Рост и развитие углеводородокисляющих микроорганизмов в
advertisement
На правах рукописи АЛЕКСАНДРОВ Алексей Юрьевич Рост и развитие углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ставрополь – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный технический университет» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Самыгин Виктор Михайлович. Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Мануйлов Игорь Михайлович; доктор биологических наук, профессор Майский Виктор Григорьевич. Ведущая организация: ГОУ ВПО «Кубанский государственный технологический университет» Защита диссертации состоится 9 июня 2010 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета при ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 2, комн. 506. С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета. Автореферат разослан 30 апреля 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета Ржепаковский И.В. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Нефть является одним из самых распространённых загрязнителей окружающей среды. Её разливы вызывают гибель организмов, изменение свойств экосистем и их деградацию. Проблема нефтяного загрязнения приобрела глобальные масштабы в конце XX века. Это связано с тем, что нефть стала самым используемым источником энергии. Потери при современных объёмах добычи нефти исчисляются десятками миллионов тонн в год (Миркин Б.М., Наумова Л.Г., 2001). Процесс самовосстановления биоценозов в регионах, которые подверглись нефтяному загрязнению, занимает весьма продолжительное время и протекает порой в течение 10-25 лет. (Давыдова С.Л., Тагасов В.И., 2004; Киреева Н.А., 2007) . Из многочисленных методов, которые позволяют уменьшить концентрацию нефти в окружающей среде, наиболее перспективными считаются биологические методы, основанные на естественных процессах разложения нефти в природе, участие в которых принимают углеводородокисляющие микроорганизмы: бактерии, микроскопические грибы и дрожжи (Киреева Н.А., 1994; Коронелли Т.В., 1996; Аренс В.Ж. и др., 1999). Одним из основных направлений биологической очистки от нефтяного загрязнения является стимуляция аборигенной микрофлоры на месте загрязнения (Вельков В.В., 1995). В этом случае большое значение имеют факторы окружающей среды, оказывающие влияния на углеводородокисляющую активность: температура, условия аэрации, обеспеченность элементами питания и кислотность среды (Vidali M., 2001; Миронов О.Г., 2002; Войно Л.И., 2006). Наряду с оптимизацией процессов роста и развития углеводородокисляющих микроорганизмов, применяется внесение активных углеводородокисляющих микроорганизмов в среду, чаще всего в виде промышленных биопрепаратов. В настоящее время существует большой рынок коммерческих препаратов, но, несмотря на это, продолжается поиск новых штаммов-нефтедеструкторов, обладающих высокой окислительной способностью по отношению к широкому спектру углеводородов нефти. Кроме того, некоторые из углеводородокисляющих микроорганизмов относятся к условно-патогенным видам, поэтому необходимо соблюдение условий безопасности при получении и применении биопрепаратов (Соловьев В.И. и др., 2001). Поэтому пополнение микробной коллекции свежевыделенных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), изучение условий их культивирования и получение биомассы для последующего применения в процессах ликвидации разливов нефти является актуальным. Целью диссертационной работы являлось изучение особенностей роста и размножения углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях глубинного аппаратного культивирования в синтетических средах на основе нефти. Основные задачи исследования. 1. Идентифицировать штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенные из нефтезагрязнённой почвы. 3 2. Экспериментально определить основные параметры роста выделенных штаммов микроорганизмов, а также влияние физико-химических факторов и состава питательной среды на развитие бактериальной популяции. 3. Определить углеводородокисляющую активность отобранных штаммов и остаточную фитотоксичность почвы в процессах биоремедиации нефтезагрязнённых объектов. 4. Сконструировать установку для культивирования микроорганизмов, обеспечивающую биологическую и экологическую безопасность процессов их выращивания. Научная новизна. Впервые: − идентифицированы выделенные из нефтезагрязнённой почвы два активных штамма-нефтедеструктора, относящиеся к родам Pseudomonas и Bacillus и обладающие различной углеводородокисляющей способностью и детоксицирующим действием в тестах на фитотоксичность; − определены закономерности и основные параметры роста выделенных бактерий Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22, установлено влияние состава питательной среды и физико-химических факторов на развитие микробной популяций в условиях глубинного аппаратного культивирования; − показано, что метод молярности этаноловых капель может быть успешно применён для оценки углеводородокисляющей способности штаммов в загрязнённых нефтью природных объектов; − сконструирована установка, обеспечивающая биологическую и экологическую безопасность процессов глубинного выращивания микроорганизмов. Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологии получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов на основе штаммов Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22. Данные о благоприятном влиянии мелассы, солей молибдена, перфторированных соединений углерода в питательной среде могут быть использованы в биотехнологии для эффективного получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов. Для оценки углеводородокисляющей активности микроорганизмов и определения концентрации нефти в почве пригоден использованный в работе метод молярности этаноловых капель. По материалам диссертационной работы опубликованы методические указания «Изучение скорости потребления кислорода при глубинном культивировании микроорганизмов» (в соавторстве с В.М. Самыгиным, И.В. Владимцевой и Т.В. Хохловой), которые используются студентами химико-технологического факультета и факультета технологий пищевых производств Волгоградского государственного технического университета на лабораторных занятиях по курсу «Основы биотехнологии». Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии и написании дипломных работ в Волгоградском государственном техническом университете. Разработанная с участием автора установка для культивирования микроорганизмов нашла отражение в методических указаниях МУ 1.3.2411-08 «Биологическая 4 безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов III групп патогенности», утверждённых Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.07.2008 г. Положения, выносимые на защиту. 1. Идентифицированные как Pseudomonas sp.ТУ10 и Bacillus sp.ТУ22 штаммы микроорганизмов потребляют в качестве источника углерода углеводороды нефти и могут быть использованы для очистки природных объектов, загрязнённых нефтью и её продуктами. 2. Использование метода молярности этаноловых капель и теста на фитотоксичность является эффективным средством для оценки углеводородокисляющей и детоксицирующей способностью бактерий в загрязнённых нефтью объектах окружающей среды. 3. Штаммы Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22 обладают различной активностью в процессах биоремедиации. На их рост и размножение оказывают влияние состав питательной среды и физико-химические факторы, которые обеспечивают различную скорость развития бактериальных популяций в условиях глубинного культивирования. 4. Сконструированная лабораторная установка создаёт возможности проведения процессов глубинного культивирования в условиях биологической и экологической безопасности. Апробация. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены: на 11-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология- наука XXI века» (Пущино, 2007); XII и XIII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2007, 2008); 45-й и 46-й научных конференциях Волгоградского государственного технического университета (Волгоград, 2008, 2009); Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий» (Тула, 2008); Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (II Ржавитинские чтения) (Саранск, 2008); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); Tenth International In Situ and On-Site Bioremediation Symposium (Балтимор, США, 2009). Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени. Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных экспериментальных исследований, а также заключения, выводов и списка 5 использованной литературы, включающего 214 наименований, из них 51 иностранных. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования являлись два активных штамма-нефтедеструктора, выделенные из нефтезагрязнённой почвы в г. Волгограде. Идентификацию штаммов проводили по общепринятым методикам на основании изучения культуральных, морфологических и биохимических свойств (Теппер и др., 1993; Определитель бактерий Берджи, 1997). При изучении влияния температуры на рост углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) использовали питательный бульон фирмы «Difco». Кислотно-щелочной баланс питательной среды устанавливали с помощью фосфатного буфера. Из фторированных органических соединений использовали перфтортрибутиламин – (C4F9)N3 – в количестве 5% (об). Молибден добавляли в виде аммониевой соли (NH4)6Mo7O24·4H2O. Осмотическое равновесие в среде на основе мелассы поддерживали за счёт 0,9% раствора NaCl. Эксперименты по определению влияния физико-химических факторов (температуры, величины pH, условий аэрации) на