Document 2292443
advertisement
Реферат Отчет 107 с., 1ч., 20 рис., 6 табл., 177 источников. ЛАКТАПТИН, ОПУХОЛЬ-АДРЕСОВАННЫЕ ПЕПТИДЫ, КОМБИНАТОРНАЯ ПЕПТИДНАЯ БИБЛИОТЕКА, ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ, МЕТОД АФФИННОЙ СЕЛЕКЦИИ, АПОПТОЗ, ОПУХОЛЬ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ПРОТИВОРАКОВАЯ ТЕРАПИЯ, ТАРГЕТНАЯ ДОСТАВКА ЛЕКАРСТВ, ИММУНОДЕФИЦИТНЫЕ МЫШИ Объектом противоопухолевой исследований являются активностью, рекомбинантные состоящие из слитые белки апоптоз-индуцирующего с белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, отобранных из пептидной фаговой библиотеки методом аффинной селекции и обеспечивающих доставку лактаптина в опухоль. Цель работы - разработка и получение бифункциональных агентов белковой природы для направленной элиминации раковых клеток - рекомбинантных слитых белков, состоящих из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, обеспечивающих доставку лактаптина к опухоли. Основные результаты 1 этапа проекта: 1 Проведен аналитический обзор информационных источников, дающий представление о современном состоянии исследований в области противоопухолевых препаратов белковой природы и рассматривающий перспективные стратегии разработки препаратов направленного действия, обеспечивающих специфическое воздействие на злокачественные новообразования. 2 Проведены патентные исследования, целью которых являлись исследования технического уровня и тенденций развития противоопухолевых средств на основе слитых белков «адресный пептид - апоптоз-индуцирующий белок». К тенденциям развития объекта исследования относятся следующие: разработка новых противоопухолевых препаратов на основе апоптоз-индуцирующих белков; расширение спектра опухольадресованных пептидов; создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов слитых белков, содержащих противоопухолевый апоптоз-индуцирующий белок и опухольадресованный пептид; создание готовых противоопухолевых лекарственных форм на основе слитых белков (апоптоз-индуцирующего белка и опухоль-адресованного пептида). 3 Разработана методика отбора опухоль-адресованных пептидов в системах in vitro и in vivo, позволяющая отбирать из пептидной фаговой библиотеки пептиды, специфически распознающие рецепторные структуры мышиных опухолей in vivo и раковых клеток in vitro. 4 4 Проведен отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на культурах раковых клеток гепатокарциномы А1 (ГА-1) и аденокарцинома легкого (АЛ) мыши. Отобраны два фаговых клона, несущих пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH, которые специфически связываются с рецепторными структурами раковых клеток обеих линий. 5 Проведен отбор опухоль-адресованных пептидов in vivo на мышиной опухолевой модели ГA-1. Отобраны два фаговых клона, несущие пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH. Эти же клоны были отобраны при селекции in vitro на раковых клетках ГА-1 и АЛ. 6 Разработана методика получения генетических конструкций, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин». Генетические конструкции получены на основе вектора Pet15b. При синтезе слитого белка последовательность опухоль-адресованного пептида находится на N-конце белка. Для выделения слитых белков из биомассы клеток-продуцентов в С-конец введен полигистидиновый тракт. 7 Разработана методика получения продуцентов рекомбинантных слитых белков. Рекомбинантные штаммы E. coli получены на основе реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к ампициллину. 8 За счет внебюджетных средств проведена закупка оборудования для наработки экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков, приобретен одноразовый биореактор BIOSTAT® CultiBag STR 200 L. Информация о проекте размещена на официальном сайте ИХБФМ СО РАН в сети интернет по адресу http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/ru/science/gk. В настоящем проекте для усиления противоопухолевого эффекта лактаптина впервые использованы опухоль-адресованные пептиды, отобранные с помощью пептидной фаговой библиотеки и обеспечивающие доставку противоопухолевого средства в опухоль. В результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране: генетические конструкции, обеспечивающие синтез слитых белков, штаммы-продуценты слитых белков и сами рекомбинантные слитые белки с цитотоксической и противоопухолевой активностью. Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств и в практическом здравоохранении. 5 Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных. Разработанные в результате выполнения проекта бифункциональные терапевтические противоопухолевые агенты могут являться основой для производства фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм противоопухолевых препаратов. 6 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 9 1 Аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Обоснование направления исследования. 13 2 Проведение патентных исследований 48 3 Разработка методики отбора опухоль-адресованных пептидов в системах in vitro и in vivo 49 4 Отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на культурах раковых клеток мыши 59 5 Отбор опухоль-адресованных пептидов in vivo на мышиных опухолевых моделях 62 6 Разработка методики получения генетических конструкций, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков, состоящих из отобранных пептидов и лактаптина, клетками штаммов-продуцентов 68 7 Разработка методики получения штаммов-продуцентов E. coli продуцентов рекомбинантных слитых белков 79 8 Закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред (для наработки штаммов-продуцентов рекомбинантных слитых белков) 87 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 93 7 ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ГА-1 гепатокарцинома А1 АЛ аденокарцинома легкого MCF-7 аденокарцинома молочной железы человека MDA-MB 435 аденокарцинома молочной железы человека Ig E иммуноглобулин Е GAPDH глицеральдегид - 3- фосфат дегидрогеназа PCNA ядерный антиген клеточной пролиферации (Proliferating cell nuclear antigen) G0, G1 фазы клеточного цикла СРР пептиды, проникающие в клетки (cellpenetrating peptides) TNF-α фактор некроза опухолей FITC флуоресцеин изотиоцианат 8 ВВЕДЕНИЕ Основание и исходные данные для разработки темы: основанием для проведения ПНИ, выполняемых в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», является Соглашение о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.607.21.0063. На сегодняшний день онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности как в России, так и за рубежом. Ежегодная смертность от злокачественных новообразований в нашей стране составляет около 180 случаев у мужчин и 95 случаев у женщин на 100 тысяч населения. По прогнозам ВОЗ смертность от рака будет продолжать расти, и в 2030 году ожидается до 13 миллионов случаев смерти от онкологических заболеваний. Многие годы основными способами лечения онкологических заболеваний были хирургия и радиотерапия, направленные на удаление первичной опухоли. При этом главной причиной последующей смертности оставался метастатический рост опухолей. Применение "неспецифических" цитостатических и цитотоксических средств, а также гормонов для подавления роста метастазов существенно расширило возможности и повысило эффективность противоопухолевую лечения активность рака. Однако, химиотерапевтических несмотря средств на и их высокую широкое применение, такой важный показатель эффективности терапии как продолжительность жизни пациентов увеличивается незначительно или вообще не меняется, и главной причиной последующей смертности остается метастатический рост опухолей [1]. Кроме того, высокая общая токсичность большинства используемых цитостатиков значительно ограничивает возможности их применения. Главными требованиями к вновь создаваемым противораковым препаратам являются минимальная токсичность по отношению к здоровым клеткам организма и максимальная эффективность по отношению к онкотрансформированным клеткам. Подобная селективность может быть основана на избирательной индукции в раковых клетках процессов гибели: апоптоза или аутофагии. В настоящее время создание противоопухолевых препаратов на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток и селективно подавлять рост опухоли является одним их активно развивающихся направлений поиска новых противораковых лекарственных средств. Такие проапоптотические соединения белковой природы как цитокины семейства фактора некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины, некоторые вирусные белки (апоптин, 9 белок NS1 парвовируса грызунов, белок E4orf4 человека), рибонуклеазы (онконаза, биназа, барназа), кротамин, белки и пептиды молока являются основой противораковых лекарств, которые уже используются в клинической практике или проходят различные этапы доклинических и клинических испытаний [2]. В ИХБФМ СО РАН из молока человека был выделен и охарактеризован белок лактаптин, являющийся протеолитическим фрагментом каппа-казеина молока человека с молекулярной массой ~8.6 кДа. Было показано, что лактаптин индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток в культуре [3, 4]. Был получен штамм-продуцент E.coli, синтезирующий рекомбинантный аналог природного пептида, также обладающий способностью индуцировать апоптоз раковых клеток человека в культуре и тормозить рост и метастазирование опухолей животных и человека в модели ксенографтов [5, 6, 7, 8, 9]. На основе полученного рекомбинантного пептида создан новый противоопухолевый препарат "Лактаптин - концентрат для приготовления раствора для инфузий" и закончены доклинические исследования этого препарата. По результатам доклинических исследований показано, что разработанный препарат является безопасным при внутривенном применении, обладает противоопухолевой и антиметастатической активностью на модельных животных и низкой иммуногенностью и может быть рекомендован для проведения клинических испытаний. Однако, лактаптин, как и другие белковые терапевтические препараты, равномерно распределяется по органам и тканям организма, что уменьшает его концентрацию в опухоли и, соответственно, снижает эффективность противоопухолевого действия. Повысить противоопухолевую эффективность лактаптина можно за счет адресной доставки препарата к клеткам опухоли. Перспективным использование направлением опухоль-адресованных реализации адресного подхода является пептидов небольшого размера (до 50 аминокислотных остатков) для направленной доставки лекарственных средств к клеткам опухоли. Поиск и получение таких органо- и тканеспецифических пептидов проводят с использованием комбинаторных пептидных библиотек, в частности с помощью фаговых пептидных библиотек. Ключевым моментом этой технологии отбора является способность получать высокоспецифичные к определенной мишени пептиды при отсутствии информации об этой мишени. Предлагаемый подход позволяет проводить селекцию опухоль-адресованных пептидов как in vitro на культурах раковых клеток (отбор на специфические рецепторные структуры опухолевых клеток), так и in vivo на 10 опухолевых моделях (отбор и на клеточные рецепторы, и на рецепторы сосудов опухоли) [10]. В настоящее время такие органо- и тканеспецифические пептиды используют для поиска маркеров различных заболеваний, изучения рецепторов и их лигандов, детектирование биологических процессов in vivo, доставки цитотоксических лекарств, проапоптотических и апоптотических пептидов [11, 12]. Целью настоящего проекта является разработка и получение бифункциональных агентов белковой природы для направленной элиминации раковых клеток - рекомбинантных слитых белков, состоящих из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, обеспечивающих доставку лактаптина к опухоли. Опухоль-адресованные пептиды будут отобраны из фаговой пептидной библиотеки (Ph.D. Phage Display Library, New England BioLabs), созданной на основе нитчатого фага М13. Отбор будет производиться методом фагового дисплея на культурах раковых клеток in vitro и на опухолевых моделях in vivo. Будет определена первичная последовательность отобранных пептидов и созданы генетические конструкции, обеспечивающие продукцию рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин». Будут созданы штаммы E.coli - продуценты рекомбинантных слитых белков. Разработанный технологический процесс позволит получать целевые продукты минуя стадии наработки, выделения и очистки каждого компонента (лактаптина и адресного пептида) в отдельности, а также стадию финальной конъюгацию двух белковых молекул. Будут проведены исследования цитотоксических, адресных и противоопухолевых свойств полученных рекомбинантных слитых белков и разработан Лабораторный технологический регламент получения рекомбинантных слитых белков с наилучшим терапевтическим потенциалом. Разработка и апробация Лабораторного регламента будет проведена на опытном производственном участке ООО «Фабрика биополимеров», учредителем которого является индустриальный партнер проекта ООО «ИРВИН 2». Ожидаемые результаты проекта - высокоспецифичные и малотоксичные противоопухолевые агенты, будут востребованы фармацевтическими компаниями, которые занимаются разработкой и производством новых противоопухолевых терапевтических средств, и практическим здравоохранением для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных. Таким образом, актуальность предлагаемых в проекте исследований и запланированного результата не вызывает сомнения. В результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране: генетические конструкции с встроенными генами лактаптина и опухоль11 адресованных пептидов, обеспечивающие экспрессию слитых белков «адресный пептид лактаптин» в клетках-продуцентах; штаммы-продуценты слитых белков «адресный пептид-лактаптин»; прототипы новых противоопухолевых лекарственных средств, а также способы терапии злокачественных новообразований разработанным лекарственным средством. Задачами первого этапа выполнения проекта являются: 1 Проведение аналитического обзора информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, и обоснование направления исследования. 2 Проведение патентных исследований. 3 Разработка методика отбора опухоль-адресованных пептидов в системах in vitro и in vivo. 4 Проведение отбора опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на культурах раковых клеток мыши. 5 Проведение отбора опухоль-адресованных пептидов in vivo на мышиных опухолевых моделях. 6 Разработка методики получения генетических конструкций, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков, состоящих из отобранных пептидов и лактаптина, клетками штаммов-продуцентов. 7 Разработка методики получения штаммов-продуцентов E. coli - продуцентов рекомбинантных слитых белков. 8 Проведение закупки материалов и оборудования для приготовления культуральных сред (для наработки штаммов-продуцентов рекомбинантных слитых белков). 12 1 Аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научнотехническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Обоснование направления исследования На сегодняшний день онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности как в России, так и за рубежом. Ежегодная смертность от злокачественных новообразований в нашей стране составляет около 180 случаев у мужчин и 95 случаев у женщин на 100 тысяч населения. По прогнозам ВОЗ смертность от рака будет продолжать расти, и в 2030 году ожидается до 13 миллионов случаев смерти от онкологических заболеваний. Многие годы основными способами лечения онкологических заболеваний были хирургия и радиотерапия, направленные на удаление первичной опухоли. При этом главной причиной последующей смертности оставался метастатический рост опухолей. Применение "неспецифических" цитостатических и цитотоксических средств, а также гормонов для подавления роста метастазов существенно расширило возможности и повысило эффективность лечения рака. Однако, несмотря на высокую противоопухолевую активность химиотерапевтических средств и их широкое применение при лечении больных метастазирующими раками, такой важный показатель эффективности терапии как продолжительность жизни пациентов увеличивается незначительно или вообще не меняется, и главной причиной последующей смертности остается метастатический рост опухолей. Кроме того, высокая общая токсичность большинства используемых цитостатиков значительно ограничивает возможности их применения [1, 13]. На сегодняшний день разработка теоретической базы и экспериментальная апробация новых препаратов и методов лечения, характеризующихся высокой эффективностью и низкой общей токсичностью, являются ключевыми проблемами в лечении онкологических заболеваний. При этом, комплексные исследования механизма действия препарата конструирование на клеточном терапевтических уровне молекул позволяют и подробно проводить исследовать направленное возможные молекулярные мишени инновационных лекарственных средств, что, в свою очередь, позволяет прогнозировать чувствительность различных опухолей к определенным лекарствам. Таким образом, главными требованиями к вновь создаваемым противораковым препаратам являются минимальная токсичность по отношению к здоровым клеткам организма и максимальная эффективность по отношению к онкотрансформированным 13 клеткам. Подобная селективность может быть основана на избирательной индукции в раковых клетках процессов гибели: апоптоза или аутофагии. Однако, отсутствие адресной доставки к опухоли многих, даже наиболее перспективных противоопухолевых лекарств резко снижает эффективность их действия и влечет за собой необходимость использования высоких доз терапевтического агента, сопровождающихся, чаще всего, выраженными побочными эффектами. То есть, разработка стратегий таргетной доставки противооопухолевых лекарственных средств, безусловно, является актуальной. В настоящее время перспективным направлением реализации адресного подхода является использование опухоль-адресованных пептидов небольшого размера (до 50 аминокислотных остатков) для направленной доставки лекарственных средств к клеткам опухоли. В данном аналитическом обзоре мы, с одной стороны, представили наиболее перспективные, на наш взгляд, лекарственные средства, основой которых являются проапоптотические белки и пептиды природного происхождения - цитокины, индуцирующие апоптоз моноклональные антитела, вирусные белки, рибонуклеазы, белки и пептиды молока человека и т.д. Кроме того, был проведен анализ механизмов действия, достоинств и недостатков рассмотренных лекарственных средств, находящихся на различных этапах доклинических и клинических исследований. С другой стороны, в обзоре подробно рассмотрена технология фагового дисплея как метода получения адресующего агента, способного обеспечить специфичность взаимодействия лекарственного средства и органа или ткани-мишени. Представлены возможные способы использования органо- и тканеспецифических пептидов в биомедицине и применение таких пептидов при создании инновационных лекарственных средств. Проведенный анализ литературы дает представление о современном состоянии исследований в области противоопухолевых препаратов белковой природы и рассматривает перспективные стратегии разработки препаратов направленного действия, обеспечивающих специфическое воздействие на злокачественные новообразования. 1.1 Комбинаторные фаговые библиотеки На рубеже 20-говека немецкий физик Paul Ehrlich предложил концепцию, в которой химические вещества с избирательной аффиностью к определенным патогенам могут выступать в качестве «волшебной пули» для борьбы с инфекцией без вреда для организма в целом [14]. Эта концепция вдохновила многих исследователей на создание 14 принципиально новых противоопухолевых препаратов, эффективность действия которых обеспечивалась избирательным связыванием с опухолью. Такое избирательное связывание основано на том, что любой клеточный тип, в том числе раковые клетки, обладают собственным «профилем» рецепторов на своей поверхности, которые либо отсутствуют, либо представлены в гораздо меньшем количестве у других клеток. Этот уникальный «профиль» клеток позволяет разрабатывать направленную лекарственную терапию. В свою очередь, известно, что сосуды разных тканей и органов, в том числе и опухолей, тоже обладают отличительными биохимическими свойствами. Более того, в отличие от раковых клеток, эндотелиальные клетки сосудов опухоли генетически более стабильны, что редко приводит к приобретению ими лекарственной устойчивости, и, кроме того, клетки этдотелия сосудов доступнее для терапевтических средств, особенно при внутривенном введении [15]. Разработка комбинаторных фаговых пептидных библиотек на основе технологии фагового дисплея позволила получать высокоспецифичные пептиды, в том числе к различным типам опухолей. В настоящее время такие опухолеспецифические пептиды рассматривают как перспективные таргетные агенты для доставки терапевтических генов, цитотоксических лекарств, проапоптотических и апоптотических пептидов, агентов для визуализации и цитокинов [16]. 1.1.2 Фаговый дисплей и строение нитчатых бактериофагов Технология фагового дисплея, впервые предложенная в 1985 G.P. Smith, сыграла важную роль в разработке принципиально новых подходов исследований в области молекулярной биологии и открыла новые возможности для развития фармацевтической индустрии. Концепция фагового дисплея заключается в клонировании чужеродной ДНКпоследовательности в специфический сайт гена поверхностного белка бактериофага, так чтобы эта последовательность находилась в одной рамке считывания с белком. В результате считывания генома на поверхности бактериофага образуется (представляется) химерный белок, последовательность в состав (рисунок которого 1.1). При включена чужеродная этом физиологические жизнеспособность вирусной частицы сохраняются [10, 17]. 15 аминокислотная свойства и Рисунок 1.1 - Строение бактериофага с экспонированной чужеродной аминокислотной последовательностью в составе поверхностного белка pIII (отмечено красным цветом). Поверхностный белок pIII состоит из трех доменов: N1, N2 и С. Технология фагового дисплея разработана для различных бактериофагов, например, λ, T4, T7. Наиболее широкое применение для создания фагового дисплея получила группа нитчатых бактериофагов Ff [11]. Нитчатые бактериофаги значительно отличаются от других фагов как по морфологическому строению, так и по жизненному циклу. Как правило, они инфицируют грамотрицательные бактерии (Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Xanthomonas, Vibrio, Thermusand и Neisseria). Форма вириона нитчатых бактериофагов похожа на длинную тонкую нить, за что они и получили свое название. Бактериальная клетка, инфицированная нитчатыми бактериофагами, высвобождает новые вирусные частицы, но при этом сама не лизируется. Характерной особенностью этих фагов также являются их небольшие размеры и просто устроенный геном [18]. Наиболее изученные из нитчатых фагов – M13, f1 и fd – относят к семейству Inoviridae, роду Inovirus и объединяют в группу Ff фагов, поскольку они инфицируют E. coli, несущие F-пили. Штаммы группы Ff фагов содержат кольцевую одноцепочечную ДНК. Ее идентичность между разными штаммами группы составляет 98,5% [18]. Геном представлен 11 генами, которые можно сгруппировать по их функциональному назначению: белки капсида - pIII, pVI, pVII, pVIII, pIX, белки, участвующие в репликации ДНК – pII, pV, pX и белки, отвечающие за сборку фаговой частицы, – pI, pIV, pXI (рисунок 1.1) [19]. Белки pIII (406 а.к.) и pVIII (50 а.