas цитохром b был связан с фракцией частиц, содержавшей фумаратредуктазу. Показано, что он участвовал в переносе элеrтронов в Н 2 ; фумаратредуктазной системе. Наибольшее количество цитохрома b присутствовало в экстракте клеток D.vulgaris, где он, как предполагается, был связан с лактатдегидрогеназой. Цитохром d обнаружили только у D.africanus и о его физиологической роли ничего не известно. 2.7.2. Переносчики электронов другого типа В клетках сульфатвосстанавливающих бактерий нашли несколько низкомолекулярных переносчиков электронов, содержащих негемовое железо, в том числе ферредоксин, флаводоксин и рубредоксин, и, кроме того, менахинон МК-6 (витамин К) и а-токоферол. Ферредоксин, найденный впервые у D.desulfuricans, мог участвовать как переносчик электронов в световых в темновых реакциях фотосинтеза, проходивших в бесклеточном экстракте листьев шпината. Он передавал электроны, образующиеся в первичном фотохимическом акте, на пиридиннуклеотиды, восстанавливал последние в темноте в присутствии бактериальной гидрогеназы и Н 2 и образовывал молекулярный водород с аскорбатом, цистеином или дитионитом в качестве доноров электронов. Ферредоксин выделили и получили в кристаллическом виде из клеток D.gigas, D.desulfuricans штамма Berre S и D.desulfuricans штамма Norway. Ферредоксин имеет мол. вес 6000-6200, содержит 4 атома негемового железа и 4 атома сульфидной или так называемой кислотолабильной серы на молекулу, характеризуется Уф-спектром с максимумами при 305 и 390 нм и перегибом при 290 нм и имеет низкий окислительно-восстановительный потенциал Е 0 ' в пределах от -310 до -330 мВ. Аминокислотный состав ферредоксина, выделенного из трех штаммов Desulfovibrio, представлен в таблице 6. Он включает 54-57 аминокислотных остатков, среди которых во всех случаях присутствуют 6 остатков цистеина и в большинстве случаев отсутствуют тирозин, триптофан, аргинин и гистидин. По составу аминокислот ферредоксин сульфатвосстанавливающих бактерий сходен с ферредоксинами анаэробных бактерий p. Clostridium. и Chromatium. ЭПР-сигналы и ЯМР-спектр ферредоксина сульфатвосстанавливающих бактерий типичны для 4Fe-4S ферредоксинов, наиболее распространенных у бактерий. Известно, что ферредоксины, относящиеся к наиболее простым белкам, содержащим железо в серу, делятся на два типа: ферредоксины с центрами 2Fe-2S (2 атома негемового железа и 2 группы кислотолабильной сульфидной серы), встречающиеся главным образом у растений, и ферредоксины с центрами 4Fe-4S, характерные для бактерий. В молекуле ферредоксина сульфатвосстанавливающих бактерий 6 остатков цистеина распределены неравномерно: 4 остатка находятся в одной половине молекулы и только 2 остатка в другой. Сравнивая структуру ферредоксинов различного происхождения, J.Travis и соавт. пришли к выводу, что первая половина ферредоксина сульфатвосстанавливающих бактерий имеет большое сходство с бактериальными ферредоксинами, тогда как вторая гомологична ферредоксинам зеленых растений, и предположили, что в эволюции ферредоксины сульфатвосстанавливающих бактерий образовались из прототипа, промежуточного между ферредоксинами бактерий и зеленых растений. Использовав данные по структуре ферредоксинов, H.D. Peck построил филогенетическое дерево и заключил, что сульфатвосстанавливающие бактерии произошли от фотосинтезирующих бактерий. Совсем недавно обнаружили, что у D.gigas имеются, кроме известного 4Fe-4S ферредоксина, ферредоксины еще двух типов. Один из них был очищен и оказался ферредоксином 2Fe-2S типа, сходным с растительными ферредоксинами также и по аминокислотному составу. Этот белок имел, однако, высокий мол. вес (120000) и содержал один атом Мо на молекулу. Интересно, что в клетках D.desulfuricans штамма Norway также присутствовал второй ферредоксин с более кислыми свойствами, который не удалось очистить из-за его нестабильности. В качестве переносчика электронов ферредоксин, по-видимому, может участвовать в клетках сульфатвосстанавливающих бактерий в нескольких процессах. Он требовался для фосфорокластического декарбоксилирования пирувата у D.vulgaris (53) и стимулировал восстановление сульфита, сцепленное с фосфорокластической реакцией у Dm.nigrificans (54). В экстрактах D.vulgaris ферредоксин принимал электроны от пируватдегидрогеназы и передавал на цитохром С 3 или непосредственно на гидрогеназу (хотя процесс в последнем случае происходил слабее). С другой стороны, ферредоксин, очищенный из клеток Dm.nigrificans (54), участвовал в переносе электронов от пирувата на сульфит, но был мало активен в сцеплении фосфорокластической реакции с гидрогеназой. Функциональная роль ферредоксина в восстановлении сульфата, сульфита и тиосульфата была подтверждена у D.gigas. Предполагается, однако, что специфическим переносчиком электронов для восстановления тиосульфата в клетках D.gigas служит цитохром СС 3 ’, тогда как ферредоксин является неспецифическим переносчиком. Ферредоксин участвовал в восстановлении тиосульфата в экстрактах D.vulgaris и D.desulfuricans. J.U. Akagi (53) предложил следующую схему последовательности переноса электронов в фосфорохластнчесхой реакции: P.А. Trudinger также считает, что ферредоксин одно из недостающих звеньев между цитохромами с 3 и сульфитредуктазой и предлагает аналогичную схему, связывающую восстановление сульфита, декарбоксилирование пирувата и метаболизм водорода у D.vulgaris: Физиологическая роль недавно выделенного Mo-2Fe-2S-белка не известна. Он не участвовал в переносе электронов между гидрогеназой и сульфитредуктазой (десульфовиридин) и не был связан с формиатдегидрогеназной системой. Хотя сообщение о присутствии у сульфатвосстанавливающих бактерий значительных количеств флавопротеинов появилось более 20 лет назад, подробные исследования этих соединений начались только в 70-х гг. Кристаллические флавопротеины, аналогичные флаводоксину, выделенному ранее из клеток Clostridium pasteurianum, получили из клеток D.gigas и двух штаммов D.vulgaris. Флаводоксин имел мол. вес 16000 (по результатам аминокислотного анализа), в качестве простетической группы содержал ФМН, не содержал каких-либо металлов, восстанавливался в голубую форму при облучении Уф-светом или в темноте в присутствии гидрогеназы и Н 2 ; его окислительно-восстановительный потенциал 280 мВ. По разработанной классификации он относится к флавопротеинам с голубым радикалом. Апопротеин флаводоксинов сульфатвосстанавливающих бактерий состоит из 149-152 остатков аминокислот с характерным повышенным содержанием аспарагиновой и глутаминовой кислот (табл. 6). В отличие от флаводоксинов других бактерий флаводоксины сульфатвосстанавливающих бактерий содержат 5, а штамм D.vulgaris Miyazaki даже 9 остатков цистеина (у остальных бактерий 1-2). Методом рентгеноструктурного анализа при разрешении 2,5 Ǻ изучены структура и форма молекул флаводоксина D.vulgaris в монокристаллах. Показано, что молекула флаводоксина представляет собой сплющенный сфероид размером 25x40х45 Ǻ, состоящий из центральной части в виде плоской ленты, сложенной складками, и двух боковых участков в форме спиралей. ФМН расположен большей частью недалеко от поверхности молекулы, однако метильные группы, часть флавиновой и рибитильной группы находятся на поверхности. Ни один из остатков цистеина не образовывал связей S=S и не был связан с ФМН. Таблица 6. - Состав аминокислот сульфатвосстанавливающих бактерий негемовых переносчиков электронов Феррелоксин Рубрсдоксин Флаводокси н Аминокислоты Dtdasulfuricaai штамм Eerre S Лизин Гнстидин Аргинин Треонин Серин Аспврагиноовя x-ra Глутвмнновая к-та Пролнн Глицин Аланин Цистин (1/2) Метионин Волин Iboicituim Лапимин Триптиан Тирозин валолинин Обшее количество 2 1 О 3 3 10 11 3 6 2 6 0 5 4 2 о' 0 0 57 штамм Norwa y 2 0 0 3 3 5 11 3 2 7 6 2 3 5 1 н.о. 0 1 54 Негемное железо 4 4 Лабильный сульфид 4 4 Обозначения: и.о. - не определялось D.gigas D .desulfuricans 1 0 1 0 3 11 9 4 1 6 6 2 5 5 1 0 0 1 56 штамм штамм D.vul D.gig D.vul D. Fazoto Noiway garis as garin gigas voran 4 5 3 5 4 8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 С 3 2 4 2 2 6 0 2 0 4 4 7 8 7 13 9 8 20 17 8 5 5 5 17 18 6-7 5 7 5 4 в 6 7 7 6 19 14-15 6 5 6 5 18 15 4 4 4 4 5 5 1 1 1 1 0 2 5 6 5 4 10 16 5 0 0 3 9 5 0 1 1 2 13 14 1 н.о. 1 1 1-2 1 3 4 2 3 5 5 3 2 о 3 6 3 60 63 61 61 151- 149152 150 1 1 1 1 0 0 0 0 0 о о о 4 4 Специальным методом спектрометрии анализировалась кинетика связывания ФМН с алопротеином и восстановления метилвиологеном полувосстановленного белка. Рекомбинация апофлаводоксина и ФМН происходила легко и приводила к образованию флаводоксина, активного в специфических реакциях с переносом электронов. При восстановлении флаводоксина наблюдалось образование стабильной полухинонной промежуточной формы. По основным свойствам флаводоксины D.gigas и D.vulgaris были сходны с флаводоксинами других бактерий. Флаводоксин функционально сходен с ферредоксином. Он замещал последний в качестве переносчика электронов при восстановлении сульфита молекулярным водородом, а также при переносе электронов от водорода на АФС-редуктазу и тиосульфатредуктазу. В клетках D.gigas флаводоксин более специфичен в реакции восстановления сульфита и не специфичен при восстановлении тиосульфата. Не наблюдалось синергидного действия при добавлении флаводоксина в ферментную систему, содержащую ферредоксин. Флаводоксин стимулировал пируватфосфорокластическую реакцию в экстрактах D.gigas и D.vulgaris. В обоих случаях для полной активности системы требовалось присутствие дополнительного цитохрома С 3 . Так как в экстрактах штамма D.vulgaris флаводоксин не стимулировал активность сульфитредуктазы в тиосульфатредуктазы, но требовался при восстановлении сульфита до H 2 S, предполагается, что он необходим для восстановления тритионата и осуществляет перенос электронов с цитохрома с 3 на тритионатредуктазу. Участие флаводоксина в фосфорокластическом расщеплении пирувата и в реакциях, связанных с восстановлением сульфита, представляется следующим образом: Розовый пигмент, экстрагированный из клеток D.gigas оказался сходен по спектру и другим свойствам с содержащим негемовое железо кислым белком рубредоксином из Clostridium pasteurianum. Рубредоксин также выделили из клеток D.vulgaris и двух штаммов D.desulfuricans. Он имеет мол. вес 6000 - 6500, содержит один атом железа на молекулу и не содержит лабильного сульфида. Абсорбционный спектр окисленного рубредоксина характеризуется максимумами при 279, 375 и 490 нм. Аминокислотный состав четырех рубредоксинов (табл. 6) отличается преобладанием кислых аминокислот и отсутствием гистидина и аргинина; все рубредоксины содержат 4 остатка цистеина. Полная последовательность аминокислот была определена у рубредоксина D.gigas. Определены спектры кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения и степень