Комбинированный спектроскопический метод исследования
advertisement
На правах рукописи Савельева Татьяна Александровна КОМБИНИРОВАННЫЙ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СИЛЬНОРАССЕИВАЮЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД 01.04.21 – Лазерная физика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Лощенов Виктор Борисович Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей физики им. АМ. Прохорова Российской академии наук, заведующий лабораторией Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Кустов Евгений Федорович, Национальный исследовательский университет «МЭИ», профессор кандидат физико-математических наук, Приезжев Александр Васильевич, Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, доцент Ведущая организация: Национальный исследовательский Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского Защита диссертации состоится 2 декабря 2013 г. на заседании диссертационного совета Д002.063.03 при ИОФ РАН по адресу г. Москва 119991, ул. Вавилова, 38. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОФ РАН. Автореферат разослан ___________________ (дата) Ученый секретарь диссертационного совета__________________________Т.Б. Воляк (подпись) Общая характеристика работы Работа посвящена флуоресцентного и исследованию широкополосного взаимодействия излучения с лазерного, сильнорассеивающими биологическими средами, содержащими флуоресцентный фотосенсибилизатор протопорфирин биологических IX, сред и для развитию спектроскопических осуществления возможности методов анализа интраоперационного определения концентраций содержащихся в тканях хромофоров и флуорофоров и их распределения в поверхностном слое тканей различных органов или в зоне хирургического вмешательства. Актуальность работы Разнообразие светорассеивающих сред и сложность их изучения обуславливают научный интерес к этому объекту. Одним из классических примеров мутных сред являются биологические ткани. Спектроскопический анализ состава сильнорассеивающих сред, в частности биологических тканей, сопряжен с трудностью интерпретации спектральных зависимостей излучения, подвергшегося в среде как поглощению, так и многократному рассеянию. На настоящий момент при проведении флуоресцентного спектрального анализа in vivo в некоторых случаях его сочетают с измерением спектров обратного диффузного отражения [1, 2]. Коррекция спектров флуоресценции с помощью результатов анализа спектров диффузного отражения обеспечивает определение состава флуорофоров в ткани. В ряде случаев спектр обратного диффузного отражения используется для независимого анализа поглощающих и рассеивающих свойств исследуемых сред [3]. Также следует отметить, что последовательное измерение спектров диффузного отражения и флуоресценции чревато возникновением артефактов, обусловленных взаимным смещением источника света, объекта и фотоприемника, и увеличением времени анализа, что может оказаться неприемлемым в клинических условиях. Что касается систем спектрально-разрешенной визуализации, то они, как правило, используют наборы узкополосных фильтров или перестраиваемые фильтры для получения изображений объекта, либо основаны на методе сканирования всего поля изображения поточечно с использованием классической спектроскопической 3 системы с диспергирующим элементом [4]. У обоих подходов основным недостатком является низкая скорость анализа данных. В то же время при решении прикладных задач нет необходимости в анализе всего видимого диапазона спектра, либо в получении гиперспектральных изображений с максимально возможным разрешением. Достичь высокой эффективности диагностики биологических сред в каждом конкретном случае можно тщательно изучив свойства исследуемых тканей, их пигментный состав, метаболические и структурные особенности и построив теорию формирования спектроскопических зависимостей с учетом условий регистрации сигнала. Целью данной работы являлось создание алгоритмов интерпретации комбинированных спектроскопических сигналов, получаемых с использованием оптоволоконных зондов и матричных фотоприемников, для диагностики состояния биологических тканей в живом организме. Для чего были решены следующие задачи: 1. Разработка методов регистрации комбинированных спектров диффузного отражения и флуоресценции с применением волоконно-оптических зондов и матричных фотоприемников. 2. Разработка алгоритмов анализа комбинированных спектров, позволяющих проводить спектроскопический анализ в живом организме в реальном времени. 3. Создание программного и аппаратного обеспечения для повышения чувствительности и специфичности интраоперационной диагностики и апробация на физических и биологических моделях, а также в клинических условиях. Научная новизна представленной работы состоит в разработке оригинального метода регистрации и анализа комбинированных спектров обратного диффузного отражения и флуоресценции. Метод реализован с помощью разделения видимого диапазона на три канала и последующего анализа с экстраполяцией данных, полученных в каждом канале, на соседние диапазоны. Также разработан метод регистрации и анализа спектрально-разрешенных изображений, основанный на линеаризации зависимости коэффициента экстинкции от отношения оптических свойств исследуемых тканей в физиологическом диапазоне их изменения. 