Хитинолитические ферменты: источники
advertisement
Вестник ДВО РАН. 2004. № 3 Н.В.ЖУРАВЛЕВА, П.А.ЛУКЬЯНОВ Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии Хитин является одним из широко распространенных биополимеров. Его модификация и деградация в природе происходят благодаря различным хитинолитическим ферментам, широко представленным в живых организмах и выполняющим различные функции. Они участвуют в процессе линьки у насекомых и деградации кутикулы у ракообразных. Растения, рыбы и млекопитающие используют хитинолитические ферменты в защите от грибковых патогенов, микроорганизмы — для утилизации хитина и хитозана в качестве источников углерода, грибы — для частичного гидролиза хитиновой клеточной стенки в процессе пролиферации. В настоящее время выделено и охарактеризовано большое число хитинолитических ферментов. Они находят широкое применение в биотехнологии, сельском хозяйстве и медицине. Это очень удобные инсектициды и фунгициды. В лаборатории химии неинфекционного иммунитета проводится постоянный скрининг продуцентов хитинолитических ферментов среди штаммов Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН. Из изолята морского гриба Phoma glomerata выделена и охарактеризована высокоактивная N–ацетил–β–D–гексозаминидаза, обладающая трансгликозилирующей активностью. Chitinolityc enzymes: Sources, characteristics, and application in biotechnology. N.V.ZHURAVLEVA, P.A.LUKYANOV (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok). Chitin is one of the abundant polysaccharides in nature. Its modification and degradation occur due to the various chitinolytic enzymes widely distributed in living organisms and playing an important role in different biological processes. They participate in molt of insects and cuticle degradation in crustaceans. Plants, fishes, and mammals use chitinolytic enzymes as defense against the fungi pathogens. By their means, microorganisms utilize chitin and chitosan as the carbon sources, and fungi use the chitinolytic complex for partial hydrolysis of a chitin cellular wall during proliferation. By the present, many chitinolytic enzymes have been isolated and characterized. These enzymes are widely used in biotechnology, agriculture, and medicine. They are very convenient insecticides and fungicides. The screening of chitinolytic enzymes among strains of the marine fungi from Collection of Marine Microorganisms of the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of FEB RAS is constantly carried out at the Laboratory of Chemistry of Noninfectious Immunity. The high-activity N–acetyl–β–D–hexoseaminidase with transglycosylation activity has been isolated from a liquid culture of the marine fungus Phoma glomerata and has been described. Хитин является одним из широко распространенных биополимеров в природе, по запасам он уступает только целлюлозе. Хитин был открыт в 1811 г. при исследовании состава грибов и получил название фунгин, в 1823 г. немецкий ученый A.Одер выделил аналогичный биополимер из надкрылий насекомых и назвал его хитин. Но только в 1931 г. оба соединения были идентифицированы. Хитин является природным биополимером, и, безусловно, его биосинтез, получение, модификация и деградация связаны с ферментативными превращениями. ЖУРАВЛЕВА Наталья Владимировна, ЛУКЬЯНОВ Павел Александрович — доктор химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). 76 Изучение их — важное научное направление, что подтверждается ежегодным проведением конференций и симпозиумов Европейского и Российского хитиновых обществ. Первые исследования в России, связанные с модификацией хитина, состоялись под руководством академика Павла Шорыгина. Серия работ была проведена советскими учеными на Черном море в период с 1930 по 1970 г. Первые препараты из хитина (радиопротекторы — лекарства, защищающие от облучения) были созданы еще в 1960–е годы. Сегодня сфера применения хитина и его производных поистине безгранична, они используются как жидкие кристаллы и флокулянты для очистки воды, как сорбенты и консерванты, в производстве бумаги и в сельском хозяйстве при защите растений от вредителей. Особенно быстро исследуется применение этого естественного биополимера в медицине и фармакологии. Сейчас активно изучают и способность хитина и его производных активизировать синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками при коррекции иммунитета. Установлено, что низкомолекулярные производные хитина и хитозана обладают иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами. Олигосахариды хитина, полученные с помощью хитиназ, уже сейчас