к.), которые также называют минорными и мажорными белками, соответственно, наиболее часто используют в технологии фагового дисплея для экспозиции чужеродной аминокислотной 16 последовательности. Оба синтезированных белка имеют N-концевые сигнальные последовательности, которые отщепляются сигнальной пептидазой во время созревания белка, после переноса к внутренней части бактериальной мембраны. Зрелые белки встраиваются в оболочку бактериофага в процессе ее сборки. Таким образом, для того, чтобы чужеродный пептид был представлен на поверхности фаговой частицы, кодирующая его последовательность должна быть клонирована между последовательностью поверхностного белка и сигнальной последовательностью в единой рамке трансляции [18]. Бактериофаг содержит от до 3 до 5 копий pIII белка. Вместе с белком pVI они образуют дистальную крышку вириона и необходимы для его стабилизации, а также терминации сборки фаговой частицы при выходе из бактериальной клетки. Кроме того, pIII играет важную роль при инфицировании, прикрепляясь к бактериальной клетке через F-пили [20]. pIII состоит из трех доменов: N1, N2 и C, разделенные между собой глициновыми спейсерами (рисунок 1.1). Домен С отвечает за сборку вириона, а N1 и N2 за инфицирование бактериальной клетки [21]. Возможная длина чужеродной вставки, которая не повлияет на инфекционность или сборку вириона, определяется длиной спейсерного участка между лидерной последовательностью и первым доменом [12]. В этом случае каждый pIII белок будет нести чужеродную вставку, и такой вид фагового дисплея называется тип 3. Белок pVIII представлен около 2700 копиями на одну частицу и образует оболочку бактериофага. Белок имеет спиралевидную структуру. На С-конце белка находятся четыре положительно заряженных лизина, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами вирусной одноцепочеченой ДНК внутри фага. Nконец расположен на внешней стороне вирусной частицы [22, 23]. Максимальная длина чужеродной вставки, которая не приводит к значительным нарушениям и будет экспонирована в каждом белке, составляет 6 - 7 аминокислот (тип 8 фагового дисплея) [24, 25]. При экспозиции более длинных чужеродных аминокислотных последовательностей, необходимо восполнение утраченных функций химерного белка диким типом белка pIII или pVIII. Существуют системы, в которых фаговый геном содержит два типа pIII (pVIII) гена: рекомбинантный и дикий тип. В результате, только часть pIII (pVIII) белков будут презентовать чужеродную последовательность, тогда как другая сохранит природные функции (тип 33 (88) фагового дисплея) [26]. Восполнение утраченной функции белка может осуществляться в системах с использованием фагмидных векторов и фагов-помощников [27]. Фагмидный вектор в таких случаях содержит плазмидные и фаговые ориджины 17 репликации, последовательность, кодирующую ген устойчивости к антибиотику, и последовательность, кодирующую химерный белок. Фаг-помощник кодирует дикий тип белка и необходим для правильной сборки вирусных частиц. В этом случае бактериофаг также будет устроен по мозаичному типу, т.е. содержать белки дикого и рекомбинантного типа (тип 3+3 или 8+8 фагового дисплея) [26]. Первые работы с использованием технологии фагового дисплея были направлены на то, чтобы экспонировать определенный пептид или белок, способный специфически связываться с антителами. Smith G.P. в своей пилотной работе по фаговому дисплею сначала получил фаговый клон (fECO1), у которого в белок pIII был встроен фрагмент рестриктазы EcoRI. Этот клон эффективно нейтрализовался антителами против рестриктазы [17]. В продолжение и развитие этих работ опубликовано множество других, в которых фаговые частицы с экспонированным антигеном использовали в качестве иммуногенов, способных вызывать ответную реакцию иммунной системы [28, 29, 30]. Во второй части своей работы G.P. Smith исследовал возможность обогащения смешанной популяции бактериофагов специфическими фагами fECO1 путем афинного связывания с антителами к EcoRI. К абсорбированным антителам против EcoRI добавляли смесь фагов fECO1 и значительный избыток дикого фага M13mp8. Не связавшиеся фаги смывали средой, а абсорбированные элюировали кислым буфером, нейтрализовали и титровали. В результате трех последовательных экспериментов было достигнуто обогащение популяции фагом fECO1 по сравнению с фагом дикого типа в 1500-7200 раз [17]. На этом этапе возникла идея использовать антитела для отбора специфических клонов из популяции бактериофагов (комбинаторной фаговой библиотеки), где каждая отдельная фаговая частица экспонирует на своей поверхности случайную аминокислотную последовательность. С 1988 г. процедуры аффинного обогащения популяции специфическим бактериофагом стали называть «биопэннингом» [31]. Типичный раунд биопэннинга включает в себя следующие стадии: 1) инкубация комбинаторной фаговой библиотеки с мишенью (белки, культура клеток, опухолевая ткань и т.д.); 2) отмывка не связавшихся фагов; 3) элюция связавшихся фагов; 4) амплификация элюированного фага для следующих раундов (рисунок 1.2). 18 Рисунок 1.2 – Схема типичного раунда биопэннинга фаговой библиотеки. А-Б. Инкубация комбинаторной фаговой библиотеки с мишенью (белки, культура клеток, опухолевая ткань и т.д.); В. Отмывка не связавшихся фагов; Г. Элюция связавшихся фагов и их амплификация для следующих раундов. После нескольких раундов биопэннинга степень обогащения популяции искомым бактериофагом определяют титрованием и/или иммуноферментными методами анализа. Затем индивидуальные фаговые клоны изолируют и определяют последовательность чужеродной вставки. Важно отметить, что простая физическая связь между экспонированным пептидом и клонированной в геном фага последовательностью позволяет легко анализировать первичную структуру чужеродной вставки. Благодаря небольшим размерам нитчатых бактериофагов (5 нм в диаметре и 1мкм в длину) концентрация фаговых частиц может достигать до 1014 частиц/мл, что позволяет проводить скрининг огромного количества вариантов. Представительность пептидной фаговой библиотеки библиотеки достигает 109 различных вариантов вставки [12]. Сегодня комбинаторные фаговые библиотеки получили широкое распространение в качестве метода, позволяющего решать самые различные задачи молекулярной биологии, биохимии и биомедицины. Библиотеки могут быть выполнены на основе 19 случайных комбинаций олигопептидов, антител [32], ферментов [33], а также фрагментов геномной ДНК, кДНК, открытых рамок считывания или других функциональных районов генома [34]. Скрининг библиотек позволяет отбирать молекулы со специфическими свойствами, изучать белок-белковые взаимодействия, искать субстраты для различных ферментов, исследовать маркеры определенных тканей, органов и биохимических процессов, проводить поиск эпитопов антигенов и паратопов антител и, наконец, получать высоко специфические молекулы с адресными свойствами [35]. 1.1.3 Фаговые библиотеки антител Антитела – гликопротеины, состоящие из двух идентичных тяжелых цепей (Нцепей) и из двух идентичных лёгких цепей (L-цепей). Каждая цепь имеет вариабильный домен (V) и константный (С). К тяжелым цепям ковалентно присоединены олигосахариды. При помощи протеазы папаина антитела можно расщепить на два Fab (fragment antigen binding – антиген-связывающий фрагмент) и один Fc (fragment crystallizable – фрагмент, способный к кристаллизации) (рисунок 1.3). Рисунок 1.3 – Строение антитела, Fab – и scFv – фрагментов Fab- и scFv-фрагменты могут быть экспонированы на поверхности бактериофага. Fab-фрагмент состоит из легкой цепи (VL–CL) и части тяжелой цепи, которая представлена вариабельным доменом и первым константным доменом Fd (VH-CH1). При этом легкая цепь и часть тяжелой цепи соединены между собой дисульфидной связью (рисунок 1.3). Для создания Fab-библиотеки легкую цепь и Fd-домен клонируют в соответствующем 20 векторе. При этом обычно используют тип 3+3 фагового дисплея. Одну цепь клонируют в фагмиду, другая синтезируется в свободном виде без объединения с каким-либо белком. В процессе сборки и перемещения в периплазматическое пространство E. coli обе цепи ассоциируют и образуют активный Fab-фрагмент [36, 37]. scFv-фрагмент (single-chain fragment variable – одноцепочечный вариабельный домен), сконструированный так, что он состоит только из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и вариабельного домена легкой (VL), соединенные между собой глициновым линкером, обеспечивающий гибкость [38, 39] (рисунок 1.3). Для создания scFv библиотеки VH- и VL-гены объединяют в единую ДНК-последовательность с помощью ПЦР. Полученные scFv-гены клонируют в какой-либо вектор, обеспечивающий экспрессию scFv-антител в составе химерного белка с поверхностным белком pIII нитчатых бактериофагов. Глициновый линкер облегчает ассоциацию вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, необходимую для формирования антигенсвязывающей поверхности, и, таким образом, наличия дисульфидных связей между цепями не требуется [40,41]. Как правило, аффинность антител, полученных в результате биопэннинга, к антигенам достаточно низка, что затрудняет их использование в иммунотерапии и в высокочувствительной иммунодиагностике. Для повышения аффинности таких антител создают вторичные фаговые библиотеки антител на основе уже отобранных клонов. Для этого в V-ген селектированных клонов вносят различные мутации, и новый вариант фаговой библиотеки используют для вторичного биопэннинга [42]. Отобранные антитела с высокой аффинностью к определенному антигену могут быть использованы для реконструкции иммуноглобулина человека и получения высокоэффективных моноклональных человеческих антител. В отличие от антител, наработанных в организме животных, они не вызывают иммунный ответ с образованием антиглобулиновых антител. Другое направление – использование селектированных клонов в качестве детекторов антигенов или их эпитопов [43]. Так, если использовать фаговую библиотеку антител типа scFv-pIII и антитела против фагового белка pVIII, меченные каким-либо флуорохромом, можно детектировать антигены, с которыми антитело, экспонированное фаговой частицей, специфически связалось [44]. 1.1.4 Фаговые библиотеки кДНК Фаговые библиотеки, в которых экспрессированная последовательность является частью геномной ДНК, кДНК или открытой рамкой считывания, называют протеомными. 21 Протеомные фаговые библиотеки широко используют для изучения различных белковых взаимодействий и ДНК-, РНК-белковых взаимодействий. Бактериофаги, отобранные фаговым дисплеем и экспонирующие специфические пептиды, соответствующие последовательности, например, кДНК, используют для исследования белковых взаимодействий и мотивов белков, участвующих в этих взаимодействиях. Для создания протеомных фаговых пептидных библиотек используют бактериофаги с различными жизненными циклами - М13, T7 и λ [34]. В процессе жизненного цикла фага М13 сборка вирусной частицы происходит на внутреннем пространстве клеточной стенке E.coli (в периплазматическом пространстве) при участии комплекса фаговых и бактериальных белков. Затем вирион, без разрушения клетки E.сoli, секретируется через мембрану. Сборка литических фагов Т7 или λ происходит в цитозоле с последующим лизисом бактериальной клетки. Здесь важно отметить, что системы шаперонов цитозоля и периплазматического пространства отличаются, что может влиять на структуру экспонированного белка. Протеомные фаговые библиотеки используют, например, для выявления аллергенов. Для этого кДНК библиотеку инкубируют с сывороткой, полученной от аллергика и содержащей IgE. Затем, после нескольких раундов селекции, специфические клоны, связавшихся с IgE, анализируют и определяют аминокислотную последовательность пептида, вызывающего аллергическую реакцию [45]. Протеомная библиотека может быть представлена собранием полного генома какого-либо патогена и использована для детекции его иммуногенов. Существуют библиотеки на основе генома бактерий (например, рода Mycoplasma), вирусов (например, цитомегаловирус), простейших (например, Plasmodiumfalciparum) и даже некоторых высших эукариот (например, свиной цепень) [46]. В токсикологии фаговые протеомные библиотеки используют для изучения взаимодействия между химическим агентом и клеткой-мишенью, что вносит большой вклад в понимание механизмов действия того или иного токсического агента [47]. 1.1.5 Фаговые пептидные библиотеки Конструирование пептидной библиотеки является одним из ключевых моментов успешного скрининга, поскольку вероятность отбора лиганда, который специфически свяжется с определенной мишенью, во многом зависит от разнообразия библиотеки и длины вставки. Известно, что каждая аминокислота кодируется кодоном, состоящим из трех нуклеотидов. При этом, одна и та же аминокислота может быть закодирована несколькими кодонами (свойство вырожденности генетического кода). Одна из наиболее 22 распространенных стратегий конструирования комбинаторной библиотеки пептидов опирается на правила триплетности и вырожденности генетического кода и заключается в генерировании различных комбинаций на основе (NNK)n кодона, где N – это эквимолярное соотношение всех четырех нуклеотидов, а K – смесь только гуанина и тимина (1:1). Благодаря использованию (NNK)n кодона вместо (NNN)n, во-первых, сокращается число возможных стоп-кодонов с трех (TAA, TGA, TAG) до одного (TAG), во-вторых, выравнивается вероятность кодирования разных аминокислот. Таким образом, 32 возможных варианта (NNK)n кодона кодируют 20 канонических аминокислот и один стоп-кодон [48]. Число возможных вариантов аминокислотной последовательности длиной n будет равно 20n. Однако на практике на представительность библиотеки влияют и другие факторы, такие как встреча стоп-кодона в последовательности пептида и эффективность трансформации клеток E. coli фаговыми конструкциями. Обычно представительность коммерческой фаговой пептидной библиотеки составляет около 109 [49]. Пептидная вставка может быть как линейной, так и кольцевой, за счет образования дисульфидных мостиков между цистеинами, фланкирующими вставку. Как уже описывалось выше, чужеродная вставка может быть экспонирована белком pIII, либо белком pVIII. Библиотеки на основе белка pIII, который представлен всего 3-5 копиями на одном из концов вирусной частицы, используют для получения высокоспецифичных лигандов, обладающих высоким сродством к мишени. С помощью таких библиотек получают лиганды с константами диссоциации в пределах 1-10 µМ. Наиболее распространенное использование столь специфических пептидов – доставка различных веществ к мишени или визуализация специфических структур и биохимических процессов. Мажорный белок pVIII, покрывающий капсид, обеспечивает мультивалентное связывание и высокую авидность, что отрицательно отражается на аффинности взаимодействия пептида с мишенью. С помощью библиотек на основе белка pVIII селектируют лиганды с более низкой индивидуальной аффиностью, константы диссоциации для таких лигандов находятся в пределах 10-100 µМ [50]. Однако такие библиотеки также нашли широкое применение, поскольку селектированные фаговые частицы обладают высоким сродством к мишени, стабильностью и могут быть легко наработаны в большом количестве. Lang Q. с соавторами разработали способ детекции простато-специфичного антигена (Prostate-specific antigen (PSA)) с помощью отобранного из библиотеки pVIII фагового клона методом иммуноферментного анализа [51]. Bedi D. с соавторами показал возможность доставки GAPDH миРНК химерными белками pVIII фаговых частиц, используя свойство фаговых белков к самосборке в присутствии какой23 либо нуклеиновой кислоты. Авторы работы использовали фаговую пептидную библиотеку на основе мажорного белка pVIII для отбора специфических клонов к клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Рекомбинантные белки pVIII специфического отобранного клона были проинкубированы с GAPDH миРНК с образованием так называемых нанофагов. Показано, что полученные частицы (нанофаги) способны защищать GAPDH миРНК от деградации нуклеазами плазмы крови, специфически доставлять их к клеткам MCF-7, обеспечивать их интернализацию внутрь клетки, не влияя при этом на функциональность GAPDH миРНК [52]. Таким образом, в настоящее время фаговые пептидные библиотеки являются важным инструментом фундаментальтных исследований в области молекулярной и клеточной биологии, а также перспективным подходом при разработке и создании адресных лекарственных средств. 1.2 Системы скрининга фаговых пептидных библиотек 1.2.1 Скрининг фаговых пептидных библиотек в системе in vitro Скрининг фаговых пептидных библиотек в системе in vitro проводят на различных объектах: инактивированных вирусах и бактериях, очищенных фракциях белков, ферментов, рецепторов, функциональных доменов и на клеточных культурах [53, 54]. К скринингу in vitro также относят отбор на неорганических молекулах (например, металлы) или на синтетических материалах [55]. In vitro скрининг состоит из следующих этапов: (1) иммобилизации мишени на подложке, (2) инкубации фаговой пептидной библиотеки с мишенью, (3) отмывка не связавшихся фагов, (4) элюция связавшихся фагов и использование их для последующих раундов селекции. Наиболее простым и прямым методом отбора специфических пептидов in vitro является селекция на очищенной субстанции белка-мишени. Например, с помощью скрининга фаговой пептидной библиотеки, экспонирующей 7-звенный пептид, с фактором роста фибробластов 8 (FGF 8b) был получен пептид HSQAAVP (Р12), специфически связывающийся с этим рецептором. FGF 8b является основной изоформой, продуцирующейся клетками рака простаты. Авторы работы показали, что отобранный пептид P12 ингибирует FGF 8b-индуцируемую пролиферацию клеток, останавливает клеточный цикл в G0/G1 фазе путем супрессии Cyclin D1 и PCNA, и блокирует активацию Erk1/2 и Akt каскадов как в клетках рака простаты, так и в клетках эндотелия сосудов [56]. Недостатком или, скорее, ограничением такого способа отбора является то, что пептиды, полученные после скрининга на очищенной субстанции белков, могут не обладать 24 таргетностью к мишени in vivo. Одной из причин этого могут являться специфические посттрансляционные модификации белков в живых организмах, которые имеют место при протекании различных процессов, в том числе, при злокачественных перерождениях клетки. Кроме того, получение растворимой субстанции очищенного белка с сохранение его природной структуры и функции не всегда является тривиальной задачей. Cкрининг in vitro на культурах клеток позволяет успешно отбирать пептиды к различным поверхностным структурам клетки, а также пептиды, способные проникать внутрь клеток, так называемые, CPP-пептиды (от англ. cell penetrating peptides). Преимуществом такого метода селекции является возможность получения пептидов, специфичных к определенному типу клеток, без знания конкретной мишени, с которой эти пептиды свяжутся [57]. Менее распространенным объектом для скрининга фаговой пептидной библиотеки являются различные биологические жидкости. Так известно, что в экстрацеллюлярном матриксе опухоли обнаруживается большое количество фибрина. Повышенное содержание фибрина вызвано постоянным проникновением фиброгена в строму опухоли и его расщеплением. Принимая во внимание этот факт, Pilch J. с соавторами провели биопэннинг со свернувшейся плазмой крови и специфически связываться с отобрали пептиды, способные фибрин-фибронектиновыми комплексами. При внутривенном введении иммунодефицитным мышам с привитой опухолью MDA-MB-435 эти пептиды накапливались в экстрацеллюлярном пространстве опухоли [58]. Таким образом, пептиды, полученные в результате скрининга фаговых пептидных библиотек в системе in vitro могут быть использованы для детекции бактерий, вирусов и отдельных белковых субстанций, а также при характеризации поверхностных клеточных рецепторных структур и рецептор-опосредованных каскадов, обеспечивающих интернализацию веществ внутрь клетки. 1.2.2 Скрининг фаговых пептидных библиотек в системе in vivo Впервые возможность отбора специфических пептидов скринингом фаговой пептидной библиотеки in vivo была продемонстрирована Pasqualini и Ruoslahti в 1996 [59]. In vivo скрининг включает в себя следующие стадии: (1) введение фаговой пептидной библиотеки живому объекту, (2) сбор целевых органов (тканей), на которых направлен отбор, (3) элюция связавшихся фагов и использование их для последующих раундов селекции. Существует несколько способов введения фаговой пептидной библиотеки экспериментальным животным. Наиболее 25 распространенным способом является внутривенное введение. Такой способ позволяет библиотеке практически моментально быть представленной рецепторам кровеносных сосудов, органам и тканям. В процессе циркуляции фаговой пептидной библиотеки в кровяном русле часть популяции фагов связывается с белками плазмы и с другими не целевыми органами и тканями. Эта часть библиотеки не попадает в дальнейшие раунды селекции, поскольку амплифицируется только та часть библиотеки, которая связалась с целевым органом. Однако внутривенный способ введения не позволяет проводить отбор пептидов, специфичных к структурам головного мозга, поскольку фаговые частицы не проникают через гематоэнцефалический барьер. Для этой цели был разработан интраназальный способ ввдения фаговой пептидной библиотеки. Установлено, что при интраназальном введении вещества большая его часть всасывается в кровь, меньшая – при помощи периневрального транспорта по чувствительным нервам через нейроны обонятельного тракта попадает непосредственно в мозг и далее распространяется по структурам головного мозга при помощи механизмов, не связанных с кровотоком [60, 61]. Альтернативой внутривенному введению является введение непосредственно в мишень (ортотопическое). Например, внутрибрюшинное введение фаговой пептидной библиотеки мышам с раком желудка позволило отобрать пептиды, специфически связывающиеся с матастазами рака желудка [62]. Ортотопическое введение позволяет представлять мишени все возможные варианта библиотеки и уменьшает вероятность захвата фаговых частиц другими органами. С другой стороны, при внутривенном введении пептидов, отобранных ортопически, таргетность таких пептидов резко снижается. Наконец, существует трансдермальный (перкутанный) способ введения, позволяющий отбирать пептиды, способные к проникновению через интактную кожу [63, 64]. Одним из ключевых вопросов скрининга in vivo является время полужизни и неспецифическое распределение по органам введенного фага. Показано, что при циркуляции фаг накапливается в значительном количестве в печени и селезенке. Максимальная концентрациядикого фага M13 в крови наблюдается через 5 мин от момента внутривенного введения у мышей (линия CF-1) с ненарушенной иммунной системой и через 15 мин у иммунодефицитных мышей. Затем концентрация фаговых частиц в кровяном русле достаточно быстро снижается. Важно отметить, что концентрация фаговых частиц в селезенке у мышей с ослабленным иммунитетом гораздо меньше, чем у здоровых, что говорит об участии иммунной системы, в частности ретикулоэндотелиальной системы, в захвате фаговых частиц [65]. Время полужизни фага 26 М13 дикого типа в кровяном русле мыши составляет около 4,5 часов, различные модификации фагов (например, гликозилирование или сукцинилирование) резко сокращают время полужизни до минут. По-видимому, сокращение времени полужизни и быстрая деградация модифицированных фагов связана с их связыванием с рецепторами и интернализацией [66]. Эти нюансы необходимо учитывать при построении и анализе экспериментов in vivo. В 2002 году была опубликована первая работа по скринингу фаговой пептидной библиотеки in vivo на пациенте в коме [67]. После одного раунда скрининга при внутривенном введении фаговой пептидной библиотеки авторы работы анализировали биопсии нескольких органов. Было проанализировано 47160 фаговых клонов и показано, что их распределение между органами не случайно. Этот эксперимент был первым шагом в создании «молекулярной карты» специфического распределения рецепторов человека. Один из экспонированных пептидов обладал тропностью к ткани простаты и накапливался в этом органе в значительных количествах. Позднее было показано, что он является лигандом для интерлейкина-11 [68]. В дальнейшем фаговых частицы, отобранные из биопсий различных органов после первого раунда селекции, были объединены в новую библиотеку. С помощью этой новой библиотеки было проведено еще два последовательных раунда селекции на двух пациентах с раком простаты. Скрининг и биоинформатический анализ отобранных из различных органов клонов определил пятнадцать пептидов, которые потенциально могут являться лигандами определенных рецепторов. С помощью биоинформатических методов (High-throughput analysis by similarity search, protein arrays) и аффинной хромотографии было доказано, что четыре из пятнадцати пептидов являются лигандами для аннексина А4, аполипопротеина Е3, аннексина А2 и протеиназы-3 лейкоцитов [69]. Таким образом, одним из главных преимуществ этого метода отбора является то, что мишени, на которые отбирают специфические пептиды, представлены в естественном микроокружении живого организма. Мишенями для отбора могут выступать поверхностные структуры кровеносных и лимфатических сосудов, а также клетки тканей и органов. Пептиды, отобранные с помощью фаговых пептидных библиотек в системе in vivo и специфичные к определенным органам и тканям, могут быть непосредственно использованы как адресующие агенты для доставки лекарственных и диагностических средств. 27 1.3 Применение органо- и тканеспецифических пептидов в биомедицине Изначально пептиды не рассматривали в качестве перспективных кандидатов для внедрения в практическую медицину. Однако развитие технологии получения органо- и тканеспецифических пептидов с помощью пептидных фаговых библиотек, а также открытия новых свойств пептидов заставили заново пересмотреть этот вопрос. Фаговые пептидные библиотеки стали мощным молекулярным инструментов для получения пептидов с различными свойствами. Большой интерес вызывает возможность их применения в диагностике и лечении рака, особенно при сравнении с традиционно используемыми моноклональными антителами (МкАТ) и белками. Во-первых, химический синтез коротких пептидов является гораздо дешевле производства МкАТ и белков, и конечный продукт, при этом, не требует дополнительной очистки от компонентов клеточной стенки бактерий или плазматической мембраны эукариот [70]. Во-вторых, небольшие размеры пептидов позволяет им эффективно проникать в глубину паренхимы опухоли, что является важным аспектом таргетной терапии [71]. В-третьих, пептиды неиммуногенны, что обеспечивает их безопасность для клинического применения [70]. 