4 Впервые предложена математическая модель формирования сигнала диффузного рассеяния света нервными тканями, включающая в рассмотрение такие структурные элементы нервных тканей как оболочки миелинизированных волокон. Практическая значимость Предложенный метод комбинированной спектроскопии был апробирован в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко при проведении интраоперационной навигации во время операций по удалению внутричерепных и интрамедуллярных опухолей. В качестве опухолевого маркера использовался эндогенный протопорфирин IX, индуцированный предварительным введением в организм пациента 5-аминолевулиновой кислоты. Метод показал повышение чувствительности и специфичности диагностики по сравнению как с ординарным спектроскопическим анализом, так и с анализом видеофлуоресцентных изображений с помощью операционного флуоресцентного микроскопа Karl Zeiss Opmi Pentero. Система анализа мультиспектральных изображений, сопряжённая со стандартной щелевой лампой, была использована в ФГБУ «НИИ глазных болезней» РАМН для косвенной оценки уровня внутриглазного давления по степени оксигенации сосудов глазного дна и при проведении лабораторных исследований по эффективности фотодинамической терапии и приживлению тканей в ИОФ РАН. Разработанные методы также нашли применение в научных исследованиях, выполняемых совместно с ФГБУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского» Минздрава России. Основные положения, выносимые на защиту 1. Разделение видимого спектра на диапазоны регистрации спектров обратного диффузного отражения и флуоресценции позволяет проводить одновременный анализ содержания основных хромофоров и флуорофоров, а также структурных изменений биологических тканей. 2. Для восстановления информации о содержании в тканях гемоглобина в оксигенированной и дезоксигенированной форме по спектрально-разрешенным изображениям может быть использовано линейное приближение зависимости коэффициента экстинкции от концентрации поглотителей. 5 3. Сигнал обратного диффузного отражения, регистрируемый от нервных тканей с помощью оптоволоконного зонда на расстоянии от осветительного волокна, сравнимом по величине с диффузионной глубиной, обусловлен тремя основными компонентами – малыми органеллами, клеточными ядрами и миелинизированными нервными волокнами. 4. Комбинированный спектроскопический метод повышает чувствительность и специфичность интраоперационной диагностики по сравнению с методами, использующими в качестве опухолевого маркера только один параметр. Апробация работы Материалы диссертации были доложены на ряде научных конференций: II Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине»; Отечественные противоопухолевые препараты 2007, 2008, 2009; Advanced Laser Technologies 2007, 2008, 2009; International symposium on Laser medical application (LMA’2010), Москва; XIV International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics Saratov Fall Meeting SFM’2010, 2011; научнопрактическая конференция «Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика» 2011, Санкт-Петербург; LPHYS'11, Sarajevo; Laser Florence 2011; SPIE Photonics West, San Francisco, 2012. По основным результатам работы опубликовано 16 работ в рецензируемых журналах и научных сборниках, а также глава монографии «Современные технологии и клинические исследования в нейрохирургии». Содержание работы Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследования, основные положения, выносимые на защиту, приведена практическая значимость разработанного метода. В первой главе рассмотрен вопрос актуальности анализа состава биологических тканей с помощью спектроскопии диффузного отражения и флуоресцентной спектроскопии, обусловленной тем, что спектроскопический анализ биологических сред позволяет определять как структурные изменения тканей, так и их метаболическую активность, не повреждая сами ткани. Его методы отличаются высокой скоростью, значительной чувствительностью и хорошим 6 пространственным разрешением, что приобретает особое значение в микрохирургии и нейроонкологии. Однако особенности спектроскопического анализа биологических сред требуют комплексного подхода для достижения максимальной чувствительности диагностического метода, построенного на его основе. В первой главе формулируются основные проблемы, требующие решения при анализе спектров диффузного отражения и флуоресценции, получаемых в процессе анализа сильнорассеивающих биологических сред, а также существующие на настоящий момент способы их решения. Во второй главе описаны устройство для одновременной регистрации и анализа спектров диффузного отражения и флуоресценции и устройство для регистрации и анализа спектрально-разрешенных изображений, реализующие предложенный в работе комбинированный спектроскопический метод. Спектроскопические спектроанализатора