Некоторые ферменты гликолиза как субстраты шаперонина
advertisement
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова Биологический факультет кафедра биохимии Некоторые ферменты гликолиза как субстраты шаперонина TRiC. Выделение TRiC и исследование его термодинамических параметров. Дипломная работа Работа выполнена студентом 5-го курса кафедры биохимии И. А. Федюниным Научные руководители: д.б.н., профессор В.И. Муронец к.б.н. И.Н. Налетова Москва 2008 г ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ .............................................................4 ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................................5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..............................................................................................................7 ШАПЕРОНЫ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ФОЛДИНГ БЕЛКОВ.......................................................................7 СЕМЕЙСТВО ШАПЕРОНИНОВ........................................................................................................9 ШАПЕРОНИНЫ ПЕРВОГО КЛАССА ..............................................................................................10 ШАПЕРОНИНЫ ВТОРОГО КЛАССА ..............................................................................................13 ШАПЕРОНИН TRIC ....................................................................................................................16 Строение ...............................................................................................................................16 Субстраты шаперонина TRiC ............................................................................................16 Механизм работы ................................................................................................................20 Источники выделения TRiC ................................................................................................22 Другие функции .....................................................................................................................23 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ .....................................................................................................................25 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ....................................................................................................26 МАТЕРИАЛЫ...............................................................................................................................26 МЕТОДЫ .....................................................................................................................................26 Выделение TRiC ....................................................................................................................26 Выделение шаперонина GroEL и кошаперонина GroES ...................................................27 Определение концентрации TRiC .......................................................................................29 Определение концентрации иммобилизованного белка....................................................30 Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях ............................................31 Голубой нативный гель-электрофорез ..............................................................................31 Иммобилизация ГАФД на BrCN-активированной сефарозе 4В ......................................32 Денатурация ГАФД, иммобилизованной на сефарозе 4В ................................................33 Изучение связывания денатурированной формы ГАФД с шаперонином TRiC ..............34 Определение концентраций реагентов ..............................................................................34 Определение ферментативной активности ГАФД .........................................................35 Определение ферментативной активности ЛДГ ............................................................35 2 Реактивация ГАФД и ЛДГ ..................................................................................................35 Кинетика термоагрегации ГАФД ......................................................................................36 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) .................................................36 Метод динамического лазерного светорассеивания (ДЛС) ............................................36 Масс-спектрометрический анализ белка ..........................................................................37 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................39 ВЫДЕЛЕНИЕ TRIC ......................................................................................................................39 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛУЧЕННОГО ПРЕПАРАТА ШАПЕРОНИНА TRIC ...................44 МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННОГО БЕЛКА .................................................46 ИССЛЕДОВАНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА ПОЛУЧЕННОГО ПРЕПАРАТА TRIC ........................48 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ TRIC С ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ФОРМОЙ ГАФД ..........................................54 РЕАКТИВАЦИЯ ГАФД И ЛДГ В ПРИСУТСТВИИ ШАПЕРОНИНОВ GROEL И TRIC ......................56 ТЕРМОАГРЕГАЦИЯ ГАФД ..........................................................................................................64 ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГАФД С ШАПЕРОНИНОМ TRIC МЕТОДОМ ДСК ..........................................................................................................................69 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .........................................................................................................................72 ВЫВОДЫ ....................................................................................................................................75 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................76 3 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ГАФД - D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия ДТТ – 1,4-дитио-DL-треитол ЛДГ – лактатдегидрогеназа β-МЭ - β –меркаптоэтанол ПААГ – полиакриламидный гель TM – температура в точке максимума пика теплопоглащения Трис - трис(гидроксиметил)метиламин 3-ФГА - 3-фосфоглицериновый альдегид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ADP – аденозиндифосфат ATP – аденозинтрифосфат GroEL – шаперонин, комплекс из 14 субъединиц x 60 кДа (840 кДа) GroES – кошаперонин, комплекс из 7 субъединиц x 10 кДа (70 кДа) GuHCl- гуанидингидрохлорид HEPES – N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-этансульфоновая кислота NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный PMSF – фенилметилсульфонилфторид TRiC – эукариотический шаперонин, комплекс из 16 гомологичных субъединиц 4 ВВЕДЕНИЕ Шаперонин TRiC (TCP-1 Ring Complex), также известный как CCT (Cytosolic Chaperonin containing TCP-1), осуществляет сворачивание ряда белков в цитоплазме эукариотических клеток. Хотя изначально предпологалось, что данный шаперонин осуществляет лишь фолдинг белков цитоскелета, таких как актин и тубулин, количество других известных субстратов TRiC постоянно увеличивается. На настоящий момент известно, что TRiC взаимодействует примерно с 10% всех синтезируемых в цитоплазме белков. Тем не менее, перечень известных субстратов шаперонина остается раскрытым не полностью и, на данный момент, известно лишь около двух десятков таких белков. По сравнению с другими шаперонами TRiC гораздо менее изучен. Количество работ посвященных его бактериальному аналогу - GroEL в десятки раз превышает работы, связанные с эукариотическим шаперонином. Несмотря на схожесть эукариотического и бактериального шаперонинов, для них не известно общих белков-субстратов. Однако существуют данные о том, что GroEL способен связывать некоторые белковые субстраты TRiC, такие как актин и тубулин, но не способен осуществить их фолдинг. Несмотря на это, на основе данных, полученных в процессе работы с GroEL, рядом авторов высказываются эукариотической клетки предположения изучаемых о поведении модельных в систем цитоплазме на основе цитоплазматических белков и бактериального шаперонина. Данная ситуация связана не только с тем, что GroEL был открыт раньше, чем TRiC, но также и с тем, что процесс выделения и работа с TRiC сложнее. Известные на данный момент методы выделения TRiC достаточно непросты. Во-первых, они включают большое количество трудоемких стадий, и, во-вторых, требуют труднодоступного источника. 5 В настоящее время не вызывает сомнения вовлечение шаперонина TRiC во многие патологии. Известно, что TRiC способен связываться с белками, содержащими полиглутаминовые повторы, тем самым, препятствуя их агрегации. Рядом авторов было показано, что понижение концентрации TRiC в цитоплазме ведет к повышенной агрегации подобных белков. Образование таких агрегатов характерно при развитии болезни Хантингтона (Nam et. al. 2006; Kitamura et. al, 2006). Раннее в нашей лаборотории было показано для шаперонина GroEL способность предотвращать агрегацию и разрушать уже образовавшиеся агрегаты глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы (Naletova et. al. 2006). Поскольку GroEL и TRiC входят в одно семейство предположение о шаперонинов возможности и во многом предотвращении схожи, возникает термоагрегации эукариотическим шаперонином. 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Шапероны и их влияние на фолдинг белков В процессе синтеза белков результатом трансляции является появление в клетке новой полипептидной цепи. Для того чтобы вновь синтезируемый белок приобрел присущие ему функциональные свойства, цепь должна свернуться в пространстве определенным образом, сформировав тем самым нативную структуру. Согласно первичным представлениям, сложившимся в экспериментах in vitro, пространственная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью (Anfinsen, 1973). В настоящее же время процесс сворачивания белка (фолдинг) представляется следующим образом. Вначале формируются лишь элементы вторичной структуры, являющиеся затравками для образования более сложных мотивов супервторичной структуры. Далее происходит формирование компактного интермедиата за счет образования специфических контактов между значительно удаленными в первичной структуре участками. Основной движущей силой этого процесса является уход из водного окружения белка его гидрофобных аминокислотных остатков и образование гидрофобного ядра молекулы. На данном этапе молекула имеет пространственную структуру близкую к нативной, но еще не обладает функциональной активностью, присущей данному белку. В этом состоянии, получившем название «расплавленная глобула», молекула имеет меньшую степень упорядоченности и более лабильную, чем нативный белок, структуру, которая склонна к агрегации (Yon, 1997). Как in vivo, так и in vitro, корректное складывание белка конкурирует с межмолекулярными взаимодействиями, которые могут мешать вновь синтезируемым цепям, достигать нативного состояния или даже приводить к формированию агрегатов. Для предотвращения этих процессов исследования по изучению процесса сворачивания белков in vitro проводились и 7 проводятся в «идеальных» условиях: при низких температуре и концентрации белка. Между тем, условия, существующие в клетке, сильно отличаются по этим параметрам. Внутриклеточная концентрация белка составляет нередко более 300 мг/мл. В таком высококонцентрированном окружении сильно изменяются параметры многих биологических процессов. Значительно увеличиваются (более чем на несколько порядков) константы скоростей реакций ассоциации, например, агрегации, и заметно изменяются свойства интеремедиатов сворачивания (Minton, 2000; Zimmerman and Minton, 1993). Так, при исследовании in vitro сворачивания денатурированных белков, было показано, что белки, способные спонтанно формировать нативную структуру в разбавленных водных растворах, агрегируют в условиях максимально приближенных к клеточным (van den Berg et. al., 1999). В конце 80-х годов были поставлены эксперименты по ренатурации ряда белков. Эти опыты были направлены на выяснение роли внутриклеточного окружения в сворачивании белка. Было показано, что многие белки сворачиваются с высокой эффективностью без выраженной агрегации, причем стимулирующее действие на этот процесс оказывают белки эндоплазматического ретикулума. Были выделены частично свернутые полипептиды в комплексе со специфическими клеточными белками, оказавшиеся белками теплового шока. Ранее было известно, что экспрессия подобных белков резко увеличивается в условиях стресса, в том числе и при повышении температуры. Именно поэтому они и были названы белками теплового шока (Heat shock protein/ Hsp) (Schlesinger 1990; Yura and Nakahigashi, 1999; Nover and Scharf, 1997). В дальнейшем стало понятно, что сложные мультидоменные или олигодоменые белки могут «правильно» сворачиваться только в присутствии именно таких клеточных белков, которые не являются частью нативного белка. Подобные дополнительные белки называют также «молекулярными помощниками» («molecular chaperones») (Ellis, 1987; Hartl, 1996; Martin and Hartl, 1997). Впоследствии термины «молекулярные