1.3.1 Собственные биологические функции органо- и тканеспецифических пептидов В большинстве случаев скрининг фаговых пептидных библиотек проводят с целью получения пептидов, которые специфически связываются с рецепторными структурами целевым органом или тканей и впоследствии могут служить адресным агентов для доставки различных веществ. С другой стороны, клеточные рецепторы запускают множество механизмов: пролиферацию, адгезию, миграцию, инвазию. Поэтому не удивительно, что определенными отобранные из и сами органо- биологическими фаговых и тканеспецифические функциями. пептидных В частности, библиотек, обладают пептиды обладают некоторые пептиды, противоопухолевой активностью. Например, пептид LyP-1, специфически связывающийся с лимфатическими сосудами некоторых опухолей, при систематическом внутривенном введении ингибирует рост карциномы молочной железы MDA-MB-435 в модели ксенографтов на мышах SCID. Авторами работы было показано, что LyP-1 вызывает апоптотическую гибель только тех клеток, с которыми связывается [72]. Bai F. и соавторы при отборе пептидов на клетки рака желудка получили пептиды GEBP11 и GX1, обладающие противоопухолевой активностью. В дальнейшем авторами 28 был получен пептид GMBP1, который специфически связывался с рецепторами клеток множественной лекарственной резистентности рака желудка и изменял их фенотип, то есть также обладал противоопухолевыми свойствами [73]. Известно, что кислый фактор роста фибробластов (aFGF) продуцируется клетками рака молочной железы и через взаимодействие с рецептором фактора роста фибробластов (FGFRs) способствует прогрессированию рака. Белок AP8 способен специфически связывать aFGF и ингибировать как пролиферацию клеток опухоли, блокируя клеточный цикл, так и клеток новообразованных опухолевых сосудов [74]. Такие бифункциональные пептиды, специфичные к опухолевым клеткам и клеткам сосудов опухоли, могут являться как самостоятельными противоопухолевыми агентами, так и средствами доставки других лекарств, усиливая их эффект собственным противоопухолевым действием. Wang H. и соавторы разработали стратегию совместного использования апоптотического AVPI пептида и ДНК, кодирующей ген p53, в качестве адъювантной терапии рака молочной железы. Они модифицировали AVPI пептид, добавив к нему восемь аргининов. AVPIR8 способен эффективно проникать в раковые клетки, а также, за счет положительнозаряженного «хвоста» из аргининов, образовывать нанокомлексы с нуклеиновой кислотой. Авторами показано, что использование комбинации AVPIR8/p53 ДНК значительно снижает множественную лекарственную резистентность опухолевых клеток in vitro и in vivo и увеличивает чувствительно опухоли к доксирубицину [75]. 1.3.2 Использование органо- и тканеспецифических пептидов в генной терапии В настоящее время опухолеспецифические пептиды используют в качестве основы для создания направленных геннотерапевтических препаратов. Опухолеспецифические пептиды могут быть использованы для модификации средств доставки нуклеиновых кислот. Например, при встраивании в мембрану липосом, нагруженных нуклеиновой кислотой, такие пептиды обеспечивают дополнительную адресацию структур доставки. В работе Yang Z. и соавт. в состав липосом были включены два рецепторспецифичных пептида: Angiopep и tLyP-1. Angiopep специфичен к рецептору липопротеинов низкой плотности, который экспрессируется в большом количестве на структурах гематоэнцефалического барьера. tLyP-1 специфичен к рецептору нейролипина-1 и эффективно проникает в паренхиму опухоли. Такие модифицированные липосомы эффективно доставляли миРНК против фактора роста сосудов эндотелия (VEGF siRNA) через гематоэнцефалический барьер. На культуре клеток глиобластомы человека U87MG в системе in vitro и на глиобластоме в модели ксенографтов была 29 показана эффективная трансфекция клеток глиобластомы и противоопухолевая активность таких модифицированных липосом [76]. В работе Grifman M. был получен адено-ассоциированный вирусный вектор, в капсид которого был встроен пептид с NGR мотивом, отобранный из фаговой пептидной библиотеки. Этот рекомбинатный вирус обладал тропизмом к клеткам, экспрессирующим CD13 рецептор (рецептор связывания NGR мотива) [77]. Для направленной генной терапии также могут быть использованы генетически модифицированные бактериофаги, экспонирующие в составе одного из своих поверхностных белков адресные пептиды. Важными преимуществами бактериофагов при использовании в генной терапии является их безопасность для человека, высокая стабильность фаговых частиц и «пластичный» геном для конструирования. Кроме того, к настоящему времени известног несколько способов эффективной трансфекции клеток млекопитающих бактериофагами [78, 79]. Одна из первых работ, доказавшая возможность направленной генной терапии с помощью модифицированных бактериофагов, была выполнена на нитчатом бактериофаге, у которого генно-инженерным способом в состав минорного белка pIII был введен фактор роста фибробластов (FGF2). В качестве репортерного гена в состав генома фага был введен ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Такие модифицированные бактериофаги специфически проникали только в те клетки, на поверхности которых есть рецептор FGF2, интернализовались внутрь клетки и доставляли ген GFP в функциональном состоянии [80]. Таким образом, бактериофаг, несмотря на отсутствие тропизма к клеткам человека, может быть модифицирован таким образом, что приобретает специфичность к определенному типу клеток и способность проникать внутрь клетки и доставлять чужеродный генетический материал. В другой работе авторы исследовали возможность доставки VEGFR2 миРНК ковалентносвязанной с адресным пептидом cRGD. cRGD специфически связывается с αvβ3 рецепторами, экспрессирующимися в высокой плотности эндотелии опухолевых сосудов и самих клетках опухоли. Показано, что ковалентный комплекс cRGD-siRNA специфически проникаект в αvβ3-позитивные клетки HUVEC и вызывает «выключение» таргетного гена; в экспериментах in vivo на иммунодефицитных мышах с привитой рака легкого A549 был показан специфический противоопухолевый эффект описанных конструкций [81]. 30 1.3.3 Органо- и тканеспецифические пептиды при диагностике заболеваний Возможность отбора пептидов из фаговой пептидной библиотеки, специфичных к любому органу или ткани, позволила разработать на их основе новые диагностические средства. Пептиды, отобранные на определенный рецептор или тканеспецифический белок и меченные каким-либо маркером, могут быть использованы для характеризации культуры клеток и при иммуногистохимическом окрашивании клеток вместо антител. Например, RGD-пептид, конъюгированный с FITC-красителем, используют в экспериментах in vitro для оценки экспрессии интегринов αvβ3 на различных раковых клетках в культуре. Было также показано, что окрашивание биоптатов различных опухолей человека, заключенных в парафин, с помощью FITC-RGD позволяет достоверно оценить αvβ3 профиль опухолевой ткани. При этом, этот метод окрашивания гораздо проще и дешевле, чем окрашивание с помощью антител к αvβ3 интегриновым рецепторам [82]. Использование адресных пептидов для визуализации определенных структур и процессов in vivo также представляется актуальным и перспективным их применением. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) — диагностический радионуклидный томографический метод исследования. В основе этого метода лежит детекция распределения в организме соединений (радиопрепаратов), меченных позитрон- излучающими радиоизотопами. Разработка новых радиопрепаратов в настоящее время становится ключевым этапом в развитии метода ПЭТ. Они должны удовлетворять определенным требованиям по времени удержания в опухоли, скорости выведения и не должны неспецифически захватываться другими органами. В настоящее время в качестве белковых меток в ПЭТ используют, в основном, природные пептиды (бомбезин, саматостатин) [83]. Тем не менее, некоторые новые радиопрепараты, созданные, например, на основе RGD пептида, проходят клинические испытания [84]. Другой радиопрепарат для ПЭТ был создан на основе 64 Cu–меченого NGR- содержащего пептида, полученного с помощью фаговой пептидной библиотеки и специфичного к CD13 рецептору (биомаркер сосудов опухоли). Такой препарат связывался с CD13-позитивными клетками HT-1080 и не имел тропности к CD-13негативным клеткам MCF-7 в экспериментах in vitro. Результаты экспериментов in vitro были подтверждены на модели ксенографтов с опухолями HT-1080 и MCF-7 [85]. 31 1.3.4 Опулеспецифические пептиды как средства доставки лекарственных препаратов Пептиды, специфически связывающиеся с опухолевыми клетками и сосудами опухоли, в перспективе могут быть использованы в качестве адресных агентов для доставки цитотоксических лекарств, проапоптотических и апоптотических пептидов, веществ для визуализаии опухоли [11]. Одним из примеров таких работ является объединение проапоптотического пептида KLAK и адресного пептида RGD. RGD-мотив в составе пептида узнает интегриновые рецепторы, которые в большом количестве экспрессируются на новообразованных сосудах и раковых клетках. Был получен бифункциональный белок, который посредством адресного пептида доставляется к целевым клеткам (клетки эндотелия опухоли), проникает внутрь клетки и за счет действия противоопухолевой части повреждает мембраны митохондрий [86]. В другой работе в качестве адресного агента для доставки проапоптотического белка KLA был предложен пептид M2pep, который специфически связывается с опухольассоциированными макрофагамии с M2 макрофагами мыши [87]. Опухоль- ассоциированные макрофаги играют важную роль в развитии опухоли, стимулируя рост опухолевых клеток, ангиогенез, метастазирование и способствуя развитию резистентности к химиотерапии [88]. Полученный рекомбинантный белок M2pepKLA замедлял развитие опухоли и специфически сокращал популяцию опухоль- ассоциированных макрофагов [87]. При селекции пептидов с помощью пептидной фаговой библиотеки на основе фага T7 был отобран пептид CRGDKGPDC, объединяющий свойства двух мотивов - RGD и R/KXXR/K [89]. При этом RGD адресует пептид к опухоли, а R/KXXR/K - увеличивает проницаемость сосудов опухоли и, таким образом, повышает эффективность доставки лекарственных агентов в паренхиму опухоли через сосудистый барьер. Такие пептиды, обладающие одновременно свойствами таргетности и способные проникать в глубь паренхимы опухоли, образовали отдельный класс пептидов - CPHPs (cell penetrating homing peptides) [90]. Было показано, что конъюгат iRGD с противораковым препаратом абраксаном (альбумин-стабилизированный паклитаксел) увеличивает эффективность действия абраксана и значительно снижает общую токсичность препарата [91, 92]. Кроме того, оказалось, что совместное введение iRGD-пептида с различными лекарственными препаратами (доксирубицин, абраксан, липосомы с доксирубицином, трастузумаб) 32 увеличивает эффективность проникновения лекарств в паренхиму опухоли и их терапевтический индекс [91]. Некоторые лекарственные препараты на основе опухоль-адресованных пептидов находятся на различных стадиях клинических исследований. Так, например, циклический пептид [Arg-Gly-Asp-Dphe-(NMeVal)], содержащий мотив RGD, является основой противоопухолевого препарата Циленгитид (Cilengitide). Циленгитид - высокоселективный ингибитор интегрина, подавляющий ангиогенез, рассматривается в качестве препарата для лечения опухолей центральной нервной системы и мозга, в частности глиобластом, а также мелкоклеточного рака легкого, рака простаты и метастазирующей и/или плоскоклеточной карциномы головы и шеи. В клиническом испытании I/II фазы циленгитида в комбинации со стандартной радиотерапией и применением темозоломида у пациентов с впервые диагностированной глиобластомой после удаления опухоли или биопсии было показано достижение первичной конечной точки (69% выживаемость без прогрессирования в течение 6 мес) [93]. II/III стадию клинических испытаний для лечения рака яичников и рецидивов глиобластомы проходит онколитический аденовирус Ad5-∆24-RGD, модифицированный RGD и способный реплицироваться в клетках, у которых отсутствует Rb/p16 сигнальный путь [10]. Клинические испытания другого трехаминокислотного мотива NGR, таргетом которого является аминопептидаза N (CD13), начались после получения обнадеживающих результатов противоопухолевой терапии на животных моделях фьюжен-белком, состоящим из человеческого фактора некроза опухолей и NGR (NGR-hTNF) [94]. NGRhTNF тестировали и как самостоятельный препарат для лечения мезотелиомы плевры и рака печени, так и в комбинированной терапии с химиопрепаратами для лечения рецидивов рака яичников, колоректального рака и мелкоклеточного рака легкого [10, 95]. Подводя итог, можно сделать вывод, что актуальность применения метода скрининга фаговых пептидных библиотек и использования полученных пептидов для таргетной доставки белковых препаратов не вызывает сомнений. Адресные пептиды, помимо вышеупомянутых преимуществ по сравнению с другими доставляющими агентами, могут быть легко конъюгированы с белковыми противоопухолевыми препаратам генно-инженерными способами. В результате такого рода конъюгации получают рекомбинантную плазмиду, способную стабильно продуцировать фьюженбелок, обладающий противоопухолевыми свойствами и состоящий их двух доменов, один из которых - адресный, выполняющий функцию доставки препарата к опухоли, а другой 33 киллерный, обладающий цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам. 1.4 Лекарственные средства на основе проаптоптотических пептидов и белков Известно, что существуют природные белки и пептиды, обладающие способностью индуцировать апоптоз раковых клеток. Некоторые из них в настоящее время успешно используются в клинической практике, а целый ряд представителей этого класса соединений проходит различные этапы доклинических и клинических испытаний. 1.4.1 Проапоптотические цитокины TNF-α, FasL и TRAIL Применение цитокинов семейства фактора некроза опухоли в противораковой терапии основано на их способности индуцировать апоптоз опухолевых клеток, экспрессирующих рецепторы семейства TNFR [96]. В настоящее время создан и проходит III фазу клинических испытаний препарат на основе рекомбинантного TNFα («Альнорин») [97]. Данный препарат применяют в комплексной терапии солидных опухолей, таких как злокачественные заболевания кожи, саркома Капоши, базальноклеточный рак, грибовидный микоз, опухоли молочной железы, гениталий, рак головы и шеи и др. Противоопухолевая активность «Альнорина» усиливается при совместном применении с интерферонами, а опухоленекротизирующий эффект возрастает при непосредственном введении препарата вопухоль. Однако применение данного препарата сопровождается рядом побочных эффектов: острыми, но обратимыми нарушениями функции печени и снижением кровяного давления [97, 98]. На сегодняшний день проводятся интенсивные исследования препаратов на основе проапоптотического цитокина TRAIL, относящегося к семейству TNF [99]. Этот цитокин экспрессируется на цитоплазматической мембране клеток иммунной системы и после гидролитического отщепления мембранного домена высвобождается во внеклеточное пространство в растворимой форме. TRAIL взаимодействует, по меньшей мере, с пятью рецепторами, экспрессируемыми клетками человека. Два из этих рецепторов DR4 и DR5 относятся к семейству рецепторов смерти и участвуют в индукции апоптоза опухолевых клеток. Важной особенностью TRAIL, отличающей его от факторов TNFα и FasL, является низкая цитотоксичность по отношению к здоровым клеткам организма [2, 100]. Однако применение в противоопухолевой терапии препаратов на основе TRAIL затруднено, так как продолжительное использование этого фактора приводит к развитию устойчивости к нему опухолевых клеток [101]. Устойчивость опухолевых клеток к действию TRAIL связана с изменениями фенотипа этих клеток, выраженными в 34 конститутивном увеличении экспрессии антиапоптотических или в снижение экспрессии проапоптотических генов [102, 103]. В связи с этим, на данном этапе внедрения TRAIL в клиническую практику разрабатываются новые терапевтические подходы, направленные на снижение указанной лекарственной устойчивости. Недавно было показано синергическое противоопухолевое действие 3,3`-диселенодипропионовой кислоты (DSeA) и TRAIL - 3,3`-диселенодипропионовая кислота усиливает апоптотическое действие TRAIL на клетках меланомы A375, индуцируя ROS-зависимый апоптоз [104]. Также в настоящее время проходят клинические испытания ряд препаратов на основе рекомбинантного TRAIL [100, 101, 105, 106]. 1.4.2 Моноклональные антитела, индуцирующие апоптоз Моноклональные антитела (МКА) служат эффективными терапевтическими средствами в борьбе со злокачественными заболеваниями. Большинство из этих препаратов специфичны к тирозинкиназным рецепторам семейства ERBB, к которым относятся рецепторы EGFR, HER, VEGFR и др. [107, 108, 109]. Противоопухолевое действие данной группы препаратов является специфичным по отношению к раковам клеткам, экспрессирующим на мембране рецепторы семейства ERBB в большей концентрации, чем нормальные немалигнизированные клетки. При этом противоопухолевое действие этих МКА обусловлено несколькими различными механизмами, такими как стимуляция клеток иммунной системы к устранению раковых клеток, непосредственное связывание лигандов рецепторов ERBB с МКА, прямое нарушение сигнала от рецептора в клетку путем связывания рецептора с МКА или адресная доставка токсинов с помощью МКА к опухолевым клеткам [107, 110]. Помимо рассмотренных антител, в настоящее время разработаны и проходят клинические испытания препараты на основе проапоптотических МКА, являющихся высоко-аффинными агонистами рецепторов смерти DR4 и DR5 [100]. К этим препаратам относятся: мапатумумаб, лексатумумаб и конатумумаб [108, 111, 112, 113, 114]. Механизм действия препаратов на основе МКА, агонистичных к рецепторам смерти DR4 иDR5, аналогичен механизму действия TRAIL, и механизмы резистентности опухолей к действию данных препаратов также схожи. В связи с этим в настоящее время разрабатываются новые подходы комбинационной терапии онкологических заболеваний с использованием субтоксичных концентраций химиотерапевтических препаратов в сочетании с препаратами МКА [100, 111, 113]. 35 1.4.3 Интерфероны Интерфероны являются плеотропными цитокинами, проявляющими биологическую активность при взаимодействии с клеточными рецепторами. Интерфероны препятствуют инфицированию клеток вирусами, а также обладают антиангиогенным, антипролиферативным, иммуномодулирующим и проапоптотическим действием [115]. В настоящее время выделяют 3 основные группы интерферонов: интерфероны I-го типа, к которым относятся α-интерфероны (12 разновидностей) и β-интерферон [116]; интерфероны II-го типа - γ- интерферон, и интерфероны III-типа - λ-интерферон [117]. В 1986 Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA, United States Food and Drug Administration) впервые одобрила для клинического применения в качестве противоопухолевого средства интерферон rhIFNα-2b (recombinant human IFNα-2b). rhIFNα-2b применяют в качестве монотерапии, а также комбинированной терапии совместно с цитарабином (cytarabin), винбластином (vinblastine), 5-флуорацилом (5fluorouracil), тамоксифеном (tamoxifen) и интерлейкином-2 (interleukin-2). rhIFNα-2b индуцирует апоптоз опухолевых клеток как по рецепторному, так и по митохондриальному пути. Оба пути приводят к активации каспазного каскада, фрагментации ДНК и гибели клетки. Индукция апоптоза происходит через семейство рецепторов TNF- α (TNF-a/TNF-aR, FasL/Fas, Apo1, TRAIL/TRAILR, and Apo2). Действие rhIFNα-2b приводит к увеличению концентрации p53 и активации p38. Кроме того, rhIFNα-2b активирует PKR (protein kinase R), которая контролирует транскрипцию и трансляцию белков Fas, p53, and Bax апоптотических каскадов [118]. К настоящему времени препараты интерферонов получили одобрение для клинического применения при терапии ряда вирусных, аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний, а также некоторых онкологических заболеваний (таблица 1.1) [117, 119, 120]. Таблица 1.1 - Клиническое применение препаратов интерферона [120]. Тип заболевания Злокачественные новообразования Название заболевания Волосато-клеточный лейкоз Фолликулярная лимфома Миелома Хронический миелолейкоз Саркома Капоши Почечно-клеточный рак Меланома 36 Вирусные заболевания Гепатит С Гепатит В Герпетический кератит Папилломавирусная инфекция Остроконечные кондиломы Кондиломы гортани Миелопролиферативные синдромы Эссенциальная тромбоцитемия В то же время известно, что лечение препаратами интерферонов может сопровождаться рядом побочных эффектов. При длительном применении могут развиваться недомогание, депрессия, потеря аппетита и снижение веса. Кроме того, помимо системного и нейротоксического действия, могут проявляться миелосупрессия и гепатотоксичность. 1.4.4 Интерлейкин-24 (IL-24/mda-7) Интерлейкин-24 (IL-24) относится к семейству цитокинов Il-10. Главным образом IL-24 вырабатывается Тh2 клетками и активированными моноцитами. Предварительно IL24 был описан как антиген-7 дифференциации меланомы (MDA-7). Было показано, что IL24/MDA-7 либо не экспрессируется, либо экспрессируется в пониженных количествах в раковых клетках по сравнению с не трансформированными клетками [121]. Позже было обнаружено, что IL-24 эффективно индуцирует гибель раковых клеток различного тканевого происхождения [122]. На основе аденовирусов были получены системы, экспрессирующие IL-24, и продемонстрирована способность таких систем индуцировать апоптотическую гибель раковых клеток in vivo без повреждения окружающих опухоль здоровых клеток [123, 124, 125]. К настоящему времени препараты на основе аденовирусов, экспрессирующих IL24, доказали свою эффективность и безопасность, что позволило перейти к клиническим испытаниям этих препаратову [126]. 1.4.5 Вирусные белки, индуцирующие апоптоз раковых клеток Некоторые вирусы, такие как папилломавирусы, вирус везикулярного стоматита, аденовирусы, вирус простого герпеса и другие могут селективно реплицироваться в раковых клетках, вызывая лизис этих клеток. Такие вирусы относят к онколитическим вирусам. Онколитические вирусы не проявляют перекрестной устойчивости с другими противоопухолевыми препаратами и способны убивать даже те раковые клетки, в которых, по каким-то причинам, не реализуется программа апоптоза. 37 Апоптин или VP3 - белок вируса анемии кур. Апоптин индуцирует гибель широкого спектра раковых клеток человека по механизму апоптоза. При этом нормальные не малигнизированные клетки не чувствительны к действию апоптина [127]. Независимые эксперименты in vivo с использованием ксенографтных мышей с привитыми опухолями человека доказали, что введение апоптина и его рекомбинантных аналогов ведет к значительному торможению роста опухолей без видимых побочных эффектов [128, 129]. При исследовании интернализации и внутриклеточной локализации апоптина было показано, что он проникает в клетки по механизму эндоцитоза и локализуется в ядре и цитоплазме опухолевых и нормальных не малигнизированных клеток [129]. Апоптин индуцирует p53-независимый апоптоз в различных типах раковых клеток человека и не влияет на нормальные клетки. Показано, что апоптин взаимодействует с различными клеточными белками, включая Akt и anaphase-promoting complex, регулирующий каспазозависимый апоптоз [130]. Из числа всех исследованных в настоящее время парвовирусов грызунов (PVs) противоопухолевая активность была показана для парвовируса H-1, парвовируса крыс, парвовируса собак, мелкого мышиного вируса, вируса мышиной лейкимии [131, 132]. Геном PVs представлен одноцепочечной ДНК и кодирует 2 капсидных белка (VP1 и VP2) и 5 неструктурированных регуляторных полипептидов [133]. Положительные результаты были получены при исследовании противоопухолевой активности PVs в экспериментах на животных с привитыми опухолями человека, такими как глиома, нейробластома, лимфома, карцинома поджелудочной железы и опухоли молочной железы [131]. Одним из возможных механизмов цитотоксической активности PVs по отношению к опухолевым клеткам является индукция апоптотической гибели этих клеток, вызываемая действием белка NS1 (одного из неструктурированных регуляторных полипептидов) [133]. Было показано, что цитотоксичность NS1 коррелирует с его способностью связывать каталитический домен казеинкиназы II (CKIIα), что приводит к ингибированию ее активности, изменениям цитоскелета и апоптотической гибели клетки [134]. Другим белком парвовирусов, способным индуцировать апоптоз, является малый неструктурный белок 11кДа парвовируса В19. В 2011 г начались клинические испытания противоопухолевого препарата на основе парвовируса H-1 на пациентах с глиобластомой GMB [135]. E4orf4 (E4 open reading frame 4) является белком аденовируса E4 человека. В клетках, инфицированных этим вирусом, E4orf4 участвует в регуляции экспрессии вирусного генома, фосфорилировании вирусных и клеточныхбелков. E4orf4 способствует альтернативному сплайсингу мРНК вируса и участвует в регуляции процесса трансляции 38 белков. В клетках, трансфицированных плазмидной ДНК, экспрессирующей E4orf4, происходит индукция апоптоза по не классическому, каспаз-независимому и p53независимому пути, сопровождающегося задержкой клеточного цикла в G2/M фазе [136]. В настоящее время E4orf4 рассматривается в качестве потенциальной основы для создания генно-терапевтического препарата. 