рост штаммов УОМ, а также изучение роста ассоциированных культур штаммов проводили в условиях глубинного аппаратного культивирования. Для этого использовали лабораторный ферментёр «LKB-1607 Polyferm» (Швеция), с рабочим объёмом культурального сосуда 400 мл. Для определения концентрации биомассы использовали стандартный образец мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а концентрацию живых клеток определяли методом высева на плотные питательные среды. Параметры роста – удельную скорость роста (µ), время генерации (td), степень размножения (n), максимальную концентрацию (М) – рассчитывали на определённом этапе развития бульонной культуры общепринятыми методами (Перт, 1978). Для определения эффективности исследуемых штаммов в процессах биоремедиации и оценки степени биодеструкции нефти в почве был использован molarity of ethanol droplet (MED) метод или метод молярности этаноловых капель (King, 1981). Фитотоксичность нефтезагрязнённых почв оценивали методом проростков, для чего была использована тест-культура редиса Raphanus sativus L. var. sativus сорта «Красный с белым кончиком» (Биккинина и др., 2006; Никитина и др., 2006). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Идентификация штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов При посеве штамма №22 на питательный агар Difco в чашках Петри через 16-24 ч формировались среднего размера (d=2-9 мм) матовые, неправильной или круглой формы, плоские, с зубчатыми краями, морщинистой 6 поверхностью, белого цвета, однородной структуры и сухой консистенции колонии. При выращивании в пробирках с мясопептонным бульоном (Difco) наблюдалось образование плотной слизистой плёнки белого цвета, при этом среда оставалась прозрачной. При микроскопии мазков наблюдались отдельно или цепочками расположенные прямые палочки, которые положительно окрашивались по Граму. При окраске по Пешкову и Шефферу-Фултону обнаружены эндоспоры сферической формы центрального типа спорообразования. При нанесении на поверхность колоний 3% перекиси водорода наблюдалось образование пузырьков, что указывало на каталазную активность микроорганизма. В полужидком агаре отмечен диффузный рост, что свидетельствовало об активной подвижности изучаемого штамма. На основании полученных данных штамм был отнесён к роду Bacillus и в дальнейшем получил название Bacillus sp. ТУ22. При идентификации штамма №10 было установлено, что клетки представляют собой палочки, которые отрицательно окрашивались по Граму. При окраске клеток методом Шеффера-Фултона споровых форм не обнаружено. При посеве на мясопептонный агар Difco формировались выпуклые, гладкие, блестящие, сероватого цвета, диаметром 10-25 мм колонии. В пробирках с мясопептонным бульоном Difco плёнка не образовывалась, наблюдался плотный осадок белого цвета, через 24 ч среда мутнела. В полужидком агаре наблюдался диффузный рост, что указывает на активную подвижность штамма. Результаты исследования наличия оксидазы указанного штамма при помощи СИБ показали отрицательный результат. Штамм обладал каталазной активностью, а на среде Хью-Лейфсона окислял, но не ферментировал глюкозу. Результаты экспериментов по декарбоксилированию аминокислот обнаружили положительную реакцию на аргининдигидролазу и отрицательную на лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарбоксилазу. Полученные результаты исследований позволили отнести данный штамм к роду Pseudomonas и обозначить как Pseudomonas sp. ТУ10. Влияние физико-химических факторов на рост и углеводородокисляющую активность микроорганизмов Нами проведена сравнительная оценка нескольких синтетических сред с целью выяснения, какая из них является пригодной для развития штаммов Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22. Конкретно, в наших экспериментах были использованы три среды, содержащие углеводороды нефти: Гафарова, Рахимовой и 8Е. Для того, чтобы выяснить, насколько присутствие углеводородов нефти оказывает влияние на рост штаммов УОМ, в контрольные флаконы со средами нефть не добавляли. Штаммы засевали в количестве 108 кл/мл, выращивали при температуре 37° С в течение 7 суток, делая высевы на чашки Петри с питательным агаром. При культивировании Bacillus sp. ТУ22 в синтетических средах, не содержащих нефти, во всех вариантах наблюдалось уменьшение по сравнению с начальной концентрации клеток. В средах с добавлением нефти рост 7 отмечался только в среде Гафарова, причем наиболее заметно это проявлялось на 2 сутки культивирования, когда концентрация увеличивалась до 1,2·108 КОЕ/мл (рис.1). Рисунок 1 – Кинетика роста штамма Bacillus sp. ТУ22 в различных синтетических средах: а – среды без добавления нефти, б – среды с добавлением нефти (1% об.) При культивировании Pseudomonas sp. ТУ10 как в средах с добавлением нефти, так и без