устойчивости к гаунидину, цианиду, хелатным соединениям и реагентам на SH-гpyппы у рубредоксина D.desulfuricans. Сравнение свойств кристаллических рубредоксинов из клеток D.gigas и D.vulgaris показало, что они сходны между собой и с другими бактериальными рубредоксинами. Об участии рубредоксина в определенных процессах ничего известно. Добавление очищенного рубредоксина в ферментные системы не активировало восстановление сульфита или тиосульфата. Выделен фермент, восстанавливающий рубредоксин в присутствии НАДН 2 , но не НАДФН 2 , причем восстановленный рубредоксин мог передать дальше электроны на цитохром у млекопитающих и значительно слабее реагировал с цитохромом с з . Аналогичный фермент участвует вместе с рубредоксином и -гидроксилазой в гидроксилировании углеводородов у P.oleovorans. Однако рубредоксин из клеток D.gigas был не активен в этой реакции при замещении им рубредоксина Pseudomonas olevorans [36]. Менахинон-6 или витамин К 2 выделили из клеток D.gigas D.vulgaris и в сравнительно больших количествах (l,7 M/г сухих клеток) нашли у другого штамма D.gigas и D.desulfuricans. G.C.Wagne: и соавт. обсуждали возможность участия витамина К 2 в цепи переноса электронов у сульфатвосстанавливающих бактерий в связи с его относительно высоким окислительно-восстановительным потенциалом - 0,067 ± 0,010 мВ и пришли к выводу, что он может быть переносчиком электронов и участвовать в процессе фосфорилирования при восстановлении фумарата до сукцината (67), а также, возможно, осуществлять транспорт электронов между гидрогеназой и фумаратредуктазой., Есть предположение об участии менахинона в переносе электронов между цитохромом с з и связанным цитохромом b (67). Из клеток Dm.nigrificans выделили соединение, идентифицированное по величине R f , и Уф-спектру как а-токоферол, но не обнаружили кофермент Q. Попытка описать полную цепь переноса электронов у сульфатвосстанавливающих бактерий, очевидно, пока что невозможна, так как даже для наиболее хорошо химически изученных компонентов достоверно не известны физиологические акцепторы электронов. Чтобы прояснить картину, необходимо добиться полной очистки гидрогеназы и конечных редуктаз и составить представление о пространственной организации всех компонентов энергетической системы в клеточных структурах и механизмах регуляции. К сожалению, таких работ пока что нет. Кроме того, по-видимому, известны еще не все переносчики электронов. В ферментной системе, включающей гидрогеназу и связанную с фракцией частиц фумаратредуктазу D.gigas, имелись все необходимые неизвестные переносчики и ни один из известных переносчиков не активировал процесс восстановления фумарата. 2.8. Окислительное фосфорилирование Ю.И. Сорокин (57) показал, что при окислении водорода сульфатвосстанавливающими бактериями происходит синтез АТФ. Расчеты свидетельствуют, что субстратное фосфорилирование в результате фосфорокластического расщепления пирувата может покрыть только расходы на активацию сульфата, поэтому у сульфатвосстанавливающих бактерий должно происходить фосфорилирование в цепи переноса электронов, то есть окислительное фосфорилирование. Наличие окислительного фосфорилирования удалось показать при восстановлении сульфита, тиосульфата или фумарата в атмосфере водорода бесклеточными экстрактами D.gigas (51). Отношение Р/Н 2 или Р/2е-варьировало от 0,18 до 0,4. Это предполагает одно фосфорилирование, связанное с одним цитохромом. Для фосфорилирования требовалось присутствие растворимой фракции и фракции клеточных частиц. Динитрофенол, пентахлорфенол и грамицидин, соединения, известные своей способностью разобщать фосфорилирование в дыхательной цепи, подавляли образование АТФ. Система была не чувствительна к олигомицину. Окислительное фосфорилирование также происходило при окислении лактата с фумаратом в качестве акцептора электронов, восстанавливавшимся количественно до сукцината (68). Оно было чувствительно к тем же ингибиторам и не зависело от растворимой фракции. Отношение Р/Н 2 составляло 0,3-0,4. Бесклеточный экстракт содержал не зависимую от пиридиннуклеотидов L(+)лактатдегидрогеназу. Никакого фосфорилирования не наблюдалось с пируватом и фумаратом, НАДН 2 и фумаратом или НАДФН 2 и фумаратом. У D.gigas обнаружили растворимую и связанную с частицами АТФазы, стимулируемые динитрофенолом и ионами Са 2+ и Мg 2+ . АТФаза была высоко специфична к АТФ. Наличие таких АТФаз подтверждает присутствие системы окислительного фосфорилирования у сульфатвосстанавливающих бактерий, так как они всегда имеются у других организмов, осуществляющих фосфорилирование в дыхательной цепи. В ростовых экспериментах с D.desulfuricans было рассчитано, что отношение Р:2е при сульфатредукции с лактатом менее 0,5. Автор предполагает, что фосфорилирование должно происходить на участке, где электроны с лактата или пирувата поступают в электронно-транспортную систему. Несколько ферментов, обнаруженных у сульфатвосстанавливающих бактерий, возможно, связаны с окислительными процессами в анаэробных условиях. В клетках D.gigas присутствовала НАД(Ф)Н 2 - менаионоксидоредуктаза, которая однако была не активна с собственным менахиноном МК-6. Значительная активность каталазы оказалась в клетках D.vulgaris штамм Hildenborough и D.gigas, но не у D.desulfuricans штамм El Agheila Z (69). Фермент высоко очистили из клеток D.vulgaris и показали, что он является гемопротеином, с мол. весом 200000, абсорбционными максимумами при 405, 500, 535, 589 и 623 нм и производным протогема IX в качестве простетической группы. Из клеток D.desulfuricans штамм Norway очистили до гомогенного состояния дисмутазу перекиси, катализирующую дисмутацию перекисных свободных радикалов. Дисмутаза имела мол. вес 43000, содержала железо, но не лабильный сульфид, и состояла из двух субъединиц, не связанных ковалентной связью. По спектру поглощения и аминокислотному составу фермент D.desulfuricans был сходен с содержащими железо дисмутазами аэробных микроорганизмов. В клетках D.gigas обнаружили гранулы полифосфата. Они не были связаны с определенными внутриклеточными структурами и образовывались на среде с лактатом или пируватом даже при низких концентрациях магния и фосфора. Полифосфат, возможно, является запасным энергетическим материалом, однако он не был найден у четырех других видов р. Desulfovibrio и всех видов p. Desulfotomaculum. 3. КОНСТРУКТИВНЫЙ ОБМЕН Сульфатвосстанавливающие бактерии по типу питания относятся к литогетеротрофным микроорганизмам (50). Результаты работ, выполненных с меченными С 14 соединениями и бикарбонатом со штаммом D.vulgaris Hildenborough и D. desulfuricans [ (41), (42), (40),], заставили отказаться от взгляда на возможность истинной автотрофии у сульфатвосстанавливающих бактерий. По полученным данным штамм D.vulgaris, обладающий сильной гидрогеназной активностью при выращивании в атмосфере Н 2 на минеральной среде, содержащей С 14 и дрожжевой экстракт, большую часть углерода для построения компонентов клеток извлекал из соединений дрожжевого экстракта. Включение углерода бикарбоната не превышало 10% и было одинаковым в "автотрофных" условиях в атмосфере Н 2 и на среде с этанолом или лактатом. Аналогичные результаты получил ЮЛ. Сорокин [ (40), (42)] со штаммом сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенным из пластовых вод нефтяного месторождения. Его штамм, развиваясь за счет анаэробного окисления молекулярного водорода, формиата или этанола, использовал для биосинтеза СО 2 и ацетат. Дрожжевой экстракт, маннит, аланин и некоторые другие соединения могли заменять ацетат. Кроме того, оказалось, что ацетат в СО 2 , образующиеся при окислении этанола и формиата, не используются непосредственно для процессов биосинтеза, а выделяются в среду. Эти наблюдения позволили предположить, что сульфатвосстанавливающие бактерии имеют пространственно разобщенные пути энергетического и конструктивного обмена (40). Ю.И. Сорокиным (42) предложена схема взаимосвязи энергетического и конструктивного обмена при окислении этанола D.desulfuricans (см. рисунок). Пути сульфатредукции и ассимиляции органических соединений и двуокиси углерода у D.desulfuricans (42) Отдельные этапы и ферменты конструктивного обмена у сульфатвосстанавливающих бактерий еще только начинают выясняться. 3.1. Цикл трикарбоновых кислот Использование сульфатвосстанавливающими бактериями для энергетического обмена лактата, пирувата и некоторых других соединений приводит к накоплению в качестве конечного продукта ацетате, который, по-видимому, включается в обмен и используется для построения компонентов клеток через цикл трикарбоновых кислот. Некоторые ферменты этого цикла обнаружены у сульфатвосстанавливающих бактерий. В клетках нескольких штаммов D.vulgaris и D.desulfuricans обнаружили фумаразу (КФ. 4.2.1.2) и сукцинатдегидрогеназу (КФ 1.3.99.1), а в клетках пяти видов - цитратсинтазу. У двух штаммов D.vulgaris и двух штаммов D.desulfuricans присутствовала атипичная цитратсинтаза (R)-типа, которая образовывала [1-С14]-нитрат из [1-С14]-апетил-КоА и оксалацетата, в отличие от типичной цитратсинтазы (S)-типа, синтезирующей [5-С14]-цитрат. Типичная цитратсинтаза имелась у D.gigas, D.salexigens и Dm.ruminis. Предполагается, что атипичная синтеза, которая имеется у нескольких анаэробных бактерий, возникла в эволюции, когда микроорганизмы стали прототрофами в отношении глутамата. Цикл трикарбоновых кислот у Desulfovibrio недавно изучен более подробно. В клетках D.vulgaris и D. desulfuricans нашли активность цитратсинтазы, аконитазы, изоцитратдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, фумаразы, малик-фермента, пируваткарбоксилазы, аланиндегидрогеназы (КФ 1.4.1.1) и глутаматдегидрогеназы (КФ 1.4.1.2). Отсутствовало несколько ключевых ферментов цикла, в том числе акетоглутаратдегидрогеназа, сукцинил-КоА-синтетаза и малатдегидрогеназа. Об отсутствии малатдегидрогеназы у D.gigas сообщалось ранее. Во время роста бактерий за счет дисмутации фумарата возрастала активность ферментов, непосредственно связанных с метаболизмом фумарата (сукцинат-дегидрогеназа, фумараза и малик-фермент), а также активность окисления НАДфН. Последнее свидетельствует, что у сульфатвосстанавливающих бактерий имеется электронный акцептор для НАДфН. A.J.Lewis и J.D.A.Miller дали следующую схему реакций схема трикарбоновых кислот и связанных с ним превращений у бактерий Desulfovibrio: Рост бактерий на лактате приводит к образованию пирувата, так же, как дисмутация фумарата. Пируват через фосфорокластическую реакцию превращается в ацетилфосфат или с помощью пируваткарбоксилазы в оксалацетат. Дрожжевой экстракт, который обычно стимулирует рост сульфатвосстанавливающих бактерий, репрессировал синтез цитратсинтазы, аконитазы и изоцитратдегидрогеназы также, как добавление а-кетоглутарата и использование глутамина