измерения проводились ЛЭСА-01-БИОСПЕК [5], с помощью модифицированного лазерного системой фильтров и использованием волоконно-оптического зонда с двумя осветительными каналами. В диапазоне спектра 500-600 нм реализована регистрация спектров обратного диффузного отражения, позволяющая производить количественную оценку концентрации гемоглобина в оксигенированной и редуцированной форме. Интенсивность диффузно отраженного назад лазерного излучения, используемого для возбуждения флуоресценции опухолевого маркера, служит для анализа рассеивающих свойств исследуемых тканей. В красном и ближнем инфракрасном диапазонах регистрируется сигнал флуоресценции протопорфирина IX и продуктов фотораспада. Геометрия измерений, производимых с помощью оптоволоконного зонда, представлена на рис. 1. Два тонких оптоволокна с заданными значениями апертуры ввода и приема излучения находятся на некотором расстоянии друг от друга. По одному из них к исследуемой ткани поступает лазерное или широкополосное излучение, которое, подвергшись многократному рассеянию и частичному поглощению, поступает во второе волокно, передающее ослабленный сигнал на вход спектрометра. При этом часть поглощенного в ткани излучения вызывает 7 флуоресценцию содержащихся в ней флуорофоров, что приводит к регистрации флуоресцентного излучения. Рис. 1. Схема проведения спектроскопических измерений с использованием оптоволоконной системы. Взаимодействие излучения с биологическими средами на микроуровне описывается в терминах комплексного показателя преломления (n� = n + i ∙ k) и относительного размера (x = 2πna⁄λ) основных структурных элементов ткани (с характерным размером a). Эти параметры позволяют с помощью уравнений Максвелла вычислить такие параметры как сечение поглощения (σa ) и рассеяния (σs ) света отдельной частицей, а также определить угловую зависимость рассеяния (P(Θ)). При переходе от отдельных частиц к их ансамблям используют уже усредненные по некоторому элементарному объёму оптические характеристики, такие как коэффициент поглощения (µa = c ∙ σa ), коэффициент рассеяния (µs = c ∙ σs ) и фактор анизотропии (g = ⟨cos (Θ)⟩). Для сред, характеризующихся анизотропным рассеянием, вводят также так называемый редуцированный коэффициент рассеяния (µ′s = µs (1 − g)). При переходе к рассмотрению взаимодействия излучения с макрокопическими объектами определенной геометрии вводятся такие параметры как коэффициент отражения (R), коэффициент диффузного отражения (Rd), коэффициент пропускания излучения через объект (T), коэффициент поглощения средой (A) падающего излучения. Эти параметры зависят не только от геометрии объекта, но и от геометрии измерений. Применение теории переноса излучения 8 (ТПИ) в среде позволяет, последовательно пройдя по всем введенным выше масштабным описаниям, восстановить фундаментальные параметры компонентов среды. Одной из важных характеристик распространения излучения в сильнорассеивающей среде является глубина проникновения света в вещество, определяемая в диффузионном приближении ТПИ как �3µa (µa + (1 − g)µs ). δ = 1/µeff = 1/ Однако в оптических измерениях, проводимых на живом организме, зачастую возможность измерения пропускания затруднена и в подавляющем большинстве случаев используется геометрия измерений, представленная на рис. 1. В этом случае коэффициент обратного диффузного отражения зависит не только от оптических свойств среды, но и от взаимного положения источника и приемника, а также от их числовых апертур и угла наклона по отношению к поверхности. При этом в рассмотрение вводится такая величина как глубина зондирования, соответствующая средней глубине, которой достигает излучение в ткани при прохождении от осветительного волокна к приемному. Рис. 2. Схема моделирования регистрации спектрально-разрешенных изображений формирование сигнала одного пикселя изображения. Регистрации мультиспектральных изображений также соответствует особая геометрия измерений. Для реализации метода было разработано устройство смены 9 фильтров, рассчитанное на комплект из четырех фильтров с учетом количества исследуемых параметров (любые четыре из набора 542 нм, 560 нм, 576 нм, 586 нм, 596 нм и фильтр для регистрации флуоресцентного излучения с максимумом пропускания на 710 нм). В качестве приемника изображений использовались камера Видеоскан-415-USB и фотоаппарат Canon EOS 5D Mark II. Рассмотрены варианты установки фильтрового колеса в осветительном и приемном каналах. На рис. 2 приведена схема формирования сигнала одного пикселя изображения как в дальней, так и в ближней зоне наблюдения. В работе рассмотрено влияние числовой апертуры приемника в различных положениях относительно поверхности ткани на значения детектируемого сигнала диффузного отражения. В силу высокой плотности рассеивающих элементов биологические ткани принято рассматривать как мутные среды, поэтому в работе подробно рассмотрены различные приближения теории переноса излучения и влияния на результат измерений геометрии эксперимента. В случае сложной геометрии оптической системы и/или исследуемой