1.4.6 Рибонуклеазы - индукторы апоптоза раковых клеток Рибонуклеазы или РНКазы - ферменты, катализирующие гидролиз РНК с образованием коротких фрагментов. Помимо основной нуклеазной активности, РНКазы обладают ангиогенной, нейротоксической, иммуносупрессорной и противоопухолевой активностью [137, 138]. Особый интерес вызывают рибонуклеазы, обладающие селективным цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам человека. К ним относятся: онконаза и амфиназы – рибонуклеазы, выделенные из ооцитов лягушки Rana pipiens [139], cSBL и jSBL РНКазы - лектины из ооцитов лягушек Rana catesbeiana и Rana japonica, соответственно [140], бактериальные рибонуклеазы биназа и барназа [141], BS-РНКаза (Bovine seminal ribonuclease) из бычьих семинников [142], панкреатическая бычья рибонуклеаза А [143]. Онконаза представляет собой небольшую рибонуклеазу, проявляющую специфическую токсичность по отношению к раковым клеткам в большей степени, чем к нормальным не малигнизированным клеткам. Другое название онконазы - ранпирназа указывает на ее природный источник – лягушку Rana pipiens [144]. Онконаза связывается с отрицательно заряженными мембранами клеток, проникает в клетку по механизму AP2/клатрин-зависимого эндоцитоза и перемещается в цитозоль, где осуществляет гидролиз РНК, избегая действия ингибиторов, специфичных для рибонуклеаз млекопитающих (рисунок 1.4) [145, 146]. 39 Рисунок 1.4 - Предположительный механизм цитотоксического действия онконазы. Катионные и анионные биомолекулы изображены синим и красным цветом, соответственно. Сначала молекулы онконазы (синие) формируют внеклеточный равновесный комплекс с гепаринсульфатом (красный) на внешней поверхности мембраны клетки. Далее онконаза захватывается путем эндоцитоза, перемещается в цитозоль, расщепляет РНК-субстраты и инициирует апоптоз [145]. Показано, что онконаза специфически индуцирует апоптоз раковых клеток человека различного тканевого происхождения и обладает низкой токсичностью для нормальных клеток. Одна из гипотез такой избирательность состоит в том, что белки, значение изоэлектрической точки которых больше 9.5 (pI > 9.5), селективно интернализуются опухолевыми клетками, поскольку опухолевые клетки несут больший отрицательный заряд по сравнению с нормальными. Онконаза гидролизует рРНК, тРНК, мРНК и некодирующие микро-РНК, что приводит к ингиброванию синтеза белка и апоптозу [147]. Например, онконаза индуцирует апоптотическую гибель клеток HeLa по p53-независимому пути, с активацией инициаторной каспазы-9, эффекторных каспаз-3 и 7, деградацией хроматина и фрагментацией ядра [148]. Результаты доклинических испытаний показали, что онконаза проявляет активность в отношении даже тех линий раковых клеток, которые резистентны к цитостатическим препаратам. Клинические испытания онконазы проводят на пациентах с различными типами рака - рак печени, рак молочной железы, рак поджелудочной железы. В настоящее время завершена III стадия клинических испытаний на пациентах с мезотелиомой и проходит II стадия на пациентах с немелкоклеточным раком легкого [149]. 40 Биназа - цитотоксическая рибонуклеаза, выделенная из бактерии Bacillus intermedius. При исследовании механизма цитотоксического действия биназы на малигнизированные клетки было показано, что в клетках, чувствительных к действию данного фермента, происходит значительное снижение уровня РНК. Возможный механизм действия биназы связан с гидролизом РНК, образованием нового пула малых регуляторных РНК и инициацией как митохондриальных, так и рецептор-опосредованных путей апоптоза, в частности, за счет увеличения уровня экспрессии некоторых проапоптотических генов, включая TNFα [150]. Барназа – рибонуклеаза, природным источником которой является бактерия Bacillus amyloliquefaciens. Исследование данной рибонуклеазы на культурах раковых клеток человека показало ее устойчивость к действию ингибиторов РНКаз. В экспериментах in vitro обнаружено, что барназа обладает цитотоксическим действием по отношению к различным клеткам карциномы человека и клеткам лейкемии [151]. При исследовании цитотоксического действия конъюгата scFv 4D5-дибарназы, состоящего из двух молекул барназы, ковалентно связанных с легкой цепью вариабельного фрагмента (scFv) гуманизированного антитела 4D5, узнающего внеклеточный домен HER2 рецептора, было показано, что конъюгат scFv 4D5-дибарназа связывается с HER2 положительными клетками и проникает в цитоплазму по рецепторному пути эндоцитоза. При этом индекс цитотоксичности (ИК50) исследуемого конъюгата составил 1,8 нM для клеток карциномы яичников человека, и 4,2 и 2,4 нМ для культур клеток карциномы молочной железы человека SKBR-3 и BT-474, соответственно [151, 152]. Исследование механизма цитотоксического действия барназы показало, что данная РНКаза индуцирует апоптотическую экстернализацией гибель малигнизированных фосфатидилсерина клеток, сопровождающуюся (PS) на внешнюю сторону плазматической мембраны клетки, активацией каспазы-3 и олигонуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК [151]. В экспериментах in vivo в модели ксенографтов на мышах BALB/c nude с привитыми опухолями SKBR-3 было показано, что после 10 кратного введения животным конъюгата scFv 4D5-дибарназа в дозе 7 мг/кг происходило торможение роста опухоли на 76%. При этом, при однократном введении данного препарата мышам BALB/c nude и BDF1 в той же дозе видимых побочных эффектов не наблюдалось [152]. 1.4.7 Кротамин Кротамин - основный полипептид с молекулярной массой ~4,8 кДа, был выделен из яда бразильской гремучей змеи Crotalus durissus terrificus. Кротамин относится к 41 миотоксичным ядам, вызывающим сокращение и спазм скелетных мышц, что связано с ингибированием активности потенциал-чувствительных K/Na-каналов клеток мышечной ткани [153]. По структуре и механизму проникновения в клетки эукариот кротамин относят к пептидам класса CPP [154, 155]. В экспериментах in vivo и in vitro было показано, что кротамин эффективно проникает в активно делящиеся клетки и способен доставлять в эти клетки отрицательно заряженные молекулы, такие как ДНК и РНК, связываясь с ними электростатическими взаимодействиями [154]. Кроме того, данный пептид оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки [156]. Проникновение кротамина в раковые клетки приводит к интенсивному высвобождению Ca2+ из лизосом и ЭР в цитоплазму, что индуцирует диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий [155]. Это может приводить к нарушению проницаемости внешней мембраны митохондрий, высвобождению митохондриальных проапоптотических факторов в цитоплазму клетки и индукции апоптотической гибели клетки по митохондриальному пути [157, 158]. 1.4.8 Проапоптотические белки и пептиды молока человека Известно, что молоко человека содержит ряд проапоптотических белковых факторов, таких как TNF-α, Fasl, TGF-β, а также ряд ферментов, потенциально способных индуцировать гибель клеток млекопитающих в культуре [159]. В недавних исследованиях было показано, что молоко человека содежит в большом количестве противоопухолевый цитокин TRAIL [160]. Кроме того, известно, что ряд мажорных белков молока: αлактальбумин в комплексе с жирными кислотами [161], лактоферрин [162], а также его протеолитические фрагменты [163] могут вызывать апоптоз клеток млекопитающих. В сыворотке молока большинства видов млекопитающих в высоких концентрациях (1,1-1,5 мг/мл) содержиться белок α-лактальбумин. Интересным свойством этого белка является способность связывать жирные кислоты. При обработке α-лактальбумина хелатирующими агентами (ЭДТА), связывающими ионы Ca2+, происходит изменение его третичной структуры, что способствует образованию комплекса с жирными кислотами [164]. α-лактальбумин является регуляторным компонентом лактоз-синтазного комплекса и участвует в биосинтезе лактозы в период лактации. Было показано, что протеолитические фрагменты α-лактальбумина обладают бактерицидным действием [164]. Кроме того, при исследовании цитотоксических свойств α-лактальбумина человека было показано, что комплексы этого белка с олеиновой кислотой (HAMLET) обладают противоопухолевым действием [165]. 42 HAMLET (human a-lactalbumin made lethal to tumor cells) - молекулярный комплекс α-лактальбумина человека и олеиновой кислоты [161]. При исследовании цитотоксического действия препарата HAMLET было показано, что он индуцирует апоптоз многих раковых линий клеток в культуре, в то время как не трансформированные клетки остаются резистентными к действию комплекса. При действии HAMLET в раковых клетках наблюдают разрушение митохондрий с высвобождением цитохрома С, а также слабый каспазный ответ, выраженный активацией каспаз-3 и -9 и связанной с повреждением ДНК каспазы-2. Кроме того, HAMLET взаимодействует с протеосомами, нарушая их функционирование. Наконец, HAMLET проникает через мембрану ядра и взаимодействует с гистонами H3 и H4, с меньшей аффиностью - с H2a и H2b, а также приводит к повреждению и фрагментации ДНК [166]. Было показано, что под действием HAMLET в клетках повышается уровень p62/SQSTM1, который является субстратом для ферментов аутофагосом, что указывает на возможность формирования аутофагосом и на возможный вклад аутофагии в процесс гибели клеток [167]. При исследовании противоопухолевого действия HAMLET в модели ксенографтов на мышах с привитой опухолью глиомы человека GMB было показано, что данный препарат индуцирует апоптотическую гибель клеток опухоли. Результаты исследования мозга этих животных методом магнитного резонанса показали, что у животных, получавших HAMLET, наблюдалась значительная редукция размеров опухоли по сравнению с контрольной группой. При этом, влияния препарата на прилегающие интактные ткани мозга и не трансформированные астроциты не было отмечено [168]. Основным недостатком HAMLET является необходимость ортотопического введения препарата (непосредственно в место локализации опухоли), что значительно ограничивает спектр опухолей, доступных для такой терапии. Лактоферрин - железо-связывающий гликопротеин, секретируемый в молоко,слезную жидкость, слюну, бронхиальную жидкость и плазму крови большинства видов млекопитающих. Основными физиологическими функциями данного белка являются перенос и аккумуляция железа в крови и участие в системе врожденного иммунитета. Лактоферрин также обладает антимикробной, антивирусной и антиоксидантной активностями [169, 170]. Кроме того, было показано, что данный белок обладает цитотоксическим действием по отношению к раковым клеткам различного тканевого происхождения (рак легкого, печени и прямой кишки) [171, 172, 173]. При исследовании механизма действия лактоферрина человека было показано, что он индуцирует апоптотическую гибель клеток в культуре, сопровождающуюся активацией протеинкиназы JNK и транскрипционного фактора E2F1 и подавлением активности 43 антиапоптотических белков семейства Bcl-2, что приводит к активации инициаторных и эффекторных каспаз [174]. Лактоферрицин может быть получен путем гидролиза лактоферрина пепсином в кислой среде. Лактоферрицин сохраняет большинство защитных функций лактоферрина. Показано, что в концентрациях нетоксичных для нормальных немалигнизированных клеток лактоферрицин обладает цитотоксическим действием по отношению к различным опухолевым клеткам, таким как клетки лейкемии, фиброкарциномы, меланомы и кишечной карциномы. При исследовании механизма цитотоксического действия лактоферрицина было показано, что он взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатными группами фосфатидилсерина, экспонированными на внешнюю поверхность мембраны раковых клеток. Взаимодействие лактоферрицина с клеточной мембраной приводит к нарушению ее целостности, активации Ca2+/Mg2+ зависимой эндонуклеазы и индукции апоптотической гибели клетки по оксидант-зависимому пути [175]. Авторами проекта в молоке человека был обнаружен пептид, вызывающий апоптоз клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 [3]. Было показано, что этот пептид, названный лактаптином, является протеолитическим фрагментом каппа-казеина человека с молекулярной массой 8,6 кДа [4]. Для дальнейших исследований был получен штамм-продуцент E.coli, синтезирующий рекомбинантный аналог природного лактаптина - RL2, также обладающий цитотоксическими свойствами по отношению к раковым клеткам в культуре и способный тормозить рост и метастазирование опухолей животных и человека в модели ксенографтов [5, 6, 7, 8]. RL2 эффективно тормозит пролиферацию раковых клеток человека различного тканевого происхождения и не влияет на жизнеспособность немалигнизированных клеток в системе in vitro. Гибель клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB 231, индуцируемая действием рекомбинантного лактаптина, проходит по механизму p53-независимого апоптоза. При этом наблюдается транслокация фосфатидилсерина на внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны клеток, диссипация трансмембранного потенциала митохондрий и активация инициаторных каспаз-8 и -9 и эффекторных каспаз-3 и -7. Лактаптин проникает в цитоплазму клеток, ивзаимодействует с белками цитоскелета α, β-тубулином и α-актинином [6]. Также показано, что RL2 индуцирует LC3-процессинг, который характерен для аутофагии [9]. На основе полученного рекомбинантного пептида создан новый противоопухолевый препарат "Лактаптин - концентрат для приготовления раствора для инфузий" и закончены доклинические исследования этого препарата. По результатам доклинических исследований показано, что разработанный препарат является безопасным при 44 внутривенном применении, обладает противоопухолевой и антиметастатической активностью на модельных животных и низкой иммуногенностью и может быть рекомендован для проведения клинических испытаний. Наибольшую эффективность Лактаптин проявляет в отношении раков молочной железы (РМЖ) человека (как эстроген зависимых, так и эстроген независимых). 1.5 Обоснование направления исследования По оценкам международного агентства по исследованию онкологических заболеваний (IARC) Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (доклад от 4 февраля 2014 года) к 2035 году количество ежегодно диагностируемых случаев онкологических заболеваний достигнет 24 - 25 миллионов. Проведенный аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, показал, что поиск и разработка малотоксичных противоопухолевых препаратов направленного действия и повышение эффективности терапии онкологических заболеваний являются «горячими точками» молекулярной биологии, биомедицины и фармацевтики. Особенно актуально использование в составе таких препаратов природных пептидов и белков, многие из которых способны избирательно действовать на опухолевые клетки, индуцируя в них процессы апоптоза и аутофаги и не повреждая при этом здоровые клетки организма. Адресная доставка лекарства к опухоли возможна благодаря наличию на поверхности раковых клеток большого количества рецепторов, которые либо отсутствуют, либо представлены в гораздо меньшем количестве на нормальных клетках. Эти рецепторы могут служить мишенями для таргетной терапии. Сосуды опухолей также имеют свои специфические особенности строения и обладают отличительным профилем экспрессирующихся рецепторов. Традиционно в качестве молекулярных адресных агентов используют антитела или их фрагменты, однако они имеют существенные недостатки, такие как низкие коэффициенты проникновения в опухоль из-за большого размера и неспецифический захват мононуклеарной фагоцитарной системой, что значительно ограничивает их применение. В настоящее время представляется перспективным использование в качестве направляющих и адресующих агентов пептидов небольшого размера, отобранных из комбинаторных пептидных библиотек методом аффинной селекции и специфичных к рецепторным структурам клеток и сосудов опухолей. Эта технология позволяет проводить 45 селекцию опухолеспецифических пептидов как in vitro на культурах раковых клеток, так и in vivo на опухолях, трансплантированных лабораторным животным, и является быстрым и удобным инструментом молекулярной биологии. Отобранные опухолеспецифические пептиды обладают высокими коэффициентами проникновения в опухоль [91], низкой иммуногенностью, высокой аффинностью к мишени, относительной стабильностью и являются удобными объектами для конъюгирования с другими противоопухолевыми агентами, в том числе и белковой природы. В настоящее время эту технологию используют при решении множества задач поиск маркеров различных заболеваний, изучение рецепторов и их лигандов, детектирование биологических процессов in vivo. При этом, в отличие от моноклональных антител, терапевтическая взаимодействовать с эффективность заранее которых выбранными основана антигенами на способности опухолевых клеток, опухолеспецифические пептиды могут быть отобраны как на «известные», так и на «неизвестные» поверхностные клеточные антигены. Создание противоопухолевых терапевтических агентов, состоящих из цитотоксических природных белков и опухоль-адресованных пептидов, позволит увеличить концентрацию лекарства в опухоли за счет адресной доставки, снизить терапевтическую дозу препарата и уменьшить возможные токсические эффекты. Прикладные научные исследования, проводимые в рамках данного проектв направлены на создание адресных бифункциональных агентов белковой природы с противоопухолевой активностью - рекомбинантных слитых белков, состоящих из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, обеспечивающих доставку лактаптина в опухоль. Разработанные с применением этого подхода рекомбинантные слитые белки «адресный пептид-лактаптин» будут одновременно обладать противоопухолевыми свойствами и высокой тропностью к опухоли, обеспечивая направленную доставку лекарства, что позволит значительно повысить эффективность противоопухолевого действия лактаптина. Технологический процесс наработки рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин», включающий получение рекомбинантных плазмид и штаммовпродуцентов, будет обеспечивать синтез готовых целевых продуктов, минуя стадии наработки, выделения и очистки каждого компонента (лактаптина и адресного пептида) в отдельности, а также финальную конъюгацию двух белковых молекул. 46 Вывод: Проведен аналитический обзор информационных источников, дающий представление о современном состоянии исследований в области противоопухолевых препаратов белковой природы и рассматривающий перспективные стратегии разработки препаратов направленного действия, обеспечивающих специфическое воздействие на злокачественные новообразования. Особое внимание уделено бифункциональным препаратам белковой природы, объединяющим опухоль-адресующий агент и противоопухолевое терапевтическое средство. На основании данных аналитического обзора информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, и собственных исследований показано, что создание адресных бифункциональных агентов белковой природы, одновременно обладающих противоопухолевыми свойствами, высокой тропностью к опухоли и низкой токсичностью, является актуальной задачей современной биомедицины и биофармацевтики. 47 2 Проведение патентных исследований В ходе выполнения 1 этапа работ по проекту были проведены патентные исследования, в результате которых были получены достоверные данные об уровне техники, тенденциях развития и патентно-лицензионной ситуации. Целью настоящих патентных исследований являлось исследования технического уровня и тенденций развития противоопухолевых средств на основе слитых белков «адресный пептид - апоптоз-индуцирующий белок». Предметом патентного поиска (объектом исследования) являлись адресные бифункциональные агенты белковой природы с противоопухолевой активностью; рекомбинантные слитые белки, состоящие из апоптоз-индуцирующего белка и опухольадресованных пептидов, обеспечивающих доставку апоптоз-индуцирующего белка в опухоль; слитые белки лактаптина и опухоль-адресованного пептида, обеспечивающего доставку лактаптина в опухоль; штаммы - продуценты рекомбинантных слитых белков. Выводы и рекомендации отчета о патентных исследованиях: За отчетный период по объекту исследования опубликовано более 900 патентных документов. Наибольшее количество патентов получено в США, Китае, Канаде и Республике Корея. Наиболее активно в данном направлении работают следующие зарубежные компании: Лексиген Фармасьютикэлс Корпорейшн (US), Рисерч Дивелопмент Фаундейшн (US), Дженентек Инк. (US), Дзе Бордоф Риджентсоф дзе юниверсити оф Техас Систем (US), Faulk Pharmaceuticals, Inc. (US), Cytotech labs, LLC, (US), Shenzhen Allucks Biotech Co LTD (CN), Nanjing University (CN), Inst of Biolog Technology Chin [CN], Industrial Technology Research Institute (TW), Сеул Нэшнл Юниверсити Индастри Фаундейшн (KR), Kyungpook National University Industry-academic Cooperation Foundation (KR), Seoul National University R&Db Foundation (KR); Nano Intelligent Biomedical Engineering Corporation CO LTD, (KR), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KR), Advanced Accelerator Applications [FR], Bayer Schering Pharma AG (DE), Univ Erasmus Medical CT [NL], Айрм ЛЛС (BM), Универсидади Фидералду Риу ди Жанейру (BR). К тенденциям развития объекта исследования относятся следующие: - разработка новых противоопухолевых препаратов на основе апоптоз индуцирующих белков, в частности, пептидов женского молока; - расширение спектра опухоль-адресованных пептидов; - создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов слитых белков, содержащих противоопухолевый апоптоз-индуцирующий белок и опухоль-адресованный пептид; 48 - создание готовых противоопухолевых лекарственных форм на основе слитых белков (апоптоз-индуцирующего белка и опухоль-адресованного пептида). В результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране: генетические конструкции с встроенными генами лактаптина и опухольадресованных пептидов, обеспечивающие экспрессию слитых белков «адресный пептид лактаптин» в клетках-продуцентах; штаммы-продуценты слитых белков «адресный пептид-лактаптин»; прототипы новых противоопухолевых лекарственных средств, а также способы терапии злокачественных новообразований разработанным лекарственным средством. Отчет о патентных исследованиях оформлен отдельным документом. 49 3 Разработка методики отбора опухоль-адресованных пептидов в системах in vitro и in vivo На рубеже 20-говека немецкий физик Paul Ehrlich предложил концепцию, в которой химические вещества с избирательной аффиностью к определенным патогенам могут выступать в качестве «волшебной пули» для борьбы с инфекцией без вреда для организма в целом [14]. Эта концепция вдохновила многих исследователей на создание принципиально новых противоопухолевых препаратов, эффективность действия которых обеспечивалась избирательным связыванием с опухолью. Такое избирательное связывание основано на том, что любой клеточный тип, в том числе раковые клетки, обладают собственным «профилем» рецепторов на своей поверхности, которые либо отсутствуют, либо представлены в гораздо меньшем количестве у других клеток. Этот уникальный «профиль» клеток позволяет разрабатывать направленную лекарственную терапию. В свою очередь, известно, что сосуды разных тканей и органов, в том числе и опухолей, тоже обладают отличительными биохимическими свойствами. Более того, в отличие от раковых клеток, эндотелиальные клетки сосудов опухоли генетически более стабильны, что редко приводит к приобретению ими лекарственной устойчивости, и, кроме того, клетки этдотелия сосудов доступнее для терапевтических средств, особенно при внутривенном введении [15]. Благодаря уникальному «профилю» раковых клеток и опухолевых сосудов разработка комбинаторных фаговых пептидных библиотек на основе технологии фагового дисплея позволила получать высокоспецифичные пептиды. В настоящее время такие опухолеспецифические пептиды рассматривают как перспективные таргетные агенты для доставки терапевтических генов, цитотоксических лекарств, проапоптотических и апоптотических пептидов, агентов для визуализации и цитокинов [16]. Для разработки методики получения опухолеспецифических пептидов в системах in vitro и in vivo нами была выбрана 12-мерная фаговая пептидная библиотека, выполненная на основе вектора M13KE, полученного из нитчатого бактериофага М13mp19 (рисунок 3.1). 50 Рисунок 3.1 – Карта векторной плазмиды M13KE, полученной из бактериофага М13mp19. Фаговая пептидная библиотека построена таким образом, что случайная аминокислотная последовательность пептида закодирована в составе гена поверхностного белка pIII, который представлен пятью копиями на поверхности частицы. В результате экспонированные пептиды располагаются в N-конце белка pIII фаговой частицы и отделены от белка pIII коротким глициновым линкером (GGGS) (рисунок 3.2). 