или глутамата в качестве источника азот. Таким образом, очевидно, что осуществляется регуляция синтеза глутамата через реакции цикла. Полученные данные позволяют предположить, что у сульфатвосстанавливающих бактерий Desulfovibrio имеется неполный цикл трикарбоновых кислот, функционирующий только для биосинтеза. Наличие активной пируваткарбоксилазы соответствует сообщениям о способности сульфатвосстанавливающих бактерий удовлетворять часть своей потребности в углероде за счет гетеротрофной фиксации углекислоты (41). У сульфатвосстанавливающих бактерий, по-видимому, не функционирует глиоксилатный цикл. 3.2. Азотный обмен Аммонийный азот считается наилучшим источником азота для сульфатвосстанавливающих бактерий. Бактерии не используют азот нитратов, нитритов и мочевины и медленно растут на средах с аминокислотами в качестве источника азота. Фиксация азота сульфатвосстанавливающими бактериями впервые была показана давно и подтверждена затем в опытах с N 15 только со штаммами D. desulfuricans Веrrе. После появления высокочувствительного ацетиленового теста способность к фиксации азота обнаружили среди видов p. Desulfovibrio и у мезофильных штаммов p. Desulfotomaculum. Термофильные штаммы Dm.nigrificans не фиксировали молекулярный азот. Высказано предположение, что ферредоксин и рубредоксин являются компонентами нитрогеназы Desulfovibrio. В бесклеточных экстрактах D.desulfuricans азотфиксация наблюдалась только в присутствии пирувата, метилвиологена, АДФ и КоА. Активность препаратов отсутствовала при добавлении сульфата или замене АДФ на НАД или НАД+АТФ. При инкубации клеток в атмосфере H 2 , являющегося единственным источником энергии и электронов, они не восстанавливали ацетилен независимо от присутствия или отсутствия сульфата. Анализ содержания адениннуклеотидов в клетках показал, что нитрогеназа активна только при наличии высокого уровня АТФ или высокого отношения АТФ/АДФ и не зависит от величины отношения + + (НАДН+НАДфН)/(НАД НАДф ). Несколько работ посвящено вопросам, связанным с биосинтезом аминокислот у сульфатвосстанавливающих бактерий. В клетках D.desulfuricans штамм АТСС 7757 нашли активность ферментов, участвующих в биосинтезе треонина, аланина и серина. Показано, что синтез серина происходил из 3-фосфоглицерата обычным путем через фосфооксипируват и фосфосерин. Фермент, катализирующий восстановительное аминирование пирувата с образованием аланина, был очищен в 56 раз. L -Аланиндегидрогеназа оказалась высокоспецифичной в отношении аланина и НАД и чувствительной к п-хлормеркурибензоату. Параллельно частично очистили глутаматдегидрогеназу. Из клеток D.desulfuricans также выделили и высоко очистили -аспартатдекарбоксилазу. Сообщается о ее специфичности к субстратам и чувствительности к различным ингибиторам. В бесклеточных экстрактах D.desulfuricans и фототрофной бактерии Chromatium sp. открыта ферментная система, катализировавшая новую реакцию восстановительного карбоксилирования пропионил- КоА с образованием а-кетобутирата. Синтез зависел от присутствия восстановленного ферредоксина, АТФ и КоА. Клетки используют а-кетобутират для синтеза изолейцина и через а-кетоглутарат для синтеза глутамата. Из клеток азотфиксирующего штамма D.desulfuricans штамм Веrrе-sol очистили в 800 раз неспецифическую адениннуклеотиддезаминазу, равно активную с АМФ, АДФ и АТФ. Фермент конкурентно ингибировался мочевиной, пхлормеркурибензоатом, цитратом, сукцинатом, малеатом, фосфатом, какодилатом, СuSO 4 и ионами Сl - . Дезаминаза отсутствовала у четырех других штаммов Desulfovibrio. 3.3. Биосинтез липидов Изучение состава фосфолипидов у нескольких видов p. Desulfovibrio показало, что бактерии по этому признаку были довольно сходны между собой и с другими анаэробными бактериями. Основным фосфолипидом был фосфатидилэтаноламин и в меньшем количестве присутствовали фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин. Штамм D.desulfuricans, выделенный из морского ила, не отличался от других бактерий рода по качественному составу фосфолипидов (36). Среди жирных кислот общего липидного экстракта у этого штамма присутствовали насыщенные и моноеновые изо- (С 15 -С 19 ) и антеизо- (С 15 ,С 17 ) кислоты, насыщенные нормальные С 14 -С 18 и моноеновые нормальные C 16 и С 18 кислоты. При сравнении данных по составу жирных кислот p. D.vulgaris Hildenborough, D.desulfuricans Esex 6 и D.desulfuricans Berre-sol обнаружили большое сходство между ними (36). Анализ структуры обнаруженных жирных кислот позволил сделать вывод, что моноеновые жирные кислоты синтезировались по так называемому «анаэробному пути синтеза». Этот путь синтеза моноеновых жирных кислот известен у многих других анаэробных и факультативно анаэробных бактерий (36), однако у них не были найдены ненасыщенные жирные кислоты с разветвленной цепью. Наличие изо- и антеизо-моноеновых жирных кислот у D.desulfuricans предлагается в дальнейшем использовать как таксономический признак этой бактерии. Из клеток D.gigas выделили липид, содержащий орнитин, который оказался главным компонентом полярных липидов и был поровну распределен между фракциями цитоплазматической мембраны и внутриклеточных мембран. Липид по мнению авторов, имеет, значение для структурной целостности мембран, дефицитных по фосфолипидам, играя компенсаторную роль. Подобные липиды найдены и у других микроорганизмов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Большое значение, которое сульфатвосстанавливающие бактерии имеют в природном круговороте углерода и серы, начиная с древних геологических времен (50), и существенный вред, наносимый ими экономике современного мира, определяют интерес к биохимическим процессам, лежащим в основе жизнедеятельности этой группы бактерий. Сульфатвосстанавливающие бактерии интересны еще тем, что по многим своим свойствам они могут рассматриваться как одни из наиболее древних и примитивных микроорганизмов. Под этими свойствами подразумевают наличие гидрогеназы; ферредоксина и нитрогеназы, способность осуществлять восстановительное карбоксилирование ацетата и фосфорокластическое расщепление пирувата и некоторые другие. Диссимиляторная сульфатредукция, по-видимому, единственный известный процесс, который мог привести к повышенному обогащению изотопом S32 сульфидов и серы, обнаруженных в породах, образовавшихся 1-2·109 лет назад. Понять механизм бактериального фракционирования изотопов серы будет трудно без знания отдельных этапов и ферментов пути восстановления сульфата. Уже довольно много известно о первых стадиях активации сульфата и его восстановления до сульфита, выделен ряд промежуточных переносчиков электронов и редуктаз частично восстановленных форм серы, хотя четкого представления об их взаимодействии пока что нет. Ясно, что окислительное фосфорилирование - основной процесс, обеспечивающий энергию для жизнедеятельности сульфатвосстанавливающих бактерий. Полная цепь переноса электронов и участки сопряжения однако не установлены. Хорошо изучена химическая структура многих участвующих компонентов, но из мозаики фактов еще лишь проглядывает картина их общего взаимодействия в обменных процессах сульфатвосстанавливающих бактерий. Появились только первые работы по конструктивному обмену, из которых тем не менее ясно, что подобно другим анаэробным бактериям, сульфатвосстанавливающие бактерии имеют укороченный цикл трикарбоновых кислот, обеспечивающий только потребности биосинтезу Выделение недавно новых видов сульфатвосстанавливающих бактерий, таких как Desulfotomaculum acetoxidans и Desulfomonas pigra, и обнаружение способности сульфатвосстанавливающих бактерий (70) и близкой по свойствам строго анаэробной бактерии Desulfuromonas acetoxigans использовать элементарную серу в качестве акцептора электронов свидетельствует, что мы еще многого не знаем о микроорганизмах участвующих в диссимиляторном восстановлении окисленных соединений серы в природе. 1.4 Методы предотвращения микробиологической коррозии Существует несколько способов предотвращения микробиологической коррозии (71): 1) применение ингибиторов-бактерицидов; 2) продувка среды кислородом для предотвращения развития анаэробных бактерий; 3) подавление жизнедеятельности бактерий путем изменения рН пластовой воды; 4) применение защитных покрытий; 5) катодная защита внешней поверхности сооружений; 6) удаление из среды органических веществ, являющихся питательной средой для СВБ. В зависимости от воздействия на микроорганизмы возможно подавление или стимулирование их жизнедеятельности. Фронт подавления представляют методы защиты, которые условно можно разделить на методы защиты воздействием на материал, воздействием на среду, в том числе и на микроорганизмы, и комбинированные методы [ (72), (73), (74)]. Принципиально эта классификация применима в более широком плане – к методам защиты от процессов повреждения материалов конструкций техники (коррозии, старения) в результате воздействия факторов среды. Возможна классификация методов защиты в зависимости от характера механизма, и средств применения. Кроме того, методы защиты от биоповреждений можно рассматривать в зависимости от применения мероприятий на стадии проектирования (рациональный выбор трассы, оптимальная конструкция сооружения и методов защиты), в процессе производства материалов и конструкций техники (выбор металла, нанесение защитных покрытий), а также в условиях эксплуатации (при защите новых участков, ранее не требовавших ее) и ремонта машин, оборудования и сооружений. Воздействие на металл и покрытие: 1. Механическое удаление загрязнений; 2. Повышение общей коррозионной стойкости металлов и защитной способности покрытий; 3. Гидрофобизирование поверхности; 4. Повышение адгезии покрытий; 5. Физические методы: обезвоживание, облучение; 6. Контактные ингибиторы коррозии, смазочные материалы; 7. Применение биоцидных ингредиентов в лакокрасочных покрытий (ЛКП). Воздействие на среду и условия эксплуатации: 1. Поддержание t ~ 20 °С, влажности менее 80 %, воздухообмен. 2. Предотвращение проникновения микроорганизмов (герметизация, очистка, осушка, воздуха и т. п.). 3. Электрохимические методы (катодная защита и т. п.). 