применяют в качестве биологически активной пищевой добавки. Они также способны восстанавливать микробную флору кишечника, связывать и выводить из организма токсины. Хитинолитические ферменты являются удобными инструментами для получения олигосахаридов различной степени полимеризации. Морские микроорганизмы служат источником ферментов с необычными свойствами, позволяющими использовать их в биотехнологии для получения новых биологически активных неогликоконъюгатов. Источники хитинолитических ферментов. Хитиназы широко представлены в живых организмах [12]. В высших растениях хитиназы выполняют защитную функцию от различных патогенов и вредителей, как и хитиназы у водорослей. Рыбы и млекопитающие также используют хитиназы для защиты. Хитиназы насекомых и ракообразных активизируются для гидролиза хитина кутикулы при линьке. Микроорганизмы продуцируют хитиназы для переваривания хитин–содержащего субстрата, грибы — для частичного гидролиза хитиновой клеточной стенки при клеточной пролиферации. Классификация хитинолитических ферментов. Согласно общепринятой «Номенклатуре ферментов» существует два хитинолитических фермента: эндохитиназа (КФ 3.2.1.14) и N–ацетил–β–глюкозаминидаза (КФ 3.2.1.30). Первая расщепляет полимерную цепь в случайных местах, тогда как вторая гидролизуют концевые N–ацетилглюкозаминные остатки хитобиозы или более высшего аналога с невосстанавливающего конца. Термин «хитиназа» следует использовать только при определении фермента с эндотипом активности. В литературе также встречается название хитобиаза (во многих случаях это является синонимом N–ацетилглюкозаминидазы), т. е. атакующая хитобиозу и дающая N–ацетилглюкозамин. Необычная хитиназа, продуцируемая Тrichoderma harzianum, отличается от ферментов КФ 3.2.1.14 и КФ 3.2.1.30. Это фермент экзотипа, который способен отщеплять димерные звенья полимерной цепи с невосстанавливающего конца [2]. Также к хитинолитическому комплексу относят фермент хитозаназу. Она гидролизует связь между остатками глюкозамина (GlcN–GlcN) и не гидролизует связь между остатками N–ацетилглюкозамина (GlcNAc–GlcNAc). Классификация гликозилгидролаз. Все упомянутые выше хитинолитические ферменты действуют в природе совместно, и это характерная черта большинства хитинолитических комплексов. В настоящее время разрабатывается современная классификация гликозилгидролаз по гомологии в аминокислотной последователь77 ности. На ее основе гликозилгидролазы объединялись сначала в 35 семейств. По мере того как данные о аминокислотной последовательности гликозилгидролаз накапливались, были добавлены новые семейства. В 1993 г. были опубликованы сведения уже о 45 семействах, и за последнее время было добавлено еще одно семейство [9]. Согласно этому методу классификации, хитиназы формируют семейства 18, 19, лизоцимы включены в семейства 22, 23 и 24, хитозаназы — в семейства 33, 34, 45 и 46. Все эти ферменты гидролизуют β–1,4–гликозидную связь, но по специфичности отличаются друг от друга. Хитиназы гидролизуют связь между N–ацетилглюкозаминными остатками, хитозаназы разрушают связь между глюкозаминными остатками, лизоцимы разрушают связь между N–ацетилмураминовой кислотой и N–ацетилглюкозамином. Классификация согласно гомологии аминокислотной последовательности отражает различие в субстратной специфичности. Это большое преимущество такого метода, так как белок может быть классифицирован прежде выяснения его ферментативной активности. Кроме того, могут быть выявлены не только схожие доменные структуры фермента, но и определено их местоположение в полипептидной цепи. Как было отмечено ранее, хитиназы классифицируются по гомологии аминокислотных последовательностей в семейства 18 и 19. Семейство 18 включает в себя белки вирусов, бактерий, грибов, насекомых, рептилий и части растений. Они отличаются по длине полипептидной цепи, и некоторые из них имеют мультидоменную структуру. Семейство 19 объединяет группу растительных хитиназ, имеющих одинаковые консервативные участки, которые, в свою очередь, подразделяются на две ветви: одна с богатым цистеином N–концевым доменом и вторая без него. Известно, что гидролиз гликозилгидролазами из семейства 18 протекает по механизму двойного замещения, без обращения конфигурации (β–аномеры), а из семейства 19 — по механизму одинарного замещения с обращением (α–аномеры) [9]. Пути деградации хитина в природе. В 1984 г. ученые Дэвис и Эвелей [4] предположили, что в природе могут существовать два пути катаболизма хитина. Один путь хорошо изучен и используется микроорганизмами для утилизации хитина как источника энергии, углерода