51 Рисунок 3.2 – Участок нуклеотидной последовательности, кодирующей белок pIII. Показан сайт клонирования случайной аминокислотной последовательности экспонированного белка. Изображен рекомбинантный белок pIII, на N-конце которого расположен чужеродный пептид (Х12), отделенный от белка pIII глициновым спейсером. В качестве штамма-хозяина использовали E.coli ER2738, обладающий генотипом F´proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/ fhuA2 glnV Δ(lac-proAB) thi-1 Δ(hsdSmcrB)5. Этот штамм несет F-фактор (F-плазмиду), кодирующий F-пили на поверхности частицы, которые необходимы бактериофагу М13 для связывания и инфицирования E.coli. В составе F-плазмиды также закодирован ген устойчивости к тетрациклину, что резко снижает вероятность потери F-фактора при добавлении тетрациклина в среду для выращивания и поддержания культуры. Поскольку в составе вектора M13KE, на основе которого выполнена фаговая пептидная библиотека, закодирован ген lacZα (N-концевая часть β-галактозидазы), то при инфицировании рекомбинантным бактериофагом M13 штамма E.coli ER2738, у которого делетирован 5` участок гена lacZ, происходит α-комплементация. α-комплементация происходит путем не ковалентного объединения двух частей белка β-галактозидазы и 52 восстановления его функции. Таким образом, при инфицировании рекомбинантным бактериофагом М13 бактериальной клетки ER2738 в результате α-комплементации гена lacZ появляется активность бета-галактозидазы. Поэтому бляшки, образованные путем заражении E.coli рекомбинантным бактериофагов М13, окрашиваются в голубой цвет при выращивании на среде с добавлением Xgal/IPTG. 3.1 Материалы и методы В работе использовали: соляную кислоту, гидроксид натрия, соли, спирт этиловый (химические реактивы марки хч, Россия); Ph.D.™-12 Phage Display Peptide Library Kit (New England Biolabs, США); триптон, дрожжевой экстракт, агар (MP Biomedicals, Россия); глицерол, Tween-20, (Хеликон, Россия); PEG 8000, бычий сывороточный альбумин (БСА) (Amresco); изопропилтиогалактозид (ИПТГ) (Медиген, Россия), X-gal (Fermentas), культуральная среда DMEM, L-глутамин, трипсин, Avertin, PMSF (Sigma, США); сыворотка крупного рогатого скота (FBS), амфотерицина В, пенициллин/стрептомицин (Gibco BRL Co., Gaithersburg, MD); тетрациклин (Биосинтез, Россия); для определения нуклеотидной последовательности ДНК использовали наборы реагентов фирмы ABI. Животные: в работе использованы 3-4 месячные мыши линий A/Sn, C57 Black, CBA, CH3A разведения Института цитологии и генетики СО РАН. Животные содержались в стандартных условиях вивария, на стандартном пищевом и питьевом рационе, согласно действующим нормам. Все эксперименты с лабораторными животными выполнены в соответствии с рекомендациями и требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986). Опухолевые штаммы: опухолевые штаммы гепатоаденокарциномы-1 (ГА-1), гепатоаденокарциномы-29, аденокарциномы легких (АЛ), аденокарциномы Кребс-2, аденокарциномы легких Льюиса и карциномы Эрлиха получены из Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Клеточная линия Меланомы В16 любезно предоставлена Мироновой Н.Л (ЛБНК, ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). Опухолевые штаммы ГА-1, ГА-29, АЛ, Кребс-2, карциномы Льюиса и Эрлиха поддерживали в асцитной форме путем еженедельных внутрибрюшинных трансплантаций на мышах соответствующих линий. Для экспериментов in vivo асцитные клетки опухолей ресуспендировали в физиологическом растворе до конечной концентрации 106 клеток/мл и вводили мышам подкожно по 150 мкл суспензии. 53 Меланому В16 культивировали in vitro в среде DMEM в присутствии 10% сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамина, 250 мг/мл амфотерицина В и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Для экспериментов in vivo клетки меланомы В16 открепляли с помощью 0,25% раствора трипсина, разводили до концентрации 106 клеток/мл и вводили мышам подкожно в 200 мкл суспензии. Животных использовали в эксперименте при достижении опухолевого узла размера 0,5-0,6 см в диаметре. 3.2 Негативная селекция фаговой пептидной библиотеки на первичной культуре мышиных фибробластов Для «обеднения» фаговой пептидной библиотеки с целью удаления пептидов, связывающихся с нормальными клетками, использовали первичную культуру фибробластов мыши линии C57 Black. Клетки выращивали по достижению 80%конфлюэнтности, отмывали PBS и инкубировали с 1 мл (1011 БОЕ/мл) 12-мерной фаговой пептидной библиотекой в течение 1 ч при 37°С. Супернатант, содержащий «обедненную» библиотеку не связавшихся с фибробластами бактериофагов, отбирали, и амплифицировади содержащиеся в нем фаговые частицы. 3.3 Амплификация бактериофагов Колонию ER2738 с чашки с LB-агаром (тетрациклин 20 мкг/мл) помещали в 5 мл LB-среды с тетрациклином (20 мкг/мл) и наращивали до оптической плотности 0,01-0,05 при длине волны λ=600 нм (OD600) (фаза ранней лог-фазы). Суспензию бактериофагов вносили в 25 мл жидкой культуры E.coli ER2738 (OD600=0,01-0,05) и наращивали в шейкер-инкубаторе при 170 об/мин и температуре 37°С в течение 4,5 ч. Полученную суспензию бактериальных клеток и бактериофагов центрифугировали 10 мин., 12 000 g при 4°С. Супернатант, содержащий амплифицированную популяцию бактериофагов, переносили в новые пробирки и добавляли раствор ПЭГ/NaCl (1/6 по объему), инкубировали при 4°С не менее 2 ч для преципитации бактериофагов. Затем суспензию центрифугировали ресупендировали 15 мин., 12 000 g при 4°С, супернатант удаляли. Осадок в 1 мл PBS и переносили в новые пробирки. Суспензию центрифугировали 5 мин., 12 000 g при 4°С для осаждения остатков E. coli. Супернатант переносили в новые пробирки и добавляли раствор ПЭГ/NaCl (1/6 по объему), инкубировали 1 ч. на льду. Суспензию центрифугировали 10 мин., 12 000 g при 4°С, удаляли супернатант и осадок ресупендировали в 200 мкл PBS. Концентрацию 54 бактериофагов после амплификации определяли титрованием на агаризованной среде LB с добавлением 1мг/мл X-Gal и 1,25 мг/мл ИПТГ. Растворы: LB среда (на 1 л): триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 10 г; ПЭГ/NaCl: 20% ПЭГ-8000 (w/v), 2,5 М NaCl. 3.4 Титрование бактериофагов Колонию ER2738 с чашки с LB-агаром (тетрациклин 20 мкг/мл) помещали в 5 мл LB-среды с тетрациклином (20 мкг/мл) и наращивали в шейкер-инкубаторе при 170 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. Верхний агар разливали по 3 мл в стерильные пробирки и помещали их на водяную баню, нагретую до 45ºС. Готовили необходимые серии разведений суспензии бактериофагов в LB-среде, таким образом, чтобы финальный объем разведения был равен 1 мл суспензии бактериофагов в LB-среде. Суспензию амплифицированных бактериофагов разводили в 108-1011 раз. Суспензию не амплифицированных бактериофагов разводили в 101-104 раз. 100 мкл разведения бактериофагов и 50 мкл культуры ER2738 вносили в пробирку с верхним агаром, перемешивали на вортексе и выливали на заранее приготовленную чашку с агаризованной средой LB (1мг/мл X-Gal и 1,25 мг/мл ИПТГ). Чашки инкубировали при температуре 37°С в течение 14-16 ч. Для пересчета концентрации бактериофагов в суспензии использовали те чашки, на которых число голубых бляшек, образованных бактериофагами, находилось в пределах 100-200 колоний. Концентрацию бактериофагов в начальной суспензии определяли по формуле: С (БОЕ/мл) = x*10*10y, где x - количество голубых бляшек, у - разведение. Растворы: Верхний агар: LB-среда с добавлением 0,7% агара. 3.5 Отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на мышиных раковых клетках ГА-1 и АЛ Асцитные опухолевые клетки ГА-1 и АЛ отмывали от асцитной жидкости и эритроцитов методом временного нарушения осмотического давления. Для этого к асциту клеток добавляли трехкратный объем дистиллированной воды, охлажденной до 4ºС, и инкубировали 30 сек. К полученному раствору опухолевых клеток и разрушенных эритроцитов добавляли однократный объем 3,5% NaCl для восстановления осмотического давления. Клетки центрифугировали в течение 3 мин, 150g. Клеточный осадок ресуспендировали в PBS до финальной концентрации 106 клеток/мл. 55 Для проведения биопэннинга использовали 1 мл клеточной суспензии. Клетки центрифугировали в течение 5 мин. при 300 g. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл блокировочного буфера и инкубировали 10 мин при 4°С. Клетки отмывали один раз раствором PBST и трижды PBS. Инкубацию с фаговой пептидной библиотекой проводили при 4ºС в течение 60 мин в соотношении 1011 фаговыхчастиц:106 опухолевых клеток. Клетки отмывали дважды PBST, дважды PBS и затем лизировали в 1 мл H2O. Суспензию фаговых частиц амплифицировали (п.1.2). Амплифицированную популяцию фаговых частиц использовали для последующих раундов селекции. Концентрацию бактериофагов после амплификации определяли титрованием на агаризованной среде LB с добавлением 1мг/мл X-Gal и 1,25 мг/мл ИПТГ. Растворы: Блокировочный буфер: PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА); PBST: PBS, содержащий 0,1% Tween-20. 3.6 Отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vivo на мышиной опухолевой модели ГА-1 Асцитные клетки опухолевого штамма гепатомы ГА-1 ресуспендировали в физиологическом растворе до конечной концентрации 5*106 клеток/мл и вводили мышам подкожно 0,1 мл клеточной суспензии. Животных использовали в эксперименте при достижении размера опухолевого узла 0,5-0,6 см в диаметре. Мышам с подкожно трансплантированной опухолью в хвостовую вену вводили 0,5 мл 12-мерной фаговой пептидной библиотеки (2*1011 БОЕ/мл), разведенной в физиологическом растворе. После 5 минут циркуляции фаговых частиц, мышей подвергали глубокому наркозу, используя в качестве наркотизирующего средства 2,5% раствор Avertin в дозе 0,2 мл на 20 г веса мыши, и через сердце перфузировали 15 мл физиологического раствора для отмывки не связавшихся частиц. Опухоль извлекали, отмывали в PBS и гомогенизировали в 1 мл PBS, содержащем 1 мМ ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфлюорида (PMSF). Гомогенат опухолевой ткани центрифигурировали 10 мин., 10 000 g при комнатной температуре, супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали в 1 мл блокировочного буфера и центрифигурировали 10 мин., 10 000 g при комнатной температуре, супернатант удаляли. Затем осадок ресуспендировали в 1 мл жидкой культуры E. сoli ER2738 в LB-средe (OD600 0,2 – 0,3) для элюции связавшихся с опухолью бактериофагов и инкубировали 30 мин. при 37ºС. Элюат фаговых частиц центрифигурировали 10 мин., 10 000 g при комнатной температуре. 56 Суспензию фаговых частиц амплифицировали (п.1.2). Амплифицированную популяцию фаговых частиц использовали для последующих раундов селекции. Концентрацию бактериофагов после амплификации определяли титрованием на агаризованной среде LB с добавлением 1мг/мл X-Gal и 1,25 мг/мл ИПТГ. Для последующих раундов селекции амплифицированную фаговую пептидную библиотеку разводили до концентрации 2*1011 БОЕ/мл и вводили в хвостовую вену 0,5 мл суспензии бактериофагов в физиологическом растворе. Растворы: Блокировочный буфер: PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). 3.7 Определение последовательностей экспонированных бактериофагами пептидов После третьего (в системах in vitro и in vivo) и четвертого раундов (в системе in vivo) селекции фаговые частицы титровали на агаризованной среде LB с добавлением 1мг/мл X-Gal и 1,25 мг/мл IPTG для получения индивидуальных фаговых колоний. Индивидуальные фаговые колонии использовали для получения одноцепочечной ДНК. Для получения одноцепочечной ДНК фаговую колонию помещали в 1 мл жидкой культуры E.coli ER2738 в ранней лог-фазе (OD600 0,01 – 0,05) и инкубировали в шейкеринкубаторе при 170 об/мин в течение 4,5 ч., 37ºС. Полученную суспензию бактериальных клеток и бактериофагов центрифугировали 5 мин., 12 000 g при 4°С. Супернатант (500 мкл) переносили в новые пробирки, добавляли 200 мкл ПЭГ/NaCl и инкубировали в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Суспензию центрифугировали 10 мин., 12 000 g при 4ºС и супернатант удаляли. К осадку добавляли 100 мкл йодного буфера и 250 мкл 96% этилового спирта, аккуратно пипетировали инкубировали в течение 10-20 мин. при комнатной температуре. Затем проводили центрифугирование в течение 10 мин, при 4ºС, 12 000g. Супернатант удаляли, осадок промывали сначала 70% этиловым спиртом, затем 96% этиловым спиртом. Осадок высушивали в вакуумном испарителе. Полученные одноцепочечные ДНК использовали для реакции Сэнгера (-96III секвенирующий праймер (5`-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG - 3`)) (New England Biolabs, США). Определение последовательностей продуктов реакции секвенирования осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) (ЦКП СО РАН «Геномика», ЦКП ИБХ). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей встроек, кодирующие пептиды, проводили с помощью компьютерной программы “MEGA 4.0”. 57 Растворы: Йодный буфер: 10 мМ Tris-HCl, 1 mM ЭДТА, 4М NaI. Вывод: Разработана методика отбора из фаговой пептидной библиотеки методом аффинной селекции опухоль-адресованных пептидов, специфически связывающихся с раковыми клетками мыши в системе in vitro и мышиной опухолью, трансплантированной экспериментальным животным in vivo. Опухоль-адресованные пептиды, отобранные согласно разработанной методике, могут быть использованы для конъюгации с цитотоксическими агентами и создания адресных противоопухолевых препаратов. Разработанная методика оформлена отдельным Приложением 1 к Научнотехническому отчету. 58 4 Отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на культурах раковых клеток мыши Cкрининг in vitro на культурах клеток позволяет успешно отбирать пептиды к различным поверхностным структурам клетки, а также пептиды, способные проникать внутрь клеток, так называемые, CPP-пептиды (от англ. cell penetrating peptides). Преимуществом такого метода селекции является возможность получения пептидов, специфичных к определенному типу клеток, без знания конкретной мишени, с которой эти пептиды свяжутся [57]. Отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro проводили на культурах раковых клеток мыши - гепатокарциноме ГА-1 и аденокарциноме легкого АЛ. Опухолевые штаммы ГА-1 и АЛ поддерживали в асцитной форме путем еженедельных внутрибрюшинных трансплантаций на мышах соответствующих линий (А/Sn и C57 Black). Перед проведением селекции фаговой пептидной библиотеки in vitro на мышиных раковых клетках ГА-1 и АЛ-1 была проведена негативная селекция на первичной культуре фибробластов мыши линии C57 Black. Негативная селекция обедняет библиотеку по тем бактериофагам, которые потенциально могут связаться со здоровыми немалигнизированными клетками или с пластиковой подложкой (пластиком пробирки). Обедненную библиотеку не связавшихся с фибробластами бактериофагов отбирали и аплифицировали. Амплифицированную библиотеку использовали для проведения отбора опухоль-адресованных пептидов in vitro на раковых клетках мыши. Для отбора фаговых частиц, экспонирующих опухолеспецифические пептиды, были проведены 3 раунда селекции in vitro на мышиных раковых клетках ГА-1 и АЛ. После третьего раунда селекции были получены индивидуальные фаговые колонии. Индивидуальные фаговые колонии использовали для получения одноцепочечной ДНК и определения нуклеотидных последовательностей встроек, кодирующих пептиды. Определены и проанализированы последовательности для 53 клонов бактериофагов, отобранных на клетки ГА-1 (таблица 4.1) и 32 клонов, отобранных на клетки АЛ (таблица 4.2). 59 Таблица 4.1 - Последовательности и частоты встречаемости экспонированных бактериофагами пептидов, отобранных после третьего раунда селекции in vitro на мышиные раковые клетки ГА-1. Последовательность пептида Частота встречаемости (%) Последовательность Частота пептида встречаемости (%) GLHTSATNLYLH SGVYKVAYDWQH QWNWPVRSVANV GDGNSVLKPGNW DRWVARDPASIF DRTMNDLPGLMH GYSFIDPPRKFH GYTLISGPTPGI GQSEHHMRVASF YSTKDSPMRHLS YTSVLSPQYHLV APSLYTEKPGSA AVPMTAHSLNAS ATGVEGSMLWLV ASLVDWHHSNFP VWGSPPGAVAFF VVQNAMFHAAIS LLPDVMLRATIG LTGPMSPKSYNS 9,4 18,9 5,7 3,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 MDNKTTRWRDPL SSYYNSRWAFYP SALKGLFPADHH SAELQTVMAPRL SVTVHQARLASK SLDGAGAALRTS SDERGLWFHKMD STASYPT NWSHNVRLNYTY WNAPSVANGPRM TIGSNTLLSSIR HSKPGGLPLLFP HDDVLWTPRLYK HPHDYNDLTSPF HAAFIDLPLIRY HVADTGSLISKR EPHNYSFWLNPD DLFGSRHNPGNI 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 Таблица 4.2 - Последовательности и частоты встречаемости экспонированных бактериофагами пептидов, отобранных после третьего раунда селекции in vitro на мышиные раковые клетки АЛ. Последовательность пептида Частота встречаемости (%) Последовательность Частота пептида встречаемости (%) GLHTSATNLYLH SGVYKVAYDWQH SQDIRTWNGTRS KASGSPSGFWPS TSIQISNAHPKS TTSIKINKYAGH MHPNAGHGSLMR IGLPHSANSTKP HYPPREGSTPWG TGAPPRLDARPA 18,8 12,5 12,5 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 AVPMTAHSLNAS VPSDDSWLRRSV GPERTTNPVLPH IGTLPLKIENRR AVKHPSSHRQTI GVLHMYDLPYNG DMNVIMYRLALA DRWVARDPASIF GXILRLLICICM 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 3,1 60 Бактериофаги, экспонирующие пептиды GLHTSATNLYLH, SGVYKVAYDWQH, AVPMTAHSLNAS и DRWVARDPASIF, отобрались после трех раундов биопэннинга in vitro как на клетках ГА-1, так и на клетках АЛ. И в том, и в другом отборе клоны, несущие пептиды AVPMTAHSLNAS и DRWVARDPASIF встретились всего один раз. Клоны 1 и 2, экспонирующие пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH, соответственно, обладали наибольшей частотой встречаемости. При отборе на клетки ГА-1 частота встречаемости клона 1 среди всех остальных проанализированных бактериофагов составила 9,4%, частота встречаемости клона 2 – 18,9%. Частота встречаемости клона 1 при отборе на клетки АЛ, наоборот, оказалась меньше, чем клона 2 (12,5%), и составила 18,8%. Вывод: Таким образом, трех раундов селекции in vitro на мышиных раковых клетках ГА-1 и АЛ было достаточно, чтобы отобрать два специфических фаговых клона, несущих пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH. 61 5 Отбор опухоль-адресованных пептидов in vivo на мышиных опухолевых моделях 5.1 Отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vivo на мышиной опухолевой модели ГА-1 Впервые возможность отбора специфических пептидов скринингом фаговой пептидной библиотеки in vivo была продемонстрирована Pasqualini и Ruoslahti в 1996 [59]. Одним из главных преимуществ этого метода отбора является то, что мишени, на которые отбирают специфические пептиды, представлены в естественном микроокружении живого организма. Мишенями для отбора могут выступать поверхностные структуры кровеносных и лимфатических сосудов, а также клетки тканей и органов. Для отбора фаговых частиц, экспонирующих опухолеспецифические пептиды, были проведены 4 раунда селекции in vivo на мышах линии A/Sn с подкожно трансплантированной опухолью ГA-1. После третьего и четвертого раунда селекции были получены индивидуальные фаговые колонии для получения одноцепочечной ДНК и определения нуклеотидных последовательностей встроек, кодирующих пептиды. После третьего раунда селекции было определено и проанализировано 37 экспонированных последовательностей (таблица 5.1). После четвертого раунда - 38 последовательностей (таблица 5.2). Таблица 5.1 - Последовательности и частоты встречаемости экспонированных бактериофагами пептидов, отобранных после третьего раунда селекции in vivo на мышах линии A/Sn с подкожно трансплантированной опухолью ГА-1 Последовательность пептида Частота встречаемости (%) Последовательность Частота пептида встречаемости (%) GLHTSATNLYLH SGVYKVAYDWQH GSAPLLTVDTSK GRIEPHRLFQGA QFDYMRPANDTH LGSSHGHGASHQ DRWVARDPASIF YASDLQPLTQFI STSDYTQWTSYA 35,1 21,6 5,4 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 YGHGLNQAELRQ GDGNSVLKPGNW GTGLVTLPRLTV DLGRASWNPFFS ANLTRWPHNVST DVSTYKTNAQNS NWSHNVRLNYTY NTNYVTWSPSSR 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 62 Таблица 5.2 - Последовательности и частоты встречаемости экспонированных бактериофагами пептидов, отобранных после четвертого раунда селекции in vivo на мышах линии A/Sn с подкожно трансплантированной опухолью ГА-1 Последовательность пептида Частота встречаемости (%) GLHTSATNLYLH SGVYKVAYDWQH MHPNAGHGSLMR SFKIPYHYDSGQ DRWVARDPASIF ENLMHADKNFRS LQSTSPAYTHRM GDGNSVLKPGNW 63,2 21,1 5,3 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 После третьего раунда селекции in vivo на опухолевую модель ГА-1 с наибольшей частотой встречаемости отобрались два фаговых клона, несущих пептиды GLHTSATNLYLH (35,1%) и SGVYKVAYDWQH (21,6%). Эти же клоны (под номерами 1 и 2) были отобраны при селекции in vitro на мышиные раковые клетки ГА-1 и АЛ. После четвертого раунда селекции in vivo частота встречаемости клона 1 увеличилась до 63,2%. Кроме того, клон DRWVARDPASIF, отобранный in vitro на обеих клеточных линиях, встретился по одному разу после третьего и четвертого раундов селекции in vivo. Поскольку клоны 1 и 2 отобрались с максимальной частотой встречаемости как в экспериментах in vitro на мышиные раковые клетки ГА-1 и АЛ, так и в экспериментах in vivo на мышиную опухоль ГА-1, то эти клоны и были выбраны для дальнейших исследований. 5.2 Исследование специфичности отобранных бактериофагов к различным типам мышиных опухолей in vivo Способность двух отобранных клонов 1 (GLHTSATNLYLH) и 2 (SGVYKVAYDWQH) специфически связываться с опухолями in vivo была изучена на опухолях ГА-1, АЛ, Меланома В16, опухоль Кребса, аденокарцинома легких Льюиса, карцинома Эрлиха и гепатоаденокарциномой-29 (ГА-29). Наработанный индивидуальный фаговый клон в количестве 109 фаговых частиц в 0.5 мл физиологического раствора вводили мышам в хвостовую вену. Через 24 часа после введения опухоль и контрольные органы (легкое и печень) исследовали на содержание бактериофагов (БОЕ/мг ткани) путем титрования на культуре клеток E. сoli ER2738 (рисунок 5.1). 63 64 65 Рисунок 5.1 – Относительное связывание клонов 1 (GLHTSATNLYLH), 2 (SGVYKVAYDWQH) и контрольного бактериофага, не экспонирующего пептид, с различными типами опухолей по сравнению с контрольными органами (печень, легкое). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (M ± s). Показано достоверное связывание обоих клонов с гепатомой А1 (A/Sn), аденокарциномой легких (A/Sn), Меланомой В16 (C57 Black), опухолью Кребса (C57 Black) и аденокарциномой легких Льюиса (CBA). Достоверного связывания с опухолью Эрлиха (CH3A) и гепатоаденокарциномой-29 (CBA) не выявлено. Согласно полученным результатам через 24 часа после внутривенного введения концентрация контрольного бактериофага без экспонированного пептида в опухоли всего в два-три раза выше, чем в печени и легком. Эти данные согласуются с литературными, согласно которым дикий бактериофаг способен задерживаться и накапливаться в опухолевой ткани по причине недоразвитости сосудистой системы опухоли [15]. Новообразованные сосуды опухоли тонкие и извилистые, что способствует задерживанию фаговых частиц в опухоли. В результате проведенных исследований показано, что экспериментальные фаговые клоны 1 (GLHTSATNLYLH) и 2 (SGVYKVAYDWQH) специфически распределяются по органам (опухоль, печень, легкое). Они накапливаются в значительном количестве в опухолевой ткани гепатомы ГА-1, аденокарциномы легких, Меланомы Б16, карциномы Кребса и аденокарциномы легких Льюиса через 24 часа после внутривенного введения. Концентрация фаговых клонов в 10-100 раз выше в зависимости от типа 66 опухоли, чем в контрольных органах. Отсутствие тропности к опухоли Эрлиха и гепатоаденокарциноме-29 вероятно вызвано тем, что клоны специфичны к структуре, присутствующей не на всех типах опухолей. Выводы: 1 В результате отбора опухоль-адресованных пептидов в системе in vivo на мышиной опухолевой модели ГА-1 были получены 2 фаговых клона, несущие пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH. 2 Последовательности отобранных пептидов полностью совпали с последовательностями пептидов, отобранных в системе in vitro на раковых клетках в культуре. 