неё, максимальный рост выявлен в среде Рахимовой. При этом максимальная концентрация биомассы псевдомонад в среде Рахимовой с добавлением нефти, во-первых, достигалась быстрее, чем в среде без нефти: на 1-ые и 5-ые сутки культивирования соответственно, и, во-вторых, была выше в 1,5 раза, чем концентрация клеток в среде без добавления нефти (1,6 против 1,1·108 КОЕ/мл) (рис.2). Рисунок 2 – Кинетика роста штамма Pseudomonas sp. ТУ10 в различных синтетических средах: а – среды без добавления нефти, б – среды с добавлением нефти (1% об.) 8 Таким образом, из исследованных синтетических сред оптимальной для роста Bacillus sp. ТУ22 оказалась минимальная среда Гафарова, а для Pseudomonas sp. ТУ10 – среда Рахимовой. Температура является одним из важнейших факторов, влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Прежде всего, была определена возможность развития штаммов при температуре 10° С и 42° С. Оказалось, что у обоих штаммов в этих условиях активного роста и не наблюдалось. В последующем динамика роста обоих штаммов при глубинном аппаратном культивировании была исследована в течение 48 часов в более узком диапазоне температур: 20° С, 30° С и 37° С. Установлено, что при 30° С штамм Bacillus sp. ТУ22 практически сразу же начинал активно развиваться, и максимальная концентрация биомассы превышала посевную дозу почти в 30 раз. В условиях выращивания при 20° и 37° С активный рост бактерий начинался через 3-9 часов, а урожайность биомассы превышала исходную концентрацию клеток в 18,3 и 6,6 раза соответственно. Размножение клеток Pseudomonas sp. ТУ10 происходило после непродолжительной (2-6 ч) лаг-фазы в течение 6-10 часов. Стационарная фаза начиналась через 9 часов, если бактерии выращивали при 30° либо 37 ° С, или через 48 ч при инкубации при 20° С. В зависимости от температуры культивирования концентрация биомассы в стационарной фазе, по сравнению с начальной, увеличивалась соответственно в 34, 20,2 и 4,83 раза. Таким образом, для эффективного размножения Bacillus sp. ТУ22 оптимальной является температура 30° С, а для Pseudomonas sp. ТУ10 – 37° С. Полученные данные по влиянию температуры на рост двух штаммов легли в основу дальнейшей исследовательской работы при глубинном аппаратном культивировании. Как и температура, кислотность среды является лимитирующим фактором для развития микроорганизмов. В соответствии с этим исследовано влияние слабокислой (pH=6,8±0,1) и слабощелочной (pH=7,2±0,1) реакции среды на штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов. В процессе опытов установлено, что при pH=6,8±0,1 фаза экспоненциального роста у Bacillus sp. ТУ22 начиналась через 3-4 часа после посева материала и продолжалась 6-8 часов. Концентрация биомассы в стационарной фазе по сравнению с посевной дозой увеличивалась в 2,23 раза. Удельная скорость роста равнялась µ=0,08 ч-1, время удвоение биомассы составляло td=8,66 ч, а степень размножения n=0,93. В слабощелочной среде (pH=7,2±0,1) у Bacillus sp. ТУ22 лаг-фаза продолжалась в течение 0,5-1,5 часа, после чего наступала фаза логарифмического роста, которая длилась от 4 до 6 часов. В этих случаях максимальная концентрация клеток достигала 1,78·109 КОЕ/мл и превышала начальную в 17,8 раза. Параметры роста в экспоненциальной фазе составили: µ=0,72 ч-1, td=0,96 ч, n=4,15. При культивировании Pseudomonas sp. ТУ10 в среде со слабокислой реакцией размножение клеток происходило незначительно, и концентрация изменялась в пределах (5·107) –(2·108) кл/мл. Лаг-фаза длилась 5-7 часов, после чего наступала непродолжительная фаза экспоненциального роста. Макси9 мальная концентрация микробной биомассы превышала начальную в 1,67 раза. Определенный рост Pseudomonas sp. ТУ10 наблюдался в слабощелочной среде (pH=7,2±0,1). В этих случаях максимум концентрации микроорганизмов в жидкой среде был выше начального значения в 5,87 раза. Это происходило через 12 часов после начала культивирования. Таким образом, для размножения штамма Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУ10 слабощелочная среда (pH=7,2±0,1) оказалась более благоприятной по сравнению со слабокислой (pH=6,8±0,1). При глубинном культивировании для нормального роста УОМ необходим кислород. Было изучено влияние различных условий аэрации на размножение бактериальных клеток: в одном случае аэрация жидкой питательной среды осуществлялась за счет искусственно нагнетаемого со скоростью 0,5 л/мин воздуха и перемешивания среды с помощью магнитной мешалки, в другом воздух в культуральный сосуд не подавали. В третьем варианте в аэрируемую среду добавляли перфтортрибутиламин, препарат который обладает аномально высокой способностью к растворению газов при обычном барометрическом давлении. При культивировании штамма Bacillus sp. ТУ22 в трёх вариантах отмечалось снижение концентрации