шапероны» или просто шапероны стали 8 применяться к обширным семействам белков, которые вовлекаются в сворачивание, формирование ансамблей и транслокацию белков, но не входят в состав сворачивающейся структуры и не участвуют в реализации ее функций. Было показано, что данные белки связывают частично развернутую полипептидную цепь, создавая условия для оптимального фолдинга, и тем самым не позволяя ей неправильно сворачиваться и образовывать агрегаты с другими белками (Saibil, 2000). Шапероны встречаются во всех типах клеток и во всех клеточных компартментах и необходимы для обеспечения жизнедеятельности клетки в нормальных и стрессовых условиях. Существуют две группы белков, вовлекаемых в сворачивание полипептидов в клетках. Первая группа – ферменты, катализирующие отдельные этапы сборки цепей путем образования с ними промежуточных комплексов. Эти ферменты названы фолдазами. Вторая группа – молекулярные шапероны, которые реализуют свои функции только за счет нековалентных взаимодействий с полипептидной цепью и обладают «медленной» ATPазной активностью. Обозначать эти белки принято по величине молекулярных масс, составляющих их полипептидных цепей. Существуют три больших семейства ATP-зависимых шаперонов, осуществляющих регуляцию процессов фолдинга на ко- и посттрансляционном уровне – Hsp 70 (или Dna K в клетках E.coli), Hsp90 и шаперонины. Семейство шаперонинов Шаперонины широко распространены в природе и наряду с другими шаперонами необходимы для выживания и роста клеток. Белки, относящиеся к этому семейству, повышают эффективность фолдинга белков путем их сворачивания внутри полостей находящихся внутри больших белковых комплексов цилиндрической формы. Шаперонины делятся на два класса: класс 1 встречается в бактериях, митохондриях и пластидах (Ranson et al., 1998; Fenton and Horwich, 2003); класс 2 – в цитоплазме эукариот и археях (Kim et al., 1994; Cowan and Lewis, 2002). Все они являются АТР-азами, 9 использующими энергию, получаемую при связывании и гидролизе АТР, для осуществления конформационных перестроек. В результате этого происходит захват и освобождение полипептидных цепей белков, которые либо приняли нативное биологически активное состояние, либо нет. Шаперонины первого класса Представителем шаперонинов первого класса является GroEL. GroEL из E.coli наиболее изученный из всех шаперонинов. (Gething and Sambrook, 1992; Horwich and Willison, 1993). Делеция гена GroEL является летальной для клетки E.coli, поскольку среди субстратов шаперонина есть белки, наличие которых в клетке в функционально активном состоянии является критичным для ее жизнедеятельности. Для идентификации белков, являющихся субстратами GroEL, экстракт клеток E.coli, выращенных в среде, содержащей 35 S-метионин, обрабатывали специфичными к шаперонину антителами и преципитированные белки анализировали затем методом двумерного электрофореза (Houry et. al., 1999). Было обнаружено, что GroEL связывает приблизительно 1000 полипептидных цепей из 4300, кодируемых в геноме E.coli. Дополнительными методами было доказано, что в данном эксперименте связывание белков с шаперонином происходит внутри клетки, а не в процессе экстракции. Было обнаружено также, что треть субстратов, многие из которых представляют зрелые белки, постоянно находятся в состоянии связанном с GroEL. По-видимому, нативная структура подобных белков является недостаточно стабильной и легко переходит в частично развернутое состояние, узнаваемое шаперонином, особенно в условиях стресса. Роль GroEL в клетке – это предоставление микрокомпартмента, в котором облегчается правильное сворачивание белков. Для обеспечения фолдинга белков GroEL выполняет две функции, причем каждая связана со специфическим состоянием шаперонина. Одна из них – это связывание белковых интермедиатов, образуемых в процессе неправильного 10 сворачивания и предотвращение, тем самым, их агрегации. Такое связывание основано на узнавании гидрофобных участков, экспонированных наружу у частично развернутых белков. Другая функция – это облегчение сворачивания, которое происходит внутри центрального канала шаперонина после присоединения к GroEL кошаперонина GroES в присутствии ATP. Считается, что связывание внутри полости шаперонина не происходит, и по истечении порядка 20 секунд полипептидная цепь белка освобождается наружу, вне зависимости от того принял он нативное состояние или нет (рисунок 1). Если белок не принял нативное состояние, он может снова быть захвачен молекулой шаперонина GroEL и пройти еще раз через цикл инкапсулирования и последующего высвобождения. (Fenton and Horwich, 1997). На первый взгляд такой цикл может показаться не эффективным, но именно с помощью него удается противодействовать нежелательной тенденции ненативных белков агрегировать и формировать стабильные агрегаты (например, при амилоидозах) которые являются характерными при нарушениях системы фолдинга белков. Идея подобного рода функционирования шаперонинов заключается в том, что белки проводят меньшую часть своего времени – около 2% всего времени – вне полости шаперонина, где они свободны к агрегации (Ranson et al., 1997). 11 Рисунок 1. Цикл работы GroEL/GroES в процессе фолдинга белков. Два кольца GroEL работают поочередно и в определенный момент времени находятся на разных стадиях своего цикла. Цикл можно разделить на несколько стадий: связывание, инкапсулирование/фолдинг и освобождение. В течение связывания (1), гидрофобные области полипептида защищены от агрегации. Акцепторное кольцо (нижнее) свободное от нуклеотида, но, тем не менее, имеет высокое сродство к полипептиду. Связывание ATP (2) и GroES (3) с кольцом вызывает конформационные изменения в молекуле GroEL. Сродство апикальных доменов для полипептидной цепи ниже, чем для GroES, и она проходит внутрь полости, где начинается ее сворачивание. Последующий гидролиз ATP (5) вызывает конформационные изменения в GroEL (верхнее кольцо), что позволяет нижними кольцу связать молекулу полипептида и начать новый цикл. После связывания ATP и GroES с нижним кольцом, GroES диссоциирует от верхнего кольца и из полости шаперонина освобождается молекула полипептда-субстрата. В квадратных скобках показано образование одного из возможных интермедиатов цикла симметричного комплекса. (Walter, 2002) 12 Шаперонины второго класса Шаперонины второго класса были открыты значительно позднее первого. В электронном микроскопе наблюдали, что после лизиса клеток Pyrodictium (представитель архебактерий) подвергнутых тепловому шоку, происходит выход большого количества частиц по форме близкой к сферической и состоящих из двух октамерных колец (Phipps et al., 1991). По форме, индукции их синтеза после теплового шока и ATP-азной активности они напоминали белки GroEL/Hsp60/Cpn60 семейства и, поэтому, возникло предположение, что эти частицы представляют собой шаперонин архебактерий. Впоследствии этот шаперонин назвали термосомой, поскольку индукция его синтеза происходит после теплового шока, а также он крайне термостабилен. Открытие схожего 9-субъединичного белкового комплекса у Sulfolobus shibatae (TF55 или термофильный фактор с субъединицами 55 кДа), который был способен связывать денатурированные белки in vitro, подтвердило существование шаперонинов у архебактерий (Trent et al., 1991). Вскоре обнаружилась высокая гомология между шаперонинами архебактерий и полипептидом TCP-1 (от tailless complex polypeptide 1) с неизвестной функцией (Gupta, 1990). Раннее было известно, что ген данного полипептида связан с различными генетическими нарушениями, которые приводили у дрозофилы к фенотипу с укороченным хвостом, к смерти или к стерильности самцов (Ursic, Culbertson, 1991) и каким-то образам связан с функционированием микротрубочек. Таким образом, TCP-1 был идентифицирован как одна из субъединиц цитоплазматического шаперонина TRiC. Позднее TRiC был выделен и было продемонстрировано его участие в биогенезе таких белков цитоскелета, как актин и тубулин. (Frydman et al., 1992; Gao et al., 1992). Шаперонины второго и первого классов схожи. Так субъединицы шаперонинов обоих классов имеют аналогичное общее строение и состоят из 13 трех доменов (рисунок 2а): экваториального АТР-связывающего домена; апикального домена, который вовлечен в связывание субстрата; промежуточного шарнирного домена, через который взаимосвязь между первыми двумя доменами. В и осуществляется то время как экваториальный домен достаточно консервативен у различных субъединиц, наблюдается различие в последовательности апикального домена, который содержит участки для связывания субстратов (Kim et al. 1994) К настоящему моменту в базе данных Swissprot доступно больше сотни последовательностей субъединиц шаперонинов второго класса (36 для архей и 106 для эукариот). Полные последовательности генов шаперонинов расшифрованы для нескольких представителей архей и ряда эукариотических организмов, таких как дрожжи, нематода, мышь, человек. Кроме того, для быка известны почти все последовательности субъединиц цитоплазматического шаперонина. Многое известно о субъединичном составе шаперонинов второго класса в то время как их строение хорошо известно лишь для шаперонинов архей – термосом. В большинстве случаев в состав термосом входят две разные субъединицы, однако, существуют комплексы, состоящие из одинаковых субъединиц. Наибольшей сложности достигает комплекс эукариотического цитоплазматического шаперонина (TRiC), который состоит из двух колец, образованных восемью разными субъединицами (Gutsche et al., 1999). В отличие от GroEL шаперонины второй группы могут выполнять свою работу без кошаперонина (как GroES у шаперонина GroEL). Отсутствие данного белка-помошника удалось объяснить после установления кристаллической структуры термосомы (рисунок 2б) из Termoplasma acidophilum. При сравнении структур субъединиц GroEL и термосомы было обнаружено, что все апикальные домены субъединицы термосомы имеют дополнительный выступающий фрагмент, который ограничивает доступ в полость шаперонина (рисунок 2в). Таким образом, выступы апикальных доменов второй группы шаперонинов выполняют функцию GroES, открывая 14 и закрывая доступ в полость во время цикла работы шаперонинов (рисунок 2г) (Meyer et al. 2003). Используя кристаллическую структуру, также удалось установить, что в центральной полости (в закрытом состоянии) могут быть инкапсулированы пептиды с молекулярной массой до 50 кДа (Ditzel et al. 1998). (а) а (б) (в) б в апикальный промежуточный й (г) г открытое закрытое Открытое Связанное с АТР, состояние закрытое состояние состояние состояние экваториальный Рисунок 2. Общая структура шаперонинов второго типа. а – строение α-субъединицы термосомы из Termoplasma acidophilum. Экваториальный АТР-азный домен (красный) связан с субстрат-связывающим апикальным доменом (желтый) через шарнирный промежуточный домен (голубой). Выступ в виде спирали, характерный для второй группы шаперонинов отмечен зеленым; б – Боковой вид комплекса термосомы в закрытом состоянии полученный с помощью рентгенографии. Субъединицы покрашены так же как и в случае a. Видно, что полный комплекс состоит из двух олигомерных колец. В случае TRiC каждое кольцо образовано из восми разных субъединиц; в – вид сверху на термосому в закрытом состоянии. На рисунке видно как апикальные выступы закрывают доступ в полость (один из них закрашен в красный цвет); г – ATP-зависимые переходы между открытым и закрытым состояниями у шаперонинов второй группы (Meyer et al. 2003). 15 Шаперонин TRiC Строение Шаперонин TRiC является наиболее сложно организованным из всех известных шаперонинов. Он состоит из двух симметричных колец каждое из которых образовано из 8 паралогичных субъединиц (α, β, γ, δ, ε, ε, ζ, δ). В эволюции эукариот предковый ген TRiC дуплицировался очень рано; гомологичные субъединицы из разных эукариотических организмов более схожи между собой, чем различные субъединицы шаперонина одной клетки (Waldmann et al., 1995) . Гены 8 субъединиц шаперонина TRiC являются паралогами и имеют идентичность около 30%. Имеется пример факультативной тканеспецифичной экспрессии субъединицы TRiC. Так в семенниках млекопитающих имеется вторая факультативно экспрессирующаяся δ-субъединица (Kubota et al., 1997). Пока не было высказано предположений о значении подобного изменения субъединичного состава шаперонина. Существуют различные предположения, объясняющие различие субъединиц шаперонина TRiC. Одно из них заключается в том, что субъединицы TRiC изменялись в процессе эволюции, для того чтобы выполнять различные функции. Другое рассматривает подобное различие между субъединицами как результат коэволюции эукариотического шаперонина с его основными субстратами – белками цитоскелета: актином и тубулином. (Hartl, 1996, Kubota et al., 1995). Тем не менее, на данный момент не существует окончательно подтвержденной теории, и этот вопрос остается одним из наиболее интригующих в биохимии шаперонинов. Субстраты шаперонина TRiC Представитель второй группы шаперонинов – TRiC, устроен значительно сложнее, чем более изученный бактериальный аналог – GroEL. 