3 Показано, что бактериофаги, несущие пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH, обладают специфичностью к различным типам мышиных опухолей in vivo. 67 6 Разработка методики получения генетических конструкций, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков, состоящих из отобранных пептидов и лактаптина, клетками штаммов-продуцентов 6.1 Материалы и методы В работе использовали: соляную кислоту, гидроксид натрия, соли, спирт этиловый (химические реактивы марки хч, Россия); агарозу (Медиген, Россия); триптон, дрожжевой экстракт, агар (MP Biomedicals, Россия); глицерол, краситель бромфеноловый синий, ЭДТА (Хеликон, Россия); додецилсульфат натрия (SDS) (Sigma, США); наборы для проведения ПЦР, маркеры молекулярных весов ДНК (Biolabmix, Россия); ампициллин (Биосинтез, Россия); набор для выделения и очистки ДНК Gel Extraction kit (QIAGEN, ЕС), набор для выделения и очистки плазмид GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, ЕС); ферменты производства Thermo Fisher Scientific: рестриктазы BamHI и NcoI, ДНК-лигаза Т4; Pfu-полимераза (СибЭнзим, Россия). Для определения нуклеотидной последовательности ДНК использовали наборы реагентов фирмы ABI. 6.1.2 Проведение рестрикции векторной ДНК и фрагмента Векторную ДНК pET-15b (1 мкг) и клонируемый ПЦР-фрагмент (1 мкг), кодирующий слитый белок, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI (по 2 ед. каждого фермента) в объеме реакционной смеси 50 мкл. Реакцию проводили в условиях, рекомендованных производителем. Все продукты ПЦР-реакции очищали от белков фенол-хлороформной экстракцией и осаждали в течение нескольких часов при температуре минус 20°С добавлением 3M NaAc pH 5,2 (1/10 от объема растворенной фракции нуклеиновых кислот), 96% этиловым спиртом (2,5 объема растворенной фракции нуклеиновых кислот). Полученный после центрифугирования (10000 g, 10 мин) осадок промывали 70% этиловым спиртом и высушивали в вакуумном испарителе. После обработки рестриктазами BamHI и NcoI векторную ДНК pET-15b и клонируемый ПЦР-фрагмент очищали электрофорезом в 1,5% агарозном геле с последующей экстракцией из геля набором QIAquick Gel Extarction Kit согласно протоколу производителя. 6.1.3 Проведение лигазной реакции векторной ДНК и фрагмента Реакцию лигирования Т4 ДНК-лигазой линеализированного вектора pET-15b и клонируемого фрагмента, обработанными ранее эндонуклеазами рестрикции BamHI и 68 NcoI, проводили в объеме 5 мкл при комнатной температуре в течение 30 мин. В реакции использовали 50 нг линейной формы плазмиды pET-15b и клонируемый фрагмент в трехкратном молярной избытке по отношению к вектору. 6.1.4 Получение компетентных клеток E.coli TOP10 Колонию с чашки с LB-агаром помещали в 5 мл SOB среды и наращивали в шейкер-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. Инокулировали 1 мл полученной культуры в 100 мл предварительно нагретой до 37°С SOB среды и подращивали в шейкер-инкубаторе при 200 об/мин, температуре 37°С до оптической плотности 0,55-0,65 при длине волны λ=600 нм (OD600). Культуру охлаждали во льду, переносили в центрифужные стаканы и центрифугировали при 1000 g, 4°С в течение 5 мин. Супернатант удаляли, клетки помещали в лед и ресуспендировали в 10 мл охлажденного до 4°С FSB раствора. Суспензию клеток инкубировали на льду в течение 15 мин и центрифугировали при 1000 g, 4°С в течение 5 мин. Супернатант удаляли и ресуспендировали осадок, помещенный в лед, в 1,8 мл охлажденного FSB раствора. Аккуратно добавляли 65 мкл ДМСО к клеточной суспензии и инкубировали на льду в течение 15 мин. Затем суспензию клеток расфасовывали в предварительно охлажденные пробирки по 50 мкл. Хранили трансформированные клетки при минус 70°С. Растворы: SOB среда: триптон – 20мг/мл, дрожжевой экстракт – 5мг/мл, NaCl – 8,6 мМ, KCl – 2,5 мМ, MgCl2 – 10мМ; FSB раствор: CH3COOK – 10мМ, MnCl2 – 45мМ, KCl – 100 мМ, [Со (NH3)6]С13– 3мМ, глицерин – 10% (объем/объем). 6.1.5 Трансформация компетентных клеток E.coli TOP10 Трансформацию компетентных клеток E.coli TOP10 (в объеме 50 мкл) проводили после размораживания их во льду, затем добавляли 5 мкл лигазной смеси, аккуратно перемешивали и инкубировали 15 минут во льду. Пробирки помещали в термостат с температурой 37оC на 5 мин (тепловой шок), затем охлаждали до 0оC на льду. В пробирки добавляли по 500 мкл LB среды, инкубировали в течение 1 ч при 37оC. После этого клетки рассевали на чашках Петри, содержащих LB-агар с ампициллином (100 мкг/мл). Растворы: LB среда (на 1 л): триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 10 г; Антибиотики: Ар – 100 мг/мл. 69 6.1.6 Выделение плазмидной ДНК После трансформации компетентных клеток E.coli отбирали клоны с фенотипом Amp+. Отдельную колонию наращивали в 5 мл LB среды с ампициллином(100 мкг/мл) в шейкер-инкубаторе при 170 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. Из полученной биомассы выделяли плазмидную ДНК с помощью коммерческого набора GeneJET Plasmid Miniprep Kitсогласно протоколу производителя. Качество выделенной ДНК проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле. 6.1.7 Рестрикционный анализ плазмидных ДНК Плазмидную ДНК (300-400 нг) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI (по 2 ед. каждого фермента) в объеме реакционной смеси 20 мкл. Реакцию проводили в условиях, рекомендованных производителем. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. 6.1.8 Секвенирование плазмидной ДНК Реакцию секвенирования проводили с использованием BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA) с последующей очисткой продуктов реакции секвенирования с помощью набора DyeEx Spin Kit (Qiagen, USA) в ЦКП «Геномика» СО РАН. Для секвенирующей реакции использовали праймеры Т7seq_F 5` -TAATACGACTCACTATAGGG – 3` и Т7seq_R 5` - GCTAGTTATTGCTCAGCGGT – 3`.Определение нуклеотидных последовательностей очищенных продуктов реакции секвенирования осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Анализ исследуемых нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерной программы “MEGA 4.0”. Положение каждого нуклеотида прочитывалось по двум цепям. 6.2 Результаты Ранее была получена рекомбинантная плазмида pGSD/FR2 (3164 п.н.), содержащая последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный аналог лактаптина RL2. Был получен штамм-продуцент E.coli, синтезирующий рекомбинантный аналог природного пептида, также обладающий способностью индуцировать апоптоз раковых клеток человека в культуре и тормозить рост и метастазирование опухолей животных и человека в модели ксенографтов [5, 6, 7, 9] (рисунок 6.1). Плазмиду pGSD/FR2 использовали для получения ДНК-последовательности, кодирующей аналог лактаптина RL2. 70 Рисунок 6.1 – Карта рекомбинантной плазмиды pGSD/FR2 Для получения генетических конструкций, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных слитых белков (фьюжен-белков), состоящих из отобранных пептидов и RL2, была выбрана векторная плазмида pET-15b (5708 п.н.) (Novagen, США) (рисунок 6.2). Плазмида pET-15b содержит сайт множественного клонирования, ген устойчивости к ампициллину, ColE1 ориджин репликации, промотор фага Т7, ген lacI, кодирующий белок-репрессор, и lac оператор, перекрывающийся с T7 промотором. Транскрипция гена слитого белка осуществляется индуцируемой Т7 РНК полимеразой, ген которой закодирован либо в геноме штамма-хозяина под контролем промотора lacUV5, либо в геноме бактериофага штамма-хозяина под промоторами λpL и pI. Преимущество плазмидного вектора pET-15b, по сравнению с широко используемым вектором pUC, заключается в использовании промотора фага Т7, а не lac промотора, для экспрессии целевого белка. Во-первых, промотор фага Т7 сильнее lac промотора. Во-вторых, РНК полимеразами E.сoli гораздо менее эффективно связываются с промотором фага Т7. Втретьих, Т7 РНК полимераза обладает высокой специфичностью к промотору. Благодаря этим свойствам при проведении индукции обеспечивается эффективная транскрипция только клонированного гена. 71 Рисунок 6.2 – Карта плазмиды pET-15b и района клонирования Любой клонированный чужеродный белок, синтезирующийся в E.сoli, потенциально может быть токсичен для нее. Это приводит к возможной нестабильности и элиминации плазмиды, а также может влиять на рост E.coli. Даже при отсутствии индукции в штаммах E.сoli, несущих ген РНК полимеразы Т7, базальная активность промотора lacUV5 приводит к базальному уровню транскрипции целевого белка. Поэтому важным этапом создания экспрессионных векторов является возможность максимального подавления экспрессии клонированного гена до момента его индуцирования. При трансформации рекомбинантным плазмидным вектором pET-15b штамма E.сoli, не содержащего ген РНК полимеразы Т7, ген клонированного целевого белка сохраняется полностью транскрипционно неактивным. Благодаря этому при трансформации лигазной смесью 72 штамма E.сoli, не содержащего ген РНК полимеразы Т7, вероятность получения стабильных клонов увеличивается, а наработка рекомбинантной плазмиды становится гораздо эффективнее. Наработанная, выделенная и очищенная рекомбинантная плазмида может быть использована для клонирования штаммов-продуцентов, способных экспрессировать чужеродный белок, за счет наличия гена РНК полимеразы Т7. Последовательность, кодирующая слитый белок, сконструирована таким образом, что продукт синтеза с нее представляет собой полипептид, у которого адресный пептид располагается на N-конце, гистидиновый тэг - на С-конце и рекомбинантный аналог лактаптина - между ними. Адресный пептид, RL2 и гистидиновый тэг разделены между собой гистидиновыми линкерами, выступающими в роли гибких шарниров (рисунок 6.3). Гистидиновые линкеры обеспечивают подвижность функциональных доменов (адресный пептид, RL2 и гистидиновый тэг) относительно друг друга. Рисунок 6.3 – Схема строения последовательности ДНК, кодирующей слитый белок. Конструирование осуществляли путем встраивания нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, по сайтам рестрикции NcoI и BamHI, под промотор РНК-полимеразы фага Т7 (рисунок 6.4). Рисунок 6.4 – Карта рекомбинантнойплазмиды pET-15b. 73 6.2.1 Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок На первом этапе нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный аналог лактаптина (RL2), амплифицировали с плазмиды pGSD/RL2, используя праймеры RL2_Fи c1_RL2_R (таблица 6.1). Полученный продукт ПЦР-реакции (375 п.н.) очищали от белков фенол-хлороформной экстракцией и осаждали этиловым спиртом. Таблица 6.1 - Последовательности олигонуклеотидов Олигонуклеотид Последовательность (5`-3`) RL2_F AACCAGAAACAACCAGCATGCCATGAGAATGAT c1_RL2_R CATCATGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGATCCGCCGATGGT c1_RL2_F CATCATCCATGGGTTTGCATACTTCGGCT c1_R CTGGTTGTTTCTGGTTCGAACCTCACCAGCAA ClonN1_target GGTTTGCATACTTCGGCTACTAATCTGTATTTGCATGGTGGAGGTTCG c2_RL2_F CATCATCCATGGGCAGTGGTGTGTATAAGGTT c2_R TGGTTGTTTCTGGTTCGAACCTCCACCATGCT ClonN2_target AGTGGTGTGTATAAGGTTGCGTATGATTGGCAGCATGGTGGAGGTTCG На втором этапе были синтезированы нуклеотидные последовательности ClonN1_target и ClonN2_target, кодирующие фрагменты, отобранных с помощью фаговой пептидной библиотеки адресных пептидов (таблица 6.1). Последовательности ClonN1_target и ClonN2_target использовали в качестве матриц для амплификации последовательностей Т1 и Т2, кодирующих адресные пептиды. Нуклеотидные последовательности адресных пептидов были определены исходя из результатов секвенирования отобранных фаговых клонов 1 (GLHTSATNLYLH) и 2 (SGVYKVAYDWQH). Последовательности Т1 и Т2амплифицировали таким образом, чтобы на 3`-конце находился участок (15-16 нуклеотидов), идентичный 5`-концу ПЦРфрагменту (RL2), полученному на 1-м этапе. Последовательность Т1 (75 п.н.) амплифицировали, используя праймеры c1_RL2_F и c1_R,с матрицы ClonN1_target. Последовательность T2 (77 п.н.) амплифицировали, используя праймеры c2_RL2_F и c2_R, с матрицы ClonN2_target (таблица 6.1, рисунок 6.5). На третьем этапе единые (слитые) нуклеотидные последовательностиT1_RL2 (434 п.н.) и T2_RL2 (437 п.н.), кодирующие адресный пептид и лактаптин в единой рамке трансляции, получали с помощью ПЦР. Для получения последовательности T1_RL2на основе ПЦР-фрагментов Т1 и RL2 использовали праймеры c1_RL2_F иc1_RL2_R. Для 74 получения последовательности T2_RL2на основе ПЦР-фрагментов Т2 и RL2 использовали праймеры c2_RL2_F иc2_RL2_R. ПЦР-фрагменты T1_RL2 и T2_RL2 очищали с помощью набора QIAquick Gel Extraction в соответствии с рекомендациями производителя. Рисунок 6.5 – Схема получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих слитые белки. 6.2.2 Получение рекомбинантных плазмид pET-15b Векторная плазмида pET-15b и ПЦР-фрагменты T1_RL2, T2_RL2, кодирующие слитые белки, были обработаны эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI. После 75 обработки ферментами рестрикции ПЦР-фрагменты и линеаризованный вектор очищали электрофорезом в 1,5% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью коммерческого набора QIAquick Gel Extraction в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводили лигирование векторной ДНК pET-15b и фрагмента, кодирующего слитый белок. После трансформации лигазной смесью компетентных клеток E. сoli TOP10 отбирали клоны с фенотипом Amp+. Штамм E. сoli TOP10 является производным от штамма DH5α. Он не содержит ген РНК полимеразы Т7, имеет генотип F- mcrA Δ( mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ( araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG, где recA1 приводит к снижению случайной рекомбинации, а endA-- к снижению неспецифической эндонуклеазной активности. Благодаря этому штамм E.сoli TOP10 обладает высокой трансформационной активностью и обеспечивает высокую копийность плазмиды. Отсутствие гена РНК полимеразы Т7 сохраняет плазмиду транскрипционно не активной. Отдельные колонии трансформированных E.сoli нарабатывали для анализа плазмидной ДНК. Подтверждение наличия и правильности встройки гена слитого белка проводили с помощью ПЦР, используя праймеры Т7seq_F/Т7seq_R (рисунок 6.6), рестрикционного анализа (рисунок 6.7) и определения нуклеотидной последовательности встройки. Рисунок 6.6 – Электрофоретический анализ ПЦР-фрагментов, амплифицированных с рекомбинантых плазмид pET-15b_T1_RL и pET-15b_T2_RL с помощью праймеров Т7seq_F/Т7seq_R, подтверждающий наличие клонируемой вставки в 2% агарозном гел; Дорожки: 1. ДНК-маркер; 2. ПЦР-продукт с плазмиды pET-15b_T1_RL (582 п.н.); 3. ПЦРпродукт с плазмиды pET-15b_T2_RL (585 п.н.). 76 Рисунок 6.7 – Рестрикционный анализ ферментами NcoI и BamHI выделенной плазмидной ДНК; Дорожки: 1. Плазмида pET-15b_T1_RL; 2. Плазмида pET-15b_T2_RL; 3. ДНКмаркер. По результатам ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования выбирали плазмидные рекомбинантные ДНК, содержащие правильную структуру фрагмента, кодирующего слитый белок (рисунок 6.8). Нуклеотидная последовательность слитого белка Т1_RL2 77 Нуклеотидная последовательность слитого белка Т2_RL2 Рисунок 6.8 – Фрагменты последовательностей ДНК, кодирующие слитые белкиТ1_RL2 и Т2_RL2. Желтым цветом выделена последовательность промотора гена РНК полимеразы Т7. Красным цветом выделена последовательность, кодирующая адресный пептид. Светло-серым цветом выделены участки кодирования глициновых спейсеров. Голубым цветом выделена последовательность, кодирующая RL2. Темно-серым цветом выделена последовательность кодирования гистидинового тэга. Зеленым цветом выделена последовательность терминатора. Выводы: 1 Разработана методика получения генетических конструкций, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков, состоящих из отобранных пептидов и лактаптина, клетками штаммов-продуцентов. 2 Получены две рекомбинантные плазмиды pET-15b_T1_RL (6054 п.н.) и pET15b_T2_RL (6057 п.н.), кодирующие рекомбинантные слитые белки, состоящие из отобранных пептидов и лактаптина. Последовательность, кодирующая слитый белок, сконструирована таким образом, что продукт синтеза с нее представляет собой полипептид, у которого адресный пептид располагается на N-конце, гистидиновый тэг - на С-конце и рекомбинантный аналог лактаптина - между ними. Адресный пептид, RL2 и гистидиновый тэг разделены между собой гистидиновыми линкерами, выступающими в роли гибких шарниров. 3 Правильность встройки гена слитого белка была подтверждена методами ПЦР, рестрикционного анализа и определения нуклеотидной последовательности встройки. Разработанная методика получения генетических конструкций, обеспечивающих наработку рекомбинантных слитых белков, оформлена отдельным Приложением 2 к Научно-техническому отчету. 78 7 Разработка методики получения штаммов-продуцентов E. coli - продуцентов рекомбинантных слитых белков 7.1 Материалы и методы В работе использовали: соляную кислоту, гидроксид натрия, соли, спирт этиловый (химические реактивы марки хч, Россия); агарозу, акриламид 2К Standard Grade («Медиген», Россия); триптон, дрожжевой экстракт, агар (MP Biomedicals, Россия); краситель Coomassie brilliant blue G-250, дитиотреитол (ДТТ), 2-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия (SDS) (Sigma, США); глицин (AppliChem, Германия); N,N` метилен-бис-акриламид (ICN, США), персульфат аммония (Gerbu, Германия), ТЕМЕД N,N,N`,N`- тетраметилендиамин, краситель бромфеноловый синий, глицерол, ЭДТА (Хеликон, Россия), маркер молекулярной массы белков (Thermo Scientific, ЕС), изопропилтиогалактозид (ИПТГ) (Медиген, Россия). 7.1.1 Получение компетентных клеток E.coli BL21(DE3) Колонию с чашки с LB-агаром помещали в 5 мл SOB среды и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. 1 мл полученной культуры инокулировали в 100 мл предварительно нагретой до 37°С SOB среды и подращивали в шейкер-инкубаторе при 200 об/мин, температуре 37°С до оптической плотности 0,55-0,65 при длине волны 600 нм (OD600). Культуру охлаждали во льду, переносили в центрифужные стаканы и центрифугировали при 1000 g, 4°С в течение 5 мин. Супернатант удаляли, клетки помещали в лед и ресуспендировали в 10 мл охлажденного до 4°С FSB раствора. Суспензию инкубировали на льду в течение 15 мин и центрифугировали при 1000 g, 4°С в течение 5 мин. Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 1,8 мл охлажденного FSB раствора. Аккуратно помешивая, добавляли 65 мкл ДМСО. Полученную клеточную суспензию инкубировали на льду в течение 15 мин. Затем суспензию клеток расфасовывали в предварительно охлажденные пробирки по 50 мкл. Трансформированные клетки хранили при минус 70°С. Растворы: SOB среда: триптон - 20 мг/мл, дрожжевой экстракт - 5мг/мл, NaCl - 8,6 мМ, KCl - 2,5 мМ, MgCl2 - 10мМ; FSB раствор: CH3COOK - 10мМ, MnCl2 - 45мМ, KCl - 100 мМ, [Со (NH3)6]С13- 3 мМ, глицерин - 10% (об./об.). 79 7.1.2 Трансформация компетентных клеток E.coli BL21(DE3) Трансформацию компетентных клеток E.coli BL21(DE3) (в объеме 50 мкл) проводили после размораживания клеток во льду, затем добавляли 5 мкл лигазной смеси, аккуратно перемешивали и инкубировали 15 минут во льду. Пробирки помещали в термостат с температурой 37оC на 5 минут (тепловой шок), затем охлаждали до 0оC на льду. В пробирки добавляли 500 мкл LB среды, инкубировали в течение 1 часа при 37оC. После этого 30 мкл клеточной суспензии рассевали на чашки Петри, содержащие LB–агар с ампициллином (100 мкг/мл). Растворы: LB среда на 1 л: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 10 г; Антибиотики: Ар - 100 мг/мл. 7.1.3 Проведение индукции синтеза целевого белка Отдельную колонию трансформированных клеток выращивали в LB-среде с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и глюкозы (0,5%) в шейкер-инкубаторе при 170 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. Ферментацию (индукцию синтеза целевого белка) проводили в шейкер-инкубаторе в колбах-качалках вместимостью 750 мл, содержащих100 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) с плотностью засева 5% от объема среды (5 мл) выросшей культурой. По достижению оптической плотности культуры OD600 = 0,7-0,8 о.е. добавляли индуктор изопропилтиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,5 мМ и продолжали процесс ферментации в тех же условиях (170 об/мин, 37 °С). Для анализа содержания целевого белка анализировали аликвоты культуры до и после проведения индукции. 7.1.4 Анализ культуры на содержание целевого белка Аликвоту бактериальной культуры центрифугировали в течение 5 мин, при10 000 g для отделения биомассы. Супернатант удаляли, осадок бактерий ресуспендировали в лизирующем буфере. Лизат клеток прогревали в течение 5 мин при 96°С. Анализ лизатов клеток на содержание целевого белка проводили электрофорезом в денатурирующем 13% ПААГ. Растворы: лизирующий буфер (6хSDS sample buffer): 0,375M Tрис pH 6.8, 12% SDS, 60% глицерол, 0,6M ДТТ, 0,06% краситель бромфеноловый синий. 7.2 Результаты Для получения генетических конструкций, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных слитых белков (фьюжен-белков), состоящих из отобранных пептидов и 80 RL2, была выбрана векторная плазмида pET-15b (5708 п.н.). Были получены две рекомбинантные плазмиды pET-15b_T1_RL и pET-15b_T2_RL, кодирующие рекомбинантные слитые белки, состоящие из отобранных пептидов и RL2 (рисунок 7.1). Рисунок 7.1 – Карта рекомбинантной плазмиды pET-15b. Клонированная последовательность ДНК, кодирующая слитый белок, находится под контролем промотора Т7 РНК полимеразы. pET –система векторов устроена таким образом, что клонированный ген слитого белка находится под контролем промотора бактериофага Т7. Транскрипция гена слитого белка осуществляется индуцируемой Т7 РНК полимеразой, ген которой закодирован либо в геноме штамма-хозяина, либо в геноме бактериофага штамма-хозяина. Т7 РНК полимераза обладает свойствами высокой селективности и активности по отношению к ее промотору, что обеспечивает высокий уровень продукции целевого белка. Целевой продукт может составлять более 50% от общего пула белков клетки уже через несколько часов с момента индукции. Уровень экспрессии целевого белка можно варьировать, изменяя концентрацию индуктора, при этом снижение экспрессии приводит к тому, что большая часть целевого белка переходит в растворимую форму. Другим важным свойством системы является возможность сохранения гена целевого белка транскрипционно неактивным. Для этого рекомбинантной плазмидой pET, содержащей ген целевого белка, трансформируют штамм-хозяин, не содержащий ген РНК полимеразы Т7. Поскольку чужеродной целевой белок токсичен для E.сoli, транскрипционная неактивность гена плазмиды обеспечивает ее стабильность в штамме-хозяине, что 81 оздания реккомбинантн ной плазми иды и ее э ффективно ой наработтки. необбходимо наа этапах со Индуукция синттеза белкаа с pET-пллазмиды может м осущ ществлятьсяя заражени ием штамм махозяина бактерриофагом λCE6, λ в генооме которо ого закодир рован ген Т Т7 РНК пол лимеразы под п моторами λp λ Lи pI, ли ибо перено сом плазм миды pET в штамм-ххозяин, нессущий ген Т7 пром РНК К полимераазы под ко онтролем ппромотораа lacUV5. Во В втором м случае индукция, и к как праввило, осущеествляется при добавллении инду уктора ИПТ ТГ в бактерриальную культуру. к В качесстве штам мма-продуццента нами был вы ыбран штаамм E.сolii BL21(DE E3), содеержащий коопию гена РНК полим меразы Т7 (Т7 gene 1)). Штамм E E. Coli BL2 21(DE3) им меет pT gal (λ DE3) [dccm] ∆hsdS, λ DE3 = λ sBamH HIo ∆EcoR RI-B генотип fhuA22 [lon] omp int::((lacI::PlacU UV5::T7 geene1) i21 ∆ ∆nin5. Гено ом содержи ит фрагменнт ДНК баактериофагга λ DE3, в котором м закодиро ован ген laccI и ген РН НК полимер разы Т7 поод контролем промотора lacU UV5. Промотор lacU UV5 3’-коннцомперекр рывается с lac оперратором. В отсутстввии индууктора промотор lacU UV5 заблоккирован бел лком-репреессором, ко который синтезируетсся с гена lacI и связзывается с lac l оператоором, препяятствуя траанскрипциии. Векторы ы pET-систтемы, в тоом числе и использов ванный в рработе век ктор pET-115b, такж же содержатт ген lacI, кодирующ щий белок-р репрессор, и lac операатор, перек крывающийся с T7 промотороом. Поэтом му при отсуутствии инд дукции Т7 промотор ттакже не ак ктивен. Индуктоором трансскрипции с промотора lacUV5 и промоттора Т7 яввляется ИП ПТГ (изоп пропил-β-D D-1-тиогалаактопираноозид). ИПТГ явл ляется анналогом аллолактоозы, метааболита лакктозы. Наличие атомаа серы в ИП ПТГ предо отвращает рразложение индукторра в кулььтуральной среде (риссунок 7.2). Рисунок 7.2 7 – Молек кула изопрропил-β-D-1-тиогалактопиранозиида (ИПТГ Г). ИПТГ сввязываетсяя с белком--репрессоро ом, конфор рмация посследнего иззменяется, что привводит к ди иссоциации и белка-реппрессора от о операторного учасстка. Пром мотор lacU UV5 становится дооступным для посаадки РНК К полимеразы E. ссoli, котор рая начин нает тран нскрибироввать ген T7 gene 1. РНК-поли имераза Т7 7, в свою очередь, связывается с я с 82 2 промотором Т7, который также находится в доступном состоянии после добавления ИПТГ. Таким образом происходит активация транскрипции целевого гена (рисунок 7.3). Рисунок 7.3 – Схема регуляции синтеза целевого белка с рекомбинантной плазмиды pET штаммом-продуцентом, содержащим ген РНК полимеразы Т7 под индуцируемым промотором lacUV5 (pET System Manual, Novagen). Известно, что низкий базальный уровень транскрипции целевого гена у векторов pET-системы может поддерживаться дополнительным добавлением глюкозы в среду для культивирования [176]. Как только культура достигает стационарной фазы роста, она начинает использовать глюкозу в качестве источника углерода в первую очередь, затем используются другие альтернативные источники, например, глицерол. При метаболизме альтернативных источников углерода происходит активация фермента аденилатциклазы, которая катализирует превращение АТФ в циклическую форму - цАМФ (циклическую форму АМФ в данном случае также называют «сигналом клеточного голода»). Глюкоза является ингибитором фермента аденилатциклазы и активирует фосфодиэстеразу фермент, катализирующий превращение молекулы цАМФ в АМФ. Механизм действия цАМФ, изученный для дикого lac оперона, заключается в том, что цАМФ соединяется с белком, активирующим катаболизм (англ. САР, catabolism activating protein), при этом 83 образуется комплекс, который взаимодействует с промотором лактозного оперона, изменяет его конформацию и приводит к повышению сродства РНК-полимеразы к данному участку [177]. Если в клетке концентрация глюкозы достаточна для поддержания метаболизма, активация лактозного оперона не происходит. Поэтому для подавления преждевременного синтеза целевого белка, который потенциально может быть токсичен для штамма-хозяина, на первых этапах культивирования в культуральную среду добавляли 0,5% глюкозы. 