среды зачастую используют имитационное моделирование распространения света в сильнорассеивающих средах. Авторский программный код, реализующий имитационное моделирование методом МонтеКарло, приведен в Приложении к диссертационной работе. Особенностью разработанного алгоритма является учет длины пути света в ткани от осветительного до приемного волокна и глубины зондирования. Гистограммы распределения этих величин подвергались аппроксимации логнормальной зависимостью, мода которой соответствовала использованным при поиске описательной аналитической зависимости средним значениям длины пути и глубины зондирования. С целью интерпретации регистрируемых зависимостей рассмотрено взаимодействие света с биологическими тканями на микроуровне и влияние структурных и биохимических особенностей биологических тканей на их оптические свойства. В силу разнообразия структурных элементов, составляющих здоровое белое вещество и опухолевые ткани, таких как микрососуды, нервные волокна, клетки и клеточные органеллы, а также клеточные мембраны, характеризующиеся развитой поверхностью, рассмотрены различные решения 10 уравнений Максвелла для рассеяния света на структурах, геометрия которых в первом приближении описывает биологические прототипы. В третьей главе описаны теоретические основы разработки предлагаемого метода регистрации и анализа комбинированных спектров диффузного отражения и флуоресценции, его апробация на тестовых объектах и результаты применения в клинических условиях. Алгоритм анализа комбинированных спектров включает выделение из сигнала компонент, обусловленных рассеянием и поглощением, их интерпретацию и учет их влияния на спектр флуоресценции. Спектральная зависимость коэффициента поглощения позволяет восстановить информацию о концентрации исследуемых хромофоров. Для этого производится деконволюция спектра поглощения на известные компоненты, такие как гемоглобин в оксигенированной и редуцированной форме и Пп IX. Редуцированный коэффициент рассеяния используется в качестве критерия оценки плотности тканей, а также для количественного анализа содержания флуоресцирующего маркера в рассеивающей среде по спектру флуоресценции. Спектр флуоресценции, регистрируемый в длинноволновой области видимого спектра, нормируется на интенсивность диффузно-отраженного лазерного излучения с учетом поправки на отличия рассеивающих свойств среды в диапазоне флуоресцентного и возбуждающего излучения. Предложенный алгоритм не ограничивает свою функциональность 5АЛК индуцированным протопорфирином IX и может быть использован для анализа ряда флуоресцентных маркеров и фотосенсибилизаторов, в том числе тетрапиррольной природы, обладающих способностью к возбуждению и флуоресценции в соответствующих диапазонах спектра. Алгоритм восстановления данных основан на аналитической аппроксимации, полученной с помощью численного моделирования зависимости коэффициента диффузного отражения от оптических свойств исследуемой среды. Ниже приведены результаты моделирования для значений числовой апертуры источника и приемника излучения NA=0.37 для ряда расстояний между ними 0.25, 0.5, 1, 1.5 мм (рис.3). Показатель поглощения изменяется при этом в диапазоне от 0.5 до 8 см-1, что соответствует физиологическим значениям нормального белого вещества и астроцитарных опухолей различной степени озлокачествления [6]. 11 Коэффициент рассеяния и фактор анизотропии приняты равными таковым у нормальной ткани Рассматриваются мозга (белое коэффициент вещество) диффузного на длине отражения волны при 632.8 нм. определенном взаимном положении источника и приемника, глубина зондирования и длина пути излучения в ткани между источником и приемником. Их совместный анализ помогает прояснить физический смысл аппроксимирующих зависимостей. Рис. 3. Влияние коэффициента поглощения на коэффициент диффузного отражения (Rd), глубину зондирования и длину пути света в ткани для различных расстояний между источником и приемником. Очевидно, основной тенденцией всех рассматриваемых величин (рис. 3) является их снижение с ростом коэффициента поглощения. При этом с увеличением расстояния между источником и приемником (рис. 1) интенсивность диффузно-отраженного излучения падает, в то время как растут глубина зондирования и длина пути. Скорость падения сигнала диффузного отражения линейно увеличивается с увеличением расстояния. При этом из полученных зависимостей можно заключить, что эта скорость имеет физический смысл средней длины пути фотонов в ткани. R d (µa , d) = R0d (d) ∙ e−L(d)∙µa (1) На длину пути света в ткани также влияет и коэффициент рассеяния. В связи с этим аналогичный предыдущему анализ был проведен для ряда значений 12 коэффициента рассеяния при фиксированном значении коэффициента поглощения. Ниже приведены результаты имитационного моделирования, по которым можно судить о немонотонности исследуемых зависимостей (рис. 4). Рис. 4. Влияние коэффициента рассеяния на коэффициент диффузного отражения (R d ), глубину зондирования и длину пути света в ткани для различных расстояний между источником и