16 Раннее объяснение подобной усложненности заключалось в том, что TRiC создан специально для фолдинга двух белков цитоскелета – актина и тубулина. Это предположение возникло по данным, полученным с помощью электронной микроскопии, использование которой позволило увидеть, что эти субстраты связываются ассиметрично. Позднее было показано, что эти белки имеют специфические участки, которые и взаимодействуют с шаперонином, когда он находится в открытом состоянии. Взаимодействие происходит скорее посредством полярных контактов, чем неполярных гидрофобных, как в случае GroEL. После закрывания TRiC определенные участки белка-субстрата проталкиваются внутри полости шаперонина и, таким образом, полипептидная цепь испытывает изменения приводящие, в конечном счете, к образованию нативного состояния. Такой механизм развился специально для преодоления высокого кинетического барьера при фолдинге актина и тубулина (Gao et al., 1992). Поэтому сложность, связанная с наличием восьми разных субъединиц казалась решенной – она развилась для создания специфичности связывания. Однако стало известно, что TRiC имеет достаточно большое количество субстратов (Dunn et al., 2001; Gomez-Puertas et al., 2004) – миозин ΙΙ, циклин Е, белок супрессор опухоли фон Гиппель-Линдау, белкиконтроллеры клеточного цикла, люциферазу светлячков, белок капсида вируса, Gα-трансдуцин и некоторые другие (Feldman et. al., 1999; Srikakulam, Winkelmann, 1999; Gutsche, Essen, 1999; Willison, 1999) Не так давно с помощью протеомных исследований список субстратов TRiC был расширен и включил в себя ряд белков содержащих повторы триптофил-аспарагиновой кислоты, которые формируют домены типа β-пропеллера (таблица 1). Более того, было показано, новосинтезированных что белков большое количество цитоплазмы около способны 10% всех связываться с шаперонином TRiC (Thulasiraman et. al., 1999). Известные субстраты шаперонина TRiC не имеют каких-либо схожих участков последовательности или структурных мотивов. Более того, их размеры сильно различаются и 17 могут превышать 100 кДа. Как отмечалось раннее, данный размер больше того, что может быть инкапсулирован в центральной полости шаперонина, и в связи с чем возникает вопрос о том, как TRiC может осуществлять фолдинг таких крупных полипептидов. Один из возможных способов - фолдинг отдельных доменов большого субстрата в полости шаперонина. Любопытно, что белки-субстраты TRiC не могут сворачиваться другими эукариотическими и прокариотическими шаперонами. Это связано с тем, что белки с повторами триптофил-аспарагиновой кислоты и другие субстраты TRiC такие как фактор фон Гиппель-Линдау или циклин E, не найдены в бактериальном геноме. Из этого возникает предположение о том, что TRiC и его субстраты возникли совместно с появлением эукариотической клетки и коэволюционировали (Archibald et al. 2001). Бактериальный аналог эукариотического шаперонина – GroEL может связывать денатурированные тубулин и актин, но не может обеспечивать их фолдинг, также GroEL не может обеспечить фолдинг люциферазы светлячков. На данный момент не известно общих белков-субстратов у бактериального и эукариотического шаперонинов. Поэтому считается что субстраты TRiC не могут быть свернуты GroEL/GroES системой (Leroux and Hartl 2000). Раннее в нашей лаборатории было показано, что бактериальный шаперонин GroEL способен осуществить фолдинг эукариотической лактатдегидрогеназы. Фолдинг происходит по цис-механизму для которого достаточно связывания денатурированного фермента с апикальными доменами субъединиц шаперонина (не требуется инкапсулирование в полости) (Naletova et. al. 2006). Так как было показано, что шаперонин GroEL может связывать некоторые белки-субстраты TRiC, то, возможно, что некоторые субстраты GroEL, сворачивание которых происходит по цисмеханизму, могут быть свернуты шаперонином TRiC. Интересно, что многие субстраты TRiC образуют гомо- или гетероолигомерные комплексы (таблица 1). Для этих белков их функции и фолдинг сопряжены с включением в олигомерные комплексы (Dunn et al. 18 Таблица 1. Субстраты шаперонина TRiC (Spiess et. al., 2004) Белок Молекулярная масса (кДа) Возможность образования олигомерных комплексов α-актин, β-актин α-тубулин, β-тубулин,γтубулин Миозин тяжелой цепи Люцеферин 4-монооксигеназа G α-трансдуцин Опухолевой супрессор болезни Фон ГиппельЛандау G1-S-специфичный циклин E1 Кофилин Фактор деполимеризации актина 1 Актин-связывающий белок V (центрактин) Белок капсида вируса гепатита В Ядерный белок EBNA-3 Полипротеин Gag M-PMV Деацетилаза 3 гистонов SET домен белка 3 Возможная деацетилаза HOS2 гистонов Контролирующий деление клетки белок 20 (Cdc20p) Контролирующий деление клетки белок 15 (Cdh1p) Регуляторная субъединица В (Cdc55) фосфатазы PP2A Рецептор (Pex7p) для пероксисомного сигнального пептида 2 Сплайсинг фактор (PRP46) пре-мРНК β’-субъединица Sec27p β-субъединица ГТФсвязывающего белка (Ste4p) 42.1, 41.7 50.2, 49.8, 51.2 223.0 60.1 Да Нет Нет Нет 40.0 24.2 Да Да Нет Нет 47.1 Да Нет 18.5 16.1 Нет Нет Нет Нет 42.6 Да Нет 20.9 Да Нет 89.1 73.1 48.8 85.5 51.5 Не известно Да Да Да Да Нет Нет Нет Нет Нет 67.4 Да Да 110.4 Да Да 59.6 Да Да 42.3 Нет Да 50.7 Да Да 99.4 46.6 Да Да Да Да Да Да повторяющийся мотив триптофиласпарагиновой кислоты Нет Нет 19 2001). Более того, некоторые субстраты, такие как, тубулин, фактор фон Гиппель-Линдау, CDC20, освобождаются от связи с шаперонином только в присутствии партнеров, которые связаны с включением субстрата в олигомерный комплекс. Этот механизм обеспечивает предотвращение освобождения отдельных компонентов комплекса, которые могут оказывать иное влияние на клетку, чем образуемые ими олигомерные комплексы. К примеру, некоторые субстраты TRiC включая фактор фон Гиппель-Линдау, образующий вместе с элонгином BC лигазу (VBC-лигазный комплекс), и Cdc20 и Cdh1 входящие в комплекс активирующий переход в анафазу. Если произошел их фолдинг и освобождение без включения в функциональные лигазные комплексы, то эти отдельные белки оказываются способными связывать свои белки субстраты, но не могут катализировать их превращение. Подобные комплексы оказываются устойчивыми к протеолитической деградации, в результате чего не происходит должного инактивирования регуляторных белков. Шаперонин TRiC может препятствовать этому, освобождая синтезированные субъединицы комплекса только в собранный лигазный комплекс (Spiess et. al., 2004). Механизм работы Из всех субстратов TRiC его взаимодействие наиболее изучено с белками цитоскелета актином и тубулином. Именно для этих белковсубстратов установлен механизм фолдинга с участием шаперонина. Для того чтобы принять нативное состояние данные белки нуждаются, как in-vitro, так и in-vivo, во взаимодействии с эукариотическим шаперонином. С помощью электронной микроскопии удалось выяснить, что актин и тубулин связываются с TRiC в состоянии близком к нативному. Подобное состояние достигается или самопроизвольно или с участием специального белка помощника называемого префолдином так же известном как GimC. Префолдин связывает развернутые молекулы белков, обеспечивая их 20 сворачивание лишь до квазинативного состояние, в котором он и передает их шаперонину TRiC. Актин и тубулин связываются с определенными субъединицами шаперонина TRiC. Актин взаимодействует в положении 1-4 двумя альтернативными способами – с субъединицами δ и ε или δ и β. Взаимодействие шаперонина с тубулином более сложное, в нем задействовано пять субъединиц. Также как и в случае актина, оно может происходить по двум альтернативным путям (рис. 3) (Valpuesta et. al., 2002). Рисунок 3. Связывание актина и тубулина с субъединицами TRiC. Видно, что в связывания двух субстратов задействованы разные субъединицы шаперонина. Связывание, как актина, так и тубулина может происходить двумя альтернативными путями. N-концевой домен актина и тубулина окрашен в красный, C-концевой – в синий (Valpuesta et. al., 2002). С помощью электронной микроскопии было показано, что связывание АТР вызывает конформационные изменения в апикальном домене TRiC, что ведет к закрыванию полости. В этом процессе непосредственное участие принимают спиральные выступы апикальных доменов. Сходные процессы происходят и в случае с шаперонинами архей (термосома). Отличие же TRiC от других шаперонинов заключается в том, что конформационные изменения в апикальных доменах не происходят одновременно. В данном случае происходят последовательные конформационные изменения субъединиц 21 TRiC (начиная с α-субъединицы далее в направлении γ → β → δ). Благодаря такой конформационной подвижности происходит проталкивание молекулы белка внутри полости шаперонина. В случае обоих субстратов (актина и тубулина) малый N-концевой домен движется в сторону закрепленного большого С-концевого домена, связанного более прочно с апикальным доменом. В результате такого перемещения N-концевого домена относительно C-концевого белок принимает нативное состояние. Таким образом, в отличие от GroEL, где белок в полости находится в свободном состоянии, у эукариотического шаперонина внутри полости происходит связывание с полипептидом (Gomez-Puertas et.al., 2004). В то время как события, происходящие после захвата субстрата, сильно разнятся у эукариотического и бактериального шаперонинов общий принцип работы существенно не отличается. На рисунке 4 представлен цикл работы шаперонина TRiC. Источники выделения TRiC В отличие от большого количества GroEL в бактериальных клетках и термосом, составляющих около 2% от всех белков архей, эукариотический шаперонин TRiC находится в изобилии лишь в некоторых тканях. Такими источниками являются ретикулоциты и семенники, в других же тканях шаперонин присутствует в гораздо меньших количествах. Поэтому основными источниками для выделения TRiC являются семенники (Frydman et al, 1992) и ретикулоциты (Gao et al., 1992). Все мышиные субъединицы шаперонина TRiC были клонированы, но попытки коэкспрессировать их в ретикулоцитах кролика оказались неуспешными (Liou et al., 1998). 22 белок-субстрат (а) (г) (б) (в) Нативный субстрат Рисунок 4. Цикл работы шаперонина TRiC. (а) в отсутствии нуклеотида, открытый комплекс способен связывать развернутый субстрат (U-субстрат). При этом участвуют сайты связывания внутри центральной полости (красные линии). (б) АТР-связывание само по себе не ведет к закрыванию полости и значительному фолдингу субстрата, по крайней мере в случае актина. (в) Образование промежуточного комплекса при гидролизе АТР ведет к закрыванию полости. (г) Окончательный разрыв связи в АТР или диссоциация γ-фосфата приводит к открыванию полости и освобождению свернутого субстрата. Скорее всего, цикл ассиметричный, но механизм, который обеспечивает поддержание двух колец в разных состояниях, неясен. На схеме показано функционирование лишь одного из двух колец (голубое) (Spiess et. al., 2004) Другие функции В дополнении к роли фолдинга полипептидов, было обнаружены и другие роли TRiC в клеточных процессах. Так шаперонин TRiC способен связывать в цитоплазме продукты протеасомного расщепления белков и переносить их к энодоплазматическому ретикулуму, защищая от полной деградации. В эндоплазматическом ретикулуме они используется для презентации антигена в составе главного комплекса гистосовместимости 1-го 23 класса (Kunisawa and Shastri, 2003). Кроме того, TRiC может способствовать посттрансляционной транслокации белков через мембрану ЭПР, поддерживая их в состояние, которое необходимо для перемещения (Plath and Rapoport 2000). Подобные открытия проливают свет на участие шаперонина в других клеточных процессах и могут помочь в определении мотивов в полипептидах-субстратах, которые направляют их на шаперонин опосредуемый путь фолдинга. В последнее время не вызывает сомнение вовлеченность TRiC в развитие некоторых заболеваний. К примеру, при рецессивной мутации в четвертой субъединице шаперонина происходит замена высококонсервативного цистеина на тирозин, что ведет к сенсорной невропатии (Lee et al. 2003). Вызывающая опухоль мутация в шаперонине TRiC в области, ответственной за связывание с VHL супрессором опухоли, ведет к накоплению агрегатов данного белка in vivo. Таким образом, некоторые болезни, причиной которых является потеря функции белка, могут быть связаны с нарушением их фолдинга шаперонином TRiC (Feldman et al. 2003). В экспериментах с Caenorhabditis elegans было показано, что понижение концентрации TRiC методом РНК-интерференции увеличивает накопление агрегатов белков с полиглутаминовыми повторами (Nollen et al. 2004). Недавно было показано, что шаперонин TRiC способен связывать и препятствовать токсичной агрегации белка хантитгтина имеющего протяженные полиглутаминовые повторы (Nam et. al. 2006; Kitamura et. al, 2006). Данный шаперонин при участии Hsp70 препятствует образованию токсичных агрегатов белка хантигтина, способствуя образованию нетоксичных растворимых агрегатов. (Behrends et. al. 2006). Подобные исследования важны для понимания защитных механизмов препятствующих развитию нейродегенеративных заболеваний. 24 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ Целью данной работы являлось выделение шаперонина TRiC, исследование его термодинамических параметров и рассмотрение некоторых ферментов гликолиза в качестве субстратов TRiC. В соответствии с целью работы перед нами стояли следующие задачи: 1. Разработать простой способ выделения шаперонина TRiC. 2. Исследовать способность TRiC связывать и принимать участие в фолдинге некоторых ферментов гликолиза: глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. 3. Выяснить способность шаперонина TRiC препятствовать термоагрегации белков. 