бактерий в первые 4-6 часов после начала эксперимента. Затем в случаях, когда в среду искусственно нагнетали воздух, происходило размножение клеток, и после 5-6 часового роста культура достигала стационарной фазы, продолжавшейся в течение 26-31 ч. Максимальная концентрация бактерий была выше начальной в 2,23 раза. Во втором варианте клетки постепенно отмирали, их концентрация на всем протяжении опыта была ниже, чем в момент посева. Добавление ПФОС не оказывало на рост штамма стимулирующего воздействия, а, наоборот, наблюдалось снижение числа бактериальных клеток (рис.3). Рисунок 3 – Кинетика роста Bacillus sp. ТУ22 в различных условиях аэрации 10 При выращивании Pseudomonas sp. ТУ10 лаг-фаза во всех трёх вариантах длилась от 2 до 5 часов. Фаза экспоненциального роста в условиях принудительной аэрации была непродолжительной и длилась 4-6 часов. Добавление в среду ПФОС увеличивало экспоненциальную фазу до 22-25 часов, при этом концентрация биомассы псевдомонад через 36 ч после начала культивирования была наиболее высокой и составляла 6,39·109 КОЕ/мл. Отсутствие принудительной аэрации оказывало отрицательный эффект на рост микробной популяции, и концентрация бактерий на вторые сутки снижалась до (1-3)·105 КОЕ/мл (рис. 4). Рисунок 4 – Кинетика роста Pseudomonas sp. ТУ10 в различных условиях аэрации Таким образом, рост двух штаммов в условиях искусственной аэрации был интенсивнее, чем в случаях, когда подача воздуха и перемешивание среды не проводились. Добавление в питательную среду ПФОС оказывало различный эффект на рост изучаемых штаммов. Эти соединения не оказывали благоприятного эффекта на рост штамма Bacillus sp. ТУ22, но позитивно влияли на развитие Pseudomonas sp. ТУ10. Нижневолжский регион, в который входит Волгоградская область, омывается водами Каспийского моря. В связи с этим исследована способность роста двух штаммов в среде с высоким содержанием морских солей и нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии. Эксперименты проводились в средах с различной концентрацией морской соли «Marbelle»: 5‰, 10‰, 35‰, 50‰. Наименее выраженное ингибирующее действие на рост бактерий наблюдалось при содержании морской соли в среде в количестве 5‰. В этих случаях через 24 часа после начала экспериментов происходило снижение 11 концентрации клеток Bacillus sp. ТУ22 до 3,33·107 КОЕ/мл. Увеличение концентрации соли и продолжительности процесса выращивания приводило к дальнейшей гибели клеток исследуемого микроорганизма. В целом концентрация клеток Bacillus sp. ТУ22 в течение эксперимента во всех вариантах была ниже начальной концентрации. При культивировании Pseudomonas sp. ТУ10 в среде с 5‰ морской соли через 24 и 48 часов после начала эксперимента концентрация микробной биомассы составила соответственно 1,57·108 и 1,58·108 КОЕ/мл. Эти значения превышали посевную дозу и были максимальными во всех вариантах эксперимента. Таким образом, из двух микроорганизмов лишь штамм Pseudomonas sp. ТУ10 проявлял определенные галофильные свойства, обладал способностью размножаться в содержащей морскую соль среде. Наиболее заметное размножение клеток наблюдалось в среде, содержащей морскую соль в количестве 5‰, хотя процессы развития микробных популяций происходили и при более высоких концентрациях (10‰). На рост и развитие микроорганизмов оказывают значительное влияние микроэлементы. Одним из таких микроэлементов является молибден. У факультативных анаэробов, среди которых встречаются представители двух изучаемых родов, молибден входит в состав нитратредуктазы – фермента, регулирующего процессы биологического окисления, при которых нитраты могут быть использованы в качестве альтернативных акцепторов электронов. Было исследовано влияние на рост УОМ этого микроэлемент, который вносили в среду в виде молибденовокислого аммония в концентрациях 5, 50 и 500 мг/л. В контрольном среде молибдат аммония отсутствовал. При культивировании штамма Pseudomonas sp. ТУ10 в среде с молибденовокислым аммонием в количестве 5 мг/л концентрация микробной биомассы через 48 часов превышала начальную в 10,2 раза, а при его содержании 50 мг/л – в 11,2 раза. Показатели концентрации составили соответственно 1,02·109 и 1,12·109 КОЕ/мл. Увеличение молибдата аммония в среде до 500 мг/л приводило к замедлению роста культуры и уменьшению биомассы по сравнению с посевной дозой в 2 раза. Через 24 часа роста Bacillus sp. ТУ22 концентрация биомассы штамма в среде с содержанием молибдата аммония 500 мг/л была выше начальной в 43,3 раза, а через 48 часов – в 10,9 раза. В остальных вариантах столь интенсивного роста не наблюдалось, хотя максимальная концентрация превышала начальную в 7-9 раз. Таким образом, наиболее эффективное действие на рост Pseudomonas sp. ТУ10 молибдат аммония оказывал при содержании в среде в количестве 50 мг/л, а для роста Bacillus sp. ТУ22 наиболее эффективной установлена концентрация в 500 мг/л. Микробиологические процессы, в том числе и окисление нефти, зачастую осуществляются ассоциациями микроорганизмов. В связи с этим исследован рост штаммов Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22 в виде двухкомпонентной культуры, а также взаимоотношения штаммов внутри микробной ассоциации, возможность их совместного использования для биоремедиации. 