7.2.1 Анализ колоний штаммов продуцентов на содержание целевого белка Рекомбинантные штаммы-продуценты E.сoli BL21(DE3)/pT1_RL и BL21(DE3)/pT2_RL получали трансформацией реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) плазмидами pET-15b_T1_RLи pET-15b_T2_RL, соответственно. В качестве селективной среды для отбора трансформированных клеток использовали LB-агар с добавлением ампициллина (100 мкг/мл). Выросшие колонии трансформированных клеток рассевали на агаризованную среду. Отдельные колонии клеток отбирали и анализировали на содержание в них целевого белка. Аминокислотные составы слитых белков представлены ниже: Длина белка T1_RL: 137аминокислот Брутто-формула: C714H1072N208O190S3 Молекулярная масса: 15705.71Да (с учетом естественного содержания изотопов) Изоэлектрическая точка: pI =10.08 Состав: аминокислота количество % A 9 6.57 C 1 0.73 G 7 5.11 V 7 5.11 L 6 4.38 I 10 7.3 M 2 1.46 S 6 4.38 T 7 5.11 F 2 1.46 Y 13 9.49 W 0 0 D 2 1.46 84 E 2 1.46 N 10 7.3 Q 8 5.84 H 12 8.76 K 5 3.65 R 8 5.84 P 20 14.6 Длина белка T2_RL: 138аминокислот Брутто-формула: C725H1077N209O192S3 Молекулярная масса: 15888.88Да (с учетом естественного содержания изотопов) Изоэлектрическая точка: pI =10.02 Состав: аминокислота количество % A 9 6.53 C 1 0.73 G 8 5.8 V 9 6.53 L 3 2.18 I 10 7.25 M 2 1.45 S 6 4.35 T 5 3.63 F 2 1.45 Y 14 10.15 W 1 0.73 D 3 2.18 E 2 1.45 N 9 6.53 Q 9 6.53 H 11 7.98 K 6 4.35 R 8 5.8 P 20 14.5 85 Для анализа содержания целевого белка были взята аликвоты культуры до и после проведения индукции. Лизаты клеток на содержание целевого белка анализировали электрофорезом в денатурирующем ПААГ (рисунок 7.4). А кДа 250,0 150,0 100,0 70,0 50,0 40,0 1 2 3 4 Б кДа 1 2 3 4 116,0 66,2 45,0 35,0 30,0 25,0 20,0 18,4 15,0 14,4 10,0 Рисунок 7.4 – Анализ колоний E. сoli на содержание в них целевого белка в 13% ПААГ в присутствии 2-меркаптоэтанола; Дорожки: 1 – набор маркерных белков, 2 – лизат клеток E. coli до проведения индукции, 3 – лизат клеток E.сoli через 1 ч. с момента проведения индукции, 4 – лизат клеток E. coli через 2 ч. с момента проведения индукции. А. Анализ колонии E. coli BL21(DE3)/pT1_RL. Б. Анализ колонии E. coli BL21(DE3)/pT2_RL. Исходя из полученных данных (рисунок 7.4), видно, что до момента проведения индукции видимых следов целевого белка не наблюдали, в то время как уже спустя час с момента проведения индукции ИПТГ происходит наработка целевого рекомбинантного белка. Подлинность синтезированного белка подтверждали Вестерн блотт анализом антиRL2 антителами (рисунок 7.5). 86 Рисунок 7.5 – Вестерн блотт анализ; Дорожки: 1 – набор маркерных белков, 2 – RL2, 3 – лизат клеток E. coli BL21(DE3)/pT1_RL, 4 – лизат клеток E. coli BL21(DE3)/pT2_RL. Выводы: 1 Разработана методика получения штаммов-продуцентов E. сoli – продуцентов рекомбинантных слитых белков. 2 Получены два штамма E. coli BL21(DE3)/pT1_RL и BL21(DE3)/pT2_RL. Оба штамма синтезируют слитый белок, состоящий из отобранных ранее опухолеспецифических пептидов и RL2. Разработанная методика получения штаммов-продуцентов рекомбинантных слитых белков оформлена отдельным Приложением 3 к Научно-техническому отчету. 87 8 Закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред (для наработки штаммов-продуцентов рекомбинантных слитых белков) При выполнении 1 этапа проекта за счет средств Индустриального партнера ООО «ИРВИН 2» была проведена закупка оборудования для материально технического обеспечения работ по проекту, был приобретен биореактор BIOSTAT® CultiBag STR 200 L, необходимый для получения рекомбинантных белков, в том числе экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин», разрабатываемых в рамках проекта. BIOSTAT® CultiBag STR 200 L - одноразовый биореактор с перемешивающим устройством для культивирования больших партий. Полностью одноразовая масштабируемая система с рабочим объёмом 200 л. Области применения • задачи, связанные с культурами клеток • промышленные и научные исследования • промышленные разработки • оптимизация процесса производства • производство пилотных партий • культивирование посевного материала для промышленных биореакторов • промышленное производство Одноразовые ферментеры / биореакторы имеют ряд преимуществ в использовании по сравнению с многоразовыми биореакторами, так как уменьшаются затраты на обслуживание оборудования, а также уменьшаются или исчезают затраты на: • стерилизацию • очистку • использование воды для инъекций • уменьшение времени и количества трудозатрат на обслуживание, соответствие валидационным требованиям • уменьшается риск перекрёстной контаминации В качестве опорного каркаса CultiBag STR для установки мешков используется корпус из нержавеющей стали. Для устранения риска контаминации, возникающего при использовании пробоотборников, в системе используются предварительно установленные и простерилизованные одноразовые датчики. CultiBag STR представляет собой пластичную ёмкость для культивирования с возможностью выбора широкого диапазона конструкций, соединений, мешалок и 88 барботеров, предварительно установленных в мешок. Система привода соединяется с мешалкой посредством электромагнитной связи, что позволяет системе оставаться закрытой и стерильной на протяжении всего процесса культивирования. При увеличении объёмов геометрия мешка и соотношение сторон остаются одинаковыми, что позволяет с легкостью транспортировать вещества из традиционных стальных танков в одноразовые системы. Одноразовые биореакторы применяются в производстве моноклональных антител, рекомбинантных белков и вакцин. Внебюджетное финансирование проекта осуществлялось ООО «ИРВИН 2» за счет собственных средств путем инвестирования ООО «Фабрика биополимеров» - инновационного предприятия по организации опытного производства противоопухолевых препаратов, созданного ООО «ИРВИН 2» и ИХБФМ СО РАН в соответствие с ФЗ-217. Внебюджетные вложения ООО «ИРВИН 2» при выполнении 1 этапа работ составили 13 659 636,16 руб. Согласно условиям Соглашения объем вложенных внебюджетных средств на 1 этапе выполнения работ должен составить 8 670 000 рублей. Поскольку оплата счетов и поставка реактора были проведены в декабре 2014 г. стоимость заказанного оборудования резко возросла из-за изменения курса валют. Документы, подтверждающие внебюджетное финансирование проекта приложены к отчету. 89 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время в большинстве развитых стран онкологические заболевания занимают второе место среди причин смерти. По оценкам Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания к 2020 году выйдут на первое место в мире по смертности, обогнав при этом «традиционного лидера» – сердечнососудистые заболевания. Усовершенствование методов лечения и разработка новых средств терапии онкологических заболеваний, специфичных по отношению в клеткам опухоли и не повреждающих здоровые клетки организма, являются приоритетными направлениями развития молекулярной онкологии. Целью данного проекта является создание малотоксичных бифункциональных терапевтических агентов, состоящих из цитотоксического белка лактаптина и опухольадресованных пептидов, обеспечивающих направленную элиминацию раковых клеток. Разработанные при проведении проекта противоопухолевые терапевтические агенты могут являться основой для создания фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм противоопухолевых лекарственных средств и будут востребованы фармацевтической промышленностью и практическим здравоохранением. В результате выполнения 1 этапа работ по Соглашению о предоставлении субсидии были решены следующие задачи: 1 Проведен аналитический обзор информационных источников, дающий представление о современном состоянии исследований в области противоопухолевых препаратов белковой при-роды и рассматривающий перспективные стратегии разработки препаратов направленного дей-ствия, обеспечивающих специфическое воздействие на злокачественные новообразования. 2 Проведены патентные исследования, целью которых являлись исследования технического уровня и тенденций развития противоопухолевых средств на основе слитых белков «адресный пептид - апоптоз-индуцирующий белок». К тенденциям развития объекта исследования относятся следующие: разработка новых противоопухолевых препаратов на основе апоптоз-индуцирующих белков; расширение спектра опухольадресованных пептидов; создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов слитых белков, содержащих противоопухолевый апоптоз-индуцирующий белок и опухольадресованный пептид; создание готовых противоопу-холевых лекарственных форм на основе слитых белков (апоптоз-индуцирующего белка и опу-холь-адресованного пептида). 90 3 Разработана методика отбора опухоль-адресованных пептидов в системах in vitro и in vivo, позволяющая отбирать из пептидной фаговой библиотеки пептиды, специфически распознающие рецепторные структуры мышиных опухолей in vivo и раковых клеток in vitro. 4 Проведен отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на культурах раковых клеток гепатокарциномы А1 (ГА-1) и аденокарцинома легкого (АЛ) мыши. Отобраны два фаговых клона, несущих пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH, которые специфически связываются с рецепторными структурами раковых клеток обеих линий. 5 Проведен отбор опухоль-адресованных пептидов in vivo на мышиной опухолевой модели ГA-1. Отобраны два фаговых клона, несущие пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH. Эти же клоны были отобраны при селекции in vitro на раковых клетках ГА-1 и АЛ. 6 Показано, что экспериментальные фаговые клоны, экспрессирующие пептиды GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH, специфически распределяются по органам (опухоль, печень, легкое) экспериментальных животных и накапливаются в значительном количестве в опухолевой ткани гепатомы ГА-1, аденокарциномы легких, Меланомы Б16, карциномы Кребса и аденокарциномы легких Льюиса через 24 часа после внутривенного введения. Концентрация фаговых клонов в 10-100 раз выше в зависимости от типа опухоли, чем в контрольных органах. 6 Разработана методика получения генетических конструкций, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин». Генетические конструкции получены на основе вектора Pet15b. При синтезе слитого белка последовательность опухоль-адресованного пептида находится на N-конце белка. Для выделения слитых белков из биомассы клеток-продуцентов в С-конец введен полигистидиновый тракт. 7 Разработана методика получения продуцентов рекомбинантных слитых белков. Рекомбинантные штаммы E. coli получены на основе реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к ампицилину. 8 За счет средств индустриального партнера проекта ООО «ИРВИН 2» проведена закупка оборудования для материально-технического обеспечения работ по проекту, приобретен одноразовый биореактор BIOSTAT® CultiBag STR 200 L. Внебюджетные вложения ООО «ИРВИН 2» при выполнении 1 этапа работ составили 13 659 636,16 руб. 91 Информация о проекте размещена на официальном сайте ИХБФМ СО РАН в сети интернет по адресу http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/ru/science/gk. Таким образом, требования технического задания и плана-графика, заявленные на 1 этап «Выбор направления исследований. Получение штаммов-продуцентов рекомбинантных слитых белков» работ по Соглашению о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.607.21.0063 по теме «Создание адресных бифункциональных агентов на основе цитотоксического белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов для направленной элиминации раковых клеток», выполнены полностью. 92 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Соухами Р., Тобиас Дж. Рак и его лечение. – М.: Бином, 2009. – 440 с. 2. Dimberg L.Y., Anderson C.K., Camidge R., Behbakht K., Thorburn A., Ford H.L. On the TRAIL to successful cancer therapy? Predicting and counteracting resistance against TRAILbased therapeutics // Oncogene. – 2013. – V. 32. – P. 1341–50. 3. Некипелая В.В., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. Лактаптин – белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы MCF-7 // Доклады Академии Наук. – 2008. – Т. 419. – С. 268–271. 4. Власов В.В., Рихтер Семенов Д.В. Некипелая В.В., Кулигина Е.В. Потапенко М.О. «Пептид, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека». 2008. Патент РФ № 2317304. 5. Тикунова Н.В., Семенов Д.В., Бабкина И.Н., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Фомин А.С., Матвеева В.А., Матвеев А.Л., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом каппа-казеина человека, и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам. // Патент РФ № 2401307, от 10.10.2010. 6. Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their effect on cultured human cells // The Protein Journal. – 2010. – V. 29. – P. 174–180. 7. Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Richter V.A. A novel pro-apoptic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice models. // Biochimie. – 2012. – V. 94. – P. 2467–2474. 8. Коваль О.А., Каледин В.И., Кулигина Е.В., Семенов Д.В., Фомин А.С., Потапенко М.О., Рихтер В.А. Способ лечения опухолей у млекопитающих. // 2012. Патент РФ № 2461566. 9. Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S., Semenov D.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V., Zavjalov E.L., Richter V.A. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts // PLoS One. – 2014. – V. 9. – P. e93921. 10. Bábíčková J., Tóthová Ľ., Boor P., Celec P. In vivo phage display – a discovery tool in molecular biomedicine // Biotechnol Adv. – 2013. – V. 31. – P. 1247–59. 11. Bakhshinejad B., Karimi M., Sadeghizadeh M. Bacteriophages and medical oncology: targeted gene therapy of cancer // Med Oncol. – 2014. – V. 31. – P. 110. 93 12. Hamzeh-Mivehroud M., Alizadeh A.A., Morris M.B., Church W.B., Dastmalchi S. Phage display as a technology delivering on the promise of peptide drug discovery. Drug Discov. Today – 2013. – V.18. – P. 1144–57. 13. Stevens E.A., Rodriguez C.P. Genomic medicine and targeted therapy for solid tumors. J. Surg. Oncol. – 2014. – doi: 10.1002/jso.23699. 14. Vigevani L., Valcárcel J. A splicing magic bullet // Science Molecular biology. – 2014. – V. 345. – P. 624-625. 15. Ruoslahti E. Specialization of tumour vasculature // Nat. Rev. Cancer. – 2002. – V. 2. – P. 83–90. 16. Bakhshinejad B., Sadeghizadeh M. Bacteriophages as vehicles for gene delivery into mammalian cells: prospects and problems // Expert. Opin. Drug Deliv. – 2014. – V. 11. – P. 1561-74. 17. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface // Science. – 1985. – V. 228. – P. 1315–7. 18. Rakonjac J., Bennett N.J., Spagnuolo J., Gagic D., Russel M. Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications // Curr. Issues Mol. Biol. – 2011. – V. 13. – P. 51–76. 19. Marvin D.A., Symmons M.F., Straus S.K. Structure and assembly of filamentous bacteriophages // Prog. Biophys. Mol. Biol. – 2014. – V. 114. – P. 80–122. 20. Rakonjac J., Feng Jn., Model P. Filamentous phage are released from the bacterial membrane by a two-step mechanism involving a short C-terminal fragment of pIII. // J. Mol. Biol. – 1999. – V. 289. – P. 1253–65. 21. Hoffmann-Thoms S., Weininger U., Eckert B., Jakob R.P., Koch J.R., Balbach J., Schmid F.X. Initiation of phage infection by partial unfolding and prolylisomerization // J. Biol. Chem. – 2013. – V. 288. – P. 12979–91. 22. Zeri A.C., Mesleh M.F., Nevzorov A.A., Opella S.J. Structure of the coat protein in fd filamentous bacteriophage particles determined by solid-state NMR spectroscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2003. – V. 100. – P. 6458–63. 23. Marvin D.A., Welsh L.C., Symmons M.F., Scott W.R., Straus S.K. Molecular structure of fd (f1, M13) filamentous bacteriophage refined with respect to X-ray fibre diffraction and solidstate NMR data supports specific models of phage assembly at the bacterial membrane // J. Mol. Biol. – 2006. – V.355. – P. 294–309. 24. Iannolo G., Minenkova O., Petruzzelli R., Cesareni G. Modifying filamentous phage capsid: limits in the size of the major capsid protein // J. Mol. Biol. – 1995. – V. 248. – P. 835–44. 94 25. Kay B.K., Kasanov J., Yamabhai M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries // Methods – 2001. – V. 24. – P. 240–6. 26. Bratkovic T. Progress in phage display: evolution of the technique and its application // Cell Mol. Life Sci. – 2010. – V. 67. – P. 749–67. 27. Gupta A., Shrivastava N., Grover P., Singh A., Mathur K., Verma V., Kaur C., Chaudhary V.K. A novel helper phage enabling construction of genome-scale ORF-enriched phage display libraries // PLoS One. – 2013. – V. 8. – P. e75212. 28. Prisco A., De Berardinis P. Filamentous bacteriophage fd as an antigen delivery system in vaccination // Int. J. Mol. Sci. – 2012. – V. 13. – P. 5179–94. 29. Sartorius R., Bettua C., D'Apice L., Caivano A., Trovato M., Russo D., Zanoni I., Granucci F, Mascolo D., Barba P., Del Pozzo G., De Berardinis P. Vaccination with filamentous bacteriophages targeting DEC-205 induces DC maturation and potent anti-tumor T-cell responses in the absence of adjuvants // Eur. J. Immunol. – 2011. – V. 41. – P. 2573–84. 30. Samoylova T.I., Norris M.D., Samoylov A.M., Cochran A.M., Wolfe K.G., Petrenko V.A., Cox N.R. Infective and inactivated filamentous phage as carriers for immunogenic peptides // J. Virol. Methods. – 2012. – V. 183. – P. 63–8. 31. Parmley S., Smith G. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes // Gene. – 1988. – V. 73. – P. 305–318. 32. Ayat H., Burrone O.R., Sadghizadeh M., Jahanzad E., Rastgou N., Moghadasi S., Arbabi M. Isolation of scFv antibody fragments against HER2 and CEA tumor antigens from combinatorial antibody libraries derived from cancer patients // Biologicals. – 2013. – V. 41. – P. 345–54. 33. Brunet E., Chauvin C., Choumet V., Jestin J.L. A novel strategy for the functional cloning of enzymes using filamentous phage display: the case of nucleotidyltransferases // Nucleic Acids Res. – 2002. – V. 30. – E. 40. 34. Sundell G.N., Ivarsson Y. Interaction Analysis through Proteomic Phage Display // Biomed. Res. Int. – 2014. – V. 2014. – doi: 10.1155/2014/176172. 35. Azzazy H.M., Highsmith W.E.Jr. Phage display technology: clinical applications and recent innovations // Clin. Biochem. – 2002. – V. 35. – P. 425–45. 36. Kang A.S., Barbas C.F., Janda K.D., Benkovic S.J., Lerner R.A. Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 1991. – V. 88. – P. 4363–6. 37. Solforosi L., Mancini N., Canducci F., Clementi N., Sautto G.A., Diotti R.A., Clementi M., Burioni R. A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial 95 libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments // New Microbiol. – 2012. – V. 35. – P. 289–94. 38. Tang Y., Jiang N., Parakh C., Hilvert D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology // J. Biol. Chem. – 1996. – V. 271. – P. 15682–6. 39. Zuhaida A.A., Ali A.M., Tamilselvan S., Alitheen N.B., Hamid M., Noor A.M., Yeap S.K. Construction of single-chain variable fragment antibodies against MCF-7 breast cancer cells // Genet. Mol. Res. – 2013. – V. 12. – P. 5547–59. 40. Hosseini H., Rajabibazl M., Ebrahimizadeh W., Dehbidi G.R. Inhibiting angiogenesis with human single-chain variable fragment antibody targeting VEGF // Microvasc. Res. – 2014. – V. 97C. – P. 13–18. 41 Тикунова Н.В., Морозова В.В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Acta naturae. – 2009. – № 3. – C. 22–31. 42. Shahi B., Mousavi Gargari S.L., Rasooli I., RajabiBazl M., Hoseinpoor R. Random mutagenesis of BoNT/E Hcnanobody to construct a secondary phage-display library // J. Appl. Microbiol. – 2014. – V. 117. – P. 528–36. 43. Alves P.T., Fujimura P.T., Morais L.D., Goulart L.R. Revisiting the CD14: Epitope mapping by Phage Display // Immunobiology. – 2014. – doi: 10.1016/j.imbio.2014.07.002. 44. Goldman E., Walper S. Phage-displayed single domain antibodies as recognition elements // Methods Mol. Biol. – 2014. – V. 1108. – P. 201–10. 45. Rhyner C., Weichel M., Flückiger S., Hemmann S., Kleber-Janke T., Crameri R. Cloning allergens via phage display // Methods. – 2004. – V. 32. – P. 212–8. 46. Kügler J., Zantow J., Meyer T., Hust M. Oligopeptide m13 phage display in pathogen research // Viruses. – 2013. – V. 16. – P. 2531–45. 47. Van Dorst B., Mehta J., Rouah-Martin E., Somers V., De Coen W., Blust R., Robbens J. cDNA phage display as a novel tool to screen for cellular targets of chemical compounds // Toxicol. In Vitro. – 2010. – V. 24. – P. 1435–40. 48. Fagerlund A., Myrset A.H., Kulseth M.A. Construction of a filamentous phage display peptide library // Methods Mol. Biol. – 2014. – V. 1088. – P. 19–33. 49. Derda R., Tang S.K., Li S.C., Ng S., Matochko W., Jafari M.R. Diversity of phage-displayed libraries of peptides during panning and amplification // Molecules – 2011. – V. 21. – P. 1776– 803. 50. Noren K.A., Noren C.J. Construction of high-complexity combinatorial phage display peptide libraries // Methods. – 2001. – V. 23. – P. 169–78. 96 51. Lang Q., Wang F., Yin L., Liu M., Petrenko V.A., Liu A. Specific probe selection from landscape phage display library and its application in enzyme-linked immunosorbentassay of free prostate-specific antigen // Anal. Chem. – 2014. – V. 86. – P. 2767-74. 52. Bedi D., Gillespie J.W., Petrenko V.A. Selection of pancreatic cancer cell-binding landscape phages and their use in development of anticancer nanomedicines // Protein Eng. Des. Sel. – 2014. – V. 27. – P. 235–43. 53. Guo Z., Wang X., Li H., Gao Y. Screening E3 substrates using a live phage display library // PLoS One. – 2013. – V. 8. – P. e.76622. 54. Kuramoto K., Yamasaki R., Shimizu Y., Tatsukawa H., Hitomi K. Phage-displayed peptide library screening for preferred human substrate peptide sequences for transglutaminase 7 // Arch. Biochem. Biophys. – 2013. – V. 537. – P. 138–43. 55. Frascione N., Codina-Barrios A., Bassindale A.R., Taylor P.G. Enhancing in vitro selection techniques to assist the discovery, understanding and use of inorganic binding peptides // Dalton. Trans. – 2013. – V. 42. – P. 10337–46. 56. Wang W., Chen X., Li T., Li Y., Wang R., He D., Luo W., Li X., Wu X. Screening a phage display library for a novel FGF8b-binding peptide with anti-tumor effect on prostate cancer // Exp. Cel.l Res. – 2013. – V. 319. – P. 1156–64. 57. Shadidi M., Sioud M. Identification of novel carrier peptides for the specific delivery of therapeutics into cancer cells // FASEB J. – 2003. – V. 17. – P. 256-8. 58. Pilch J., Brown D.M., Komatsu M., Järvinen T.A., Yang M., Peters D., Hoffman R.M., Ruoslahti E. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2006. – V. 103. – P. 2800–4. 59. Pasqualini R., Ruoslahti E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries // Nature. – 1996. – V. 380. – P. 364–6. 60. Wan X.M., Chen Y.P., Xu W.R., Yang W.J., Wen L.P. Identification of nose-to-brain homing peptide through phage display // Peptides. – 2009. – V. 30. – P. 343–50. 61. Chen H., Chen C.C., Acosta C., Wu S.Y., Sun T., Konofagou E.E. A new brain drug delivery strategy: focused ultrasound-enhanced intranasal drug delivery // PLoS One. – 2014. – V. 9. –P. e108880. 62. Akita N., Maruta F., Seymour L.W., Kerr D.J., Parker A.L., Asai T., Oku N., Nakayama J., Miyagawa S.Identification of oligopeptides binding to peritoneal tumors of gastric cancer // Cancer Sci. – 2006. – V. 97. – P. 1075–81. 97 63. Chen Y., Shen Y., Guo X., Zhang C., Yang W., Ma M., Liu S., Zhang M., Wen L.P. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display // Nat. Biotechnol. – 2006. – V. 24. – P. 455–60. 64. Lee N.K., Kim H.S., Kim K.H., Kim E.B., Cho C.S., Kang S.K., Choi Y.J. Identification of a novel peptide ligand targeting visceral adipose tissue via transdermal route by in vivo phage display // J. Drug Target. – 2011. – V. 19. – P. 805–13. 65. Zou J., Dickerson M.T., Owen N.K., Landon L.A., Deutscher S.L. Biodistribution of filamentous phage peptide libraries in mice // Mol. Biol. Rep. – 2004. – V. 31. – P. 121–9. 66. Molenaar T.J., Michon I., de Haas S.A., van Berkel T.J., Kuiper J., Biessen E.A. Uptake and processing of modified bacteriophage M13 in mice: implications for phage display // Virology. – 2002. – V. 293. – P. 182–91. 