приемником. Такое поведение коэффициента диффузного отражения обусловлено тем, что с ростом коэффициента рассеяния излучение концентрируется в проксимальной к источнику области, поскольку оно рассеивается после прохождения все меньшего пути и поглощается во все меньшем объеме. Если с увеличением коэффициента рассеяния приемное волокно оказывается за пределами области, определяемой величиной глубины проникновения, то интенсивность регистрируемого в этой точке диффузно-отраженного излучения спадает, поскольку эта область рассеяния сильнее «прижимается» к источнику. При этом сигнал, регистрируемый волокном внутри области, будет расти. Предложенная выше экспоненциальная зависимость (1) учитывает падение сигнала диффузного отражения с увеличением коэффициентов поглощения и рассеяния, то есть описывает поведение измеряемой величины за пределами области, проксимальной к волокну. Для аналитического описания поведения сигнала при различных соотношениях коэффициента рассеяния и расстояния между источником и приемником была 13 предложена модифицированная экспоненциальная зависимость, содержащая в качестве сомножителя коэффициент рассеяния, что обеспечило рост сигнала в проксимальной к источнику области: R d = A ∙ µ′s ∙ e−(B0+B1∙µ′s+B2∙µa) (2) где A, B i –коэффициенты, зависящие от расстояния между источником и приемником излучения. Модель показала хорошее соответствие с данными численного эксперимента (коэффициент корреляции >0.997) (рис.5). Рис. 5. Аппроксимация зависимостей сигнала диффузного отражения от рассеяния и поглощения, полученных в результате численного моделирования. Верификация предложенного алгоритма разложения сигнала на компоненты, обусловленные рассеянием и поглощением, была осуществлена с использованием оптических фантомов, содержащих эритроцитарную массу и жировую эмульсию в различных концентрациях. Следующим этапом исследования было построение модели формирования компоненты сигнала, обусловленной рассеянием. Известно, что при развитии опухолевого процесса увеличиваются размер и количество ядер опухолевых клеток, что является основным его морфологическим маркером. Однако не менее важными как с функциональной точки зрения, так и с точки зрения влияния на исследуемый сигнал являются изменения, происходящие на субклеточном и тканевом уровнях. Вследствие перехода опухолевых клеток на гликолиз деградируют структура и функции митохондрий, уменьшается их число. При замещении нормальных тканей опухолевыми клетками изменяются расположение и количество миелинизированных нервных волокон. В предложенной в настоящей 14 работе модели формирования сигнала были учтены все три перечисленных выше морфологических структуры. Особенностью этой модели является то, что они оказывают конкурирующее воздействие на сигнал диффузного отражения. В работе были рассмотрены рассеивающие свойства этих структур в отдельности посредством аналитического произведена оценка их математического вклада в моделирования, сигнал в составе а также комплексных сильнорассеивающих сред с помощью метода численного моделирования. Верификация предложенной модели производилась посредством сопоставления результатов численного моделирования и данных о плотности ткани, полученных в результате интраоперационного анализа спектральной зависимости диффузно-отраженного излучения. В результате были обнаружены различия в светорассеивающих свойствах для центра и края опухоли различной степени злокачественности (рис. 6). Рис. 6. Распределение относительного коэффициента диффузного отражения в зависимости от морфологического статуса ткани по результатам исследования внутриопухолевых локальных изменений (II, II, IV – степень озлокачествления по ВОЗ). Светорассеяние центральной части опухоли доброкачественных новообразований ниже, чем у глиобластомы, однако в обоих случаях эта величина значительно ниже, чем светорассеивающие свойства нормального белого вещества. Постепенная демиелинизация нервных волокон, их смещение и деструктуризация, а также падение содержания митохондрий вследствие перехода опухолевых клеток с окислительного фосфорилирования на гликолиз, приводят к снижению сигнала рассеяния, в то время как увеличение размеров и плотности ядер ведет к его увеличению. 15 Еще один параметр, определяемый методом комбинированной спектроскопии, - концентрация флуоресцентного опухолевого маркера Пп IX. Ее оценка производилась по соотношению интенсивности флуоресценции в области 710 нм и интенсивности рассеянного назад возбуждающего флуоресценцию лазерного излучения. Однако ввиду различий оптических свойств среды на длинах волн возбуждающего и флуоресцентного излучения был введен поправочный коэффициент, учитывающий эти различия и позволяющий нормировать флуоресценцию на рассеивающие свойства ткани в соответствующем ей спектральном диапазоне. Апробация комбинированного спектроскопического метода в клинических условиях осуществлялась в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко в рамках клинических исследований эффективности флуоресцентной диагностики с использованием 5-АЛК индуцированного Пп IX. В данной работе приведено рассмотрение распределения исследуемых параметров в операционном поле при удалении опухоли для пациентов с глиобластомой. На рис. 7 приведены спектральные зависимости, получаемые интраоперационно с помощью комбинированного метода. Рис. 7. Пример спектральных зависимостей, регистрируемых интраоперационно, и вычисляемых по ним характеристик, полученных во время удаления глиобластомы. 