и азота. Этот путь (рис. 1, а) заключается в деградации хитина под действием хитиназ первоначально до высших хитоолигосахаридов и далее до хитобиозы с последующим превращением ее в N–ацетилглюкозамин в присутствии N–ацетил–β–глюкозаминидазы и в глюкозамин при действии N–ацетилглюкозаминдезацетилазы. Во втором пути, так называемом хитозановом (рис. 1, б), ключевым ферментом является хитиндезацетилаза (КФ 3.5.1.41), которая отвечает за превращение хитина в хитозан. Этот фермент был найден в некоторых микроорганизмах, в частности в Хитиндезацетилаза Хитиназа грибах. Образующийся хитоХитозан зан под действием хитозаназы Хитозаназа Хитиназа деградирует до олигомеров (GlcN)2 глюкозамина, последние, в Глюкозаминидаза свою очередь, — до мономера Хитобиаза в присутствии фермента глюГлюкозамин козаминидазы. Nацетилглюкозаминдезацетилаза В настоящее время выделены, очищены и описаны хиРис. 1. Установленный хитиновый (а) и постулированный хи- тиндезацетилазы из целого рятозановый (б) пути деградации хитина в природе да микроорганизмов [4, 7]. 78 Эти ферменты представляют собой гликопротеины. Они могут быть локализованы либо внутри клетки, либо секретироваться в межклеточное пространство. Кроме того, все ферменты значительно отличаются по молекулярной массе и рН–оптимуму активности, но все строго специфичны к водорастворимому поли–β–(1,4)–N–ацетилглюкозамину (см. таблицу). Хитиндезацетилазы из грибов в природе могут выполнять двойную функцию: участвовать при формировании клеточной стенки и использоваться при проникновении патогена в поражаемое растение. У гриба Mucor rоuхii хитинсинтетаза первоначально синтезирует хитин полимеризацией N–ацетилглюкозаминных остатков из уридин–5'–дифосфат–N–ацетил–D–глюкозамина. Далее хитиндезацетилаза гидролизует N–ацетамидные связи вдоль полимерной цепи, образуя хитозан, причем реакция протекает более эффективно на вновь синтезированном субстрате, чем на плотно упакованном (микрофибриллярном) хитине. Аналогичный путь биосинтеза был прослежен и у гриба Absidia coerulea. Кроме этого, было определено, что хитиндезацетилаза локализована на внутренней стороне клеточной стенки грибов. На примере Streptomyces cerevisiae показано, что хитиндезацетилазы необходимы при дезацетилировании в процессе аскоспорирования клеточной стенки [12]. Другая функция хитиндезацетилазы — участие фермента в процессе взаимодействия растение–патоген. Исследования проводили на грибе Соllеtotrichum lindemuthianum, патогенном для растений и синтезирующем внеклеточную хитиндезацетилазу, активную по отношению к хитоолигосахаридам. Хитоолигомеры со степенью полимеризации 4—6 являются элиситорами при защите растения от патогенов, тогда как их дезацетилированная форма такой функцией не обладает. Полагают, что хитиндезацетилаза гриба дезацетилирует хитоолигосахариды, которые, в свою очередь, образуются при действии растительных хитиназ на клеточную стенку патогена, и, таким образом, снижает их элиситорную активность. Кроме того, хитиндезацетилаза способствует проникновению грибной гифы в ткани растения, т. е. фермент дезацетилирует хитин гифы, и вследствие этого происходит менее эффективный гидролиз модифицированного хитина растительными эндохитиназами, образуется меньше хитоолигосахаридов (элиситоров), и постепенно патоген поражает растение. Имеются также работы, в которых показано, что дезацетилированные олигомеры также могут в ряде случаев играть роль элиситоров [10, 16]. Механизм действия хитиндезацетилазы был подробно изучен на примере действия фермента из М. rouxii на олигомеры хитина. Показано, что процесс гидролиза N–ацетильных групп субстрата происходит по механизму множественной атаки. Этот механизм предусматривает образование фермент–полимерного комплекса с последующим гидролизом ацетильных групп вдоль полимерной цепи. Необходимым условием успешного протекания реакции является наличие трех последовательно расположенных N–ацетилглюкозаминных остатков в полимерной цепи [7, 12]. Механизм действия. В настоящее время известно несколько семейств ферментов, сильно отличающихся по структуре и способу гидролиза хитина. Впервые механизм действия хитинолитических ферментов был описан на примере лизозима (КФ 3.2.1.17), выделенного из яичного белка. Данный белок обладает хитинолитической активностью, и именно с него началось изучение хитиназ. Существует два возможных пути гидролиза гликозидной связи по типу кислотно–основного катализа. Для данного катализа необходимо наличие донора протонов и нуклеофильного основания. Гидролиз может протекать либо с сохранением, 79 либо с обращением аномерной