006649 - 1 - Изобретение относится к биологии, а именно к

006649
Изобретение относится к биологии, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в различных областях медицины, ветеринарии, иммунологии, фармакологии и косметологии.
Известен способ получения препарата для внутривенного введения, содержащего иммуноглобулин,
включающий концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине
рН 3,5-5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, добавление стабилизатора,
установление содержания иммуноглобулина в растворе 5% и величины рН 3,5-5,0, стерилизующую
фильтрацию и высушивание. Перед добавлением стабилизатора проводят восстановление гидратных
оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации
низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны, в качестве которой используют ультрафильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе менее 100000
Да или диализные вискозные оболочки (патент РФ № 2122864, кл. А 61K 39/395, 1998).
В сумме получаемых иммуноглобулинов отсутствуют целевые иммуноглобулины - антиидиотипические к альфа-фетопротеину антитела из-за несоблюдения временных параметров и выбора пола доноров, при которых необходимые белки присутствуют в плазме крови.
Известен способ выделения иммуноглобулина G из сыворотки крови кур, в котором осаждение иммуноглобулинов проводят полиэтиленгликолем молекулярной массой 6000 Да. Процесс выделения иммуноглобулинов включает в себя диализ, благодаря которому препараты белка отделяют от полиэтиленгликоля (авт.св. СССР № 1695931, кл. А 61K 39/00, 1989).
Указанный способ обеспечивает высокий выход продукта, однако он весьма длителен по времени,
так как включает несколько фаз образования осадка при добавлении новых порций полиэтиленгликоля и
диализ готового продукта от фосфатного буфера.
Кроме того, при осуществлении способа получения целевых иммуноглобулинов не учитывался
фактор времени, при котором в крови птиц присутствуют антиидиотипические к альфа-фетопротеину
антитела в максимальной концентрации.
Известен способ получения иммунорегуляторного глобулина путем фракционного осаждения белков сыворотки крови человека сульфатом аммония, отделение осадка, растворение его в буферном растворе с последующим диализом и стерилизации продукта. В качестве сырья используют полиспецифические сыворотки периферической крови женщин, рожавших более двух раз, содержащие анти-HLAантитела, а к раствору иммуноглобулина после диализа добавляют ЭДТА и глюкозу в конечной концентрации 0,7-0,9 и 2-5% соответственно, и стерилизуют или лиофильно высушивают (патент РФ
№ 2122863, кл. А 61K 30/395).
Способ позволяет получить препарат иммуноглобулинов, обладающий иммуномодулирующим (супрессорным) действием на иммунокомпетентные клетки и который может храниться без потери активности в течение 6 месяцев. Целевым продуктом, получаемым согласно известному способу, являются
анти-HLA-антитела.
Получение антиидиотипических к альфа-фетопротеину антител таким способом затруднительно изза того, что не учитывается фактор времени, когда в крови женщин или самок животных находится максимальная концентрация целевых иммуноглобулинов - антиидиотипических к альфа-фетопротеину антител.
Задачей изобретения является получение целевых антиидиотипических антител из различного биологического сырья, в качестве которого используются физиологические жидкости и/или ткани особей
женского рода человека и животных в строго определенный период времени, определяемый физиологическим состоянием доноров, когда в них отмечается максимальное содержание целевого продукта.
Расширение арсенала средств для коррекции иммунного состояния организма достигается тем, что
в способе получения антител, включающем фракционное осаждение белков сыворотки крови сульфатом
аммония, отделение осадка центрифугированием и очистку выделенных антител, согласно изобретению,
выделяют антиидиотипические антитела к альфа-фетопротеину, очистку выделенных антител осуществляют гель-фильтрацией, а в качестве биологического материала используют сыворотку крови, лимфу,
гемолимфу женских особей в состоянии формирования эмбриона у млекопитающих или в период лактации, сыворотку молока, яйца птиц или икру рыб; сыворотку крови, молока, молозиво, лимфу, гемолимфу
организма донора после иммунизации его антителами к альфа-фетопротеину или их Fab-фрагментами;
белковые компоненты молозива и/или сыворотки молока; биологические продукты синтеза в культуре
клеток и/или тканей эмбриона; белковые компоненты яиц животных и птиц, икры рыб.
Известно, что идиотипические признаки характеризуют аминокислотный состав и структуру вариабельной области иммуноглобулинов, определяющих специфичность антител.
Получить целевые антиидиотипические антитела можно при иммунизации реципиентов иммуноглобулинами, специфичными к исходным антигенам, или их Fab-фрагментами.