1 – нормальный мозг, 2 – край опухоли, 3 – центр опухоли. В результате сопоставления данных интраоперационного спектроскопического анализа, проводимого in vivo в зоне удаления (резекции) опухоли, и гистологической экспертизы образцов ткани, взятых из тех же областей, были получены данные о соответствии исследуемых спектроскопических характеристик типу ткани. Спектроскопические измерения, производимые во время операции, показали плавные изменения исследуемых характеристик в направлении от здоровой ткани к 16 центру опухоли, подчиняющиеся определенным закономерностям. В тканях с преобладанием некроза было показано отсутствие накопления Пп IX, высокий уровень рассеяния и кровенаполнения, низкий уровень оксигенации. Для этих участков уместнее оперировать термином «концентрация гемоглобина» вместо термина «кровенаполнение», поскольку в некротических тканях высокое значение этого параметра, скорее всего, достигается за счет геморрагий. Для образцов ткани из центра опухоли с микроскопическими включениями некроза был показан флуоресцентный контраст по сравнению со здоровой корой равный 7±1.7, уменьшение плотности ткани более чем вдвое по сравнению с нормой, кровенаполнение, превышающие в среднем в 6 раз и уровень оксигенации составляющий 60% от значений соответствующих параметров интактного мозга. Ткань из центра опухоли без признаков некроза показала сходные характеристики за исключением кровенаполнения, которое оказалось ниже. Зоне инфильтрации соответствовал максимальный уровень накопления Пп IX (в 10±3 раз выше, чем в норме), наименьшая плотность ткани, кровенаполнение вдвое превышающее норму и самый высокий уровень оксигенации, близкий к таковому интактного мозга. Избирательное накопление Пп IX в опухолевых тканях по сравнению с нормальными обусловлено рядом ферментативных нарушений в быстро пролиферирующих клетках опухоли. Также было показано [7], что накопление Пп IX коррелирует с индексом пролиферации, что объясняет высокий уровень в активно растущей части опухоли в зоне инфильтрации и несколько заниженные его значения в центре опухоли. В целом можно заключить, что более малигнизованные участки опухоли характеризуются более высоким уровнем кровенаполнения и пониженным уровнем оксигенации по сравнению с зоной инфильтрации опухолевых клеток в здоровый мозг. Использование комбинированного спектроскопического метода привело к повышению чувствительности интраоперационной демаркации границ опухоли по сравнению с методом видеофлуоресцентной визуализации с использованием микроскопа Zeiss OPMI Pentero с 78 % до 96 %, специфичности – с 60 % до 82 %. В четвертой главе рассмотрена система регистрации и анализа спектральноразрешенных изображений в диффузно-отраженном и флуоресцентном свете, представляющая собой комбинацию двух или трех источников излучения и 17 системы фильтров. Представлены различные варианты реализации системы. Один из вариантов повторяет функциональность рассмотренного в третьей главе комбинированного спектроскопического метода, объединяя анализ гемоглобина в диапазоне 500-600 нм по сигналу диффузного отражения и анализ Пп IX в окрестности 710 нм по сигналу флуоресценции. Второй вариант реализации системы подразумевает одновременное использование двух источников возбуждения флуоресценции ПпIX с длинами волн 405 нм и 630 нм, что соответствует полосе Соре и одной из линий в Q-полосе спектра поглощения Пп IX, с целью повышения эффективности возбуждения флуоресценции и преодоления экранирующего действия крови. Также в четвертой главе рассмотрены вопросы спектрального и пространственного разрешения системы визуализации, проведено имитационное моделирование взаимодействия излучения с рассеивающей средой с учетом геометрии используемой оптической системы. Показаны отличия зависимости сигнала диффузного отражения от оптических параметров для системы визуализации по сравнению с оптоволоконной системой. Спектральное разрешение представленной системы ограничено шириной полосы пропускания используемых фильтров. В связи с этим был проведен предварительный анализ допустимого значения этой величины. При рассмотрении вопроса о пространственном разрешении системы визуализации было принято в расчет, что в сильнорассеивающей среде излучение, соответствующее одному пикселю изображения, характеризуется широким распределением по длине пути в ткани. Таким образом, чем значительнее рассеяние по сравнению с поглощением, тем большее влияние оказывают соседние пиксели друг на друга. С целью оценки этого влияния и его различий в исследуемых спектральных диапазонах было проведено имитационное моделирование пятна рассеяния на различных