67. Arap W., Kolonin M.G., Trepel M., Lahdenranta J., Cardó-Vila M., Giordano R.J., Mintz P.J., Ardelt P.U., Yao V.J., Vidal C.I., Chen L., Flamm A., Valtanen H., Weavind L.M., Hicks M.E., Pollock R.E., Botz G.H., Bucana C.D., Koivunen E., Cahill D., Troncoso P., Baggerly K.A., Pentz R.D., Do K.A., Logothetis C.J., Pasqualini R. Steps toward mapping the human vasculature by phage display // Nat. Med. – 2002. – V. 8. – P. 121–7. 68 Zurita A.J., Troncoso P., Cardó-Vila M., Logothetis C.J., Pasqualini R., Arap W. Combinatorial screenings in patients: the interleukin-11 receptor alpha as a candidate target in the progression of human prostate cancer // Cancer Res. – 2004. – V. 64. – P. 435–9. 69. Staquicini F.I., Cardó-Vila M., Kolonin M.G., Trepel M., Edwards J.K., Nunes D.N., Sergeeva A., Efstathiou E., Sun J., Almeida N.F., Tu S.M., Botz G.H., Wallace M.J., O'Connell D.J., Krajewski S., Gershenwald J.E., Molldrem J.J., Flamm A.L., Koivunen E., Pentz R.D., Dias-Neto E., Setubal J.C., Cahill D.J., Troncoso P., Do K.A., Logothetis C.J., Sidman R.L., Pasqualini R., Arap W. Vascular ligand-receptor mapping by direct combinatorial selection in cancer patients // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2011. – V. 108. – P. 18637–42. 70. Laakkonen P., Vuorinen K. Homing peptides as targeted delivery vehicles // Integr. Biol. (camb). – 2010. – V. 2. – P. 326–37. 71. Gao H., Xiong Y., Zhang S. RGD and Interleukin-13 Peptide Functionalized Nanoparticles for Enhanced Glioblastoma Cells and Neovasculature Dual Targeting Delivery and Elevated Tumor Penetration // Mol Pharm. – 2014. – V. 11. – P. 1042–52. 72. Laakkonen P., Porkka K., Hoffman J.A., Ruoslahti E. A tumor-homing peptide with a targeting specificity related to lymphatic vessels // Nat. Med. – 2002. – V. 8. – P. 751–5. 98 73 Bai F., Liang J., Wang J., Shi Y., Zhang K., Liang S., Hong L., Zhai H., Lu Y., Han Y., Yin F., Wu K., Fan D. Inhibitory effects of a specific phage-displayed peptide on high peritoneal metastasis of gastric cancer // J. Mol. Med. (Berl). – 2007. – V. 85. – P. 169–80. 74. Dai X., Cai C., Xiao F., Xiong Y., Huang Y., Zhang Q., Xiang Q., Lou G., Lian M., Su Z., Zheng Q. Identification of a novel aFGF-binding peptide with anti-tumor effect on breast cancer from phage display library // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2014. V. 445. – P. 795–801. 75. Wang H., Wang H., Liang J., Jiang Y., Guo Q., Peng H., Xu Q., Huang Y. Cell-Penetrating Apoptotic Peptide/p53 DNA Nanocomplex as Adjuvant Therapy for Drug-Resistant Breast Cancer // Mol. Pharm. – 2014. – V. 11. – P. 3352–60. 76. Yang Z., Xiang B., Dong D., Wang Z., Li J., Qi X. Dual Receptor-Specific Peptides Modified Liposomes as VEGF siRNA Vector for Tumor-Targeting Therapy // Curr. Gene Ther. – 2014. V. 14. – P. 289–99. 77. Grifman M., Trepel M., Speece P., Gilbert L.B., Arap W., Pasqualini R., Weitzman M.D. Incorporation of tumor-targeting peptides into recombinant adeno-associated virus capsids // Mol. Ther. – 2001. – V. 3. – P. 964–75. 78. Shoae-Hassani A., Keyhanvar P., Seifalian A.M., Mortazavi-Tabatabaei S.A., Ghaderi N., Issazadeh K., Amirmozafari N., Verdi J. λ Phage nanobioparticle expressing apoptin efficiently suppress human breast carcinoma tumor growth in vivo // PLoS One. – 2013. – V. 8. – P. e79907. 79. Larocca D., Burg M.A., Jensen-Pergakes K., Ravey E.P., Gonzalez A.M., Baird A. Evolving phage vectors for cell targeted gene delivery // Curr. Pharm. Biotechnol. – 2002. – V. 3. – P. 45– 57. 80. Larocca D., Kassner P.D., Witte A. et al. Gene transfer to mammalian cells using genetically targeted filamentous bacteriophage // FASEB J. – 1999. – V. 13. – P. 727–34. 81. Liu X., Wang W., Samarsky D., Liu L., Xu Q., Zhang W., Zhu G., Wu P., Zuo X., Deng H., Zhang J., Wu Z., Chen X., Zhao L., Qiu Z., Zhang Z., Zeng Q., Yang W., Zhang B., Ji A. Tumor-targeted in vivo gene silencing via systemic delivery of cRGD-conjugated siRNA // Nucleic Acids Res. – 2015. – V. 42. – P. 11805–17. 82. Ji S., Zheng Y., Czerwinski A., Valenzuela F., Pennington M., Liu S. FITC-Conjugated Cyclic RGD Peptides as Fluorescent Probes for Staining Integrin αvβ3/αvβ5 in Tumor Tissues // Bioconjug. Chem. – 2014. – V. 25. – P. 1925–41. 83. Reubi J.C., Maecke H.R. Peptide-based probes for cancer imaging // J. Nucl. Med. – 2008. – V. 49. – P. 1735–8. 99 84. Haubner R., Maschauer S., Prante O. PET radiopharmaceuticals for imaging integrin expression: tracers in clinical studies and recent developments // Biomed. Res. Int. – 2014. – doi: 10.1155/2014/871609. 85. Li G., Wang X., Zong S., Wang J., Conti P.S., Chen K. MicroPET Imaging of CD13 Expression Using a 64Cu-Labeled Dimeric NGR Peptide Based on Sarcophagine Cage // Mol. Pharm. – 2014. – V. 11. – P. 3938–46. 86. Ellerby H.M., Arap W., Ellerby L.M. et al. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides // Nature medicine – 1999. – V. 5. – P. 1032–1038. 87. Cieslewicz M., Tang J., Yu J.L. et al. Targeted delivery of proapoptotic peptides to tumorassociated macrophages improves survival // PNAS. – 2013. – V.10. – P.15919–24. 88. Mantovani A., Allavena P., Sica A., Balkwill F. Cancer-related inflammation // Nature. – 2008. – V. 454 – P. 436–44. 89. Hoffman J.A., Giraudo E., Singh M. et al. Progressive vascular changes in a transgenic mouse model of squamous cell carcinoma // Cancer cell. – 2003. – V. 4. – P. 383–391. 90. Svensen N., Walton J.G., Bradley M. Peptides for cell-selective drug delivery // Trends Pharmacol Sci. – 2012. – V. 33. – P. 186–92. 91. Sugahara K.N., Teesalu T., Karmali P.P. Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors // Cancer Cell. – 2009. – V. 16. – P. 510–20. 92. Wang X., Li S., Shi Y. The development of site-specific drug delivery nanocarriers based on receptor mediation // J. Control. Release. – 2014. – doi: 10.1016/j.jconrel.2014.05.028. 93. Stupp R., Weller M. 2010: Neuro-oncology is moving! // Curr. Opin. Neurol. – 2010. – V. 23. – P. 553–5. 94. Corti A., Ponzoni M. Tumor vascular targeting with tumor necrosis factor alpha and chemotherapeutic drugs // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2004. – V. 1028. – P. 104–12. 95. D'Onofrio N., Caraglia M., Grimaldi A., Marfella R., Servillo L., Paolisso G., Balestrieri M.L. Vascular-homing peptides for targeted drug delivery and molecular imaging: Meeting the clinical challenges // Biochim. Biophys. Acta. – 2014. – V. 1846. – P. 1–12. 96. Масычева В.И., Белкина А.О., Даниленко Е.Д., Сысоева Г.М. Некоторые аспекты клинических испытаний препаратов фактора некроза опухолей // Рос. биотерапевтж. – 2010. – Т. 9. № 4. – С. 39–43. 97. Гамалей С.Г., Батенева А.В., Урманцева З.Ф., Сысоева Г.М., Маркус Я.В., Даниленко Е.Д., Михайлова В.К., Волосникова Е.А., Левагина Г.М., Масычева В.И. Лекарственная форма фактора некроза опухоли альфа для местного применения // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2012. – Т. 85. № 3. Ч. 2. – С. 264–266. 100 98. Wiley S.R., Schooley K., Smolak P.J., Din W.S., Huang C.P., Nicholl J.K., Sutherland G.R., Smith T.D., Rauch C., Smith C.A., etal. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis // Immunity. – 1995. – V. 3. N 6. – P. 673–682. 99. Mahalingam D., Oldenhuis C.N., Szegezdi E., Giles F.J., de Vries E.G., de Jong S., Nawrocki S.T. Targeting TRAIL towards the clinic // Current drug targets. – 2011. – V. 12. N 14. – P. 2079–2090. 100. Maksimovic-Ivanic D., Stosic-Grujicic S., Nicoletti F., Mijatovic S. Resistance to TRAIL and how to surmount it // Immunologic research. – 2012. – V. 52. № 1-2. – P. 157-168. 101. Holoch P.A., Griffith T.S. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL): a new path to anti-cancer therapies // European journal of pharmacology. – 2009. – V. 625. № 1–3. – P.63–72. 102. Khaider N.G., Lane D., Matte I., Rancourt C., Piché A. Targeted ovarian cancer treatment: the TRAILs of resistance // Am. J. Cancer Res. – 2012. – V. 2. – P. 75–92. 103. Wang F., Lin J., Xu R. The Molecular Mechanisms of TRAIL Resistance in Cancer Cells: Help in Designing New Drugs // Curr. Pharm. Des. – 2014. – V. 20. – P. 6714–22. 104. Cao W., Li X., Zheng S., Zheng W., Wong Y.S., Chen T.. Selenocysteine derivative overcomes TRAIL resistance in melanoma cells: evidence for ROS-dependent synergism and signaling crosstalk // Oncotarget. – 2014. – V. 5. – P. 7431–45. 105. Поляновский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М. ERBB-Онкогены – мишенимоноклональных антител // Биохимия. – 2012. – Т. 77. № 3. – С. 289–311. 106. Graves J.D., Kordich J.J., Huang T.H., Piasecki J., Bush T.L., Sullivan T., Foltz I.N., Chang W., Douangpanya H., Dang T., O'Neill J.W., Mallari R., Zhao X., Branstetter D.G., Rossi J.M., Long A.M., Huang X., Holland P.M. Apo2L/TRAIL and the death receptor 5 agonist antibody AMG 655 cooperate to promote receptor clustering and antitumor activity // Cancer Cell. – 2014. – V. 26. – P. 177–89. 107. Dienstmann R., Markman B., Tabernero J. Application of monoclonal antibodies as cancer therapy in solid tumors // Current clinical pharmacology. – 2012. – V. 7. N 2. – P. 137-145. 108. Moretto P., Hotte S.J. Targeting apoptosis: preclinical and early clinical experience with mapatumumab, an agonist monoclonal antibody targeting TRAIL-R1 // Expert opinion on investigational drugs. – 2009. – V. 18. N 3. – P. 311–325. 109. Kawamoto T., Ishige K., Thomas M., Yamashita-Kashima Y., Shu S., Ishikura N., Ariizumi S., Yamamoto M., Kurosaki K., Shoda J. Overexpression and gene amplification of EGFR, HER2, and HER3 in biliary tract carcinomas, and the possibility for therapy with the HER2targeting antibody pertuzumab // J. Gastroenterol. – 2014. 101 110. Zhou L., Xu N., Sun Y., Liu X.M. Targeted biopharmaceuticals for cancer treatment // Cancer Lett. – 2014 – V. 352. – P. 145–51. 111. Surget S., Chiron D., Gomez-Bougie P., Descamps G., Menoret E., Bataille R., Moreau P., Le Gouill S., Amiot M., Pellat-Deceunynck C. Cell death via DR5, but not DR4, is regulated by p53 in myeloma cells // Cancer research. – 2012. – V. 72. N 17. – P. 4562-4573. 112. Engesaeter B., Engebraaten O., Florenes V.A., Maelandsmo G.M. Dacarbazine andthe Agonistic TRAIL Receptor-2 Antibody Lexatumumab Induce Synergistic Anticancer Effectsin Melanoma // PloS one. – 2012. – V. 7. N 9. – P. e45492. 113. Kay B.P., Hsu C.P., Lu J.F., Sun Y.N., Bai S., Xin Y., D'Argenio D.Z. Intracellularsignalingtumor-regression modeling of the pro-apoptotic receptor agonists dulanermin andconatumumab // Journal of pharmacokinetics and pharmacodynamics. – 2012. – V. 39. N 5. – P.577–590. 114. Trinchieri G. Type I interferon: friend or foe? // The Journal of experimentalmedicine. – 2010. – V. 207. N 10. – P. 2053-2063. 115. Pestka S., Krause C.D., Walter M.R. Interferons, interferon-like cytokines, and theirreceptors // Immunological reviews. – 2004. – V. 202. N – P. 8–32. 116. Lasfar A., Abushahba W., Balan M., Cohen–Solal K.A. Interferon lambda: a newsword in cancer immunotherapy // Clinical & developmental immunology. – 2011. – V. 2011. N– P. 349575. 117. George P.M., Badiger R., Alazawi W., Foster G.R., Mitchell J.A. Pharmacology andtherapeutic potential of interferons // Pharmacology & therapeutics. – 2012. – V. 135. N 1. – P.44–53. 118. Asmana Ningrum R. Human interferon alpha–2b: a therapeutic protein for cancer treatment // Scientifica (Cairo). – 2014. – doi: 10.1155/2014/970315. 119. Boehm U., Klamp T., Groot M., Howard J.C. Cellular responses to interferongamma // Annual review of immunology. – 1997. – V. 15. – P. 749–795. 120. Чебнэр Б.Э., Линч Т.Дж., Лонго Д.Л. Руководство по онкологии // «МЕДпресс– информ», 2011. 121. Eager R., Harle L., Nemunaitis J. Ad–MDA–7; INGN 241: a review of preclinicaland clinical experience // Expert opinion on biological therapy. – 2008. – V. 8. N 10. – P. 1633– 1643. 122. Margue C., Kreis S. IL-24: physiological and supraphysiological effects on normaland malignant cells // Current medicinal chemistry. – 2010. – V. 17. N 29. – P. 3318–3326. 102 123. Jiang G., Yang C.S., Xu D., Sun C., Zheng J.N., Lei T.C., Liu Y.Q. Potent anti–tumour activity of a novel conditionally replicating adenovirus for melanoma via inhibition of migration and invasion // Br. J. Cancer. – 2014. – V. 110. – P. 2496–505. 124. Chen X., Liu D., Wang J., Su Q., Zhou P., Liu J., Luan M., Xu X.. Suppression effect of recombinant adenovirus vector containing hIL-24 on Hep-2 laryngeal carcinoma cells // Oncol. Lett. – 2014. V. 7. – P. 771–777. 125. Jiang G., Zhang K., Jiang A.J., Xu D., Xin Y., Wei Z.P., Zheng J.N., Liu Y.Q. A conditionally replicating adenovirus carrying interleukin–24 sensitizes melanoma cells to radiotherapy via apoptosis // Mol. Oncol. – 2012. – V. 6. – P. 383–91. 126. Noteborn M.H. Proteins selectively killing tumor cells // European journal of pharmacology. – 2009. – V. 625. N 1–3. – P. 165–173. 127. Rollano Peñaloza O.M., Lewandowska M., Stetefeld J., Ossysek K., Madej M., Bereta J., Sobczak M., Shojaei S., Ghavami S., Łos MJ8. Apoptins: selective anticancer agents // Trends Mol Med. – 2014. – V. 20. – P. 519–28. 128. Sun J., Yan Y., Wang X.T., Liu X.W., Peng D.J., Wang M., Tian J., Zong Y.Q.,Zhang Y.H., Noteborn M.H., Qu S. PTD4–apoptin protein therapy inhibits tumor growth in vivo// International journal of cancer Journal international du cancer. – 2009. – V. 124. N 12. – P. 2973–2981. 129. Zhou S., Zhang M., Zhang J., Shen H., Tangsakar E., Wang J. Mechanisms ofApoptin– induced cell death // Medical oncology. – 2012. – V. 29. N 4. – P. 2985–2991137. 130. Bullenkamp J., Tavassoli M. Signalling of apoptin // Adv. Exp. Med. Biol. – 2014. –V.818. – P. 11–37. 131. Loktev V.B., Ivankina T.I., Netesov S.V., Chumakov P.M. Oncolytic parvoviruses. A new approaches for cancer therapy // Vestn Ross Akad Med Nauk. – 2012. – V. 2. № – P. 42–47. 132. Saxena L., Kumar G.R., Saxena S., Chaturvedi U., Sahoo A.P., Singh L.V., Santra L., Palia S.K., Desai G.S., Tiwari A.K. Apoptosis induced by NS1 gene of Canine Parvovirus–2 is caspase dependent and p53 independent // Virus Res. – 2013. – V. 173. – P. 426–30. 133. Chen A.Y., Qiu J. Parvovirus infection–induced cell death and cell cycle arrest // Future Virol. – 2010. V.5. – P. 731–743. 134. Nuesch J.P., Rommelaere J. A viral adaptor protein modulating casein kinase II activity induces cytopathic effects in permissive cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2007. – V. 104. N 30. – P. 12482–12487. 135. Geletneky K., Huesing J., Rommelaere J., Schlehofer J.R., Leuchs B., Dahm M., Krebs O., von Knebel Doeberitz M., Huber B., Hajda J. Phase I/IIa study of intratumoral/intracerebral or 103 intravenous/intracerebral administration of Parvovirus H–1 (ParvOryx) in patients with progressive primary or recurrent glioblastoma multiforme: ParvOryx01 protocol // BMC cancer. – 2012. – V. 12. – P. 99. 136. Kleinberger T. Induction of cancer–specific cell death by the adenovirus e4orf4 protein // Adv. Exp. Med. Biol. – 2014. – V. 818. – P. 61–97. 137. Schein C.H. From housekeeper to microsurgeon: the diagnostic and therapeutic potential of ribonucleases // Nature biotechnology. – 1997. – V. 15. N 6. – P. 529–536. 138. Fang E.F., Ng T.B. Ribonucleases of different origins with a wide spectrum of medicinal applications // Biochimica et biophysica acta. – 2011. – V. 1815. N 1. – P. 65–74. 139. Ardelt W., Shogen K., Darzynkiewicz Z. Onconase and amphinase, the antitumor ribonucleases from Rana pipiens oocytes // Current pharmaceutical biotechnology. – 2008. – V. 9. № 3. – P. 215–225. 140. Nitta K., Ozaki K., Ishikawa M., Furusawa S., Hosono M., Kawauchi H., Sasaki K., Takayanagi Y., Tsuiki S., Hakomori S. Inhibition of cell proliferation by Rana catesbeiana and Rana japonica lectins belonging to the ribonuclease superfamily // Cancer Res. – 1994. – V. 54. – P. 920–7. 141. Ulyanova V., Vershinina V., Ilinskaya O. Barnase and binase: twins with distinct fates // The FEBS journal. – 2011. – V. 278. N 19. – P. 3633–3643. 142. Lee J.E., Raines R.T. Cytotoxicity of bovine seminal ribonuclease: monomer versus dimer // Biochemistry. – 2005. – V. 44. – P. 15760–7. 143. Patutina O.A., Mironova N.L., Ryabchikova E.I., Popova N.A., Nikolin V.P., Kaledin V.I., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Tumoricidal Activity of RNase A and DNase I // Acta naturae. – 2010. – V. 2. N 1. – P. 88–94. 144. Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen K. Amino acid sequence of an anti–tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases // The Journal of biological chemistry. – 1991. – V. 266. N 1. – P. 245–251. 145. Johnson R.J., Chao T.Y., Lavis L.D., Raines R.T. Cytotoxic ribonucleases, The dichotomy of Coulombic forces // Biochemistry. – 2007. – V.46. – P. 10308–16. 146. Rodriguez M., Torrent G., Bosch M., Rayne F., Dubremetz J.F., Ribo M., Benito A., Vilanova M., Beaumelle B. Intracellular pathway of Onconase that enables its delivery to the cytosol // Journal of cell science. – 2007. – V. 120. N Pt 8. – P. 1405–1411. 147. Qiao M., Zu L.D., He X.H., Shen R.L., Wang Q.C., Liu M.F. Onconase downregulates microRNA expression through targeting microRNA precursors // Cell Res. – 2012. – V. 22. – P. 1199–202. 104 148. Iordanov M.S., Ryabinina O.P., Wong J., Dinh T.H., Newton D.L., Rybak S.M., Magun B.E. Molecular determinants of apoptosis induced by the cytotoxic ribonuclease onconase: evidence for cytotoxic mechanisms different from inhibition of protein synthesis // Cancer research. – 2000. – V. 60. N 7. – P. 1983–1994. 149. Zwolińska M., Smolewski P. Onconase: a ribonuclease with antitumor activity // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). – 2010. – V. 64. – P. 58–66. 150. Mironova N.L., Petrushanko I.Y., Patutina O.A., Sen'kova A.V., Simonenko O.V., Mitkevich V.A., Markov O.V., Zenkova M.A., Makarov A.A. Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells // Cell Cycle. – 2013. – V. 12. – P. 2120–31. 151. Edelweiss E., Balandin T.G., Ivanova J.L., Lutsenko G.V., Leonova O.G., Popenko V.I., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells // PloS one. – 2008. – V. 3. N 6. – P. e2434. 152. Balandin T.G., Edelweiss E., Andronova N.V., Treshalina E.M., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. Antitumor activity and toxicity of anti–HER2 immunoRNase scFv 4D5–dibarnase in mice bearing human breast cancer xenografts // Investigational new drugs. – 2011. – V. 29. N 1. – P. 22–32. 153. Peigneur S., Orts D.J., Prieto da Silva A.R., Oguiura N., Boni–Mitake M., de Oliveira E.B., Zaharenko A.J., de Freitas J.C., Tytgat J. Crotamine pharmacology revisited: novel insights based on the inhibition of KV channels // Molecular pharmacology. – 2012. – V. 82. N 1. – P. 90–96. 154. Hayashi M.A., Oliveira E.B., Kerkis I., Karpel R.L. Crotamine: a novel cellpenetrating polypeptide nanocarrier with potential anti–cancer and biotechnological applications // Methods in molecular biology. – 2012. – V. 906.– P. 337–352. 155. Nascimento F.D., Sancey L., Pereira A., Rome C., Oliveira V., Oliveira E.B., Nader H.B., Yamane T., Kerkis I., Tersariol I.L., Coll J.L., Hayashi M.A. The natural cell–penetrating peptide crotamine targets tumor tissue in vivo and triggers a lethal calcium–dependent pathway in cultured cells // Molecular pharmaceutics. – 2012. – V. 9. N 2. – P. 211–221. 156. Coronado M.A., Georgieva D., Buck F., Gabdoulkhakov A.H., Ullah A., Spencer P.J., Arni R.K., Betzel C. Purification, crystallization and preliminary X–ray diffraction analysis of crotamine, a myotoxic polypeptide from the Brazilian snake Crotalus durissus terrificus // Acta crystallographica Section F, Structural biology and crystallization communications. – 2012. – V. 68. N Pt 9. – P. 1052–1054. 105 157. Estaquier J., Vallette F., Vayssiere J.L., Mignotte B. The mitochondrial pathways of apoptosis // Advances in experimental medicine and biology. – 2012. – V. 942. – P. 157–183. 158. Verrier F., Deniaud A., Lebras M., Metivier D., Kroemer G., Mignotte B., Jan G., Brenner C. Dynamic evolution of the adenine nucleotide translocase interactome during chemotherapy– induced apoptosis // Oncogene. – 2004. – V. 23. N 49. – P. 8049–8064. 159. Buescher E.S., McWilliams–Koeppen P. Soluble tumor necrosis factor–alpha (TNFalpha) receptors in human colostrum and milk bind to TNF–alpha and neutralize TNF–alpha bioactivity // Pediatric research. – 1998. – V. 44. N 1. – P. 37–42. 160. Davanzo R., Zauli G., Monasta L., Vecchi Brumatti L., Abate M.V., Ventura G., Rimondi E., Secchiero P., Demarini S. Human Colostrum and Breast Milk Contain High Levels of TNF– Related Apoptosis–Inducing Ligand (TRAIL) // Journal of human lactation : official journal of International Lactation Consultant Association. – 2012. – V. 29. – P. 23–5. 161. Svensson M., Sabharwal H., Hakansson A., Mossberg A.K., Lipniunas P., Leffler H., Svanborg C., Linse S. Molecular characterization of alpha–lactalbumin folding variants that induce apoptosis in tumor cells // The Journal of biological chemistry. – 1999. – V. 274. N 10. – P. 6388–6396. 162. Kanyshkova T.G., Babina S.E., Semenov D.V., Isaeva N., Vlassov A.V., NeustroevK.N., Kul'minskaya A.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Multiple enzymic activities of humanmilk lactoferrin // European journal of biochemistry / FEBS. – 2003. – V. 270. N 16. – P. 3353–3361. 163. Roy M.K., Kuwabara Y., Hara K., Watanabe Y., Tamai Y. Peptides from the N– terminalend of bovine lactoferrin induce apoptosis in human leukemic (HL–60) cells // Journal of dairy science. – 2002. – V. 85. N 9. – P. 2065–2074. 164. Barbana C., Sanchez L., Perez M.D. Bioactivity of alpha–lactalbumin related to its interaction with fatty acids: a review // Critical reviews in food science and nutrition. – 2011. – V. 51. № 8. – P. 783–794. 165. Mossberg A.K., Hun Mok K., Morozova–Roche L.A., Svanborg C. Structure and function of human alpha–lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET)–type complexes // The FEBS journal. – 2010. – V. 277. N 22. – P. 4614–4625. 166. Mok K.H., Pettersson J., Orrenius S., Svanborg C. HAMLET, protein folding, and tumor cell death // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2007. – V. 354. – P. 1–7. 167. Zhang Y.B., Gong J.L., Xing T.Y., Zheng S.P., Ding W. Autophagy protein p62/SQSTM1 is involved in HAMLET–induced cell death by modulating apotosis in U87MG cells // Cell Death Dis. – 2013. – V. 4. – P. e550. 106 168 Aits S., Gustafsson L., Hallgren O., Brest P., Gustafsson M., Trulsson M., Mossberg A.K., Simon H.U., Mograbi B., Svanborg C. HAMLET (human alpha–lactalbumin made lethal to tumor cells) triggers autophagic tumor cell death // Int. J. Cancer. – 2009 – V. 124. – P. 1008–19. 169. Wang J., Li Q., Ou Y., Han Z., Li K., Wang P., Zhou S. Inhibition of tumor growth by recombinant adenovirus containing human lactoferrin through inducing tumor cell apoptosis in mice bearing EMT6 breast cancer // Archives of pharmacal research. – 2011. – V. 34. N 6. – P.987–995. 170. Mulder A.M., Connellan P.A., Oliver C.J., Morris C.A., Stevenson L.M. Bovinelactoferrin supplementation supports immune and antioxidant status in healthy human males // Nutrition research. – 2008. – V. 28. N 9. – P. 583–589. 171. Tsuda H., Kozu T., Iinuma G., Ohashi Y., Saito Y., Saito D., Akasu T., AlexanderD.B., Futakuchi M., Fukamachi K., Xu J., Kakizoe T., Iigo M. Cancer prevention by bovinelactoferrin: from animal studies to human trial // Biometals : an international journal on the roleof metal ions in biology, biochemistry, and medicine. – 2010. – V. 23. N 3. – P. 399–409. 172. Gibbons J.A., Kanwar R.K., Kanwar J.R. Lactoferrin and cancer in different cancermodels // Frontiers in bioscience. – 2011. – V. 3. № – P. 1080–1088. 173. Yin C.M., Wong J.H., Xia J., Ng T.B. Studies on anticancer activities of lactoferrin and lactoferricin // Curr. Protein Pept. Sci. – 2013. – V. 14. – P. 492–503. 174. Lee S.H., Hwang H.M., Pyo C.W., Hahm D.H., Choi S.Y. E2F1–directed activationof Bcl– 2 is correlated with lactoferrin–induced apoptosis in Jurkat leukemia T lymphocytes // Biometals: an international journal on the role of metal ions in biology, biochemistry, andmedicine. – 2010. – V. 23. N 3. – P. 507–514. 175. Gifford J.L., Hunter H.N., Vogel H.J. Lactoferricin: a lactoferrin–derived peptide with antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties // Cellular and molecular life sciences : CMLS. – 2005. – V. 62. N 22. – P. 2588–2598. 176 Grossman T.H., Kawasaki E.S., Punreddy S.R., Osburne M.S. Spontaneous cAMPdependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instability // Gene. – 1998. – V 209. – P. 95–103. 177 Borukhov S., Lee J. RNA polymerase structure and function at lac operon // C. R. Biol. – 2005. – V. 328. – P. 576–87. 107