12 Эксперименты по изучению роста проводили при температуре 30°С, на среде Рахимовой глубинным методом в трёх вариантах, которые различались в соотношениях посевной дозы. В первом варианте концентрация двух микроорганизмов при посеве была одинаковой – 108 кл/мл, т.е. соотношение составило 1:1. Во втором и третьем вариантах концентрации клеток Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22 было 10:1 и 1:10. Оказалось, что во всех вариантах происходит ингибирование роста штамма Bacillus sp. ТУ22 и уменьшение концентрации бактерий по сравнению с начальной в 500-1000 раз. На фоне этого наблюдалось размножение клеток Pseudomonas sp. ТУ10. Причем наиболее высокая урожайность псевдомонад отмечена при равных посевных дозах. В этом случае концентрация достигала 2,73·108 КОЕ/мл через 12 часов после начала эксперимента. В других вариантах концентрация биомассы Pseudomonas sp. ТУ10 в течение всего эксперимента не превышала начальную. Таким образом, использование штаммов Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22 в виде ассоциированной культуры для биоремедиации нефтезагрязненных объектов представляется малоперспективным. Для получения микробной биомассы в лабораторных и промышленных условиях необходимо, прежде всего, обеспечить клетки необходимыми элементами питания. С экономической точки зрения наиболее выгодно использовать для этих целей различные отходы пищевой промышленности, богатые углеводами, в том числе мелассу. Меласса представляет собой побочный продукт сахарной промышленности и содержит 61-86% сухих веществ, основная часть которых – сахароза (40-55%) и зольные вещества (813%). Было исследовано развитие штаммов в среде с содержанием мелассы 0,1%, 0,5%, 1%, 2,5%, 5%. Результаты исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 – Концентрация микробной биомассы в среде с различным содержанием мелассы Концентрация мелассы (%) 0,1 0,5 1 2,5 5 Концентрация микробной биомассы, КОЕ/мл Pseudomonas sp. ТУ10 Bacillus sp. ТУ22 24 часа 48 часов 24 часа 48 часов 8 9 7 1,4·10 2,3·10 6,3·10 5,5·109 8 10 8 8,5·10 1,3·10 2,0·10 1,1·1010 1,2·108 8,2·109 5,3·107 3,3·109 7 7 3,3·10 2,0·10 0 0 0 0 0 0 Из таблицы видно, что рост обоих микроорганизмов наблюдался при концентрации мелассы в среде в пределах от 0,1% до 1%. Наиболее эффективной урожайность микробной биомассы оказалась при концентрации мелассы 0,5% и продолжительности выращивания в течение 48 часов. Повышение содержания мелассы до 2,5% приводило к снижению урожайности псевдомонад, тогда как рост Bacillus sp. ТУ22 в этих случаях вовсе 13 прекращался. Дальнейшее увеличение мелассы в среде (до 5%) пагубно сказывалось и на развитие Pseudomonas sp. ТУ10. В последующих экспериментах при глубинном культивировании в ферментёре в среде с мелассой установлено, что Pseudomonas sp. ТУ10 после некоторой лаг-фазы (9 ч.) начинал интенсивно размножаться, и логарифмический рост продолжался с 9 до 24 ч после начала эксперимента. Максимальная концентрация к началу стационарной фазы составила 1,67·1010 КОЕ/мл, µ=0,68 ч-1, td=1,02 ч, n=11,82. У штамма Bacillus sp. ТУ22 лаг-фаза продолжалась 12 часов, а экспоненциальная фаза - до 24 часов от начала опыта. Максимальная концентрация биомассы бацилл достигала 5,8·1010 КОЕ/мл, µ=0,19 ч-1, td=3,74 ч, n=4,29. Изучение способности штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов к биоремедиации нефтезагрязнённых почв Способность двух штаммов к окислению нефти в почве изучали в условиях искусственной модели экосистемы. Для этого использован метод молярности этаноловых капель, который применяется для изучения гидрофобных свойств почвы и определения общего содержания углеводородов нефти в почве. Для установления зависимости между молярностью этаноловых капель, проникающих в почву, и общим содержанием в ней углеводородов нефти использовали чашки Петри, в которые помещали почвенные образцы и вносили нефть из расчета 5, 10, 15, 20 и 25 мг/г. Чашки закрывали и оставляли при комнатной температуре в течение 72 часов. Затем на поверхность почвы в чашках наносили капли этилового спирта различной молярности и наблюдали за скоростью впитывания капли в почву в течение 10 секунд. На основании полученных данных построен калибровочный график. В экспериментах по определению степени биодеструкции нефти исследуемыми штаммами по 20 г почвы вносились в 