конфигурации (рис. 2). Реализация пути, по которому будет проходить реакция, зависит от трехмерной структуры фермента. Важным условием направления реакции является расстояние между двумя каталитическими остатками аминокислот, обычно глутаминовой и аспарагиновой. Расстояние 4,8—5,5 Å характерно для протекания гидролиза с сохранением аномерной конфигурации (механизм двойного замещения; рис. 2, а), 9—10 Å — для механизма одинарного замещения с обращением конфигурации (рис. 2, б) [5, 7, 9, 11, 15]. Существует два варианта механизма катализа. Первый вариант подразумевает наличие протонированного кислого остатка (обычно карбоксильная группа глутаминовой кислоты) как донора протонов и отрицательно заряженной аминокислоты, которая электростатически стабилизирует положительный заряд при углеродном атоме (С–1), образующийся в процессе катализа (рис. 2, а). Электростатическое взаимодействие протона карбоксильной группы глутаминовой кислоты с кислородным атомом гликозидной связи приводит к ее поляризации, образуется промежуточный карбкатион. Отрицательно заряженная аминокислота стабилизирует его или атакует как нуклеофил, приводя к образованию промежуточного комплекса — гликозил–фермента. Далее карбкатион реагирует с активной формой воды (OH–) при экваториальном расположении заместителей, что приводит к сохранению аномерной конфигурации при углеродном атоме С–1. Данный механизм описан для хитиназ из огурца, каучукового дерева, Bacillus curculans WL–12, Streptomyces griseus и для лизоцимов яичного белка и человека. При реализации катализа по второму варианту основание (отрицательно заряженный остаток аминокислоты) располагается далеко от углеродного атома С–1, чтобы стабилизировать промежуточный положительно заряженный карбион (рис. 2, б). Образование промежуточного соединения облегчается благодаря молекуле воды, которая атакует непосредственно из аксиального положения, что приводит к обращению аномерной конфигурации. Так работают хитиназы из ячменя, бобов, ямса, S. griseus HUT 6037 и лизоцим папайи. На примере хитиназы В из Serratia marcescens изучено влияние кислых остатков аминокислот, входящих в активный центр, на ферментативную активность. Например, замена в каталитическом центре глутаминовой кислоты (Glu144) на ее амид или на аланин приводит к сильному снижению актива б ности. Такой же результат наблюдается при аналогичной замене остатков аспарагиновой кислоты (Аsр140, 142 и 215). Наличие второго кислого остатка, тесно примыкающего к каталитическому центру и действующего как нуклеофил на стадии образования фермент–субстратного комплекса, является необходимым [7]. Физико–химические Рис. 2. Механизм каталитического гидролиза β–гликозидной свойства. Хитиназы высших связи с сохранением (а) и обращением (б) конфигурации замерастений и водорослей имеют стителя у С–1 атома 80 молекулярную массу около 30 kDa. Хитиназы с молекулярной массой 40—90 kDa и 120 kDa были обнаружены в моллюсках, членистоногих и в некоторых позвоночных, таких как рыбы, амфибии и млекопитающие. Широкий диапазон значений молекулярной массы от 30 до 120 kDa наблюдается у бактерий и грибов. Некоторые хитиназы высших растений, насекомых и микроорганизмов являются гликопротеинами [3, 11, 12, 15, 16]. Хитиназы имеют широкий диапазон значений изоэлектрической точки: от 3,0 до 10,0 у высших растений и водорослей; 4,7—9,3 у насекомых, ракообразных, моллюсков и рыб и 3,5—8,8 у микроорганизмов. Таким образом, в этих организмах представлены как кислые, так и основные хитиназы [11, 12]. Оптимальные для активности хитиназ значения pH также лежат в широком диапазоне: pH 4—9 характерны для высших растений и водорослей, pH 4,8—7,5 — для животных, pH 3,5—8,0 — для микроорганизмов. Для аналитических целей традиционно используются растворимые субстраты — гликоль–хитин и хитоолигосахариды. pH-Оптимум хитиназы при использовании гликоль–хитина наблюдался в слегка щелочных по сравнению с низкомолекулярными субстратами типа хитоолигосахаридов и их производных значениях pH (см. таблицу). Например, хитиназы из тутового шелкопряда и ямса имели два оптимума pH при гидролизе гликоль–хитина — рН 4 и рН 8—10. Однако эти хитиназы имеют только один оптимум pH в кислом диапазоне pH 4—6 при расщеплении хитоолигосахаридов. Это может объясняться существованием или дополнительного хитин–связывающего субсайта хитиназы, располагающегося вблизи активного центра, или отдельной хитин–связывающей области в полипептидной цепи. Хитиназа с высокой хитин–связывающей способностью имеет два pH–оптимума при гидролизе гликоль–хитина. Некоторые из хитиназ ямса — один при pH 4 даже в реакции с гликоль–хитином [12]. Хитинолитические ферменты обладают различной температурной стабильностью. Существует удивительный класс растительных хитиназ семейства 18 и хитиназа из бактерии Bacillus licheniformis, которая была найдена в горячих источниках. Эти хитиназы выдерживают температуры до 80 °C. А хитиназы насекомых, таких как тутовый шелкопряд, имеют температурную стабильность до 40 °C. Это объясняется тем, что оптимальные условия жизнедеятельности насекомых лежат при температуре 25 °C. Поэтому насекомым не требуются хитиназы с высокой температурной стабильностью. Хитиназы насекомых в основном более крупные, чем растительные. Низкомолекулярные и компактные хитиназы являются более термостабильными [3, 11, 12]. Ингибиторы и активаторы. Аллозамидин был впервые представлен как специфический ингибитор хитиназ насекомых [6]. Значение константы ингибирования для него равно 0,1 µМ. Ингибитор имеет структуру, схожую с оксозалиновым циклом промежуточного звена, сформированного между карбонильным кислородом N–ацетильной группы и C–1 атомом остатка N–ацетилглюкозамина во время гидролиза. Аллозамидин и его производные ингибируют хитиназы тутового шелкопряда, креветки и микроорганизмов Piromyces communis, Streptomyces sp. и S. olivaceoviridis [12]. Недавно было показано, что аллозамидин ингибирует также хитиназу ямса на 50 % при концентрации 44,7 µM [11]. Эта растительная хитиназа принадлежит семейству 18 гликозилгидролаз. Аллозамидин продуцируется Streptomyces sp. [15]. Интересно, что этот микроорганизм синтезирует два типа хитиназ: один аллозамидин–чувствительный, а другой — нет. Таким образом, аллозамидин и его производные ингибируют только хитиназы, принадлежащие к семейству 18 гликозилгидролаз, но не ингибируют хитиназы из семейства 19. 81 Кинетические характеристики хитиназ из различных источников [12] Источник Субстрат Растения Капуста (30 kDa) Томаты Ямс хитиназа Е хитиназа Н Гликоль–хитин (рН 5) Хитин (рН 5,5) Гликоль–хитин (рН 4) Гликоль–хитин (рН 8) GlcNAc3–6 (рН 4) Гликоль–хитин (рН 4) Гликоль–хитин (рН 8) GlcNAc4–6 (рН 4) Гликоль–хитин (рН 4) GlcNAc4–6 (рН 4) GlcNAc5–6 (рН 6,7) Гликоль–хитин (рН 5,5) GlcNAc5–6 *** Гликоль–хитин (рН 6,5) GlcNAc5–6*** Гликоль–хитин (рН 9) GlcNAc5–6*** Гликоль–хитин (рН 9) GlcNAc5–6*** Гликоль–хитин (рН 9) GlcNAc5–6*** КМ–хитин (рН 7,7) Хитин GlcNAc4–6 (рН 6,7) GlcNAc5–6 (рН 5,5) Хитин* (рН 5,5) Хитин кальмара (рН 7,0) Хитин кальмара (рН 7,0) 4MU–GlcNAc2 (pH 6,1) pNp–GlcNAc2 (pH 6,0) pNp–GlcNAc2 (pH 6,0) pNp–GlcNAc2 (pH 6,0) pNp–GlcNAc2 (pH 6,0) 4MU–GlcNAc2 (pH 7,0) 4MU–GlcNAc2 (pH 5,5) 4MU–GlcNAc3 (pH 5,5) Хитин* (рН 5,0) Хитин* (рН 5,0) Хитозан (рН 4,5) КМ–хитин (рН 4,5) Хитин** (рН 5,0) Хитин* (рН 5,0) Гликоль–хитин (рН 5,0) Хитин** (рН 5,0) Хитин* (рН 5,0) Гликоль–хитин (рН 5,0) Гликоль–хитин (рН 5,0) КМ–хитин (рН 5,0) хитиназа G1 Красная водоросль Gigartina mikamii Тутовый шелкопряд (65 kDa) (88 kDa) Микроорганизмы Животные Табачный жук–рогач (50 kDa) (62 kDa) (75 kDa) Антарктический криль Североамериканский криль Креветка Японский угорь Aeromonas hydrophyla subsp. anaerogenes Vibrio alginoyticus H8, C1 V. alginoyticus H8, С3 Serratia marcescens BJL2000, В Bacillus licheniformis X–7u, I II III IV Clostridium paraputrificum, ChiB Streptomyces plicatus, Chi63 Streptomyces sp. AJ9463, S IS S. kurssanovii, Chi42 Choanephora cucurbitarum Phascolomyces articulosus Myrothecium verrucaria Км 76 µМ 0,408 мг/мл 0,639 мг/мл 0,518 мг/мл 0,88—0,017 мМ 0,381 мг/мл 0,323 мг/мл 0,11—0,07 мМ 2,24 мг/мл 0,424—0,139 мМ Нет данных 0,134 мг/мл — 0,023 мг/мл — 1,68 мг/мл — 0,23 мг/мл — 0,15 мг/мл — 0,3 мг/мл 1,6 мг/мл 5,2 мг/мл 0,249—0,005 мМ 2,8 мг/мл 1,4 мг/мл 0,8 мг/мл 31,4 µМ 0,11 мМ 0,77 мМ 0,50 мМ 0,33 мМ 6,3 µМ 5,0 µМ 0,5 µМ 0,56 г/мл 0,056 г/мл 16 µМ 18 µМ 0,63 г/мл 0,80 г/мл 0,47 г/мл 2,3 мг/мл 0,8 мг/мл 1,0 мг/мл 1,33 г/мл 2,85 г/мл * Коллоидный хитин. ** Регенерированный хитин. *** Не гидролизуется хитиназой. Что касается ионов металлов, то хитиназы обычно ингибируется ионами Hg2+ и Ag+. Действие Cu2+ двояко: один тип хитиназ ингибируется данным ионом, а другой активируется. Хитиназы, активируемые ионами Cu2+, были найдены в некоторых рыбах и микроорганизмах [7, 12]. Применение хитинолитических ферментов в защите растений. Ежегодные потери урожая во всем мире от различных заболеваний сельскохозяйствен- 82 ных растений, вызываемых патогенами бактериальной, грибной или вирусной природы, достигают 540 млн т на сумму 50 млрд долл. США. Поскольку традиционная химическая защита растений во многих случаях может оказаться