длинах волн для всех исследуемых соотношений концентрации основного поглотителя (гемоглобина) и рассеивающей среды при облучении узким коллимированным источником. С изменением содержания крови в образце от 0 % до 8 % размер пятна рассеяния уменьшается втрое. Также пятно уменьшается при повышении концентрации рассеивателя, как это было рассмотрено ранее в третьей главе. Таким образом, размер пятна рассеяния зависит как от состава образца, так и от длины волны, а соседние 18 пиксели оказывают влияние друг на друга, что приводит к сглаживанию спектральных характеристик в точке. Для каждой точки выражение, описывающее сигнал диффузного отражения, будет равно интегралу выражения, предложенного в (2), для расстояний между источником и приемником, соответствующих всей площади осветительного пятна. Восстановление оптических свойств по такому интегральному выражению представляет слишком сложную задачу для реализации ее в реальном времени. Однако общее представление о поведении системы позволяет создать приближенное описание, действующее в биологически релевантном диапазоне изменения исследуемых величин. Предложен следующий алгоритм декомпозиции регистрируемого сигнала на компоненты, обусловленные рассеянием и поглощением (рис. 8): A = ln �1�R� = A0 + A1 ∙ µa /�µ′s (3) где А – коэффициент экстинкции; R – регистрируемый сигнал диффузного отражения; A 0 и A 1 – подстроечные коэффициенты, зависящие от геометрии измерений. Рис. 8. Аппроксимация зависимости коэффициента экстинкции от оптических параметров среды. Оценка точности вычисления с помощью этой модели степени оксигенации при аппроксимации экспериментальных данных предложенной теоретической зависимостью по всему диапазону доступных длин волн при измерении спектра с помощью спектроанализатора и по 4-м характерным длинам волн с учётом полос пропускания интерференционных фильтров показала соответствие в пределах 5%. 19 Тестовые исследования алгоритма проводились на модели гипоксии при окклюзии сосудов пальца. На рис. 8 приведены результаты применения предложенного алгоритма обработки спектрально-разрешенных изображений, полученных в диффузно-отраженном свете. Рис. 9. Визуализация степени оксигенации сосудов кожи пальцев руки (степень оксигенации представлена стандартной цветной шкалой, соответствующей равномерному разбиению диапазона степени оксигенации от 0 до 100%). В работе также представлены результаты визуализации степени оксигенации сосудов кожи лабораторных животных до и после проведения процедуры фотодинамической терапии по кислородному механизму. Приведенные результаты апробации системы на оптических фантомах, содержащих исследуемые хромофоры и флуорофоры, а также апробация модуля системы, реализующего картирование степени оксигенации гемоглобина на биологических моделях позволяют рассматривать данный метод в перспективе как реализацию комбинированного спектроскопического метода в системах нейровизуализации. В заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы, приведенные ниже. Разработаны методы комбинированного спектроскопического анализа с применением волоконно-оптических зондов и матричных фотоприемников, алгоритмы анализа комбинированных спектров и спектрально-разрешенных изображений. Создано программное и аппаратное обеспечение, показавшее по результатам апробации в клинике повышение чувствительности с 78% до 88%, специфичности – с 60% до 82% по сравнению с методом видеофлуоресцентной визуализации с использованием микроскопа. 20 Основные публикации по теме диссертации с участием автора: 1. Стратонников А.А., Меерович Г.А., Рябова А.В., Савельева Т.А., Лощенов В.Б. Использование спектроскопии обратного диффузного отражения света для мониторинга состояния тканей при фотодинамической терапии. Квантовая электроника, 2006, 36(12), 1103–1110. 2. Савельева Т.А., Стратонников А.А., Меерович Г.А., Лощенов В.Б. Разработка метода и оборудования для видеофлуоресцентной диагностики рака желудка. Альманах клинической медицины, 2006, № 12, 31-31. 3. Стратонников А.А., Кузнецов А.В., Меерович Г.А., Рябова А.В., Савельева Т.А., Лощенов В.Б. Использование спектроскопии обратного диффузного отражения света ин виво для диагностики, контроля за терапией и в спортивной медицине. Альманах клинической медицины, 2006, № 12, 38-38. 4. Savelieva T.A., Stratonnikov A.A., Loschenov V.B. Multi-spectral imaging of oxygen saturation. Proc. SPIE 7022, Advanced Laser Technologies 2007, 702205 (June 05, 2008); doi:10.1117/12.803905. 5. Brysin N.N., Linkov K.G., Stratonnikov A.A., Savelieva T.A., Loschenov V.B. The video fluorescent device for diagnostics of cancer of human reproductive system. Proc. SPIE 7022, Advanced Laser Technologies 2007, 702206 (June 05, 2008); doi:10.1117/12.803906. 6. Шмырева В.Ф., Петров С.Ю., Антонов А.А., Стратонников А.А., Савельева Т.А., Шевчик С.А., Рябова А.В. Исследование метаболизма тканей переднего отрезка глаза по уровню оксигенации гемоглобина в венозном русле при первичной открытоугольной глаукоме. Глаукома, 2008, №3, 3-10. 7. Брысин Н.Н., Линьков К.Г., Стратонников А.