4. Сравнить способность и характер взаимодействия эукариотического и бактериального шаперонинов с денатурированными глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и лактатдегидрогеназой 25 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы В работе были использованы Трис, ДТТ фирмы “Fluka”; NAD+, NADH, β-меркаптоэтанол, глицерин, HEPES, глицеральдегид-3-фосфат, ATP, глицин, ЭДТА, ДТНБ, кумаси бриллиантовый синий, сефароза 4В, ДСН, PMSF, гуанидин гидрохлорид, сульфат аммония, MgCl2, ЛДГ фирмы “Sigma”; KH2PO4, сефадекс G-100, пируват фирмы “Merck”. BrCN синтезировали из KCN и Br2 перед активацией сефарозы. Все растворы готовили на бидистиллированной воде. Методы Выделение TRiC Семенники барана очищали от соединительно-тканной оболочки, жира и крови. 75 г ткани нарезали на небольшие кусочки (примерно по 7 г) и промывали буфером для гомогенизации (ГБ: 250 мМ сахароза, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,4). После этого к ткани добавляли 150 мл ГБ, содержащий 1 мМ PMSF, и гомогенизировали сначала в блендере (не более 30 сек), а затем в стеклянном гомогенизаторе с пестиком. Полученный гомогенат центрифугировали 30 мин при 16 000 g, после чего фильтровали через 4-е слоя марли. Дальнейшее очищение TRiC проводили путем фракционирования сульфатом аммония сначала до 30%, а затем до 50%. Высаливание сульфатом аммония до 30 % насыщения проводили на льду при перемешивании. После высаливания инкубировали в течение 30 мин и центрифугировали 30 мин при 16 000 g на холоду (40 С). Высаливание до 50% насыщения сульфата аммония и последующее центрифугирование проводили в тех же условиях. Полученный осадок растворяли в 10 мл хроматографического буфера (ХБ: 5 мМ ацетат магния, 0,5 мМ ЭДТА, 10% глицерол, 1 мМ ДТТ, 1 мМ 26 PMSF, 250 мМ KCl, 50 мМ HEPES-NaOH, рН 7,2). Объем полученного раствора белка составил 16 мл. На дно ультрацентрифужных пробирок наносили по 2 мл 1 М раствора сахарозы в буфере ХБ и сверху наслаивали по 4 мл полученного раствора, после чего центрифугировали 3,5 часа при 240 000 g на холоду (40 С). После ультрацентрифугирования из пробирок отбирали слой сахарозы над желеобразным осадком, а оставшийся супернатант отбрасывали. Желеобразный осадок ресуспендировали в ХБ и объединяли с отобранным раннее слоем сахарозы. Полученный раствор (около 50 мл) наносили на колонку 2,5x10 см гепарин-сефарозы уравновешенную ХБ. После промывания тремя объемами того же буфера связавшиеся белки смывали линейным градиентом 250-500 мМ KCl в ХБ. Фракции белков анализировали при помощи SDS-электрофореза. Образцы, содержащие наибольшее количество TRiC, объединяли и подвергали повторной хроматографии в тех же условиях. Рехроматография на данном этапе выделения позволяет повысить степень чистоты белкового препарата. Фракции, содержащие наибольшее количество шаперонина TRiC, концентрировали и подвергали диализу в течение ночи против буфера хранения (0,1 М NaCl, 5 мМ MgCl2, 5% глицерин, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,2). В итоге было получено 12 мл раствора шаперонина TRiC с концентрацией 0, 68 мг/мл. Выделение шаперонина GroEL и кошаперонина GroES Очистку шаперонина проводили по методике Корралеса и Фершта с некоторыми модификациями (Corrales and Fersht, 1996). Клетки E. coli штамма W3110 трансформировали плазмидой рОF39, содержащей ген GroEL. 8 г осадка клеток суспендировали в 30 мл буфера А (100 мМ ТрисНСl, рН 8,1 (4 С), 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 0,2 мг/мл PMSF) и суспензию обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кГц (пять раз по 45 с). Фрагменты разрушенных клеток удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g. Супернатант фракционировали (NH4)2SO4. Фракцию 30-80 % 27 насыщения отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 12000 g, растворяли в 10 мл буфера Б (50 мМ Трис-НСl, рН 7,2 (4 С), 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ) и диализовали против этого же буфера. Дальнейшую очистку шаперонина проводили методом ионообменной хроматографии на DЕАЕсефацеле. На колонку (3 8 см), уравновешенную буфером Б, наносили 15-25 мл полученного раствора белка. Для удаления несвязавшихся белков сорбент промывали 100 мл буфера Б. Белки, связанные с носителем, элюировали 300 мл линейного градиента NaCl (0-0,5 М) в буфере Б. GroES элюировался в диапазоне 0,18 – 0,23 М NaCl. Фракции, содержавшие частично очищенный GroES (по данным ДСН-электрофореза) объединяли. Раствор GroES в элюирующем буфере (50 мМ Трис-НСl, рН 7,2 (4 С), 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0,2 М NaCl), подвергали термообработке, инкубируя пробы при 60 С в течение 10 минут с последующим охлаждением до 25 С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 15000 g. Далее раствор инкубировали при 80 С в течение 10 минут и полученный осадок так же удаляли. Данный подход двукратного нагрева препарата существенно увеличивал выход GroES по сравнению с однократной обработкой при 80 С. На последней стадии очистки GroES диализовали в течение ночи против 10 мМ калий-фосфатного буфера, pH 7,5 и концентрировали в пробирках Centriprep до концентрации 2-7 мг/мл. GroES хранили в данном буфере при температуре -70 С. Чистоту препаратов GroES анализировали при помощи ДСН- электрофореза в 12% ПААГ. Очищенный препарат давал единственную полосу соответствующую молекулярной массе 15 кДа, что объяснятся его аномальной подвижностью в ПААГ (теоретическая молекулярная масса GroES составляет 10,5 кДа) (Marusich et. al., 1998). GroEL элюировался в диапазоне 0,31 –0,37 М NaCl. Степень очистки шаперонина анализировали методом ДСН-электрофореза в 12% ПААГ. После диализа (в течение ночи против 3 литров буфера Б) объединенных 28 фракций частично очищенного GroEL проводили повторную хроматографию на DЕАЕ-сефацеле при тех же условиях. При помощи ДСН-электрофореза анализировали и объединяли наиболее гомогенные фракции белка. Полученный раствор диализовали в течение ночи против 2 литров 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5, а затем концентрировали в пробирках Centriprep до концентрации 7,2 мг/мл. Конечный препарат хранили в 10 мМ калий фосфатного буфере, рН 7,5 при температуре - 70 С. Концентрацию GroEL14 и GroES7 определяли спектрофотометрически, считая коэффициент А2800,1% равным 0,18 и 0,14, соответственно (Walters et. al., 2002). Молекулярную массу GroEL14 считали равной 840000 Да (субъединица 60000 Да), GroES7 70000 Да (субъединица 10000 Да). Определение концентрации TRiC Концентрацию спектрофотометрически TRiC и по измеряли методу двумя Бредфорд. При методами: определении концентрации спектрофотометрическим методом использовали коэффициент А0,1%, 280 нм = 0,4. Данный коэффициент был рассчитан теоретически исходя из суммарного поглощения всех аминокислот входящих в белок. Поскольку для овечьего шаперонина аминокислотная последовательность не установлена используемое А0,1%, 280 нм было рассчитано для TRiC из быка. При определении концентрации TRiC по методу Бредфорд, для построения калибровочного графика использовали бактериальный представитель класса шаперонинов – GroEL. 29 Рисунок 5. Калибровочный график по методу Бредфорд, построенный по шаперонину GroEL Определение концентрации иммобилизованного белка Определение концентрации ГАФД, иммобилизованной на сефарозе, проводили, используя модифицированный метод Бредфорд (Asryants et. al., 1985). Концентрацию иммобилизованной ГАФД проводили, используя калибровочный график для данного фермента (рисунок 5). Рисунок 6. Калибровочный график, построенный с использованием ГАФД в качестве стандарта, для определения концентрации иммобилизованной ГАФД. 30 Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) с использованием прибора для электрофореза “Mini-Protean электрофореза гелевый 3” (BioRad). В (концентрирующий 0,5 данной М модификации Трис-НСI буфер, содержащий 0,4%-ный ДСН, рН 6,8 и разделяющий 1,5 М Трис-НСI буфер, содержащий 0,4%-ный ДСН, рН 8,8) и электродный (0,025 Трис, 0,192 М глицин, рН 6,8) буферные растворы отличаются по составу и величине рН. Использование двух типов гелей с разной концентрацией акриламида (концентрирующего и разделяющего) приводит к тому, белковые образцы концентрируются на их границе. Образцы белка готовили на четырехкратном буфере для образцов: 0 125 М Трис-НСI буфер рН 6,8 4%-ный ДСН 20%-ный глицерин, 0,002%ный бромфеноловый синий, 10% -меркаптоэтанол. После добавления буфера для образцов пробы кипятили на водяной бане в течение 3 мин. На дорожку геля наносили 1-10 мкг белка. Гели после электрофореза окрашивали 0,04 % раствором Кумасси бриллиантового синего R-250 на смеси изопропанол – этанол – уксусная кислота – вода в соотношении 2 : 1 : 1 : 6. Отмывали от краски 10% раствором уксусной кислоты при нагревании. В случае иммобилизованных белков к порции сефарозы добавляли 4-х кратный буфер для образцов и кипятили в течение 3 мин на водяной бане. В данных условиях происходит частичное разрушение ковалентных связей с сефарозой, а также переход в раствор нековалентно связанных белков. Пробы для нанесения отбирали шприцом с диаметром иглы меньшим, чем гранулы сефарозы. Голубой нативный гель-электрофорез Голубой нативный гель-электрофорез является аналитическим методом для определения молекулярной массы и олигомерного состояния белков. В 31 данной разновидности электрофореза в отсутствие денатурирующих условий белки сохраняют свое нативное олигомерное состояние. Электрофорез проводили в линейном градиенте полиакриламидного геля (5,5 - 12%), используя десятилуночные гребенки. Градиентный гель позволяет улучшить качество разделения. Буфер для геля содержал 200 мМ ε-аминокапроновую кислоту и 150 мМ Бис-трис (рН 7,0). В лунку вносили не более 5 мкл пробы. В качестве маркеров молекулярных весов использовали смесь овальбумина (45 кДа), БСА (66 и 132 кДа) и ферритина (443 и 886 кДа) с концентрациями 5 мг/мл. Электрофорез проводили при 40 С. Вначале использовали голубой катодный буфер (50 мМ трицин, 15 мМ Бис-трис, 0,02 % Кумасси голубой G 250, рН 7,0 при 40 С ), через 20 мин буфер меняли на белый (тот же буфер, но без добавления Кумасси). Кумасси, связываясь с молекулой белка, создает отрицательный заряд на еѐ поверхности, в результате чего белки движутся по гелю к положительному электроду со скоростью, обратно пропорциональной их молекулярной массе. В качестве анодного буфера использовали 50 мМ Бис-трис (рН 7,0 при 4ºС). Электрофорез начинали при напряжении 100 V, затем увеличивали напряжение по мере продвижения проб в геле до 300 V. Гели окрашивали в растворе красителя (0,04% раствор Кумасси R250 в 10% уксусной кислоте и 20% изопропаноле) и отмывали 10% уксусной кислотой при нагревании (Schagger, 1994). Иммобилизация ГАФД на BrCN-активированной сефарозе 4В Сефарозу 4В промывали на стеклянном фильтре 0,1 М калийфосфатным буфером рН 11 для избавления от возможных загрязнений, а затем водой. Для иммобилизации ГАФД за одну субъединицу использовали низкую степень активации сефарозы – 5 мг CNBr на 1 г влажной сефарозы. 40 мг CNBr растворяли в 800 мкл холодной воды и добавляли к 8 г взвешенной влажной сефарозы в 1 М калий-фосфатном буфере рН 11 32 (объемное соотношение сефароза:буфер равнялось 1:1). Инкубировали 6 мин при низкой скорости перемешивания на ледяной бане. На стеклянном фильтре промывали сефарозу 20 объемами охлажденной воды, затем 20 объемами 0,1 М калий-фосфатного буфера рН 8,3. К сефарозе добавляли раствор ГАФД из мышц кролика из расчета 1 мг белка на 1 г сефарозы (белок предварительно обессоливали путем диализа против 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 8.3). Инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре, аккуратно перемешивая. Затем к суспензии добавляли сухой глицин до конечной концентрации 50 мМ для блокировки непрореагированных активных групп сефарозы и оставляли на ночь при +40 С и осторожном перемешивании. От несвязавшегося белка и глицина сефарозу отмывали на стеклянном фильтре 0,1 М калий-фосфатным буфером (5 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, рН 8,3) до исчезновения оптической плотности при 280 нм в промывных водах. Затем определяли концентрацию иммобилизованного белка по модифицированному методу Бредфорд. Полученная концентрация составила 238 мкг/мл суспензии сефарозы (объемное соотношение сефарозы к буферу 1:1). Удельная активность полученного иммобилизованного фермента 14,6 Ед/мг. Денатурация ГАФД, иммобилизованной на сефарозе 4В Суспензию иммобилизованного тетрамера отмывали от буфера на стеклянном фильтре и помещали в денатурирующий буфер (50 мМ Трис-HCl, 8 М мочевина, рН 7,5) на 24 часа при комнатной температуре и осторожном перемешивании. На стеклянном фильтре смывали денатурированные субъединицы денатурирующим буфером, затем промывали буфером без мочевины до исчезновения в промывных водах оптической плотности при 280 нм. Затем определяли концентрацию белка в препарате по модифицированному методу Бредфорд. Она составила 104 мкг на 1 мл суспензии сефарозы (в объемном соотношении 1:1). 