Антиидиотипические антитела - это обычные по структуре иммуноглобулины, соответствующие по
своим физико-химическим и биологическим свойствам (молекулярная масса, групповая электрофоретическая подвижность и т.д.) антителам, присутствующим в организме, к которым могут быть применены
известные способы выделения и очистки.
-1-
006649
Источником сырья для выделения антиидиотипических антител, как и для обычных иммуноглобулинов, могут быть ткани и любые физиологические жидкости организма человека и животных, такие как
сыворотка крови, слюна, лимфа, молозиво и сыворотка молока, а так же и другие источники - белки яиц
птиц, рептилий и икра рыб, культуральные жидкости, при использовании биотехнологических методов.
Экспериментально установлено, что антиидиотипические к альфа-фетопротеину антитела в максимальной концентрации выявляются в физиологических жидкостях женских особей человека и животных
в период формирования ими эмбриона (у птиц яйца или икры у не живородящих рыб), в период рождения и некоторый период после родов (отложения яйца или икры).
В каждом конкретном случае как выбор наиболее доступного и богатого по содержанию необходимых иммуноглобулинов источника, так и периода времени выделения, во многом определяет стратегию
процесса получения и очистки антител.
Так, например, иммуноглобулины из сыворотки крови могут быть получены осаждением белков
этиловым спиртом по Кону (Conn E.J.), которым и получают в настоящее время в промышленных масштабах препараты белков сыворотки крови, в том числе и иммуноглобулины.
Кроме того, источником получения антиидиотипических к альфа-фетопротеину антител могут быть
культуральные жидкости при биотехнологических методах, ткани эмбрионов и/или плода животных и
человека, погибшего при абортах или родах, а также белки яиц птиц, морских животных и икры рыб.
Предлагаемый способ реализуется при использовании указанного выше сырья с учетом периода
времени его получения, при котором в сырье содержится максимум целевого продукта, путем применения известных методов фракционирования сложных белковых композиций.
Отличительной особенностью предлагаемого способа получения антиидиотипических антител к
альфа-фетопротеину, которая отличает его от известных способов получения иммуноглобулинов, является не только выбор определенных источников сырья, но и выбор пола донора и необходимого периода
времени (вынашивание эмбриона, яиц, икры), когда целевой продукт представлен в сырье в максимальной концентрации.
Использование метода иммуноферментного анализа (ИФА) с применением обычных антител к альфа-фетопротеину подтверждает наличие антиидиотипических иммуноглобулинов в сыворотке крови беременных женщин и животных, в молозиве и молоке, в тканях эмбрионов, белке яиц птиц (овоглобулины) и икре рыб.
Получают антиидиотипические антитела к альфа-фетопротеину следующим образом.
Сыворотку молока козы, полученную после створаживания и удаления казеина, центрифугируют
для отделения от остатков казеина и насыщают сульфатом аммония, растворяя сухую соль в сыворотке
до 20% насыщения.
Дают образоваться осадку, который удаляют центрифугированием.
Надосадочную жидкость досаливают до 35% насыщения, образовавшийся осадок иммуноглобулинов отделяют центрифугированием, растворяют в 0,9% растворе хлористого натрия и отделяют от сульфата аммония гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G50, уравновешенной 0,9% раствором хлористого натрия.
Наличие антиидиотипических антител к альфа-фетопротеину в полученной по такому способу
фракции иммуноглобулинов сыворотки молока доказывается ИФА с применением суммы обычных или
отдельных, индивидуальных по специфичности, моноклинальных антител к альфа-фетопротеину.
Срок годности полученного препарата 3 года без потери активности.
При необходимости получения более чистых фракций антиидиотипических антител к альфафетопротеину процесс выделения целевых иммуноглобулинов можно дополнить аффинной хроматографией, где в качестве лиганда используют антитела к альфа-фетопротеину.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения антител, включающий фракционное осаждение белков сыворотки крови сульфатом аммония, отделение осадка центрифугированием и очистку выделенных антител, отличающийся
тем, что выделяют антиидиотипические антитела к альфа-фетопротеину, очистку выделенных антител
осуществляют гель-фильтрацией, а в качестве биологического материала используют сыворотку крови,
лимфу, гемолимфу женских особей в состоянии формирования эмбриона у млекопитающих или в период
лактации, сыворотку молока, яйца птиц или икру рыб; сыворотку крови, молока, молозиво, лимфу, гемолимфу организма донора после иммунизации его антителами к альфа-фетопротеину или их Fabфрагментами; белковые компоненты молозива и/или сыворотки молока; биологические продукты синтеза в культуре клеток и/или тканей эмбриона; белковые компоненты яиц животных и птиц, икры рыб.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-2-