неэффективной, в последние 25 лет широкое распространение получил микробиологический метод защиты растений — использование препаратов на основе Bacillus thuringiensis, выделяющей хитинолитические ферменты. Перенос гена хитиназы в клетки растений позволил сделать их носителями собственного инсектицида. В этой области достигнуты значительные успехи. На рынке появились коммерческие сорта «инсектицидных» культурных растений. Подобные работы открывают и другие интересные перспективы, например создание растений, уничтожающих москитов, комаров и других насекомых, представляющих опасность для человека и животных. Пример тому — трансгенные водоросли, несущие токсин, убивающий личинок малярийного комара. Встраивание в растения гена хитиназы — фермента, разрушающего хитин, — делает их практически неуязвимыми для грибковых заболеваний [16]. В ответ на вирусную, бактериальную или грибковую инфекцию растения синтезируют множество молекул с различными функциями. Белки, продуцируемые в условиях поражения растения патогеном, называются PR–белками (pathogenesis–related proteins), среди них — хитиназы и хитозаназы с антифунгальным действием [13, 16, 18]. В эксперименте in vitro микроинъекции хитиназ активируют гидролиз клеточной стенки гаустории гриба Erysiphe graminis в ячменных колеоптильных клетках и таким образом останавливают рост патогена [18]. Доктор Тойода с сотрудниками провели исследование химической структуры полимеров клеточной стенки Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. С помощью твердофазной 13C–ЯМР спектроскопии были изучены спектры компонентов клеточной стенки гриба, хитина и в различной степени N–ацетилированного хитозана [7, 18]. Клеточная стенка F. оxysporum наиболее вероятно содержит хитозан, степень ацетилирования которого находится в диапазоне 25—35 %. Подобный результат был получен с помощью инфракрасной спектроскопии фракций клеточных стенок. Дальнейшая информация относительно структуры клеточной стенки была получена с помощью хитиназ и хитозаназ. Хитиназа из Streptomyces griseus гидролизует 25—35 %–ный N–ацетилированный хитозан с образованием нескольких гетероолигосахаридов, включающих GlcN и GlcNAc. Однако оказалось, что при гидролизе клеточной стенки F. oxysporum данным ферментом гетероолигосахаридов не получается. N–ацетилированные углеводные остатки в клеточной стенке гриба распределены блоками, в то время как в синтетических частично N–ацетилированных хитозанах они распределены равномерно. Основным продуктом гидролиза клеточной стенки гриба хитозаназой из Bacillus pumilus являются GlcN–GlcNAc и несколько других гетероолигосахаридов, которые имеют GlcNAc на восстанавливающем конце. Благодаря этим результатам была уточнена химическая структура хитин–содержащего компонента клеточной стенки F. oxysporum. Была разработана стратегия для ее эффективного гидролиза. Очевидно, что хитозаназа более важна для эффективной деградации клеточной стенки F. oxysporum, чем хитиназа. Но хитиназа необходима для полной деградации грибной клеточной стенки. Доктор Тойода и его коллеги в Университете Кинки (Япония) проводят эксперименты по связыванию генов бактериальных хитиназы и хитозаназы для получения гибридного белка, обладающего как хитиназной, так и хитозаназной активностью. Такой белок был бы более эффективен при гидролизе грибной клеточной стенки. Встраивание гена такого белка приве- 83 дет к созданию трансгенных растений, которые обладали бы сильной защитой от грибковых заболеваний [7]. В течение нескольких десятилетий синтетические химические инсектициды были мощным инструментом для контроля численности насекомых–вредителей. Однако использование таких инсектицидов привело к серьезным проблемам, таким как разрушение экосистем и загрязнения на различных уровнях пищевых цепей. Поэтому потребовались более безопасные стратегии для контроля над насекомыми–вредителями. В процессе линьки насекомых совместное участие принимают эндохитиназа и экзо–N–ацетилглюкозаминидаза [8, 11]. Процесс гидролиза хитиназой является ограничивающим фактором в процессе линьки. Биосинтез хитиназы регулируется гормоном роста. Предполагается, что фермент может быть вреден для роста насекомого, если он синтезируется в несоответствующее время. С помощью твердофазной 13C–ЯМР спектроскопии [7] были изучены спектры неповрежденной кутикулы гусеницы Manduca sexta и выделенного их нее хитина. Спектр кутикулы насекомого подобен предварительно изученному спектру хитина, это указывает на то, что хитиновый компонент кутикулы M. sexta является почти полностью N–ацетилированным хитином. Это