33 Изучение связывания денатурированной формы ГАФД с шаперонином TRiC К 50 мкл осевшей сефарозы с иммобилизованной на ней денатурированной ГАФД добавляли 100 мкл TRiC в 10 мМ К-фосфатном буфере рН 7,5. Шаперонин добавляли в избытке так что соотношение иммобилизованной ГАФД к TRiC составляло 1 : 2. Далее проводили инкубацию в течение 30 мин. при комнатной температуре. После инкубации сефарозу 5 раз промывали 10 мМ К-фосфатным буфером рН 7,5, добавляли 50 мкл 4-х кратного буфера для образцов и наносили пробы на электрофорез после кипячения. Определение концентраций реагентов Концентрации NAD+ определяли энзиматически в реакции окисления 3-ФГА, регистрируя увеличение оптической плотности при 340 нм и считая коэффициент молярной экстинкции образующегося NADН равным 6,22 103 М-1см-1. Реакционная среда (рН 8,9) содержала 50 мМ глицин, 100 мМ KH2PO4, 5 мМ ЭДТА, около 50 мкг ГАФД, 1 мМ 3-ФГА и 5 мкл исследуемого раствора NAD+. Концентрацию 3-ФГА определяли энзиматически в той же среде, добавляя 1 мМ NAD+ и 5 мкл исследуемого раствора 3-ФГА. Концентрацию NADH определяли энзиматически в реакции восстановления пирувата, регистрируя падение оптической плотности при 340 (считая коэффициент молярной экстинкции NADН равным 6,22 103 М1 см-1). Реакционная среда содержала (рН 7,0) 100 мМ KH2PO4 около 50 мкг ЛДГ, 1,6 мМ пируват и 5 мкл исследуемого раствора NADH. Концентрацию пирувата определяли энзиматически в той же среде, добавляя 0,2 мМ NADH и 5 мкл разбавленного в 20 раз исследуемого раствора 3-ФГА. 34 Определение ферментативной активности ГАФД Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически при 25 С, измеряя скорость образования NADH при 340 нм в ходе реакции окисления 3-ФГА. Проба (объем 1 мл) содержала 50 мМ глицин, 2 мМ ЭДТА, 100 мМ KH2PO4, pH 8,9, 1 мМ 3-ФГА, 1 мМ NAD+ и 0,8-2 мкг ГАФД из мышц кролика. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля NAD+ в минуту. Определение ферментативной активности ЛДГ Определение активности ЛДГ проводили спектрофотометрически при 25 С, измеряя скорость убыли NADH при 340 нм в ходе реакции восстановления пирувата. Проба (объем 1 мл) содержала 100 мМ KH2PO4, pH 7,0 1,6 мМ пируват, 0,2 мМ NADH и 0,5-1 мкг ЛДГ. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля NADH в минуту. Реактивация ГАФД и ЛДГ ГАФД и ЛДГ (концентрация 2-3 мг/мл) инкубировали в 4 М GuHCl до полной инактивации ферментов. Реактивацию инициировали 100-кратным разбавлением денатурированных белков. Спонтанную реактивацию ГАФД и ЛДГ проводили в буфере следующего состава: 50 мМ KH2PO4, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ меркаптоэтанол, 1,5 мМ NAD+ (при реактивации ЛДГ вместо NAD+добавляли 1,5 мМ пируват), 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+. В случае шаперонин-зависимой реактивации смесь также содержала шаперонин TRiC. Реактивация проводилась при комнатной температуре при перемешивании. В процессе реактивации из реакционной среды отбирали аликвоты в течение 1,5 – 2,5 часов c шагом примерно 20 минут и определяли ферментативную активность ГАФД или ЛДГ. 35 Кинетика термоагрегации ГАФД Кинетику термоагрегации белков измеряли в термостатируемой кювете на спектрофотометре "SIM Aminco DW–2000" (США). За ходом термоагрегации белка следили по увеличению поглощения раствора при 320 нм. В кювету вносили буферный раствор (50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, рН 7,4) и нагревали до температуры 450 С. Затем вносили раствор ГАФД до конечной концентрации 0,8 мкМ (объем раствора в кювете составлял 1 мл) и регестрировали увеличение оптического поглощения в течение часа при постоянной температуре. Аналогично прописывали кинетику термоагрегации шаперонина TRiC. Концентрация TRiC в пробе составляла 0,27 мкМ. Для постановки термоагрегации ГАФД в присутствии шаперонина, буфер нагревали до 450 С, после чего процесс термоагрегации начинали внесением раствора ГАФД и TRiC. Соотношение TRiC к мономеру ГАФД в пробе составляло 1:3. Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи компьютерной программы "ORIGIN 7.0". Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) Анализ белков микрокалориметрии методом проводили на дифференциальной адиабатическом сканирующей микрокалориметре ДАСМ – 4 (Биоприбор, Пущино, Россия) в кювете объемом 0,47 мл при скорости сканирования 1 С/мин. Концентрация белка составляла 1-2 мг/мл. Обработку полученных данных и расчет значений Tmax (максимальная температура перехода) проводили, используя оригинальную программу Arina, разработанную в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского. Метод динамического лазерного светорассеивания (ДЛС) Эксперименты проводили с использованием прибора «Zetasizer nanoZS» (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания). Прибор оснащен лазером с длинной волны 633 нм (He-Ne, 4 мВ) и оптической системой, 36 позволяющей измерять интенсивность светорассеяния под углом 173°. Для интерпретации полученных результатов использовали параметр «распределение числа частиц по размеру» (size distribution by number) и «распределение числа частиц по интенсивности светорассеяния» (size distribution by intensity). Измерения проводили в термостатируемой кювете при 250С. Каждое значение на полученных графиках являлось средним из 5 измерений полученных в течение 30 секунд. Масс-спектрометрический анализ белка Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле, окрашенном Coomassie Brilliant Blue (G-250), проводили следующим образом: вырезали кусочек геля размером 1 1 мм, который дважды промывали для удаления красителя путем инкубации в 100 мкл 40 % раствора ацетонитрила в 0,1 М NH4HCO3 в течение 30 мин при 37 С. После удаления раствора для дегидратации геля добавляли 100 мкл ацетонитрила. Удалив ацетонитрил и высушив кусочек геля, прибавляли к нему 4 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega) в 0.05 М NH4HCO3 с концентрацией 15 мкг мл-1. Гидролиз проводили в течение 12 ч при 37 С, затем к раствору добавляли 8 мкл 0.5 % ТФУ в 10 % растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Надгелевый раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров. Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на мишени смешивали 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich,10 мг мл-1 в 20 % ацетонитриле в воде с 0.5 % ТФУ), и полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетновремяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных 37 масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0,007 %. Масс-спектрометрический анализ белковых полос в геле и последующая их идентификация была проведена фирмой «ПИННИ». Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск по «пептидному фингерпринту» проводился в базе данных NCBI среди белков быка, с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом. 38 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение TRiC Для экспериментального исследования шаперонина TRiC был разработан новый метод выделения TRiC из семенников барана. На первом этапе настоящей работы были проанализированы различные способы выделения шаперонина (Gao et. al., 1992; Norcum 1996; Ferreyra, Frydrnan, 2000). Оказалось, что все известные методы либо включают большое количество достаточно трудоемких стадий, либо несложны, но требуют труднодоступного в большом объеме материала (например, ретикулоцитов). Разработанный нами метод является комбинацией этих методик с получением несложного способа выделения шаперонина TRiC из семенников барана. Данный метод включает всего три стадии: высаливание, ультрацентрифугирование и хроматографию. Для повышения степени чистоты препарата белка последнюю стадию выделения проводили дважды (рехроматография в тех же условиях). На всех стадиях выделения отбирали пробы и анализировали методом электрофореза в денатурирующих условиях. После гомогенизации и центрифугирования ткани (см. «Материалы и методы») нами был получен супернатант, содержащий большое количество белков. Как видно из приведенной на рисунке 7 электрофореграммы (дорожка 1), содержание шаперонина в полученном супернатанте небольшое. На дорожках 2-5 представлены данные после проведения фракционирования полученного супернатанта. На следующем этапе выделения проводили ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. После проведения данной стадии также отбирали пробы для электрофореза (дорожки 6-8). Как видно из рисунка, на стадии ультрацентрифугирования препарат все еще остается достаточно загрязненным примесями других 39 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 66 кДа 45 кДа 36 кДа 29 кДа 24 кДа 14 кДа Рисунок 7. Анализ методом электрофореза в денатурирующих условиях промежуточных фракций, полученных при выделении шаперонина TRiC М – маркерные белки (14, 20, 24, 29, 36, 45, 60 кДа); 1 – супернатант после центрифугирования гомогенизированной ткани; 2 – осадок, 30% насыщения сульфата аммония; 3 – супернатант, 30% насыщения соли; 4 – осадок, 50% насыщения соли; 5 – супернатант, 50% насыщения соли; 6 – желеобразный осадок после ультрацентрифугирования; 7 – слой сахарозы над желеобразным осадком после ультрацентрифугирования; 8 – белки, не вошедшие в слой 1 М сахарозы при ультрацентрифугировании; 9 – раствор белка, подверженный ионообменной хроматографии; 10 – проскок, ионообменная хроматография; 11 – конечная проба белка после элюции с колонки и концентрирования 40 М 9 13 15 17 21 23 25 29 31 33 35 37 39 43 45 49 53 60 кДа 45 кДа 36 кДа 29 кДа 24 кДа 20 кДа 14 кДа Рисунок 8. Анализ фракций, полученных после хроматографии на гепарин-сефарозе. М – маркерные белки (14, 20, 24, 29, 36, 45, 60 кДа) Цифры над дорожками соответствуют номерам фракций элюируемых при хроматографии. 41 белков, поэтому затем была проведена хроматография на гепарин-сефарозе. На рисунке 8 представлена электрофореграмма проб после проведения элюции. Из рисунка видно, что данный белок элюируется в широких пределах концентрации KCl. Основная фракция шаперонина элюируется от 360 до 470 мМ KCl (рис. 8, фракции с 21 по 49). После хроматографии фракции, содержавшие наибольшее количество белка, объединяли, путем диализа переводили в буфер для хроматографии (ХБ) и подвергали рехроматографии. При проведении рехроматографии в процессе нанесения раствора белка на колонку основное количество шаперонина связывалось с носителем, а большая часть примесей смывалась буфером ХБ. Таким образом, для получения более концентрированного препарата белка и для уменьшения времени, которое затрачивается на рехроматографию, вероятно, стоит наносить белок на колонку и элюировать буфером с 470 мМ KCl, а не градиентом 250-500 мМ KCl. На рисунке 9 представлен препарат шаперонина после 1 и 2 хроматографии (дорожки 1 и 2, соответственно). Из рисунка 9 видно, что рехроматография позволяет повысить степень очистки белка. После рехроматографии исчезли примесные полосы в районе 50 кДа, а также выраженная полоса снизу на уровне фронта. Таким образом, в результате проведенного выделения, был получен гомогенный препарат белка, который дает при проведении электрофореза ряд близкорасположенных полос от 50 до 60 кДа. Полученный результат соотносится с данными, представленными в литературе (Frydman et al., 1992; Lewis et al., 1992). 42 60 кДа 45 кДа Рисунок 9. Результат электрофоретического анализа проб белка до и после рехроматографии. 1 – препарат белка, полученный после первой хроматографии 2 – белковый препарат после рехроматографии Положение маркеров с соответствующими им молекулярными весами отмечены стрелками. 43 Определение концентрации полученного препарата шаперонина TRiC Концентрацию полученного шаперонина определяли двумя способами – спектрофотометрически спектрофотометрического и при помощи определения метода Бредфорд. концентрации белка Для был теоретически рассчитан коэффициент молярного поглощения (на сайте www.expasy.org) как сумма данных коэффициентов для всех аминокислот входящих в TRiC. Поскольку для шаперонина из барана аминокислотная последовательность не установлена, то А0,1%, 280 нм рассчитывали для шаперонина из быка. Таким образом, коэффициент А0,1%, 280 нм для TRiC составляет 0,4. Также для более полной характеристики полученного препарата определяли спектр его поглощения (240 – 300 нм), который представлен на рисунке 10. Из рисунка 10 видно, что поглощение при 260 нм превышает поглощение при 280 нм. Соотношение D280/D260 составляет 0,703. В связи с этим можно предположить, что выделенный шаперонин связан с ADP (или ATP), максимум Следовательно, поглощения определение которых концентрации находиться шаперонина при при 260 нм. помощи спектрофотометрического метода невозможно. Более того, используя продолжительный диализ (в течение 1,5 суток) и активированный уголь не удалось отделить АТР от белка. Вторым методом для определения концентрации полученного белка был метод Бредфорд. Так как для определения концентрации данным способом необходимо построить калибровочную кривую, а концентрация препарата не известна и спектрофотометрически не была определена достаточно точно, то для построения калибровочного графика мы использовали шаперонин GroEL (рис. 5). 