А., Савельева Т.А., Рябова А.В., Беляева Л.А., Лощенов В.Б. Видеофлуоресцентный комплекс для диагностики репродуктивной системы человека. Лазерная медицина, 2009, 13(1), 49-53. 8. Kalyagina N.A., Loschenov V.B., Wolf D., Daul C., Blondel W., Savelieva T.A. Experimental and Monte Carlo investigation of visible diffuse reflectance imaging sensitivity to diffusing particle size changes in an optical model of a bladder wall, Applied Physics B, 2011, 105(3), 631-639. 9. Савельева Т.А,, Рябова А.В., Андреева И.В., Калягина Н.А., Конов В.И., Лощенов В.Б. Комбинированный спектроскопический метод определения концентрации флуорофоров в сильнорассеивающих средах. Краткие сообщения по физике, 2011, №11, 30-38. 10. Savelieva T.A., Loschenov M.V., Linkov K.G. The multispectral visualization of glial brain tumors containing PP IX in diffuse and laser induced fluorescent light, Lasers in Medical Science, Supplement, 2011, 26(1). 11. Потапов A.A., Гаврилов А.Г., Охлопков В.А., Шишкина Л.В., Горяйнов С.А., Шурхай В.А., Зеленков П.В., Лощенов В.Б., Савельева Т.А., Грачев П.В., Холодцова М.Н., Кузьмин С.Г., Гольбин Д.А. Использование флюоресцентной диагностики и лазерного спектрального анализа в хирургии внутричерепных менингиом. Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко, 2012, 76(4), 12-18. 12. Потапов А.А., Гаврилов А.Г., Горяйнов С.А., Гольбин Д.А., Зеленков П.В., Кобяков Г.Л., Охлопков В.А., Жуков В.Ю., Шишкина Л.В., Шурхай В.А., Лощенов В.Б., Савельева Т.А., Грачев П.В., Холодцова М.Н., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Интраоперационная флуоресцентная диагностика и лазерная спектроскопия в хирургии глиальных опухолей головного мозга. Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко, 2012, 76(5), 3-12. 13. Горяйнов С.А., Потапов А.А., Гольбин Д.А., Зеленков П.В., Кобяков Г.Л., Гаврилов А.Г., Охлопков В.А., Шурхай В.А., Шелеско Е.В., Жуков В.Ю., Лощенов В.Б., Савельева Т.А., Кузьмин С.Г. Флуоресцентная диагностика и лазерная 21 биоспектросокпия как один из методов мультимодальной нейронавигации в нейрохирургии. Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко, 2012, 76(6), 57-65. 14. Потапов А.А., Горяйнов А.А., Лощенов В.Б., Савельева Т.А., Гаврилов А.Г., Охлопков В.А., Жуков В.Ю., Зеленков П.В., Гольбин Д.А., Шурхай В.А., Шишкина Л.В., Грачев П.В., Холодцова М.Н., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н., Чумакова А.П. Интраоперационная комбинированная спектроскопия (оптическая биопсия) глиом головного мозга. Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко, 2013, 77(1), 3-10. 15. Коновалов А.Н., Потапов А.А., Гаврилов А.Г., Шурхай В.А., Горяйнов С.А., Охлопков В.А., Калинин Г.Л., Фомичев Д.В., Кутин М.А., Жуков В.Ю., Гольбин Д.А., Зеленков П.В., Хить М.А., Лощенов В.Б., Савельева Т.А., Холодцова М.Н., Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Чехонин В.П., Юсубалиева Г.М, Баклаушев В.П.. Глава 2. Современные технологии в нейрохирургии. // В издании «Современные технологии и клинические исследования в нейрохирургии» под ред. А.Н. Коновалова. Стр. 55-112. 16. Savelieva T.A., Kalyagina N.A., Kholodtsova M.N., Potapov A.A., Goryainov S.A., Loschenov V.B.. Numerical modelling and in vivo analysis of fluorescent and laser light backscattered from glial brain tumours. // SPIE Proceedings, Vol. 8230, 82300L-1-L9, 2012. 17. Model S.S., Savelieva T.A., Linkov K.G. System for determining the concentration and visualization of the spatial distribution of photosensitizers based on tetrapyrrole compounds in the tissues of the human ocular fundus . Proc. SPIE 8699, Saratov Fall Meeting 2012: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XIV; and Laser Physics and Photonics XIV, 86990E (February 26, 2013); doi:10.1117/12.2016675. Цитируемая литература 1. Bradley R.S., Thorniley M.S. A review of attenuation correction techniques for tissue fluorescence, J. R. Soc. Interface, 2006, 3, 1–13. 2. G. Palte et al. Fluorescence and reflectance spectroscopy for protoporphyrin IX quantification in tissue-like media, Photonic Therapeutics and Diagnostics VII, edited by N. Kollias, et al., Proc. of SPIE Vol. 7883, 788340, 2011. 3. Valdes P.A. et al., Combined fluorescence and reflectance spectroscopy for in vivo quantification of cancer biomarkers in low- and high-grade glioma surgery, Journal of Biomedical Optics, 2011, 16(11), 116007. 4. Hillman E.M.C. Optical brain imaging in vivo: techniques and applications from animal to man, Journal of Biomedical Optics, 2007, 12(5), 051402. 5. Loschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic Therapy and Fluorescence Diagnostics, Laser Physics, 2000, 10(6), 1188-1207. 6. Biomedical Photonics Handbook. Ed. Vo-Dinh T. Boca Raton, FL: CRC Press, 2003. 7. Valdés P.A. et al. δ-aminolevulinic acid–induced protoporphyrin IX concentration correlates with histopathologic markers of malignancy in human gliomas: the need for quantitative fluorescence-guided resection to identify regions of increasing malignancy. Neuro Oncol., 2011, 13(8): 846–856. 22