значительно отличается от хитинового компонента клеточной стенки грибов. Кутикула содержит хитин практически без хитозановых блоков. Подтверждением этого был факт полного гидролиза кутикулы насекомого хитиназой. Все эти результаты показывают, что использование хитиназ против насекомых вредителей наиболее эффективно [7]. Применение хитинолитических ферментов в медицине. На Дальнем Востоке на протяжении многих лет хитин и его производные использовались для диетологических и медицинских целей. Многие люди принимают диетические добавки, полученные из хитина и хитозана, для улучшения здоровья и считают, что добавки помогают им бороться с рядом недомоганий, включая высокое содержание холестерина в крови, высокое кровяное давление, аллергии и артрит. Они также указывают на улучшение состояния кожи, волос и ногтей при приеме этих добавок. Олигосахариды хитина находятся среди наиболее распространённых функциональных пищевых добавок в Японии. Производные хитина, такие как хитоолигосахариды и олигосахариды хитозана, получаемые с помощью хитинолитических ферментов, также обладают многими важными и полезными для здоровья свойствами, проявляют противоопухолевое действие, улучшают функции кишечника (последнее объясняется способностью стимулировать рост Bifidobacteria — полезной кишечной бактерии, которая помогает справляться со многими болезнями пищеварительного тракта) [7, 10, 14]. Было показано, что хитин, хитозан и хитоолигосахариды стимулируют неспецифическую иммунную защиту у мышей, приводящую к повышению уровня Т–клеток, которые атакуют опухолевые клетки. Исследователи предположили, что олигосахариды хитозана могут действовать точно таким же образом. Другим важным направлением использования хитинолитических ферментов в медицине является получение различных неогликоконъюгатов. Известно, что хитиназы, N–ацетилглюкозаминидазы и хитозаназы ряда микроорганизмов помимо гидролитической могут проявлять и трансгликозилирующую активность [19—21]. Это свойство ферментов можно использовать для получения олигосахаридов со степенью полимеризации 3—8. Так, хитиназа из Streptomyces kurssanovii первоначально гидролизует хитоолигосахариды до триозы, биозы и N–ацетилглюкозамина. Далее под действием этого же фермента в результате реакции трансгликозилирования происходит образование более длинных хитоолигосахаридов (пента– и те- 84 трамеров) [6]. Имеются данные, что хитоолигосахариды обладают иммуностимулирующей, антиопухолевой, антимикробной и противовоспалительной активностью [17]. Олигосахариды активируют Т– и цитотоксические лимфоциты [1]. В живых организмах хитиназы, проявляющие трансгликозилирующую активность, играют роль в связывании других полисахаридов с хитином в отрезок времени между полимеризацией и кристаллизацией хитина. Неогликоконъюгаты, полученные с помощью гликозидаз, обладающих трансгликозилирующей активностью, применяют в медицине для ингибирования процесса метастазирования при онкопатологии. При всем внимании, уделяемом хитинолитическим ферментам наземных видов, эти ферменты мало исследуются среди морских обитателей. Хитинолитический комплекс морских грибов, эффективных продуцентов широкого спектра ферментов, ранее практически не изучался. Поэтому велика вероятность обнаружения высокоактивных ферментов с необычными свойствами. В последнее время в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии проводятся исследования хитинолитических ферментов морских грибов, коллекция штаммов которых собрана в различных районах Тихого океана и поддерживается в нашем институте. Мы провели скрининг хитиназ, хитозаназ и N–ацетил—β–D–глюкозаминидаз среди некоторых штаммов морских грибов и выявили эффективных продуцентов различных хитинолитических ферментов [22]. Высокоактивная N–ацетил–β–D–гексозаминидаза была выделена в гомогенном состоянии из культуральной среды морского гриба Phoma glomerata. После оптимизации условий культивирования штамма и схемы выделения фермента был получен препарат с удельной активностью 1020 Ед/мг белка с выходом 12 мг/л культуральной среды [21]. N–ацетил–β–D–гексозаминидаза из P. glomerata обладает трансгликозилирующей активностью, с ее помощью были синтезированы метилгликозиды N–ацетил–D–глюкозамина и N–ацетил–D–галактозамина с выходом 38 % и 46 % соответственно. Фермент стабилен и может повышать активность более чем в два раза в присутствии протонных органических растворителей до 40 %. Этот фермент в дальнейшем может быть использован для получения олигосахаридов, служащих стандартами при определении углеводной структуры гликоконъюгатов или исходными углеводными