44 0,18 0,16 0,14 D 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 240 250 260 270 280 290 300 длина волны, нм Рисунок 10. Спектр полученного белкового препарата шаперонина TRiC Спектр прописывали от 240 до 300 нм. В пробе присутствовал TRiC в концентрации 0,68 мг/мл (определенная по методу Бредфорд) в 10 мМ калий фосфатном буфере рН 7,5 45 В результате определения концентрации белка двумя разными методами были получены разные значения. Так концентрация белка, определенная спектрофотометрическим методом, оказалось, в 2,1 раз выше по сравнению со значением, полученным методом Бредфорд. Исходя из полученных данных, можно заключить, что следует определять концентрацию шаперонина TRiC при помощи метода Бредфорд. Масс-спектрометрический анализ полученного белка Чтобы подтвердить то, что полученный препарат является действительно шаперонином TRiC, использовали масс-спектрометрический анализ. Как известно из данных литературы, шаперонин TRiC представляет собой мультисубъединичный комплекс, состоящий из двух колец, каждое из которых образовано 8 разными субъединицами с близкой молекулярной массой. При окраске белков на геле после электрофореза в денатурирующих условиях субъединицы видны близко располагающими полосами в районе 50-60 кДа (рисунок 11). Для масс-спектрометрического анализа из геля после электрофореза в денатурирующих условиях вырезали небольшие участки размером чуть больше 1 мм2, брали фрагменты полос из нижней, верхней и средней частей в районе от 50 до 60 кДа. Белки были идентифицированы, используя базу данных для быка. Результаты представлены в виде таблицы (таблица 2). Из таблицы 2 видно, что было идентифицировано 7 субъединиц, и все они соответствуют шаперонину TRiC. Однако еще одна субъединица «Tcomplex protein 1 subunit epsilon» не была определена. Скорее всего, это связано с тем, что ее последовательность была установлена только для мыши и человека (молекулярная масса 59,6 кДа), но в настоящее время не расшифрована для быка. Таким образом, из полученных данных можно сделать вывод о том, что выделенный нами белок является шаперонином TRiC. Более того, проведенный анализ позволяет установить соответствие между 46 Таблица 2. Наиболее вероятные белки, определенные массспектрометрическим методом. Анализированные пробы находились в области 50-60 кДа на электрофоретическом геле. Положение Наиболее вероятные белки Молекулярная вырезанного из геля масса фрагмента в ряду кДа белков, белковых полос в области 50-60 кДа Нижнее T-complex protein 1 subunit beta 57,3 Среднее T-complex protein 1 subunit zeta 57,8 T-complex protein 1 subunit eta 58,1 T-complex protein 1 subunit delta 59,4 T-complex protein 1 subunit theta 59,4 T-complex protein 1 subunit theta 59,4 T-complex protein 1 subunit alpha 60,2 T-complex protein 1 subunit gamma 60,5 Верхнее 47 субъединицами и полосами на геле в области 50-60 кДа (рис. 11). Также одной из проблем при выделении TRiC, является возможность загрязнения препарата шаперонином Hsp60, который может появиться в супернатанте при неправильной гомогенизации и разрушении митохондрий. Как видно из таблицы 2, Hsp60 в пробе отсутствует. Исследование олигомерного состава полученного препарата TRiC На первом этапе, для того чтобы определить олигомерное состояние полученного шаперонина TRiC, мы использовали метод нативного голубого электрофореза. Суть данного метода в том, что в отсутствие денатурирующих условий Кумасси связывается с молекулой белка и создает отрицательный заряд на еѐ поверхности, в результате чего белки движутся по гелю к положительному электроду со скоростью, обратно пропорциональной их молекулярной массе. Для того чтобы определить олигомерное состояние полученного препарата, в первую очередь, нами была рассчитана масса всего шаперонина – 950 кДа, как сумма молекулярных масс составляющих его субъединиц (молекулярная масса субъединицы с нерасшифрованной последовательностью аминокислот была принята как средняя молекулярная масса расшифрованных 7 субъединиц). Нативный голубой электрофорез проводили, используя в качестве маркеров белки с молекулярной массой 886 кДа, 443 кДа, 66 кДа и 45 кДа. На рисунке 12 представлен результат электрофореза, где на дорожке Т видна одна полоса, находящаяся выше маркерного белка ферретина (886 кДа). Это говорит, во-первых, об отсутствии белковых примесей с меньшей молекулярной массой, а, вовторых, о том, что полученный нами препарат содержит только белки с молекулярной массой выше 886 кДа, то есть представляет собой олигомер. 48 gamma, alpha, theta theta, delta, eta, zeta beta Рисунок 11. Соответствие белковых полос, видимых после SDSэлектрофореза, субъединицам шаперонина TRiC. Субъединицы подписаны справа от соответствующих полос. 49 М Т 886 кДа 443 кДа 66 кДа 45 кДа Рисунок 12. Исследование олигомерного состава препарата методом голубого нативного гель-электрофореза. М – маркеры (886, 443, 66, 45 кДа) Т – выделенный препарат TRiC. выделенного 50 Исходя из полученных нами данных о том, что препарат, полученного шаперонина является гомогенными, виделось целесообразным провести анализ размера частиц шаперонина TRiC. Данный параметр определяли при помощи метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС), который позволяет определить размер частиц в растворе. На рисунке 13 представлено «распределение числа частиц по размеру» в выделенном препарате TRiC. На графике можно наблюдать один пик с максимумом 17 нм. По данным swissprot диаметр шаперонина TRiC составляет от 12 до 16 нм. Различия между данными, представленными в литературе и полученными нами, вопервых, незначительны, а, во-вторых, с помощью данного метода измеряется гидродинамический радиус, который немного превышает реальный. Кроме того, при помощи метода ДЛС мы также показали, что препарат гомогенен, о чем говорит отсутствие других пиков на рисунке 13. Следовательно, мы показали, что выделенный нами препарат шаперонина TRiC является гомогенным, TRiC не денатурированный и находится в растворе в виде олигомерного белка. Если при измерении распределения частиц по размеру размер получаемых пиков на графике зависит только от количества частиц определенного размера, то при измерении распределения частиц по интенсивности размер пиков зависит от двух параметров - количества частиц определенного размера и их диаметра. Поскольку интенсивность светорассеяния возрастает с увеличением размера частиц, то даже небольшое количество частиц большого размера дает значительный пик. На рисунке 14 показано «распределение частиц по интенсивности светорассеяния» в полученном после выделения растворе TRiC. На рисунке видно, что в растворе присутствуют частицы двух размеров: шаперонин TRiC и примесные частицы, дающие пик с максимумом 160 нм. Размер примесных частиц примерно в 10 раз превышает размер шаперонина поэтому небольшое их количество в пробе дает пик на графике. 51 30 25 Количество, % 20 15 10 5 0 1 10 100 1000 10000 Диаметр частиц, нм Рисунок 13. Распределение частиц по размеру в полученном препарате TRiC. TRiC инкубировали при 250С в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,5. Концентрация TRiC составляла 0,27 мкМ. Параметры светорассеяния определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». 52 9 Интенсивность светорассеяния, % 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 1 10 100 1000 10000 Диаметр частиц, нм Рисунок 14. Распределение частиц по интенсивности светорассеяния в полученном препарате TRiC. TRiC инкубировали при 250С в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,5. Концентрация TRiC составляет 0,27 мкМ. Параметры светорассеяния определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». 53 Из предыдущего рисунка (рисунок 13), где показано распределение частиц по размеру, видно, что количество примесных частиц минимально. Третий пик в области 5000 нм, скорее всего, обусловлен попаданием крупных частиц пыли из воздуха в раствор. Взаимодействие TRiC с денатурированной формой ГАФД Для изучения связывания TRiC с денатурированной ГАФД мы иммобилизовали ГАФД на сефарозе 4В. Как описано в разделе «Материалы и методы» сначала была проведена иммобилизация нативной ГАФД, а затем денатурация связанного с сефарозой фермента. После иммобилизации нативной ГАФД на сефарозе была определена концентрация белка по модифицированному методу Бредфорд с использованием калибровочного графика построенного с использованием ГАФД (см. «Материалы и методы» рисунок 6). Она составила 238 мкг белка на 1 мл суспензии (где объемное соотношение сефарозы к буферу 1:1). После денатурации ГАФД концентрация белка составила 104 мкг на 1 мл суспензии. Данное количество составляет 45% от изначального количества пришитого фермента, то есть можно было бы предположить, что после денатурации в связанном состоянии остается около двух субъединиц тетрамера. Однако хорошо известно, что при данной степени активации происходит присоединение ГАФД только за одну субъединицу, а для ковалентного связывания фермента за две субъединицы требуется значительно большее количество BrCN (30 мг вместо 5мг для иммобилизации за одну субъединицу). Поэтому столь высокое содержание белка ГАФД после денатурации по сравнению с нативным иммобилизованным ферментом, скорее всего, связано с тем, что изначально была пришита не только тетрамерная, но и димерная форма ГАФД. Так как ГАФД перед иммобилизацией обессоливали путем диализа на холоду, то, скорее всего, в этих условиях произошла частичная диссоциация субъединиц. 54 1 2 3 60 кДа TRiC 45 кДа 36 кДа ГАФД 29 кДа 24 кДа 20 кДа 14 кДа Рисунок 15. Исследование образования комплекса между денатурированной иммобилизованной на сефарозе 4В ГАФД и шаперонином TRiC TRiC (0,04 мкМ) в 10 мМ KH2PO4, рН 7,5, инкубировали с денатурированной иммобилизованной ГАФД, отмывали 10 мМ фосфатным буфером от несвязавшегося белка и анализировали пробы при помощи ДСНэлектрофореза. Цифры вверху рисунка соответствуют следующим пробам: 1. исходный раствор TRiC 2. TRiC, который остался в супернатанте после инкубации с денатурированной иммобилизованной ГАФД 3. денатурированная иммобилизованная ГАФД после инкубации с TRiC 55 Иммобилизованную на сефарозе денатурированную форму ГАФД инкубировали в течение 30 минут с раствором шаперонина TRiC. После инкубации сефарозу осаждали и отбирали супернатант, осаждѐнную сефарозу отмывали калий-фосфатным буфером. Пробу с осевшей сефарозой и пробу с супернатантом анализировали при помощи SDS-электрофореза. В процессе нагрева пробы происходило разрушение нековалентных связей между белком и шаперонином, а также частично между ГАФД и сефарозой. Таким образом, мы могли наблюдать, шаперонин TRiC связался с иммобилизованной ГАФД или остался в супернатанте. Полученный результат представлен на рисунке 15. Дорожки 1, 2 и 3 соответствуют исходному раствору шаперонина TRiC, супернатанту, отобранному после осаждения сефарозы, и сефарозе с иммобилизованной ГАФД, осаждѐнной после инкубации с раствором TRiC. Как видно из электрофореграммы, на дорожке 3 присутствуют полосы, соответствующие шаперонину TRiC и ГАФД. Эти результаты демонстрируют взаимодействие шаперонина с денатурированной ГАФД. Реактивация ГАФД и ЛДГ в присутствии шаперонинов GroEL и TRiC Для сравнения влияния бактериального и эукариотического шаперонинов на реактивацию и термоагрегацию, кроме шаперонина TRiC, нами также был выделен шаперонин GroEL. GroEL и кошаперонин GroES выделяли из E. coli, как описано в разделе «Материалы и методы». В результате выделения, очистки и концентрирования были получены гомогенные препараты белков GroEL и GroES. На рисунке 16 (дорожки 1 и 2) представлены конечные препараты GroES и GroEL, соответственно. Из рисунка видно, что выделены гомогенные препараты белков с соответствующими им кажущимися молекулярными массами. 56 1 2 3 60 кДа 50 кДа 36кДа 25 кДа 15 кДа Рисунок 16. Электрофореграмма выделенных препаратов GroEL и GroES 1– конечный препарат GroES 2– конечный препарат GroEL 3белки стандарты (кажущиеся молекулярные массы, соответствующие полосам белков подписаны справа от рисунка) 57 Ранее в нашей лаборатории было проведено исследование влияния шаперонина GroEL на сворачивание предварительно денатурированной гуанидин гидрохлоридом ГАФД (рис. 17). Нами было показано, что уровень спонтанной реактивации фермента составляет около 4% (удельная активность 2,5-3,5 Ед/мг белка), присутствие в среде только GroEL/GroES в отсутствие Mg-ATP полностью блокирует спонтанную реактивацию (удельная активность менее 0,1 Ед/мг белка), а наличие «полной системы», содержащей GroEL-GroES и Mg-ATP, приводит к существенному увеличению реактивации до 16-20% (удельная активность 13-20 Ед/мг). Исходя из полученных нами данных о взаимодействии денатурированной ГАФД с шаперонином TRiC, мы предположили, что TRiC, как и шаперонин GroEL, может способствовать рефолдингу ГАФД. Для денатурации фермента мы инкубировали ГАФД в присутствии 4 М гуанидин гидрохлорида при концентрации белка от 30 до 120 мкМ. В процессе инкубации отбирали аликвоты для измерения ферментативной активности ГАФД. Было показано, что по истечению 15-20 минут инкубации в 4 М гуанидин гидрохлориде белок полностью терял свою активность. Для инициации рефолдинга денатурированный фермент разводили в 100 раз буфером для реактивации и следили за восстановлением активности. На рисунке 18 представлен результат TRiC-зависимой реактивации денатурированной ГАФД в присутствии и в отсутствие Mg-ATP. Из кривых, представленных на рисунке 18, видно, что присутствие в пробе только шаперонина без Mg-ATP приводит к уменьшению реактивации фермента. Такое частичное блокирование свидетельствует, во-первых, о связывании денатурированной ГАФД шаперонином и, во-вторых, о том, что для шаперонин-зависимого рефолдинга, вероятно, недостаточно наличия в пробе лишь части компонентов «полной системы». Поскольку в данном эксперименте молярное соотношение TRiC меньше ГАФД (2 : 3 соответственно), то, видимо, реактивировался свободный от связанного шаперонина фермент, что и дало низкий уровень восстановления активности. 58 10 3 активность, ед/мг 8 6 4 1 2 2 0 0 20 40 60 80 100 120 время, мин Рисунок 17. Спонтанная и GroEL-зависимая реактивация ГАФД денатурированной в гуанидин гидрохлориде. ГАФД (0,13 мкМ) инактивировали в 4 М растворе гуанидин хлорида, далее разводили в 100 раз до конечной концентрации 1 мкМ в буфере для рефолдинга (10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ NAD+, 5 мМ, 2-меркаптоэтанол) в присутствии 2 мМ ATP и 2 мМ Mg2+ (1); или в присутствии 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES (2); или в присутствии 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+, 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES (3). Через определенные промежутки времени отбирали пробы из реакционной смеси и измеряли активность ГАФД (см. «Материалы и методы»). 