10 чашек Петри и стерилизовали при 165-170° С в течение 2 часов. Затем в чашки с почвой вносили нефть в тех же концентрациях нефти на 1 грамм почвы и засевали штаммами УОМ Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУ10. Чашки засевали из расчёта 108 кл/г почвы и с открытыми крышками помещали в термостат при температуре 30°С. Контроль за степенью разложения нефти проводили в течение 70 суток после начала эксперимента. Результаты опытов показали, что биодеструкция наблюдалась при концентрациях нефти меньше 15 мг/г. При содержании нефти в почве 5 мг/г штамм Pseudomonas sp. ТУ10 наиболее активно окислял углеводороды нефти, и на 63 сутки эксперимента их концентрация снижалась до значений, которые не удавалось обнаруживать данным методом. Bacillus sp. ТУ22 при содержании нефти 5 мг/г обладал несколько меньшей углеводородокисляющей активностью. При более высоких концентрациях данным методом деградацию нефти зарегистрировать не удалось (табл.2). Нефть оказывает токсическое воздействие на почву и вызывает негативные последствия для организмов, которые обитают в почве, в том числе и для растений. 14 Таблица 2 – Степень биодеструкции нефти в почве штаммами УОМ Начальная Степень биодеструкции нефти в почве, в % от начальной концентрация нефти концентрации в почве, мг/г Pseudomonas sp. ТУ10 Bacillus sp. ТУ22 5 100 92 10 58 61 15 21 27 Одним из методов определения фитотоксичности почв является метод проростков, который основан на реакции тест-культур на содержание в почве различных загрязнителей (в том числе и нефти) и позволяет выявить токсичное (ингибирующее) действие поллютанта на проростки тест-культур. Выращивание растений в нефтезагрязнённой почве проводили с использованием контейнеров с почвой. Для этого в опытные контейнеры вносили нефть в концентрации 5 мг/г почвы. Затем добавляли суспензию штаммов УОМ как в отдельности, так и в виде ассоциации в концентрациях 3·107 – 108 кл/мл. В качестве контроля использовалась почва без нефти и штаммов-нефтедестукторов. Все варианты опыта и контроля продолжались в течение 21 дня при комнатной температуре и влажности грунта 50-60%, после чего в контейнеры были внесены семена редиса. Наблюдения за проростками проводили в течение двух недель. Об остаточной фитотоксичности судили по всхожести семян редиса. Анализ всхожести семян редиса показал, что лучше всего семена прорастали в опытах, где в качестве нефтедеструктора использовался штамм Bacillus sp. ТУ22. В случаях, где в контейнеры с нефтезагрязнённой почвой был внесён только штамм Pseudomonas sp. ТУ10, всхожести семян не наблюдалось. В контейнерах, куда добавляли в почву микробную ассоциацию из штаммов Pseudomonas sp. ТУ10 и Bacillus sp. ТУ22 всхожесть семян была невысокой – 25%. Таким образом, методом биотестирования на остаточную фитотоксичность удалось установить, что штамм Bacillus sp. ТУ22 эффективно снижает токсическое воздействие содержащейся в почве нефти, тогда как у Pseudomonas sp. ТУ10 подобного действия не отмечено. Конструирование установки для глубинного культивирования микроорганизмов При получении микробной биомассы и продуктов микробного синтеза используются различные установки для культивирования микроорганизмов. Однако известные промышленные и лабораторные установки не всегда обеспечивает надёжную защиту окружающей среды от бактериальных аэрозолей, непременно образующихся в результате искусственной аэрации, необходимой для насыщения питательной среды кислородом. Особое значение проблема биологической защиты приобретает при выращивании условно патогенных 15 микроорганизмов, среди которых встречаются углеводородокисляющие виды. В связи с этим, в процессе настоящей работы сконструирована установка, оснащённая вакуумным насосом, подключённым к патрубкам отвода воздуха и отбора проб, системой очистки отработанного воздуха, состоящей из ёмкостей с дезинфицирубщими растворами, при этом указанные патрубки и патрубок для подачи инокулята снабжены клапанами. Установка предотвращает попадание бактериальных аэрозолей в окружающую среду и обеспечивает высокую степень экологической и биологической безопасности. Разработанная установка утверждена Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и рекомендована для проведения процессов глубинного культивирования микроорганизмов различной степени патогенности. ВЫВОДЫ 1. Изучены выделенные из нефтешлама углеводородокисляющие микроорганизмы, которые на основании тинкториальных, морфологических, культуральных и биохимических свойств идентифицированы как Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУ10. 