4. Химические методы (летучие ингибиторы коррозии, биоциды и др.). Прямое воздействие на микроорганизмы: 1. Радиационная защита (радиоактивные вещества); 2. Биологическая защита (антагонизм, конкуренция микроорганизмов); 3. Экологическая защита (паразитизм неопасных микроорганизмов на опасных для повреждений микроорганизмов); 4. Подбор биоценозов в целях подавления процессов повреждений. Комбинированные методы: 1. Комплекс воздействий на металл; 2. Комплекс воздействий на среду; 3. Комплекс воздействий на микроорганизмы; 4. Сочетание комплексов воздействий. Защита металлов от биокоррозии в основном сводится к приемам предотвращения, ограничения развития или уничтожения микроорганизмов. Это достигается: повышением общей коррозионной стойкости металлов и покрытий; применением ЛКП, обладающих биоцидными свойствами или включающих биоциды; нанесением на поверхность конструкций машин смесей, включающих гидрофобизирующие, ингибирующие вещества и биоциды; поддержанием определенных условий эксплуатации (относительная влажность воздуха не более 80 %, температура не выше 20 °С, воздухообмен, очистка воздуха и поверхностей конструкций от механических загрязнений); вводом в водные среды эффективных добавок бактерицидов; применением катодной защиты для подземных сооружений, протекторной защиты для гидросооружений и плавсредств; применением рецептур для консервации, содержащих ингибиторы коррозии, в том числе летучие. Коррозионная стойкость металлов и покрытий может быть повышена применением металлов и покрытий, устойчивых против атмосферной коррозии; металлических покрытий, которые являются ядами для микроорганизмов (цинк, свинец) или продукты окисления которых являются биоцидами (окислы меди и др.); снижением шероховатости и очисткой поверхности металлов от загрязнений всех видов; использованием в растворах, предназначенных для нанесения металлических и конверсионных покрытий, биоцидных веществ (борная кислота и ее соли, полиамины и полиимины, оксихинолин и его производные и т. п.) и удалением из растворов веществ, которые могут адсорбироваться на поверхности и в порах покрытия и служить питательной средой для микроорганизмов (декстрин, крахмал, столярный клей, сахара, аминокислоты, цианиды и т. п.) (75). Комплексные соединения меди с различными органическими кислотами (щавелевой, пировиноградной, кетоглутаровой, яблочной, винной, лимонной и др.) обладают биоцидностью, как и ионы меди. Однако увеличение концентрации адденда снижает токсичность комплекса. Многие адденды и активные добавки, вводимые в электролиты, тоже имеют высокую биоцидность (бензтриазол, иодаллилуротропин, полиэтиленимин, некоторые алифатические и ароматические альдегиды) (76). Для ингибирования бактериальной коррозии, стимулируемой накопительными культурами СВБ, и подавления жизнедеятельности последних разработаны методы защиты с применением ингибиторов-бактерицидов из классов нитропарафинов, селенсодержащих бии тетрациклических органических соединений, вводимых в интервале концентраций 0,1...0,2 г/л. При этом практически полностью предотвращается образование сероводорода. Эффективную защиту водоохлаждающих систем от биоповреждений микробными ассоциациями обеспечивает смешанный цинк-хромат-фосфатный ингибитор коррозии (77). Гидрофобизирование пористых покрытий (металлических, фосфатных, оксидных) осуществляют пропиткой 5... 15 %-ным раствором ГКЖ-94 в бензине Б-70. Для меди, медных сплавов и покрытий сочетание предварительной обработки поверхностей изделий в патинирующих растворах с последующей пропиткой приведенным гидрофобизирующим составом обеспечивает защитную способность покрытий в течение многих лет. Защита металлической арматуры заглубленных в почву бетонных сооружений осуществляется введением в строительный материал или нанесением на поверхность конструкций силиконов, щелочных, щелочноземельных и цинковых солей кремнефтористоводородной кислоты, солей и окислов меди. Однако рекомендуемые добавки, введенные в бетон, теряют свою активность, а на поверхности конструкций имеют недостаточную стабильность (78). Катодная защита ингибирует рост микроорганизмов. Это явление может быть объяснено следующими причинами: ионы водорода поступают к катоду в большем количестве, чем могут быть использованы микроорганизмами; молекулярный водород образует защитную пленку; на поверхности металла образуется избыток гидроксильных ионов (анодная зона), вследствие чего идет процесс подщелачивания (рН увеличивается до 9...10) и создаются среды, подавляющие развитие бактерий и грибов. Предотвращение обрастания микроорганизмами и биокоррозии в водных и органических растворах достигается обработкой поверхности изделий радиоактивным технецием или его соединениями. Толщина покрытий от моноатомного до 0,127 мм. Способ нанесения электрохимический, катодный, распылением, осаждением из газовой фазы, металлизацией, осаждением в вакууме (79). Консервация и применение ингибиторов, обладающих биоцидными свойствами, позволяет в условиях эксплуатации обеспечить достаточно высокую защиту машин, оборудования и сооружений от коррозии и воздействия микроорганизмов. Из известных средств заслуживают внимания смазочные материалы и масла с присадками, обеспечивающими защиту от атмосферной биокоррозии, а также пленки, бумаги, ткани, обработанные биоцидами, летучие ингибиторы. Применение последних осуществляется: нанесением соответствующих растворов на поверхности металлоконструкций; периодическим распылением их в замкнутом пространстве или в условиях с ограниченным обменом воздуха; предварительной пропиткой упаковочных материалов, вкладышей и поглотителей (80). Специальные средства защиты, предотвращающие биокоррозию, появились не так давно. Ранее, как правило, использовались катодная защита и методы и средства защиты от почвенной коррозии. Отмечалось лишь, что для снижения коррозионной опасности с участием СВБ следует избегать анаэробных условий, а в качестве самого действенного защитного средства указывалась аэрация. Для ее повышения рекомендовалось улучшить дренаж заболоченных почв и использовать в качестве грунтовой засыпки крупнозернистые материалы, например гравий. Данный способ борьбы с биокоррозией малоперспективен, так как СВБ не погибают в присутствии кислорода, в то же время возникают дополнительные проблемы с обычной коррозией (81). Также предполагалось, что в основе действия традиционной катодной защиты лежит неблагоприятный для СВБ сдвиг в крайне отрицательную щелочную область. Эффективным считалось применение катодного тока с плотностью до 160 мА/дм2. Значение рН при этом достигали 9-10. Однако, как указывалось ранее, на практике сохраняется как количество СВБ, так и их активность. Таким образом, возникла необходимость применения более эффективных методов борьбы с биокоррозией, которые в настоящее время подразделяются на физические и химические (82). К физическим методам борьбы с СВБ относятся рентгеновское и ультрафиолетовое облучение, воздействие ультразвуком, радиационное облучение λ-, β-, γ-лучами, тепловое воздействие, а также применение токов высокой частоты. Ионизирующее излучение обладает высокой проникающей способностью, при этом эффект воздействия зависит от дозы облучения. Нередки случаи, когда излучения в малых дозах стимулирует интенсивность жизненных процессов. Однако с возрастанием дозы излучения все резче проявляется угнетающее действие лучей – изменяются морфологические и физиологические свойства бактерий, задерживается их рост и размножение. Дальнейшее увеличение лучистой энергии вызывает гибель бактериальной клетки. Установлена возможность уменьшения скорости биокоррозии стали путем стерилизации вод ультрафиолетовым излучением с длинной волны 254-257 нм. Скорость коррозии углеродистой стали в облученных водах снижается до 50 %, благодаря подавлению жизнедеятельности СВБ, тионовых и железобактерий. В качестве источника γ-излучения в установках используют радиоактивный кобальт 60 ( Со). Основная масса бактерий (90 %) погибает при относительно невысоких дозах облучения 10000-15000 Р. Основным критерием, характеризующим коррозионную активность СВБ, является концентрация биогенного сероводорода. Разработанный метод заметно угнетает развитие СВБ, а при летальных дозах γ-излучения полностью прекращает жизнедеятельность бактерий и образование в среде основного коррозионного агента – сероводорода. Чувствительность бактериальных клеток к радиоактивным излучениям зависит от состава экологической среды обитания микроорганизмов, возраста культуры бактерий, наличия кислорода, температуры, рН среды, условий культивирования до и после облучения и другие. Характерной особенностью излучений является их способность вызывать ионизацию атомов и молекул, что приводит к разрушению молекулярных структур, вызывает патологические изменения в клетках и отмирание микроорганизмов. Бактерицидное действие ультразвука основано на механическом разрушении бактерий в ультразвуковом поле: действие ультразвука распространяется в равной мере на вегетативные и споровые формы микроорганизмов. В настоящее время имеется множество способов термического воздействия на микроорганизмы, в которых рабочим агентом является пар высокого давления. Создана установка непрерывного действия, и разработан способ обеззараживания сточных вод с использованием струйных аппаратов. Установка предназначена для стерилизации сред, содержащих споровые и неспоровые микроорганизмы. Испытания показали, что полная инакцивация СВБ наступает при мгновенном нагреве воды до 90 0С. Известен метод стерилизации воды путем применения электрогидравлического эффекта (ЭГЭ) – высоковольтного импульсного разряда в жидкости, сопровождающегося резким повышением температуры, гидравлического давления в канале разряда и так далее. Отмечена перспективность применения ЭГЭ для обеззараживания воды. При использовании методов радиационного и ультрафиолетового облучения, ультразвукового воздействия и электрогидравлического эффекта стерилизация происходит только в пределах самой установки. Однако эти способы не оказывают влияния на внутреннюю поверхность трубы и тем более пласт, где происходит генерация сероводорода. На зараженных СВБ и сероводородом объектах применение вышеперечисленных физических методов не приводит к стерилизации всей системы. Полная стерилизация всей системы в этих условиях может быть достигнута только при сочетании физических и химических методов обеззараживания. Ввиду отсутствия гарантий бесперебойной работы любой установки стерилизацию химреагентами необходимо производить периодически. В нефтегазовой промышленности наибольшее применение нашла обработка зараженных микроорганизмами сред химическими веществами - бактерицидами. Указанные реагенты должны обладать высоким бактерицидным эффектом, в особенности по отношению к СВБ; эффективно защищать сталь от коррозии в агрессивных коррозионных средах; хорошо диспергироватся в субстрате; кроме того, желательно, чтобы бактерицид не был высокотоксичным. Важно, чтобы рекомендуемые бактерициды и их композиционные смеси имели хорошую сырьевую базу и экономически выгодную стоимость. В качестве бактерицидов применяются различные классы как органических, так и неорганических соединений. Для удаления сероводорода из воды и закачки в нефтеносные пласты применяют нейтрализаторы, такие как реагент ЖС-7, представляющий собой порошок следующего состава: 98 % Fe 2 O 3 и 1,5-2,0 FeCl 3 ; комплексное соединение меди – тетрааминкупрогидроксид [Cu(NH 3 ) 4 (OH) 2 ]; хлорид цинка ZnCl 2 ; двуокись марганца MnO 2 и так далее. Эти реагенты взаимодействуют с сероводородом с образованием нерастворимых в воде сульфидов и других продуктов. Реакции с соединениями такого типа носят обратимый характер и для устойчивости получаемых продуктов необходима щелочная среда. Поэтому для поддержания рН в пределах 9-10 добавляют известь или едкий натр, например: 2 FeCl 3 + H 2 S → 2 FeCl 2 + 2 HCl + S; 2 FeCl 2 + 2 NaOH + H 2 S → FeS↓ + 2 NaCl + 2 H 2 O; HCl + NaOH → NaCl + 2 H 2 O. Существуют критерии, по которым судят об эффективности применяемого бактерицида: концентрация H 2 S и SO 24 , число СВБ в единице объема воды или грунта. Эти показатели определяются до и после обработки среды биоцидом, концентрация которого в промышленных испытаниях всегда на 1-1,5 порядка превосходит данные лабораторных испытаний. Считают, что эффективной концентрацией бактерицида является та, при которой погибает не менее 99 % бактерий. Одним из наиболее распространенных, дешевых и достаточно эффективных бактерицидов является формалин. Он представляет собой 40 % водный раствор формальдегида (Н 2 СО). На промыслах «Татнефти» были проведены промышленное испытание формалина с концентрацией 0,1-0,2 %. Установлено, что продолжительность бактерицидного эффекта составляет около года. При повторной обработке формалином зараженной бактериями среды адаптации СВБ к реагенту не происходит. С целью ингибирования роста микроорганизмов в околотрубных грунтах и на стенках обсадных колонн скважин для предотвращения биокоррозии в качестве бактерицида испытан диэтиламин (С 2 H 5 ) 2 NH, являющийся доступным товарным продуктом, выпускаемым химической промышленностью. Обработка почв и буровых растворов диэтиламином уже в течение первых 24 часов позволила на несколько порядков снизить численность микроорганизмов. Эффективным реагентом для борьбы с сероводородной коррозией является металлилсульфонат (МСН) – доступный промышленный продукт, широко используемый как сополимер при синтезе нитронного волокна, обладающий бактерицидной активностью в отношении СВБ и свойствами нейтрализатора сероводорода. Реагент представляет собой тонкодисперсный порошок, хорошо растворимый в воде и нетоксичный. Для повышения эффективности предотвращения роста бактерий, оздоровления условий труда и уменьшения доз бактерицида предложен способ, по которому в притрубный грунт или пластовую воду вводился реагент β-хлорэтоксин-2,2,2-трихлорэтил-Nметилкарбамат. Данное вещество представляет собой вязкую жидкость с температурой кипения 148 оС, не растворимую в воде, но растворимую в ацетоне, спирте, бензоле. Реагент вводится в количестве 0,4-0,5 мл/л воды. Дозировка карбамата 0,1 мл/л полностью подавляет жизнедеятельность СВБ, но с учетом разбавления реагента в пластовых водах дозировку бактерицида увеличивают до 0,4-0,45 мл/л. Для закачки в грунт это количество снижается в 3-4 раза. Технико-экономические преимущества предполагаемого способа заключается в том, что данный реагент по своей эффективности превосходит бактерицидность такого биоцида, как формалин, и действует при этом в гораздо меньших дозах. Кроме того, он более дешев, не является летучим и не оказывает токсического воздействия на людей. Среди четвертичных солей аммония (ЧСА) в качестве бактерицидов известны алкилтриметиламмонийхлорид, алкилбензилдиметиламмонийхлорид, алкилбензолпиридинийхлорид и др.; они зарекомендовали себя как эффективные реагенты для борьбы с СВБ. Преимуществами четвертичных солей аммония в качестве биоцидов перед другими соединениями являются продолжительное время сохранения активности при минимальных биоцидных концентрациях и относительно низкая стоимость. Возможный механизм действия четвертичных солей аммония связан с катионной структурой соединений и способностью растворяться в фосфолипидных слоях клеточной оболочки бактерий, вызывая их разрушение. Известны также композиционные смеси, где в качестве биоцидной основы применяются алкилтриметаламмонийхлорид C12 H 25 C 20 H 41 N CH 3 3 (АТМ-хлорид). Смесь состоит из АТМ-хлорида, Na 3 PO 4 , Na 2 CO 3 и Na 2 P 2 O 7 . Примером таких смесей может служить реагент нитран, используемый для защиты металлического оборудования нефтегазовых промыслов от бактериальной коррозии. Обычно смесь различных четвертичных соединений используют чаще, чем отдельные вещества, в виду того, что смесь обладает высоким защитным и бактериальным действием. Кроме того, для борьбы с СВБ используются третичные и четвертичные азотосодержащие органические соединения другого типа, например: NH CH 3 R HC N CH 3 NR2 NH CH 3 R1 C X , и NH CH 3 R3 где R 1 , R 2 , R 3 – алкил, арил или арилакил; Х – галоген. При концентрации 100-200 мг/л этих веществ отмечено полное подавление жизнеспособных форм СВБ, а при 50-100 мг/л защитный эффект в кислых средах составляет 96-98 %. Для предупреждения развития СВБ предложены сульфитобетаины с общей формулой R1 R4 R2 N CH CH 2 OSO2 , R3 где R 1 – алкильный радикал с длиной цепи от С 8 до С 12 ; R 2 , R 3 , R 4 представляют собой водород или алкид с числом атомов углерода от 1 до 4. В насыщенных сульфатами грунтах и водах для борьбы с СВБ рекомендуются SO 2 – замещенные амины с формулой R1 N SO2 , R2 R3 где R 1 – алкильный остаток с длинной цепи от С 8 до С 12 ; R 2 и R 3 – H+ или алкильные остатки с длиной цепи от С 2 до С 4 . Наиболее эффективны соединения, у которых R 2 и R 3 – метил и этил. Использование этих соединений при очень низких концентрациях обеспечивает значительный эффект по отношению к сульфатредукторам. Технология производства бактерицида проста и заключается в замещении соответствующих аминов диоксидом серы (83). Методика определения количества жизнеспособных клеток СВБ после воздействия МГДО на промысловые среды Оценка эффективности воздействия МГДО на жизнедеятельность бактерий осуществлялась в ходе визуального наблюдения с помощью микроскопа «Биолам» (× 2000), а также с использованием метода предельного разведения (ОСТ 39-151-83) и тестов контроля количества в среде «Dip-slides containing TTC and Rose Bengal Medium» и «BART™ TEST FOR HAB» (приложение Б). Сущность методики заключается в определении количества бактерий в 1 мл пробы. Определение количества бактерий методом предельного разведения включает последовательное десятикратное разведение анализируемой пробы в питательной среде, регистрацию наличия или отсутствия роста бактерий во флаконах после инкубации их в термостате (таблица 2) и расчет наиболее вероятного числа клеток бактерий, содержащихся в 1 мл исходной пробы. Следует учесть, что методика предельных разведений дает возможность определить не истинное число бактерий, а только число жизнеспособных клеток в популяции и не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут или растут крайне медленно. Для проведения разведений используют пенициллиновые флаконы, в которые предварительно с соблюдением стерильности было разлито по 9 мл питательной среды. Затем отбирают 1 мл анализируемой пробы стерильным шприцем и вводят в первый пенициллиновый флакон с 9 мл питательной среды. Это первое разведение - 1:10. Полученную в первом разведении суспензию тщательно перемешивают и с помощью нового стерильного шприца переносят 1 мл этого разведения в следующий (второй) флакон. Это второе разведение - 1:100. Таким же образом готовят и последующие разведения. Для приготовления каждого последующего разведения используется новый стерильный шприц. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата. Таблица 2 - Определение наиболее вероятного числа живых клеток в исходной пробе Номер флакона, в котором отмечен рост бактерий Разведение 1 2 3 4 5 6 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000 Наиболее вероятное количество бактерий в исходной пробе, клеток/мл от 1 до 10 свыше 10 и до 100 свыше 100 и до 1000 свыше 1000 и до 10000 свыше 10000 и до 100000 свыше 100000 и до 1000000 Обычно делают 5-7 разведений в 2-3 параллельных флаконах. Засеянные флаконы помещают в термостат при 34-35 0С. Время инкубации 15 дней. Развитие СВБ определяют по помутнению среды и образованию черного осадка сульфида железа. Исходя из полученных данных (наличие или отсутствие роста после инкубации), рассчитывают число жизнеспособных клеток, содержащихся в 1 мл исходной (анализируемой) неразведенной пробы. Согласно таблице 2, которая поможет определить наиболее вероятное число живых бактерий в исходной пробе. На практике при подсчете бактерий методом предельных разведений можно наблюдать случаи, когда среди флаконов, в которых регистрируется рост бактерий, имеется один флакон, где рост отсутствует. Например, приготовлены последовательно разведения в семи флаконах. Рост отмечен в 1, 2, 3 и 5 флаконах, но отсутствует в 4, 6 и 7. В этом случае объяснения могут быть следующими: - по какой-то причине бактерии в 4 флаконе погибли, тогда как в 5 флаконе остались живыми; - произошло случайное заражение бактериями среды в 5 флаконе; - в 4 флакон из 3 флакона попали единичные клетки бактерий и при последующем разведении все эти бактерии были просто перенесены в 5 флакон. В данном случае значение числа жизнеспособных клеток надо выразить в виде величины «10000 клеток/мл», но не «100000 клеток/мл». Метод предельных разведений требует особой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать питательные среды, шприцы от заражения микроорганизмами (например, из воздуха). Необходимые аппаратура и реактивы: Опытная ячейка для проведения МГДО (рисунок 10); Микроскопа «Биолам» (×2000); Магнитная мешалка ПЭ 6110; Колбы химические емкостью 250 мл по ГОСТ 1770-74; Фильтры бумажные «белая лента» по ТУ 6-09-1678-95; Пенницилиновые флаконы со средой Постгейта; Стерильные шприцы; Термостат SNOL 67/350. Проведение экспериментов Цель эксперимента определить влияние магнитной обработки на жизнедеятельность СВБ. Для проведения МГДО промысловых сред, содержащих СВБ, была разработана и изготовлена опытная магнитная ячейка (рисунок 9). На рисунке 10 приведена схема опытной ячейки для проведения МГДО. Она состоит из немагнитных корпуса (5) и крышки (1) с двумя патрубками (2) для продувки азотом с целью удаления кислорода, перемешивающего устройства (4) и ИМП (6). В качестве ИМП были выбраны магниты Nd 2 Fe 14 B с индукцией 0,1 Тл, которые при относительно невысокой цене обеспечивают длительную работу устройств для МГДО промысловых сред. Тарировку ячейки проводили с помощью тесламетра типа ПИЭ МГ Р 2, замеряя величину магнитной индукции в зазоре между ИМП. Изменение размера зазора предусмотрено в конструкции ячейки. Приведенная погрешность измерений величины магнитной индукции составляла 1,5 %. Для развития и роста СВБ требуется специальная среда - среда Постгейта, имеющая следующий состав: калий фосфорнокислый однозамещенный, аммоний хлористый, кальций сернокислый, магний сернокислый, натрий молочнокислый, натрий хлористый; добавки: дрожжевой экстракт, железо сернокислое закисное, натрий углекислый кислый, натрий сернистый. Для проведения исследований использовали 2 колбы с пластовой водой по 20 мл в каждой, зараженной клетками СВБ, а также 16 флаконов со средой Постгейта. Флаконы с питательной средой маркировали путем порядковой нумерации. Из анализируемой пробы, зараженной СВБ, отбирали 1 мл пластовой воды стерильным шприцем и вводили ее во флакон с питательной средой Постгейта, размешивали и из него же отбирали 1 мл раствора и помещали во второй флакон. Затем из второго в третий, из третьего в четвертый и т.