59 ГАФД ГАФД+TRiC 1 +TRIC-MgATP ГАФД 4.0 1 активность, ед. 3.5 3 3.0 2.5 2.0 1.5 2 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 время, мин Рисунок 18. Спонтанная и TRiC-зависимая реактивация ГАФД денатурированной в гуанидин гидрохлориде. ГАФД (70 мкМ) инактивировали в 4 М растворе гуанидин хлорида, далее разводили в 100 раз до конечной концентрации 0,6 мкМ в 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ NAD+, 5 мМ, 2меркаптоэтанол) с 2 мМ ATP и 2 мМ Mg2+ (1); в присутствии 0,4 мкМ TRiC(2); или в присутствии 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+, 0,4 мкМ TRiC(3). Через определенные промежутки времени отбирали пробы из реакционной смеси и измеряли активность ГАФД (см. «Материалы и методы»). 60 С другой стороны, из рисунка 18 видно, что уровень TRiC-зависимой реактивации ГАФД очень близок к уровню спонтанной реактивации фермента. Таким образом, можно заключить, что TRiC связывает ГАФД, денатурированный в GuHCl, но не реактивирует его. Раннее в нашей лаборатории было показано, что бактериальный шаперонин GroEL способен осуществить фолдинг эукариотической лактатдегидрогеназы (рис. 19). Фолдинг происходит по цис-механизму для которого достаточно апикальными связывания доменами денатурированного субъединиц шаперонина фермента (не с требуется инкапсулирование в полости) (Naletova et. al. 2006). Поэтому мы предположили, что, так как рефолдинг ЛДГ может проходить разными путями, то, возможно, уровень реактивации в присутствии шаперонина TRiC будет выше, чем в случае спонтанной. Для проверки этого предположения нами была исследована реактивация ЛДГ в присутствии TRIC и Mg-ATP (рис. 19). Результаты опытов, приведенные на рисунке 20, свидетельствуют о значительном увеличении реактивации фермента в присутствии шаперонина по сравнению со спонтанной реактивацией. Причем для спонтанного рефолдинга ЛДГ характерно постепенное увеличение количества реактивированного фермента, а затем заметное снижение. Вероятно, это говорит о том, что рефолдинг происходит не полностью и молекулы фермента постепенно теряют активность и агрегируют. Совершенно подругому выглядит ситуация в случае, когда в пробе содержится шаперонин и Mg-ATP. Из рисунка видно, что реактивация ЛДГ в присутствии TRiC превышает примерно в 3 раза уровень спонтанной реактивации. Более того, уровень TRiC-зависимой реактивации через 60 минут выходит на плато и сохраняется достаточно длительное время. Мы полагаем, что рефолдинг ЛДГ в данном случае происходит путем связывания развернутой молекулы ЛДГ с апикальным доменом TRiC и последующим высвобождением ЛДГ в раствор. 61 12 11 10 2 активность, ед/мг 9 8 7 6 5 4 3 1 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 время, мин Рисунок 19. GroEL-зависимая реактивация ЛДГ, денатурированной в гуанидин гидрохлориде. ЛДГ (18 мкМ) инактивировали в 4 М растворе гуанидин хлорида, после чего начинали реактивацию фермента разведением в 100 раз до конечной концентрации 0,14 мкМ в буфере для рефолдинга (10 мМ калий-фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ пируват, 5 мМ, 2меркаптоэтанол) без добавок (1); или в присутствии 0,14 мкМ GroEL, 0,14 мкМ GroES, 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+ (2). Через определенные промежутки времени отбирали пробы из реакционной смеси и измеряли активность ЛДГ (см. «Материалы и методы»). 62 B E 3.0 2.8 2.6 2 2.4 активность, ед. 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 1 0.2 0.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 время, мин Рисунок 20. TRiC-зависимая реактивация ЛДГ, денатурированной в гуанидин гидрохлориде. ЛДГ (71,4 мкМ) инактивировали в 4 М растворе гуанидин хлорида, после чего начинали реактивацию фермента разведением в 100 раз до конечной концентрации 0,6 мкМ (1) в буфере для рефолдинга (10 мМ калийфосфатный буфер, 150 мМ NaCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ пируват, 5 мМ, 2-меркаптоэтанол) без добавок (2) или в присутствии 0,4 мкМ TRiC с 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+. Через определенные промежутки времени отбирали пробы из реакционной смеси и измеряли активность ЛДГ (см. «Материалы и методы»). 63 Таким образом, следует подчеркнуть два основных вывода. Во-первых, вероятное существование отличий в механизмах TRiC-зависимого фолдинга двух ключевых дегидрогеназ – глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, и, во-вторых, возможность TRiC-зависимой реактивации ЛДГ, в отличие от ГАФД. Термоагрегация ГАФД Шапероны не только влияют на фолдинг белков, но также препятствуют агрегации неправильно свернутых белков. Ранее в нашей лаборатории было проведено исследование влияния шаперонина GroEL на термоагрегацию ГАФД. За ходом термоагрегации ГАФД в присутствии шаперонина и без его добавления следили по увеличению мутности раствора при 320 нм. На рисунке 21 (кривая 1) показана типичная кривая увеличения мутности раствора ГАФД во времени в процессе инкубации при 45 С. Температура 45 С была выбрана поскольку в данных условиях начинается постепенная денатурация ГАФД, а структура шаперонина остается нативной. Для изучения влияния шаперонина на термоагрегацию ГАФД мы проводили инкубацию в присутствии с GroEL. В данном случае происходило блокирование агрегации за счет связывания термоденатурированных молекул ГАФД (кривая 2). Таким образом, из рисунка следует, что шаперонин GroEL способен связывать термоденатурированные молекулы ГАФД и препятствовать ее термоагрегации. Подобный эффект было интересно проверить также для шаперонина TRiC на примере данного фермента. Поскольку из литературных источников мало известно о термодинамических параметрах шаперонина TRiC, прежде всего, необходимо было выяснить условия, при которых происходит термоагрегация TRiC. Для этой цели с помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) мы определяли температуру, при которой происходит термоагрегация исследуемых белков в заданных условиях (концентрация белка, буфер). 64 0,122 мкМ ГАФД 0.05 1 D320 0.04 0.03 0.02 0.01 0,122 мкМ ГАФД + 0,122 мкМ GroEL 2 0.00 0 10 20 30 40 50 60 время, мин. Рисунок 21. Влияние GroEL на термоагрегацию ГАФД. Раствор фермента (0,122 мкМ) в буфере (50 мМ калий фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) нагревали в термостатируемой кювете при 45 С. Во всех случаях белок вносили в буфер, прогретый до заданной температуры. ГАФД нагревали без добавок (кривая 1), и в присутствии 0,122 мкМ GroEL (кривая 2). 65 При достижении определенной температуры происходит плавление молекул белка, в результате чего экспонируются гидрофобные области, и происходит агрегация полипептидных цепей. При использовании метода ДЛС образуемые агрегаты дают пик на графиках распределения частиц по размеру и интенсивности светорассеяния. Шаперонин инкубировали в термостатируемой кювете в интервале температур от 35 до 70 0 С с интервалом 1 градус за 22 минуты. Длительная инкубация при увеличении температуры на каждый градус была необходима для приведения системы в равновесное состояние. Как следует из рисунка 22 (кривая 2) в случае с инкубацией шаперонина процесс агрегации начинается после 520 С. Схожие параметры в идентичных условиях были определены также для ГАФД. Как видно из рисунка 22 (кривая 1) процесс денатурации ГАФД начинается с 400 С. Таким образом нами было установлено, что если термоагрегация ГАФД начинается при 400 С, а шаперонина TRiC – при 520 С, то изучение возможности защиты фермента от агрегации эукариотическим шаперонином стоит проводить при 450 С. Агрегацию ГАФД в присутствии и в отсутствие шаперонина TRiC проводили в стеклянных кюветах, объѐмом 1 мл в 50 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, рН 7,5 при температуре 45 С. Во всех проведѐнных экспериментах кювету с буфером заранее нагревали до заданной температуры. Результаты эксперимента представлены на рисунке 23. На рисунке 23 видно, что со временем при температуре 450С происходит образование агрегатов ГАФД (кривая 1). Из кривой термоагрегации шаперонина (кривая 2) можно заключить, что TRiC практически не агрегирует при данной температуре. Характер термоагрегации ГАФД в присутствии TRiC (кривая 3) практически не отличается от таковой для ГАФД. 66 700 диаметр частиц, нм 600 500 400 2 300 200 1 100 0 35 40 45 50 55 60 65 70 0 T, C Рисунок 22. Зависимость размера белковых частиц в пробе от температуры. ГАФД 0,8 мкМ (1) или TRiC 0,27 мкМ (2) нагревали со скоростью 1 градус за 22 минуты в буфере (50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, рН 7,5). С помощью метода ДЛС по ходу времени следили за изменением размера частиц в растворе 67 0,8 мкМ ГАФД + 0,27 мкМ TRiC 0.18 3 2 0.16 0.14 0,8 мкМГАФД D320 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0,27 мкМ TRiC 0.02 1 0.00 0 10 20 30 40 50 60 время, мин Рисунок 23. Влияние TRiC на термоагрегацию ГАФД. Раствор фермента (0,8 мкМ) в буфере (50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5) нагревали в термостатируемой кювете при 45 С. Во всех случаях белок вносили в буфер, прогретый до заданной температуры. ГАФД (0,8 мкМ) (1) и TRiC (0,27 мкМ) (2) инкубировали в буфере отдельно (1,2) и совместно (3). 68 Суммируя полученные нами данные, можно заключить, что в отличие от шаперонина GroEL, шаперонин TRiC не препятствует термоагрегации ГАФД. Исследования взаимодействия ГАФД с шаперонином TRiC методом ДСК Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) позволяет определять термодинамические параметры термоденатурации белков. Кроме того, с помощью метода ДСК можно регистрировать взаимодействие белка с различными лигандами или с другими белками, поскольку изменение его термодинамических свойств при связывании лигандов приводит к изменению этих параметров. Наличие пика теплопоглощения обусловлено термоденатурацией белка, а области до и после пика соответствуют нативному и денатурированному состояниям. Наличие или отсутствие пика кооперативного теплопоглощения для данного белка в данных условиях является критерием наличия (или отсутствия) у этого белка жесткой кооперативно плавящейся третичной структуры (Ptitsyn, 1995; Privalov, 1979). В области пика присутствуют одновременно обе формы белка, причем при температуре, соответствующей максимуму пика (Тм), число денатурированных и нативных молекул одинаково (Sturtevant, 1977). С помощью метода ДСК были получены кривые теплопоглощения для ГАФД, TRiC и раствора ГАФД в присутствии TRiC. Поскольку TRiC имеет много большую молекулярную массу по сравнению с мономером ГАФД, то при приготовлении такого раствора в пробе оказывается недостаточное количество ГАФД для его индивидуального анализа методом ДСК. Поэтому для получения контрольной кривой ГАФД использовали раствор с большей концентрацией фермента. Полученные результаты представлены на рисунке 24. Как видно из рисунка, величина Тм для ГАФД без добавления шаперонина составляет 55оС (кривая 1). Свободный TRiC характеризуется 69 300 TRiC 1,8 мкМ + GAPD 1,7 мкМ TRiC 1,8 мкМ 3 кДж/(моль*К) 250 200 GAPD 27 мкМ 2 1 150 100 50 0 30 40 50 60 70 80 90 100 Температура, С Рисунок 24. Анализ взаимодействия шаперонинов с ГАФД методом ДСК. Растворы белков в 10 мМ калий-фосфатном буфере, pH 7,5, нагревали в ячейке калориметра со скоростью 1 град/мин: 27 мкМ ГАФД (кривая 1), 1,8 мкМ TRiC (кривая 2), совместная инкубация 1,8 мкМ TRiC с 1,7 мкМ ГАФД (кривая 3). 