компонентами в хемоферментативном синтезе более сложных олигосахаридов. В настоящее время в нашей лаборатории создается коллекция низкомолекулярных хитоолигосахаридов и полученных на их основе неогликопротеинов и неогликолипидов, которые планируется использовать для изучения статуса глюкозамин-связывающих клеточных рецепторов и векторной доставки липосомных препаратов при онкопатологиях. Таким образом, среди малоисследованных морских микроорганизмов велика вероятность обнаружения продуцентов высокоактивных хитинолитических ферментов с различной субстратной специфичностью. Это открывает новые перспективы в морской биотехнологии. ЛИТЕРАТУРА 1. Bezouska K., Yuen C.T., O’Brien J., Childs R.A., Chai W., Lawson A.M., Drbal K., Fiserova A., Pospisil M., Feizi T. Oligosaccharide ligands for NKR-P1 protein activate NK cells and cytotoxicity // Nature. 1994. Vol. 372, N 6502. P. 150—157. 2. Bielka H., Dixon H., Karlson P., Webb E. Enzyme nomenclature. N. Y.: Academic Press, 1984. 350 p. 3. Collinge S., Kragh K., Nikkelsen J., Rausmussen U., Vad K. Plant chitanases // Plant J. 1993. Vol. 3, N 3. P. 31—40. 85 4. Davis B., Eveleigh D. Chitosanases: occurrence, production and immobilization // Chitin, chitosan and related enzymes / Ed. Zikakis J.P. Orlando: Academic Press, 1984. P. 161—179. 5. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases // Structure. 1995. Vol. 3, N 12. P. 853—859. 6. Flatch J., Pilet P.E., Jolles P. What’s new in chitinase research? // Experementia. 1992. Vol. 48, N 2. P. 701—716. 7. Fukamizo T. Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate binding, and their application // Curr. Protein Peptide Sci. 2000. Vol. 1, N 1. P. 105—24. 8. Fukamizo T., Kramer K. Mechanism of chitin hydrolysis by the binary chitinase system in insect moulting fluid // Insect Biochem. 1985. Vol. 15, N 1. P. 141—145. 9. Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification for glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. Vol. 293, N 11. P. 781—788. 10. Hirano S. Chitin biotechnology applications // Biotechnol. Annu. Rev. 1996. Vol. 2, N 1. P. 237—258. 11. Koga D. Comparative biochemistry of insect and plant chitinases // Chitin Enzymology / Ed. Muzzarelli R.A.A. Ancona: Atec. Grottammare, 1996. Vol. 2. P. 85—94. 12. Koga D., Mitsutomi M., Kono M., Matsumiya M. Biochemistry of chitinase // Chitin and Chitinases / Eds Jolles P., Muzzarelli R.A.A. Ancona: Atec. Grottammare, 1999. P. 111—123. 13. Lorito M., Woo S., Donzelli B., Scala F. Synergistic, antifungal interactions of chitinolytic enzymes from fungi, bacteria and plants // Chitin Enzymology / Ed. Muzzarelli R.A.A. Ancona: Atec. Grottammare, 1996. Vol. 2. P.157—164. 14. Sandorf P.A. Chitosan: commercial uses and potential applications // Chitin and Chitosan / Eds Skjak–Braek G., Anthonsen T., Sandorf P.A. L.: Elsevier, 1989. P. 51—69. 15. Sasaki C., Yokoyama A., Itoh Y., Hashimoto M., Watanabe T., Fukamizo T. Comparative study of the reaction mechanism of family 18 chitinases from plants and microbes // J. Biochem. 2002. Vol. 131, N 1. P. 557—564. 16. Schlumbaum A., Mauch F., Vogeli K., Boller T. Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth // Nature. 1986. Vol. 324, N 11. P. 365—367. 17. Se–Kwon Kim, Pyo–Jam Park, You–Jin Jeon, Hee-Guk Byun. Continuous production of chitosan oligosaccharides and their biooacivities // Advances in Chitin Science / Eds Varum K.M., Domrad A., Smidstrod O. Trondheim, Norway: Tapyyr Uttrykk, 2003. Vol. 6. P. 97—100. 18. Toyoda H., Matsuda Y., Yamaga T., Ikeda S., Morita M., Tamai T., Ouchi S. Suppression of the powdery mildew pathogen by chitinase microinjected into barley coleoptile cells // Plant Cell Rep. 1991. Vol. 10, N 2. P. 217—220. 19. Unverzagt C., Kunz H., Paulson J.C. High–efficiency synthesis of sialyloligosaccharides and sialoglycopeptides // J. Am. Chem. Soc. 1990. Vol. 112, N 34. P. 9309—9310. 20. Usui T., Hayashi Y., Nanjo F., Sakai K., Ishido Y. Transglycosylation reaction of a chitinase purified from Nocardia orientalis // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 923, N 1. P. 302—309. 21. Zhuravleva N., Luk’yanov P., Pivkin M. N–acetyl–β–D–hexoseaminidase with transglycosylation activity from marine fungus Phoma glomerata // Advance in Chitin Science / Eds Varum K.M., Domrad A., Smidstrod O. Trondheim, Norway: Tapyyr Uttrykk, 2003. Vol. 6. P. 308—309. 22. Zhuravleva N., Pivkin M., Hwan J., Luk’yanov P. Complex chitinolytic system of marine fungi // Proc. 3rd Intern. Symp. Chitin Enzymology. Ancona, Italy, 6—10 May, 2001. P. 94. 86