д. а) внешний вид б) расстановка магнитов Рисунок 9 - Опытная ячейка для проведения МГДО О2 N2 1 2 5 3 4 6 S S N N S S N N 7 1 - герметичная крышка; 2 - патрубки; 3 - испытуемая среда; 4 - перемешивающее устройство; 5 - корпус; 6 – ИМП; 7 - держатели магнитов Рисунок 10 – Схема опытной ячейки для проведения МГДО Всего делали 8 пересевов. В остальные 8 флаконов – добавили пластовую воду, которая была обработана магнитным полем с помощью магнитной мешалки ПЭ 6110 в специальносконструированной микробиологической магнитной ячейке в течение 5 минут. Под воздействием центробежных сил сульфат-ионы и клетки СВБ относятся к стенкам ячейки, где обрабатываются магнитным полем. Из обработанной пробы стерильным шприцом отбирали 1 мл пластовой воды и вводили сначала в первый флакон, и так далее, по методике предельных разведений. Засеянные флаконы поставили для инкубации в термостат SNOL 67/350 при температуре 34 0С на 2 недели. Угловую и линейную скорость вращения среды относительно ИМП устанавливали на перемешивающем устройстве. При этом угловую скорость (с-1) рассчитывали по формуле где n – число оборотов, а линейную (м/с) - n 30 , (5) V R , (6) где R – радиус ячейки, м. Среднестатистическая относительная ошибка измерения величин ω и V не превышала 5 %. При вращении перемешивающего устройства клетки СВБ в биозараженной среде под действием центробежных сил переносятся к внутренней стенке ячейки и группируются по ее периметру. В том же направлении под действием индуцированных в магнитном поле электрических токов перемещаются ионы гидроксония, в результате чего рН среды в области по периметру внутренней стенки ячейки становится равным 2-3. Это приводит к прекращению жизнедеятельности СВБ. Необходимые аппаратура и реактивы Опытная магнитная ячейка (рисунок 9); Термостат SNOL 67/350; рН-метр МА 130 (Metler, Toledo); Питательная среда Постгейта; Штаммы СВБ; Индикаторы рН: бромтинол красный, бромфенол красный, бумага лакмусовая (ПНД-50-97584); Колбы химические емкостью 250 мл по ГОСТ 1770-74; Пробирки по ГОСТ 1756-76; Микрошприц 0,1 мл; Пластовая вода (ППД филиала «Башнефть-Уфа» ОАО «Башнефть» от 24.04.06); Вода, дистиллированная по ГОСТ 6709-72; Фильтры бумажные «белая лента» по ТУ 6-09-1678-95; Кювета химическая. Водородный показатель промысловых сред определяли с помощью электронного рНметра типа МА 130 (Metler, Toledo) и индикаторов рН [147]. Среднестатистическая относительная ошибка измерения величины рН составила 1,5 %. 2.4 Влияние МГДО пластовых сред, содержащих СВБ, на скорость и характер коррозии стали 20 Влияние МГДО на скорость коррозии стали 20 в средах, содержащих СВБ, определяли гравиметрическим методом на образцах, помещавшихся в необработанную и обработанную среду. Необходимые аппаратура и реактивы Опытная ячейка для проведения МГДО; Образцы из стали 20; Колба ёмкостью 2000 мл по ГОСТ 1770-74; Ячейки объемом 700 мл; Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72; Медь (ll) сернокислая 5-водная «Ч» по ГОСТ 4165-78; Сода каустическая по ГОСТ 2263-79; Фильтры бумажные «белая лента» по ТУ 6-09-1678-95; Штаммы СВБ; Микрошприц МШ – 1 0,1 мл; Термостат SNOL 67/350. Для приготовления модели пластовой воды в колбу емкостью 2000 мл помещают 50 г сульфата меди, 40 г каустической соды и 40 г хлорида натрия, добавляют дистиллированной воды до метки и тщательно перемешивают. Затем, из приготовленного раствора удаляют осадок, используя фильтр «белая лента». Приготовление раствора выполняется при температуре окружающего воздуха 20 ± 1 °С. Очищенный раствор разливают по двум ячейкам, причем первая ячейка обрабатывается в постоянном магнитном поле с целью уменьшения содержания свободных сульфат-ионов. В ячейки помещают исследуемые стальные образцы, которые предварительно зачищают, обезжиривают и взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,0001 г. Ячейки продувают азотом в течение 15 минут для удаления кислорода, герметично закрывают и затем, среду заражают клетками СВБ, добавляя в ячейки с помощью микрошприца по 0,1 мл культуры СВБ. После этого ячейки помещают в термостат при температуре 32 °С на 14 дней. После проведения исследований образцы вынимают, осторожно зачищают от продуктов коррозии, обезжиривают и взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,0001 г. Среднестатистическая относительная ошибка измерения скорости коррозии образцов не превышала 0,5 %. 2.5 Исследование эффективности противокоррозионных и биоцидных свойств реагентов в сравнении с МГДО промысловой среды Предметами проведенных исследований являлись испытания эффективности противокоррозионного защитного действия ингибиторов коррозии СНПХ-1004, КорМастер 1035 и Азол 5010 относительно углеродистой стали в средах, характерных для промысловых систем сбора и транспорта подтоварной воды месторождений Западной Сибири, а также оценка их бактерицидной активности относительно СВБ. Защитные свойства реагентов испытывались в водных бескислородных (углекислотная) средах. В качестве исходной коррозионной среды использовалась минерализованная вода следующего состава: - NaCl-17 г/л; - СаС1 2 ·Н 2 О – 0,26 г/л; - NaHC0 3 – 0,63 г/л. Удаление кислорода из среды осуществлялось продувкой углекислым газом в течение 40 минут. При определении защитного действия использовались следующие дозировки реагентов: 25 мг/л, 50 мг/л, 100 мг/л, а при оценке бактерицидной активности - 100 мг/л, 200 мг/л, 500 мг/л, 1000 мг/л, 2000 мг/л. Исследования проводились на металлических пластинках (сталь 20), имеющих площадь поверхности, равную 10 см2 или 10-3 м2. Оценка бактерицидного действия проведена по отношению к планктонным и адгезированным формам СВБ. Исследования проводились в соответствии с ГОСТ 9.506-87 «Ингибиторы коррозии металлов в водно-агрессивных средах», РД 39-3-973-83 «Методика контроля зараженности нефтепромысловых вод и оценка защитного и бактерицидного действия реагентов» и РД 39-0147103-350-89 «Оценка бактерицидной эффективности реагентов относительно адгезированных клеток сульфатвосстанавливающих бактерий при лабораторных испытаниях» [148-152]. В начале готовятся ячейки (колбы): тщательно промываются и ополаскиваются дистиллированной водой. Для каждого реагента и контроля готовятся по две стальные пластинки, предварительно зачищаются, обезжириваются и выдерживаются в эксикаторе. Взвешивают пластинки и погружают в ячейки с агрессивной средой, которую предварительно продувают углекислым газом для насыщения и удаления кислорода. Ячейки плотно закрываются пробкой для того, чтобы ограничить доступ кислорода. Шприцом через пробку вводят заданное количество реагента. Далее каждая ячейка ставится на магнитную мешалку. Опыт проводят в течение 6 часов. По истечении времени мешалку отключают. Образцы очищают от образовавшихся продуктов коррозии, сушат в эксикаторе и взвешивают. Скорость коррозии рассчитывают по формуле (7) K m (m1 m0 ) , S (7) где K m - показатель коррозии массы, г/(м2·ч); m 0 - начальная масса образца, г; m1 - масса образца после испытаний, г; S - площадь поверхности образца, м2; - время испытаний, ч. Защитную эффективность ингибитора от общей коррозии (Z ок , %) определяли, согласно ГОСТ 9.506-87, по скорости коррозии (г/м2·ч) образцов в неингибированной среде (V х.о. ) и в той же среде содержащей ингибиторы коррозии (V инг. ) по формуле Z ок. = V х.о Vинг . 100 %, V х .о . (8) Реагенты, показавшие при испытаниях защитный эффект, равный 80% и выше, рекомендуют к внедрению. Среднестатистическая относительная ошибка измерения скорости коррозии не превышала 3 %. РД- Оценка бактерицидной эффективности реагентов относительно адгезированных клеток сульфатвосстанавливающих бактерий при лабораторных испытаниях Настоящий руководящий документ предназначен для инженерно-технических и научных работников предприятий (организаций) Миннефтепрома, занимающихся проблемами защиты нефтепромыслового оборудования и коммуникаций от микробиологической коррозии. П.2.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ П.2.1.1. Значительная часть коррозионных повреждений нефтепромыслового оборудования и коммуникаций обусловлена жизнедеятельностью микробных сообществ, формирующихся в условиях нефтяного месторождения. Среди микроорганизмов, иницинирующих процесс разрушения металла, главная роль принадлежит сульфатвосстанавливающим бактериям (СВБ). При этом большая часть СВБ, содержащаяся в нефтепромысловых водах, адгезирована на твердой поверхности и лишь небольшое количество представлено свободно-плавающими (планк-тонными) клетками. Адгезия бактериальных клеток на поверхности осуществляется с помощью продуцируемых ими внеклеточных биополимеров-полисахаридов, которые играют роль барьера, предохраняющего клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе и бактерицидов. Бактерициды оказывают избирательное действие на клетки бактерий. Как правило, адгезированные СВБ более устойчивы к их действию, чем планктонные клетки. Следовательно, для оценки реальной эффективности бактерицидов необходимы исследования как на планктонных, так и на адгезированных клетках СВБ. П.2.1.2 Данная методика разработана для скрининга реагентов относительно адгезированных на металлической поверхности СВБ в лабораторных условиях. П.2.1.3 Сущность метода заключается в следующем: образцы из малоуглеродистой стали выдерживают в активной культуре СВБ. Затем их обрабатывают бактерицидом и асептически переносят в культуральные сосуды с питательной средой и определяют минимальную летальную концентрацию реагента. Испытания проводятся в статических условиях. П.2.2. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ П.2.2.1 Для работы с адгезированными на металической поверхности сульфатвосстанавливающими бактериями необходимо следующее оборудование: автоклав электрический ГОСТ 9586-75Е термостат суховоздушный ТУ 64-1-1382-83 ТС-80М-2 шкаф сушильный лабораторный ТУ 16-531. 097-67 диспергатор ультразвуковой ТУ 25-05. 