2. Показано, что на развитие идентифицированных штаммов благоприятно влияла принудительная аэрация и слабощелочная реакция питательной среды. Добавление в среду перфторированных органических соединений углерода в условиях аэрации обеспечивало наиболее высокую концентрацию биомассы псевдомонад, тогда как в отношении бацилл эти соединения стимулирующим действием не обладали. Оптимальной для развития штамма Bacillus sp. ТУ22 оказалась температура 30° С, а для Pseudomonas sp.ТУ10 37° С. 3. Определена способность штаммов расти в среде, содержащей морскую соль и нефть в качестве единственного источника углерода и энергии. Выявлено, что из двух изучаемых микроорганизмов галофильным оказался лишь Pseudomonas sp. ТУ10. Штамм размножался в среде с содержанием соли до 5-10 ‰, тогда как на другой микроорганизм такие концентрации оказывали ингибирующее действие. Показано позитивное влияние соединений молибдена на рост и развитие изучаемых штаммов. Эффективной для роста Pseudomonas sp.ТУ10 оказалась концентрация молибденовокислого аммония 50 мг/л, а для Bacillus sp. ТУ22 – 500 мг/л. Экспериментально обоснована возможность использования и определена оптимальная концентрация (0,5%) мелассы как основы питательной среды для получения биомассы УОМ. 4. Обнаружено, что при росте микробной ассоциации, состоящей из штаммов двух микроорганизмов, Pseudomonas sp. ТУ10 имеет конкурентное преимущество по отношению к Bacillus sp. ТУ22. 5. На основе искусственной модели с использованием метода молярности этаноловых капель определена эффективность бактерий в процессах биоремедиации нефтезагрязненной почвы. Наиболее эффективно окисление нефти происходило при её концентрации 5 мг/г. Pseudomonas sp. ТУ10 практически полностью разлагал углеводороды нефти в течение 63 суток, а при использовании Bacillus sp. ТУ22 уровень содержания углеводородов снижался 16 на 92% после 70 суток инокуляции. Однако последний микроорганизм обладал более выраженным детоксицирующим действием в тестах на фитотоксичность. 6. Для эффективного получения биомассы и продуктов микробного синтеза сконструирована установка, обеспечивающая высокую степень экологической и биологической безопасности процессов глубинного культивирования микроорганизмов различной степени патогенности. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Самыгин, В.М. Конструктивные особенности установки для глубинного культивирования патогенных микроорганизмов / В.М. Самыгин, Т.А. Гришкина, Л.К. Жога, А.Ю. Александров, С.Э. Лекарева // Материалы IX съезда Всероссийского науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – М., 2007. – Т.2. – C. 310-311. 2. Александров, А.Ю. Некоторые характеристики штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтешлама / А.Ю. Александров, И.В. Соколова // Биология – наука XXI века: 11-ая Пущинская школа конференция молодых учёных: сборник тезисов. – Пущино, 2007. – C. 28. 3. Александров, А.Ю. Исследование штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов / А.Ю. Александров // XII Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области, Направление 16 «Архитектура, градостроительство, строительство и экологические проблемы»: тезисы докладов. – Волгоград: ВолгГАСУ, 2008. – C. 22-24. 4. Александров, А.Ю. Углеводородокисляющий штамм бактерий рода Bacillus / А.Ю. Александров, В.М. Самыгин // Приоритетные направления развития науки и технологий: доклады всероссийской научн.-техн. конф. – Тула: Изд-во ТулГУ, 2008. – C. 59. 5. Самыгин, В.М. Конструкция установки для глубинного культивирования аэробных патогенов / В.М. Самыгин, И.В. Владимцева, Т.А. Гришкина, А.Ю. Александров, С.В. Редкозубов // Биотехнология. – 2008. – № 2. – C. 65-68. 6. Александров, А.Ю. Штаммы-деструкторы нефти и нефтепродуктов: идентификация и свойства / А.Ю. Александров // Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): материалы междунар. науч. конф. – Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2008. – C. 335-337. 7. Александров, А.Ю. Рост углеводородокисляющих микроорганизмов в среде на основе мелассы / А.Ю. Александров, Т.Н.М. Нгуен // XIII Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области, Направление 11 «Биология и география»: сб.науч. материалов. – Волгоград: Изд-во ВГПУ «Перемена», 2009. – C. 7-9. 8. Александров, А.Ю. Оценка степени биодеструкции нефти в почве методом молярности этаноловых капель / А.Ю. Александров // Экологические проблемы промышленных городов: сб. науч. трудов. – Саратов, 2009. – Ч.1. – С.124-127. 9. Александров, А.Ю. Влияние состава среды и условий культивирования на рост углеводородокисляющих микроорганизмов / А.Ю. Александров // Ло17 моносов-2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; секция «Биология»: тезисы докладов. – М.: МАКС Пресс, 2009. – С. 155-156. 10. Александров, А.Ю. Характеристика штаммов микроорганизмов, участвующих в процессах биоремедиации / А.Ю. Александров // Вестник Волгоградского государственного университета. Сер. 3 «Экономика. Экология». – 2009. – №1 (14). – С. 231-237. 18