70 величиной Тм 59,4 (рис. 24, кривая 2). В тех случаях, когда температуры термоденатурации двух белков отличаются (например, как в случае ГАФД и TRiC), при совместном прогревании можно выяснить происходит ли взаимодействие между ними. По этой причине при нагревании ГАФД в присутствии TRiC большая часть ГАФД переходит в денатурированное состояние до начала термоденатурации TRiC. Как видно из рисунка (кривая 3) полученная кривая теплопоглощения не отличается значительно от таковой для индивидуального шаперонина (кривая 2). При связывании термоденатурированной ГАФД близким аналогом TRiC - шаперонином GroEL, происходит увеличение ТМ на 30 С, уменьшение ширины в 1,47 раз и примерно двукратное увеличение высоты пика (Naletova et. al. 2006). Поэтому можно заключить, что TRiC не связывает термоденатурированную ГАФД. 71 Заключение Таким образом, нам удалось разработать достаточно простой способ выделения TRiC из нового источника – семенников барана путем комбинации и дополнительной модификации двух известных ранее методов (технически сложного выделения TRiC из семенников быка и простого способа выделения TRiC из труднодоступного и дорогостоящего источника – ретикулоцитов). То, что выделенный нами препарат белка является именно TRiC было доказано несколькими способами. Прежде всего, нами было показано, что он обладает шаперонной активностью, по крайней мере, в отношении одного субстрата – лактатдегидрогеназы. Во-вторых, было показано, что препарат содержит набор полипептидов, молекулярная масса которых соответствует молекулярным массам субъединиц TRiC. В-третьих, оказалось, что препарат содержит только крупные олигомерные молекулы с молекулярной массой выше 886 кДа и гидродинамическим радиусом 17 нм, которые также близки к соответствующим доказательством параметрам выделения И, наконец, окончательным TRiC явились данные TRiC. именно масс- спектрометрического анализа. Оказалось, что в полученном препарате было идентифицировано 7 из 8 субъединиц шаперонина, и все они соответствуют TRiC. Одна субъединица «T-complex protein 1 subunit epsilon» не была определена, так как ее последовательность установлена только для мыши и человека. Дальнейшее исследование возможности взаимодействия TRiC с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и лактатдегидрогеназой и участия шаперонина TRiC в рефолдинге этих ферментов было связано с необходимостью продолжения начатых в нашей лаборатории работ с шаперонином GroE. В этих работах было изучено взаимодействие бактериального шаперонина GroE и различными формами глицеральдегид-372 фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы и высказаны гипотезы о роли этих взаимодействии в развитии амилоидозов. Однако первым шагом для приближения этих гипотез к реальным ситуациям, происходящим в тканях животных и человека, должен быть переход от бактериального шаперонина к шаперонину цитоплазматическому, то есть к TRiC, что и было сделано в данной работе. Прежде всего, нами было показано, что хотя шаперонин TRiC и не способен осуществлять рефолдинг глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, а также связываться с термоденатурированной ГАФД и препятствовать ее агрегации, тем не менее, он прочно связывается с ГАФД, денатурированной в GuHCl. В свете развиваемой в нашей лаборатории концепции о блокировании активности шаперонов неправильно свернутыми формами (“misfolded forms”) белков и о роли этого процесса в развитии нейродегенеративных заболеваний (Polyakova et al, 2005; Naletova et al, 2006) это наблюдение нам кажется наиболее важным. Мы полагаем, что данные формы белков, в основном возникающие при окислении вновь синтезируемых полипептидных цепей, могут блокировать TRiC по тем же механизмам, которые были обнаружены ранее для бактериального шаперонина GroE. Вероятно, такого рода процессы могут происходить в тканях и органах животных, играя определенную роль как в развитии нейродегенеративных заболеваний, так и в регуляции метаболизма в целом. Подтверждение всех этих высказываний на примере взаимодействия TRiC и различных неправильно свернутых форм (“misfolded forms”) белков будет предметом дальнейших исследований. Также важным наблюдением можно считать и обнаруженную нами способность шаперонина TRiC увеличивать эффективность рефолдинга лактатдегидрогеназы. Это не только расширяет число белков, реактивируемых шаперонином TRiC, которое не слишком велико до настоящего времени, но и демонстрирует способ поиска новых субстратов. Мы полагаем, что те белки, для рефолдинга которых необходимо 73 проникновение во внутреннюю камеру GroE (например, ГАФД), не могут быть свернутыми TRiC, а те, для которых достаточно связывания с апикальными доменами GroE (например, ЛДГ) (Naletova et al, 2006), будут подвергаться TRiC-зависимому рефолдингу. Такого рода предположения, конечно, требует дальнейших экспериментальных исследований и доказательств. 74 ВЫВОДЫ Разработан новый способ выделения шаперонина TRiC из 1. семенников барана. Выделенный препарат обладает активностью шаперонина, гомогенен, является олигомером с молекулярной массой выше 886 кДа и гидродинамическим радиусом 17 нм и, по данным массспектроскопии, содержит 7 полипептидных цепей, характерных для шаперонина TRiC. 2. Показано, что TRiC связывает денатурированные в GuHCl глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу способен увеличивать продуктивность и лактатдегидрогеназу, рефолдинга только в однако случае лактатдегидрогеназы. 3. Показана способность бактериального шаперонина GroEL и эукариотического шаперонина TRiC увеличивать продуктивность рефолдинга одного и того же белка – лактатдегидрогеназы. 4. Продемонстрировано, что шаперонин TRiC в отличие от GroEL не связывает термоденатурированную форму ГАФД и не препятствует ее термоагрегации. 75 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Anfinsen, C.B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181:223-230 2. Archibald J.M., Blouin C., Doolittle W.F. (2001) Gene duplication and the evolution of group II chaperonins: implications for structure and function. J. Struct. Biol. 135, 157–169 3. Behrends C., Langer C.A., Boteva R., Böttcher U.M., Stemp M.J., Schaffar G., Rao B.V., Giese A., Kretzschmar H., Siegers K., Hartl F.U. (2006) Chaperonin TRiC promotes the assembly of polyQ expansion proteins into nontoxic oligomers. Mol. cell, 23(6):887-97 4. Corrales, F.J., Fersht, A.R. (1996) Kinetic significance of GroEL14. (GroES7)2 complexes in molecular chaperone activity. Fold. Des. 1:265-273 5. Dunn A.Y., Melville M.W. and Frydman J. (2001) Cellular substrates of the eukaryotic chaperonin TRiC/CCT. J. Struct. Biol.135, 176–184 6. Ellis J. (1987) Proteins as molecular chaperones. Nature 328:378-379 7. Ewbank J.J., Creighton T.E., Hayer-Hartl M.K., Ulrich Hartl F. (1995) What is the molten globule? Nat Struct Biol. 2:10-11 8. Feldman D.E., Thulasiraman V., Ferreyra R.G., Frydman J. (1999) Formation of the VHL-elongin BC tumor suppressor complex is mediated by the chaperonin TRiC. Mol Cell, 4:1051-1061 9. Feldman D.E., Spiess C., Howard D.E., Frydman J. (2003) Tumorigenic mutations in VHL disrupt folding in vivo by interfering with chaperonin binding. Mol. Cell 12, 1213–1224 10. Fenton W.A. and Horwich A.L. (2003) Chaperonin-mediated protein folding: fate of substrate polypeptide. Q. Rev. Biophys. 36, 229–256 11. Ferreyra R.G., Frydman J. (2000) Purification of the cytosolic chaperonin TRiC from bovine testis. Methods Mol Biol. 140:153-60 76 12. Frydman J., Nimmesgern E., Erdjument-Bromage H., Wall J. S., Tempst P., Hartl F.U. (1992) Function in protein folding of TRiC, a cytosolic ring complex containing TCP-1 and structurally related subunits. EMBO J. 11, 47674778. 13. Gao Y., Thomas J.O., Chow R.L., Lee G.H., Cowan N. J. (1992). A cytoplasmic chaperonin that catalyzes b-actin folding. Cell. 69, 1043-1050. 14. Gething M.-J. and Sambrook J. (1992) Protein folding in the cell. Nature 355:33-45 15. Gomez-Puertas P., Martin-Benito J., Carrascosa J.L., Willison K.R. and Valpuesta J.M. (2004) The substrate recognition mechanisms in chaperonins. J. Mol. Recognit. 17, 85–94 16. Grantcharova V., Alm E.J., Baker D. and Horwich A.L. (2001) Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11:70-82 17. Gupta R. S. (1990). Sequence and structural homology between a mouse T-complex protein TCP-1 and the `chaperonin' family of bacterial (GroEL, 60-65 kDa heat shock antigen) and eukaryotic proteins. Biochem. Int. 20, 833-841. 18. Gutsche I, Essen L-O, Baumeister W. (1999) Group II chaperonins: new TRIC(k)s and turns of a protein folding machine. J Mol Biol 293:295-312 19. Hartl F. U. (1996). Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 381, 571-579. 20. Horwich A.L., and Willison K.R. (1993) Protein folding in the cell: functions of two families of molecular chaperone, hsp 60 and TF55-TCP1. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 339:313-326 21. Houry W.A., Frishman D., Eckerskorn C., Lottspeich F. and Hartl F.U. (1999) Identification of in vivo substrates of the chaperonin GroEL. Nature. 402:147-154 22. Kubota H., Hynes G. M., Kerr S. M. and Willison K. R. (1997). Tissue-specific subunit of the mouse cytosolic chaperonin-containing TCP-1. FEBS Letters. 402, 53-56. 77 23. Kim S., Willison K.R. and Horwich A.L. (1994). Cystosolic chaperonin subunits have a conserved ATPase domain but diverged polypeptidebinding domains. Trends Biochem. Sci. 19, 543–548 24. Kitamura A, Kubota H, Pack CG, Matsumoto G, Hirayama S, Takahashi Y, Kimura H, Kinjo M, Morimoto RI, Nagata K. (2006) Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nat. cell biol. 8(10):1163-70 25. Kubota H., Hynes G. and Willison, K. (1995). The chaperonin containing t-complex polypeptide 1 (TCP-1). Multisubunit machinery assisting in protein folding and assembly in the eukaryotic cytosol. Eur. J. Biochem. 230, 3-16. 26. Kunisawa J. and Shastri N. (2003) The group II chaperonin TRiC protects proteolytic intermediates from degradation in the MHC class I antigen processing pathway. Mol. Cell 12, 565–576 27. Laemmli K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685 28. Leroux M.R. and Hartl F.U. (2000) Versatility of the cytosolic chaperonin TRiC/CCT. Current biology, 10(7): 260-264 29. Lee M.J. et al. (2003) Hereditary sensory neuropathy is caused by a mutation in the delta subunit of the cytosolic chaperonincontaining t-complex peptide-1 (Cct4) gene. Hum. Mol. Genet. 12, 1917–1925 30. Lewis V.A., Hynes G.M., Zheng D., Saibil H. and Willison K. (1992). T-complex polypeptide-1 is a subunit of a heteromeric particle in the eukaryotic cytosol. Nature. 358, 249-252 31. Liou A.K., McCormack E.A. and Willison K.R. (1998). The chaperonin containing TCP-1 (CCT) displays a single-ring mediated disassembly and reassembly cycle. Biol. Chem. 379, 311-319. 32. Martin J. and Hartl F.U. (1997) Chaperone-assisted protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 7:41-52 33. oxidized, Naletova I.N., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. (2006) Unfolded, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate 78 dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways. Biochem. Biophys. Acta. 1764(4):831-8. 34. Nollen E.A., Garcia S.M., van Haaften G., Kim S., Chavez A., Morimoto R.I., Plasterk R.H. (2004) Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 6403–6408 35. Norcum M.T. (1996) Novel isolation method and structural stability of a eukaryotic chaperonin. The TCP-1 ring complex from rabbit reticulocytes. Protein Sci. 5:1366-1375 36. Nover L., and Scharf K.D. (1997) Heat stress proteins and transcription factors. Cell. Mol. Life Sci. 53:80-103 37. Phipps B.M., Hoffmann A., Stetter K.O. and Baumeister W. (1991). A novel ATPase complex selectively accumulated upon heat shock is a major cellular component of thermophilic archaebacteria. EMBO J. 10, 1711-1722. 38. Plath K. and Rapoport T.A. (2000) Spontaneous release of cytosolic proteins from posttranslational substrates before their transport into the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 151, 167–178 39. Polyakova, O.V., Roitel, O., Asryants, R.A., Polyakov, A.A., Branlant, G., Muronetz, V.I. (2005) Misfolded forms of glyceraldehydes-3phosphate dehydrogenase interact with GroEL and inhibit chaperonin-assisted folding of the wild-type enzyme, Protein Science. 14:921-928 40. Privalov P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv. Prot. Chem. 33:167-241 41. Ptitsyn O.B. (1995) Molten globule and protein folding. Adv. Prot. Chem. 47:83-229 42. Ranson N.A., White H.E. and Saibil H.R. (1998). Chaperonins. Biochem. J. 333, 233–242 43. Saibil H. (2000) Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 10:251-258 79 44. Schagger H., Cramer W.A., von Jagow G. (1994) Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem.; 217(2): 220-230 45. Schlesinger M.J. (1990) Heat shock proteins. J. Biol. Chem. 265:12111-12114 46. Spiess C., Meyer A.S., Reissmann S., Frydman J. (2004) Mechanism of the eukaryotic chaperonin: protein folding in the chamber of secrets. Trends in Cell Biol., 14 (11), 598-604 47. Srikakulam R., Winkelmann D.A. (1999) Myosin II folding is mediated by a molecular chaperonin. J Biol Chem 274:27265-27273 48. Sturtevant J.M. (1977) Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:2236-2240 49. Tam S., Geller R., Spiess C., Frydman J. (2006) The chaperonin TRiC controls polyglutamine aggregation and toxicity through subunit-specific interactions. Nat. cell biol. 8(10):1155-62 50. Thulasiraman V., Yang C-F, Frydman J. (1999) In vivo newly translated polypeptides are sequestered in a protected folding environment. EMBO J. 18:85-95 51. Trent J.D., Nimmesgern E., Wall J.S., Hartl F.U. and Horwich A.L. (1991) A molecular chaperone from a thermophilic archaebacterium is related to the eukaryotic protein t-complex polypeptide-1. Nature, 354, 490-493. 52. Ursic D. and Culbertson M.R. (1991) The Yeast Homolog to Mouse Tcp-1 Affects Microtubule-Mediated Processes. Mol. Cell. Biol. 11, 2629-2640. 53. Valpuesta J.M., Martín-Benito J., Gómez-Puertas P., Carrascosa J.L., Willison K.R. (2002) Structure and function of a protein folding machine: the eukaryotic cytosolic chaperonin CCT. FEBS Lett. 529(1):11-16 54. van den Berg B., Ellis R.J., Dobson C.M. (1999) Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation. EMBO J. 18:69276933 80 55. Waldman T., Lupas A., Kellermann J., Peters J. and Baumeister W. (1995). Primary structure of the thermosome from Thermoplasma acidophilum. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 376, 119-126. 56. Walter S. (2002) Structure and function of the GroE chaperone. Cel. and Mol. Life Sci., 59:1589-1597 57. Willison K.R. (1999) Composition and function of the eukaryotic cytosolic chaperonin-containing TCP-1. Mol. Chap. and Fold. Cat. Edited by Bukau B. Amsterdam: Harwood Academic; 555-571 58. Yon, J.M. (1997) Protein folding: concepts and perspectives. Cell Mol. Life Sci. 53:557-567; 59. Yura T., and Nakahigashi K. (1999) Regulation of the heat-shock response. Curr. Opin. Microbiol. 2:153-158 60. Zimmerman S.B., Minton A.P. (1993) Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22:27-65 81