2170-77 приспособление для закручивания алюминиевых колпачков шприцы медицинские, емкостью 1,2 мл, с набором инъекционных ГОСТ 22967-82Е игл ГОСТ 25377-82Е пипетки колбы плоскодонные ГОСТ 20292-74Е ГОСТ 25336-82Е склянки пеницилиновые с плоскими резиновыми пробками пробирки химические ГОСТ 25336-82Е стерилизатор медицинский ГОСТ 19569-80Е пробки резиновые ГОСТ 7852-76 спиртовки ГОСТ 25366-82Е спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87 рН-метр-милливольтметр типа рН-673М ГОСТ 15150-69 бумага индикаторная универсальная алюминевые колпачки образцы плоские диаметром 10 мм (h=2 мм) из малоуглеродистой стали 3 камера с ламинарным течением воздуха типа УО-БГ или УПЕК-1 ТУ 46-22-562-80 П.2.2.2 Для обнаружения СВБ и поддержания культуры с целью сохранения жизнеспособности клеток, а также таксономических свойств бактерий используется среда Постгейта В: основная среда калий фосфорнокислый ГОСТ 4198-75 однозамещенный КН 2 РО 4 -0,5 г ГОСТ 3773-72 аммоний хлористый - 1 г NH 4 Cl ГОСТ З210-77 кальций сернокислый - 1,0 г CaSO 4 магний сернокислый 7-водный MgSO 4 7H 2 O- 2,0 г ГОСТ 4523-77 натрий молочнокислый C 2 H 5 O 3 Na - 3,5 г ТУ 6-09-3664-74 натрий хлористый NaCl- 5 г ГОСТ 4233-77 Добавки : дрожжевой экстракт (5% водный экстракт)- 1 г ТУ 6-09-3979-75 железо сернокислое закисное 7-водное FeSO 4 7H 2 O - 0,5 г ГОСТ 4148-78 ГОСТ 4201-79 натрий углекислый кислый NaHCO 3 натрий сернистый Na 2 S 9H 2 O- 0,2 г ГОСТ 2053-77 В качестве восстановителей для питательных сред можно использовать сульфид натрия, аскорбиновую кислоту и другие. Все реактивы основной среды растворяют в 1 л водопроводной воды. Добавки готовят каждую в отдельности. П.2.2.3 Для накопления клеток СВБ в лабораторной практике для исследовательскнх целей используется среда Постгейта С: калий фосфорнокислый однозамеГОСТ 4198-75 щенный KH 2 PO 4 0,5 г аммоний хлористый Na 2 Сl - 1 г ГОСТ 3773-72 натрий сернокислый Na 2 SO 4 - 4,5 г кальций хлористый 6-водный CaCl 2 6H 2 O - 0,06 г магний сернокислый 7-водный MgSO 4 7H 2 O -0,06 г натрий молочнокислый C 2 H 5 O 3 Na - 6 г натрий лимоннокислый C 6 H 5 O 7 Na-0,3 г дрожжевой экстракт- 0,1 железо сернокислое - 7-водное FeSO 4 7H 2 O -0,004 г дистиллированная вода - 1 л хлористый натрий NaCl - ГОСТ 6053-77 ГОСТ 4209-77 ГОСТ 4523-77 ТУ 6-09-3664-74 ГОСТ 22280-76 ТУ 6-09-3979-75 ГОСТ 4148-78 по мере надобности П.2.3. ПОДГОТОВКА И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ДОБАВОК И ПОСУДЫ П.2.3.1 Приготовление добавок Навеску дрожжевого экстракта, растворенную в дистиллированной воде, тщательно перемешивают, кипятят 20 минут и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вновь кипятят 20 минут и фильтруют через мелкопористый бумажный фильтр. Железо сернокислое закисное готовят в виде 5 % раствора в растворе соляной кислоты. Натрий углекислый кислый - 5 % водный раствор, который используют для установления рН среды до 7.2. Натрий сернистый - 5 % раствор в 5 % растворе натрия углекислого кислого, хранится в холодильнике, после стерилизации используется не более 7 дней. П.2.3.2 Стерилизацию питательных сред, добавок и других материалов проводят насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного в специально предназначенных для этого автоклавах. Питательную среду и добавки разливают в колбы не выше, чем на половину объема колбы и закрывают ватными пробками и бумажными колпачками. Стерилизацию основной среды проводят в автоклаве при температуре 120 2 0С, избыточном давлении 0,1 МПа, а добавок - при давлении 0, 05 МПа. Время стерилизации 30 мин. П.2.3.3 После стерилизации основной раствор питательной среды обескислораживают кипячением с последующим быстрым охлаждением под струей водопроводной воды. Затем в той же последовательности, которая указана в П2.2.2., вносятся добавки. П.2.3.4 Величину рН среды контролируют с помощью рН-метра или по универсальной индикаторной бумаге. Раствор сульфида натрия приливают по каплям стерильной пипеткой до появления темно-серой окраски среды. Разлив сред и добавок проводят с соблюдением правил стерильности над пламенем спиртовки. П.2.3.5 Установка автоклава и работа с ним производится при строгом выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица. Простерилизованные автоклавированием среды проверяют на стерильность путем термостатирования в течение суток при температуре 30 °С. Если среда сохраняет прозрачность, считают, что она стерильна. Хранят среды в холодильнике. Срок хранения не более 2-х недель. П.2.3.6 Всю посуду перед стерилизацией тщательно моют и высушивают. П.2.3.7 Колбы, пробирки и пенициллиновые склянки закрывают ватными пробками и заворачивают в бумагу. П.2.3.8 Пробки готовят из медицинской ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце. П.2.3.9 В концы пипеток вставляют ватные тампоны и заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см. П.2.3.10 Резиновые пробки моют горячей водой с добавлением соды, затем тщательно промывавт водопроводной и дистиллированной водой, помещают в термостойкие стаканы с водой и стерилизуют в автоклаве при температуре 1200 С и избыточном давлении 0, 1 МПа. П.2.3.11 Подготовленную посуду стерилизуют сухим паром в сушильном шкафу при 0 160 С в течении 2 часов с момента достижения указанной температуры. П.2.3.12 Простерилизованную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60 0С. П.2.4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АДГЕЗИРОВАННЫХ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ П.2.4.1 Металлические образцы тщательно обезжиривают, промывают водой, опускают на 5 мин. в раствор соляной кислоты 1: 1, снова промывают водой и затем обрабатывают 70 % раствором этанола. П.2.4.2 Подготовленные образцы помещают на дно стерильного сосуда, вносят питатальную среду Постгейта и накопленную культуру СВБ (2-3 суточную) в количество 510% от объема среды, закрывают пробкой и помещают в термостат (температура 32-35 0 С). П.2.4.3 Период инкубации длится 5-7 дней до достижения статических условий роста адгезированных СВБ. Рост СВБ определяется количественно во время всего периода инкубации. П.2.4.4 Количественная оценка адгезированных СВБ производится методом предельных разведений после предварительного удаления клеток с поверхности металлических образцов. Результаты представляются как количество клеток на единицу площади - кл/см2. П.2.4.5 Удаление адгезированных клеток (биопленки) с поверхности образцов осуществляется следующим образом: образец помещают в стерильную чашку Петри и, придерживая пинцетом, очищают его поверхность небольшими кусочками (1см2) стерильной губки типа "эффект", загрязненные кусочки губки помещают во флакон со средой Постгейта, или образец помещают в стерильную чашку Петри (или фарфоровую чашу) с питательной средой и, придерживая его пинцетом, делают соскоб стерильным скальпелем. Полученный соскоб переносят в пенициллиновый флакон. Затем для диспергирования биопленки флакон энергично встряхивают в течении (30-60) с или подвергают ультразвуковой обработке на диспергаторе (22 кГц, 0,3-0,4 А, 30-60 с). При этом клетки СВБ сохраняют свою жизнеспособность. Из приготовленной суспензии делают 7-9 разведений. Пробы инкубируют в течении 14 дней при температуре 32-35 ° С. П.2.5. ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ РЕАГЕНТОВ П.2.5.1 В ряд маркированных стерильных пробирок известного объема (20-25 см3) вводят определенное количество исследуемого реагента (например, 100, 200, ... 500 мг/лдм3 и т. п.) и наливают предварительно прокипяченую и охлажденную минерализованную воду. П.2.5.2 Образцы со сформировавшейся на них биопленкой достают из сосуда стерильным пинцетом и промывают их стерильным буферным раствором (рН = 7,0-7,2) 3-4 раза для удаления культуральной среды и планктонных клеток СВБ. Для сохранения асептических условий эту и последующие операции рекомендуется выполнять в камере с ламинарным течением воздуха в струе инертного (стерильного) газа, например, гелия. П.2.5.3 Образцы с адгезированными клетками СВБ помещают в пробирки с бактерицидом и закрывают пробирки пробкой. Пробы выдерживают при комнатной температуре от 1 до 24 часов. Для выбора более оптимальных параметров технологического режима время выдержки и концентрации исследуемого бактерицида варьируют. П.2.5.4 Затем обработанные бактерицидом образцы с адгезированными клеткам помещают в пробирки с питательной средой Постгейта инкубируют в термостате в течении 14 суток при температуре 32-350 С. Две пробирки с образцами без добавления реагента служат контрольной пробой. Для каждой концентрации проводят три параллельных испытания. П.2.5.5 Наблюдение за образцами осуществляют визуально, отмечая развитие СВБ по образованиючерного осадка сульфида железа, распространяющегося от образца вверх по объему питательной среды. Отсутствие роста СВБ свидетельствует об эффективности действия бактерицида. П.2.5.6 С целью определения эффективности действия бактерицидов на адгезированные клетки бактерий можно рекомендовать количественное выявление жизнеспособных СВБ в биопленки методом предельных разведений. Для этого адгезированные клетки СВБ после воздействия на них бактерицида удаляют с поверхности образцов (4.5.), готовят суспензию клеток и делат ряд разведений. Затем пенициллиновые флаконы с пробами помещают в термостат при температуре 330С и наблюдают за развитием бактерий по образованию осадка сульфида железа. Отсутствие роста СВБ свидетельствует об эффективности действия бактерицида. Список использованной литературы: 1. Абдуллин И.Г., Давыдов С.Н., Худяков М.А., Кузнецов М.В. Коррозия нефтегазового и нефтегазопромыслового оборудования: Учебное пособие. Уфа : Изд. Уфимск. нефт. ин-та, 1990. стр. 72. ISBN 5-230-18958-4. 2. Жук Н.П. Курс теории коррозии и защиты металлов. М. : Издательство "Металлургия", 1976. стр. 472. 3. Авраменко И.Ф. Микробиология. М. : Колос, 1979. стр. 176 с. 4. Шпегель Г. Общая микробиология. М. : Мир, 1987. стр. 306 с. 5. Андреюк Е.И., Билай В. И., Коваль Э. З., Козлова И. А. Микробная коррозия и ее возбудители. Киев : Наукова думка, 1980. стр. 288. 6. Билай В.И. Основы общей микологии. Киев : Высшая школа, 1964. стр. 396 . 7. Iverson W.P. Biological corrosion. Advances in corrosion science and technology. New-York : Fontana M. G. and Stackle., 1972. стр. 342. 8. Мудрецова-Висс К.А. Микробиология. М. : Экономика, 1978. стр. 240. 9. Герасименко А.А. Защита машин от биоповреждений. М. : Машиностроение, 1984. стр. 112. 10. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. М. : МГУ, 1976. стр. 167. 11. Карюхина Т. А., Чурбанова И. Н. Химия воды и микробиология. М. : Стройиздат, 1974. стр. 216. 12. Возная Н.Ф. Химия воды и микробиология. М. : Высшая школа, 1979. стр. 340. 13. Емелин М. И., Герасименко А. А. Защита машин от коррозии в условиях эксплуатации. М. : Машиностроение, 1980. стр. 224. 14. Пименова М.П., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. : МГУ, 1971. стр. 234. 15. Ли. А.Д., Полюбай Г. И. Борьба с образованием сероводорода в неф-тяных пластах при заводнении. М. : ВНИИОЭНГ.- ТНТО, 1974. стр. 87. 16. Алексеев Л.С., Гладков В.А. Улучшение качества мягких вод. М. : Стройиздат, 1994. стр. 152. 17. 2.04.02-84*, СНиП. Водоснабжение. Наружные сети и сооружения. М. : Стройиздат, 1996. стр. 34. 18. Журбы М.Г. Водоснабжение. Проектирование систем и сооружений. Очистка и кондиционирование природных вод. Вологда-Москва : ВоГТУ, 2001. стр. 324. 19. Беличенко Ю.П., Гордеев Л. С, Комиссаров Ю.А. Замкнутые системы водообеспечения химических производств. М. : Химия, 1996. стр. 272. 20. Когановский A.M., Клименко Н.А., Левченко Т.М., Марутовский P.M., Рода И.Г. Очистка и использование сточных вод в промышленном во-доснабжении. М. : Химия, 1983. стр. 288. 21. Яковлев СВ., Краснобородько И.Г., Рогов В.М. Технология электро-химической очистки воды. Л. : Стройиздат, Ленингр. отд-ние, 1987. стр. 312. 22. Алексеев В.И., Винокурова Т.Е., Пугачев Е.А. Проектирование со-оружений переработки и утилизации осадков сточных вод с использованием компьютерных информационных технологий. Учебное пособие. М. : Издательство АСВ, 2003. стр. 176. 23. Никифоров А. Ф., Мигалатий Е.В., Аксенов В.И., Аникин Ю.В., Браяловский Б. С. Физикохимия воды и водных растворов. Учебное пособие. Екатеринбург : ГОУ УТТУ-УПИ, 2003. стр. 92. 24. Кострикин Ю.М., Мещерский НА., Коровина О.В. Водоподготовка и водный режим энергообъектов низкого и среднего давления. Справочник. М. : Энергоатомиздат, 1990. стр. 254. 25. Макаров Г.В., Стрельчук Н.А., Кушелев В.П., Орлов Г.Г. Охрана труда в химической промышленности. М. : Химия, 1977. стр. 568. 26. Кушелев В.П., Орлов Г.Г., Сорокин Ю.Г. Охрана труда в нефтепере-рабатывающей и в нефтехимической промышленности. М. : Химия, 1983. стр. 472. 27. Телегин Л.Г., Ким Б.И., Зоненко В.И. Охрана окружающей среды при сооружении и эксплуатации газонефтепроводов. М. : Недра, 1988. стр. 190. 28. Шаммазов А.М., Хайдаров Ф.Р., Шайдаков В.В. Физико-химическое воздействие на перекачиваемые жидкости. Уфа : Монография, 2003. стр. 263. 29. Сыркин А.М., Максимова Н.Е. Химия воды. Уфа : УНИ, 1991. стр. 46. 30. Розанова Е.П., Кузнецова Е.С. Возбудители биогенной сульфатредукции. М. : Наука, 1980. стр. 188. 31. Розанова Е.П., Кузнецов С.И. Микрофлора нефтяных месторождений. М. : Наука, 1974. стр. 156. 32. Работнова И.Л. Общая микробиология. М. : Высшая школа, 1966. стр. 79. 33. Новый бесспоровый термофильный организм, восстанавливающий сульфаты Desulfovibrio thermophilus nov.sp. Розанова Е.П., Худякова А.И. № 6, б.м. : "Микробиология", 1974 r., Т. 43, стр. 1069-1075. 34. Мезофильная палочковидная бесспоровая бактерия, восстанавливающая сульфат. Розанова И.П., Назина Т.Н. № 5, б.м. : «Микробиология», 1976 r., Т. 45, стр. 825-830. 35. Infrared spectra of some sulphate-reducing bacteria. Booth G.H., Miller J..D.A., Paisley R.M., Saleh A.M. 11, 1966 r., "J. Gen. Microbiol.", Т. 4, стр. 83-87. 36. Significance and taxonomic value of iso and anteiso monoenoic fatty acids and branched Bhydroxy acids in Desulfovibrio desulfuricans. Bonn Jaap J., de Leeuw J.W., Hoek G..J. v.d., Vosjan J..H. 3, 1977 r., "J. Bacterid.", стр. 1183-1191. 37. Гоник А.А. Сероводородная коррозия и меры ее предупреждения. М. : Недра, 1966. стр. 178. 38. Кузнецов СИ. Роль микроорганизмов в круговорота веществ в озерах. Л. : Наука, 1970. 39. Рубенчих Л.М. Сульфатвосстанавливающие бактерии. М. : Изд-во АН СССР, 1947. 40. Источники энергии и углерода для биосинтеза у сульфатредуцирующих бактерий. Сорокин ЮЛ. 35, 1966 r., стр. 761-766. 41. О роли углекислоты и апетата в биосинтезе у сульфатредуцирующих бактерий. Сорокин, Ю.И. 35, 1966 r., «Микробиология», стр. 766-769. 42. Исследование конструктивного обмена сульфатредуцирующих бактерий с помощью С14. Сорокин Ю.Л. 35, 1966 r., стр. 967-977. 43. Биологическое поражение нефти и нефтепродуктов и их защита при транспорте и хранении. М. : ЦНИИТ, 1970. Темат. обзор ЦНИИТнефть. стр. 92. 44. Cholin fermentation by Desulfovibrio desulfuricans. Baker F.D., Papiska H.R.C Campbell L.L. V.5, 1962 r., "J. Bacterid.", Т. J 10,, стр. 973-978. 45. Microbiological Corrosion. Booth Н. London : б.н., 1971. стр. 87. 46. Макаров Г.В., Стрельчук Н.А., Кушелев В.П., Орлов Г.Г. Охрана труда в химической промышленности. М. : Химия, 1977. стр. 568. 47. The amino acid sequence of cytochrome C3 from Desul -fovibrio vulgaris (N..C.I.B. 8303). Ambler R.P. V 5, 1968 r., "Biochem. J.", Т. HJ9, стр. 47-48. 48. Multiple forms of bacteria hydrogenases. Ackrell Е.С, Asato R.H., Hower H.F. № 4, б.м. : jtt, 1966 r., "J. Bacterid.", стр. 828-838. 49. Применение изотопов для изучения интенсивности процесса редукции сульфатов в озере Бедоводь. Иванов М.В. № 3, б.м. : «Микробиология», 1956 r., «Микробиология», Т. 25, стр. 305-309. 50. Заверзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы. M. : «Наука», 1972. стр. 138-161. 51. Phosphorylation coupled to oxidation of hydrogene with fumarate in extracts of the sulfatereducing bacterium, Desulfovi-brio gigas. Barton L.L., LeGall J., Peck H.D. V4, 1970 r., "Biochem. Biophys. Res. Commun.", стр. 1036-1042. 52. Phosphoroclastic reaction of Clostridium nigrificans. Akagi J.M. КЗ, б.м. : Ibid., 1964 r., Т. JS8, стр. 813-814. 53. Electron carriers for the phosphoroclastic reaction of Desul fovibrio desulfuricans. Akagi J.M. V 10, 1967 r., "J. Biol. Chem.", Т. 24, стр. 2478-2483. 54. The participation of ferredoxin of Clostridium nigrificans in sulfite reduction. Akagi J.M. № 1, 1965 r., "Biochem. Biophys. Res. Commun.", стр. 72-77. 55. Purification and properties of sul-phurylase from Desulfovibrio desulfuricans. Baliga B.S., Vartak H.G., Jagannatham V. 31, 1961 r., "J. Sci. Industr. Res.", стр. 33-40. 56. Degradation of glucose by proliferation colls of Desulfotomaculum nigrificans. Akagi J.M., Jackson G. № 5, 1967 r., "Appl. Microbiol.", стр. 1427-1430. 57. Сорокин Ю.И. Изучение хемосинтеза у сульфатвосстанавливающих бактерий. Ин-т микробиологии АН СССР. М. : б.н., 1953. Автореф. канд. дисс. 58. Studies of thermophilic sulfatereducing bacteria. II. Hydrogenasa activity of Clostridium nigrificans. Akagi J.M., Campbell L.L. 5, 1961 r., Т. J32, стр. 927-932. 59. Evidence for the periplasmic location of hydrogenase in Desulfovibrio gigas. Bell G.B., Le Gall J., Peck H.D. 2, 1974 r., "J. Bacterid.", Т. 120, стр. 994-997. 60. Studies of thermophilic sulfate reducing bacteria. III. Adenosine triphosphate-sulfuryfase of Clostridium nigrificans and Desulfovibrio desulfuricans. Akagi J.M., Campbell L.L. V.6, 1962 r., Т. 84, стр. 1194-1201. 61. Inorganic pyrophosphatase of Desulfovibrio desulfuricans. Akagi J.M., Campbell L.L. № 3, 1963. r., Ibid., Т. J3, стр. 563-568. 62. Observations on the bisulfite reductase (P582) isolated from Desulfotomaculum nignficans. Akagi J.M., Chan May, Verna A. № 1, 1974 r., Ibid., Т. 120, стр. 240-244. 63. Isolation of a bisulfite reductase activity from Desulfoto-maculum nigrificans and its identification as the carbon monoxide-binding pigment P582. Akagi J.M., Adams V. № 1, 1973 r., "J. Bacterid.", Т. 116, стр. 392-396. 64. Biochimie coraparee des cytochro¬mes des bacteries sulfato-reductrices. Ambler R.P., Bruschi M., Le Gall J. Mexico : In "Rec. Adv. in Microbiol.", 1971. 10th Int. Congr. for Microbiol. стр. 25-34. 65. The amino acid sequence of cytochrome С3 from Desulfovibrio desulfuricans (strain El Agheila L) NCIB 8380. Ambler R.P., Bruschi M., Le Gall J. V2, 1971 r., Ibid., Т. J8, стр. 347-350. 66. The structure of cytochrome С3 from Desulfovibrio gigas (N..G.I.B. 9332). Ambler R.P., Bruschi M., Le Gall J. 1969 r., "FEES Lett.", Т. .VI, стр. 115-117. 67. Oxidative phosphorylation in the obligate anaerobe, Desulfovibrio gigas. Barton L.L., Le Gall J., Peck R.D. N.Y. : Acad о Press, 1972 r., In. "Horizons of Bioenerge— tics", стр. 44-45. 68. Phosphorylation coupled to electron transfer between lactate and fumarate in cell—free extracts of the sulfate — reducing anaerobe, Desulfovibrio giqas. Barton L.L., Peck H.D. 1971 r., "Bacterid. Proc", стр. 149. 69. The catalase of the sulfate—reducing obligate anaerobe, Desulfovibrio. Bell G.B., Le Gall J. 1971 r., Ibid/, стр. 167. 70. Growth of sulfate-reducing bacteria with sulfur as electron acceptor. Biell H., Pfennig N. 2, 1977 r., "Arch. Microbiol.", Т. VI, стр. 115-117. 71. Мифтахова Г.М., Мухамедзянов А.Х., Быковский И.А. Исследование подавления сульфатвосстанавливающих бактерий электрообработкой сточной водой. 1989. стр. 24, Рукопись деп. в ВНИИОЭНГ. - N 1587 – нг 88 //Реф. Журн. Химия. - 1989. – 24 И 668 Деп. 72. Липович Р.Н., Гоник А.А., Низамов К.Р. Микробиологическая коррозия и методы ее предотвращения. Серия «Коррозия и защита в нефтегазовой промышленности». М. : ВНИИОЭНГ, 1977. стр. 123. 73. Защитное действие алкиламмониевых солей в сероводородсодержащих минерализованных средах. Титанкина Р.Ф., Феоктистов А.К., Еникеев Э.Х. № 2, 1991 r., Нефтяное хозяйство, стр. 60. 74. Левин Я. А., Мазитова Ф.Н., Игламова Н. А. Подавление сульфатвос-станавливающих бактерий нефтяных месторождений соединениями со свя-зью сера-сера // Интенсификация химических процессов переработки нефтяных компонентов. Казань : б.н., 1989. стр. 157. 75. Бактерициды для подавления СВБ на Усинском и Войзейском месторождениях. Капитонова 3. Ф., Коновалова Л. В. № 9, 1984 r., Нефтепромысловое дело и трансп. нефти, стр. 18-20. 76. Технология при-менения бактерицида СНПХ-1002 - новый универсальный метод повышения нефтеотдачи пластов. Шермергорн И. М., Пантелеева А. Р., Низамов Р. X. № 12, М. : ВИИИОЭНГ, 1991 r., Экспресс информ. Серия разработка нефтяных месторождений и методы повышения нефтеотдачи, стр. 23-24. 77. Особенности микробиологических процессов в заводненном нефтяном месторождении Среднего Приобья. Беляев С. С., Розанова Е. П., Борзенков И. А. 6, М. : б.н., 1990 r., Микробиология, Т. 59, стр. 1075-1081. 78. Хисамутдинов Н. И., Телин А. Г., Ежов М. Б., Исмагилов Т. А. Обследование зараженности закачиваемых и добываемых вод микроорганизмами-агентами биокоррозии и биообразований для разработки технологии повышения нефтеотдачи применением биоцидов. Уфа : б.н., 1991 - 1992. стр. 34, Отчет малого предприятия "Нефтегазтехнология". 79. Тодт Ф. Коррозия и защита от коррозии. Коррозия металлов в промышленности. Л. : Химия, 1967. стр. 712. 80. Кессельман Г.С. Экономическая эффективность предотвращения коррозии в нефтяной промышленности. М. : Недра, 1988. стр. 215. 81. Кессельман Г.С, Колотыркин Я.М., Новаковский В.М. Некоторые экономические аспекты проблемы коррозии и противокоррозионной защиты. М. : ВНИИОЭНГ, 1979. стр. 64. 82. Гутман Э.М., Низамов К. Р. Защита нефтепромыслового оборудования от коррозии. Учебное пособие для рабочих. М. : Недра, 1983. стр. 152. 83. Гоник А.А. Коррозия нефтепромыслового оборудования и меры ее предупреждения. М. : Недра, 1976. стр. 192.
